VAJE IZ @IVILSKE KEMIJEAbram,V., M.Zelenik-Blatnik, Vaje iz živilske kemije Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2002 3 Za pripravo slepega vzorca uporabi 25 ml Luffove

Univerza v Ljubljani

Biotehniška fakulteta

Oddelek za živilstvo

VAJE IZ ŽIVILSKE KEMIJE

za študente živilske tehnologije

2. popravljena izdaja

Veronika Abram, Marija Zelenik - Blatnik

Ljubljana, 2002

Abram,V., M.Zelenik-Blatnik, Vaje iz živilske kemije Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2002

II

Recenzenta: prof. dr. Marina Komar, univ. dipl. kem.

prof. dr. Anton Perdih, univ. dipl. ing. kem.

Lektor: prof. dr. Andrej Šmalc, univ. dipl. ing. kem.

Izdalatelj: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Tisk: Tiskarna Littera picta, d.o.o.

Rožna dolina c.IV/34, Ljubljana

Naklada: 300 izvodov

ABRAM, Veronika

Vaje iz živilske kemije za študente živilske tehnologije / Veronika

Abram, Marija Zelenik-Blatnik. - 2. popravljena izd. - Ljubljana :

Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2002 (Ljubljana : Littera

picta)

ISBN 961-6333-18-6

1. Zelenik-Blatnik, Marija [avtor]. - I. Blatnik, Marija

Zelenik-Zelenik-Blatnik, Marija

663/664:543(075.8)(076.5)

COBISS-ID 116512512

Vse pravice pridržane. Ponatis celote ali posameznih delov je dovoljen le s pisnim

dovoljenjem izdajatelja.

http://cobiss2.izum.si/scripts/cobiss?ukaz=FFRM&mode=5&id=1051174285818073&PF1=AU&PF2=TI&PF3=PY&PF4=KW&CS=a&PF5=CB&run=yes&SS1=




III

KAZALO

1. VAJA

KVANTITATIVNO DOLOČANJE GLUKOZE IN SAHAROZE V SKUPNEM

VZORCU (METODA PO SCHOORL-LUFFU) .................................................... 1

2. VAJA

SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE VINSKE KISLINE V SADNIH

SOKOVIH .......................................................................................................... 7

3. VAJA

DOLOČANJE AKTIVNOSTI TRIPSINSKEGA INHIBITORJA V SOJI ............ 11

4. VAJA

KVANTITATIVNA DOLOČITEV ŠKROBA V MOKI .......................................... 15

5. VAJA

KVANTITATIVNA DOLOČITEV HOLESTEROLA V MLEKU .......................... 19

6. VAJA

DOLOČANJE AKTIVNOSTI POLIFENOL OKSIDAZE V KROMPIRJU ......... 23


1

1. VAJA

KVANTITATIVNO DOLOČANJE GLUKOZE IN SAHAROZE V SKUPNEM

VZORCU (METODA PO SCHOORL-LUFFU)

Uvod

D(+)-glukoza (grozdni sladkor ali dekstroza) je kemijsko aldoheksoza z

molekulsko formulo C6H12O6. V naravi je zelo razširjena, saj je najpomembnejši

monosaharid v živalskih in rastlinskih organizmih. Prosto glukozo najdemo v

sadju, medu, krvi, vezano pa v mnogih oligosaharidih (saharoza, laktoza,

maltoza) in polisaharidih (škrob, glikogen, celuloza). Pomembni metabolični

intermediati so fosfatni estri. ADP-glukoza je nujna za sintezo škroba v rastlinah,

medtem ko je UDP-glukoza donor glukoznih enot v sintezi številnih drugih oligo-

in polisaharidov.

Glukoza nastaja v rastlinah v temotnih reakcijah fotosinteze, potem ko se veže

CO2 na ribuloza-1,5-difosfat, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat ter po redukciji z

NADPH gliceraldehid-3-fosfat. Ta se lahko vključi v nastanek glukoze-fosfata in

dalje v tvorbo saharoze ali škroba.

Saharoza (trsni ali pesni sladkor) je -D-glukopiranozil--D-fruktofuranozid z

molekulsko formulo C12H10O11. Je zelo razširjena v rastlinah, kjer je v vakuolah

glavno transportno sredstvo za prenos C-atomov. V rastlinah nastaja saharoza

po reakciji med UDP-glukozo in fruktoza-6-fosfatom. Pod vplivom saharoza-6-

fostat sintaze nastane saharoza-6-fosfat in po delovanju fosfataze prosta

saharoza. Živali je ne morejo sintetizirati. Saharoza se veliko uporablja v

prehrani, predvsem kot sladilo. Mikroorganizmi jo lahko izrabljajo kot vir

prehrane, v visokih koncentracijah pa saharoza zavira rast mikroorganizmov.

Tako Schoorl-Luffova kot Fehlingova metoda za določanje reducirajočih

sladkorjev v vzorcu se sedaj precej opuščata in ju nadomeščata encimska

metoda in visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC). Slednji sta seveda

hitrejši, vendar pa tudi dražji. Predvsem velja to za HPLC, ker je potrebna

oprema zelo draga in se dejansko izplača nakup samo tedaj, kadar bomo stalno

analizirali veliko število vzorcev.


2

Princip

Reducirajoči sladkorji, kot sta glukoza in fruktoza, izločijo iz alkalne kompleksne

raztopine CuSO4 rdečerjavo oborino Cu2O. Redukcijo bakrovega(II) iona zato

lahko uporabimo za titrimetrično določanje tistih sladkorjev, ki so reducenti. V ta

namen je na razpolago več metod, ki se med seboj razlikujejo po pripravi alkalne

raztopine CuSO4.

Tako Fehlingovo raztopino sestavlja bakrov(II) sulfat, natrijev hidroksid in kalij-

natrijev tartrat. Tartratni ion tvori z bakrovim ionom kompleksen ion, s čimer

preprečimo izločanje težko topne oborine bakrovega hidroksida. Pri

kvantitativnem določanju glukoze po Schoorl-Luffu dodamo bakrovemu sulfatu

natrijev karbonat in citronsko kislino, pri čemer nastane bakrov citratni kompleks.

