Vanderlan da Silva BolzaniUniversidade Estadual Paulista UNESPUnesp

Criando os Elos Fundamentais da Cadeia de Fitoterápicos: Extratos e Marcadores

São Paulo/19/082015

Biodiversidade = Diversidade Química - Variedade de todas as formas de vida na Terra, em diferente níveis hierárquicos: paisagens, ecossistemas, espécies, genes, proteoma, metaboloma” Criado por E. Wilson, 1998, “The Diversity of Life and The Future of Life” Edward O. WilsonValoração da

biodiversidadeA investigação científica da biodiversidade é uma estratégia valiosa para fornecer bens e serviços essenciais diretos e indiretos, para a humanidade de grande valor  agregado

Produz amplo espectro  de metabólitos secundáriosúteis como:

• Alimento•Fármaco

• Agroquímico•Sabores e fragrâncias

• Cosméticos; Têxtil•Madeira; Combustível

• Material de construção

………e mantém o equilíbrio de sua própria regulação e manutenção:   •Purificação do ar e água•Decomposição de resíduos•Clima, estabilização •Ciclo de nutrientes•Fertilidade do solo•Polinização•Controle de insetos e microrganismos•Recursos genéticos

Sua Preservação é essencial para a manutenção das espécies e para a economia nacional se explorada de forma racional e sustentável

(Jay Withgott & Scott Brennan, 2005)

Saldo Comercial crescentemente dependente de setores intensivos em recursos naturais

Brasil, país que detém uma biodiversidade única, abriga 70% de todas as espécies, incluindo plantas e animais o que equivale a 15-20% da biodiversidade da Terra

Fonte de Matérias Primas

Produtos dealto valor agregado

Produtos de baixo valor agregado

2005 – The first antiinflammatory herbal medicine completely developed in Brazil

Aché usa biodiversidade para lançar Fitoterápico 100% brasileiro

Sintocalmy - usa princípios ativos da passiflora (patente internacional para a empresa, que investe em pesquisas da biodiversidade nacional)

Notícia Jornal Brasil Econômico, 10-03-2010

FITOSCAR – lançado em 2007, é uma mistura de taninos constituinte do extrato seco de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville a 50% 60 mg

Luis Marques, et al, 2012

A linha L’Occitane au Brésil lançada no mercado brasileiro em 15 de maio de 2013. No restante do mundo, os produtos estarão disponível a partir 2014

Fruto da palmeira, típica da AmazôniaFamília Arecaceae Gênero/espécie: Euterpe oleracea

BIOECONOMIA DO AÇAÍ

15% POLPA

+85% CAROÇO

- SORVETE- TORTAS GELÉIAS- LICOR- BOMBONS

PRINCIPAIS USOS- ADUBOS- CURTUME/TANINO- XAXINS- ISOLANTES

USOS COM MAIOR VALOR AGREGADO- USOS INDÚSTRIA - -AUTOMOBILISTICA- DRUGS

Baixo Valor agregado

Prospeção de metabólitos

secundários de várias classes e biopolímeros

Frequency of patent applications deposited in the period between 2003 and 2008, coming from the State of Amazonas, executed by their respective industrial sector.

Frickmann, et al. J. Technol. Manag. Innov., 6 (4) 2011

Distribution of research groups involved with medicinal plants, phytotherapic and phytocosmetic by Brazilian Amazonia, per category of STI, in 2010

Depósitos de patentes sobre produtos da biodiversidade amazônica por região depositadas no INPI e/ou PCT, 1982-2009

Arruda, et al, Revista Amazônia 6, 23-24, 2008; Arruda, et al. Parcerias estratégicas. Brasília?DF, Brasil 14(29), 145-172.

