Veterinarska Stanica 05 2009

VETERINARSKA STANICA 40 (5), 2009.

ORIGINALNI ZNANSTVENI RAD

257

Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog proljeva teladiIvana Lojki, T. Bedekovi, . a i M. Lojki

Dr. sc. Ivana LOJKI, znanstvena suradnica, Tomislav BEDEKOVI, dr. vet. med., asistent, dr. sc. eljko A, dr. vet. med., znanstveni suradnik, dr. sc. Mirko LOJKI, dr. vet. med., redoviti profesor, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb

Sindrom neonatalnog proljeva vrlo je est u novoroene teladi i uzrokuje znatne gospodarske tete. Karakter-izira ga proljev te posljedino de-hidracija, odbijanje hrane, slabost i uginue (Naylor, 2002.). Proljev je vodenasto ut, siv ili zelenkast te moe sadravati i tragove krvi. Mnogo je uzronika neonatalnog proljeva, a oni bolest mogu uzrokovati pojedinano ili je infekcija mjeovita. Od virusa su najee rotavirusi i koronavirusi, za-tim parvovirusi, torovirusi, kalicivi-rusi, norovirusi i pestivirus proljeva goveda/bolesti sluznice goveda. Meu bakterijskim uzronicima najprisut-niji su enterotoksini E. coli. Od ostalih uzronika mogu se nai Cryptosporidia i Coccidia (Snodgrass i sur., 1986.).

Rotavirusi su najei uzronici akutnog virusnog gastroenteritisa u mladih ivotinja i djece irom svijeta

(Bern i Glass, 1994.). Pripadaju rodu Ro-tavirus, porodici Reoviridae, a seroloki se klasificiraju u 7 skupina (AG) (Es-tes, 2001.). Ipak, najei uzronik pro-ljeva u ljudi i ivotinja je rotavirus sku-pine A.

Govei koronavirus (BCV) je enter-opatogeni virus to se umnaa u zre-lim enterocitima duodenuma i kolona, uzrokujui u novoroene teladi teki proljev (Mebus i sur., 1973., Tsunemitsu i Saif, 1995.) i akutnu crijevnu infekciju goveda to se pojavljuje uglavnom ti-jekom zimskih mjeseci tzv. zimsku di-zenteriju (Dea i sur., 1995., Saif i sur., 1991.), a esto izaziva i infekcije respira-tornog trakta teladi (Tsunemitsu i sur., 1991.). BCV je jednolanani RNK virus iz roda Coronavirus, porodice Corona-viridae, red Nidovirales. Tri su skupine koronavirusa odreene na temelju pripadajuih epitopa na glikoproteinu

Uvod

IVANA LojKI, T. BEdEKoVI, . A I M. LojKI

VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009.258

ovojnice i nukleotidnog slijeda, a BCV pripada skupini 2 (Cavanagh, 1995). I rotavirusi i koronavirusi najee se izdvajaju iz izmeta bolesne teladi izmeu jednog dana i tri tjedna starosti.

Ovi se uzronici mogu dokazati raznim tehnikama kao to su izdva-janje virusa na staninoj kulturi, elek-tronska mikroskopija, ELISA (imuno-enzimni test), kromatografija i RT-PCR (lanana reakcija polimerazom uz pre-thodnu reverznu transkripciju). Prve dvije spomenute tehnike su dugotrajne i neekonomine, dok ELISA test za do-kazivanje antigena za govei koronavi-rus i rotavirus moe biti neekonomian kada se pretrauje mali broj uzoraka. Danas je RT-PCR tehnika od izbora zbog brzine i specifinosti te je po-godna i na malom broju uzoraka. Za brzo dokazivanje uzronika na terenu u uporabi su i nitrocelulozne test trake razliitih proizvoaa to djeluju na principu kromatografije.

Svrha ovog rada je dokazivanje najeih virusnih uzronika neonatal-nog proljeva teladi te njihovo izdvaja-nje. Ovo je ujedno i prvi dokaz i izdva-janje BCV kao uzronika neonatalnog proljeva teladi Hrvatskoj.

Materijal i metodeUzorci izmeta prikupljeni su od

ukupno 16 teladi. Telad je bila u dobi od 5 do 12 dana, podrijetlom s dvije farme s oko 50 grla. Bolest je trajala oko 10 dana. Na farmi A je peti dan nakon pojave simptoma etiri teleta uginulo.

Uzorci izmeta razrijeeni su s 9 volumena MEM-a (Minimum Essential

Media) (pH 7,4) i centrifugirani 10 min. pri 1000 x g. Virusna RNA izdvojena je iz 140 L nadtaloga suspenzije izmeta uporabom QiAMP Viral RNA Mini kit (Qiagen, Njemaka). Virusna RNA prevedena je reverznom transkrip-cijom (RT) u komplementarnu DNA sa Supersccript III (Invitrogen, SAD). Lanana reakcija polimerazom (PCR) napravljena je s JumpStart RedTaq polimerazom (Sigma, Njemaka) uz koritenje specifinih poetnica za dio gena za nukleokapsidu (N) veliine 406 bp (parova baza) BCV (Tsunemitsu i sur. 1999.) i dio gena za virusni pro-tein 6 (VP6) veliine 294 bp goveeg rotavirusa A (BRV-A). Poetnice za do-kazivanje BRV dizajnirane su prema nukleotidnoj sekvenci br. X53667 u banci gena (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Produkti reakcije PCR provjere-ni su elektroforezom u gelu agaroze. Komercijalno ivo cjepivo to sadri oba virusa upotrijebljeno je kao pozi-tivna kontrola za izdvajanje virusne RNK i RT-PCR, a kao negativna kon-trola koritena je suspenzija crijevnog sadraja juneta podrijetlom s farme bez prisutnih klinikih znakova bolesti. Suspenzije svih pozitivnih uzoraka in-okulirane su na linijsku staninu kult-uru BEK (Bovine Embryonic Kidney). Prije inokulacije suspenzija je tretirana kroz milipore veliine 0,45 m te inku-birana na 37oC kroz 120 minuta. Nakon toga suspenzija je odlita iz boica s kul-turom, a stanice dva puta isprane te je dodan MEM i tripsin (5 g/ml). Stan-ice su svakodnevno pregledavane na prisutnost citopatskog uinka (CPE).

Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog proljeva teladi

VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009. 259

RezultatiSakupljeno je 16 uzoraka izmeta

teladi u dobi do 14 dana podrijetlom s dvije farme u sredinjoj Hrvatskoj. Te-lad je bila u dobi do 14 dana, a proljev je trajao oko pet dana. Elektroforezom proizvoda reakcije PCR od ukupno 6 pretraenih uzoraka podrijetlom s farme A, otkrivena su tri uzorka pozi-tivna na BCV i dva na BRV. Na farmi B, od ukupno 10 pretraenih uzoraka 8 ih je bilo pozitivno na BCV, a samo jedan na BRV. Mijeana infekcija bila je prisutna u po jednom uzorku s obje farme. Specifinost umnaanja odreenih fragmenata oba virusa

potvrena je uspjenim umnaanjem pozitivnih kontrola (slika 1). Na kul-turi stanica BEK, CPE tipian za ko-ronavirus uoen je nakon pet pasaa te je uspjeno umnaanje BCV potom potvreno ponovnim izdvajanjem virusne RNK iz nadtaloga suspen-zije stanica i umnaanjem specifinog odsjeka metodom RT-PCR. Ipak, umnaanje BRV na linijskoj staninoj kulturi BEK nije uspjelo.

RaspravaGubitci teladi u ranom postnatal-

nom razdoblju svake su godine sve vei i kreu se ve preko 15%. Kao glavni uzrok proljeva najei su virusi (rota-, korona-, virusni proljev teladi uzro-kovan pestivirusima i dr.) i bakterije (enterotoksini E. coli). Ovi uzronici koji su u naoj goveoj populaciji sve-prisutni, a u pravilu mogu dovesti do tekih oboljenja s akutnim tijekom bolesti i nerijetko izazvati uginue. Pa-togenetski u pravilu najprije dolazi do infekcija u duodenumu ili kolonu to dovodi do oteenja sluznice crijeva pa time pogoduje sekundarnoj bakteri-jskoj infekciji. Telad se moe zaraziti ve i za vrijeme samog telenja i kratko nakon telenja. U tom trenutku telad jo nije u stanju aktivno izgraditi lokalnu imunost koja bi sprijeila nastanak in-fekcije pa se preporuuje cijepljenje visoko breih krava i junica s cjepiv-om protiv rotavirusa, koronavirusa i enterotoksogenih sojeva E. coli, koja potie tvorbu kolostralnih protutijela u cijepljenih krava i junica, kao sredstvo izbora. Aktivnim cijepljenjem potie se

Slika 1. Elektroforeza amplikona reakcije RT-PCR. M: 50-bp DNA marker; Stupac 1: pozitivna kontrola za BCV; Stupac 2: BCV pozitivni uzorak, Stupac 3: pozitivna kontrola za BRV.



poveanje razine protutijela u kolostru-mu i u mlijeku te posljedino pasivna zatita njihove teladi sa svrhom sman-jenja uestalosti i trajanja neonatalnih proljeva. Cijepljenje djeluje prije svega i na produenje izluivanja majinskih protutijela i time zatiuje sluznicu cri-jeva od uzronika proljeva.

Na dvije farme goveda virolokim je tehnikama utvrena mjeovita in-fekcija s rotavirusima i koronavirusima te enterotoksigenom E. coli koja se po-javljuje sekundarno i dodatno oteava kliniku sliku. Ovakva je slika neona-talnog proljeva karakteristina za telad stariju od 7 dana, stoga je i rotavirus bio slabije zastupljen od koronavirusa. Te-renske je izolate BCV neto tee, ali ne i nemogue prilagoditi rastu na in vitro. Ipak, u literaturi je zabiljeen uspjean rast i izolacija BCV na sljedeim stani-cama: BEK-1 (Bovine embryonic kid-ney), VERO (African green monkey kidney), MDBK (Madin-Darby bovine kidney), PK-15 (Porcine kidney) i HRT-18 (Human rectal tumor) koje su se pokazale i najosjetljivije (Tsunemitsu i sur; 1991.). Na kulturi stanica BEK, CPE tipian za koronavirus uoen je nakon pet pasaa, a uspjeno je umnaanje BCV potom potvreno ponovnim izdvajanjem virusne RNK iz nadtalo-ga suspenzije stanica i umnaanjem specifinog odsjeka metodom RT-PCR. Ipak, umnaanje BRV na lini-jskoj staninoj kulturi BEK nije us-pjelo. Budui da je izdvajanje BCV na staninoj kulturi BEK bilo uspjeno ra-zlog ne moemo pripisati inhibitornim supstancama u uzorcima izmeta. Kako su samo tri uzorka dala pozitivnu PCR reakciju na BRV, dok ih je ak 11 bilo

pozitivno na BCV, moemo zakljuiti da je bolest ve bila u kasnijem tijeku te da u uzorcima izmeta vie nije bilo vi-jabilnog rotavirusa. Budui da se meto-dom PCR dokazuje samo dio genoma virusa, za pretragu nije potreban ivi virus. Tako su koritenjem specifinih oligonukleotidnih poetnica za BCV i BRV umnoeni dijelovi genoma oba virusa tono oekivanih veliina, to je potvreno i uspjenim umnaanjem pozitivnih kontrola.

Na temelju dobiveni rezultata mo emo zakljuiti da je na dvjema istraivanim farmama utvrena mje-ovita infekcija s rotavirusima i koro-navirusima.

SaetakU cilju dokazivanja i izdvajanja

najeih virusnih uzronika neona-talnog proljeva teladi uzeti su uzorci izmeta teladi s dvije farme u sredinjoj Hrvatskoj. Telad je bila u dobi do 14 dana, a proljev je trajao oko pet dana. Budui da su korona- i rotavirusi najei uzronici neonatalnog prolje-va teladi izdvojena je virusna RNK iz uzoraka izmeta te napravljena lanana reakcija polimerazom uz prethod-nu reverznu transkripciju (RT-PCR) koritenjem specifinih oligonukleo-tidnih poetnica za gen nukleokapside goveeg koronavirusa (BCV) i za gen VP6 goveeg rotavirusa A (BRV-A). Elektroforeza proizvoda reakcije PCR u gelu agaroze pokazala je odsjeak veliine 406 parova baza za BCV i 294 za BRV- A kako u uzorku pozitivne kontrole tako i u testiranim uzorcima.

Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog proljeva teladi


Tri su, od ukupno est uzoraka, bila pozitivni na BCV, a dva na BRV od te-ladi podrijetlom s farme A. Na farmi B specifian je odsjeak BCV bio prisutan u 8 od ukupno 10 uzoraka, a samo je jedan uzorak dao pozitivnu reakciju na BRV. Mijeana infekcija bila je prisutna u po jednom uzorku s obje farme. Sus-penzije izmeta svakog uzorka inokuli-rane su na stanice bubrega goveeg em-brija (BEK). Citopatski uinak tipian za koronavirus uoen je nakon pet pasaa te je metodom RT-PCR potvreno izd-vajanje BCV. Ovo je ujedno prvi dokaz i izdvajanje BCV kao uzronika neona-talnog proljeva teladi u nas.

Literatura1. BERN, C. and R. I. GLASS (1994): Im-

pact of diarrheal diseases worldwide. In: KAPIKIAN, A. Z.: Viral Infections of the Gastrointestinal Tract, 2nd ed. Marcel Dekker, New York (126).

2. CAVANAGH, D. (1995): The coronavi-rus surface glycoprotein In: SIDDELL, S. G. The Coronaviridae. Plenum, New York (73-113).

3. DEA, S., L. MICHAUD and G. MILA-NE (1995): Comparison of bovine coro-navirus isolates associated with neona-tal calf diarrhoea and winter dysentery in adult dairy cattle in Qubec. J. Gen. Virol. 76, 12631270.

4. ESTES, M. K. (2001): Rotaviruses. In: Fields Virology, 4th ed. Lippincott Wil-liams & Wilkins, Philadelphia (17471785).

5. MEBUS, C. A., E. L. STAIR, M. B. RHODES and M. J. TWIEHAUS (1973): Neonatal calf diarrhea: propa-gation, attenuation, and characteristics of a coronavirus-like agent. Amer. J. Vet. Res. 34, 145-150.

6. NAYLOR, J. M. (2002): Neonatal Rumi-nant Diarrhea. In: SMITH, B. P.: Large animal internal medicine. Mosby, St. Louis (355-356).

7. SAIF, L. J., K. V. BROCK, D. R. RED-MAN and E. M. KOHLER (1991): Win-ter dysentery in dairy herds: electron microscopic and serological evidence for an association with coronavirus in-fection. Vet. Rec. 128, 447449.

8. SNODGRASS, D. R., H. R. TERZOLO, D. SHERWOOD, I. CAMPBELL, J. D. MENZIES and B. A. SYNGE (1986): Aetiology of diarrhoea in young calves. Vet. Rec. 119, 31-34.

9. TSUNEMITSU, H. and L. J. SAIF (1995): Antigenic and biological comparisons of bovine coronaviruses derived from neonatal calf diarrhea and winter dys-entery of adult cattle. Arch. Virol. 140, 13031311.

10. TSUNEMITSU, H., H. YONEMICHI, T. HIRAI, T. KuDo, S. ONOE, K. MORI and M. SHIMIZU (1991): Isola-tion of bovine coronavirus from feces and nasal swabs of calves with diar-rhea. J. Vet. Med. Sci. 53, 433-437.

11. TSUNEMITSU, H., D. R. SMITH and L. J. SAIF (1999): Experimental inocu-lation of adult dairy cows with bovine coronavirus and detection of corona-virus in feces by RT-PCR. Arch. Virol. 144, 167-175.



Detection and isolation of a bovine coronavirus in neo-natal calf diarrhea in Croatia

Ivana LOJKI, Ph.D., Scientific Associate, Tomislav BEDEKOVI, DVM, Assis-tant; eljko A, Ph.D., DVM, Scientific Associate; Mirko LOJKI, Ph.D., DVM, Full Professor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

Coronaviruses and rotaviruses are the most common viruses involved in neonatal calf diarrhea. Fecal samples from diarrheic calves were collected from two farms in the central part of Croatia. For the detection of corona- and rotavirus, viral RNA was extracted from fecal suspensions. Specific oli-gonucleotide primers for PCR (poly-merase chain reaction) detection of a nucleocapsid gene of bovine coronavi-rus (BCV) and VP6 gene of bovine type A rotaviruses (BRV-A) were used. Aga-rose gel electrophoresis of PCR ampli-fied products showed fragments of ex-pected size in positive control sample as well as in tested samples. A 406-bp PCR product of bovine coronavirus

was present in three tested samples and 294-bp product of bovine type A rotavi-rus in two samples, all originated from farm A. On farm B, bovine coronavi-rus was detected in eight samples and rotavirus only in one sample. Mixed infection was present in one sample on both farms. Suspension from each sample was also inoculated into bovine embryo kidney cells (BEK). Cytopathic effect typical for coronaviruses was observed after 5 passages the isolation of the virus was confirmed by PCR. In this study, we detected and isolated for the first time a bovine coronavirus involved in calf neonatal diarrhea in Croatia.

OBAVIJEST

Od broja 6. za 2009. godinu asopis Veterinarska stanica uvodi novu ru-briku pod naslovom Besplatni oglasnik u kojem se mogu objaviti oglasi u svezi ponude i potranje poslova za doktore veterinarske medicine. Va oglas e biti objavljen dva puta uzastopce, a nakon toga samo na Va ponov-ljen zahtjev.

Oglas se dostavlja glavnom i odgovornom uredniku: doc. dr. sc Marko Samardija, Heinzelova 55, 10000 Zagreb ili na e-mail: [email protected].



263

Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godiniMaja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja Duvnjak, Ivana Rai i . Cvetni

Dr. sc. Maja ZDELAR-TUK, dr. vet. med., znanstvena suradnica, dr. sc. Silvio PII, dr. vet. med., znan-stveni suradnik, Sanja DUVNJAK, dipl. in. biol., znanstvena novakinja, Ivana RAI, dipl. in. biol., struna suradnica, dr. sc. eljko CVETNI, dr. vet. med., znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski in-stitut, Zagreb

Paratuberkuloza (Johneova bolest) je kronina zarazna bolest, koja se kliniki oituje tekim nezaustavljivim proljevom i mravou, a patoloko-anatomski zadebljanjem sluznice tank-og crijeva, osobito ileuma. Opisana je najprije u goveda, a zatim u ovaca i koza no dokazana je i u drugih vrsta preivaa u divljini (jelena, antilopa, bizona, mu-flona i drugih). Osim preivaa, konji i mule su takoer potvreni kao nositelji bakterije, ali bez klinikih znakova. U pokusno zaraenih laboratorijskih ivotinja (mievi, takori, zeevi, hrci i zamorci) te ptica (perad i golubo-vi) uoeno je takoer umnoavanje uzronika (Frelier i sur., 1990., Beard i sur., 2001.). Nedavno je prisutnost

uzronika potvrena i u lisica, zeeva, zerdava, lasica i jelena (Beard i sur., 1999., Greig i sur., 1999., Kopecna i sur., 2008.). Paratuberkuloza u mlijenoj in-dustriji uzrokuje velike tete s obzirom na pad mlijenosti (Wilson i sur., 1993., Benedictus i sur., 1997., Hendrick i sur., 2005., Lombard i sur., 2005.), smanjene klaonike vrijednosti (Johnson-Ifearu-lundu i Kaneene, 1997., Johnson-Ifea-rulundu i sur., 1999.) i poveani remont stada (Ott i sur., 1999.). Isto se tako, ne moe zaobii ni zoonotski znaaj paratuberkuloze goveda u patogenezi Crohnove bolesti u ljudi (Chiodini i sur., 1984., Hermon-Taylor i sur., 2000., Harris i Lammerding, 2001., Greenstein i Collins, 2004.).

Uvod

Maja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja duvnjak, ivana rai i . CveTni,


Bolesne ivotinje i kliconoe fecesom izluuju velike koliine uzronika i oneiuju okolinu, stelju, vodu i dr. irenje uzronika u okolinu i iz cri-jeva u ostale organe inficiranih goveda uglavnom je povezano s kliniki pre-poznatljivim oblikom bolesti (Antogno-li i sur., 2008., Hasonova i sur., 2009.) Prirodnim putem uzronik ulazi u or-ganizam ispaom na kontaminiranim panjacima, no kao velik problem navo-di se infekcija novoroene teladi koja je osobito prijemljiva za uzronika zbog nerazvijenog imunolokog sustava. Glavni izvor infekcije za telad je mlijeko zaraenih krava ili mlijeko zagaeno fecesom bolesnih ivotinja (Harris i Barletta, 2001.). Mogu je i intrauterini prijenos do kojeg dolazi uglavnom kod fetusa ije su majke u uznapredovalom stadiju bolesti. Provedena istraivanja pokazala su da su mlaa goveda znatno osjetljivija na infekciju i razvoj klinikih znakova paratuberkuloze u usporedbi s odraslim ivotinjama (Wa-ters i sur., 2003.). U nezaraene uzgoje bolest se unosi inficiranim grlima ili kontaminiranom hranom, dok Ay-ele (2004.) navodi mogunost infek-cije zaraenim sjemenom. Poznata je i injenica vertikalnog prijenosa in utero (Whittington i Windsor, 2009.). Smatra se takoer da infekciji pogoduje pretjer-ano iskoritavanje, gravidnost i bolesti poremeenog metabolizma. Otkrivanje goveda kliconoa i zaraenih stada najee se bazira na serolokoj pretrazi imunoenzimskim testom (ELISA), koja je vrlo osjetljiva za otkrivanje goveda koja izluuju velike koliine uzronika fecesom (Whitlock i sur., 2000., Collins i sur., 2005.).

U radu je opisana seroloka, bak-terioloka i molekularna dijagnostika paratuberkuloze u domaih ivotinja tijekom 2008. godine.

Materijal i metodeMaterijal za pretragu na paratuber-

kulozu dolazi u Laboratorij za bakteri-jske zoonoze temeljem godinje Na-redbe MPRRR, koja propisuje kontrolu krvi i fecesa bikova, ovnova i jareva koji slue za proizvodnju sjemena za umjetno osjemenjivanje ili prirodni pri-pust te krv svih krava u laktaciji prije formiranja novog uzgoja i novonabav-ljenih junica prije uvoenja u uzgoj.

Tijekom 2008. godine u Laborato-riju za bakterijske zoonoze na para-tuberkulozu je serolokim metodama pretraeno 13782 krvi goveda te 15533 krvi ovnova i jareva, fecesi 33 goveda i 2017 ovnova i jareva, izvreno je 7 bakteriolokih pretraga i 2 molekularne identifikacije izolata uzronika.

U rutinskoj dijagnostici paratuber-kuloze u Laboratoriju za bakterijske zoonoze krvi bikova, ovnova i jareva na paratuberkulozu pretrauju se imu-noenzimskim testom probira (ELISA Paratuberculosis Antibody Screen-ing, Institut Pourquier, Francuska), a serume koji su reagirali pozitivno pretraujemo dodatno potvrdnim imu-noenzimskim testom (ELISA Paratu-berculosis Antibody Verification, Insti-tut Pourquier, Francuska).

Uzorke fecesa pretraujemo mikros-kopskom pretragom (bojanje po Ziehl-Neelsenu). U sluaju uginua ivotinje, dostavljeni materijal (intestinalni limfni

Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godini


vorovi, dijelovi ileuma ili jejunuma, ili ileocekalna valvula) pretraujemo mi-kroskopski te nasaivanjem materijala na hranjive podloge. Porasle kolonije identificiramo molekularnim metoda-ma.

Seroloke metode: ELISA Paratuberculosis Antibody

Screening i Verification, Institut Po-urquier, Francuska su komercijalno pripremljeni dijagnostiki kitovi za paratuberkulozu preivaa. Granina je vrijednost iznad koje je serum poziti-van je u uputi za uporabu testa. Rezul-tati su oitavani na spektrofotometru Tecan Sunrise, Austrija.

Bakterioloke metode: Kulturelna pretraga uzorka organa

i fecesa izvrena je prema opisanoj me-todi (Pavlik i sur., 2000., Kopecna i sur., 2008.) Ukratko: svaki uzorak tkiva (oko 1 g) homogeniziran je i dekontaminiran s 0,75% HPC (Heksadecilpiridinium klorid, Merck KGaA, Darmstadt, Nje-maka) kroz 72 h. Uzorci fecesa (oko 1 g) razmueni su u 30 ml sterilne de-stilirane vode, mijeani kroz 30 minuta na vodoravnoj mjealici i ostavljeni na sobnoj temperaturi kroz pola sata. Za-tim smo 5 ml nadtaloga dekontamini-rali s 25 ml 0,9% HPC- a kroz 72 h na sobnoj temperaturi. Kao podloga za uzgoj koristi se Herold-ova podloga s mikobaktinom koju priprema Labora-torij za pripremu hranjivih podloga i sterilizaciju HVI-a ili CATTLETYPE MAP HEYM (Labor Diagnostic Leip-zig). Svaki uzorak nacijepili smo na 3 hranjive podloge i inkubirali u termo-statu na 37 C tijekom 3-4 mjeseca uz

jednotjedne kontrole porasta kolonija. Na tvrdoj hranjivoj podlozi primarne kolonije Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis porastu u razdoblju od 5 tjedana do 6 mjeseci (prosjeno 3 mje-seca), a za ovje sojeve i do 9 mjeseci.

