LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS

UŽKREČIAMŲ LIGŲ KATEDRA

Neringa Šinkūnienė

VALGOMOJO RŪGŠTINIO KAZEINO BENDRAS

BAKTERINIS UŽTERŠTUMAS

Magistro darbas

Darbo vadovė:

e. prof. p. dr. Jūratė Šiugždaitė

Kaunas, 2005 m.

2

Magistro darbas atliktas 2003 – 2005 metais Lietuvos veterinarijos akademijos

Užkrečiamų ligų katedros mikrobiologijos laboratorijoje, „X“ įmonės mikrobiologijos ir

chemijos laboratorijose.

Magistro darbą paruošė: Neringa Šinkūnienė

(Vardas, pavardė) (parašas)

Magistro darbo vadovė: e. prof. p. dr. Jūratė Šiugždaitė

(Vardas, pavardė) (parašas)

(LVA Užkrečiamų ligų katedra)

Recenzentė: doc. dr. Judita Žymantienė

(Vardas, pavardė) (parašas)

3

Tekste vartojamų sutrumpinimų paaiškinimas

aw

bendras mėginys

BŽ agar

dafnijos

EEB

g

HCl

K2HPO4

KLD agar

KSV/g

kt.

l

Leven E.M.B. agar

L. monocytogenes

ISO

LST

LST broth

LTBŽ broth

Mc agar

mg

min.

ml

MKTTn broth

n

Nr.

PCA agar

vandens aktyvumas

mėginys, į kurį įeina po 4, 5, 6, 7, 9 mėginius

Brilijantinės žalumos agaras

Daphnia rūšies vėžiagyviai

Europos Ekonominė Bendrija

gramas

Druskos rūgštis

dikalio hidrofosfato tirpalas

Ksilozės lizino dezoksicholato agaras

kolonijas sudarantys vienetai 1 grame kazeino

kiti

litrai

Leveno eozino ir metileno mėlio agaras

Listeria monocytogenes

Tarptautinė standartizacijos organizacija

Lietuvos standartizacijos tarnyba

Laurilo sulfato ir triptozės sultinys

Laktozės, tulžies ir briliantinio žaliojo sultinys

MacConkey agaras

miligramai

minutė

mililitrai

Miulerio-Kaufmano tetrationato ir novobiocino sultinys

mėginių skaičius

numeris

Plate count agaras

4

proc.

RVS broth

s.

S. durans

S. faecium

spp.

S. thermophilicus 0T

t

TS

val.

VRTL agar

procentai

Rappaport-Vassiliadis sojos sultinys

sekundė

Streptococcus durans

Streptococcus faecium

porūšiai

Streptococcus thermophilicus

Ternerio laipsniais

tonos

tikėtiniausias skaičius

valandos

Violetinio raudonojo tulžies laktozės agaras

5

Turinys

Įvadas.............................................................................................................................................7

1. Darbo tikslas............................................................................................................................10

2. Literatūros apžvalga...............................................................................................................11

2.1. Pieno mikroflora...............................................................................................................11

2.2. Pieno mikrofloros atsparumas temperatūrai......................................................................12

2.3. Drėgmės kiekio svarba pieno mikroflorai.........................................................................14

2.4. Pieno mikrofloros atsparumas rūgštingumui.....................................................................16

2.5. Kazeinas ir jo cheminė sudėtis..........................................................................................18

2.6. Kazeino gamyba...............................................................................................................21

3. Medžiagos ir metodai..............................................................................................................25

3.1. Naudotos terpės................................................................................................................25

3.2. Valgomojo rūgštinio kazeino mikrobiologiniai ir cheminiai kriterijai..............................27

3.3. Tiriamųjų valgomojo rūgštinio kazeino mėginių, pradinių suspensijų ir dešimtkarčių skiedimų ruošimas mikrobiologiniams tyrimams.....................................................................27

3.4. Valgomojo rūgštinio kazeino bendro bakterinio užterštumo tyrimas................................28

3.5. Termofilinių bakterijų tyrimas valgomajame rūgštiniame kazeine....................................29

3.6. Koliforminių bakterijų tyrimas valgomajame rūgštiniame kazeine...................................29

3.7. Salmonelių išskyrimas iš valgomojo rūgštinio kazeino.....................................................31

3.8. Listeria monocytogenes išskyrimas iš valgomojo rūgštinio kazeino.................................32

3.9. Valgomojo rūgštinio kazeino cheminės sudėties tyrimas..................................................33

3.10. Statistinis duomenų įvertinimas......................................................................................35

4. Tyrimų rezultatai....................................................................................................................36

4.1. Valgomojo rūgštinio kazeino bendro bakterinio užterštumo nustatymas...........................36

4.2. Valgomojo rūgštinio kazeino termofilinių bakterijų skaičiaus nustatymas........................41

4.3. Koliforminės bakterijos valgomajame rūgštiniame kazeine..............................................43

4.4. Salmonella spp. ir Listeria monocytogenes nustatymas valgomajame rūgštiniame kazeine..........................................................................................................................................48

4.5. Valgomojo rūgštinio kazeino cheminės sudėties nustatymas............................................48

5. Tyrimų rezultatų apibendrinimas..........................................................................................51

6. Išvados.....................................................................................................................................55

7. Pasiūlymai................................................................................................................................56

8. Summary..................................................................................................................................57

9. Literatūros sąrašas..................................................................................................................63

6

10. Priedai............................................................................................................................69

7

Įvadas

Kazeinas - pagrindinė pieno sudedamoji baltyminė medžiaga. Kazeinas gaminamas

traukinant nugriebtą pieną, paprastai tam naudojant rūgštis arba šliužo fermentą. Žinomos kelios

kazeino rūšys, kurios skiriasi priklausomai nuo pieno sutraukinimo būdo, pvz., rūgštinis kazeinas ir

fermentinis kazeinas (parakazeinas) (http://europa.eu.int/smartapi/cgi/sgadoc?smartapi!celexdoc!

prod!CELEXnumdoc&lg=LT&numdoc=31997D0080&model=lex.).

Maistinis kazeinas naudojamas kazeinato gamyboje. Kazeinatams (kazeino druskoms)

priklausančios natrio ir amonio druskos žinomos kaip „tirpieji kazeinai“. Šios druskos naudojamos

maisto koncentratų ir vaistų gamyboje. Kalcio kazeinatas priklausomai nuo jo savybių

naudojamas maisto produktų gamyboje, kaip vienas iš ingredientų dedamas į sūrius, taip pat gali

būti naudojami klijų gamybai (http://europa.eu.int/smartapi/cgi/sgadoc?smartapi!celexdoc!prod!

CELEXnumdoc&lg=LT&numdoc=31997D0080&model=lex; http://www3.lrs.lt/c-bin/eu/getfmt?C1

=w&C2=39481; http://www.sala.lt/portal/index.php?handler=news detailed &id=11804.).

Ikikarinėje Lietuvoje techninis kazeinas pradėtas gaminti 1930 m. Jį gamino Kintų, Kelmės,

Klausučių, Utenos, Pandėlio ir Kauno pieninės. Po karo beveik iš visų pieninių buvo reikalaujama

gaminti kazeiną. 1960 m. jo buvo pagaminta 1125 t., 1977 m. – 1200 t., vėliau gamyba sumažėjo iki

700 t. Šiuo metu vienintelė Rytų Europoje maistinio kazeino gamybos bendrovė "Žalmargės pienas".

Pelningai dirbantis "Žalmargės pienas" visą kazeiną eksportuoja į Europos Sąjungos (ES) šalis,

daugiausiai jo parduodama prancūzams, lenkams, vokiečiams. Eksportas sudaro 85 proc. visos

apyvartos (Visackas, 2000; http://www.jt.lt/Analitika/Naujienos1.asp?FirmID=87&Kur=0&ID=

32561; http://www.utena-on.lt/Utenos_enciklopedija/pramone/akcines.htm.).

Kazeinas yra vienas iš nedaugelio pieno produktų, turinčių paklausą užsienyje, todėl

visai natūralu kai kurių gamyklų interesas plėsti kazeino gamybą. Kazeiną tuomet iš bendrovės

"Žalmargės pienas" pirktų ir Lietuvos pieno perdirbimo įmonės, kurios dabar jį perka užsienyje

(Pridotkienė, Šarkinas, 1993; http://www.jt.lt/Analitika/Naujienos1.asp?FirmID=87&Kur=0&ID=

32561; http://www.Ut ena-on.lt/Utenos_enciklopedija/pramone/akcines.htm.).

Lietuvos pieno ir pieno produktų rinkos 2004 m. rugpjūčio duomenimis Lietuvos pieno

perdirbimo įmonėse buvo pagaminta 111 t. kazeino ir kazeinato. Į Europos Sąjungos šalis buvo

išvežta 78 t. Europos gamintojai patys pasigamina apie 120000 t. kazeino per metus, dar apie

60000–70000 t. kazeino importuojama (Pridotkienė, Šarkinas, 1993; http://www.ris.lt/?id=4016

&action=more.).

8

Produktų fizikinės, cheminės, biologinės savybės gali slopinti arba skatinti

mikroorganizmų dauginimąsi. Kazeino gamybos technologijoje yra kazeino grūdelių praplovimo

procesas, kurio dėka smarkiai sumažėja mineralinių medžiagų kiekis galutiniame produkte

(Pridotkienė, Šarkinas, 1993.). Moksliniam tyrimui kazeino cheminės sudėties rodikliai pasirinkti

šie: drėgmė, riebalai, laisvosios rūgštys.

Kadangi kazeinas naudojamas maisto produktų gaminimui, kurie skirti žmonėms vartoti,

todėl turi atitikti Lietuvoje patvirtintuose norminiuose dokumentuose nustatytiems sudėties

rodikliams. Šiame darbe kazeino biologinio užterštumo mikroorganizmai tirti šie: bendras

bakterinis užterštumas, termofilinių bakterijų skaičius, koliforminės bakterijų skaičius, iš patogeninių

mikroorganizmų - Listeria monocytogenes, Salmonella spp.

Bendras mikroorganizmų skaičius yra apytikris rodiklis ir kartu su žarnų lazdelių grupės

bakterijų skaičiumi rodo bendrą produkto užterštumo, tarp jų ir patogeniniais mikroorganizmais,

lygį. Potencialūs mikroorganizmai tai yra indikatoriai higienos ir sanitarijos sąlygų (Vaitkus,

1999; Serafini ir kt., 2003.).

Produkto gamybos procese svarbus yra pasterizavimo etapas, po kurio daugelis

mikroorganizmų žūsta. Išlikę mikroorganizmai (termofilinės bakterijos) yra tolerantiškesni

stresinei būklei ir pakelia gana aukštą temperatūrą. Taip pat išsilaiko technologijos proceso metu.

Pasterizuotą pieną greitai ataušinus iki 3–50C temperatūros, likę psichrofiliniai mikrobai žūva, o

palaikytame aukštesnėje kaip 100C temperatūroje dauginasi šilumai atsparios pieno rūgšties

bakterijos (Streptococcus thermophilicus, S. faecium, S. durans). Jos nesunaikinamos

pasterizuojant pieną 75–760C temperatūroje. Po momentinės pasterizacijos (85–900C) išlieka

gyvos termofilinės pieno rūgšties lazdelės ir įvairių bakterijų sporos, kurios turi įtakos sūrių

brendimui (Alegria ir kt., 2004; Poznanski ir kt., 2004; Pernoud ir kt., 2004.).

Žarninių lazdelių grupės bakterijų terminis atsparumas didesnis negu patogeninių

mikroorganizmų. Žarnų lazdelių grupės bakterijos yra mikroorganizmai indikatoriai. Radus daug

E. coli bakterijų, paaiškėja, kad aplinka ar produktai šviežiai užteršti fekalijomis. Produktų

užterštumas koliforminėmis bakterijomis ir Escherichia coli yra didelė įmonės problema. Dažnai

produktų partijoje randama Enterobacteriaceae šeimos mikroorganizmų. Ekonominėje srityje

įmonės nukenčia (Vaitkus, 1999; Parisi, 2003; Macedo ir kt., 2004; Kasimoglu ir kt., 2004.).

Mirtini listerijozės atvejai gali siekti net 70 proc., dažniausiai būna 20–30 proc. Listeria

spp. mikroorganizmai labai paplitę ir aptinkami bet kurioje maisto gamybos aplinkoje. Žalias

pienas gali būti užterštas listerijomis. Skirtingai nuo kitų patogeninių mikroorganizmų, vien

9

atšaldžius pieną negalima visiškai sustabdyti listerijų dauginimosi. Listerijos esant 72–750C

temperatūrai skystoje terpėje žūva per 20–30 min., 550C – per valandą (Kulikauskienė, 2000; Sarli

ir kt., 2004; Nair ir kt., 2004.).

Iš patogeninių enterobakterijų svarbios Salmonella genčių bakterijos. Salmoneliozė –

vienas iš dažniausiai pasitaikančių susirgimų, susijusių su maisto vartojimu. Salmonella spp.

nešiotojai gali būti galvijai, taip pat į pieną jų gali patekti transportuojant iš aplinkos su

nešvarumais. Salmonella spp. žūva esant 750C temperatūrai per 15 s., jeigu Salmonella spp.

randama pasterizuotame piene, vadinasi jis buvo užterštas po pasterizacijos. Maisto produktuose,

esant šiai temperatūrai, išsilaiko daug ilgiau (Kulikauskienė, 2000; Olsen ir kt., 2004.).

Kazeino sudėtis nustatoma laboratoriniais metodais, kurie aprašyti Lietuvos

standartizacijos departamento leidiniuose. Kazeino mikrobiologinės ir cheminės sudėties

įvertinimas aprašytas valstybiniuose standartuose: standartas (EEB) Nr. 2921 „Dėl paramos iš

nugriebto pieno gaminamų kazeino ir kazeinatų gamyba“ (1990) ir standartas Nr. 92/46/EEB

„Higienos reikalavimai pienui, termiškai apdorotam pienui, pieno produktų gamybai ir prekybai“

(1992). Tačiau be minėtų standartų apie kazeino mikrobiologiją literatūros rasta nedaug.

10

1. Darbo tikslas

Nustatyti valgomojo rūgštinio kazeino mėginių bendrą bakterinį užterštumą, ištirti

valgomojo rūgštinio kazeino mėginius patogeninių mikroorganizmų atžvilgiu.

1. Nustatyti valgomojo rūgštinio kazeino mėginių bendrą bakterinį užterštumą.

2. Nustatyti termofilinių bakterijų įtaka bendram bakteriniam užterštumui.

3. Nustatyti pakartotinai tirtų valgomojo rūgštinio kazeino mėginių bendrą bakterinį

užterštumą ir koliforminių bakterijų tikėtiniausią skaičių.

4. Išskirti iš valgomojo rūgštinio kazeino mėginių patogeninius mikroorganizmus, juos

identifikuoti.

5. Nustatyti valgomojo rūgštinio kazeino mėginių cheminę sudėtį.

11

2. Literatūros apžvalga

2.1. Pieno mikroflora

Pienas yra puiki terpė mikroorganizmams daugintis, taip pat ir patogeniniams, kurių

dauginimasis priklauso nuo konkuruojančių mikroorganizmų ir jų metabolinių produktų.

Pagrindiniai žalio pieno patogeniniai mikroorganizmai yra:

Staphylococcus aureus,

Streptococcus agalactiae,

Campylobacter jejuni,

Yersinia enterocolita,

Salmonella spp.,

Escherichia coli,

Lysteria monocytogenes,

Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium bovis,

Brucella abortus,

Brucella melitensis,

Coxiella burnetti (Vaitkus, 1999; Pinon ir kt., 2004.).

Daugelio patogeninių mikroorganizmų augimą stabdo žemesnė kaip 10–200C

temperatūra, dėl to laikomą pieną prieš šiluminį apdorojimą būtina atšaldyti. Esant temperatūrai,

skatinančiai mikroorganizmų dauginimąsi, patogeniniai mikroorganizmai gali būti nustelbiami

saprofitų. Jei pienas gaminamas netinkamai ir neatšaldomas, pienarūgščio rūgimo

mikroorganizmai gali greitai padidinti pieno rūgštingumą. Kai kurie streptokokai, gaminantys

pieno rūgštį, gamina į antibiotikus panašias medžiagas, stelbiančias patogeninius

mikroorganizmus. Kai kurie patogeniniai mikroorganizmai, kuriuos pieno rūgštis slopina, gali

gerai daugintis žemoje temperatūroje. Iš pieno pagamintų maisto produktų laikymo temperatūros,

pH ir vandens aktyvumo (aw) parametrai turi įtakos mikroorganizmų dauginimuisi (Vaitkus, 1999;

Pinon ir kt., 2004; Smit, 2004.).

12

2.2. Pieno mikrofloros atsparumas temperatūrai

Vienintelis mikroorganizmų naikinimo būdas yra šiluminis apdorojimas (pasterizavimas),

nes kiti metodai – baktofugavimas ar mikrofiltravimas – nepakeičia pasterizavimo ir gali tik

sumažinti mikroorganizmų kiekį. Pasterizuojant sunaikinami patogeniniai mikroorganizmai arba

jų kiekis sumažėja iki tokio lygio, kuris nepavojingas žmonių sveikatai. Pasterizavimas

naudojamas produktams su ribota laikymo trukme, atšaldytiems ir nepatvariems kambario

temperatūroje. Pasterizavimas, kaip pieno šiluminio apdorojimo procesas, gali sukelti cheminius,

fizikinius ir juslinius pokyčius. Tarptautinės Pienininkystės Federacijos rekomenduojamas lieso

pieno pasterizavimo režimas 15 s. esant 720C temperatūrai. Pasterizavimo režimai yra griežtesni

produktams, turintiems daugiau sausųjų medžiagų arba riebalų. Terpėje baltymai ir riebalai didina

mikroorganizmų atsparumą karščiui. Riebaluose atsparesnės tampa ne tik sporos, bet ir

vegetatyvinės formos. Pavyzdžiui, salmonelės, esant 60–650C temperatūrai, žūva per 30 min.,

aliejuje per tą patį laiką esant 1000C temperatūrai. Aiškinama tuo, kad riebaluose susidaro

sąlygos, panašios kaip ir kaitinant sausai. Pasterizuojant 73,90C temperatūroje 10 s., sunaikinama

99 proc. visų ir 99,95 proc. psichrotrofinių mikroorganizmų. Sūriuose, pagamintuose iš

pasterizuoto pieno, mikroorganizmų skaičius daug mažesnis (Vaitkus, 1999; Novella-Rodriguez ir

kt., 2004; http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html; http://class.fst.ohio-state.edu/FST201/ MEM/

microorg.htm.).

Termofilinių mikroorganizmų optimali temperatūra apie 45–600C. Kai kurie iš termofilinių

mikroorganizmų neauga žemesnėje nei 60–800C temperatūroje, jie žūva per 10–30 min. Gebėjimą

augti aukštoje temperatūroje nulemia ląstelės ultrastruktūros atsparumas šilumai, jos baltymų

atsparumas šilumai (termostabilumas), ląstelės membranos lipidų savita sudėtis (Poznanski ir kt.,

2004; Pernoud ir kt., 2004; http://class.fst.ohio-state.edu/FST201/MEM/ microorg.htm.).

Iš patogeninių mikroorganizmų Escherichia coli ir Listeria monocytogenes daugiausia

randama įvairiuose maisto produktuose, taip pat pasterizuotame ir nepasterizuotame piene. Žarnų

lazdelių grupės bakterijų terminis atsparumas didesnis negu patogeninių mikroorganizmų.