Glukozo lahko določimo z eno ali drugo raztopino. Za kvantitativno določitev

količine saharoze v vzorcu moramo najprej določiti količino glukoze in nato

invertirati saharozo. Inverzija pomeni razgradnjo saharoze s kislino ali encimi. Pri

inverziji razpade saharoza v zmes glukoze in fruktoze (invertni sladkor), ki sta

reducenta. To lastnost lahko izkoristimo za titrimetrično določanje saharoze v

vzorcu. Po inverziji saharoze določimo skupaj prvotno prosto glukozo in invertni

sladkor. Če od tega odštejemo količino glukoze, ki smo jo določili pred inverzijo

saharoze, dobimo količino invertnega sladkorja oziroma saharoze v vzorcu.

Določitev glukoze

Izvedba

Vzorec v merilni bučki razredči z destilirano vodo do 250 ml in ga dobro

premešaj. Nato najprej odpipetiraj v erlenmajerico z obrusom 25 ml Luffove

raztopine in šele potem dodaj 25 ml raztopine razredčenega vzorca.

Erlenmajerico priključi na povratni hladilnik nad gorilnikom in raztopino segrevaj

toliko časa, da bo vrela točno 10 minut. Nato erlenmajerico odstrani s hladilnika

(ne sme biti zamašena z zamaškom) ter jo ohladi pod tekočo vodo. K ohlajeni

raztopini dodaj z merilnim valjem 50 ml 0,4 M raztopine CH3COOH, premešaj in

nato s polnilno pipeto dodaj 10 ml 0,1 M raztopine jodovice in z merilnim valjem

še 55 ml 0,75 M raztopine HCl. Pri stresanju se izločeni Cu2O raztopi in z

jodovico oksidira v CuCl2. Prebitno jodovico retitriraj z 0,1M raztopino Na2S2O3 ob

dodatku 1 ml 1% raztopine škrobovice do preskoka barve iz temno modre v

svetlo modro.


3

Za pripravo slepega vzorca uporabi 25 ml Luffove raztopine in 25 ml destilirane

vode. Z njim postopaj enako kot s pravim vzorcem.

Kemizem

1. Nastanek oborine Cu2O - oksidacijsko-redukcijska reakcija:

R-CHO + 2/Cu(citrat)2/4-

+ 5OH- R-COO

- + Cu2O + 4 citrat

3- + 3H2O

2. Raztapljanje Cu2O in ponovna oksidacija Cu(I) v Cu(II) :

Cu2O + I2 + 4 HCl 2 CuCl2 + 2 HI + H2O

3. Retitracija prebitnega joda v vzorcu:

2 Na2S2O3 + I2 2 NaI + Na2S4O6

Račun

Volumen O,1 M raztopine Na2S2O3, ki si jo porabil za titracijo vzorca, je Vb,

volumen O,1 M raztopine Na2S2O3, ki si jo porabil za titracijo slepega vzorca pa

je Va.

Število milimolov Na2S2O3, n(Na2S2O3), izračunaj z naslednjo relacijo:

n(Na2S2O3) = (Va -Vb) .c(Na2S2O3)

Ker poteče v alkalnem mediju izomerizacija monosaharidov, nastanejo pri

oksidaciji monosaharidov tudi stranski produkti oksidacije. Pri računanju količine

sladkorjev v vzorcu tako ne moremo uporabiti stehiometrijskega razmerja med

glukozo in natrijevim tiosulfatom. To razmerje je določeno eksperimentalno. Za

25 mL dodane Luffove raztopine in 10 minutno segrevanje je eksperimentalno

določeno razmerje med natrijevim tiosulfatom in maso reducirajočih sladkorjev,

predstavljeno v tabeli 1.

Dobljeno število milimolov natrijevega tiosulfata, ki ustreza množini reduciranega

bakra, uporabi za določitev količine glukoze iz tabele 1. Dobljeno maso v mg

pomnoži z 10, da dobiš maso glukoze v celotnem vzorcu.


4

Inverzija in določitev celotnega sladkorja

50 ml raztopine razredčenega vzorca prenesi v 100 ml merilno bučko, dodaj 5 ml

36 % raztopine HCl. Merilno bučko postavi v vodno kopel in ko doseže

temperatura raztopine 70 °C, počakaj še 10 minut, da poteče hidroliza saharoze.

Merilno bučko nato ohladi pod tekočo vodo, dodaj kapljico fenolftaleina in

nevtraliziraj klorovodikovo kislino s 15% raztopino NaOH. Indikator bo v

ekvivalentni točki obarval raztopino rdečevijolično. Raztopino nato razredči z

destilirano vodo do značke.

Za določitev invertnega sladkorja odpipetiraj 25 ml hidrolizata k 25 ml Luffove

raztopine in naprej postopaj enako kot pri določanju glukoze.

Volumen 0,1 M raztopine Na2S2O3, ki si jo porabil za titracijo, je Vc.

Račun

Število milimolov raztopine natrijevega tiosulfata, n(Na2S2O3), izračunane z

relacijo:

n(Na2S2O3) = (Va - Vc) . c (Na2S2O3)

ustreza množini bakrovih ionov, potrebnih za oksidacijo glukoze in invertnega

sladkorja. Skupno maso glukoze in invertnega sladkorja pomnoži z 20, da dobiš

maso sladkorja v prvotnem vzorcu. Če od tega odšteješ maso glukoze, ki si jo

določil pred inverzijo saharoze, dobiš maso saharoze v izhodnem vzorcu.


5

Reagenti

Schoorl-Luffov reagent: 50 g citronske kisline (C6H8O7).H2O raztopi v 50 ml vode, dodaj raztopino Na2CO3 (143,73 g v 350 ml H2O) in raztopino bakrovega sulfata (25 g CuSO4.5H2O/100 ml) ter dopolni do 1000 ml.

0,4 M raztopina CH3COOH

0,1 M raztopina jodovica

0,75 M raztopina HCl

1 % raztopina škrobovice

0,1 M raztopina Na2S2O3

36 % raztopina HCl

15 % raztopina NaOH

fenolftalein (0,1 % raztopina v 70 % etanolu)

Pribor

erlenmajerice z obrusom (300 ml), vodni hladilnik, gorilnik, polnilne pipete (10, 25, 50 ml), merilni valj (50 ml), birete (100 ml), vodna kopel

Literatura

Pelshenke,P., Hampel,G.,Schăfer,W., Kleber,W., Lüdecke, H., Heuer, E., Die Untersuchung von Getriede, Mehl, Braugeste, Wurzel- und Knollengewächsen, Methodenbuch Band XV, Neumann Verlag, Berlin, 1953, str. 61.

