Embed Size (px)
Citation preview
25
Vaja številka I. – Določanje pH vrednosti
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Namen vaje b) Predznanje za vajo c) Pribor in material za določanje pH d) Potek vaje e) Izvedba vaje f) Zapis izmerjenih vrednosti pH (rezultatov)
26
a) Namen vaje Temeljni cilji so: - prikaz različnih načinov merjenja pH, - določevanje vrednosti pH v tekočinah in biološkega
materiala, - uporabiti že pridobljeno znanje iz učbenikov in predavanj
(Diagnostično terapevtski program z medicinsko propedevtiko, Biokemija in Biofizika) za razlago mehanizmov nastanka sprememb pH v človeškem organizmu.
b) Predznanje za vajo Študentje naj ponovijo naslednje teme: - pH, - fiziologija začetnega prebavnega trakta (pH v ustni votlini, - žleze slinavke, usta mikroflora, encimi v slini), - fiziologija krvi in normalne vrednosti pH krvi. Dodatno naj preštudirajo tudi teme: - vpliv spremenjenega pH v ustni votlini na razvoj mikroorganizmov, - vpliv spremenjenega pH v ustni votlini na delovanje prebavnih encimov, - vpliv spremenjenega pH krvi na zdravstveno stanje (acidoza, alkaloza). c) Pribor in material za določanje pH Študentje bodo v laboratoriju samostojno izvedeli kvalitativno in kvantitativno metodo določevanja pH vrednosti neznanih tekočin in biološkega materiala. Pribor: - 3 laboratorijske čašice z neznanimi tekočinami (A, B in C), - 1 petrijevka za človeško slino, - 1 epruveta z venozno krvjo, - testni pH lističi, - elektronski analizator pH, - staničevina in/ali vata. d) Potek vaje Uvod Za podajanje kislosti in/ali bazičnosti se uporablja pojem pH. Definiran je kot: negativni dekadični logaritem koncentracije vodikovih ionov: pH = - log [H3O+] pOH = - log [OH-] in pH + pOH = 14 Za določanje kislosti in/ali bazičnosti snovi je na voljo množica različnih pripomočkov, ki nam omogočajo kvalitativno (npr. testni pH lističi) in kvantitativno določanje pH (npr. elektronski pH analizatorji različnih vrst itd.). - Vaja temelji na poskusu določevanja pH vrednosti v treh različnih tekočin, človeški slini in venozni krvi. - Kratek test iz fiziloških temeljiv snovi, ki je navedena kot priprava za vajo.
- Ponazoritev vpliva pH na razmnoževanje mikroorganizmov v ustni votlini. - Ponazoritev vpliva pH na delovanje prebavnih encimov v ustni votlini. - Ponazoritev spremenjenega pH v krvi (acidoza, alkaloza). Izvedba praktičnega dela. e) Izvedba vaje Študentje bodo samostojno izvedlil meritev pH v vseh treh neznanih tekočinah izvedel dve meritvi, prva je t.i. kvalitativna in druga t.i. kvantitativna določitev pH vrednosti. Kvalitativna meritev neznanih tekočin: - za določen čas potopimo reagenčni trak v neznano tekočino A (čas je odvisen od navodil proizvajalca), - po določenem času reagenčni trak skrbno odcedimo, - jakost spremembe barve primerjamo s pH skalo, - dobljene vrednosti vpišemo na Sliko 1, - postopek ponovimo še za ostale tekočine (B in C). Kvantitativna meritev neznanih tekočin: - za meritev potrebujemo elektronski pH analizator, - v neznano tekočino A potopimo sondo elektronskega analizatorja, - ko smo sondo potopili v neznano tekočino lahko elektronski analizator prižgemo, - po določenem času lahko rezultat odčitamo na elektronskem zaslonu– počakati moramo, da se vrednost na elektronskem zaslonu "ustali" do desetinke natančno, dobljeno vrednost vpišemo na Sliko 1., - po zaključenem merjenju v prvi čašici, elektronski analizator ugasnemo, odcedimo in v ga vertikalni legi splahnemo pod curkom navadne vode (paziti je potrebno, da ga med spiranjem z navadno vodo ne obrnemo analizator "na glavo", kajti v tem primeru bi voda poškodovala elektronski sistem merilnika), - sondo elektronskega analizatorja skrbno