Žarninių lazdelių grupės bakterijos yra mikroorganizmai indikatoriai pieno pasterizavimo

efektyvumui nustatyti, nes žemoje temperatūroje laikomame pasterizuotame piene jos

nebesidaugina. Escherichia coli buvimas reiškia, kad piene ar jo produktuose gali būti ir

patogeninių mikroorganizmų. Žarnų lazdelių grupės bakterijos parodo pieno užterštumą po

13

pasterizacijos. Optimali šių bakterijų augimo temperatūra yra 370C (Vaitkus, 1999; Higienos

norma 15, 2003; Nair ir kt., 2004.).

Listerijos į pieną patenka antrinio užterštumo keliu, nors jas galima laikyti ir

saprofitinėmis, nes užkrėstumo listerijomis šaltinis yra dirvožemis, augalai. Jų randama 50-yje

proc. galvijų mėšlo bandinių. Nors šių bakterijų optimali augimo temperatūra 36–370C, gali augti

4–450C temperatūroje. Nors ir labai lėtai, listerijos gali daugintis net esant 00C temperatūrai

(Kulikauskienė, 2000; Šarkinas, 2000; Nair ir kt., 2004.).

Salmonelės greitai sunaikinamos pasterizuojant, todėl jos pieno produktuose gali būti dėl

nepakankamos pasterizacijos arba popasterizacinės taršos (pvz., blogos higienos, kryžminės

pasterizacijos pieno taršos žaliu). Pieno ir pieno produktų laikymas žemesnėje kaip 50C

temperatūroje apsaugo nuo salmonelių dauginimosi, nors kai kurie mikroorganizmai išlieka

gyvybingi. Salmonella spp. auga 2–540C temperatūroje (optimali 35–370C), bet maisto

produktuose neauga žemesnėje nei 70C (Vaitkus, 1999; Kulikauskienė, 2000; Olsen ir kt., 2004.).

Sūriuose ir pieno milteliuose randamos mikrofloros dalį sudaro žaliavinio pieno

mikroflora. Po pasterizacijos likusios bakterijos gali daugintis atskiruose technologinio proceso

etapuose, nes terminis apdirbimas nesunaikina visos mikrofloros ir kuo didesnis mikroorganizmų

skaičius žaliaviniame piene, tuo daugiau jų lieka po pasterizacijos. Kartais gali būti randamos

salmonelės, bet jos nėra termoatsparios ir tai rodo pasterizacijos režimų pažeidimus. Esant aukštai

pasterizacijos temperatūrai pagrindinę liekamosios mikrofloros dalį sudaro sporos, o po žemesnių

pasterizacijos temperatūrų vyrauja termoatsparių bakterijų ląstelės. Išlaikytame piene (20C

temperatūroje) psichrotrofų padaugėja 10–20 kartų per 1–2 paras, termoatsparios bakterijos

tokiomis sąlygomis nesidaugina, žaliavoje jų nepadaugėja, pasterizacija 16 s. esant 740C

temperatūrai duoda pakankamą efektą (1 lentelė) (Raguckaitė ir kt., 1990; Poznanski ir kt., 2004;

http://textbookof bacteriology.net/ nutgro.html.).

14

1 lentelė. Minimali, optimali, maksimali temperatūra mikroorganizmų dauginimuisi

(http://textbookof bacteriology.net/nutgro.html.).

Mikroorganizmai Minimali temperatūra

0C

Optimali temperatūra

0C

Maksimali temperatūra

0C Listeria monocytogenes 1 30–37 45 Pseudomonas maltophilia 4 35 41 Thiobacillus novellus 5 25–30 42 Staphylococcus aureus 10 30–37 45 Escherichia coli 10 37 45 Clostridium kluyveri 19 35 37 Streptococcus pyogenes 20 37 40 Streptococcus pneumoniae 25 37 42 Thermus aquaticus 40 70–72 79

2.3. Drėgmės kiekio svarba pieno mikroflorai

Džiovinimas yra vienas seniausių maisto konservavimo būdų. Džiovinant konservuojami

įvairūs maisto produktai: žuvis, pienas, kiaušiniai, vaisiai, daržovės, grybai ir kt. Mikroorganizmai

labai jautrūs vandens kiekio keitimuisi. Mažėjant jo terpėje, mikroorganizmai silpniau auga, ilgėja

jų prisitaikymo fazė, mažėja augimo koeficientas. Sumažėjus vandens kiekiui iki tam tikros ribos,

augimas gali visiškai sustoti, nes sutrikdoma reikiamo kiekio ATP sintezė ir tuo pačiu mikrobinis

ląstelės medžiagų apykaitos procesas. Daugumos bakterijų veikla sustoja, kai sumažėja terpėje

vandens iki 20–30 proc., o mikromicetų – iki 10–15 proc. (Toller, 1989; Garmienė ir kt., 2001;

Branco ir kt., 2003; http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html.).

Specifiniai spalvos, aromato, skonio, konsistencijos pakitimai yra sąlygojami vandens

aktyvumo (toliau aw) dydžio, kuris ir apsprendžia cheminių, fermentinių reakcijų greitį bei

mikrobiologinio proceso intensyvumą. EEB šalyse aw rodiklis yra privalomas vertinant maisto

produktų kokybę, o JAV aw yra įtrauktas į „Maisto produktų ir vaistų preparatų kokybės kontrolės

instrukciją. Lietuvoje aw rodiklis kol kas naudojamas eksportuojant kai kuriuos produktus į JAV,

taip pat kai kuriuose konditerijos įmonėse. Kazeino drėgmės kiekis nustatomas procentais

(Standartas (EEB) Nr. 2921, 1990; Garmienė, Pociūtė, 1999; Garmienė ir kt., 2001.).

Grynas vanduo (100 proc. vanduo) prilygsta 1 aw dydžiui. Produktai su mažu iki 10 proc.

drėgmės kiekiu atitinka aw<0,58. Tokio aw produktai yra dauguma išdžiovintų produktų: kazeinas,

pieno milteliai, sausos išrūgos ir kt. Pagaminto kazeino drėgmė neturi būti daugiau nei 10 proc.

Drėgmė normuojama todėl, kad svarbiausia produkto sudėtis yra kazeinas. Be to, esant

15

drėgnesniam kazeinui, jo paviršiuje gali pradėti daugintis pelėsiai. Dauguma mikroorganizmų

nesivysto esant aw<0,06. Ypač svarbus aw dydis tarp 0,58–0,97, nes gali įtakoti mikrofloros

dauginimąsi produkto gamybos ar laikymo metu. Daugeliui bakterijų optimalus aw dydis yra

0,990–0,995. Dauguma bakterijų nustoja augti kai aw mažesnis nei 0,90–0,94 (2 lentelė), o

gramneigiamoms bakterijoms reikia didesnių vandens aktyvumo verčių. Mikroorganizmų

dauginimosi intensyvumui svarbūs aw dydžiai yra 0,58–0,97: Salmonella spp. – 0,94, Listeria

monocytogenes – 0,93, Escherichia coli – 0,96, halofilinių bakterijų – 0,75, mielių – 0,88–0,85,

pelėsinių grybų – 0,8, osmofilinių mielių – 0,61–0,60, kserofilinių (vystosi ant sausų terpių)

pelėsinių grybų – 0,62–0,61. Dauguma pelėsių nesivysto jau prie aw 0,91–0,80. Dalis mielių ir

pelėsių gali egzistuoti ir prie didelės tirpiųjų medžiagų koncentracijos produkte. Pienarūgščių

bakterijų augimui taip pat turi įtakos aw reguliavimui naudojamų medžiagų cheminė prigimtis

(Bahrs, Herrero, 1979; Steinberg, 1989; Toller, Hareman, 1989; Standartas (EEB) Nr. 2921/90,

1990; Freidler ir kt., 1993; Bontovits, 1999; Visackas, 2000; Garmienė ir kt., 2001; Branco ir kt.,

2003; http:// textbookofbacteriology.net/nutgro.html; http://class.fst.ohio-state.edu/FST 201/

MEM/ microorg.htm.).

2 lentelė. Mikroorganizmų augimui minimalus vandens aktyvumas (aw) (Bontovits,

1999; http://textbookofbacteriology. net/nutgro.html.).

Mikroorganizmai Minimalus aw Caulobacter spp. 1,00 Spirillum spp. 1,00 Pseudomonas spp. 0,91 Salmonella spp. / E. coli 0,91 Lactobacillus spp. 0,90 Bacillus spp. 0,90 Staphylococcus spp. 0,85 Halococcus spp. 0,75 Listeria monocytogenes 0,93 Clostridium perfringens 0,95 Clostridium botulinum 0,93

Jei produktų aw yra ne didesnis kaip 0,7, tokie produktai gali ilgai išsilaikyti negesdami.

Vandens aktyvumas glaudžiai susijęs su santykiniu oro drėgnumu, t. y. produkto santykinis

drėgnumas, kuris nekinta esant pastoviam aplinkos oro santykiniam drėgnumui. Dauguma

bakterijų auga esant 90–95 proc. santykiniam oro drėgnumui. Sujungtas vanduo pagal savo

savybes skiriasi nuo vandens, kaip tirpiklio, kadangi tik tirpale vyksta mikrobiologiniai ir

biocheminiai procesai. Norint juos sumažinti ar sustabdyti, reikia pašalinti nesujungtą vandenį

16

arba padidinti sujungto vandens tūrį. Džiovinimo procesas leidžia pasiekti tam tikrą drėgmės lygį

maisto produktuose, kai juose sustabdomas mikrobiologinis gedimas. Sausus išdžiovintus

produktus galima ilgai sandėliuoti. Pagamintas kazeinas laikomas sausoje vėdinamoje patalpoje,

kurioje santykinis oro drėgnumas ne didesnis kaip 65 proc., esant 5–250C temperatūrai,

realizacijos trukmė ne ilgesnė kaip 24 mėnesiai (Toller, Hareman, 1989; Garmienė, Pociūtė, 1999;

Bontovits, 1999; Garmienė ir kt., 2001; „X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

Purkštuvinėse džiovyklose žūna palyginti mažai mikroorganizmų, nes esant oro

temperatūrai 150–2000C, garuojant vandeniui pieno lašelių temperatūra nukrinta iki 70–800C.

Džiovinimo metu aplink ląsteles susidaro sausų pieno medžiagų sluoksnis, apsaugantis bakterijas

nuo išdžiūvimo. Kazeinas džiovinamas 80–850C temperatūros oru. Termoatspariosios bakterijos

gali atlaikyti minėtą temperatūrą, todėl siekiant gauti geros kokybės pieno miltelius, žaliavoje

neturi būti daug šių bakterijų, taip pat būtina išvengti jų dauginimosi technologinio proceso metu.

Pagaminto produkto mikrobiologinius tyrimus reikia atlikti praėjus kelioms dienoms po jų

gamybos. Laikymo metu lieso pieno milteliuose mikroorganizmai laipsniškai žūva, išskyrus

sporas, nes miltelių drėgmė neviršija 5 proc., ir tik padidėjus drėgnumui gali daugintis pelėsiai,

taigi pagrindinis faktorius, dėl ko gali padidėti bendras bakterijų skaičius produkto saugojimo

metu yra antrinis užteršimas (Raguckaitė ir kt., 1990; Vaitkus, 1999; “X“ įmonės kazeino

gamybos instrukcija, 2003.).

2.4. Pieno mikrofloros atsparumas rūgštingumui

Aplinkos sąlygos, kuriomis kaitinami mikroorganizmai, taip pat didina arba mažina jų

atsparumą. Įtakos turi kaitinamo produkto drėgmės kiekis, cheminė sudėtis. Kaitinami rūgštinėje

terpėje mikroorganizmai žūva greičiau. Mikroorganizmų jautrumas aukštai temperatūrai kur kas

didesnis kai pH mažesnis kaip 5 (4,6 ir mažesnis). Mažinant maisto pH, proporcingai didėja

nedisocijuotų molekulių, kartu ir jų antimikrobinis aktyvumas. Sūrių gamyboje greitai sumažinta

pH vertė dar daugiau sumažina aw. Kazeino gamybos metu druskos rūgštis pastoviai maišoma su

nugriebtu pienu, mišinio pH būna nuo 4,5 iki 4,6 („X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003;

Pranik, 2003; Arenas ir kt., 2004; Alrgria ir kt., 2004.).

17

3 lentelė. Mikroorganizmų augimo minimalus, maksimalus ir optimalus pH (http://

textbookofbacteriology.net/nutgro.html.).

Mikroorganizmai Minimalus pH Optimalus pH Maksimalus pH Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0–2,8 4,0–6,0 Sulfolobus acidocaldarius 1,0 2,0–3,0 5,0 Bacillus acidocaldarius 2,0 4,0 6,0 Zymomonas lindneri 3,5 5,5–6,0 7,5 Lactobacillus acidophilus 4,0–4,6 5,8–6,6 6,8 Staphylococcus aureus 4,2 7,0–7,5 9,3 Escherichia coli 4,4 6,0–7,0 9,0 Clostridium sporogenes 5,0–5,8 6,0–7,6 8,5–9,0 Erwinia caratovora 5,6 7,1 9,3 Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6–7,0 8,0 Thiobacillus novellus 5,7 7,0 9,0 Streptococcus pneumoniae 6,5 7,8 8,3 Nitrobacter spp. 6,6 7,6–8,6 10,0

Termofilinės pieno rūgšties lazdelės geriausiai dauginasi silpnai rūgščioje terpėje (pH

6,5). Jos gali vystytis ir labai rūgščioje terpėje (pH 3,8), streptokokai tokioje terpėje nesivysto.

Dauguma pieno rūgšties bakterijos laktozę paverčia pieno rūgštimi, taip mažindamos pH. pH

mažėjimas, pridedant druskos ir šalinant vandenį, suteikia produktui stabilumo. Be to, rūgščiuose

produktuose tokios kaip pieno rūgšties bakterijos iš pieno cukraus, baltymų ir riebalų gamina

metabolitus (Smit, 2004; Pernoud ir kt., 2004; http://textbook ofbacteriology.net/nutgro.html.).

Listerijos gana atsparios aplinkos veiksniams. Optimalus jų pH yra 7,2–7,4.

Mikroorganizmų dauginimuisi žemoje temperatūroje minimalus terpės yra pH 5,7–6,37. Listerijos

išlieka gyvybingos sūryme, druskai jos atsparios. Salmonelės išlieka gyvybingos kai pH 4,1–9,0

(optimalus pH 7,2–7,4). Raugintuose produktuose, kurių aktyvusis rūgštingumas yra mažesnis

kaip 4,5, salmonelės nesidaugina. E. coli optimalus pH yra 5,5 (Kulikauskienė, 2000; Branco ir

kt., 2003; Elhanafl ir kt., 2004.).

Sūdytuose ir sausai laikytuose sūriuose bei sūryme laikytuose sūriuose mažėja pH ir

sumažėja koliforminių bakterijų, pelėsių, mielių skaičius. Enterobacteriaceae šeimos bakterijų

neberandama 15 dienų brandintuose sūriuose. Atliktuose jogurto pavyzdžių mikrobiologinės

kokybės eksperimentuose, per 1, 3 ir 9 brandinimo periodo dienas, sumažėja pH vertė ir pieno

rūgšties koncentracija. Laikymo metu sumažėja gyvybingumas Streptococcus spp. (nuo 1,01x108

iki 3,97x107 KSV/ml), be to sumažėja ir Lactobacillus spp. gyvybingumas (nuo 2,32x107 iki

6,95x106 KSV/ml). Jogurto mėginyje (po 10 dienų laikymo) pH sumažėja iki 4,5, o inokuliuotų

Salmonella hadar neaptinkama. Šviežiai pagaminto pasterizuoto pieno mikrobiologiniai tyrimai

18

gerai neparodo pieno kokybės, dėl to jie atliekami praėjus 24 val. po pagaminimo ir laikymo

(Vaitkus, 1999; Atasever ir kt., 2003; Božanic ir kt., 2003; Al-Haddad, Robinson, 2003; Arenas ir

kt., 2004.).

Plovimo talpoje kazeino grūdeliai plaunami vandeniu, kurio pH palaikomas tarp 3,8–4,0.

Rūgštus vanduo, nepaisant to, kad jame nėra organinių medžiagų, yra labai toksiškas, nes per 1

val. žūva daigiau kaip 10 proc. dafnijų, o per 3 val. – 100 proc., tuo tarpu neutralizuotame

vandenyje dafnijos išgyvena 24 val. Taigi, nutekamojo vandens pH yra vienas lemiamų rodiklių,

rodančių jo toksiškumą (Pridotkienė, Šarkinas, 1993; „X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija,

2003.).

2.5. Kazeinas ir jo cheminė sudėtis

Kazeinas yra pagrindinis pieno baltymas, kuris sudaro 80 proc. pagrindinių pieno

proteinų. Likusius sudaro išrūginiai pieno baltymai (Lehmann ir kt., 2000; Vaitkus ir kt., 2001;

http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/IFT/unit_three.html.).

Jis susideda iš αs1-, αs2-, β- ir κ-kazeinų. κ-kazeinas sudaro 1/8 kazeino. 60 proc. pieno

sudėties pokyčių priklauso nuo genetikos, o kiti 40 proc. nuo aplinkos faktorių. Sūrių gamyboje

svarbūs κ-kazeino genetiniai variantai (A, B, C, D). Pienas su κ-kazeino tipu BB turi daugiau

baltymų negu atitinkamas AA tipas, o AB tipas duoda vidutinį baltymų kiekį (Kamerleneris, 1995;

Vaitkus ir kt., 2001; Žitny ir kt., 2002.).

Kazeinas piene yra koloidinėje ištirpusioje formoje. Priklausomai nuo temperatūros,

mechaninio ir joninio ryšio kazeinas yra 10–200 nm dydžio. Esant kazeino dydžiui tarp 10–30 nm

kalbama apie kazeino submiceles, o esant dydžiui tarp 30–200 nm – apie kazeino miceles. Šios

micelės susidaro iš daugelio submicelių, kurios užima apie pusę micelių tūrio, kita dalis užpildyta

vandeniu su jame ištirpusiais jonais, laktoze ir enzimais. Submicelės susijungia į kazeino miceles,

veikiant kalcio jonais ir kalcio fosfatais, t. y. susidaro kazeino kalcio fosfato kompleksas.

Kazeinas yra sudarytas iš kazeino frakcijų, kurios pasiskirsčiusios 60 proc., 25 proc., 15 proc. nuo

bendro kazeino kiekio. Kazeino frakcijas sudaro įvairios polipeptidinės grandinės, kurios

sudarytos iš didelio kiekio amino rūgščių, kurios susijungusios tarpusavyje peptidinėmis jungtimis

(karvių piene iš žinomų 20 amino rūgščių yra 19). Kazeino frakcijos turi didelę reikšmę

nusodinant (išskiriant) kazeiną. Jas sudaro kalciui jautrus kazeinas – hidrofobinė dalis ir kalciui

19

nejautrus kazeinas – hidrofilinė dalis (Kamerleneris, 1995; Lehmann ir kt., 2000; Кузнецов,

2003.).