Molekularne metodeIzolacija DNK iz bakterijske kultureUicu kulture Mycobacterium sp.

razmutimo u 50 l destilirane vode u Eppendorfovoj kualici od 2 ml. Ovu smjesu grijemo 20 minuta na 99 oC u termobloku uz povremeno tresenje. Po-tom kualice centrifugiramo na 14000 g kroz 1 minutu. Za potrebe pretrage ko-ristimo 2 ili 5 l nadtaloga.

Molekularnu identifikaciju M. pa-ratuberculosis izvrili smo s obzirom na prisutnost inzercijske sekvence IS900, karakteristine za ovu vrstu (Green i sur., 1989.). U reakcijskoj mjeavini koristili smo poetnice MP90 (5 GTT-CGGGGCCGTCGCTTAGG 3) i MP91 (5 GAGGTCGATCGCCCACGTGA 3) u koliini od 2,5 l (konana koncentra-cija 0,4 M) (Sanderson i sur., 1992.), 5 l DNK, 15 l vode i 25 l HotStar Taq Master Mix- a (Qiagen). Umnoavanje je izvreno prema referenci Gwozdz i sur. (1997.), a oekivana veliina pro-dukta iznosi 400 parova baza (pb).

RezultatiTijekom 2008. godine serolokim je

metodama ukupno pretraeno 13782 krvi goveda te 15533 krvi ovnova i jareva. Za seroloki pozitivne ivotinje preporueno je klanje, a materijal za bakterioloku pretragu uzorkovan je na liniji klanja. Bakteriolokom pretragom



bojanjem razmaza po Ziehl-Neelsenu pretraena su 33 fecesa goveda te 2017 fecesa ovnova i jareva. Radi kulturelne pretrage u laboratorij je dostavljeno i pretraeno 7 uzoraka organa (tanka crijeva i pripadajui limfni vorovi) i fecesa na hranjivoj podlozi (Tablica 1). Molekularna identifikacija uzronika izdvojenih iz mezenterijalnih limfnih vorova goveda izvrena je metodom lanane reakcije polimeraze za 2 izolata (Slika 1.).

Slika 1. Molekularna identifikacija vrste M. para-tuberculosis: PK- pozitivna kontrola, NK- nega-tivna kontrola, G1 i G2- izolati M. paratuberculo-sis iz mezenterijalnih limfnih vorova goveda, 400 i 600- veliina produkta umnoavanja (broj parova baza)

RaspravaOtkako je opisana prvi puta 1895.

godine, paratuberkuloza se proirila gotovo cijelim svijetom s izuzetkom nekih dijelova vedske (Herthnek, 2006.) i Australije (Kennedy i Allworth,

2000.) Unato velikom ekonomskom utjecaju na mlijenu industriju irom svijeta, educiranost uzgajivaa o po-sljedicama i tetnom utjecaju bolesti je vrlo mala. Ekonomski gubitci oituju se smanjenom proizvodnjom, preranim izluivanjem iz uzgoja, veterinarskim trokovima i smanjenom klaonikom vrijednou (Johnson-Ifearulundu i Kaneene, 1997., Johnson- Ifearulundu i sur., 1999., Hasonova i Pavlik, 2006.). Osim ekonomskih gubitaka, vano je spomenuti i potencijalnu zoonotsku ulogu M. paratuberculosis, s obzirom da je otporan na pasterizaciju mlijeka i drugih mlijenih proizvoda te kao takav predstavlja opasnost za ljudsko zdravlje (Grant i sur., 2002.). Sve vie znanstvenih istraivanja (Chiodini i sur., 1984., Hermon-Taylor i sur., 2000., Harris i Lammerding, 2001., Greenstein i Collins, 2004.) upuuje na povezanost paratuberkuloze u mlijenih goveda i Chronove bolesti u ljudi, to je prvi puta sugerirao Dalziel jo 1913. godine.

Raznolikost imunologije paratuber-kuloze i mnoga ogranienja u postav-ljanju dijagnoze veliki su problem u kontroli i njezinu suzbijanju. Seroloke, bakterioloke i molekularne metode u praktinoj primjeni daju manje od 1%

Tablica 1. Prikaz serolokih i bakteriolokih pretraga u goveda, ovaca i koza tijekom 2008. godine.

SEROLOKA I BAKTERIOLOKA PRETRAGA NA PARATUBERKULOZU

Vrsta ivotinje

Imunoenz-imski test

(ELISA)

Broj pozitivnih uzoraka

Broj kulturel-no pretraenih

uzoraka or-gana i fecesa

Broj kulturelno pozitivnih uzoraka

Broj mik-roskopski

pretraenih fecesa

Broj mik-roskopski pozitivnih

fecesa

Goveda 13782 25 5 2 33 0

Ovce i koze

15521 11 2 0 2107 (ovnovi i jarevi)

0



nespecifinih reakcija. Znatan postotak ivotinja u zaraenom stadu u ranom stadiju bolesti ne pokazuje nikakve zna-kove bolesti, a ivotinje jo nisu razvile imunosni odgovor ili poele izluiva-ti mikobakterije pa se bolest ne moe nikakvim dijagnostikim metodama otkriti (Collins, 1996.). Upravo stoga dostupne podatke o prevalenciji treba uzeti s rezervom. Naime, smatra se da na svaku kravu koja pokazuje klinike znakove bolesti dolazi 25 zaraenih i-votinja, a samo se njih 15 do 25% mogu otkriti trenutno dostupnim dijagnosti-kim metodama (Whitlock i sur., 2005.). Prisustvo acidorezistentnih tapia u fecesu ovisi o fazi bolesti. U mladih i-votinja, na poetku bolesti u fecesu ih se ne moe dokazati tehnikama bojenja, a Coelho i sur. (2008.) su ih u uzgojima ovaca s dokazanom paratuberkulozom bojanjem po Ziehl-Neelsenu ustvrdili u ak 61,5% sluajeva. U 2008. godi-ni mikroskopski smo pretraili 2107 fecesa ovnova i jareva i 33 bikova s negativnim rezultatom to ukazuje da paratuberkuloza nije znatno rairena u uzgojima ovaca i koza. Takoer, ne postoje pouzdane seroloke metode, bakterioloke i molekularne tehnike koje bi osigurale rano otkrivanje infek-cije u mlijenih goveda (Dieguez i sur., 2009.). Bakterioloka se pretraga fece-sa smatra najpouzdanijom metodom pretrage u ivih ivotinja i omoguava otkrivanje 30-40% inficiranih ivotinja (Whitlock i sur., 2000.). Podudarnost kulturelne pretrage s imunoenzimskim testom u najveoj mjeri ovise o stadiju bolesti i starosti ivotinja. Tako su Jubb i sur. (2004.) u istraivanju provedenom u Australiji utvrdili u dvije, tri i etiri

godine starih goveda osjetljivost ELI-SA testa 1,2%, 8,9% i 11,6%, a u starijih goveda i do 20-30 %. Posebno izraena osjetljivost ELISA testa nad RVK i GDP testovima, pogotovo u subklinikom ti-jeku bolesti utvrena je i u istraivanji-ma ostalih autora (Gwozdz i sur., 1997., Cvetni i sur., 2004., OIE 2008.). Bakteri-oloka pretraga izvrena je na ogranie-nom broju uzoraka, uglavnom neade-kvatno uzorkovanih na liniji klanja te stoga nije mogue komentirati rezulta-te s obzirom na specifinosti seroloke i bakterioloke pretrage. Molekularna dijagnostika, koja se u rutini provodi lananom reakcijom polimerazom i temelji se na dokazu IS900 predstavlja brz nain identifikacije uzronika, a u 2008. godini nadopunjena je uvoe-njem bre i osjetljivije kvantitativne RT-PCR metode.

Na alost, ne postoji unificirani pro-gram otkrivanja, kontrole i suzbijanja paratuberkuloze. U nacionalnim sta-dima s rairenom paratuberkulozom u cilju kontrole i suzbijanja bolesti po-trebno je pretraiti feces svih odraslih goveda dva puta godinje; seroloki pretraiti krv ivotinja s proljevom; izluiti inficirane krave i bikove; osigu-rati ist prostor za teljenje; od osobite je vanosti nakon teljenja krave i telad dr-ati na nezagaenim panjacima; spri-jeiti kontaminaciju panjaka te hrane i vode inficiranim fecesom; sijeno uvati na mjestu sigurnom od kontaminacije; ne koristiti isti pribor za ienje sta-je i hranjenje ivotinja (Roussel i sur., 2005.). U Hrvatskoj se u cilju prevencije paratuberkuloze vri seroloka kontro-la prilikom uvoenja novonabavljenih ivotinja u uzgoj slobodan od bolesti i



periodika kontrola mukih rasplod-njaka, a prilikom uvoza rasplodnih i-votinja zbog nepouzdanosti seroloke dijagnostike zahtijevaju se i dodatne garancije da ivotinje potjeu iz uzgo-ja slobodnih od paratuberkuloze. Naj-vaniji imbenik koji vodi do uspjene kontrole paratuberkuloze je dosljedno provoenje navedenih mjera tijekom dueg razdoblja.

SaetakTijekom 2008. godine u Laborato-

riju za bakterijske zoonoze na para-tuberkulozu serolokim je metodama pretraeno 13782 krvi goveda te 15533 krvi ovnova i jareva. Mikroskop-skom pretragom razmaza fecesa obo-jenih metodom po Ziehl-Neelsenu pretraena su 33 fecesa goveda te 2017 fecesa ovnova i jareva te kulturelno pretraeno 7 uzoraka tkiva ili fecesa na hranjivoj podlozi. Molekularna iden-tifikacija uzronika izdvojenih iz me-zenterijalnih limfnih vorova goveda izvrena je metodom lanane reakcije polimeraze.

Paratuberkuloza nije gorui prob-lem u R. Hrvatskoj, iako u svijetu nano-si velike ekonomske tete mlijenom govedarstvu i ovarstvu. Dijagnostika bolesti je kompleksna i ne postoje uni-formni programi kontrole i suzbijanja bolesti. Temeljem toga potrebno je provoditi kontinuirane mjere kontrole bolesti s ciljem brze dijagnostike pojave bolesti i sprijeavanja njezinog irenja.

Literatura1. ANTOGNOLI, M. C., F. B. GARRY,

H. L. HIRST, J. E. LOMBARD, M. M. DENNIS, D. H. GOULD and M. D. SALMAN (2008): Characterization of Mycobacterium avium subspecies para-tuberculosis disseminated infection in dairy cattle and its association with antemortem test results. Vet. Microbiol. 127, 300308.

2. AYELE, W. Y., M. BARTOS, P. SVAS-TOVA and I. PAVLIK (2004): Distribu-tion of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in organs of naturally infected bull-calves and breeding bulls. Vet. Microbiol. 15, 103 (3-4), 209-217.

3. BEARD, P. M., D. HENDERSON, M. J. DANIELS, A. PIRIE, D. BUXTON, A. GREIG, M. R. HUTCHINGS, I. McK-ENDRICK, S. RHIND, K. STEVENSON and J. M. SHARP (1999): Evidence of paratuberculosis in fox (Vulpes vulpes) and stoat (Mustela erminea). Vet. Rec. 145, 612613.

4. BEARD P. M., M. J. DANIELS, D. HEN-DERSON, A. PIRIE, K. RUDGE, D. BUXTON, S. RHIND, A. GREIG, M. R. HUTCHINGS, I. McKENDRICK, K. STEVENSON and J. M. SHARP (2001). Paratuberculosis Infection of Nonru-minant Wildlife in Scotland. J. Clin. Microbiol. 39 (4), 1517-1521.

5. BENEDICTUS, G., A. DIJKHUIZEN and J. STELWAGEN (1997): Economic losses due to paratuberculosis in dairy cattle. Vet. Rec. 121, 142-146.

6. CHIODINI, R. J., H. J. VAN KRUININ-GEN, R. S., MERKAL, W. R. THAYER JR. and J. A. COUTU (1984): Characteristics of an unclassified Mycobacterium spe-cies isolated from patients with Crohns disease. J. Clin. Microbiol. 20, 966-971.

7. COELHO, A. C., M. L. PINTO, A. M. COELHO and J. RODRIGUES (2008): Ziehl-Neelsen staining as a fast method in the diagnosis of ovine paratubercu-losis. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 60, 1097-1102.



8. COLLINS, D. M. (1996): Diagnosis of paratuberculosis. In: Sweeney, R. W.: The veterinary clinics of North Ameri-ca-Food animal practice. Paratubercu-losis (Johnes disease): W. B. Sounder Company. Vol. 12, 357-371.

