1

Versuch vonBeadle und Tatum

Verändertes Gen-> veränderter Phänotyp Neurospora crassa

Purves et al. 12.1

Ein-Gen-ein-Polypeptid-Hypothese

Ein-Gen-ein-Enzym Hypothese

Ein-Gen-ein-Genprodukt-Hypothese

2

Das zentral Dogma: Von der DNA zum Protein

Transkription

Replikation

Translation

Purves et al. 12.2

3

Genexpression:

• Fluss von der genetischen Information (DNA) zum Genprodukt• beteiligte Vorgänge sind:

Transkription (DNA in RNA)Translation (RNA in Protein)

• findet in allen lebenden Zellen statt

Expression

Gen

Abschnitt auf der DNA, der für ein Genprodukt kodiert, inkl. Kontrollregionen

RNA

Protein

4

Bei Prokaryoten in einem Kompartiment

Purves et al. 12.3 Purves et al. 14.1

5

DNA

RNA

Protein

Transkription des Matrizenstranges

Translation

Nicht-Matrizenstrang (+)

Matrizenstrang, codogen (-)

Pro- und eukaryotische Genexpression

6Purves et al. 12.4

Transkription

7

Die chemische Struktur der RNA

RNA DNA

•RNA enthält den Zucker Ribose•RNA enthält Uracil anstelle von Thymin

8

RNA-Polymerase aus E. coli

α

α

β

β‘

Minimal (Core) Enzym, 4 UE: α2,β,β‘

α: Struktur des Enzymsβ: RNA-Syntheseβ‘: Bindung an DNA

DNA-abhängige RNA-Polymerase

Die RNA-Polymerase transkribiert DNA

•Katalyse von Phosphatdiesterbindungen•Verlängerung der wachsenden RNA Kette in 5‘->3‘Richtung•Substrat: Ribonukleosidtriphosphate, kein Primer

α

α

β

β‘

σ

Holoenzym, 5 UE: α2,β,β‘,σ

σ: Erkennung des Transkriptionsstarts

9

Konsensussequenzen prokaryotischer Promotoren-10-Region = Pribnow-Box-35-Region

Promotor: Erkennungs- und Startpunkt für die RNA-Polymerase

nicht-transkribierte DNA transkribierte DNA

ATG

+1 Start der Transkription

Start der Translation

-35 -10

- 35-Region

-10-Region

„upstream“-Bereich

-35 -10 +1 lac ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAtrp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCApL TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATKons.-S ----------TTGACA---17+/-1 bp-----TATAAT--------

-1 keine „0“

10

Transkriptionszyklus einer bakteriellen RNA-Polymerase

Promotor

DNA

σ-Faktor

RNARNA

RNA

RNA-Polymerase

1. Bindung des RNA-Pol-Holoenzymsan den Promotor (geschlossener Komplex)

2. Aufwinden der DNA(offener Komplex)

3. Anfängliche Transkription (10 nt)

4. Ablösung des σ-Faktors

5. Elongationsphase mit hoher Prozessivität (50 nt/s)

6. Termination

7. Freisetzung des Transkripts

Haar-nadel

Ribonukleosid-triphosphate

11

Alternative Sigmafaktoren: Regulation der Genexpression bei E. coli

Sigmafaktor Größe (kDA) Funktion

σ70 70 Standard-SigmafaktorσS 38 Hunger, Stressσ32 32 Hitzeschock

12

Transkriptionstermination bei E. coli

Rho-unabhängige Termination

Haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3‘ Nichtkodierungsbereich einer mRNA

Rho-abhängige Termination

Rho-Protein (Hexamer) lagert sich an mRNAspaltet ATP

13

Kodierende RegionDNA

+1 Ende

RNA-Transkript5‘ 3‘

Leadersequenz5‘ untranslatierterBereich

Trailer-Abschnitt3‘ untranslatierterBereich

Transkripte sind länger als die kodierende Region

Promotor Terminator

14

Prokaryot Eukaryot

RNA-Polymerase

polycistronischemRNA

Translation noch während der Transkription

RNA-PolymerasemonocistronischemRNACap-Struktur

Poly(A)-Schwanz

mRNA muss aus dem Kern ausgeschleustwerden

Kernpore

15

Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen

Brown 6.1

16

RNA-Polymerase Produkt Lokalisierung

RNA-Pol I: rRNA (28S, 18S, 5,8S) Nukleolus

RNA-Pol II: mRNA (Protein-kodierende Gene) NukleoplasmasnoRNAs, einige snRNAs

RNA-Pol III: 5S rRNA, tRNAs, viele snRNAs Nukleoplasmainterne Promotoren !