Kazeino submicelė įgauna tokį susisluoksniavimą, kur hidrofobinės kazeino frakcijos yra

branduolyje, o hidrofilinės kazeino frakcijos skystoje fazėje išsidėsčiusios aplinkui. Kazeino

paviršių sudaro 45 proc. kalciui jautraus kazeino ir 45 proc. nejautrios kalciui jautraus kazeino

dalies, dėl ko susidaro kalciui jautraus kazeino atsparumas kalcio jonams (Lehmann ir kt., 2000;

Кузнецов, 2003.).

Kazeino micelės yra pagrindinių kazeino frakcijų (αS-, β- ir κ- kazeinų) aglomeratai. Yra

žinoma, kad αS1- ir β- kazeinai gali prisijungti didelį Ca+2 jonų kiekį. Tai sukelia jų agregaciją ir

juos nusodina, o κ- kazeinas neprisijungia Ca+2 jonų ir yra tirpus esant didelei Ca+2 jonų

koncentracijai. Kazeino micelės paviršiuje išsidėstęs κ- kazeinas yra stabilizatorius, apsaugantis

jos sudėtyje esančias αS- ir β- kazeino frakcijas nuo agregacijos (Narkevičius, 2003; Горбатовa,

2003.).

Traukinant pieną hidrofilinis gliukomakropeptidas atskyla nuo kazeino micelę

stabilizuojančio κ- kazeino. Kazeino micelėje lieka pagrindinė hidrofobinė κ- kazeino dalis –

para- κ- kazeinas, kuris yra jautrus Ca+2 jonams. Destabilizuotos kazeino micelės jungiasi ir

sudaro sutrauką. Pieno klampumas mažėja kai pH vertė kyla, ir atvirkščiai kai pH žemėja pieno

klampumas didėja, nes tarp kazeino micelių sustiprėja jungtys (Narkevičius, 2000; Narkevičius,

2003; Achema ir kt., 2004.).

Didelė natūralaus pieno kalcio dalis prarandama gaminant baltyminius pieno rūgštinio

koaguliavimo produktus. Tai susiję su jo chemine būkle piene ir pokyčių, kintant pieno terpei,

specifika. Kazeino molekulėje kalcis yra prijungtas prie fosforilinto centro, todėl jo kiekis, susijęs

su micele, nepriklauso nuo Ca2+ koncentracijos terpėje, o vienas iš kazeino micelę stabilizuojančių

veiksnių yra amino- grupės, fosfato ir kalcio jonų elektrostatinė sąveika. Mažėjant pieno pH,

stiprėja koloidinių kalcio druskų jonizacija, didėja jų tirpumas, sukeliantis kazeino micelių

deagregavimą ir tolesnį jo koloidinės būklės destabilizavimą, ir didžioji kalcio druskų dalis

pereina į tirpalą. Pieną šildant, kalcio fosfato tirpumas mažėja, pieno mineralinių medžiagų (tarp

jų ir Ca) pusiausvyra pakinta, ir pieną atšaldžius, atsistato tik 60–65 proc. (Ramonaitytė, Činga,

1998; Narkevičius, Šimonėlienė, 2003; Горбатовa, 2003.).

Pagrindinė kalcio dalis piene yra koloidinė: 30 proc. koloidinio kalcio fosfato ir 40 proc.

kazeinatkalcio fosfato komplekso sudėtyje. Nuo druskų pusiausvyros priklauso pieno baltymų

koloidinis stabilumas. Druskų pusiausvyra kinta nuo temperatūros, aktyvaus rūgštingumo,

20

sudėtinių dalių koncentracijos ir kt. Karvės pieno druskų sudėtyje kalcio, surišto su kazeinu,

kiekis nuo bendros piene druskos masės 5,13 proc., o kiekis nuo pieno masės 0,0455 proc. Sergant

mastitu sumažėja kazeino dalelių dydis (Dukštas ir kt., 1994; Narkevičius, Šimonėlienė, 2003;

Кузнецов, 2003; Candioti ir kt., 2004.).

Kalcio kiekiui pieno produktuose turi įtakos kalcio fosfato (ar kitos kalcį sujungiančios

medžiagos) kiekis ir kiek kalcio surišta su kazeinu. Pieną šildant, kazeino micelės pradeda

deagreguoti (smulkėti), jų suminis paviršius padidėja, nes atsiranda daugiau potencialių kazeino

sąveikos su terpėje esančių joninių kalcių ir neorganinių fosfatų sričių. Atšaldžius pieną,

pasterizuotą 78 ±20C temperatūroje, iki 300C temperatūros, susmulkėję kazeino micelių agregatai,

jungdamiesi tarpusavyje, vėl sustambėja, tačiau pradinė kalcio formų pusiausvyra nevisiškai

atsistato, ir dalis sujungto kalcio ir fosfato gali būti uždaroma rūgštiškai koaguliuojančio kazeino

struktūroje. Pasterizuojant pieną aukštesnėje temperatūroje (iki 1000C) formuojasi kazeino ir Ca

sąveiką blokuojantys ĸ-kazeino ir denatūruojančio β-laktoglobulino kompleksai, deagregavusios

kazeino micelės vėl agreguoja į stambesnius darinius, atlaisvindamos žemesnėje šildymo

temperatūroje prijungtą kalcį, todėl į kazeino sutrauką jo įjungiama ne daugiau kaip iš

nepasterizuoto pieno (Ramonaitytė, Činga, 1998; Gapparov, Stan, 2003; Narkevičius,

Šimonėlienė, 2003; Горбатовa, 2003.).

Esant pH 6,6 natūraliame piene didžioji karboksilinių grupių (amino rūgščių

sudedamosios dalies) dalis disocijuoja kazeino paviršiuje ir suteikia kazeino micelei neigiamą

krūvį. Į šį neigiamą krūvį vanduo orientuoja aplinkinį skystį dėl savo dipolinio pobūdžio. Šis

vandens apvalkalas „atsakingas“ už kazeino koloidinį tirpumą (Lehmann ir kt., 2000.).

Čia suteikiamos neigiamos elektrostatinės jėgos vidinei hidratinio apvalkalo sričiai,

susisluoksniuoja teigiami kalcio jonai kaip priešingo krūvio jonai prie vandens apvalkalo ir

orientuojasi prie fazių ribos, kuri suorentavo elektrinį dvigubą sluoksnį koloide. Esant

lygiaverčiam kazeino dalelių krūviui, susidaro atostūmio jėga, dėl kurios nesusidaro natūraliame

piene baltymų dalelių aglomeracijos. Norint išskirti kazeiną, reikia sumažinti paviršiaus krūvį ir

tuo pačiu atostūmio jėgas. Dėl to dalelės galės tiek keistis, kol tarp jų ims veikti traukos jėgos

(van der Wallsso jėgos) (Lehmann ir kt., 2000.).

Kazeino dalelės juda kartu, ir susidariusios grandinės sudaro tinklą, kuris pertraukia visą

skysčio tūrį su ištirpusiomis pieno sudedamosiomis dalimis ir esančiomis riebalų dalelėmis, tai

vadinamą sutrauką. Kai hidratuotuojasi kazeinas, jo pradinė masė prisijungia vandenį, padidėja

dvigubai. Kazeino kiekis sudaro 78–80 proc. nustatyto bendrojo azoto kiekio. Kazeinas turtina

21

sutrauką ir skatina sinerezės intensyvumą. Ganyklinio sezono metu kazeino kiekis piene padidėja

(Vaitkus ir kt., 2001; Lehmann ir kt., 2000.).

Per didelis riebalų kiekis veikia kazeino grynumą ir kokybę, t. y. mažina jo panaudojimo

galimybes. Be to, laikant kazeiną, riebalai apkarsta ir pablogėja jo kokybė. Riebalų kiekis kazeine

turi būti ne didesnis kaip 1,5 proc. Žinoma, kad pagamintame kazeine labai mažai išlieka kalcio ir

laktozė, jų daug randama išrūgose (15 lentelė) (Standartas (EEB) Nr. 2921, 1990; Kamerleneris,

1995; Visackas, 2000; Mickevičius, Matijoška, 2002; Maisto produktų bandymų protokolas Nr.

2977-1, 2004.).

15 lentelė. Kauno technologijos universiteto maisto instituto bandymų laboratorijoje

ištirtų dviejų išrūgų mėginių cheminė sudėtis (Maisto produktų bandymų protokolas, Nr. 2977-

1, 2004.).

Rezultatai Rodikliai I II

Laktozės kiekis, proc. 4,46 4,35 Kalcio kiekis, mg/proc. 25 21 Bendras sausų medžiagų kiekis, proc. 5,49 5,38 Azoto kiekis, proc. 0,058 0,058 Baltymų kiekis (azoto kiekis x 6,39), proc. 0,37 0,37 Fosforo kiekis, proc. 0,021 0,017 Cinko kiekis, mg/l 0,21 0,23 Pelenų kiekis, proc. 0,64 0,64

2.6. Kazeino gamyba

„X“ įmonėje gaminamas valgomasis rūgštinis kazeinas pagal sudarytus standartų

projektus, kurie patvirtinti Sveikatos apsaugos ministerijos nustatytą tvarką (“X“ įmonės kazeino

gamybos instrukcija, 2003.).

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) gaminimo principas: kazeino nusodinimas

nugriebtame piene, grūdelių plovimas, formavimas ir džiovinimas. Lieso pieno apdorojimo

aukštoje temperatūroje metu iškrenta serumo proteinai, pvz., laktoalbuminų frakcija. „Rūgštinio

kazeino nusodinimo“ metu, iškritę serumo proteinai pereina į kazeiną (Lehmann ir kt., 2000; „X“

įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

Liesas pienas 4–60C temperatūros siurblio pagalba paduodamas į kazeino gamybą.

Plokšteliniame šilumokaityje pienas kaitinamas nuo 25 iki 300C temperatūroje ir paduodamas į

susimaišymo talpą. Dozatorius nepertraukiamai dozuoja druskos rūgštį (toliau HCl) į susimaišymo

22

talpą. HCl pastoviai maišoma su nugriebtu pienu, mišinio pH būna nuo 4,5 iki 4,6. Sutraukintas

pienas vamzdiniame šilumokaityje, kur pradeda formuotis kazeino grūdeliai, pašildomas iki 45–

480C temperatūros ir joje išlaikomas nuo 1 iki 1,5 minutės. Rūgštinės koaguliacijos metu pirmoje

proceso stadijoje kazeinas netenka kalcio, o antroje – jis pereina į izoelektrinę būklę ir atsiskiria

nuo išrūgų. Izoelektriniame taške, kai aktyvusis rūgštingumas yra 4,6, kazeino tirpstamumas yra

mažiausias, jis pereina iš zolio į gelį ir koaguliuoja. Rauginant pieną susidaro vienalytė sutrauka,

o pieną sumaišius su rūgštimi, vyksta staigi koaguliacija, susidaro dribsniai, kurie iš karto

atsiskiria nuo išrūgų (Dukštas ir kt., 1994; „X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

Specialios paskirties siurblyje – maišytuve 8–120C temperatūros liesa pienas sumaišomas

su koaguliantu (HCl) ir akumuliuojamas specialioje talpoje. Po to jis pašildomas gariniu

elektoriumi ir nukreipiamas į vamzdinį pasterizatorių, kurio srovėje formuojasi sutrauka.

Pagrindiniai technologinio reglamento parametrai: koaguliacijos temperatūra yra 40–460C,

koaguliacijos aktyvusis rūgštingumas – pH 4,4–4,6, sutraukos išlaikymo trukmė – 1,0–1,5 minutės

(Dukštas ir kt., 1994; „X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

Kai hidratuotuojasi kazeinas, jo pradinė masė prisijungus vandenį padidėja dvigubai.

Kazeino kiekis sudaro 78–80 proc. nustatyto bendrojo azoto kiekio. Esant rūgštiniam nusodinimui

teigiamai įelektrinti vandens jonai prasiskverbia į kazeino miceles, sumažindami neigiamą micelių

krūvį. Tuo pačiu metu sumažėja hidratinis apvalkalas ir taip pat teigiamai įelektrintų kalcio jonų

sukurtas elektrinis dvigubas sluoksnis. Sumažinamas lygiareikšmis krūvis ir kartu stūmos jėgos

taip, kad persvertų traukos jėgas. Dėl dalelių šiluminės energijos kazeino molekulės susiduria ir

susijungia į didelius agregatus, kurie tuomet nusėda. Jų yra tuo daugiau, kuo aukštesnė

temperatūra, nes traukos jėgos didėja didėjant temperatūrai (maksimali temperatūra yra 580C).

Esant tam tikrai vandens jonų koncentracijai, kazeino molekulės persikelia nepakrautos.

Izoelektrinis kazeino taškas yra kai pH 4,6–4,7. Šiame taške baltymas nusėda geriausiai. Rūgštinis

kazeino nusodinimas yra reversinis (grįžtamasis) (Lehmann ir kt., 2000; Vaitkus ir kt., 2001.).

Toliau suformuoti grūdeliai nukreipiami į pirmą dekanterį, kuriame kazeinas atskiriamas

nuo išrūgų. Išrūgose lieka 6–6,9 proc. sausų medžiagų, 0,6–0,9 proc. baltymų, 4,5–5 proc.

laktozės. Iš pirmojo dekanterio kazeino grūdeliai patenka į pirmąją plovimo talpą, pH palaikomas

pridedant 1,0–1,5 gramo HCl litrui vandens. Plovimo talpoje kazeino grūdelius maišo mažo

greičio maišytuvai, nesuardydami smulkių kazeino dalelių. Plovimas vykdomas tuo pačiu

vandeniu visose trijose talpose. Pirmiausia vanduo patenka į trečią talpą, iš jos į antrą ir po to į

pirmą. Kazeino grūdeliai juda priešinga kryptimi – pirma talpa, antra ir trečia. Pirmoje plovimo

23

talpoje kazeino grūdeliai plaunami apie 15 min. esant nuo 70 iki 730C temperatūrai ir pH

palaikomas tarp 3,8–4,0. Iš pirmos plovimo talpos siurbliu kazeino grūdeliai pernešami į antrą

plovimo talpą per sietą. Į antrą talpą ateinantis vanduo įžektoriaus pagalba pašildomas nuo 85 iki

900C temperatūros, nes antroje talpoje produktas pasterizuojamas ne žemesnėje kaip 82–850C

temperatūroje ir šioje temperatūroje išlaikoma 15,5 s., palaikant pH 3,8–4,0. Jeigu reikiama

pasterizacijos temperatūra nepasiekiama, suveikia produkto grąžinimo vožtuvas ir grūdeliai

grąžinami į antrą plovimo talpą pakartotinai pasterizacijai. Po pasterizacijos kazeino grūdeliai

paduodami į trečią talpą, kurioje šalto vandens pagalba atvėsinami nuo 35 iki 400C temperatūros,

o vandens pH palaikomas tarp 4,4–4,6 („X“ įmonės kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

Rūgštinė sutrauka savo tinkle suriša bendrą skysčio kiekį, tai vadinama sinereze. Tačiau

kazeiną išgarinti reikia atskirti visą skysčio kiekį kartu su jame ištirpusiomis pieno

sudedamosiomis dalimis nuo kazeino. Tam naudojamas sinerezės efektas. Sinerezė yra sutraukos

savybė, kurią sąlygoja tarp kazeino dalelių veikiančios cheminės traukos jėgos. Sinerezės proceso

metu sumažėja tūris, kurio metu sustorėja kazeino grandinė ir išspaudžiamas serumas iš sutraukos.

Tai įvyksta savaime (spontaniškai) be išorinių jėgų poveikio. Užkrėstumas (kontaminacija) vyksta

raukšlėjimosi centro kryptimi. Šis procesas yra labai priklausomas nuo temperatūros. Kuo

aukštesnė temperatūra, tuo stipriau vyksta sinerezė. Sinerezę skatina drebučių (sutraukos)

maišymas. Kuo geriau bus sutrauka supjaustyta, tuo geriau ir tuo daugiau išrūgų bus galima

išspausti (Lehmann ir kt., 2000.).

Vykstant sinerezei, sumažėja gelio tūris. Daugelyje darbų, tyrinėjančių polimerus ir

kazeino dispersiją piene, parodyta, kad sumažėjęs koloidinės sistemos dalelių tūris sumažina

klampumą. Todėl su ryškesnėmis sineretinėmis savybėmis suardytos pieno sutraukos klampumas

turėtų būti mažesnis negu sutraukos su mažesne sinereze (Kulikauskienė ir kt., 1999; Кузнецов,

2003.).

Sinerezės efektyvumui taip pat turi reikšmės ir sutraukos pH. Vandenilio jonų

koncentracijos didėjimas apsprendžia daug svarbių parakazeino savybių. Aktyviajam

rūgštingumui didėjant kalcis atskyla nuo parakazeinatfosfato komplekso ir pereina į tirpią būklę.

Trikarboninio fosfato perėjimas į tirpalą visiškai pasibaigia esant pH 4,7–4,8 (kazeino

izoelektrinis taškas). Kalcis sujungtas su parakazeinu, visiškai atskyla kai pH 4,3–4,0 (Lehmann ir

kt., 2000; Ramanauskas, Alenčikienė, 2002.).

Esant temperatūrai žemiau kaip 160C sinerezė nebevyksta, ji „užšąla“. Kazeino gamyboje

sinerezės efektas pagerėja maišant susidariusią sutrauką. Susidariusi sutrauka yra kaitinama iki

24

skirtingų temperatūrų. Sinerezę skatina kuo aukštesnė temperatūra ir kuo ilgesnis šildymo laikas.

Tačiau temperatūra yra ribota, nes nuosėdos nuo išrūgų toliau atskiriamos mechaniniu būdu, pvz.,

panaudojant dekanterį. Jei temperatūra peržengia 900C ribą gali atsirasti kazeino plastifikacijos

simptomai. Tokiu atveju sunkiai atsiskiria pieno sudėtinės dalys (laktozė, druskos ir kt.) nuo

išsiskyrusio kazeino. Lėtam, atsargiam sutraukos mišinio „degimui“ prieš „nuvandenijimą“ turėtų

būti panaudotas netiesioginis veikimo būdas, kad būtų užkirstas kelias taip vadinamam nuosėdų

sluoksnių suragėjimui, jei būtų nebegalimas išrūgų atskyrimas ir būtų nebegalima gauti „gryno“

kazeino, tokiu būdu būtų prieinama iki kokybės klaidų. Suragėjimas yra kazeino dalelių sankaupa

sutraukos kraštuose, atsirandantis kaip paseka per skubaus ir per stipraus nuosėdų terminio ar

mechaninio apdorojimo (Lehmann ir kt., 2000; Кузнецов, 2003.).

Iš trečios talpos kazeino grūdeliai nukreipiami nusausinimui į antrą dekanterį. Iš pirmos

ir trečios plovimo talpos plovimo vanduo nukreipiamas į antrąją plovimo talpą. Nusausinti

kazeino grūdeliai patenka į grūdelių formavimo įrenginį – Niblerį. Iš kazeino dribsnių

suformuojami 2–5 mm dydžio kazeino grūdeliai ir nukreipiami į džiovyklą, kurioje kazeinas

džiovinamas 80–850C temperatūros oru. Išdžiovinti smulkūs kazeino grūdeliai patenka į cikloną,

kur veikiami išcentrinės jėgos nusėda į ciklono dugną ir oro transportu paduodami į fasavimo

bunkerį. Stambesni kazeino grūdeliai patenka į malūną, kuriame grūdeliai sumalami iki 2–3 mm

dydžio ir oro transportu paduodami į fasavimo bunkerį, iš kur kazeinas fasuojamas į 1000 kg

talpos maišus su polimerinės medžiagos įdėklu. Polimerinis įdėklas užsandarinamas. Kazeino

maišai laikomi ne didesnėje kaip 65 proc. santykinės drėgmės ore ir esant nuo 5 iki 250C

temperatūroje. Tinkamas vartojimui terminas yra ne ilgesnis kaip 24 mėnesiai („X“ įmonės

kazeino gamybos instrukcija, 2003.).