9. COLLINS, M. T., S. J. WELLS, K.S. PE-TRINI, J. E. COLLINS, R. D. SCHULTZ and R. H. WHITLOCK (2005): Evaluati-on of five antibody detection tests for di-agnosis of bovine paratuberculosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12 (6), 685-692.

10. CVETNI, ., M. OCEPEK, S. PI-I, B. HABRUN, M. MITAK i B. KRT (2004): Usporedba razliitih metoda dijagnostike paratuberkuloze u uzgoju mlijenih goveda. Vet. Stanica 35 (1), 5-13.

11. DIEGUEZ F. J., A. M. GONZALEZ, S. MENENDEZ, M. J. VILAR, M. L. SA-NJUAN, E. YUS and I. ARNAIZ (2009): Evaluation of four commercial serum ELISAs for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in dairy cows. Vet. Journal 180, 231-235.

12. FRELIER, P. F., J. W. TEMPLETON, M. ESTES, H. W. WHITFORD and R. D. KIENLE (1990): Genetic regulation of Mycobacterium paratuberculosis infec-tion in recombinant inbred mice. Vet. Pathol. 27, 362-364.

13. GRANT, I. R., E. I. HITCHINGS, A. McCARTNEY, F. FERGUSON and M. T. ROWE (2002): Effect of Commercial-Scale High-Temperature, Short-time Pasteurization on Viability Mycobacte-rium paratuberculosis in Naturally Infec-ted Cows milk. Appl. Environ. Micro-biol. 68 (2), 602-607.

14. GREEN, E. P., M. L. V. TIZARD, M. T. MOSS, J. THOMPSON, D. J. WIN-TERBOURNE, J. J. MCFADDEN and J. HERMON-TAYLOR (1989): Sequen-ce and characteristicss of IS900, an in-sertion element identified in a human Chrons disease isolate of Mycobacteri-um paratuberculosis. Nucleic Acid Res. 17, 9063-9073.

15. GREIG A., K. STEVENSON, D. HEN-

DERSON, V. PEREZ, V. HUGUES, I. PAVLIK, M. E. HINES, I. McKEND-RICK and J. M. SHARP (1999): Epide-miological study of paratuberculosis in wild rabbits in Scotland. J. Clin. Micro-biol. 37, 1746-1751.

16. GREENSTEIN, R. J. and M. T. CO-LLINS (2004): Emerging pathogens: is Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis zoonotic? Lancet 364, 396-397.

17. GWOZDZ, J. M., M. P. REICHEL, A. MURRAY, W. MANKTELOW, D. M. WEST, K. G. THOMPSON (1997): De-tection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in ovine tissues and blood by the polimerase chain reaction. Vet. Microbiol. 51, 233-244.

18. HARRIS, J. E. and A. M. LAMMER-DING (2001): Crohns disease and Mycobacterium avium subsp. paratu-berculosis: current issues. J. Food Prot. 64, 2103-2110.

19. HARRIS, N. B. and R. G. BARLETTA (2001): Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol. Rew., 14 (3), 489-512.

20. HASONOVA, L. and I. PAVLIK (2006): Economic impact of paratuberculosis in dairy cattle herds: a review. Veteri-narni Medicina 51 (5), 193-211.

21. HASONOVA, L., I. TRCKA, V. BABAK, Z. ROZSYPALOVA, R. PRIBYLOVA and I. PAVLIK (2009): Distribution of Mycobacterium avium subsp. paratuber-culosis in tissues of naturally infected cattle as affected by age. Veterinarni Medicina 54 (6), 257-269.

22. HENDRICK, S. H., D. F. KELTON, K. E. LESLIE, K. D. LISSEMORE, M. AR-CHAMBAULT and T. F. DUFFIELD (2005): Effect of paratuberculosis on culling, milk production, and milk quality in dairy herds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 227, 1302-1308.

23. HERMON-TAYLOR, J., T. J. BULL, J. M. SHERIDAN, J. CHENG, M. L. STELLA-KIS and N. SUMAR (2000): Causation of Crohns disease by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.



Can. J. Gastroenterol. 14, 521-539.24. HERTHNEK, D. (2006): Detection and

confirmation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in clinical sam-ples. Licentiate thesis. ISSN 1653-8315, ISBN 91-576-7167-2 Swedish Univer-sity of Agricultural Sciences.

25. JOHNSON-IFEARULUNDU, Y. J. and J. B. KANEENE (1997): Epidemiology and economic impact of subclinical Johnes disease: a review. Vet. Bull. 67, 437-447.

26. JOHNSON-IFEARULUNDU, Y. J., J. B. KANEENE and J. W. LLOYD (1999): Herd level economic analysis of the impact of paratuberculosis on dairy herds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 214, 822-825.

27. JUBB, T. F., E. S. SERGEANT, A. P. CALLINAN and J. GALVIN (2004): Estimate of the sensitivity of an ELISA used to detect Johnes disease in Victo-rian dairy cattle herds. Aust. Vet. J. 82 (9), 569-573.

28. KENNEDY, D. J. and M. B. ALL-WORTH (2000): Progress in national control and assurance programs for bovine Johnes disease in Australia. Vet. Microbiol. 77, 443-451.

29. KOPECNA, M., I. PARMOVA, L. DVORSKA-BARTOSOVA, M. MORAVKOVA, V. BABAK and I. PAV-LIK (2008): Distribution and transmis-sion of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in farmed red deer (Cer-vus elaphus) studied by faecal culture, serology and IS900 RFLP examination. Veterinarni Medicina 53, 510-523. http://www.vri.cz/docs/vetmed/53-9-510.pdf

30. LOMBARD, J. E., F. B. GARRY, B. J. Mc-CLUSKEY and B. A. WAGNER (2005): Risk of removal and effects on milk production associated with paratuber-culosis status in dairy cows. J. Am. Vet. Med. Assoc. 227, 1975-1981.

31. OIE (2008): Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2. 1. 11.

32. OTT, S. L., S. J. WELLS and B. A. WAG-

NER (1999): Herd-level economic loss-es associated with Johnes disease on US dairy operations. Prev. Vet. Med. 40, 179-192.

33. PAVLIK, I., L. MATLOVA, J. BARTL, P. SVASTOVA, L. DVORSKA and R. WHITLOCK (2000): Parallel faecal and organ Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis culture of different pro-ductivity types of cattle. Vet. Microbiol. 77, 309-324.

34. ROUSSEL, A. J., M. C. LIBAL, R. L. WHITLOCK, T. B. HAIRGROVE, K. S. BARLING and J. A. THOMPSON (2005): Prevalence of and risk factors for paratuberculosis in purebred beef cattle. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1, 226 (5), 773-778.

35. SANDERSON, J. D., M. T. MOSS, M. L. TIZARD and J. HERMON TAYLOR (1992): Mycobacterium paratuberculosis DNA in Chrons disease tissue. Gut 33, 890-896.

36. WATERS, W. R., J. M. MILLER, M. V. PALMER, J. R. STABEL, D. E. JONES, K. A. KOISTINEN, E. M. STEADHAM, M. J. HAMILTON, W. C. DAVIS, and J. P. BANNANTINE (2003): Early Induc-tion of Humoral and Cellular Immune Responses during Experimental Myco-bacterium avium subsp. Paratuberculosis Infection of Calves. Infection and Im-munity 71 (9), 5130-5138.

37. WHITLOCK, R. H., S. J. WELLS, R. W. SWEENEY and TIEM J. VAN (2000): ELISA and fecal culture for paratuber-culosis (Johnes disease): sensitivity and specificity of each method. Vet. Microbiol. 77, 387-398.

38. WHITLOCK, R. H., R. W. SWEENY, T. L. FYOCK and J. SMITH (2005): MAP Super- Shedders: another factor in the control of Johnes disease. In: MAN-NING, E. J. B., NIELSEN, S. S. (Eds.), Proceedings of the 8th International Colloyuium on Paratuberculosis. p. 164.

39. WHITTINGTON R. J. and P. A. WIND-SOR (2009): In utero infection of cattle



with Mycobacterium avium subsp. para-tuberculosis: a critical review and meta-analysis. The Veterinary Journal 179, 60-69.

40. WILSON, D. J., C. ROSSITER, H. R. HAN and P. M. SEARS (1993): Associa-

tion of Mycobacterium paratuberculo-sis infection with reduced mastitis, but with decreased milk production and increased cull rate in clinically normal dairy cows. Am. J. Vet. Res. 54 (11), 1851-1857.

Serological, bacteriological and molecular diagnostics of paratuberculosis of domestic animals in the year 2008

Maja ZDELAR-TUK, DVM, Ph.D., Scientific Associate, Silvio PII, DVM, Ph.D., Scientific Associate, Sanja DUVNJAK, Grad. Molecular Biology, Junior Researcher, Ivana RAI, Grad. Molecular Biology, Assistant, eljko CVETNI, DVM, Ph.D., Scientific Advisor, Croatian Veterinary Institute, Zagreb

During the year 2008 in Laboratory for Bacterial Zoonoses different meth-ods were used for paratuberculosis diagnostics. By serological methods (ELISA) the sera of 13782 cattle and 15533 rams and capricorns were anal-ysed. The presence of acid-fast bacilli in fecal smears collected from 33 bulls and 2017 rams and capricorns was in-vestigated using Ziehl-Neelsen stain-ing, and we also cultivated 7 tissue and fecal samples using special media supplemented with mycobactin. Mo-lecular identification of Mycobacte-rium paratuberculosis isolated from

bovine mesenteric lymph nodes was performed by PCR.

Paratuberculosis is not a burning problem in the Republic of Croatia, although it causes enormous eco-nomic losses to the livestock industry throughout the world. Diagnostics of paratuberculosis is complex and there is not a unique scheme of control and suppression of the disease. Therefore, to control the spread of paratubercu-losis in cattle industry, it is needed to carry out continuous measures with the purpose of quick disease diagnos-tics and prevention of its spreading.

BILJEKE

VETERINARSKA KOLA U ZAGREBU. Njegovo kraljevsko Visoanstvo nasljednik prijestolja propisao je ukazom od 31. kolovoza 0.g. uredbu 0 us-trojenju veterinarske visoke kole u Zagrebu.

Novo doba (Vukovar), 99, 4, 1919 (god. 2) (l. listopada 1919.).



273

Utjecaj gravidnosti i laktacije na promjene metabolikog statusa u mlijenih krava

Opskrbljenost energijom tijekom prijelaznog perioda izmeu kasne gravidnosti i poetka laktacije (tri tjed-na prije poroda i tri tjedna nakon po-roda) predstavlja vanu komponentu u odravanju zdravlja i reprodukcijske sposobnosti mlijenih krava (Doepel i sur., 2002.). Tijekom kasne gravidnosti poveavaju se potrebe fetusa za gluko-zom i aminokiselinama, to zahtijeva prilagodbu majinog metabolizma na te fizioloke promjene. Nakon poroda poveavaju se potrebe mlijene lijezde za glukozom, aminokiselinama i mas-nim kiselinama u svrhu sinteze laktoze, proteina i triglicerida mlijeka to ini nutritivne zahtjeve jo izraenijim (Bell, 1995.). Takvi se energetski zahtjevi teko mogu zadovoljiti unosom hrane,

stoga moe doi do neravnotee iz-meu unosa energije hranom i uku-pnih energetskih zahtjeva, tj. do nas-tanka negativnog energetskog stanja. Razvoju negativnog energetskog stanja osobito su sklone mlijene krave koje su prekomjerno hranjene u suhostaju, te nakon poroda imaju smanjen apetit i stoga hranom unose manju koliinu energije (Rukkwamusk i sur., 1999.a).