A robust analytic platformHPLC, LC, GC, MS, NMR

Identification known and unknowns secondary metabolites and peptides

Map metabolic network

Biosynthesis

Biological activity

Metabolome data information

*RoleIn plant

*Regulation,genes, proteins

Bolzani, V. et al. Pure App. Chem. 2012 MEDICINES AND COSMETICS LEAD COMPOUNDS

Modern Herbal Medicines Experimental strategies

Metabolomics, proteomics and

genomics studies - by using HPLC techniques,

NMR, MS

Medicinal plants Phytomedicines

Bioassays

Cells, tissues, organisms

Functional genome(i.e. DNA arrays)

Functional proteome(i.e. Electrophoresis 2D

Comparative metabolomics studies - RNM

MULTIVARIATE ANALISIS DATA - RMN

The importance of NMR spectroscopy on metabolomic and proteomic research on bioproducts, and in special to find news leads for drugs, nutraceuticals, cosmetics - into the omics era

Shyur, Lie-F.; Yang, Ning-S. Current Opinion in Chemical Biology 12, 66 (2008)

Complete chemical fingerprint♦ Plant species♦ Quality Control♦ Identification of bioactive compounds (dereplication)

Information for♦ Pharmacology♦ Medicine♦ molecular pharmacology ♦ pharmacodynamics, pharmacokinetics

New strategies to study Natural Products

Inactive Active

Study of Chrysobalanaceae species with cytotoxic activities: Metabolomic analysis for the understanding of synergistic associations and their molecular complexity

NMR

HPLC-MSHPLC-UVExtracts

Metabolites ID - Dereplication

Cytotoxic activity

Chrysobalanaceae species

Detected moleculesIn silico metabolomic analysis– fingerprint X bioactivity

δ “active” chemical shifts1H NMRIn situ metabolomic analysis– bioactivity monitoring

Metabolic profile of cell line + plant extract by NMR Mechanism of action

Licania hoehneiLicania kunthianaLicania humilisCouepia grandifloraHirtella hebecladaParinari excelsa

Fungi

Plants

0 0.5 1

123456789

101112131415

Analysis and finger printer

EM

DAD-UV

RMN

0 1 2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

nz = 7

15.000 1H5.000 13C4.000 gHMQC4.000 gHMBC2.700 NOESY2.500 COSY1.500 TOCSY1.500 DEPT

Compounds identified

Generation of data; probability

of finding clusters of

knownmolecules

0 0.5 1

123456789

101112131415

0 0.5 1

123456789

101112131415

“IN-HOUSE NMR DATABASE”

Chemical documentation of extracts

Development of algorithms to facilitate the chemical documentation Under patent protection (Freire, F., Castro-Gamboa, 2014)

EtOH extract of leaves of L. salviaefolia (Reference extract)

Reference substances isolated from L. salviefolia

UHPLC-ESI-TOF-MS: Resourceful and useful methods for comparative metabolic studies of Lippia spp

Funari et al. Journal of Chromatography A, 1259 (2012) 167-178Funari et al. Phytochemistry, 72 (2011) 2052-2061

• Replacing harmful solvents (MeOH and MeCN) with renewable less toxic solvents (EtOH and acetone)

• Keeping extraction/separation performances• statistically-based comparisons

• Increasing the efficiency of a process

• statistically-based optimization of methods = less experiments = less energy and solvent consumptions.

• monitoring energy and solvent consumptions by employing home made metrics, such as Comprehensive metric to compare liquid chromatography methods

Funari et al. J. Sep. Sci., v. 37, 2014; Funari et al. J. Chromatogr. A (under review); Funari et al. . J. Chromatogr. A (submitted)

NuBBE: greening natural products investigation

Extract Preparation still has been a bottleneck in the obtaining scale up natural products

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

500

600

mAU (a)

(b)mAU

minutes

*

0 5 10 15 20

0 5 10 15 20

GREEN FINGERPRINTING COMPLEX SAMPLES: MEDICINAL PLANTS USED IN BRAZIL SELECTED EXAMPLES

Funari et al. J. Sep. Sci., v. 37, 2014 Funari et al. J. Chromatogr. A (in press); Funari et al. . J. Chromatogr. A (accepted)

0 10 20 30 40 50 600

20

40

xx

0 10 20 30 40 50 600

20

4045-60 min.

(a) Acetonitrile

(b) Acetone

minutes

• Replacing harmful solvents with green alternatives

• Increasing process efficiency

H2O-EtOH 80oC AcetoneH2O-EtOH

H2O-MeOH H2O-MeCN 30oC H2O-MeCN

HPLC-UV Casearia sylvestris HPLC-UV Bidens pilosa HPLC-C-CAD Lippia alba

THANK YOU FOR YOUR ATTENTIONOBRIGADA PELA SUA ATENÇÃO