Ough,C.S.,Amerine,D.L., Methods for Analysis of Musts and Wine, Rev.Ed., J.Wiley&Sons, New

York, 1988, s.36-39.

Wade, L.G. JR., Organic Chemistry, nd. Ed, Prentice-Hall International, Englewood Cliffs, 1991, s. 1057-1059. Lehninger,A.L.,Nelson,D.L.,Cox,M.M., Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York,

1993.


6

Tabela 1. Pretvorba ekvivalentne množine Na2S2O3 v maso reducirajočega

sladkorja za 25 mL Luffove raztopine in 10 minutno segravanje.

n(Na2S2O3)

(mmol)

m reducir.

sladkorjev (mg)

m (mg)

0,05 2,4

0,10 4,8 2,4

0,15 7,2 2,4

0,20 9,7 2,5

0,25 12,2 2,5

0,30 14,7 2,5

0,35 17,2 2,5

0,40 19,8 2,6

0,45 22,4 2,6

0,50 25,0 2,6

0,55 27,6 2,6

0,60 30,3 2,7

0,65 33,0 2,7

0,75 38,5 2,8

0,80 41,3 2,8

0,85 44,2 2,9

0,90 47,1 2,9

0,95 50,0 2,9

1,00 53,0 3,0

1,05 56,0 3,0

1,10 59,1 3,1

1,15 62,2 3,1


7

2. VAJA

SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE VINSKE KISLINE V SADNIH

SOKOVIH

Vinska kislina je 2,3-dihidroksibutandiojska ali 2,3-dihidroksijantarna kislina,

HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH. Njene soli in estri so tartrati. Obstaja v treh

izomernih oblikah, L-, D- in optično neaktivni mezo-obliki.

L-jabolčna in L-citronska kislina sta glavni organski kislini v sadju. Obe sta

intermediata citratnega cikla. Ostale organske kisline, ki so tudi vključene v

Krebsov ciklus, se nahajajo v sadju v majhnih količinah. Vinsko kislino najdemo

predvsem v grozdju. Na podlagi vsebnosti vinske kisline lahko sklepamo na

nedovoljene mešanice drugih sokov z grozdnim sokom. Biosinteza vinske kisline

ni povsem poznana. Predvidevajo, da se začne z oksidacijo glukoze ali fruktoze

verjetno v 5-oksoglukonsko ali askorbinsko kislino, iz katere potem nastane

vinska kislina. V človeškem organizmu se vinska kislina razgradi v glioksilatni

(CHO-COO) in hidroksipiruvatni ion (CH2OH-CO-COO).

Za določanje vsebnosti vinske kisline je znanih veliko metod. Včasih se je najbolj

uporabljala metoda, pri kateri se vinska kislina obori kot kalijev hidrogentartrat

(vinski kamen), čemur sledi alkalimetrična titracija. Metoda je doživela številne

modifikacije, ki pa niso izboljšale njene uporabnosti, zlasti v območju nizkih

koncentracij. Danes je posebno razširjena kolorimetrična metoda po Rebeleinu.

Osnova za določitev je barvna reakcija, ki jo daje vinska kislina z amonijevim ali

natrijevim vanadatom (NH4VO3 oziroma NaVO3).

Pred dodatkom monovanadata je potrebno iz vzorca, v katerem hočemo določiti

vsebnost vinske kisline, odstraniti vse snovi, ki motijo pri določanju. To so

sladkorji, druge organske kisline kot npr. mlečna, jabolčna, citronska kislina, ter

fenolne spojine.

Poleg teh spektrofotometričnih metod se dandanes za določanje vsebnosti

vinske kisline uporablja tudi visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC).


8

Eksperimentalni del

Princip

Preden barvno reakcijo razvijemo, moramo iz sadnega soka odstraniti sestavine,

ki jo motijo. To so sladkorji, barvila in fenolne spojine, ki jih odstranimo z uporabo

ustreznega ionskega Izmenjalca. V ta namen je primeren močno bazični

izmenjalec Merck III, ki ga uporabljamo v acetatni obliki. Ocetna kislina je

šibkejša od vinske in mlečne kisline, ki se adsorbirata na izmenjalcu, reagira pa

še vedno bolj kislo kot sladkorji, barvila ali fenolne spojine tako da je slednji ne

morejo izpodriniti z ionskega izmenjalca. Pri uporabi izmenjalca Merck III v

acetatni obliki dosežemo popolno izpiranje motečih spojin z 80 ml destilirane

vode. Na izmenjalec vezane kisline eluiramo z natrijevim sulfatom (s soljo

močnejše kisline).

Tako dobljeni eluat uporabimo za določanje vsebnosti posameznih kislin - vinske,

jabolčne in mlečne kisline, ki jih določamo s specifičnimi barvnimi reakcijami.

Priprava vzorca

Močno bazični anionski izmenjalec Merck III suspendiraj v 30 % raztopini

CH3COOH vsaj en dan pred uporabo.

S tako pripravljenim izmenjevalcem napolni stekleno kolono dolžine 25 cm in

premera 10-11 mm. Na dno kolone daj plast vate do višine 2-3 mm, nato začni

polniti kolono z ionskim izmenjevalcem. Plast vate daj tudi na vrh kolone, da se

izmenjalec pri nanašanju sokov in izpiranju ne bi dvigal. 30% raztopino ocetne

kisline nad izmenjevalcem pusti odteči do višine 2-3 mm nad površino zgornje

plasti vate v koloni in izperi kolono s 50 ml 0,5 % raztopine CH3COOH. Po

zadnjem izpiranju nanesi na izmenjalec 10 ml sadnega soka.

Hitrost odtekanja tekočine iz kolone uravnaj na 1-2 kapljici na sekundo, tako da

se kisline iz sadnega soka počasi adsorbirajo. Nato nanesi na kolono 10 ml 0,5

% raztopine ocetne kisline in jo končno izperi s 70 ml destilirane vode. Še preden

odteče vsa voda iz kolone, postavi pod njo 100 ml merilno bučko, v katero eluiraj

na izmenjalce vezane kisline s 7,1 % raztopino natrijevega sulfata do značke. Na


9

ta način dobiš raztopino vinske kisline v približno 7,1 % raztopini natrijevega

sulfata. Koncentracija elektrolita je namreč pri barvni reakciji vinske kisline precej

pomembna.