Sredinju ulogu u uspostavljanju stanja energetske ravnotee imaju pro-cesi metabolike prilagodbe koji se uglavnom odvijaju u jetri i masnom tkivu, ali i u miiima (Herdt, 2000.). Oni obuhvaaju poveanje glukoneo-geneze u jetri iz endogenih supstrata, smanjenje iskoritavanja glukoze u per-ifernim tkivima, smanjenje lipoge neze i

Mario Cikojevi, Stjepko ermak i Romana Turk

Mario CIKOJEVI i Stjepko ERMAK, apsolventi Veterinarskog fakulteta Zagreb; dr. sc. Romana TURK, znanstvena suradnica, Veterinarski fakultet Zagreb

Uvod

MARIo CIKojEVI, STjEpKo ERMAK I RoMANA TuRK


poveanje mobilizacije masnih kiselina iz masnog tkiva te eventualno poveanje mobilizacije aminokiselina iz miia u razdoblju krajem gravidnosti (Drackley, 1999.). Te se promjene nastavljaju ti-jekom puerperija i rane laktacije i bivaju jo izraenije, budui da su energetski zahtjevi u tom razdoblju nekoliko puta vei nego krajem gravidnosti (Bell, 1995.). Lipoliza dovodi do poveane koncentracije slobodnih masnih kise-lina u krvi, koje se u jetri esterificiraju u trigliceride, a zatim se iz jetre trans-portiraju u obliku lipoproteina vrlo ni-ske gustoe, VLDL (engl. Very low den-sity lipoproteins) (Drackley, 1999.). U ranoj laktaciji kod krava s energetskim manjkom kapacitet jetre za odravanje ravnotee izmeu izluivanja trigliceri-da u obliku VLDL-a i endogene sinteze triglicerida nije uvijek dostatan. Triglic-eridi se nakupljaju u jetri to dovodi do masne infiltracije jetre. Nemogunost potpune metabolike prilagodbe na energetski manjak moe tako uzroko-vati metabolike bolesti (masna infil-tracija jetre, ketoza, poroajna pareza), zarazne bolesti (mastitis) te reproduk-cijske poremeaje (zaostajanje postelji-ce, smanjena plodnost), (Rukkwa-musk i sur., 1999.b). Ovakva se stanja mogu oitovati klinikim simptomima naruenog opeg zdravlja ivotinja ili pak subklinikim tijekom to kasnije dovodi do smanjene plodnosti i proiz-vodnje. Stoga odreivanje pokazatelja metabolikog statusa i njihova pravilna interpretacija imaju veliku vanost u praenju zdravlja i reprodukcijskog sta-tusa krava.

Cilj ovog rada je bio istraiti poka-zatelje metabolikog statusa, tj. koncen-

traciju glukoze, triglicerida, kolestero-la, ureje, kreatinina i mokrane kiseline u serumu mlijenih krava tijekom grav-idnosti i laktacije s posebnim osvrtom na metabolizam tijekom prijelaznog perioda izmeu kasne gravidnosti i rane laktacije.

Materijal i metode

ivotinje i uzorci krviNa podruju sjeverozapadne i is tone

Hrvatske u istraivanje je ukljueno ukupno 187 mlijenih krava holstein-frizijske i simentalske pasmine koje su bile u razliitim razdobljima reproduk-cijskog ciklusa te smo ih podijelili u est skupina i to: 1) gravidnost do 3 mjeseca (n=38), 2) gravidnost 3-5 mjeseci (n=16), 3) gravidnost 6-8 mjeseci (n=36), 4) gravidnost 9 mjeseci (n=12), 5) puer-perij 10-15 dana (n=21), 6) srednja lak-tacija (6-10 tjedana).

Uzorke krvi uzimali smo Vacutainer

sistemom iz v. jugularis u epruvete bez antikoagulansa te ih 15 minuta centrifu-girali pri 3.000 okr/min. Serume odvojene od ugruka pohranili smo u zamrziva na 20 C do izvoenja analiza.

Odreivanje metabolikog statusa

Koncentraciju glukoze odreivali smo GOD-PAP metodom uporabom oksid-aze glukoze i peroksidaze (Boeringer Mannheim Diagnostica, Mannheim, Nje maka).

Koncentraciju triglicerida u serumu odreivali smo GPO-PAP metodom s



oksidazom glicerol-fosfata (Herbos Di-jagnostika, Sisak, Hrvatska), a koncen-traciju ukupnog kolesterola u serumu smo odreivali CHOD-PAP metodom (Herbos Dijagnostika, Sisak, Hrvatska).

Koncentraciju ureje u serumu odreivali smo metodom kontinu-iranog mjerenja uz prisutnost ureaze (Herbos Dijagnostika, Sisak, Hrvatska).

Koncentracija kreatinina odreena je kolorimetrijskom metodom s pi-krinskom kiselinom (Herbos Dijagnos-tika, Sisak, Hrvatska), a koncentracija mokrane kiseline kolorenzimskom metodom uz urikazu i peroksidazu (Herbos Dijagnostika, Sisak, Hrvatska). Sva su odreivanja provedena na au-tomatskom analizatoru Technicon RA-1000.

Statistika obrada podatakaStatistiki znaajna razliitost iz me-

u skupina izraunata je pomou Tukey HSD testa, a vrijednosti P



osam mjeseci (114,4 mol/L) i tijekom devetog mjeseca gravidnosti (121,4 mol/L) nego u prvom tromjeseju gravidnosti (99,5 mol/L). Najnia kon-centracija kreatinina izmjerena je u pu-erperiju (88,4 mol/L) i bila je statistiki znaajno manja od koncentracije u sku-pini krava gravidnih izmeu tri i pet mjeseci (112,6 mol/L), onih gravid-nih izmeu est i osam mjeseci (114,4 mol/L), krava gravidnih devet mjeseci (121,4 mol/L) te oteljenih krava u srednjoj laktaciji (110,2 mol/L).

Koncentracija mokrane kiseli ne je bi-la statistiki znaajno manja u krava grav-idnih izmeu est i osam mjeseci (56,0 mol/L) nego u prvom tromjeseju

gravidnosti (75,6 mol/L). Izmeu os-talih skupina ivotinja koncentracija mokrane kiseline nije se statistiki znaajno razlikovala.

RaspravaPrijelazni period izmeu kasne

gravidnosti i rane laktacije predstav-lja fazu katabolizma usmjerenog na pripremu za porod i poetak laktacije (Drackley i sur., 2005.). Intenzivni tijek metabolizma u tom razdoblju oituje se promjenama koncentracija metabolita u krvi, osobito promjenama koncen-tracija lipidnih sastojaka krvi (Rukkwa-musk i sur., 1999.a).

Tablica 1. Srednje vrijednosti (SD) koncentracije glukoze, triglicerida, kolesterola, ureje, kreatinina i mokrane kiseline u serumu krava tijekom reprodukcijskog ciklusa

Gravidnost

Puerperij (P)

Srednja lak-tacija

(L)

do 3 mjese-ca (G1)

3-5 mje-seci(G2)

6-8 mjeseci(G3)

9 mjeseci(G4)

Glukoza (mmol/L) 4,72,0 4,81,2 3,60,9

*G1 3,91,3 3,21,5*G1,G2 4,81,3*p

Trigliceridi (mmol/L) 0,200,08 0,200,06 0,260,11

*G1,P 0,300,07*G2,P 0,080,03*G1,G2,G3,G4 0,230,09*P

Kolesterol (mmol/L) 5,01,5 4,71,2 3,50,7

*G1 3,20,6*G1,G2 2,40,5*G1,G2,G3 4,91,5*G3,G4,P

Urea(mmol/L) 4,42,0 3,22,0 3,91,6 4,62,0 5,11,8

*G2 3,20,7*P

Kreatinin(mol/L) 99,5 18,7 112,62,0 114,417,5

*G1 121,421,9*G1 88,411,8*G2,G3,G4 110,220,3*P

Mokrana kiselina (mol/L)

75,631,9 65,222,3 56,019,1*G1 67,836,1 63,78,0 58,117,0

*statistiki znaajna razlika prema naznaenoj skupini (P



Zbog velikih energetskih zahtje-va u prijelaznom periodu dolazi do znaajnog pada koncentracije glukoze. U ovom je radu koncentracija glukoze bila statistiki znaajno manja u seru-mu krava krajem gravidnosti i tijekom puerperija to je u skladu s nalazima drugih autora koji takoer navode smanjenu koncentraciju glukoze u se-rumu tijekom rane laktacije, to je odraz poveanih zahtjeva fetusa i mlijene lijezde za glukozom. To rezultira ener-getskim manjkom koji ima za posljedi-cu mobilizaciju tjelesnih rezervi masti i razvoj masne infiltracije jetre (Baird, 1982., Reid i Roberts, 1983., Reid, 1986., Vazquez-Anon i sur., 1994.). Zbog nes-razmjera izmeu ulaska masnih kise-lina u jetru i izluivanja triglicerida u obliku lipoproteina koliina triglicerida se u jetri poveava neposredno poslije poroda, dok se koncentracije triglic-erida i kolesterola u serumu naglo smanjuju (Mazur i sur., 1988., Marcos i sur., 1990., Grummer, 1993.). U skladu s ovim spoznajama su i rezultati naeg istraivanja, koji pokazuju porast kon-centracije triglicerida u serumu tijekom gravidnosti i nagli pad nakon poroda, odnosno u ranoj laktaciji to takoer navode Marcos i sur. (1990.) i Turk i sur. (2005.). Poveana koncentracija tri-glicerida pri kraju gravidnosti mogla bi biti rezultat smanjene razgradnje i/ili prekomjerne sinteze triglicerida u tom razdoblju (Marcos i sur., 1990.). Koncentracija kolesterola u serumu istraenih mlijenih krava pokazivala je trend smanjivanja tijekom gravidnosti te osobito u puerperiju, da bi u razdo-blju srednje laktacije imala vrijednosti kao i na poetku gravidnosti. Ponovno

je poveanje koncentracije kolesterola i triglicerida u kasnijoj laktaciji takoer naeno u drugim istraivanjima (Pysera i Opalka, 2000.,Turk i sur., 2004., Turk i sur., 2008.a., 2008.b.). Koncentracija ureje je bila znaajno vea u puerperi-ju, dok je u razdoblju srednje laktacije ponovno bila znaajno manja nego u puerperiju to su takoer utvrdili Loor i sur. (2005.). Razlog tome je to se ti-jekom negativnog energetskog balansa mobiliziraju i proteini skeletnog miija kao izvor aminokiselina potrebnih za glukoneogenezu u jetri i metabolizam u mlijenoj lijezdi (Herdt, 2000.). Vea koncentracija ureje ima tetan utjecaj na plodnost djelujui tetno na razvoj jajne stanice, proces oplodnje i razvoj embri-ja (Jorritsma i sur., 2003., Rhoads i sur., 2006.). Vea koncentracija kreatinina u serumu krava krajem gravidnosti u naem istraivanju moe biti isto tako posljedica pojaanih katabolikih pro-cesa miia krave budui da je kreat-inin produkt endogenog metabolizma miia (Castillo i sur., 2005.). Mokrana kiselina je prisutna u krvnoj plazmi kao vaan antioksidans (Miller i sur., 1993.) i njezina je koncentracija u naem radu bila smanjena krajem gravidnosti ukazujui na poveanu koliinu slo-bodnih radikala koji se stvaraju tijekom procesa metabolike prilagodbe na manjak energije.

Rezultati ovog rada su pokazali promjene koncentracija metabolita u krvi kao odraz procesa metabolike prilagodbe u jetri, masnom tkivu i miiima u prijelaznom razdoblju to moe imati tetne posljedice na zdravlje i reprodukciju krava u kasni-joj laktaciji. Stoga odreivanje poka-



zatelja metabolikog statusa, njihova pravilna interpretacija i razumijevanje patofiziolokih procesa ukljuenih u metaboliku prilagodbu na nedostatak energije ima veliku vanost u praenju zdravlja i reprodukcijske sposobnosti krava da bi se sprijeile posljedice u kasnijoj laktaciji i ekonomski gubici u proizvodnji.

SaetakManjak energije koji se esto javlja u

razdoblju kasne gravidnosti i rane lak-tacije moe dovesti do metabolikih i reprodukcijskih poremeaja. Biolokim procesima metabolike prilagodbe na manjak energije dolazi do interak-cije metabolike energije u razliitim tkivima kao to su jetra, masno tkivo i miii. Stoga je cilj ovog rada bio istraiti pokazatelje metabolikog sta-tusa u serumu krava tijekom gravid-nosti i laktacije tj. koncentraciju glu-koze, triglicerida, kolesterola, ureje, kreatinina i mokrane kiseline s poseb-nim osvrtom na metabolizam tijekom prijelaznog razdoblja izmeu kasne gravidnosti i rane laktacije. Koncen-tracija glukoze bila je znaajno manja (P



5. DRACKLEY, J. K. (1999): Biology of dairy cows during transition period: the final frontier? J. Dairy Sci. 82, 2259-2273.

6. DRACKLEY, J. K., H. M. DANN, G. N. DOUGLAS, N. A. J. GURETZKY, N. B. LITHERLAND, J. P. UNDERWOOD and J. J. LOOR (2005): Physiological and pathological adaptation in dairy cows that may increase susceptibility to periparturient diseases and disor-ders. Ital. J. Anim. Sci. 4, 323-344.

7. GRUMMER, R. R. (1993): Etiology of lipid-related metabolic disorders in periparurient dairy cows. J. Dairy Sci. 76, 3882-3896.

8. HERDT, T. H. (2000): Ruminant adap-tation to negative energy balance: In-fluences on the etiology of ketosis and fatty liver. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 16, 215-231.

9. JORRITSMA, R., T. WENSING, T. A. M. KRUIP, P. L. A. M. VOS and J. P. T. M. NOORDHUIZEN (2003): Metabolic changes in early lactation and impaired reproductive performance in dairy cows. Vet. Res. 34, 11-36.