25

3. Medžiagos ir metodai

LVA mikrobiologijos laboratorijoje, taip pat „X“ įmonės mikrobiologinėje ir cheminėje

laboratorijose 2003–2004 metais atlikti valgomojo rūgštinio kazeino mokslinio – tiriamojo darbo

bandymai.

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginiai imti švariu ir sausu zondu, juo

smeigiant į produktą (1 Priedas), paimti po 200 g kazeino mėginiai, kurie supilti į švarius

maistinius maišelius. Paimtų kazeino mėginių pirmiausia atlikti mikrobiologiniai tyrimai, tada iš

tų pačių kazeino mėginių atlikti cheminiai tyrimai.

LVA ir „X“ įmonėje ištirti 168 kazeino mėginiai: atliktas drėgmės kiekio, riebalų kiekio,

laisvojo rūgštingumo kiekio, bendro bakterinio užterštumo (1 g kazeino mėginio), koliforminių

bakterijų tikėtiniausio skaičiaus (toliau TS) (0,1 g kazeino mėginio), E. coli nustatymas. Iš 168

kazeino mėginių atsitiktinai pasirinkti 50 kazeino mėginiai ir atlikti pakartotini (po keturių – šešių

dienų nuo kazeino pagaminimo dienos) tyrimai bendro bakterinio užterštumo ir koliforminių

bakterijų užterštumo atveju.

Iš 168 kazeino mėginių sudaryti 27 bendri kazeino mėginiai po 200 g. Bendras kazeino

mėginys sudarytas lygiomis dalimis sumaišant po 4, 5, 6, 7, 9 kazeino mėginius, kad susidarytu

vienas 200 g bendras kazeino mėginys. Šiuose bendruose kazeino mėginiuose (po keturių – šešių

dienų nuo kazeino pagaminimo dienos) ieškota termofilinių bakterijų (1 g kazeino mėginio),

Listeria spp., Salmonella spp. (25 g kazeino mėginio).

Terpės ir reagentai pirkti iš „Linea litera“ firmos. Cheminiams tyrimams naudoti

reagentai pirkti iš „Eksma“ ir „Biometrija“ firmų.

3.1. Naudotos terpės

Mikrobiologijos laboratorijoje kazeino mikrobiologiniam tyrimui naudoti:

• Skiedikliai: dikalio hidrofosfato druskos tirpalas.

Bendro bakterinio užterštumo nustatymas:

Plate count agaras (Oxoid, Anglija).

Termofilinių bakterijų skaičiaus tyrimui:

Plate count agaras (Oxoid, Anglija).

Žarnų lazdelių grupės bakterijoms:

26

Laurylo sulfato ir triptozės sultinys (Oxoid, Anglija),

EC sultinys (Oxoid, Anglija),

Triptono vanduo (Oxoid, Anglija),

Laktozės, tulžies ir briliantinio žaliojo sultinys (Oxoid, Anglija),

Endo agaras (Oxoid, Anglija),

Violetinio raudonojo tulžies laktozės agaras (Oxoid, Anglija),

Levino E.M.B. agaras (Oxoid, Anglija).

Salmonelų tyrimui:

• Buferinio peptono vanduo (Oxoid, Anglija),

Rappaport-Vassiliadis sojos sultinys (Oxoid, Anglija),

Miulerio-Kaufmano tetrationato ir novobiocino sultinys (Oxoid, Anglija),

Ksilozės lizino dezoksicholato agaras (Oxoid, Anglija),

Briliantinės žalumos agaras (Oxoid, Anglija).

Listerijų tyrimui:

Lauryno sulfato ir triptozės sultinys (Oxoid, Anglija),

Oksfordo agaras (Oxoid, Anglija),

triptono sojos mielių ekstrakto agaras (Oxoid, Anglija).

Reagentai ir maitinamosios terpės (sultiniai ir agarai) ruošti pagal gamintojo pateiktas

rekomendacijas.

Kovac's (regent soliutio for indole test) reagentas (Oxoid, Anglija), taip pat mikroorganizmų

morfologijai nustatyti naudoti „Gram method diferential staining“ (Oxoid, Anglija) dažymo tirpalai,

pirkti iš „Linea litera“ firmos. Naudotas mikroskopas su imersiniu objektyvu didinančiu 100 kartų.

27

3.2. Valgomojo rūgštino kazeino mikrobiologiniai ir cheminiai kriterijai

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių atliktų tyrimų mikrobiologiniai ir

cheminiai rezultatai lyginti su standarte (EEB) Nr. 2921 „Dėl paramos iš nugriebto pieno

gaminamų kazeino ir kazeinatų gamyba“ (1990) ir standarte Nr. 92/46/EEB „Higienos

reikalavimai pienui, termiškai apdorotam pienui, pieno produktų gamybai ir prekybai“ (1992)

nurodytais maksimaliais produkto sudėties reikalaujamais rodikliais (4 lentelė).

4 lentelė. Privalomi kriterijai (Standartas (EEB) Nr. 2921, 1990; Standartas Nr.

92/46/EEB, 1992).

Kazeino sudėtis Rodikliai Maksimalus drėgmės kiekis 10,00 proc. Maksimalus riebalų kiekis 1,50 proc. Laisvosios rūgštys (maksimalus kiekis) 0,27 ml/g Bendras bakterinis užterštumas (daugiausia 1 grame) 30 000 Koliforminės bakterijos (0,1 grame) nėra Termofilinių bakterijų skaičius (daugiausia 1 grame) 5 000 Listeria monocytogenes Nėra 25 g3, n= 10 Salmonella spp. Nėra 25 g3, n= 10

Paaiškinimas. n – kazeino mėginių skaičius, kuriuose bakterijų neturi būti;

25 g3 sudaro pasirinkti kazeino mėginiai, kurie paimti iš vienos

gamybinės partijos skirtingų vietų.

3.3. Tiriamųjų valgomojo rūgštinio kazeino mėginių, pradinių suspensijų ir dešimtkarčių skiedimų ruošimas mikrobiologiniams tyrimams

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginiai imti švariu ir sausu zondu, juo

smeigiant į produktą (2 Priedas), paimti po 200 g kazeino mėginiai, kurie supilti į švarius

maistinius maišelius. Kazeino mėginiai imti kaip nurodyta standarte LST EN ISO 707 (1999).

Kazeino mėginiai, kurie imti bendro bakterinio užterštumo ir koliforminių bakterijų

nustatymui imti nepraėjus parai po kazeino pagaminimo. Kiti kazeino mėginiai, kuriuose ieškota

Salmonella spp., Listeria monocytogenes, nustatytas termofilinių bakterijų skaičius, pakartotinai

skaičiuotas bendras bakterinis užterštumas ir koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius, imti

ketvirta – šešta diena po gamybos, kada produktas atvėsta.

Tiriamųjų kazeino mėginių pradinės suspensijos ir dešimtkarčiai skiediniai ruošti

mikrobiologiniams tyrimams pagal standartą LST EN ISO 8261 (2002). Kazeino mėginių

28

skiediklis naudotas dikalio hidrofosfato tirpalas, išpilstytas į 250 ml talpos buteliukus porcijomis

po 225 ml, 90 ml ir po 9 ml – į mėgintuvėlius.

Atsverta 10 g (25 g – salmonelių ir listerijų tyrimui) kazeino mėginio, kuris supiltas į 250

ml talpos buteliukus su 90 ml (225 ml – salmonelių ir listerijų tyrimui) dikalio hidrofosfato

tirpalu. Gautas 10-1 kazeino mėginio praskiedimas, kurio 1 ml supiltas į mėgintuvėlį su 9 ml

dikalio hidrofosfato tirpalu. Gautas 10-2 kazeino mėginio praskiedimas, ta pačia tvarka gautas ir

10-3 kazeino mėginio praskiedimas (3 Priedas).

3.4. Valgomojo rūgštinio kazeino bendro bakterinio užterštumo tyrimai

Mikroorganizmų kolonijas, išaugusias aerobinėmis sąlygomis 300C temperatūroje,

sudarančių vienetų skaičius (1 g valgomojo rūgštinio kazeino) nustatytas pagal standartą LST EN

ISO 4833 (2003). Į dvi Petri lėkšteles įpilta po 1 ml 10-2 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino)

mėginio praskiedimo, o į kitas dvi – po 1 ml 10-3 kazeino mėginio praskiedimo ir įpilta apie 15 ml

450C temperatūros Plate count agaro (toliau PCA agaro), ir išmaišyta. Sustingus terpei, lėkštelės dėtos

į termostatą, kultivuota 72 val. esant 300C temperatūrai (4 Priedas).

Vertintos lėkštelės turinčios ne mažiau kaip 15 kolonijų ir ne daugiau kaip 300 kolonijų.

Po kultivavimo mikroorganizmų skaičius N produkto grame nustatytas pagal tokią formulę:

Σ C N = ; (n1 + 0,1 n2) x d

Čia: ΣC – kolonijų, suskaičiuotų ant visų neatmestų lėkštelių suma;

n1 – pirmojo skiedinio neatmestų lėkštelių skaičius;

n2 – antrojo skiedinio neatmestų lėkštelių skaičius;

d – skiedimo laipsnis, atitinkantis pirmąjį skiedinį.

Jeigu dviejose lėkštelėse, į kurias buvo pasėtas kazeino mėginys, išaugo mažiau kaip 15

kolonijų, rezultatas skaičiuotas taip:

Mikroorganizmų skaičius grame:

N = m x d-1;

Čia: d yra pradinės suspensijos skiedimo laipsnis.

29

Gautas rezultatas apvalintas iki dviejų reikšmių skaičių. Mikroorganizmų skaičius kazeino

mėginio viename grame, išreikštas skaičiumi tarp 1,0 ir 9,9, padauginus 10x (čia x yra atitinkamas

laipsnis).

3.5. Termofilinių bakterijų tyrimas valgomajame rūgštiniame kazeine

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginiuose termofilinių bakterijų skaičius

nustatytas pagal IDF standarte 100B (1991) aprašytą metodą. Termofilinių bakterijų skaičiaus

nustatymas panašus į bendro bakterinio užterštumo nustatymą (4 Priedas), tačiau termofilinės

bakterijo kultivuojamos esant 55 ±10C temperatūrai, kaip reikalaujama standarte (EEB) Nr. 2921

(1990).

Po 1 ml 10-2 kazeino mėginio praskiedimo pasėta į dvi Petri lėkšteles su PCA agaru ir po 1

ml 10-3 kazeino mėginio praskiedimo į kitas Petri lėkšteles su PCA agaru. Kultivuota 48 val. esant

55 ±10C temperatūrai.

Apsaugant terpes nuo išdžiuvimo kultivavimo metu, lėkštelės sudėtos į sterilius

maišelius.

3.6. Koliforminių bakterijų tyrimas valgomajame rūgštiniame kazeine

Pagal standarte (EEB) Nr. 2921 (1990) taikomus reikalavimus gaminamam valgomajam

rūgštiniam kazeinui, 0,1 g valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginio neturi būti

koliforminių bakterijų. Naudota penkių mėgintuvėlių eilė ir į kiekvieną mėgintuvėlį su terpe sėta

po 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo. Koliforminių bakterijų tikėtiniausiojo skaičiaus (0,1 g

kazeino mėginio) nustatymui naudotas standarte LST ISO 4831 (1999) nurodytas metodas.

Dalis mikroorganizmų padermių, vadinamų koliforminėmis bakterijomis, tarp jų žarnų

lazdelių (Escherichia coli), nepagamina pakankamai dujų, aptikimui naudojant plūdeles (t. y.

anaerogeninės padermės). Standarte aprašytu metodu nenustatomi enterobakterinių šeimai

priklausančios gentys, kitose publikacijose priskiriami numanomoms koliforminėms bakterijoms,

t. y. tam tikri Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella gentys. Šiame standarte pateikti bendrieji

nurodymai kaip nustatyti maiste ir pašaruose esančias koliformines bakterijas tikėtiniausiojo

skaičiaus metodu po inkubavimo skystoje terpėje esant 300C, 350C ar 370C temperatūrai (LST ISO

4831, 1999.).

30

Į penkis mėgintuvėlius, su selektyviu pagausinimo Laurylo sulfato ir triptozės sultiniu

(toliau LST sultinys) išpilstytą po 10 ml į mėgintuvėlius su Durham plūdelėmis, sterilia pipete pasėti

po 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimai. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai. Po

kultivavimo iš mėgintuvėlių, su LST sultiniu, kilpele pernešta kultūra į mėgintuvėlius su

patvirtinimo Laktozės, tulžies ir briliantinio žaliojo sultiniu (toliau LTBŽ sultinys) ir kultivuota 48

val. esant 37 ±10C temperatūrai (5 Priedas). Po 48 val. kultivavimo koliforminių bakterijų skaičius

0,1 g kazeino mėginio nustatomas padauginant tikėtiniausią skaičių iš 10-1 kazeino mėginio

skiedimo.

LTBŽ sultinys skirtas koliformų aptikimui arba patvirtinimui. Joje esanti briliantinė

žaluma slopina kitus laktozę fermentuojančius mikroorganizmus, pvz., Clostridium perfringens.

Kai mėgintuvėlyje, su LTBŽ sultinyje pasėtu 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimu,

terpė po kultivavimo padrumstėjo ar Durham plūdelėse susidarė dujos, tuomet sėto kazeino

mėginio tolesnė analizė atlikta indolo testu su Kova‘c reagentu pagal standarte LST ISO 7251

(1996) aprašytą metodą. E. coli patvirtinimui naudoti trys mėgintuvėliai su LST sultiniu

(selektyviu praturtintu sultiniu), kuriame pasėta po 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo. Po 48

val. (esant 450C temperatūrai) kultivavimo iš kiekvieno mėgintuvėlio kilpele perneštas lašas

kultūros į tris mėgintuvėlius su 10 ml selektyviu EC sultiniu ir kultivuota 48 val. esant 45 ±10C

temperatūrai. Po 48 val. iš šių mėgintuvėlių kilpele perneštas kultūros lašas į atskirus

mėgintuvėlius su 5 ml triptono vandeniu ir kultivuota 24 val. esant 45 ±10C temperatūrai.

Escherichia coli 450C temperatūroje fermentuoja laktozę, išsiskiria dujas ir gamina

indolį. Kai kurios Escherichia coli patogeninės rūšys neauga 450C temperatūroje (LST ISO 7251,

1996.). Praėjus 48 valandom į mėgintuvėlius su pasėtu triptono vandeniu dėta 0,5 ml Kova‘c

reagento. Jei Kova‘c reagentas po 1 minutės nusidažo raudona spalva, tai rodo indolo buvimą, t. y.

E. coli buvimą (6 Priedas).

Nustačius koliforminių bakterijų tikėtiniausią skaičių (5 Priedas), iš mėgintuvėlių,

kuriuose LTBŽ sultinys susidrumstė ar pakeitė spalvą, taip pat kurių Durham plūdelėse susidarė

dujos, tolesnė analizė, žarnyno mikroorganizmams diferencijuoti pagal tai, ar jie fermentuoja

laktozę, kilpele perkeliama kultūra į Endo agarą, atskirų kolonijų gavimui sektoriniu metodu. Taip

pat kartu naudotas Violetinio raudonojo tulžies laktozės agaras (toliau VRTL agaras), tai

„selektyvi ir diferencinė terpė skirta aptikti ir skaičiuoti koliformus vandenyje, maiste ir pieno

produktuose. Tulžies druskos Nr. 3 ir kristalo Violetas inhibuoja gramteigiamų bakterijų augimą.

VRTL agaro sudėtyje yra 10 g/l laktozės. Laktozę fermentuojančios koliforminės bakterijos

31

parūgština terpę ko pasėkoje indikatoriaus spalva pasikeičia į raudonai violetinę spalvą ir susidaro

tulžies druskų nuosėdos. Tai selektyvi terpė laktozę fermentuojančioms gramneigiamoms

bakterijoms: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter

freundii ir dar keli giminingi tipai. Tačiau ji nėra visiškai specifinė enterobakterijų terpė.

Aeromonas ir Yersinie joje irgi gali augti“ (Oxoid, 1996.). Lėkštelės, su Endo agaru pasėtu 1 ml

10-1 kazeino mėginio praskiedimu ir su VRTL agaru pasėtu 1 ml 10-1 kazeino mėginio

praskiedimu, dėtos 24 val. į 37 ±10C temperatūros termostatą (7 Priedas). Mikroorganizmų

morfologijai tirti iš išaugintų kolonijų paruošti preparatai dažyti gramo metodu.

Paraleliai naudotas MacConkey agaras (toliau Mc agaro) – gramteigiamus kokus

inhibuojanti selektyvi terpė, kurioje lengvai atskiriami laktozę fermentuojantys ir nefermentuojantys

mikroorganizmai. Be to, ji tinka salmonelių bei šigelių išskyrimui. Į jos sudėtį įeina specialiai

paruoštos tulžies druskos ir kristalo violetas, todėl koliformų ir laktozės nefermentuojančių

mikroorganizmų kolonijos labiau skiriasi vienos nuo kitų, o gramteigiami kokai visiškai inhibuojami.

Koliformų kolonijos yra violetiniai raudonos, o laktozės nefermentuojančių bakterijų – bespalvės.

Lėkštelės, su Mc agaru pasėtu 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimu dėtos 24 val. į 37 ±10C

temperatūros termostatą (7 Priedas). Mikroorganizmų morfologijai tirti iš išaugintų kolonijų

paruošti preparatai dažyti gramo metodu.

Naudotas Levino E.M.B. agaras skirtas gramteigiamų enterobakterijų izoliavimui

farmaciniuose produktuose, maiste ir pieno produktuose. Eozino ir metileno mėlio derinys stabdo

gramteigiamų bakterijų augimą. Laktozė, esanti terpės sudėtyje įgalina skirti laktozę fermentuojančias

enterobakterijas nuo laktozės nefermentuojančių bakterijų. Koliformai auga raudonai – rudomis su

juodu centru ir žalsvu metaliniu atspalviu, tuo tarpu laktozės nefermentuojančios bakterijos

permatomomis bespalvėmis kolonijomis. Į Levino E.M.B. agaro paviršių su špateliu įtrintas 1 lašas

10-1 kazeino mėginio praskiedimo ir kultivuota 48 val. esant 30 ±10C temperatūrai (8 Priedas).

Mikroorganizmų morfologijai tirti iš išaugintų kolonijų paruošti preparatai dažyti gramo metodu.

3.7. Salmonelių išskyrimas iš valgomojo rūgštinio kazeino

Salmonella spp. išskyrimas 25 g valgomajamojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino)

mėginiuose atliktas pagal standartą LST EN ISO 6579 (2003). Šis tarptautinis standartas nurodo

bendrąjį salmonelių, tarp jų Salmonella typhi ir Salmonella paratyphi, nustatymo metodą.