Spektrofotometrično določanje vinske kisline

Princip

Reakcija z amonijevim vanadatom je za vinsko kislino sicer zelo specifična,

vendar druge hidroksikarboksilne kisline (jabolčna, citronska) znižajo

absorbanco, ki jo daje sama vanadijeva kislina brez dodatka vinske kisline. Da bi

se izognili vplivu omenjenih kislin, oksidiramo vinsko kislino pri slepem vzorcu z

dodatkom prebitne količine perjodove kisline. Presežek perjodove kisline

odstranimo z glicerolom. Produkti razgradnje vinske kisline(tj. mravljinčna kislina

in formaldehid) ne dajejo z vanadijevo kislino barvnih reakcij.

Priprava slepega vzorca

20 ml eluata dodaj 2 ml 1 M raztopine H2SO4 in 5 ml 0,05 M raztopine H5IO6.

Pusti stati 15 minut, da se vsa vinska kislina oksidira. Nato dodaj 1 ml 10%

raztopine glicerola, pusti stati 2 minuti in dodaj 5 ml 2% raztopine NH4VO3.

Priprava vzorca

20 ml eluata dodaj 2 ml 1 M raztopine H2SO4 in 5 ml 0,05 M raztopine H2SO4 ter

1 ml 10% raztopine glicerola. Dobro premešaj in dodaj 5 ml 2% raztopine

NH4VO3.

Z vzorcema napolni kiveti in izmeri absorbanco pri 530 nm proti slepemu vzorcu.

Iz umeritvene krivulje odčitaj ustrezno vrednost za vsebnost vinske kisline v

sadnem soku (v g/dm3).

Umeritvena krivulja

500 mg vinske kisline prenesi v 500 ml merilno bučko, dodaj 6,66 ml 1 M

raztopine NaOH in s 7,1% raztopino natrijevega sulfata dopolni do značke.

Odmeri po 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 in 50 ml te raztopine v 100 ml merilne

bučke in jo vsakokrat razredči s 7,1% raztopino Na2SO4 do značke. Nato naredi


10

barvno reakcijo z vsako od pripravljenih raztopin in izmeri absorbanco pri 530

nm.

Na ta način dobiš raztopine, ki ustrezajo eluatu sadnega soka z vsebnostjo

vinske kisline po 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 in 5,0 g/dm3.

Ko naneseš izmerjene vrednosti absorbanc standardnih raztopin na ordinato,

ustrezne masne koncentracije vinske kisline pa na absciso, dobiš premico, ki je

proti izhodišču koordinatnega sistema rahlo ukrivljena.

Reagenti

30 % raztopina CH3COOH

ionski izmenjalec Merck III

0,5 % raztopina CH3COOH

7,1 % raztopina Na2SO4

1 M raztopina H2SO4

0,05 M raztopina H2SO4

2 % raztopina NH4VO3

10 % raztopina glicerola

raztopina vinske kisline (1 mg/ml)

0,05 % raztopina H5I06

Pribor

steklena kolona (250x10 mm), kosem vate, steklene palčke, 100 ml merilni valj, 100 ml merilni bučki, erlenmajerici, 2 ml, 5 ml in 20 ml polnilne pipete, kolorimeter.

Literatura

Rebelein,H., Deutsche Lebensmittel Rundschau, 2,1961,s. 36-41. Rebelein, H.,Deutsche Lebensmittel Rundschau, 5,1963, s.129-132. Belitz,H.D., W.Grosch, Food Chemistry, Springer Verlag, Berlin,1987, s. 592. Zoecklein,B.W., K.C.Fugelsang, B.H.Gump, F.S.Nury, Wine Analysis and Production,

Champman&Hall,1994,s.504-508.


11

3. VAJA

DOLOČANJE AKTIVNOSTI TRIPSINSKEGA INHIBITORJA V SOJI

Stročnice vsebujejo veliko inhibitorjev tripsina in drugih serinskih proteaz. Njihova

fiziološka vloga še ni pojasnjena, predvidevajo pa možnost sodelovanja teh

inhibitorjev pri obrambi pred insekti. Inhibitorji proteaz naj bi inhibirali delovanje

proteaz insektov.

Inhibitorji teh proteaz se delijo na dve skupini: Kunitzov (KI) in Bowman-Burkov

(BBI) tip tripsinskih inhibitorjev, ki se med seboj razlikujeta. Tripsinski inhibitorji

Kunitzovega tipa imajo Mr okrog 22.000 in relativno malo cisteinskih ostankov,

Bowman-Burkov tip tripsinskega in kimotripsinskega inhibitorja pa imajo molske

mase od 8000 do 10.000 ter več cisteinskih ( 20 %) ostankov, torej tudi več

disulfidnih mostičkov.

Prvi, ki je izoliral in karakteriziral nek tripsinski inhibitor je bil Kunitz, ki je l.1947

izoliral tripsinski inhibitor iz soje, katerega primarna struktura je bila objavljena

šele l.1973. Zgrajen je iz 181 aminokislinskih ostankov; v molekuli so 4 cisteinski

ostanki, torej lahko tvori dva disulfidna mostička in ima v reaktivnem mestu

naslednje zaporedje aminokislin:

60 61 62 63 64 65 66 67

-Pro-Ser-Tyr-Arg-OH H-Ile-Arg-Phe-Ile-

Določanje aktivnosti tripsinskega inhibitorja je pomembno zaradi čedalje večje

uporabe soje za človeško prehrano. Raziskave na živalih so pokazale, da

povzroča uživanje surove soje motnje pri prebavi in absorpciji beljakovin.

Vsebnost Kunitzovega tripsinskega inhibitorja močno in hitro pade pri toplotni

obdelavi, Bowman-Burkovi inhibitorji pa so temperaturno dosti bolj stabilni. V

literaturi je znanih več načinov za določanje aktivnosti Kunitzovega tripsinskega

inhibitorja. Posebno se je uveljavila metoda, ki jo je razvil Kakade s sodelavci

l. 1974. Modificirano verzijo te metode so objavili Hamerstrand in sodelavci v

Cereal Chemistry 58 (1), 1981, in jo bomo uporabili tudi pri naših vajah.