10. LOOR, J. J., H. M. DANN, R. E. EVERTS, R. OLIVEIRA, C. A. GREEN, N. A. J. GURETZKY, S. L. RODRIGUEZ-ZAS, H. A. LEWIN and J. K. DRACKLEY (2005): Temporal gene expression pro-filing of liver from periparturient dairy cows reveals complex adaptive mecha-nisms in hepatic function. Physiol. Ge-nomics 23, 217-226.

11. MARCOS, E., A. MAZUR, P. CARDOT and Y. RAYSSIGUIER (1990): The effect of pregnancy and lactation on serum lipid and apolipoprotein B and A-I levels in dairy cows. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 64, 133-138.

12. MAZUR, A., E. GUEUX, Y. CHILL-IARD and Y. RAYSSIGUIER (1988): Changes in plasma lipoproteins and liver fat content in dairy cows during early lactation. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 59, 233-237.

13. MILLER, J. K., E. BRZEZINSKA-SLE-BODZINSKA and F. C. MADSEN (1993):

Oxidative stress, antioxidants and ani-mal function. Symposium: Antioxidants, immune response and animal function. J. Dairy Sci. 76, 2812-2823.

14. PYSERA, B. and A. OPALKA (2000): The effect of gestation and lactation of dairy cows on lipid and lipoprotein patterns and composition in serum during winter and summer feeding. J. Anim. Feed Sci. 9, 411-424.

15. REID, I. M. (1986): Diagnosis of fatty liver in dairy cows. Isr. J. Vet. Med. 42, 399-403.

16. REID, I. M. and C. J. ROBERTS (1983): Subclinical fatty liver in dairy cows current research and future prospects. Irish Vet. J. 37, 104-110.

17. RHOADS, M. L., R. P. RHOADS, R. O. GILBERT, R. TOOLE and W. R. BUT-LER (2006): Detrimental effects of high plasma urea nitrogen levels on viability of embryos from lactating dairy cows. Anim. Reprod. Sci. 91, 1-10.

18. RUKKWAMSUK, T., T. A. M. KRUIP and T. WENSING (1999a): Relation-ship between overfeeding and over-conditioning in the problems of high producing dairy cows during the post-parturient period. Vet. Quart. 21, 71-77.

19. RUKKWAMSUK, T., T. WENSING and T. A. M. KRUIP (1999b): Relationship between triaylglycerol concentracion in the liver and first ovulation in post-partum dairy cows. Theriogenology 51, 1133-1142.

20. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, N. TURK, B. REKI, V. SIMEON-RU-DOLF and A. SVETINA (2004): Serum paraoxonase activity and lipid param-eters in the early postpartum period of dairy cows. Res. Vet. Sci. 76, 57-61.

21. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, N. TURK, B. REKI, V. SIMEON-RU-DOLF, M. ROBI and A. SVETINA (2005): Serum paraoxonase activity in dairy cows during pregnancy. Res. Vet. Sci. 79, 15-18.

22. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, G. BAI, M. MILEEVI, Z. FLEGAR-



METRI, N. TURK and A. SVETINA (2008a): Bovine platelet-activating fac-tor acetylhydrolase (PAF-AH) activity related to fertility. Anim. Reprod. Sci. 105, 344-353.

23. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, A. SVETINA, N. TURK and Z. FLEGAR-METRI (2008b): Influence of oxida-tive stress and metabolic adaptation on

PON1 activity and MDA level in tran-sition dairy cows. Anim. Reprod. Sci. 108, 98-106.

24. VAZQUEZ-AON, M., S. BARTICS, M. LUCK, R. R. GRUMMER and J. PINHEIRO (1994): Peripartum liver triglyceride and plasma metabolites in dairy cows. J. Dairy Sci. 77, 1521-1528.

Influence of Pregnancy and Lactation on Metabolic Status in Dairy Cows

Mario CIKOJEVI and Stjepko ERMAK, final year students; Romana TURK, Ph.D., Scientific Associate, Faculty of Veterinary Medicine, Zagreb

Energy deficit that often occurs in late pregnancy and early lactation could lead to metabolic and reproduc-tive disorders. Biological processes of metabolic adaptation to negative en-ergy balance involve interactions of metabolic fuels taking place in various tissues like liver, adipose tissue and skeletal muscles. The objective of this study was to investigate the metabolic status of cows during pregnancy and lactation, i. e. the serum concentrations of glucose, triglyceride, cholesterol, urea, creatinine and uric acid. A sig-nificantly lower glucose concentration (P


PREGLEDNI LANAK

281

Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -gluka-na primjenjivog u biotehnologiji i biomediciniVlatka Petravi-Tominac, Vesna Zechner-Krpan, S. Sreec, B. antek,D. poljari, H. Valpoti, Maja Popovi i I. Valpoti

Dr. sc. Vlatka PETRAVI-TOMINAC, dipl. in. biotehnol., via asistentica., dr. sc. Vesna ZECH-NER-KRPAN, dipl. in. biotehnol., izv. prof., dr. sc. Boidar ANTEK, dipl. in. biotehnol., red. prof., Prehrambeno-biotehnoloki fakultet Zagreb; dr. sc Sinia SREEC, dipl. in., prof. visoke kole, Visoko gospodarsko uilite u Krievcima, Daniel POLJARI, dr. vet. med, asistent, dr. sc. Hrvoje VALPOTI, dr. vet. med, vii asistent, dr. sc. Maja POPOVI, dr. vet. med., izv. prof., dr. sc. Ivica VALPOTI, dipl. in. biol., red. prof., Veterinarski fakultet Zagreb

UvodPredmet su ovoga rada -glukani,

a njihove se bioloke aktivnosti meusobno razlikuju ovisno o ke-mijskoj strukturi, izvoru iz kojeg su izolirani i o primijenjenoj metodi izo-lacije. -glukani su polimeri glukoze (-glukopiranoze) u kojima su glu-kozne jedinice povezane glikozidnim vezama izmeu hemiacetalnog kisika na C-1 atomu jednog monosaharidnog ostatka i jedne od etiriju hidroksilnih skupina vezanih na C-2, C-3, C-4 ili C-6 atomu drugog monosaharidnog ostatka (Stone i Clarke, 1992.). Ovi spojevi mogu biti a i konfiguracije. Primjeri razliitih -glukana, izoliranih iz razliitih izvora (bakterija, kvasaca,

algi, gljiva i viih biljaka), prikazani su u tablici 1.

Pored primjena razliitih -glukana u medicini i farmaciji, mogua je i nji-hova primjena u prehrambenoj (Wylie-Rosett, 2002., Thammakiti i sur., 2004.) i kozmetikoj industriji (Pillai i sur., 2005.). Mogu se koristiti i u veterinar-skoj medicini i u proizvodnji krmiva (Wheatcroft i sur., 2002.) to je i pred-met zanimanja ovog lanka.

Najee spominjano svojstvo -glukana je imunostimulacija. Broj razliitih -glukana je veliki skoro kao i broj izvora koritenih za njihovu izo-laciju, a unato brojnim istraivanjima nemogue je rei da je samo jedan

VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK, d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI


odreeni glukan optimalni imunomod-ulator (Vetvicka, 2001.). Prema nekim autorima, najaktivniji su razgranati -1,3-D-glukani, koji se ponekad na-zivaju (13),(16)--D-glukani, a u literaturi se zbog jednostavnosti esto navode samo kao (13)--glukani. Svi oni imaju zajedniku strukturu, a to je glavni lanac, koji se sastoji od (13)-povezanih -D-glukopiranozil jedinica, uzdu kojega su nasumce smjetene -D-glukopiranozil jedinice vezane 16-vezama. Zbog toga imaju strukturu nalik na ealj, ali strukture i konformacije ovih polimera variraju, kao i njihove aktivnosti (Bohn i BeMi-ller, 1995.).

Mehanizam djelovanja -1,3-glu-kana jo uvijek nije potpuno rasvijetljen i postoje razliita miljenja o struk-turi molekule potrebnoj za postizanje fiziolokog uinka (Tokunaka i sur., 2000.). Za bioloku aktivnost ove sku-pine spojeva vani su razliiti fizikalno-kemijski imbenici kao to su primarna struktura, molna masa, razgranatost, konformacija, naboj polimera, toplji-vost, dimenzije estica netopljivih -glukana (Tzianabos, 2000., Vetvicka, 2001., Hromdkov i sur., 2003.). Jo uvijek nije dovoljno razjanjeno koja je struktura potrebna za bioloku ak-tivnost -glukana. Neki autori navode da je trostruka uzvojnica bioloki naj-aktivnija konformacija (Bohn i BeMi-ller, 1995., Ha i sur., 2002.), dok drugi smatraju da struktura uzvojnice nema nikakvog utjecaja na aktivnost (Kulicke i sur., 1997.).

U ovom radu posebna je panja posveena primjeni iskoritenog piv-skog kvasca kao sirovine za proizvod-

nju -glukana i njegovih derivata. U veini hrvatskih pivovara najvei dio iskoritenog pivskog kvasca, zaostalog nakon proizvodnje piva, isputa se u ot-padne vode to dovodi do oneienja prirodnih vodotokova organskim ma-terijalom. Primjena je pivskog kvasca kao krmiva na granici rentabilnosti. Is-tovremeno mnogi sastojci njegove bio-mase, meu kojima je i -glukan, mogu postii viu cijenu od samog kvasca. Osim izravne primjene u raznim podrujima, izolirani se -glukan moe preraditi i u druge proizvode koji imaju veliku komercijalnu vrijednost.

Bioloka aktivnost razliitih -glukanaObjavljen je niz radova o -glu-

kanima i njihovim derivatima koji se spominju kao komercijalno i kliniki zanimljivi pripravci s brojnim mogunostima medicinske primjene (Gardiner, 2000., Gardiner i Carter, 2000., Tzianabos i sur., 2000., Vetvicka, 2001., Zekovi i sur., 2005.). Bioloke aktivnosti -glukana su ukratko prika-zane u tablici 2.

Prema procjeni Svjetske zdravst-vene organizacije (engl. World Health Organisation, WHO) zbog oekivanog produljenja ivotnog vijeka, ali i poveanja zagaenja okolia, tijekom sljedea dva desetljea oekuju se epi-demijski razmjeri porasta uestalosti malignih kao i drugih civilizacijskih bolesti (Kath i Kulicke, 1999.). injenica je da brojni stresovi, kao i nezdrava prehrana slabe imunosni sustav to pogoduje nastanku bolesti. Stoga se sve vie istrauju djelatne tvari koje mogu modificirati tjelesne obrambene mehanizme, a takve tvari farmakoloki

Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini


su klasificirane kao imunomodulatori ili modifikatori biolokog odgovora (engl. biological response modifiers, BRMs). U ovu skupinu spojeva spadaju i -glukani (Tokunaka i sur., 2000., Tzianabos i sur., 2000.).

Mehanizam djelovanja -(13)-glukana je poveanje imunokompe-tencije domaina putem sistemske aktivacije imunolokog sustava ime se pojaavaju nespecifini obrambeni mehanizmi domaina. Time se ujedno postie alternativni uinak neklinikoj uporabi antibiotika. Ovo je osobito vano obzirom na porast broja bak-terija rezistentnih na odreene anti-biotike (Walsh i Fanning, 2008., Bar-ton, 2000.) te na rezidualne antibiotike prisutne u hrani (Cerniglia i Kotarski, 1999.). Budui da je u Europskoj Uniji od sijenja 2006. godine zabranjeno koritenje antibiotskih promotora ras-ta u uzgoju ivotinja postoji potreba za adekvatnom zamjenom koja e osigurati visoku proizvodnost i dobro zdravstveno stanje.

Mnoga su istraivanja pokazala postojanje jake imunostimulacijske aktivnosti -glukana njegovom prim-jenom kod velikog broja razliitih orga-nizama, ukljuujui insekte (Chen i sur., 1999., Wilson i sur., 1999., Ma i Kanost, 2000.), gujavice (Vetvicka, 2001.), ribe (Cook i sur., 2003.), rakove (Suphan-tharika i sur., 2003.), pilie, mieve, takore, kunie, zamorie, ovce, svinje i goveda (Vetvicka, 2001.), a i ovjeka (Keller, 2000., Gardiner, 2000., Gardiner i Carter, 2000., Vetvicka, 2001., Brown i Gordon, 2003.). Veina eksperimental-nih podataka dobivena je istraivanjem razliitih ivotinjskih modela, dok

se o imunostimulaciji -glukanom u ovjeka zna relativno malo (Vetvicka, 2001.).