Salmonelės nustatomos keturiais iš eilės etapais. Salmonelių gali būti nedaug kartu esant dideliam

32

kitų enterobakterijų ar kitų genčių bakterijų skaičiui. Be to, išankstinis pagausinimas būtinas

salmonelių mažiems skaičiams ar pažeistoms salmonelėms aptikti. Kazeino mėginių pradinių

suspensijų ruošimo mikrobiologiniams tyrimams bendra kazeino mėginio masė sudaryta kaip 25 g

kazeino mėginio dalis. Į 225 ml dikalio hidrofosfato tirpalą įberta 25 g tiriamojo kazeino mėginio.

Toliau pagausinta neatrankioje skystoje terpėje, t. y. po 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo

pasėta į trijų mėgintuvėlių buferinį peptono vandenį ir kultivuota 18 val. esant 37 ±10C

temperatūrai. Po 18 valandų kultivavimo po 0,1 ml kultūros pasėta į trijų mėgintuvėlių Rappaport-

Vassiliadis sojos sultinį (toliau RVS sultinys) ir po 1 ml – į trijų mėgintuvėlių Miulerio-Kaufmano

tetrationato ir novobiocino sultinį (toliau MKTTn sultinys). Užsėtas RVS sultinys kultivuotas 24

val. esant 41,5 ±10C temperatūrai, o MKTTn sultinys – 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai. Po to

iš RVS sultinio išaugusi kultūra pasėta į ksilozės lizino dezoksicholato agarą (toliau KLD agaras),

o iš MKTTn sultinio su kita sterilia kilpele – į Brilijantinės žalumos agarą (toliau BŽ agaras). Šie

agarai naudoti Salmonella spp. identifikavimui. Užsėtas KLD agaras kultivuotas 24 val. esant 37 ±10C

temperatūrai, o BŽ agaras – 37 val. esant 30 ±10C temperatūrai (9 Priedas).

BŽ terpės privalumas - stipriau inhibuojamos E. coli ir Proteus spp., Pseudomonas spp.,

kurių kolonijos panašios į salmonelių. Laktozę ir sacharozę fermentuojančių mikroorganizmų

kolonijos inhibuojamos, jei išauga pavienės kolonijos geltonai žalios. Salmonella typhi ir Shigella

spp. ant šios terpės neauga. Proteus spp., Citrobacter spp. ir Pseudomonas spp. smulkios

raudonos kolonijos panašios į salmonelių. MKTTn gausinimo sultinyje išauga daugiausiai

salmonelės, o kiti mikroorganizmai slopinami.

3.8. Listeria monocytogenes išskyrimas iš valgomojo rūgštinio kazeino

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių užterštumas tirtas listerijų

atžvilgiu pagal standarte LST ISO 10560 (1998) pateiktą Listeria monocytogenes nustatymo

metodą.

Į 225 ml dikalio hidrofosfato tirpalą įberta 25 g kazeino mėginio. Po 1 ml 10-1 kazeino

mėginio praskiedimo pasėta į tris mėgintuvėlius su LST sultiniu. Kultivuota 48 val. esant 30 ±10C

temperatūrai. Po kultivavimo iš kiekvieno tiriamo mėgintuvėlio su LST terpe kilpele persėjama

ant Oksfordo agaro. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai. Po kultivavimo atrinktos

charakteringos kolonijos iš kiekvienos lėkštelės ir persėtos ant Triptono sojos mielių ekstrakto

agaro (toliau TSYEA agaras), ir kultivuota 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai (10 Priedas).

33

Tiriamoji kultūra sumaišoma su peroksido tirpalu (3H2O2) ant objektinio stiklelio. Jei susidaro

dujų burbuliukai, reakcija teigiama (listerijos – teigiamos katalazei).

3.9. Valgomojo rūgštinio kazeino cheminės sudėties tyrimas

Cheminėje laboratorijoje atliktas valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių

drėgmės, riebalų ir laisvųjų rūgščių kiekio nustatymas.

Pagal standarte LST ISO 5547 (2001) aprašytą metodą nustatytas kazeino mėginių

laisvasis rūgštingumas. Kazeino mėginio dalis ekstraguota vandeniu 600C temperatūroje.

Filtruotas. Filtratas titruotas etaloniniu natrio hidroksido tirpalu (0,1N), naudojant indikatorių

fenolftaleiną. Etaloninio natrio hidroksido tirpalo (0,1N) tūris mililitrais, reikalingas neutralizuoti

1 g produkto vandeninį ekstraktą.

Rezultatai apskaičiuoti pagal formulę:

1 g kazeino mėginio laisvasis rūgštingumas yra lygus:

20 x V x T R= ; m

Čia: V – suvartotas etaloninis natrio hidroksido tirpalo (0,1N) tūris mililitrais;

T - etaloninio natrio hidroksido tirpalo (0,1N) molinė ekvivalentinė koncentracija;

m – tiriamosios kazeino mėginio dalies masė gramais.

Kazeino mėginio laisvasis rūgštingumas (R1) sausoje medžiagoje:

100 R1 = R x ; 100 - M

Čia: M – kazeino mėginio sausosios medžiagos procentais.

Kazeino mėginių drėgmės kiekis nustatytas pagal standartą LST ISO 5550 (1996).

Kazeino mėginys išdžiovintas 102 ±10C temperatūroje ir pasvertas, taip apskaičiuotas masės

sumažėjimas procentais.

34

Masės sumažėjimas nustatytas pagal formulę:

Drėgmės kiekis kazeino mėginyje, išreikštas masės procentais, yra lygus:

m1 – m2 D = ; m1 – m0

Čia: m0 – indo ir dangčio masė gramais;

m1 – indo, dangčio ir kazeino mėginio masė prieš džiovinimą gramais;

m2 – indo, dangčio ir kazeino mėginio masė po džiovinimo gramais.

Kazeino mėginių riebalų kiekis nustatytas pagal Kačerauskienės (1999) aprašytą

Gerberio metodą, naudojant butirometrus B (0–7). Riebalų kiekiui gauti naudota sieros rūgštis ir

izoamilo alkoholis. Po centrifugavimo riebalų kiekis (R) masės procentais apskaičiuotas pagal

formulę:

P x 1 R= ; C

Čia: P - butirometro duomenys;

C - tiriamojo kazeino mėginio masė gramais (3 g kazeino mėginio);

11 – koeficientas butirometro rodmenims perskaičiuoti į riebalų kiekį procentais.

Apskaičiuotas kazeino mėginio sausosios medžiagos riebalų kiekis (R1) masės

procentais, kuris lygus:

R x 100 R1= ; 100 - W

Čia: R – kazeino mėginio riebalų kiekis procentais;

W – kazeino mėginio drėgmės kiekis procentais.

35

3.10. Statistinis duomenų įvertinimas

Tyrimo duomenys įvertinti naudojant kompiuterinę programą Microsoft®Excel 2000.

Patikimumo laipsnis (p) nustatytas vidurkių skirtumo, pagal Stjudentą, koreliaciniai ryšiai pagal

Pearsono kriterijus (Juozaitienė, Kerzienė, 2001.). Skirtumai laikyti statistiškai patikimais jei p<0,05.

36

4. Tyrimų rezultatai

4.1. Valgomojo rūgštinio kazeino bendro bakterinio užterštumo nustatymas

Nustatytas 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių bendras bakterinis

užterštumas. Bendras bakterinis užterštumas kito nuo 1,0x102 KSV/g iki 7,9x104 KSV/g. Penkių

(3 proc.) kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas viršijo 3,0x104 KSV/g ribą, kuri leistina

maisto produktui, o 163 (97 proc.) kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas atitiko

standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus (5 lentelė).

Pastebėjome bendro bakterinio užterštumo sumažėjimą kazeino mėginiuose. Iš 168

kazeino mėginių atlikti 50 kazeino mėginių pakartotini (po keturių – šešių dienų nuo kazeino

pagaminimo dienos) tyrimai. Iš 50 kazeino mėginių 5 (10 proc.) kazeino mėginiai, kurie neatitiko

standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus bendro bakterinio užterštumo atveju, t. y. viršijo

3,0x104 KSV/g nustatytą ribą (6 lentelė), po persėjimo, palyginus su pradiniais rezultatais,

bendras bakterinis užterštumas sumažėjo 41,29 proc. (1 paveikslas). Iš persėtų 50 kazeino

mėginių, kurie neviršijo 3,0x104 KSV/g ribos, 40 (80 proc.) kazeino mėginių (7 lentelė) palyginus

su pradiniais rezultatais bendras bakterinis užterštumas sumažėjo 40,55 proc. (2 paveikslas), o 5

(10 proc.) kazeino mėginiuose (8 lentelė) – bendras bakterinis užterštumas padidėjo 67,65 proc. (3

paveikslas). Lyginant visų 50 pakartotų kazeino mėginių rezultatus su pradiniais statistikai jie

patikimi p<0,05.

37

5 lentelė. Kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas (KSV/g).

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

Kazeino mėginio Nr. KSV/g

1 7,9x104 25 1,5x103 49 2,2x103 73 3,3x102 97 2,5x102 121 7,5x102 145 6,0x102

2 2,3x103 26 1,6x103 50 5,5x102 74 3,1x103 98 3,0x102 122 1,6x103 146 1,4x103

3 1,5x103 27 1,0x103 51 2,2x103 75 2,3x103 99 7,0x102 123 3,3x103 147 5,4x103

4 1,1x103 28 5,0x102 52 7,2x103 76 1,3x103 100 3,0x102 124 3,0x103 148 4,8x104

5 2,4x103 29 1,5x104 53 3,2x103 77 5,1x103 101 2,0x102 125 1,2x103 149 4,7x103

6 1,5x104 30 1,3x103 54 1,2x104 78 1,2x103 102 2,9x103 126 3,6x103 150 1,8x103

7 1,5x103 31 5,0x103 55 1,8x104 79 2,5x102 103 5,0x103 127 3,5x102 151 8,0x102

8 4,7x103 32 1,1x103 56 3,7x104 80 1,2x103 104 1,6x104 128 7,5x102 152 2,4x103

9 1,4x104 33 2,7x103 57 1,1x103 81 2,6x103 105 1,7x104 129 7,0x102 153 5,1x103

10 1,4x104 34 3,2x103 58 1,0x103 82 1,7x103 106 2,9x103 130 1,8x103 154 1,2x103

11 2,0x104 35 1,0x103 59 7,0x102 83 4,0x102 107 1,5x103 131 5,5x102 155 1,3x104

12 1,9x104 36 2,4x103 60 1,4x103 84 1,7x103 108 1,3x103 132 3,6x103 156 1,1x104

13 7,6x103 37 4,0x103 61 6,0x103 85 6,0x102 109 2,5x102 133 3,7x103 157 6,3x103

14 2,1x104 38 1,6x103 62 5,7x103 86 9,0x102 110 3,0x103 134 2,8x103 158 2,4x103

15 4,7x103 39 1,8x103 63 4,5x103 87 1,2x104 111 8,5x102 135 8,5x103 159 1,8x103

16 6,9x103 40 6,1x103 64 1,6x103 88 5,0x102 112 6,5x102 136 5,7x103 160 1,1x104

17 1,8x104 41 2,0x102 65 3,2x103 89 1,1x103 113 5,5x102 137 1,7x103 161 7,0x103

18 1,3x104 42 1,4x103 66 7,5x102 90 1,5x104 114 1,5x103 138 5,6x103 162 5,0x103

19 5,1x104 43 3,2x103 67 5,5x102 91 4,1x103 115 1,0x103 139 8,5x102 163 1,6x104

20 1,6x104 44 2,0x103 68 1,9x103 92 1,7x103 116 1,0x102 140 8,6x103 164 6,4x103

21 5,5x104 45 3,2x103 69 2,5x103 93 3,0x103 117 2,5x102 141 1,2x103 165 2,2x103

22 1,5x103 46 5,8x103 70 1,2x103 94 2,3x104 118 7,5x102 142 1,6x103 166 1,6x104

23 2,8x103 47 4,8x103 71 1,8x103 95 6,5x103 119 1,3x103 143 3,9x103 167 5,8x103

24 5,5x103 48 7,6x103 72 3,1x102 96 7,5x102 120 7,5x102 144 5,7x103 168 1,4x103

Vidurkis 5,4x103

Paaiškinimas. Raudoni skaičiai – kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas neatitiko standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus.

38

6 lentelė. Neatitikusių standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus pakartotai

persėtų kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas.

Persėti kazeino mėginiai Nr.

PradinisKSV/g

PakartotasKSV/g

1 7,9x104 2,8x104

19 5,1x104 2,1x104

21 5,5x104 2,3x104

56 3,7x104 2,4x104

148 4,8x104 1,5x104

Vidurkis 5,4x104 2,2x104

Paaiškinimas. Raudoni skaičiai – kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas neatitiko standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

1 19 21 56 148

Kazeino mėginiai Nr.

KSV/g

pakartotas KSV/g pradinis KSV/g

1 pav. Neatitikusių standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus persėtų kazeino

mėginių bendro bakterinio užterštumo skirtumas.

39

7 lentelė. Neviršijusių standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus pakartotai persėtų

kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas.

Persėtų kazeino mėginių Nr.

Pradinis KSV/g

Pakartotas KSV/g

Persėtų kazeino mėginių Nr.

Pradinis KSV/g

PakartotasKSV/g

3 1,5x103 1,3x103 103 5,0x103 1,4x103

7 1,5x103 1,2x103 104 1,6x104 1,4x104

20 1,6x104 1,5x104 105 1,7x104 7,0x103

34 3,2x103 3,0x103 106 2,9x103 2,6x103

35 1,0x103 9,9x102 107 1,5x103 1,4x103

36 2,4x103 2,3x103 131 5,5x102 4,5x102

37 4,0x103 3,2x103 140 8,6x103 2,0x102

45 3,2x103 2,7x103 144 5,7x103 1,3x103

46 5,8x103 7,0x102 149 4,7x103 2,5x103

47 4,8x103 3,5x103 150 1,8x103 1,2x103

48 7,6x103 5,5x103 151 8,0x102 6,3x102

53 3,2x103 2,1x103 153 5,1x103 1,3x103

54 1,2x104 1,1x103 155 1,3x104 2,3x103

55 1,8x104 1,6x103 160 1,1x104 1,4x103

57 1,1x103 9,8x102 161 7,0x103 1,1x103

62 5,7x103 1,1x103 162 5,0x103 3,7x103

63 4,5x103 1,3x103 163 1,6x104 1,5x103

64 1,6x103 5,5x102 165 2,2x103 1,5x103

66 7,5x102 6,2x102 166 1,6x104 2,7x103

71 1,8x103 1,6x103 167 5,8x103 1,1x103

Vidurkis 6,1x103 2,6x103

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

3 20 35 37 46 48 54 57 63 66 103 105 107 140 149 151 155 161 163 166

Kazeino mėginiai Nr.

KSV/g

pakartotas KSV/g pradinis KSV/g

2 pav. Neviršijusių standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus persėtų kazeino

mėginių bendro bakterinio užterštumo skirtumas.

40

8 lentelė. Kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas po persėjimo.

Persėti kazeino mėginiai Nr.

Pradinis KSV/g

Pakartotas KSV/g

2 2,3x103 3,1x103

65 3,2x103 8,4x103

70 1,2x103 2,4x103

72 3,1x102 4,3x102

73 3,3x102 4,3x102

Vidurkis 1,5x103 2,1x103

Paaiškinimas. Mėlyni skaičiai – padidėjęs pakartotų kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas.

010002000300040005000600070008000

2 65 70 72 73

Kazeino mėginiai Nr.

KSV/g

pradinis KSV/g pakartotas KSV/g

3 pav. Neviršijusių standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus persėtų kazeino

mėginių padidėjusio bendro bakterinio užterštumo skirtumas.

41

4.2. Valgomojo rūgštinio kazeino termofilinių bakterijų skaičiaus nustatymas

Iš 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių sudaryti 27 bendri kazeino

mėginiai ir apskaičiuotas termofilinių bakterijų skaičius (9 lentelė). Termofilinių bakterijų

skaičius kazeino mėginiuose neviršijo reglamente (EEB) Nr. 2921 (1990) nustatyto 5,0x103

KSV/g skaičiaus. Kazeino mėginiuose termofilinių bakterijų skaičius kito nuo 1,0x102 KSV/g iki

2,2x103 KSV/g. Termofilinių bakterijų skaičius kazeino mėginiuose sudarė vidutiniškai 19,79

proc. visų kazeino mėginių bendro bakterinio užterštumo. Taip pat rasta kazeino mėginių,

kuriuose termofilinių bakterijų skaičius sudarė nuo 46,09 proc. iki 66,95 proc. bendro bakterinio

užterštumo (4 paveikslas).

9 lentelė. Kazeino mėginių termofilinių bakterijų skaičius (KSV/g).

Bendri kazeino mėginiai Nr.

Termofilinės bakterijos KSV/g

Bendri kazeino mėginiai Nr.

Termofilinės bakterijos KSV/g

1 - 4 4,5x102 86 - 91 4,2x102

5 - 11 2,8x102 92 - 98 3,4x102

12 -17 3,6x102 99 - 104 4,1x102

18 - 23 5,9x102 105 - 110 4,7x102

24 - 28 2,5x102 111 - 116 2,9x102

29 - 33 3,0x102 117 - 122 3,1x102

34 - 40 1,0x102 123 - 129 6,5x102

41 - 45 6,2x102 130 - 136 4,6x102

46 - 51 1,9x103 137 - 143 8,9x102

52 - 58 1,7x103 144 - 149 9,6x102

59 - 65 2,2x103 150 - 156 3,6x102

66 - 71 8,1x102 157 - 162 5,5x102

72 - 80 9,5x102 163 - 168 2,5x102

81 - 85 1,3x102 Vidurkis 6,3x102

42

0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,00

1-4

5-11

12-17

18-23

24-28

29-33

34-40

41-45

46-51

52-58

59-65

66-71

72-80

81-85

86-91

92-98

99-10

410

5-110

111-1

1611

7-122

123-1

2913

0-136

137-1

4314

4-149

150-1

5615

7-162

163-1

68

Bendri kazeino mėginiai Nr.

Termofilinės bakterijos proc.

4 pav. Kazeino mėginių termofilinių bakterijų skaičius procentais sudarantis bendrą bakterinį užterštumą.

43

4.3. Koliforminės bakterijos valgomajame rūgštiniame kazeine

Nustatytas 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių užterštumas

koliforminėmis bakterijomis. Tirti 168 kazeino mėginiai sėti į LTBŽ sultinį. Iš jų 23 (13,69 proc.)

kazeino mėginiai užteršti koliforminėmis bakterijomis, t. y. durham plūdelėse susidarė dujos, 15

(8,93 proc.) kazeino mėginių – įtartini koliforminių bakterijų atveju, t. y. LTBŽ sultinys

susidrumstė ir įgavo gelsvą ar geltoną spalvą, 130 (77,38 proc.) kazeino mėginiuose nerasta

koliforminių bakterijų (10 lentelė).

Iš 168 kazeino mėginių 114 (67,86 proc.) kazeino mėginių iš LTBŽ sultinio persėti į

Petrį lėkštelę su Endo agaru. Iš 23 (20,18 proc.) kazeino mėginių Endo agare išaugo 1–2 mm

diametro, tamsiai raudonos kolonijos su metalo atspalviu. Nudažius pagal Gramą ir

mikroskopuojant (imersiniu objektyvu 100x) matėsi gramneigiamos lazdelės. Nustatyta, kad 20,18

proc. kazeino mėginių užteršti E. coli. Tirti 20,18 proc. kazeino mėginių patvirtinti indolo testu,

gauti rezultatai patvirtino, kad 20,18 proc. kazeino mėginių užteršti E. coli.