12

Eksperimentalni del

Princip

Tripsin katalizira odcepitev p-nitroanilina iz substrata N-benzoil-D,L-arginin-

p-nitroanilida pri pH 8,2. Rumeno obarvan produkt ima največjo absorbanco pri

410 nm. Tripsinski inhibitor zavira delovanje tripsina, tako da nastane manj

produkta p-nitroanilina v enakem času.

O

O

N

H

C

C

H

N

CH2

(CH2)2

H2C

N

H

C

NO2

NH2

NH2

+

E (OH

-)

+

O

O

N

H

C

C

H

N

CH

(CH2)2

H2C C

NH2

NH2

O-

+

NO2H2N

Izvedba

Priprava ekstrakta

1 g vzorca zmlete soje dodaj 50 ml 0,01 M raztopine NaOH, uravnaj pH na 8,6 in

ekstrahiraj tripsinski inhibitor 1 uro pri sobni temperaturi med stalnim mešanjem.

Po končani ekstrakciji izmeri volumen ekstrakta, odvzemi 1 ml suspenzije in jo

razredči v 50 ml merilni bučki z destilirano vodo. Nato pripravi tri epruvete, jih


13

označi s številkami od 1 do 3 ter postopoma dodaj naslednje reagente kot je

navedeno v razpredelnici:

epruveta

V (ekstrakt soje)

(ml)

V (H2O)

(ml)

V (tripsin)

(ml)

1 2 - -

2 - 2 2

3 2 - 2

Vzorce in raztopino substrata nato termostatiraj 5 minut pri temperaturi 37°C in

dodaj v prvi vzorec 1 ml 30% raztopine ocetne kisline, 5 ml raztopine substrata

(BAPNA) in 2 ml raztopine tripsina. To je sedaj slepi vzorec. Vzorcu 2 in 3 dodaj

po enominutnem presledku 5 ml raztopine substrata (BAPNA). Reakcijo pusti teči

točno 10 minut, nakar dodaj po 1 ml 30 % raztopine ocetne kisline ter dobro

premešaj. Nato izmeri absorbanco raztopin proti slepemu vzorcu pri 410 nm. Po

potrebi ponovi razredčenje ekstrakta soje in sicer tako, da boš dosegel območje

od 40 % do 60 % inhibicije tripsina.

Izračun vsebnosti tripsinskega inhibitorja

Vzorec v drugi epruveti ne vsebuje sojinega ekstrakta in zato ne pride do

inhibicije encimske hidrolize substrata N-benzoil-D,L-arginin-p-nitroanilida s

tripsinom. Vrednost izmerjene absorbance tega vzorca pri 410 nm ustreza

največji možni količini p-nitroanilina, ki lahko nastane v 10 minutah pri teh pogojih

merjenja. Tretji vzorec vsebuje inhibitor tripsina in zato je v njem nastalo manj

p-nitroanilina v enakem času. Razlika v absorbanci pri 410 nm med drugim in

tretjim vzorcem mora biti taka, da ustreza od 40 % do 60 % celotne absorbance

p-nitroanilina, sproščenega v 10 minutah.

1 TU (tripsinska enota) je definirana kot povečanje absorbance raztopine pri 410

nm za 0,010 v 10 ml reakcijske mešanice pri teh pogojih določanja. Aktivnost


14

tripsinskega inhibitorja je izražena s številom tripsinskih enot, ki so se inhibirale

(TIU). Število TIU lahko izrazimo kot TIU/ml ekstrakta ali TIU/mg soje.

TIU/ml = (A410/0,010) x F

TIU/mg = ((A410/0,010) x 1/a

F je ustrezni faktor razredčenja, a pa masa soje v reakcijski zmesi (mg).

Reagenti

- 0,01 M raztopina NaOH

- 0,05 M Tris-HCl pufer, pH 8,2, z dodatkom CaCl2.2H2O do koncentracije 0,05 M

- N-benzoil-D,L-arginin-p-nitroanilid (BAPNA): 0,080 g BAPNA raztopi v 2 ml

dimetilsulfoksida in razredči do 200 ml z 0,05 M Tris-HCl pufrom s pH 8,2

- tripsin: 0,020 mg tripsina raztopi v 1 ml 0,001 M raztopine HCl.

Pribor

250 ml čaša, mešalo, polnilne pipete (1,2,5 ml), epruvete, električni vibrator,

kolorimeter

Literatura

Onesti, S., Brick, P., Blow, D.M. J.Mol.Biol., 217,1991, s. 153-176.

Hydrolytic Enzymes in New Comprehensive Biochemistry, Ed. Neuberger, A., H. Brockhurst, V.16,

Elsevier, Amsterdam, 1987, s.269-273.

Hamerstrand, G.E., Black, L.T., Glover, J.D. Cereal Chem., 58(1), 1981, s. 42-45.

Kakade, M.L., Rachis, J.J., Mc Ghee, J.E., Puski, G., Cereal Chem., 51, 1974, s. 376-382.


15

4. VAJA

KVANTITATIVNA DOLOČITEV ŠKROBA V MOKI

V večini organizmov se lahko odvečna količina glukoze pretvori v spojino,

primerno za transport, ali v polimer, ki je namenjen za shranjevanje. Tako je

rezervna snov v rastlinah škrob, ki nastaja v kloroplastih. Hitrost sinteze škroba

regulira ADP-glukoza, ki nastaja iz glukoze-1-fosfata in ATP, s pomočjo encima

ADP-glukoza- pirofosforilaze. Nato encim škrob-sintaza omogoči prenos

glukoznega ostanka z ADP-glukoze na nereducirajoči konec že obstoječe,

vendar krajše verige škroba, ki se tako podaljša za en glukozni ostanek. Škrob se

kopiči v kloroplastih, nato se razgradi, produkti razgradnje pa se prenesejo v

druge dele rastline, kjer se škrob resintetizira in shrani kot rezervna snov.

Poleg celuloze je škrob najbolj razširjen polisaharid v rastlinah. Kot rezervna snov

se nahaja v obliki zrnc v različnih delih rastline (semenih, koreninah). Oblika in

velikost škrobnih zrnc je karakteristična za posamezno rastlino, tako da je možno

pod mikroskopom določiti, kateri rastlini pripadajo določena zrnca škroba.