Zusätzlich RNA-Polymerasen in Mitochondrien und Chloroplasten

mt-RNA-Pol mitochondriale Transkripte Mitochondrien(nur eine UE) (kernkodiert)

pt-RNA-Pol (PEP) plastidäre Transkripte Plastiden(E.coli-ähnlich) (plastidenkodiert)

pt-RNA-Pol (NEP) plastidäre Transkripte Plastiden(nur eine UE) (kernkodiert)

Eukaryoten: drei DNA-abhängige RNA-Polymerasen im Kern

17

Eukaryotische Promotoren sind weniger konserviert

prokaryotischerPromotor

eukaryotischerRNA-Pol IIPromotor

Jannig & Knust 14.3

18

Struktur und Transkription eines eukaryotischen Gens

Purves et al. 14.4

19

Transkription eukaryotischer DNA durch die RNA-Polymerase II benötigt viele allgemeine Transkriptionsfaktoren (TF)

TFIIH

20

Eukaryotische Gene enthalten kodierende Exon- und nicht-kodierende Intron-Bereiche,eukaryotische RNA-Pol II-Transkripte werden prozessiert

1. Anfügen des Cap am 5‘ Ende2. Polyadenylierung am 3‘ Ende3. Spleißen

Alle drei Prozesse finden im Zellkern statt !

21

„Capping“ des Transkriptes am 5‘ Ende: Anfügen eines modifizierten Guaninnukleotids

• 5‘ Cap signalisiert 5‘ Ende eukaroytischer mRNAs•Wird während der Transkription angehängt• 5‘ Cap wichtig für Export der mRNA ins Cytosol und die Translation

Methylgruppe

5‘-5--Bindung

7-Methyl-Guanosintriphosphat

22

Polyadenylierung am 3‘-Ende

10- 20 Nukleotide < 30 Nukleotide

Spaltung durch Endonukleasekomplex

Poly(A)-Anheftung durch Poly(A)-Polymerase

wird abgebaut

• 3‘-Poly(A)-Schwanz signalisiert 3‘-Ende eukaroytischer mRNAs• Poly(A)-Polymerase (Polymerisation ohne Matrize !)• 200-250 A-Nukleotide werden angehängt• 3‘-Poly(A)-Schwanz wichtig für Export der mRNA ins Cytosol, für die Stabilität und die Translation

23

Spleißen des Transkripts

Intron wird entfernt

Teil der mRNA

• Nukleotidsequenzen markieren die Spleißstellen

• Spleißen wird durch Spleißosomenausgeführt

• Spleißosomen sind aus Proteinen und snRNAs zusammengesetzt

Spleißen = Entfernen der Intronsequenzen aus dem Primärtranskript, Verknüpfung der Exons

Janning & Knust 14.9

24

Das Spleißosom,eine Spleißmaschine

Purves et al. 14.10

25

Eukaryoten: Kontrolle der Transkription durch die Chromatinstruktur

Modifikation (z. B. Acetylierung) der Chromatinproteine (Histone) reguliert die Transkription

offenes Chromatin -> transkriptionsaktiv

kondensiertes Chromatin -> transkriptionsinaktiv

Histon-AcetylierungHiston-Acetyltransferase(HAT)

Histon-DeacetylierungHiston-Deacetylase(HDAC)

DNA

Nukleosom

30 nm

Histon-oktamer

10 nm

Janning & Knust 17.16

26

Histon-Acetyltransferase (HAT)

Reguliert Zugänglichkeit der DNA für Proteine der TranskriptionsmaschinerieHiston-Acetyltransferase (HAT) acetyliert Histone in der Nähe der TATA-Box

Histone

Nukleosom

DNA

Transkriptionsfaktor

Ac

RNA-Polymerase II

Transkription

27

Histon-Deacetylierung

Histon-Acetylierung

Histon-MethylierungDNA-Methylierung

Histon-DemethylierungDNA-Demethylierung

Modifikation des Chromatins

28

Prokaryoten Eukaryoten

RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase, drei RNA-Polymerasen,einige Sigma-Faktoren viele allgemeine

TranskriptionsfaktorenregulatorischeTranskriptions- ja ja; zahlreichfaktoren

Transkript meist polycistronisch, monocistronisch,keine Modifikation Modifikation am 5‘- u. 3‘-Ende

Introns i.d.R. nicht vorhanden, meist vorhanden,kein Spleißen Spleißen

Trennung von Transkription u. nein ja (Kern/Cytoplasma)Translation

Einfluss derChromatinstruktur kein Chromatin! ja

Initiation der Genexpression:Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryoten

29

Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen

Brown 6.1

30

Ribosomale RNA

Ribosomen bestehen aus RNA (rRNA) und Proteinen und sind aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt

Purves et al. 12.9

31

Ribosomen

32

Svedbergeinheit S

•Maß für Sedimentationsgeschwindigkeit bei Zentrifugation in einem Dichtegradienten•S-Wert abhängig von Größe, Form, Volumen und Dichte des Partikels/Moleküls•je größer und kompakter, desto größer ist Wanderungsgeschwindigkeit

Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifigation, Sedimentationsanalyse oder Dichtegradientenzentrifugation(Saccharose)

33

Dichten und S-Werte von Zellmaterial

34

Zusammensetzung der Ribosomen bei Pro- und Eukaryoten

Prokaryoten Eukaryoten

S1, S2, S3, etc.Ges.: ca. 35

18S rRNA(1874)

40SS1, S2, S3, etc.Ges.: >20

16S rRNA(1542)

30Skleine UE

L1, L2, L3, etc.Ges.: ca. 50

28S rRNA(4818)5,8S rRNA(160)5S rRNA(120)

60SL1, L2, L3, etc.Ges.: >30

23S rRNA(2904)5S rRNA(120)

50Sgroße UE

ProteinerRNA (Nukleotide)

GrößeProteinerRNA (Nukleotide)

Größe

35

Molekulare Feinstruktur eines 70S Ribosoms

Purves et al. 12.9 b

36

Sekundärstruktur der 16 S rRNA von E. coli

37

Prozessierung der eukaryotischen rRNA

Janning & Knust 15.1e

38

DNA, die rRNA kodiert ist repetitiv

Purves et al. 14.2

39

•Kernkompartiment•Ort der rRNA Synthese•Nukleolus besteht aus DNA, RNA und Proteinen•Prozessierung der prä-rRNA, Zusammensetzung präribosomaler Partikel

Nukleolus-Organisator (NO) besteht aus rDNA, die von mehreren Chromosomenstammen kann und tandemartig abgeordnete rDNA enthält

Nukleolus

40

tRNAs fungieren als Adapter(400 000 tRNA Moleküle pro Bakterien-Zelle)

41

•tRNAs bestehen aus 74 – 95 Nukleotiden•Kleeblattstruktur•Akzeptorarm bindet Aminosäure; 3‘ Ende endet immer auf -CCA•DHU-Arm enthält ungewöhnliches Pyrimidin Dihydrouracil•Anticodonarm erkennt mRNA•Variabler Arm enthält variable Anzahl an Nukleotiden•TψC enthält die Abfolge T, Pseudouracil und C

42

Tertiärstruktur der tRNA

jede tRNA hat individuelle 3D-Struktur

43

Uridin

Zucker

44

Der genetische Code

45

Die 20 in Proteinen vorkommenden Aminosäuren

Janning & Knust 15.3

46

Problem: 4 Buchstaben A,T,G,C -> aber 20 Aminosäuren

Singulet-Code: 4 CodonsDuplett-Code: 42 = 16 Codons

Triplett-Code: 43 = 64 Codons

Purves et al. 12.5

47

Frage: Welches Triplett codiert für welche Aminosäure?

Versuch von Nirenberg und Matthaei

Purves et al. 12.6

48

Der Code ist degeneriert, d.h. mehrere Triplettscodieren eine Aminosäure(Ausnahme: Tryptophan und Methionin)

Synonyme Codons sind sich meist ähnlich, so dass die ersten beiden Basen eines Tripletts oft schon die Aminosäure spezifizieren (Ausnahmen: Leucin und Arginin)

Leucin

Leucin

Arginin

Arginin

Purves et al. 12.5

49

Die "Wobble"-Hypothese (F. Crick 1965)

"wobble" = "Schwanken, Wackeln"Eine einzelne z. B. mit Glycin beladene tRNA kann drei verschiedene Codons auf der mRNA erkennen

50

"Wobble" Abweichungen bei der Bindung des Anticodons an das Codon

51

Der genetische Code ist fast universellund gilt für alle Organismen

Es gibt wenige Ausnahmen(insbesondere in Mitochondrien-Genomen) z.B. UGA (normalerweise Stop) in Mitochondrien Tryptophan und AUA (normalerweise Isoleucin) in Mitochondrien Methionin

52

Verwendung von Code-Wörtern (Codon usage)

Ein Beispiel: 6 Arginin Codons

CGT 43%

CGC 32%

CGA 7%

CGG 8%

AGA 9%

AGG 1%

korrespondiert mit Vorkommen synonymer tRNAs d.h. es gibt seltene Codons (Spezies-spezifisch)

Regulation von Genaktivität, da seltene Codons zu schwächerer Expression führen