Sposobnost reguliranja imuno lo-kog sustava smatra se najvanijom biolokom aktivnou -glukana, bu-dui da je s ovom aktivnou usko povezana veina njegovih uinaka (Gardiner, 2000., Gardiner i Carter, 2000.). Kao objanjenje imunoregulacije -glukanom najee se spominje nje-gov utjecaj na makrofage. Makrofagi zapoinju i reguliraju imu noloke pro-cese, ili izravno fagocitozom ili neiz-ravno tako to prikazuju epitope an-tigena na vlastitoj povrini kako bi se mogli vezati T i B-limfociti koji potiu efektorsku reakciju, ovisno o vrsti pri-kazanog antigena (Keller, 2000.).

U literaturi je opisano vie naina primjene -glukana. Pripravci se glu-kana u veterinarskoj i humanoj upora-bi mogu primijeniti potkono, oralno, intranazalno ili parenteralno (Wheat-croft i sur., 2002.). Oralna primjena je svakako zanimljiva zbog svoje praktinosti i mogunosti tretmana u mnotvenoj proizvodnji. Pri oralnoj primjeni -1,3-glukan ne podlijee promjenama u elucu jer je otporan na kiselinu, a osim toga u crijevima nema enzima za njegovu razgradnju u monosaharide ili disaharide koji bi se mogli apsorbirati kroz crijevne sti-jenke. S druge strane, makrofagi koji se nalaze u crijevnoj sluznici imaju odgovarajue receptore i mogu vezati estice -1,3-glukana, nakon ega sli-jedi aktivacija ovih stanica. Kasnije makrofagi migriraju do Payerovih ploa, izluuju citokine i tako induci-raju imunosnu reakciju.



Primjenom -1,3-glukana znatno se poveava proliferacija makrofaga, fagocitoza i sekrecija protupalnih ci-tokina i to podjednako u ivotinja i ovjeka. Makrofagi osoba koje su primile -1,3-glukan pokazali su bolju citolitiku aktivnost prema stanicama tumora u odnosu na osobe koje nisu tretirane (Keller, 2000.).

Zahvaljujui stimulaciji imunosnog sustava, -1,3-glukan ima antiinfekcij-ski uinak i pokazuje antimikrobno djelovanje prema razliitim patogenim mikroorganizmima (bakterijama, kvas-cima i virusima) kao to je prikazano u tablici 3. Osim preventivne funkcije, -glukani mogu usporiti tijek ve ranije uznapredovalih infekcija te smanjiti rizik od postoperativnih infekcija (Kim i sur., 2006.).

Postoji sinergistiko djelovanje -glu-kana s antibioticima te je njegovom primjenom mogue smanjiti potrebnu koliinu konvencionalnih antibio-tika. U kombinaciji s uobiajenim an-tibioticima -glukan se moe koris-titi u lijeenju niza bolesti (Vetvicka i sur., 2002.). Takoer je dokazano sinergistiko djelovanje -glukana s antifungalnim lijekovima (Ber, 1997., Gardiner, 2000.).

-1,3-glukan se moe koristiti i kao adjuvant u kombinaciji s antiinfek-tivnim i antineoplastinim agensima, radioterapijom, pripravcima koji se primjenjuju povrinski i raznim nutri-jentima (Ber, 1997.). Bioloku aktivnost imaju ne samo topljivi, ve i netopljivi -glukani (Vetvicka, 2001.). Netopljivi -glukani mogu posluiti kao sirovine za razliite postupke derivatizacije, ime se dobivaju topljivi derivati po-

godniji za neke oblike primjene (Wil-liams i sur., 1992.). Mogua je i imu-nostimulacija primjenom netopljivih pripravaka -glukana (Hunter, 2002.), pri emu je tijekom proizvodnje vano postii male dimenzije estica prip-ravka, koje odgovaraju dimenzijama odgovarajuih receptora. Aglomeri-ranje estica netopljivog -glukana takoer moe nepovoljno utjecati na njegovu aktivnost (Hunter, 2002.). Sto-ga je pri definiranju fizikalno-kemijskih svojstava pojedinih netopljivih prip-ravaka potrebno istraiti i raspodjelu estica po veliini. Dimenzije i mikros-kopska morfologija estica -glukana ovise o tehnolokim postupcima primi-jenjenim tijekom izolacije te odabranoj metodi i tehnolokim parametrima suenja i usitnjavanja (Hunter, 2002., Hromdkov i sur., 2003.).

Primjena u veterinarskoj medicini i proizvodnji krmiva

S obzirom da -glukan djeluje na brojne vrste (Vetvicka, 2001.) vano podruje primjene stoga moe biti i na tritu dodataka krmivima i veterinar-skih lijekova koji se rabe za gospodar-ski znaajne vrste domaih ivotinja.

Prilikom intenzivnog uzgoja pe-radi, goveda, riba i rakova uporabom -glukana kao aditiva u krmivima sma njuje se pojava infekcija, ime se poboljava rast i smanjuje potreba za do-datkom antibiotika (Keller, 2000., Hayen i Pollmann, 2001., Wheatcroft i sur., 2002.).

Istraivanja tvari koje nespecifino djeluju na imunoreakcije postaju sve



znaajnija i sa stajalita veterinarske med-icine. Sve vie se komercijalno vanih ivotinja uzgaja u stresnim uvjetima i poticanje njihovog imuniteta komercijal-nim imunostimulansima mo e izrazito smanjiti smrtnost induciranu bolestima vezanim uz stres.

U ivotinja, glukani su testirani ne samo kao specifini stimulansi, ve i kao dodatak trenutno koritenim cje-pivima (Vetvicka, 2001.). Nikl i All-bright (1993.) su opisali mogunost stimulacije imunolokog sustava riba iz porodice Salmonidae i pojaavanja

Slika 1. Kemijska struktura -glukana u kvascu Saccharomyces cerevisiae (Izvor: Kath i Kulicke, 1999.)

Slika 2. Sastav i struktura stanine stijenke kvasca Saccharomyces cerevisiae (Izvor: Osumi, 1998.)



djelovanja cjepiva -glukanima izoli-ranim iz viih gljiva (skleroglukanom i izofilanom) koji su sadravali -1,3-vezan glavni lanac i -1,6-vezanu glu-kozu. Ova dva spomenuta topljiva glukana izolirani su iz gljive roda Scle-rotium, odnosno gljive Schyzophyllum commune (hrv. obina dvolisnica) po kojima su i dobili trivijalne nazive.

Imunoloki uinci izofilana omo-guuju zatitu od bakterijskih infekcija u ivotinja, streptokoknih infekcija u riba i Sendai virusne infekcije u mieva (Bohn i BeMiller, 1995.).

Opisana je primjena -glukana u kombinaciji s vitaminima, u cilju poboljanja otpornosti vodenih ivo-tinja (riba, rakova i beskraljenjaka) te toplovodnih i hladnovodnih dekora-tivnih riba (Krzinger, 2001.).

Cook i sur. (2003.) su opisali pri-mjenu komercijalnog imunostimulacij-skog pripravka EcoActivaTM, izoliranog iz kvasca Saccharomyces cerevisiae. Pri-pravak je sadravao glukan i manan, a prosjena veliina estica bila je manja od 1 m. Dodatkom ovog pripravka peletima hrane koritene u prehrani

Stanine stijenke kvasca (oko 20% s.tv.)

ALKALNA IZOLACIJA

Pranje vodom

KISELINSKA IZOLACIJA

Pranje vodom

UKLANJANJEMANOPROTEINA

Pranje vodom

Slika 3. Shema postupaka izolacije -glukana iz iskoritenog pivskog kvasca

VLANI PREPARAT A

VLANI PREPARAT AK

VLANI PREPARAT AKM



riba vrste Pagrus auratus postignut je utjecaj na parametre nespecifinog imuniteta i brzinu rasta, to sugerira prednost rutinskog dodavanja ovog pripravka u riblju hranu.

Hayen i Pollmann (2001.) navode mogunost oralne primjene -glukana, izoliranog iz kvasca, kao komponen-te krmiva u svrhu poveanja rasta i-votinja.

Opisano je protektivno i anti-in-fektivno djelovanje kvaevog neto-pljivog -glukana, istraeno in vivo u mievima koji su zaraeni antraksom (Vetvicka i sur., 2002.). Oralnom prim-jenom doza od 2 i 20 mg/kg, bez upor-abe drugih lijekova, postignuto je 100% preivljavanje tijekom 10 dana, dok je u kontrolnoj skupini smrtnost bila 50%.

Izolacija -glukana iz bio-mase iskoritenog pivskog kvasca

Stanine stijenke kvasca Saccharomy-ces cerevisiae jedan su od najeih iz-vora (13),(16)--D-glukana. Cije la stanina stijenka kvasca Saccharomyces cerevisiae sadri 85-90% polisaharida i 10-15% bjelanevina (Hong i sur., 1994., Nguyen i sur., 1998.). Polisaharidni dio stanine stijenke ine manan koji je topljiv u vodi, alkalno-topljivi glu-kan, alkalno-netopljivi glukan i male koliine hitina (Klis, 1997.). Glukanska komponenta stanine stijenke kvasca esto se naziva samo glukan ili kvaev glukan (engl. yeast glucan). Kemijska struktura glukana u kvascu Saccharo-myces cerevisiae prikazana je slikom 1, dok slika 2 prikazuje sastav i strukturu

stanine stijenke ovog kvasca (Osumi, 1998.).

Kada se govori o izolaciji -glukana iz kvasaca, kao sirovina se prvenst-veno spominje pekarski kvasac Sac-charomyces cerevisiae (Bohn i BeMiller, 1995., andula i sur., 1995., Ber, 1997., Ohno i sur., 1999., andula i sur., 1999., Ueno, 2000., Hunter i sur., 2002., Jordan i sur., 2002., Aguilar-Uscanga i Fran-cois, 2003., Hromdkov i sur., 2003.), meutim -glukan se moe uspjeno izolirati i iz pivskog kvasca (Thanardkit i sur., 2002., Suphantharika i sur., 2003., Thammakiti i sur., 2004.; Liu i sur., 2008.). b-glukan izoliran iz staninih stijenki kvasca moe nai iroku prim-jenu u razliitim podrujima. Izolaci-jom b-glukana iz sekundarnog proiz-voda, kao to je otpadni pivski kvasac, -glukan postaje visokovrijedna sirovi-na za mnoge proizvode na podruju medicine, farmacije, kozmetike, vete-rine i prehrambene industrije.

Postupci izolacije -glukana iz piv-skog kvasca koji su opisani u dostupnoj literaturi namijenjeni su uglavnom proizvodnji preparata predvienih za primjenu u razliitim namirnicama (Thammakiti i sur., 2004., Worrasin-chai i sur., 2006., Santipanichwong i Suphantharika, 2007., Liu i sur., 2008.). Meutim, pripravci se dobiveni iz piv-skog kvasca mogu primijeniti i za imu-nostimulaciju, to je dokazano in vitro i in vivo u rakova (Wheatcroft i sur., 2002., Thanardkit i sur., 2002., Suphan-tharika i sur., 2003.) i riba (Wheatcroft i sur., 2002.).

Openito, pivovare proizvode velike koliine pivskog kvasca kao sekundar-ni proizvod koji se moe koristiti kao



Tablica 1. Primjeri b-glukana razliitih struktura, izoliranih iz razliitih izvora (Izvor: Stone i Clarke, 2002.)

VRSTA GLUKANA(OPIS STRUKTURE)

PRIMJERI Prirodni izvor trivijalni naziv -glukana

(13)-b-glukani (linearni,homogeni)

Bakterija Alcaligenes faecalis kurdlan Alga Euglena gracilis paramilon Poria cocos pahiman Vitis vinifera (vinova loza) kaloza Ameriki ari Larix laricina laricinan

(13), (16)-b-glukani (linearni s (16)-vezanim grananjima

Alga Laminaria sp. laminarin Raina snijet Claviceps purpurea glukan stijenke Bijela plijesan Sclerotinia sclerotiorum glukan stijenke

(13), (16)-b-glukani (linearni s (16)-vezanim -glukozil ili -gentobiozil grananjima)

Smea alga Eisenia bicyclis laminarin Gljiva Lentinula edodes glukan stijenke

(13), (16)-b-glukani (tzv. razgranata sruktura)

Kvasac Saccharomyces cerevisiae glukanstijenke Gljiva Schizophyllum commune glukan stijenke

(13),(14)-b-glukani (linearni) -glukani itarica Islandski liaj Cetraria islandica lihenin

(13),(14)-b-glukani (linearni sa (14)-b-vezanim -glukozil grananjima)

Gljiva bukovaa Pleurotus ostreatus glukan stijenke

Tablica 2. Bioloka aktivnost -glukana (Izvor: Gardiner i Carter, 2000.)