Škrob je sestavljen iz amilopektina (približno 80%), ki je v vodi netopen in topne

amiloze (približno 20%). Molekula amiloze je zgrajena iz linearne verige

500-2000 glukoznih enot, molekule amilopektina pa so razvejene in vsebujejo

nekaj 100 kratkih linearnih ter okrog 4 % razvejenih verig. Povprečna molska

masa amilopektina je najmanj 1,000.000, amiloze pa 80.000 g/mol.

Za koruzni, pšenični in krompirjev škrob je značilno dokaj stalno razmerje amiloze

in amilopektina. Škrob nekaterih vrst koruze in riža v celoti sestavlja samo

amilopektin, škrob graha in drugih vrst koruze pa vsebuje tudi od 70 do 80%

amiloze.

Vsebnost škroba v živilih je možno določiti na različne načine. Metode se

razlikujejo tudi po natančnosti. Hidroliza škroba do glukoze samo s kislino da

napačne rezultate, ker lahko pride tudi do razgradnje drugih polisaharidov (ne

samo škroba) ter razgradnje glukoze. Zato je bolj zanesljiva kombinacija kislinske


16

in encimske razgradnje z -amilazo in amiloglukozidazo do glukoze, katere

koncentracijo lahko kvantitativno določimo.

Eksperimentalni del

Princip

Pri kislinski hidrolizi nastanejo različni oligosaharidi. -amilaza, ki jo dodamo

reakcijski zmesi, cepi -(1,4)-glikozidne vezi v notranjosti, amiloglukozidaza pa

-(1,4)- glikozidne vezi od konca oligosaharidov in tudi -(1,6)-glikozidne vezi,

čeprav bolj počasi. Tako je končni produkt razgradnje samo glukoza. Hidrolizatu

nato spektrofotometrično določimo vsebnost glukoze. Glukoza je namreč močan

reducent in reducira nitro skupino v 3,5-dinitrosalicilni kislini do aminoskupine. Pri

tem nastane značilno obarvan produkt, kar omogoča spektrofotometrično

določitev.

Izvedba

a. Kislinska hidroliza

0,80 g moke stresi v 100 ml čašo, dodaj 25 ml 2 M raztopine HCl in približno

25 ml vode. Nastalo koloidno raztopino mešaj pri sobni temperaturi 20 minut.

Čašo nato postavi na ogreto ploščo (200-300°C) in počakaj, da raztopina

zavre. Raztopino pusti vreti 20 minut, čašo nato odstavi in jo ohladi na sobno

temperaturo. Izmeri pH raztopine in ga uravnaj na vrednost 6,9 s 3 M raztopino

NaOH. Raztopino kvantitativno prelij v 100 ml merilno bučko ter razredči z

vodo do značke.

b. Encimska hidroliza

Odpipetiraj 0,40 ml raztopine iz merilne bučke v epruveto, dodaj 0,70 ml

-amilaze in pusti učinkovati točno 3 minute. Nato dodaj 0,10 ml raztopine

amiloglukozidaze in postavi epruveto za 10 minut v vodno kopel s temperaturo

55°C.


17

c. Kolorimetrična določitev glukoze

Po končani hidrolizi ohladi epruveto na sobno temperaturo in dodaj 1 ml

raztopine 3,5-dinitrosalicilne kisline. Hkrati pripravi tudi slepi vzorec: odpipetiraj

1,20 ml vode in dodaj 1 ml raztopine 3,5-dinitrosalicilne kisline. Obe epruveti

nato postavi v vrelo vodo in ju segrevaj točno 5 minut. Potem ju ohladi na

sobno temperaturo in vsako posebej kvantitativno prelij v 25 ml merilno bučko,

dopolni z vodo do značke ter premešaj. Izmeri absorbanco vzorca proti

slepemu vzorcu pri 540 nm ali ob uporabi zelenega filtra.

d. Umeritvena krivulja za določitev glukoze

Pripravi 100 ml raztopine glukoze z masno koncentracijo 2 mg /ml in 7 epruvet,

v katere odpipetiraj naslednje količine raztopine in vode:

vzorec V (razt. glukoze)

(ml)

m (glukoza)

(mg)

V(H2O) (ml)

1 - - 1,20

2 0,20 0,40 1,00

3 0,40 0,80 0,80

4 0,60 1,20 0,60

5 0,80 1,60 0,40

6 1,00 2,00 0,20

7 1,20 2,40 -

Vsakemu vzorcu nato dodajaj po 1 ml raztopine 3,5-dinitrosalicilne kisline, ga

dobro premešaj in postavi v vrelo vodo za točno 5 minut. Ko raztopine ohladiš,

vsako posebej kvantitativno prelij v 25 ml merilno bučko ter razredči z vodo do

značke, premešaj in izmeri absorbanco pri 540 nm proti slepemu vzorcu. Iz

dobljenih absorbanc in mas glukoze (v mg) nariši umeritveno krivuljo za

določanje glukoze.


18

Račun:

w (škrob) = (a x 0,9 x 250 x 100)/b

w je odstotek škroba v moki, a so mase glukoze v vzorcu (mg), ki si jih odčital z

umeritvene krivulje, b pa masa vzorca (mg), pri čemer je 0,9 koeficient

razmerja molskih mas glukoznega ostanka v škrobni molekuli in proste glukoze,

250 pa faktor razredčenja.

Reagenti

- -amilaza: 10 mg encima raztopi v 20 ml fosfatnega pufra, pH 6,9. Encim naj

ima tako aktivnost, da 1 g encima razgradi 50 g škroba v 30 minutah pri

standardnih pogojih

- amiloglukozidaza: 100 mg encima raztopi v 2 ml acetatnega pufra s pH 4,3

- 3,5-dinitrosalicilna kislina: 5 g 3,5-dinitrosalicilne kisline raztopi med

segrevanjem v 100 ml 2M raztopine NaOH. Posebej med segrevanjem

raztopi 150 g kalij-natrijevega tartrata v 25 ml vode. To raztopino dolij

raztopini 3,5-dinitrosalicilne kisline v 500 ml merilni bučki in dopolni z vodo do

500 ml

- fosfatni pufer, pH 5,9: raztopi 170 mg Na2HPO4, dodaj 140 mg NaH2PO4.10H2O

ter 30 mg NaCl. Ko se vse raztopi, dopolni z vodo do 100 ml

- acetatni pufer: 29,4 ml konc. ocetne kisline (17 N) raztopi v 470,6 ml vode,

raztopini dodaj toliko NaOH, da bo pH točno 4,3 in dopolni v merilni bučki z

vodo do 500 ml.