Iš 114 (67,86 proc.) kazeino mėginių 15 (13,16 proc.) kazeino mėginių sėta ant Endo

agaro išaugo rausvos spalvos 1–2 mm kolonijos, pagal Gramą – gramneigiamos bakterijos. Kitų

76 (66,66 proc.) kazeino mėginių – ant Endo agaro neišaugo kolonijos.

Iš 168 kazeino mėginių 15 (8,93 proc.) įtartinų kazeino mėginių koliforminių bakterijų

atveju 13 (86,66 proc.) kazeino mėginių sėta į VRTL agarą. Iš jų 4 (30,77 proc.) kazeino mėginių

ant VRTL agaro išaugo raudonai violetinės kolonijos su juodais dripsniais, pagal Gramą –

nusidažė gramneigiamos lazdelės, o 6 (46,15 proc.) kazeino mėginių - VRTL agare išaugo ovalios

šviesiai violetinės spalvos 2–3 mm diametro kolonijos, pagal Gramą – nusidažė gramneigiamai.

Identifikavome Proteus mirabilis, nes ant šios terpės gana gerai auga. Iš 13 įtartinų kazeino

mėginių koliforminių bakterijų atveju 3 (23,08 proc.) kazeino mėginyje ant VRTL agaro užaugo

2–3 mm matinės kolonijos.

Iš 15 (8,93 proc.) įtartinų kazeino mėginių koliforminių bakterijų atveju 5 (33,33 proc.)

kazeino mėginiai iš LTBŽ sultinio persėti į Mc agarą, kuriame išaugo ovalios 2–3 mm laktozės

nefermentuojančių bakterijų matinės kolonijos. Nudažius pagal Gramą matėsi gramneigiamos

lazdelės.

Iš 15 (8,93 proc.) įtartinų kazeino mėginių koliforminių bakterijų atveju 3 (20 proc.)

kazeino mėginiai iš LTBŽ sultinio persėti į Leveno E.M.B agarą. Šiame agare išaugo rudai

44

matinės kolonijos, pagal Gramą nusidažė gramteigiamos lazdelės, o kitos rausvai matinės

kolonijos – gramneigiamos lazdelės.

Iš tirtų 168 kazeino mėginių 50 (29,76 proc.) kazeino mėginių atlikti pakartotini (po

keturių – šešių dienų nuo kazeino pagaminimo dienos) tyrimai koliforminių bakterijų atveju.

Persėtų 39 (78 proc.) kazeino mėginių nepasikeitė koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius

(toliau TS) rezultatas, 10 (20 proc.) kazeino mėginių koliforminių bakterijų TS sumažėjo 75,71

proc. (11 lentelė). Iš 50 persėtų kazeino mėginių 1 (2 proc.) kazeino mėginio koliforminių

bakterijų TS po persėjimo padidėjo 57,69 proc. (12 lentelė). Pradinio sėjimo metu koliforminių

bakterijų TS vidurkis 8,4, o pakartojus tyrimus – koliforminių bakterijų TS vidurkis 6,36.

Pakartojus tyrimus koliforminių bakterijų atveju 78 proc. kazeino mėginių nepasikeitė

koliforminių bakterijų TS rezultatas, 20 proc. kazeino mėginių gauti su sumažėjusiu koliforminių

bakterijų TS (5 paveikslas) ir 2 proc. kazeino mėginių – koliforminių bakterijų TS padidėjo (6

paveikslas). Lyginant visų 50 pakartotų kazeino mėginių rezultatus su pradiniais statistikai jie

nepatikimi p>0,05.

45

10 lentelė. Koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius (TS) kazeino mėginiuose.

Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS Kazeino mėginio Nr.

TS

1 4,5 25 <0,1 49 <0,1 73 <0,1 97 1 aug. 121 <0,1 145 <0,1 2 2 26 <0,1 50 <0,1 74 <0,1 98 <0,1 122 <0,1 146 <0,1 3 <0,1 27 <0,1 51 <0,1 75 <0,1 99 <0,1 123 <0,1 147 2 aug. 4 <0,1 28 <0,1 52 <0,1 76 <0,1 100 <0,1 124 <0,1 148 1 aug. 5 <0,1 29 <0,1 53 4,5 77 <0,1 101 <0,1 125 <0,1 149 <0,1 6 <0,1 30 <0,1 54 <0,1 78 <0,1 102 <0,1 126 4,5 150 1 aug. 7 2 31 <0,1 55 <0,1 79 1 aug. 103 2 127 <0,1 151 23 8 <0,1 32 <0,1 56 7,8 80 2 aug. 104 2 128 <0,1 152 <0,1 9 <0,1 33 <0,1 57 <0,1 81 <0,1 105 2 aug. 129 <0,1 153 <0,1 10 <0,1 34 7,8 58 <0,1 82 <0,1 106 5 aug. 130 <0,1 154 2 11 <0,1 35 <0,1 59 <0,1 83 <0,1 107 5 aug. 131 <0,1 155 <0,1 12 <0,1 36 <0,1 60 <0,1 84 <0,1 108 < 0,1 132 <0,1 156 4,5, 1 aug. 13 <0,1 37 4,5 61 <0,1 85 <0,1 109 <0,1 133 <0,1 157 <0,1 14 <0,1 38 <0,1 62 <0,1 86 <0,1 110 <0,1 134 <0,1 158 <0,1 15 <0,1 39 <0,1 63 <0,1 87 <0,1 111 <0,1 135 <0,1 159 <0,1 16 <0,1 40 <0,1 64 <0,1 88 <0,1 112 <0,1 136 <0,1 160 <0,1 17 <0,1 41 <0,1 65 7,8 89 <0,1 113 <0,1 137 <0,1 161 <0,1 18 <0,1 42 <0,1 66 <0,1 90 2 114 <0,1 138 <0,1 162 <0,1 19 2 43 <0,1 67 <0,1 91 1 aug. 115 <0,1 139 <0,1 163 <0,1 20 <0,1 44 <0,1 68 <0,1 92 <0,1 116 <0,1 140 1 aug. 164 <0,1 21 23 45 4,5 69 <0,1 93 5 aug. 117 <0,1 141 <0,1 165 <0,1 22 <0,1 46 <0,1 70 2 94 23 118 <0,1 142 <0,1 166 <0,1 23 <0,1 47 <0,1 71 <0,1 95 1 aug. 119 <0,1 143 2 167 2 aug. 24 <0,1 48 2 72 <0,1 96 2 aug. 120 <0,1 144 7,8 168 <0,1

Paiškinimas. 1 aug. – viename mėgintuvėlyje iš penkių kultivuotų susidarė rūgštinis augimas be dujų;

2 aug. – dvejuose mėgintuvėliuose iš penkių kultivuotų susidarė rūgštinis augimas be dujų; 5 aug. – penkiuose mėgintuvėliuose iš penkių kultivuotų susidarė rūgštinis augimas be dujų; Raudoni skaičiai – kazeino mėginiai užteršti koliforminėmis bakterijomis.

46

11 lentelė. Persėtų kazeino mėginių koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius (TS).

Persėti kazeino mėginiai Nr.

Pradinis TS

Pakartotas TS

Persėti kazeino mėginiai Nr.

Pradinis TS

Pakartotas TS

1 4,5 <0,1 71 <0,1 <0,1 2 2 <0,1 72 <0,1 <0,1 3 <0,1 <0,1 73 <0,1 <0,1 7 2 2 103 2 <0,1 19 2 <0,1 104 2 2 20 <0,1 <0,1 105 <0,1 <0,1 21 23 7,8 106 <0,1 <0,1 34 7,8 4,5 107 <0,1 <0,1 35 <0,1 <0,1 131 <0,1 <0,1 36 <0,1 <0,1 140 <0,1 <0,1 37 4,5 4,5 144 7,8 2 45 4,5 <0,1 148 <0,1 <0,1 46 <0,1 <0,1 149 <0,1 <0,1 47 <0,1 <0,1 150 <0,1 <0,1 48 2 2 151 23 13 54 <0,1 <0,1 153 <0,1 <0,1 55 <0,1 <0,1 155 <0,1 <0,1 56 7,8 4,5 160 <0,1 <0,1 57 <0,1 <0,1 161 <0,1 <0,1 62 <0,1 <0,1 162 <0,1 <0,1 63 <0,1 <0,1 163 <0,1 <0,1 64 <0,1 <0,1 165 <0,1 <0,1 65 7,8 7,8 166 <0,1 <0,1 66 <0,1 <0,1 167 <0,1 <0,1 70 2 2 Vidurkis 6,4 4,99

Paaiškinimas. Raudoni skaičiai – kazeino mėginiai užteršti koliforminėmis bakterijomis.

47

13579

11131517192123

1 7 21 36 46 54 57 64 70 73105 131 148 151 160 163 167

Kazeino mėginiai Nr.

TS

pakartotas TS pradinis TS

5 pav. Persėtų kazeino mėginių koliforminių bakterijų tikėtiniausio skaičiaus (TS)

skirtumas.

12 lentelė. Persėtų kazeino mėginių padidėjęs koliforminių bakterijų tikėtiniausias

skaičius (TS).

Persėti kazeino mėginiai Nr.

Pradinis TS

Pakartotas TS

53 4,5 7,8 Paaiškinimas. Raudoni skaičiai – kazeino mėginiai užteršti koliforminėmis bakterijomis.

1234567

53Kazeino mėginys Nr.

TS

pradinis TS pakartotas TS

6 pav. Kazeino mėginys po persėjimo su padidėjusiu koliforminių bakterijų

tikėtiniausiu skaičiumi (TS) skirtumas.

48

4.4. Salmonella spp. ir Listeria monocytogenes nustatymas valgomajame rūgštiniame kazeine

Iš 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių sudaryti 27 bendri kazeino

mėginiai, į kuriuos įeina po 4, 5, 6, 7, 9 kazeino mėginius. Šiuose bendruose kazeino mėginiuose

ieškota listerijų, salmonelių, tačiau nei listerijų nei salmonelių neišskirta.

4.5. Valgomojo rūgštinio kazeino cheminės sudėties nustatymas

Nustatyta 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių cheminė sudėtis.

Tirtų 168 kazeino mėginių drėgmė kito nuo 6,2 proc. iki 11,25 proc. (13–14 lentelės).

Vidutinis kazeino mėginių drėgnumas sudarė 8,37 proc. Keturių (2,38 proc.) kazeino mėginių

drėgmės rodiklis viršijo nustatytą normą, t. y. sudarė vidutiniškai 10,39 proc., o leista nedaugiau kaip

10 proc. Kazeino mėginių riebumas kito nuo 0,39 proc. iki 0,98 proc., t. y. vidutiniškai 0,6 proc.,

laisvasis rūgštingumas kito nuo 0,04 ml/g iki 0,13 ml/g. Vidutiniškai kazeino mėginių laisvasis

rūgštingumas sudarė 0,8 ml/g (7 paveikslas).

Kazeino mėginių drėgmės ir riebumo koreliacijos koeficientas yra -0,0993, laisvojo

rūgštingumo ir drėgmės koreliacijos koeficientas yra 0,113534, laisvojo rūgštingumo ir riebumo

yra -0,07675. Tai rodo, kad drėgmė, riebalai ir rūgštingumas vienas kitam neturi įtakos.

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00

1-4

5-11

12-1

718

-23

24-2

829

-33

34-4

041

-45

46-5

152

-58

59-6

566

-71

72-8

081

-85

86-9

192

-98

99-1

0410

5-11

011

1-11

611

7-12

212

3-12

913

0-13

613

7-14

314

4-14

915

0-15

615

7-16

216

3-16

8

Kazeino mėginiai Nr.

proc.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

proc. - ml/g

Drėgmė proc. Riebalai proc. Laisvasis rūgštingumas ml/g

7 pav. Kazeino mėginių cheminės sudėties kitimai.

49

13 lentelė. Kazeino mėginių drėgmė (proc.), riebalai (proc.) ir laisvasis rūgštingumas (ml/g kazeino mėginio). Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

1 10,23 0,41 0,07 29 8 0,4 0,08 57 8,84 0,6 0,08 2 11,25 0,61 0,07 30 7,02 0,79 0,1 58 8,9 0,4 0,07 3 8,1 0,59 0,07 31 9,03 0,59 0,08 59 8,51 0,4 0,07 4 8,43 0,79 0,08 32 8,34 0,6 0,07 60 6,54 0,58 0,08 5 8,88 0,6 0,06 33 8,18 0,4 0,08 61 7,43 0,59 0,08 6 8,81 0,6 0,07 34 9,93 0,59 0,13 62 9,36 0,4 0,09 7 8,56 0,6 0,06 35 7,72 0,61 0,09 63 8,5 0,79 0,12 8 7,98 0,59 0,09 36 8,36 0,79 0,07 64 8,73 0,4 0,13 9 9,52 0,8 0,08 37 8,35 0,79 0,08 65 7,72 0,59 0,11 10 8,83 0,4 0,08 38 8,32 0,79 0,09 66 9,98 0,61 0,08 11 7,86 0,79 0,07 39 8,18 0,59 0,11 67 7,84 0,4 0,09 12 7,12 0,59 0,08 40 8,96 0,79 0,08 68 9,12 0,6 0,08 13 8,26 0,79 0,07 41 8,91 0,8 0,12 69 8,68 0,6 0,08 14 8,62 0,4 0,06 42 9,32 0,6 0,09 70 7,34 0,59 0,08 15 9,81 0,6 0,08 43 9,5 0,4 0,08 71 7,13 0,39 0,07 16 9,86 0,61 0,08 44 9,73 0,6 0,08 72 9,79 0,6 0,08 17 8,72 0,6 0,07 45 9,93 0,4 0,13 73 9,97 0,81 0,07 18 9,86 0,8 0,06 46 7,72 0,6 0,09 74 7,86 0,59 0,08 19 8,49 0,6 0,07 47 8,94 0,41 0,1 75 8,44 0,6 0,07 20 8,43 0,6 0,06 48 8,35 0,4 0,08 76 8,4 0,79 0,08 21 7,98 0,79 0,07 49 7,76 0,4 0,1 77 9,4 0,4 0,08 22 8,46 0,6 0,07 50 9,22 0,4 0,11 78 8,67 0,4 0,07 23 9,16 0,4 0,09 51 7,79 0,6 0,13 79 9 0,6 0,08 24 9,39 0,6 0,09 52 9,27 0,59 0,08 80 7,92 0,59 0,08 25 10,01 0,41 0,06 53 8,5 0,4 0,07 81 8,72 0,4 0,09 26 7,28 0,39 0,08 54 9,51 0,6 0,08 82 8,14 0,79 0,07 27 8,59 0,4 0,07 55 8,9 0,6 0,08 83 7,6 0,59 0,07 28 10,07 0,61 0,07 56 7,05 0,59 0,07 84 6,27 0,39 0,07

Paaiškinimas. Raudoni skaičiai – kazeino mėginiai neatitiko standarto (EEB) Nr. 2921 (1990) reikalavimus.

50

14 lentelė. Kazeino mėginių drėgmė (proc.), riebalai (proc.) ir laisvasis rūgštingumas (ml/g kazeino mėginio). Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

Kazeino mėginio Nr.

Drėgmė proc.

Riebalai proc.

Rūgštingumas ml/g

85 6,68 0,4 0,08 113 6,68 0,58 0,07 141 6,9 0,59 0,07 86 7,9 0,59 0,06 114 8,64 0,6 0,07 142 7,76 0,79 0,08 87 7,42 0,78 0,06 115 7,87 0,4 0,06 143 7,39 0,78 0,07 88 8,38 0,6 0,06 116 9,98 0,41 0,08 144 8,77 0,6 0,07 89 8,64 0,4 0,07 117 9,19 0,8 0,07 145 8,96 0,6 0,1 90 7,46 0,59 0,05 118 8,38 0,6 0,07 146 8,7 0,4 0,09 91 8 0,59 0,06 119 7,71 0,59 0,06 147 8,56 0,79 0,08 92 8,72 0,4 0,06 120 9,03 0,6 0,06 148 7,86 0,79 0,08 93 8,85 0,4 0,05 121 7,86 0,79 0,07 149 7,84 0,79 0,07 94 7,2 0,78 0,04 122 8,05 0,59 0,07 150 8,76 0,6 0,08 95 6,73 0,58 0,06 123 9,45 0,6 0,07 151 8,72 0,6 0,06 96 7,5 0,59 0,08 124 8,37 0,6 0,06 152 7,74 0,59 0,06 97 6,84 0,59 0,07 125 7,45 0,59 0,07 153 9,03 0,6 0,07 98 7,52 0,4 0,07 126 7,12 0,59 0,07 154 9,52 0,6 0,07 99 8,26 0,79 0,06 127 7,74 0,4 0,06 155 8,75 0,8 0,07 100 8,23 0,59 0,07 128 8,17 0,59 0,1 156 7,32 0,59 0,07 101 6,2 0,77 0,07 129 7,6 0,79 0,08 157 8,65 0,6 0,08 102 9,05 0,6 0,07 130 8,01 0,59 0,09 158 8,33 0,59 0,06 103 9,71 0,8 0,08 131 9,12 0,8 0,07 159 7,63 0,98 0,07 104 8,33 0,79 0,07 132 8,93 0,6 0,08 160 8,07 0,79 0,08 105 8,83 0,6 0,07 133 8,17 0,79 0,08 161 8,95 0,6 0,06 106 7,86 0,79 0,07 134 8,34 0,6 0,1 162 8,3 0,59 0,06 107 8,3 0,59 0,06 135 8,32 0,59 0,06 163 9,92 0,61 0,08 108 7,72 0,4 0,07 136 8,48 0,4 0,1 164 8,51 0,6 0,07 109 8,27 0,59 0,06 137 7,21 0,59 0,12 165 7,39 0,59 0,1 110 8,45 0,6 0,06 138 8,47 0,6 0,06 166 8,75 0,79 0,07 111 7,37 0,6 0,08 139 6,97 0,59 0,06 167 7,32 0,79 0,08 112 7,07 0,78 0,07 140 6,85 0,78 0,07 168 8,65 0,6 0,06

51

5. Tyrimų rezultatų apibendrinimas

Valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) kokybę, jo mikrobiologinius rodiklius

nulemia žaliava bei technologinis procesas. Atliekant mikrobiologinę technologinio proceso

kontrolę gali būti nustatyta liekamosios mikrofloros dinamika bei antrinis užterštumas. „X“

įmonėje surinktų rezultatų duomenimis, žaliavinio pasterizuoto lieso pieno bendras

bakterinis užterštumas didesnis negu 1,0x105 ir koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius

(toliau TS) didesnis negu 110. Antrą kartą šio pieno pasterizuoti negalima, kadangi

pasikeičia kazeino baltymo struktūra ir blogai skiriasi kazeinas. „X“ įmonės darbuotojai

teigia, kad iš surūgusio pieno kazeino gamybos metu kazeinas skiriasi daug geriau ir

pagaminto kazeino bakterinis užterštumas būna mažesnis. Tačiau šiame darbe tirtas galutinis

produktas ir gautų duomenų analizė leidžia spėti, kad 3 proc. kazeino mėginių bendro

bakterinio užterštumo atvejų ir 13,69 proc. kazeino mėginių koliforminių bakterijų atveju

buvo užteršti gamybos proceso metu ir po gamybos.