Aktivnost Opis

Regulacija imunosnog sustava

modulira otputanje citokina iji je cilj borba protiv infekcije pomae pri zacjeljivanju rana modulira funkcioniranje imunosnog sustava

Prototumorsko djelovanje

stimulira oslobaanje protutijela, koja oznaavaju maligne stanice raka kako bi one bile prepoznate i unitene inhibira rast i irenje tumora

Djelovanje na ope zdravlje sniava razinu kolesterola u krvi poboljava iskoritavanje glukoze



Tablica 3. Aktivnost -glukana prema nekim patogenim mikroorganizmima

Skupina patogenih mikroorga-nizama

Mikroorganizam Referenca

Bakterije

Staphylococcus aureus Di Luzio i sur. (1979.), Liang i sur. (1998.), Gardiner (2000.), Chen i Seviour (2007.)

Escherichia coli Gardiner (2000.)

Bacillus anthracis Vetvicka i sur. (2002.), Chen i Seviour (2007.)

Streptococcus Browder i sur. (1983.), Whittington i sur. (2005.), Chen i Seviour (2007.)

Mycobacterium tuberculosis Hetland i sur. (1998.), Chen i Seviour (2007.)

Kvasci Candida albicans Ber (1997.), Chen i Seviour (2007.)Paracoccidioides brasiliensis Gardiner (2000.)

Virusi

Virus hepatitisa Vetvicka (2001.), Chen i Seviour (2007.)

Herpes simplex (HSV) Ber (1997.), Vetvicka i sur. (2002.), Zhang i sur. (2004.)

Virus humane imunodefici-jencije (HIV)

Koizumi i sur. (1993.); Ber (1997.), Chen i Seviour (2007.)

Humani papilomavirus (HPV) Vetvicka (2001.)Virus gripe Vetvicka (2001.)Citomegalovirus Vetvicka (2001.)

Tablica 4. Iskoritenja triju postupaka izolacije b-glukana razvijenih u naem laboratoriju i mase pri-pravaka -glukana koje je mogue izolirati iz procijenjene godinje proizvedene mase iskoritenog pivskog kvasca

Postupci izolacije Iskoritenja (%)* Mogua godinja proizvodnja -glukana iz iskoritenog pivskog kvascau Republici Hrvatskoj (t)**

Alkalni 13,64 477,4Alkalno-kiselinski 11,84 414,4

Alkalno-kiselinski s uklanjanjem mano-proteina

8,08 282,8

* Izraeno kao postotak izraunat na temelju mase suhe tvari u izoliranim vlanim pripravcima -glukana i mase suhe tvari iskoritenog pivskog kvasca

** Izraeno kao masa suhe tvari pripravka -glukana koja se moe izolirati iz procijenjene godinje proizvodnje iskoritenog pivskog kvasca (3500 t suhe tvari kvasca) u Republici Hrvatskoj



dodatak stonoj hrani (Mari i tefani., 1987., Hayen i Pollman, 1995., Wheat-croft i sur., 2002., Cook i sur., 2003.), suha aktivna biomasa ili sirovina za proizvodnju kvaevog ekstrakta (Sucher i sur., 1975.). Veina se kvasca prodaje nakon toplinske inaktivacije ili se smatra industrijskim otpadom.

Primjena je pivskog kvasca kao krmiva na granici rentabilnosti. Istovre-meno, mnogi sastojci iskoritene bio-mase, a meu njima i -glukan, mogu postii viu cijenu od samog kvasca. Osim izravne primjene u raznim podrujima, izolirani se -glukan moe dalje preraditi i u druge proizvode puno vee komercijalne vrijednosti.

Kao pokuaj rjeavanja proble-ma gospodarenja otpadnim pivs-kim kvascem, istodobno poveanjem profitabilnosti procesa proizvodnje piva, u sklopu tehnologijskog pro-jekta provedenoga na Zavodu za bio-kemijsko inenjerstvo Prehrambeno-biotehnolokog fakulteta Sveuilita u Zagrebu, razvijeni su razliiti postupci izolacije -glukana iz iskoritenog piv-skog kvasca (http://tprojekti.mzos.hr/prikaz_det.asp?offset=120&ID=3033). Primijenjena su tri postupka izolacije netopljivog -glukana: alkalni, alkalno-kiselinski i alkalno-kiselinski postupak s uklanjanjem manoproteina.

Iskoritenja spomenutih postupaka prikazana su u tablici 4. Zbog postupka zatite intelektualnog vlasnitva au-torima nije doputen detaljni opis triju razliitih procesa izolacije te je predoena samo pojednostavljena she-ma primijenjenih postupaka (slika 3).

Izolirani su pripravci osueni razliitim metodama i optimirani su

parametri suenja u cilju proizvodnje estica s dimenzijama odgovarajuim za postizanje optimalne bioloke ak-tivnosti. Testovima provedenim in vitro dokazana je stimulacija proiz-vodnje TNF- koja je posti gnuta izoli-ranim preparatima nakon liofilizacije i suenja rasprivanjem (Petravi Tomi-nac, 2008.).

Uz vanost potvrivanja bioloke aktivnosti dobivenih preparata, pri razmatranju procesa izolacije potrebno je osvrnuti se na ekonomsku (tablica 4) i ekoloku opravdanost proizvod-nje b-glukana iz biomase iskoritenog pivskog kvasca. Prosjena proizvodnja piva u Hrvatskoj iznosi oko 3,5 milijuna hL, stoga koliina iskoritenog pivskog kvasca koja se godinje proizvede od-govara oko 3500 tona suhe tvari. Pivo-vare koje su locirane blie tvrtkama za proizvodnju stone hrane i des-tilerijama zbog transportnih trokova preputaju proizvedeni pivski kva-sac tim tvrtkama kao sporedni proiz-vod. Obzirom na navedenu procjenu godinje proizvodnje pivskog kvasca, primjenom spomenutih postupaka izo-lacije mogla bi se godinje proizvesti masa -glukana koja bi odgovarala 282,8 477,7 tona suhe tvari, ovisno o primi-jenjenom postupku izolacije i stupnju proiavanja -glukana postignutom u pojedinim procesima. Vano je na-glasiti da -glukan moe postii veu komercijalnu vrijednost nego sam piv-ski kvasac. Zbog viestruke mogue pri mjene b-glukana, visoke cijene koju moe postii kao i njegove deficitar-nosti na svjetskom tritu, u prvom redu uzrokovane velikom potranjom, oito da bi se proizvodnjom b-glukana



iz iskoritenog pivskog kvasca mogle dodatno zaraditi ogromne svote novca. Ilustracije radi, dovoljno je spomenuti da se pakiranje koje sadri ukupno 12 g kvaevog -glukana namijenjenog za ljudsku uporabu prodaje po cijeni 29 EUR.

ZakljuakIz navedenih podataka moe se

zakljuiti da se izolacijom -glukana iz iskoritenog pivskog kvasca moe maksimalizirati ukupna profitabil-nost procesa proizvodnje piva. Stoga koritenje pivskog kvasca kao sirovine za proizvodnju -glukana predstavlja tehnoloki i ekonomski prihvatljiv iz-bor za pivovare.

Saetak-glukani se u prirodi mogu nai u

razliitim prirodnim izvorima i velik broj istraivanja pokazao je njihove jake imunostimulacijske uinke u razliitim organizmima. -glukani mogu nai primjenu u medicini i farmaciji, pre-hrambenoj, kozmetikoj i kemijskoj in-dustriji, kao i u veterinarskoj medicini i u proizvodnji krmiva. Iskoriteni se pivski kvasac, dobiven pri proizvodnji piva kao sekundarni proizvod, moe koristiti kao sirovina za izdvajanje -glukana. Unato injenici da se ve-like koliine pivskog kvasca koriste kao krmivo, odreene se koliine jo uvijek tretiraju kao tekui otpad. -glukan je jedna od komponenata koja moe postii veu komercijalnu vrijednost nego sam pivski kvasac te tako moe

maksimalizirati ukupnu profitabil-nost procesa proizvodnje piva. Stoga proizvodnja -glukana, kao i drugih visokovrijednih proizvoda baziranih na -glukanu, iz iskoritenog pivskog kvasca predstavlja isplativ tehnoloki i ekonomski izbor za pivovare.

Ovaj pregledni rad je proizaao iz vla-stitih istraivanja u okviru tehnologij-skog projekta TP-01/0058-12 Postupak izolacije -glukana iz kvaeve biomase MZO RH provedenog na Zavodu za biokemijsko inenjerstvo Prehrambeno-biotehnolokog fakulteta Sveuilita u Za-grebu (http://tprojekti.mzos.hr/prikaz_det.asp?offset=120&ID=3033), a rezultati ovih istraivanja bit e primijenjeni u podruju biomedicine u okviru znanstvenog projekta Zavoda za biologiju Veterinarskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu: Kolidiareja i kolien-terotoksemija prasadi: mukozna imunost i imunomodulacija (053-0532265-2255).

Literatura1. AGUILAR-USCANGA, B. and J. M.

FRANCOIS (2003): A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Lett. Appl. Micro-biol. 37, 268-274.

2. BARTON, M. D. (2000): Antibiotic use in animal feed and its impact on human health. Nutrition Research Reviews. 13, 279-299.

3. BER, L. (1997): Yeast-derived -1,3-glucan: an adjuvant concept. Am. J. Nat. Med. 4, 21-24.

4. BOHN, J. A., and J. N. BEMILLER (1995): (13)--D-glucans as biological response modifiers - a review of struc-ture-functional activity relationships. Carbohyd. Polym. 28, 3-14.

5. BROWDER, W., J. RAKINIC, R. MC-NAMEE, E. JONES, D. WILLIAMS and N. DI LUZIO (1983): Protective effect of nonspecific immunostimulation in



postsplenectomy sepsis. J. Surg. Res. 35, 474-479.

6. BROWN, G. D. and S. GORDON (2003): Fungal -glucans and mamma-lian immunity. Immunity 19, 311-315.

7. CERNIGLIA, C. E. and S. KOTARSKI (1999): Evaluation of Veterinary Drug Residues in Food for Their Potential to Affect Human Intestinal Microflora. Regulatory Toxicology and Pharmacol-ogy 29, 238-261.

8. CHEN, C., A. F. ROWLEY, R. P. NEW-TON and N. A. RATCLIFFE (1999): Identification, purification and prop-erties of a -1,3-glucan-specific lectin from the serum of the cockroach, Bla-berus discoidalis which is implicated in immune defence reactions. Comp. Bio-chem. Phys. B 122, 309319.

9. CHEN, J. and R. SEVIOUR (2007): Re-view - Medicinal importance of fungal -(1-3), (1-6)-glucans. Mycol. Res. 111, 635-652.

10. COOK, M. T., P. J. HAYBALL, W. HUTCHINSON, B. F. NOWAK and J. D. HAYBALL (2003): Administration of a commercial immunostimulant prep-aration, EcoActivaTM as a feed supple-ment enhances macrophage respirato-ry burst and the growth rate of snapper (Pagrus auratus, Sparidae (Bloch and Schneider)) in winter. Fish Shellfish Im-mun. 14, 333-345.

11. DI LUZIO, N. R., D. L. WILLIAMS, R. B. MCNAMEE, B. F. EDWARDS and A. KITAHAMA (1979): Comparative tumor-inhibitory and anti-bacterial ac-tivity of soluble and particulate glucan. Int. J. Cancer 24, 773-779.

12. GARDINER, T. (2000): Beta-Glucan Biological Activities: A Review. Glyco-Science 1, 1-6.

13. GARDINER, T. and G. CARTER (2000): Beta-Glucan Biological Activities: A Review (condensed version). GlycoSci-ence 1, 1 - 2.

14. HA, C. H., K. H. LIM, Y. T. KIM, S. T. LIM and C. W. KIM (2002): Analysis of alkali-soluble glucan produced by Saccharomyces cerevisiae wild type and mutants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 370-377.

15. HAYEN, D. G. and D. S. POLLMANN (2001): Animal feeds comprising yeast glucan. US Patent 6214337.

16. HETLAND, G., M. LOVIK and H. G. WIKER (1998): Protective effect of -glucan against Mycobacterium bovis, BCG infection in BALB/c mice. Scand. J. Immunol. 47, 548-553.

17. HONG, Z., P. MANN, N. H. BROWN, L. E. TRAN, K. J. SHAW, R. S. HARE and B. DIDOMENICO (1994): Cloning and characterization of KNR 4, a yeast gene involved in (1,3)--glucan synthe-sis. Mol. Cell. Biol. 14, 1017-1025.

18. HROMADKOVA, Z., A. EBRINGERO-VA, V. SASINKOVA, J. ANDULA, V. HRIBALOVA and J. OMELKOVA (2003): Influence of the drying method on the physical properties and immu-nomodulatory activity of the particu-late (13)--D-glucan from Saccharo-myces cerevisiae. Carbohyd. Polym. 51, 9-15.

Documents

Veterinarska Stanica 05 2009