Pribor

tehtnica, 250 ml čaše, merilni valji (50 ml), mešalo z grelno ploščo, pH-meter,

kapalke, merilne bučke (100 ml, 25 ml), merilne pipete (1 ml, 2 ml), termostat,

epruvete, kolorimeter, stojalo za epruvete

Literatura

Woods, A.E., Aurand, L.W., Laboratory Manual in Food Chemistry, AVI Publishing Company,

Westport, Connecticut, ZDA, 1977, s. 17-18.

Lehninger,A.L.,Nelson,D.L.,Cox,M.M.,Principles of Biochemistry,Worth Publishers, New York, 1993,

s.616-617.


19

5. VAJA

KVANTITATIVNA DOLOČITEV HOLESTEROLA V MLEKU

Holesterol je zelo pomembna sestavina živalskih celic. Spada med lipide,

kemično je sterol, njegova strukturna formula je:

HOH

H

H

H

H

H

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

C

CH2CH2CH2CH

Sinteza holesterola v živalskih celicah se začne s kondenzacijo treh molekul

acetil-CoA. Najprej nastane -hidroksi--metilglutaril-CoA (HMG-CoA), iz

katerega po redukciji z NADPH nastane mevalonat. Encim HMG-CoA reduktaza,

ki katalizira nastanek mevalonata, je tudi glavno mesto regulacije sinteze

holesterola in je lociran na membrani gladkega endoplazmatskega retikuluma.

V človeškem organizmu je holesterol sestavni del lipoproteinov, celičnih

membran, žolčnih kamnov. Iz njega nastajajo steroidni hormoni, vitamin D3 in

žolčne kisline. Holesterol je za organizem nujno potreben, vendar so prevelike

količine holesterola v krvi škodljive, saj pospešuje nastanek ateroskleroze. Zato

je vsebnost holesterola v živilih pomemben podatek posebno, če gre za

dietetično prehrano.

V literaturi so opisane številne metode za določanje holesterola. Razlikujejo se

po različnih načinih priprave vzorcev in po kvantitativni meritvi pri določanju

(kolorimetrična, kromatografska ali encimska). Kolorimetrične metode se

razlikujejo

po reagentu za razvijanje barve (reakcija s železovim(II)sulfatom, železovim

(III)kloridom ali o-ftalaldehidom v kislem mediju itd).


20

Eksperimentalni del

Princip

V holesterolu sta dve reaktivni mesti, kjer lahko poteče reakcija (-OH skupina in

dvojna vez). V vzorcu mleka najprej s saponifikacijo razgradimo trigliceride in

razcepimo vez holesterol-protein. Prost holesterol nato ekstrahiramo v organsko

fazo in ga kvantitativno določimo v alikvotnem delu z o-ftalaldehidom v prisotnosti

žveplove kisline. Reakcijski produkt je vijoličaste barve.

Izvedba

V veliko epruveto odpipetiraj 2 ml mleka, dodaj 3 ml 95% raztopine etanola in

2 ml 50 % raztopine KOH. Epruveto dobro zapri in segrevaj 15 minut pri 60°C na

vodni kopeli. Ko se raztopina ohladi, dodaj 5 ml heksana in 3 ml vode. Nato

centrifugiraj 10 minut pri 2500 min-1

v laboratorijski centrifugi, tako da se

organska plast zbistri. Odlij organsko plast v epruveto, odpipetiraj 3 ml v drugo

epruveto in odstrani heksan s prepihavanjem z dušikom. Suhemu ostanku dodaj

4 ml o-ftalaldehida, premešaj in po 10 minutah previdno dolij po steni epruvete še

2 ml koncentrirane H2SO4. Ko dodaš vso kislino, dobro premešaj in izmeri

absorbanco obarvane raztopine po 30 minutah pri 550 nm ali zelenem filtru.

Umeritvena krivulja za določanje holesterola

Pripravi raztopino holesterola v 95% etanolu (koncentracija 0,1 mg/ml) in

odpipetiraj za umeritveno krivuljo naslednje količine posameznih reagentov:


21

vzorec V(razt. holesterola)

(ml)

V(95% etanol) (ml)

1 0,25 2,75

2 0,50 2,50

3 0,75 2,25

4 1,00 2,00

5 1,25 1,75

Nato dodaj v vsako epruveto po 2 ml 50% raztopine KOH, segrevaj 15 minut pri

60°C, ohladi in dodaj 5 ml heksana in po 3 ml vode. Po centrifugiranju odlij

organsko plast v eno epruveto in odpipetiraj 4 ml v drugo epruveto. Odstrani

heksan s prepihovanjem z dušikom. Suhemu ostanku dodaj 4 ml o-ftalaldehida in

po 10 minutah še previdno dolij po steni 2 ml koncentrirane H2SO4. Počakaj 30

minut, da se barva razvije in izmeri absorbanco pri 550 nm. Slepi vzorec pripravi

iz 4 ml o-ftalaldehida in 2 ml koncentrirane H2SO4. Iz izmerjenih absorbanc in

količine holesterola v vzorcih 1, 2, 3, 4 in 5 nariši umeritveno krivuljo. Pri izračunu

vsebnosti holesterola v mleku upoštevaj, da si odvzel za analizo vzorca samo 3/5

organske faze.

Reagenti

raztopina o-ftalaldehida: 50 mg o-ftalaldehida raztopi v 100 ml koncentrirane ocetne kisline. Vsak dan pripravi svežo raztopino

95 % raztopina etanola

50 % raztopina KOH

heksan

koncentrirana žveplova kislina

standardna raztopina holesterola: 0,1 mg holesterola raztopi v 1 ml 95% etanola


22

Pribor

20 ml epruvete z obrusom, 20 ml epruvete, 5 ml merilne pipete, gumijasta

sesalka, električni vibrator, vodna kopel, laboratorijska centrifuga, jeklenka z

dušikom, kolorimeter

Literatura

Bachman, K. C., Lin Jan-Hei, Wilcox C.J., Journal of AOAC, 59(5), 1976, s. 1146-1149 Yeagle, P. L., Biology of Cholesterol, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, s. 72-78.