Nustatytas 168 valgomojo rūgštinio kazeino (toliau kazeino) mėginių bendras

bakterinis užterštumas. Iš jų 3 proc. kazeino mėginių neatitiko standarto (EEB) Nr. 2921

(1990) reikalavimus dėl padidėjusio bendro bakterinio užterštumo, kuris viršijo 3,0x104

KSV/g nustatytą ribą. Ištirtuose 168 kazeino mėginiuose termofilinių bakterijų skaičius kito

nuo 1,0x102 KSV/g iki 2,2x103 KSV/g, t. y. termofilinių bakterijų skaičius kazeino

mėginiuose sudarė vidutiniškai 19,72 proc. visų kazeino mėginių bendro bakterinio

užterštumo. Taip pat rasta kazeino mėginių, kuriuose termofilinių bakterijų skaičius sudarė

nuo 46,09 proc. iki 66,95 proc. bendro bakterinio užterštumo. Įtarėme, kad kazeino bendrą

bakterinį užterštumą lėmė didelis žaliavinio pieno užterštumas.

Sūriuose ir pieno milteliuose randamos mikrofloros dalį sudaro žaliavinio pieno

mikroflora. Po pasterizacijos likusios bakterijos gali daugintis atskiruose technologinio

proceso etapuose, nes terminis apdirbimas nesunaikina visos mikrofloros ir kuo didesnis

mikroorganizmų skaičius žaliaviniame piene, tuo daugiau jų lieka po pasterizacijos.

(Raguckaitė ir kt., 1990; Vaitkus, 1999; Novella-Rodriguez ir kt., 2004; Poznanski ir kt.,

2004.). Tačiau kazeino gamybos metu pirmoje plovimo talpoje kazeino grūdeliai plaunami

apie 15 min. esant nuo 70 iki 730C temperatūrai ir pH palaikomas tarp 3,8–4,0. Po to iš

pirmos plovimo talpos siurbliu kazeino grūdeliai pernešami į antrą plovimo talpą. Antroje

talpoje produktas pasterizuojamas ne žemesnėje kaip 82–850C temperatūroje ir šioje

52

temperatūroje išlaikoma 15,5 sekundžių, palaikant pH 3,8–4,0. Vadinasi kazeino gamybos

metu pasterizacijos temperatūra pasiekiama du kartus, be to palaikomas gana žemas pH. Šios

sąlygos nepalankios mikroorganizmams išgyventi gamybos procese ir išlikti galutiniame

produkte. Kaitinami rūgščioje terpėje mikroorganizmai žūva greičiau. Mikroorganizmų

jautrumas aukštai temperatūrai kur kas didesnis, kai pH mažesnis kaip 5 (4,6 ir mažiau).

Termofilinės bakterijos gana atsparios, tačiau ne viename kazeino mėginyje termofilinių

bakterijų skaičius neviršijo 5,0x103 KSV/g normatyviniuose dokumentuose nustatytos ribos.

Mikroorganizmai gali daugintis produktų gamybos metu, kai kurių autorių nuomone

(Raguckaitė ir kt., 1990; Vaitkus, 1999; Novella-Rodriguez ir kt., 2004; Poznanski ir kt.,

2004) „po pasterizacijos likusios bakterijos gali daugintis atskiruose technologinio proceso

etapuose, nes terminis apdirbimas nesunaikina visos mikrofloros.“ Kazeino gamybos metų

mikroorganizmų dauginimasis sunkiai įmanomas, kad nesusidarytų palankios sąlygos

daugintis mikroorganizmams, naudojamas greitas presavimo būdas. Presuotas kazeinas

smulkinamas nedideliais grūdeliais, kad jie greičiau džiūtų. Kazeine mikroorganizmų

skaičius gali padidėti nesilaikant higienos fasavimo metu, t. y. nuo dirbančio personalo arba

laikant produktą netinkamose sąlygose (laikant pagamintą produktą per didelėje santykinėje

oro drėgmėje).

Tirtuose 13,69 proc. kazeino mėginiuose išskirtos E. coli.

E. coli bakterijos aukštai temperatūrai neatsparios. Neatsparios ir daugumai

dezinfekcinių medžiagų. Koliforminių bakterijų (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella

genčių) buvimas maisto produktuose rodo šviežią fekalinį užterštumą, be to produktuose gali

būti ir kitų patogeninių mikroorganizmų (Vaitkus, 1999; Parisi, 2003; Higienos norma 15,

2003; Macedo ir kt., 2004; Kasimoglu ir kt., 2004; Nair ir kt., 2004.). Tačiau tirtuose kazeino

mėginiuose neišskirta nei L. monocytogenes nei Salmonella spp.

Literatūroje (Atasever ir kt., 2003; Božanic ir kt., 2003; Al-Haddad, Robinson,

2003; Arenas ir kt., 2004.) aprašomas mikroorganizmų sumažėjimas produktuose. Produkte

arba atskiruose technologinio proceso etapuose randamos žarninės lazdelės grupės bakterijos

gamybos procese praktiškai nesidaugina, saugant produktą jos palaipsniui žūva. Pastebėjome

bendro bakterinio užterštumo sumažėjimą kazeino mėginiuose. Atlikus 50 kazeino mėginių

pakartotinius (po keturių – šešių dienų nuo kazeino pagaminimo dienos) tyrimus, ištirtų 90

proc. kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas palyginus su pradiniais rezultatais

sumažėjo 40,93 proc., tačiau ištirtų 10 proc. kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas

53

palyginus su pradiniais rezultatais padidėjo 67,65 proc. Rezultatai, lyginant visų 50 pakartotų

kazeino mėginių rezultatus su pradiniais rezultatais, statistiškai yra patikimi p<0,05.

Pakartojus tyrimus koliforminių bakterijų atveju 78 proc. kazeino mėginių palyginus su

pradiniais rezultatais nepasikeitė koliforminių bakterijų TS rezultatas, 20 proc. kazeino

mėginių palyginus su pradiniais rezultatais sumažėjo koliforminių bakterijų TS, tačiau 2

proc. kazeino mėginių palyginus su pradiniais rezultatais TS padidėjo. Rezultatai, lyginant

visų 50 pakartotų kazeino mėginių rezultatus su pradiniais rezultatais, statistiškai yra

nepatikimi p>0,05.

Rūgštinis kazeino nusodinimas yra reversinis (grįžtamasis). Kazeinas vienas iš ne

daugelio produktų, kurį galima pergaminti (perplauti), taip sumažinant mikrobiologinį

užterštumą.

Įvertinti kazeino poveikį mikroorganizmams ištirta 168 kazeino mėginių cheminė

sudėtis. Tirtų 168 kazeino mėginių drėgmė kito nuo 6,2 proc. iki 11,25 proc.. Vidutinis

mėginių drėgnumas sudarė apie 8,37 proc. Iš 198 kazeino mėginių 2,38 proc. kazeino mėginių

drėgmės rodiklis viršijo nustatytą normą, t. y. sudarė vidutiniškai 10,39 proc., o leista nedaugiau

kaip 10 proc.

Literatūros (Bahrs, Herrero, 1979; Toller, Hareman, 1989; Freidler ir kt., 1993;

Bontovits,1999; Garmienė ir kt., 2001; Branco ir kt., 2003; standartas (EEB) Nr. 2921, 1990;

Visockas, 2000; http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html.) duomenimis produktai su

mažu iki 10 proc. drėgmės kiekiu atitinka aw<0,58. Tokio aw produktai yra dauguma

išdžiovintų produktų: kazeinas, pieno milteliai, sausos išrūgos ir kt. Dauguma

mikroorganizmų nesivysto esant aw<0,06. Ypač svarbūs mikroorganizmų dauginimosi

intensyvumui aw dydžiai yra 0,58–0,97: Salmonella – 0,94, Listeria monocytogenes – 0,93,

Escherichia coli – 0,96.

Mikroorganizmų augimą slopina maža kazeino drėgmė, be to kazeinas yra rūgštus.

Ištirtų 168 kazeino mėginių nustatytas laisvasis rūgštingumas kito nuo 0,04 ml/g iki 0,13

ml/g. Vidutiniškai kazeino mėginių laisvasis rūgštingumas sudarė 0,8 ml/g.

Terpėje baltymai ir riebalai didina mikroorganizmų atsparumą karščiui. Riebaluose

atsparesnės tampa ne tik sporos, bet ir vegetatyvinės formos. Aiškinama tuo, kad riebaluose

susidaro sąlygos, panašios kaip ir kaitinant sausai (Vaitkus, 1999; Novella-Rodriguez ir kt.,

2004; http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html; http://class.fst.ohio-state.edu/FST201/

54

MEM/ microorg.htm.). Tačiau kazeino mėginių riebumas gana mažas, Ištirtų 168 kazeino

mėginių riebumas kito nuo 0,39 proc. iki 0,98 proc., t. y. vidutiniškai 0,6 proc.

Drėgmės, riebumo ir laisvojo rūgštingumo rodikliai neturi vienas kitam didelės

įtakos. Kazeino drėgmės ir riebumo koreliacijos koeficientas yra -0,0993, laisvojo

rūgštingumo ir drėgmės koreliacijos koeficientas yra 0,113534, o laisvojo rūgštingumo ir

riebumo yra -0,07675.

Literatūros (Raguckaitė, Survila ir kt., 1990; Vaitkus, 1999.) duomenimis

pagaminto produkto mikrobiologinius tyrimus reikia atlikti praėjus kelioms dienoms po jų

gamybos. Šviežiai pagaminto kazeino mikrobiologiniai tyrimai gerai neparodo jo kokybės,

dėl to jie atliekami praėjus 4–6 dienoms po kazeino pagaminimo. Laikymo metu kazeino

milteliuose mikroorganizmai laipsniškai žūva, nes kazeino drėgmė apie 10 proc., ir tik

padidėjus drėgnumui gali daugintis pelėsiai, bei puvimą įtakojančios bakterijos, taigi

pagrindinis faktorius, dėl ko gali padidėti bendras bakterijų skaičius ir atsirasti koliforminių

bakterijų produkto saugojimo metu yra antrinis užteršimas.

55

6. Išvados

1. Valgomojo rūgštinio kazeino bendras bakterinis užterštumas padidėjęs 3 proc. atvejų,

o 97 proc. valgomojo rūgštinio kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas

neviršijo 3,0x104 KSV/g nustatytos ribos.

2. Atlikus valgomojo rūgštinio kazeino mėginių pakartotinius tyrimus 90 proc.

valgomojo rūgštinio kazeino mėginių bendras bakterinis užterštumas sumažėjo

(p<0,05). Koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius sumažėjo 20 proc.

3. Ištyrus valgomojo rūgštinio kazeino bendrą bakterinį užterštumą, termofilinės

bakterijos sudarė 19,72 proc.

4. Salmonella spp. ir Listeria monocytogenes iš tirtų valgomojo rūgštinio kazeino

mėginių neišskirtos.

5. Valgomojo rūgštinio kazeino mėginių drėgnumas sudarė 8,37 proc., riebumas 0,6

proc., laisvosios rūgštys 0,8 ml/g.

6. Drėgmės atveju nustatytiems privalomiems kriterijams neatitiko 2,38 proc.

valgomojo rūgštinio kazeino mėginių.

56

7. Pasiūlymai

1. Sukviesti maisto saugos sistemos darbo grupę ir aptarti svarbių valdymo taškų

kontrolės programą, mažinant produktų užterštumo riziką koliformų atvejų.

2. Valgomojo rūgštinio kazeino mėginius tyrimams imti praėjus keturioms –

šešioms dienoms nuo kazeino pagaminimo dienos.

57

8. Summary

Introduction. Casein – the main albumen constituent of milk. Food casein is used

in the production of caseinat. Caseinats are used in the production of food concentrates,

medicines, and cheese products. In addition, they may be used as casein glue.

According to the data about Lithuanian milk and milk products market in August

2004, 111 tons casein and its products were produced Lithuanian milk dairies. 78 tons were

delivered to the customers in the EU Member Countries. European producers generate

approximately 120 thousand tons per year, and approximately 60-70 thousand tons of casein

are imported.

Casein is one of several milk products, which have significant demand in foreign

countries, thus the willingness of some dairy companies to develop production of casein is

quite natural.

As acid casein edible casein is being used in production of food products, it should

conform to certain requirements and technical indicators, specified in legal acts.

Most often, the following indicators of acid casein edible casein biological impurity

are being indicated: total bacterial count, the number of thermophylic bacterial, coliform

totals and such pathogenic microorganisms as Listeria monocytogenes, Salmonella spp.

Sanitary research object is not only pathogenic, comparatively pathogenic and

sanitary indicator microorganisms, but also physical, chemical and biological conditions in

the environment, which suppress or stimulate the spread of the above-mentioned

microorganisms in the environment and enter human body. The chemical composition of

casein, humidity, fat, free acids, may have influence on propagation of microorganisms.

Goals of thesis. To determinate total bacterial contamination of acid casein edible,

isolate and identify pathological microorganisms.

1. To determine the general bacterial contamination of edible acid casein samples.

2. To determine the influence of thermophylic bacteria on the general bacterial

contamination.

3. To determine the general bacterial contamination of repeatedly researched

edible acid casein samples and the presumable quantity of coliformic germs.

4. To define and identify the patological microorganisms out of edible acid casein

samples.

58

5. To determine the chemical composition of edible acid casein samples.

Materials and methods. Research analytical experimentation was performed in

2003-2005 at the microbiological and chemical laboratories of the company „X“ and

microbiological laboratory of the LVA infectious condition cathedral.

Microbiological research carried out in the following way: Total bacterial

contamination of acid casein edible, isolation and identification of microorganisms

performed in accordance with the following regulations: LST EN ISO 6579:2003 lt., LST EN

ISO 4833:2003 lt., LST EN ISO 707:1999 lt., LST ISO 10560+Cor.1:1998 lt., LST EN ISO

8261:2002 lt., LST ISO 4831:1999 lt., LST ISO 7251:1996 lt., IDF Standard 100B:1991.

Chemical research carried out in the following way: LST ISO 5550:1996 lt., LST

ISO 5547:2001 lt., Method described by G. Kačerauskienė.

Results. Micro flora of crude milk constitutes certain part of micro flora, found in

powdered milk. However, the increased level of general contamination and coliform germs

shows the signs of secondary contamination. The enlarged bacteriological contamination,

which exceeded the preset limit of 3.0x104 CFU/g, was identified in 3 per cent of analyzed

acid casein edible samples. This was caused by impurity of crude milk.

During the acid casein edible casein production process, the temperature of

pasteurization was reached twice and in addition to that, comparatively low pH was

maintained. These conditions are not hospitable for microorganisms to survive through the

production process and remain alive in the final products. The number of thermophylic

germs in analyzed samples made up to 19.79 per cent of bacteria number of bacteria impurity

in average. Moreover, there were samples, where the number of thermophylic germs made up

from 46.09 per cent to 66.95 per cent of total bacterial count contamination (Fig. 1).

59

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

1-4

5-11

12-17

18-23

24-28

29-33

34-40

41-45

46-51

52-58

59-65

66-71

72-80

81-85

86-91

92-9899-1

04

105-11

0

111-11

6

117-12

2

123-12

9

130-13

6

137-14

3

144-14

9

150-15

6

157-16

2

163-16

8

Casein sample No.

per cent

Fig. 1 The number of thermophylic bacterial, constituting the total bacterial

count in casein sample.

Escherichia coli were identified in 13.69 per cent of analyzed samples. These

bacterial are not resistant to high temperature. The presence of E. coli means that pathogenic

strains of these microorganisms might be present in milk or its products.

Pathogenic L. monocytogenes ir Salmonella spp. were not identified in analyzed

samples of acid casein edible casein.

Microorganisms propagate fractionally during acid casein edible production

process. The number of microorganisms in acid casein edible might increase if the hygiene is

not observed during packaging (from working staff) or storing the products in inadequate

conditions, i.e. comparatively high humidity.

During the research, the decrease of total bacteria count was observed in casein

samples. After the repeated experiments to 90 per cent of casein samples (four – six days

after the production of casein), total bacterial contamination decreased 40.93 per cent in 90

per cent of samples. Only 10 per cent samples had increased total bacterial contamination

(Fig. 2). The results, if we compare the results of repeated 50 samples to the initial results,

are statistically reliable, p<0.05.

60

0200004000060000

80000100000120000

1 19 35 46 54 62 66 73 106 144 151 161 166

Casein sample No.

CFU/g

repeated CFU/g original CFU/g

Fig. 2 Difference of total bacterial contamination of reseeded casein samples.

Research proved that 20 per cent of acid casein edible samples had decreased

presumable quantity (PQ) of coliform microorganisms (Fig. 3). After repeated seeding,

presumable quantity (PQ) increased only in 2 per cent of analyzed acid casein edible samples

(Fig. 4). The results, if we compare the results of repeated 50 samples to the initial results,

are statistically unreliable, p>0.05.

13579

11131517192123

1 7 21 36 46 54 57 64 70 73105 131 14

8151 16

0163 16

7

Casein sample No.

PQ

repeated PQ original PQ

Fig. 3 Difference of presumable quantity (PQ) in reseeded casein samples.

61

1234567

53Casein sample No.

PQ

original PQ repeated PQ

Fig. 4 Casein sample after reseeding with increased presumable quantity (PQ)

of coliform germs.

During storage, the microorganisms gradually die in the product. Acid casein edible

has certain features, which suppress the growth of microorganisms. The humidity of casein

samples is approximately 8.37 per cent, which makes up aw<0.06, acidity – appr. 0.8 ml/g.

The fatness of acid casein edible samples is rather low, the fatness of researched acid casein

edible samples accounted to 0.6 per cent in average. Majority of microorganisms cannot

develop in these conditions.

Conclusions.

1. Total bacterial count in three percent of acid casein edible samples

increased, while total bacterial count in 97 per cent did not exceed the

allowed limit of 3.0x104 CFU/g.

2. After repeated research and experimentation of acid casein edible casein

samples, 90 per cent of samples were observed with decreased number of

bacterial (p<0.05). The presumable quantity of coliform microorganisms

decreased in 20 per cent of samples.

3. Thermophylic germs accounted for approximately 19.72 per cent of total

bacterial count.

4. Salmonella spp. and Listeria Monocytogenes were not isolated in analyzed

acid casein edible samples.

5. The humidity of edible acid casein samples made up 8.37 per cent, fatness –

0.6 per cent, acidity – 0.8 ml/g.

62

6. In case of humidity, 2.38 per cent of edible acid casein samples exceeded the

allowed requirements.

63

9. Literatūros sąrašas

1. Achema S. G., Lowe E. K., Yuming L. Effect of pH on The viscosity of heated

reconstituted skim milk. International Dairy Journal, 2004. 14 (6) 541-548. P. 1022.

2. Al-Haddad K. S. H. S., Robinson R. K. Salmonella survival. Dairy Industrines

International, 2003. 68 (7) 20-22. 902 p.

3. Alrgria E., Lopez I., Ignaco Ruiz J., Saenz J., Fernandez E., Zarazaga M., Dizy M.,

Torres C., Ruiz-Larrea F. High tolerance of wild Lactobacillus plantarium and

Oenococcus oeni strains to lyophilisatio and stress environmental conditions of acid

pH and ethanol. FEMS Microbiology Letters, 2004. 657 p.