23

6. VAJA

DOLOČANJE AKTIVNOSTI POLIFENOL OKSIDAZ V KROMPIRJU

Polifenol oksidaze se nahajajo v rastlinskih in živalskih celicah. Krompir vsebuje

polifenol oksidazo (tirozinazo), ki katalizira hidroksilacijo monofenolov in aerobno

oksidacijo nastalih difenolov v o-kinone. Primer take reakcije za tirozin prikazuje

naslednja reakcijska enačba:

OH

CH2

COOH

OH

CH NH2

O2

PFO

O

CH2

COOH

O

CH NH2

N

O

O

H

+ CO2

Nastali o-kinoni nato vstopajo v številne druge reakcije in povzročajo rjavo

obarvanje sadja in zelenjave. Encimsko porjavenje nastopi vedno, kadar

prerežemo ali poškodujemo sadje ali zelenjavo. Komercialno je ta pojav

nezaželen, ker poslabša senzorične lastnosti živil.

Med polifenol oksidaze spada tudi tirozinaza v živalskih celicah, ki je pomembna

pri metabolizmu tirozina za nastanek kožnega pigmenta melanina.

V katalitično aktivnost polifenol oksidaz so vključeni tudi bakrovi ioni, ki se v

reakciji reverzibilno oksidirajo in reducirajo. Polifenol oksidaze niso strogo


24

specifični encimi in lahko katalizirajo reakcije z različnimi fenolnimi spojinami kot

substrati.

Fenolne spojine so vse spojine, ki imajo na aromatski obroč vezane hidroksilne

skupine in njihove derivate. Znanih je približno 4000 naravnih fenolnih spojin,

najbolj so razširjeni flavonoidi.

Eksperimentalni del

Princip

Polifenol oksidaza (PFO) katalizira oksidacijo substrata 3,4-dihidroksifenilalanina (DOPA) v o-kinon:

OH

OH

CH2

CH NH2

COOH

O2

E

O

O

CH2

CH NH2

COOH

N

O

O

H

+ CO2

DOPA

Izvedba

a. Priprava surovega ekstrakta

Srednje velik, surov, ohlajen krompir hitro olupi in razreži na drobne koščke.

Odtehtaj 25 g krompirja, ga stresi v mikser, dolij 50 ml ledenomrzlega

fosfatnega pufra I. Zmes homogeniziraj 1 minuto, počakaj 15 sekund, da se

homogenat ohladi in ga nato hitro filtriraj skozi več plasti gaze. Ker je filtrat

moten, ga še centrifugiraj v laboratorijski centrifugi 10 minut pri 10.000 min-1

.

PAZI! Ekstrakt mora biti pripravljen neposredno pred analizo. Ves čas analize

ga hrani v ledenomrzli kopeli!


25

b. Vpliv koncentracije encima na aktivnost

Supernatant po centrifugiranju razredči s fosfatnim pufrom II v razmerju 1:1.

Nato pripravi vzorce za encimsko reakcijo, tako da spreminjaš volumen

dodanega ekstrakta od 0,050 do 0,300 ml.

vzorec V(pufer II) (ml)

V

(DOPA)ml)

V(razr. krom. ekstr.)

(ml)

1 1,95 1,00 0,050

2 1,90 1,00 0,100

3 1,80 1,00 0,200

4 1,70 1,00 0,300

Za vsak vzorec moraš pripraviti tudi prazni vzorec. Namesto razredčenega

krompirjevega ekstrakta uporabi enako količino vode.

PAZI! Raztopini pufra in substrata odpipetiraj neposredno v kiveto. Ko dodaš

ekstrakt, sproži štoparico, vsebino v kiveti dobro premešaj in kiveto hitro

postavi v spektrofotometer. Odčitaj absorbanco (Aizm) pri 475 nm vsakih 30

sekund. Spektrofotometer mora biti umerjen z vodo, absorbanco slepega

vzorca (Asl) izmeri glede na vodo, še preden začneš z encimsko reakcijo.

Podatke sproti vpisuj v tabelo!

Avz v odvisnosti od časa prikaži v diagramu, točke poveži v krivuljo. Nato nariši

tangento na krivuljo, ki poteka skozi čas 0. Odčitaj začetno hitrost A/min za

vsak volumen ekstrakta. Iz odčitanih začetnih hitrosti A/min in volumnov

ekstrakta nariši nov diagram, točke poveži v premico. Izberi optimalni volumen


26

t(s) Aizm Asl Aizm-Asl=Avz

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

ekstrakta za določanje aktivnosti in s tem naredi nov poskus, vendar vzemi

1,25 ml raztopine DOPA in ustrezno količino pufra II. Nariši nov diagram Avz

proti času, tangento na to krivuljo in odčitaj začetno hitrost Avz/min. To

vrednost uporabi za izračun aktivnosti polifenol oksidaz v krompirju.

Račun

Iz vrednosti začetne hitrosti A/min in molskega absorpcijskega koeficienta,

katerega vrednost je 5012 l.mol-1

.cm-1

, izračunaj, množino produkta (mol), ki

je nastal oziroma množino substrata ( mol), ki ga je razgradil encim v

določeni količini ekstrakta ter podaj rezultat kot U/ml surovega ekstrakta. Enota

encimske aktivnosti (U) je definirana kot tista množina encima, ki razgradi

1mol substrata v 1 minuti pri določenih pogojih encimske reakcije.

Reagenti

fosfatni pufer I: 0,1M Na2HPO4, pH 6,8, ki vsebuje 0,1M NaF

fosfatni pufer II: 0,1M Na2HPO4, pH 6,8


27

substrat: 4 mg 3,4-dihidroksifenilalanina raztopi v 1 ml fosfatnega pufra II.

Pripravi svežo raztopino vsak dan sproti.

Pribor

nož, deska za rezanje, mikser, 50 ml merilni valj, večplastna gaza, lij,

laboratorijska centrifuga, ledenomrzla kopel, vodna kopel, spektrofotometer,

kivete, parafilm, 2 in 5 ml merilne pipete, mikropipete, epruvete.

Literatura

Boyer, R. F., A Spectrophotometric Assay of Polyphenoloxidase Activity, J. Chemical Education,

54(9), 1977, s 585-586.

Encyclopedia of Food Science and Technology, Ed., Y. H. Hui, V.3, John Wiley & Sons, New York,

1992, s. 2055-2061.

Documents

VAJE IZ @IVILSKE KEMIJEAbram,V., M.Zelenik-Blatnik, Vaje iz živilske kemije Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2002 3 Za pripravo slepega vzorca uporabi 25 ml Luffove