4. Arenas R., Gonzalez L., Bernardo A., Kresno J. M., Tornadijo M. E. Mikrobiological

and physico-chemical chantes in Genestoso cheese, a Spanish acid curd variety,

throughout ripening. Food Control, 2004. 15 (4) 271-279. 792 p.

5. Atasever M., Kele A., Ucar G., Guner A. Use of different salting techniques in

Halloumi cheese: effect on sensory, microbiological and chemical properties. Acta

Alimentaria (Budapest), 2003. 32 (1) 7-14. 700 p.

6. Bahrs L., Herrero F. Neue Metode zur Messung der Wasseraktivitat.

Ernahrungswirtschaft, 1997. B. 26. No. 3. P. 39-40.

7. Bontovits L. The Importance of water activity (aw) in the food industrines. Elemezesi

Ipar, 1999. Vol. 37. No 12. P. 441-447.

8. Božanic R., Teatnik L., Hruškar M. Influence of culture activity on aroma

components in yoghurts produced from gats‘s and cow‘s milk. Acta Alimentaria

(Budapest), 2003. 32 (2) 151-160. 707 p.

9. Branco M. A., Figueiredo E., Burges M. F., Silva M. C., Destro M. Incidente of

Listeria monocytogenes in industrially manufactured refrigerated „coalho“ cheese.,

Curitiba, Brazil, 2003. 21 (2) 393-408. 605 p.

10. Candioti M. C., Meinardi C. A., Zalazar C. A. Effect of heat treatments higher than

pasteurization on protein distributio and clotting properties of milk.

Milchwissenschaft, 2004. 59 (3/4) 126-130. 703 p.

11. Dukštas J., Kačerauskis D., Liutkevičius A., Ramanauskas R. Pieno perdirbimo

technologija. Vilnius, 1994. P.15, 17, 326, 335.

64

12. (EEB) Nr. 2921/90. Dėl paramos iš nugriebto pieno gaminamų kazeino ir kazeinatų

gamyba. Standartas, 1990 m. spalio 10 d. P. 6-8.

13. Elhanafl D., Leenanon B., Bang W., Drake M., A. Impact of cold and cold-acid stress

on poststress tolerance and virulence factor expression of Escherichia coli. Journal of

Food Protection, 2004. 619 p.

14. Freidler B., Schmidt P. V., Kunkel K. Mikrobiologische untersuchungen zur

Lagerfahigkeit von Rohdicksaft. Zucker-industrie, 1993. B. 118. No. 11. S. 272-276.

15. Gapparov M. M., Stan E. J. Action of caseinophosphopeptides (CPPs) on

biovailability of the alimentary minerals. Voprosy Pitaniya, 2003. 72 (6) 40-44.

Moscow, Russia. 641 p.

16. Garmienė G., Pociūtė R. Vandens aktyvumo rodiklis: teorija ir praktika maisto

produktų gamyboje. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija, 1999. T. 33. 14

p.

17. Garmienė G., Šarkinas., Pociūtė R. Vandens aktyvumas įtaka pienarūgščių bakterijų

augimui. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija, 2001. T. 35. 11 p.

18. Higienos reikalavimai pienui, termiškai apdorotam pienui, pieno produktų gamybai ir

prekybai. Standartas 92/46/EEB. Europos Ekonominės Bendrijos Taryba, 1992 m.

birželio 16 d. P. 1, 4, 14.

19. HN 15:2003. Maisto higiena. Vilnius 2003. 15 p.

20. http://class.fst.ohio-state.edu/FST201/MEM/microorg.htm. Žiūrėta 2005 m. vasario

10 d.

21. http://europa.eu.int/smartapi/cgi/sga_doc?smartapi!celexdoc!prod!CELEXnumdoc&lg=L

T&numdoc=31997D0080&model=lex. Žiūrėta 2005 m. vasario 10 d.

22. http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html. Žiūrėta 2005 m. sausio 8 d.

23. http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/IFT/unit_three.html. Žiūrėta 2005 m.

sausio 10 d.

24. http://www.jt.lt/Analitika/Naujienos1.asp?FirmID=87&Kur=0&ID=32561. Žiūrėta

2005 m. sausio 10 d.

25. http://www3.lrs.lt/c-bin/eu/getfmt?C1=w&C2=39481. Žiūrėta 2005 m. vasario 10 d.

26. http://www.ris.lt/?id=4016&action=more. Žiūrėta 2005 m. vasario 10 d.

27. http://www.sala.lt/portal/index.php?handler=newsdetailed &id=11804. Žiūrėta 2005 m.

vasario 10 d.

65

28. http://www.utena-on.lt/Utenos_enciklopedija/pramone/akcines.htm. Žiūrėta 2005 m.

vasario 10 d.

29. Juozaitienė V., Kerzienė S. Biometrija ir kompiuterinė duomenų analizė. Kaunas, 2001.

115 p.

30. Lehmann H. R., Dolle E., Bücker H. Kazeino ir kazeinato procesinės linijos.

Milchwissenschaft ,2000. P. 4-8.

31. Kačerauskienė G. Pieno ir jo produktų cheminės analizės metodai. Kaunas, 1999. P.

48, 53-55.

32. Kamerleneris J. Kazeinas ir jo produktai. Deutche Milchwirtschaft, 1995. Nr. 8. P.

15-16.

33. Kasimoglu A., Sireli U. T., Akgūn S. Determination of contamination sources during the

manufacturing of yoghurt. Ankara, Turkey, 2004. 28 (1) 17-22. 800 p.

34. Kauno technologijos universiteto maisto instituto bandymų laboratorija. Pieno išrūgų

mėginių cheminė sudėtis. Maisto produktų bandymų protokolas, Nr. 2977-1, 2004 m.

gruodžio 30 d.

35. Kulikauskienė M. Kasdienių pieno produktų geros gamybos praktikos vadovas.

Lietuvos maisto institutas, 2000. P. 31-32.

36. Kulikauskienė M., Mieželienė A., Jasutienė I. Pieno sistemų pokyčiai maistinėmis

skaidulomis ir probiotikais praturtinto jogurto gamybos bei laikymo metu. Lietuvos

maisto institutas, 1999. Kaunas. 54 p.

37. LST EN ISO 6579:2003 lt. Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis salmonelių

nustatymo metodas.

38. LST EN ISO 4833:2003 lt. Mikrobiologija. Mikroorganizmų skaičiavimas. Bendrieji

nurodymai. Kolonijų skaičiavimo 30 0C temperatūroje metodas.

39. LST EN ISO 707:1999 lt. Pienas ir pieno produktai. Bandinio ėmimo taisyklės. P. 17-

18.

40. LST EN ISO 8261:2002 lt. Pienas ir pieno produktai. Tiriamųjų mėginių, pradinių

suspensijų ir dešimtkarčių skiedinių ruošimas mikrobiologiniams tyrimams. Bendrieji

reikalavimai.

41. LST ISO 5550:1996. Kazeinai ir kazeinatai. Drėgmės kiekio nustatymas (pamatinis

metodas).

66

42. LST ISI 5547:2001 lt. Kazeinai. Laisvojo rūgštingumo nustatymas (pamatinis

metodas) (tapatus ISO 5547:1978).

43. LST ISO 4831:1999 lt. Mikrobiologija. Koliforminių bakterijų skaičiavimas.

Bendrieji nurodymai. Tikėtiniausiojo skaičiaus metodas.

44. LST ISO 10560+Cor.1:1998 lt. Pienas ir pieno produktai – Listeria monocytogenes

nustatymas.

45. LST ISO 7251:1996 lt. Žarninių lazdelių (Escherichia coli) skaičiavimas. Bensrieji

nurodymai. Labiausiai tikėtino skaičiaus nustatymas.

46. Macedo A. C., Tavares T. G., Malcata F. X. Influence of native lactic acid bacteria on the

microbiological, Biochemical and sensory profiles of Serra da Estela cheese. Food

Microbiology, 2004. 21 (2) 233-240. 705 p.

47. Mickevičius E., Matijoška S. Baltyminių pamilčių kiekis sūrių, varškės ir kazeino

išrūgose. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija, 2002. T. 36. 92 p.

48. Milk and milk products enumeration of microorganisms colony count technique at 30 0C. International IDF Standard 100B:1991.

49. Nair M. K. M., Vasudevan P., Hoagland T., Venkitanarayanan K. Inactivatio of

Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in milk by caprylic acid and

monocaprylin. Food Microbiology, 2004. 21 (5) 611-616. 1088 p.

50. Narkevičius R. Fermentacijos proceso parametrų įtaka pieno baltymų stabilumui.

ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 2000. T. 34. 120 p.

51. Narkevičius R. Fermentacijos žemesnėje nei nulio laipsnių Celsijaus temperatūroje

įtaka pieno baltymų stabilumui. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija.

2003. T. 37. Nr. 1. 94 p.

52. Narkevičius R., Šimonėlienė A. Sušaldymo įtakos lieso pieno savybėms tyrimai.

ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 2003. T. 37. Nr. 2. 42 p.

53. Novella-Rodriguez S., Veciana-Nogues M. T., Roig-Sagues A. X., Trujillo-Mesa A.

J., Vidal-Carou M. C. Evaluation of biogenic amines and microbial counts throughout

the ripening of goat cheeses from pasteurized and raw milk. Journal of Dairy

Research, 2004. 71 (2) 245-252. 1011 p.

54. Olsen S. J., Ying M., Davis M. F., Deasy M., Holland B., Iampietro L., Baysinger C.

M., Sassano F., Polk L. D., Gormoley B., Hung M. J., Pilot K., Orsini M., Duyne S.,

Rankin S., Genese C., Bresnitz E. A., Smucker J., Moll M., Sobel J.Multidrung-

67

resistant Salmonella typhimurium infectionfrom milk contaminated after

pasteurizatio. Emerging Infection Diseases, 2004. 10 (5) 932-935. 1001 p.

55. Oxoid žinyno versija iš Compiled by Bridson E.Y. The OXOID manual. 7th Edition

1995. Linea litera, 1996. P. 45, 61, 65, 109, 137, 170, 178, 225.

56. Parisi S. Dependence of Coliform growing-up curves on chemical features in dairy

products at different storame coditions. Industrine Alimentai, 2003. 42 p.

57. Pernoud S., Fremaux C., Sepulchre A., Corrieu G., Monnet C. Effect of the

metabolism of urea on the acidifying activity of Streptococcus thermophilus. Journal

Of Dairy Science, 2004. 87 (3) 550-555. 1055 p.

58. Pinon A., Zwietering M., Perrier L., Tembre J., M., Leporq B., Mettler E., Thuault D.,

Coroller L., Stahl V., Vialette M. Development and validation of experimental

protocols for use of cardinal models for prediction of microorganism growth in food

products. Applied and Environmental Microbiology, 2004. 70 (2) 1081-1087. 716 p.

59. Poznanski E., Cavazza A., Cappa F., Cocconcelli P. S. Indigenous raw milk

microbiota influences the bacterial development in traditional cheese from an alpine

natural park. International Journal of Food Microbiology, 2004. 92 (2) 141-151. 1008

p.

60. Pranik D. B. Effects of temperature and pH on the flux pattern during ultrafiltration of

sweet creem buttermilk. Karnataka Journal of Agricultural Scieces, 2003. 16 (4) 636-

637. 698 p.

61. Pridotkienė A., Šarkinas A. Kazeino grūdelių praplovimo vandens neutralizavimas ir

toksiškumo įvertinimas. Maisto chemija ir technologija, 1993. T. 27. P. 44, 46.

62. Raguckaitė I., Survila R., Šarkinas A. Sudaryti sauso lieso pieno gamybos

technologinio proceso mikrobiologinių rodiklių kortas pieno džiovinimo cechams,

pateikiant rekomendacijas eksportinės kokybės produkcijai pagaminti. Mokslinio

tyrimo darbas 862.08.90.04.06 1990. Kaunas, 1990. P. 7-8

63. Ramanauskas R., Alenčikienė G. Aukštos koncentracijos parakazeino komplekso

aktyviojo rūgštingumo įtaka jo reologiniams rodikliams. ISSN 1392-0227. Maisto

chemija ir technologija. 2002. T. 36. 129 p.

64. Ramonaitytė D., Činga V. Pieno terminio apdorojimo ir priedų įtaka kalcio kiekiui

rūgštinėje sutraukoje. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 1998. T. 32.

P. 112-114.

68

65. Sarli T. A., Tozzi M., Murru N., Varlino D., Santoro A., Floro A. Hygienic controls

in ricotta whey cheese plants. Industrie Alimentai, 2004. 43 (435) 389-392. 1013 p.

66. Smit B., A. Formalion of amino acid derived cheese flavour compounds. Wageningen

University, 2004. 128pp. ISBN 90-5808-996-7. 1096 p.

67. Steinberg M. P. Water states, their equilibria and their availability for physical,

chemical and biological reactions. 1989. 197’11 ACS Ant. Meet., Dallas, Apr. 9-14. P.

1-12.

68. Šarkinas A. Žalio pieno užteršimas listerijomis. Maisto chemija ir technologija. Konf.

per. medž. KTU, 2000. 40 p.

69. Troller J. Water activity and food quality. Water and food quality, by T. Hareman,

1989. ESP Ltd. P. 8-12.

70. Vaitkus V. Pasterizuoto pieno ir grietinėlės patvarumo tyrimai. ISSN 1392-0227.

Maisto chemija ir technologija, 1999. T. 33. P. 166, 168, 170.

71. Vaitkus V., Vaitkienė A., Petruškevičius P., Urbšienė L. Žalio karvių pieno sudėties ir

kokybės tyrimai (apžvalga). ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 2001.

T. 35. P. 166, 168.

72. Valgomasis rūgštinis kazeinas. Techninės sąlygos. ĮST 000000-00:2003. „X“ įmonės

kazeino gamybos instrukcija.

73. Visackas A. Kazeinas ir jo gamybos tobulinimas. Pienininkystė, 2000. Nr. 4. 29 p.

74. Žitny J., Bujko J., Trakovicka A., Strapakova E., Tothova K. Evalutio of milk

produktion of deiry cows of the slovak spotted breed according to selection for

longevity and genetic variants of polymorphic proteins in milk. International Dairy

Journal, 2002. P. 12-13.

75. Горбатовa К. К. Биоxимия молока и молочных продуктов. Cанкт-Петербург

гиорд, 2003. S. 203.

76. Кузнецов В. В., Шилер Г. Г. Справочник технолога молочного производства.

Технология и рецептуры. Том 3, Сыры. Cанкт-Петербург гиорд, 2003. S. 103,

210.

69

10. Priedai

1 Priedas

70

2 Priedas

71

3 Priedas Kazeino mėginių ruošimas tolesniems mikrobiologiniams tyrimams

10 g kazeino mėginio suberta į 90 ml dikalio hidrofosfato skiediklį.

15 min. laikyta kambario temperatūroje, 15 min. 370C temperatūroje – vandens vonelėje kas 2 min. sukratant. Gautas 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo įpilta į mėgintuvėlį su 9 ml skiediklio. Gautas 10-2 kazeino mėginio praskiedimas.

1 ml 10-2 kazeino mėginio praskiedimo įpilta į mėgintuvėlį su 9 ml skiediklio. Gautas 10-3 kazeino mėginio praskiedimas.

72

4 Priedas

Kazeino mėginių bendro bakterinio užterštumo nustatymas

Į Petrį lėkšteles įpilta PCA agaro apie 15 ml 450C temperatūros ir gerai išmaišyta.

Į dvi sterilias Petri lėkšteles įpilta po 1 ml 10-2 kazeino mėginio praskiedimo. Į kitas dvi sterilias Petri lėkšteles įpilta po 1 ml 10-3 kazeino mėgino praskiedimo.

Kai terpė lėkštelėse sustingsta, toliau kultivuota 72 val. esant 30 ±10C temperatūrai.

I

I

II

II

73

5 Priedas Koliforminių bakterijų tikėtiniausio skaičiaus nustatymas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Sterile pipete po 1 ml pernešta į LST sultinį.

LST sultinys

Kilpele kultūra penešta į LTBŽ sultinį. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Po 48 val. kultivavimo nustatytas koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius.

LTBŽ sultinys

Kultivuota 24 ar 48 val.esant 37 ±10C temperatūrai.

74

6 Priedas Escherichia coli identifikavimas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Po 1 ml pernešta į LST sultinį.

Kultivuota 48 val. esant 45 ±10C temperatūrai.

LST sultinys

EC sultinys

Peptono vanduo

Kultivuota 48 val. esant 45 ±10C temperatūrai.

Neigiama reakcija

Teigiama reakcija

Kultivuota 48 val. esant 45 ±10C temperatūrai. Įpilta 0,5 ml Kova‘c reagento. Po 1 min. stebėta reakcija.

75

7 Priedas 1 2 4 3 1. 2. 1 2 4. 3. 4 3 Koliforminių bakterijų identifikavimas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Po 1 ml pernešta į LST sultinį.

Į LTBŽ sultinį kultūra pernešta kilpele. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai. Po kultivavimo nustytas koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius.

Kultivuota 24 ar 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Endo agaras

VRTL agaras Mc agaras

Iš mėgintuvėlių, kuriuose terpė susidrumstė ar Durham plūdelėse susidarė dujos, kilpele pernešta kultūra į Endo agarą, VRTL agarą ir Mc agarą, pasėta atskirų kolonijų gavimo sektoriu metodu. Kultivuota 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

76

8 Priedas 1 lašas

1 lašas

Laktozę fermentuojančių ir jos nefermentuojančių koliformų identifikavimas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo pasėta į LTBŽ sultinį. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai. Po kultivavimo nustatomas koliforminių bakterijų tikėtiniausias skaičius.

Ant Levino E.M.B. agaro sterilia pipete užneštas 1 lašas ir Drigalskio špateliu įtrintas į terpės paviršių. Kultivuota 48 val. esant 30 ±10C temperatūrai.

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Levino E.M.B. agaras

77

9 Priedas 1. Išankstinis pagausinimas: Po 1 ml 2. Atrankusis pagausinimas: Po 0,1 ml Po 1 ml 3. Sėjimas standžiose terpėse:

Kilpele Kilpele

Salmonella spp. identifikavimas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Po 0,1 ml kultūros pasėta į tris mėgintuvėlius su RVS sultiniu. Kultivuota 24 val. esant 41 ±10C temperatūrai.

Po 1 ml kultūros pasėta į tris mėgintuvėlius su MKTTn sultiniu. Kultivuota 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Iš MKTTn sultinio su kilpele persėta į BŽ agarą. Kultivuota 37 val. esant 30 ±10C temperatūrai.

Iš RVS sultinio kultūra persėta į KLD agarą. Kultivuota 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Peptono vanduo su 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimu. Kultivuota 18 val. esant 370C temperatūrai.

78

10 Priedas 1. Sėjimas į selektyvę terpę: Po 1 ml 2. Atrankusis pagausinimas: Kilpele 3. Sėjimas standžiose terpėse:

Kilpele

Listeria monocytogenes identifikavimas

1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimas.

Kilpele kultūra persėta ant Oksfordo agaro. Kultivuota 48 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Iš Oksfordo agaro atrinktos kolonijos persėtos ant TSYEA agaro. Kultivuota 24 val. esant 37 ±10C temperatūrai.

Po 1 ml 10-1 kazeino mėginio praskiedimo pasėta į LST sultinį. Kultivuota 48 val. esant 30 ±10C temperatūrai.