očistimo s staničevino, - postopek ponovimo še za ostale tekočine (B in C). Kvalitativna meritev človeške sline: - za določen čas potopimo reagenčni trak v človeško slino (čas je odvisen od navodil proizvajalca), - po določenem času reagenčni trak skrbno odcedimo, - jakost spremembe barve primerjamo s pH skalo, - dobljene vrednosti vpišemo na Sliko 1, Kvantitativna meritev človeške sline: - za meritev potrebujemo elektronski pH analizator, - v človeško slino potopimo sondo elektronskega analizatorja, - ko smo sondo potopili v neznano tekočino lahko elektronski analizator prižgemo, - po določenem času lahko rezultat odčitamo na elektronskem zaslonu – počakati moramo, da se vrednost na elektronskem zaslonu "ustali" do desetinke natančno, - dobljeno vrednost vpišemo na Sliko 1.,
27
- po zaključenem merjenju v prvi čašici, elektronski analizator ugasnemo, odcedimo in v ga vertikalni legi splahnemo pod curkom navadne vode (paziti je potrebno, da ga med spiranjem z navadno vodo ne obrnemo analizator "na glavo", kajti v tem primeru bi voda poškodovala elektronski sistem merilnika), - sondo elektronskega analizatorja skrbno očistimo s staničevino in sondo razkužimo.
Kvantitativna meritev venozne krvi: - za določen čas potopimo reagenčni trak v venozno kri (čas je odvisen od navodil proizvajalca), - po določenem času reagenčni trak skrbno odcedimo, - jakost spremembe barve primerjamo s pH skalo, - dobljene vrednosti vpišemo na Sliko 1. f) Zapis izmerjenih vrednosti pH Študent bo v razpredelnico (Slika 1) shematično narisal dobljene vrednosti.
Slika 1. Meritve pH neznanih tekočin in biološkega materiala
14
pH 13
skala 12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
kvalitativno kvantitativno kvalitativno kvantitativno kvalitativno kvantitativno kvalitativno kvantitativno kvalitativno
tekočina A
tekočina B
tekočina C
slina venozna kri
28
Računanje:
29
Vaja številka II. – Določanje okultne krvavitve
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Namen vaje b) Predznanje za vajo c) Pribor in material za določanje krvi v blatu d) Potek vaje e) Zapis izmerjenih vrednosti
30
a) Namen vaje Temeljni cilji so: - prikaz načinov določanja okultne krvavitve iz debelega črevesja, - uporabiti že pridobljeno znanje iz učbenikov in predavanj (Diagnostično terapevtski program z medicinsko propedevtiko, Fizilogija in Anatomija) za razlago mehanizmov nastanka okultnih krvavitev v debelem črevesju človeškega organizma. b) Predznanje za vajo: Študentje naj ponovijo naslednje teme: - anatomija prebavnega trakta - fiziologija prebavnega trakta. Dodatno naj preštudirajo tudi teme: - vpliv večjih krvavitev iz zgornjih prebavilih (ustna votlina, - grlo, požiralnik, želodec, tanko črevo) na barvo blata , - vliv večjih in okultnih krvavitev iz spodnjih prebavilih (celotno dbelo črevo in danka) na izgled blata, c) Pribor in material za določanje krvi v blatu Študent bo v laboratoriju samostojno izvedel analizo prisotnosti krvi v blatu. - 2 petrijevke/epruvete z neznano snov (A in B),
- Haemocullt pribor, - staničevina, - razkužilo za roke. d) Potek vaje - Ponazoritev večjih krvavitev iz zgornjih prebavil in nevarnosti za človeka. - Ponazoritev večjih in okultnih krvavitev iz spodnjih prebavil in nevarnosti za človeka. - Ponazoritev vpliva krvavitev v prebila na krvne vrednosti (npr. hemoglobin, hematokrit). Izvedba praktičnega dela. Izvedba vaje: - košček neznane snovi nanesemo na zato primerno mesto v Haemocullt priboru in nanjo pokapljamo primerno količino reagenta, - po določenem času (navodila proizvajalca) odčitamo vrednost, - dobljene vrednosti vnesete v razdelek 3 (obkroži). e) Zapis izmerjenih vrednosti Študent bo v razpredelnico (slika 2) zapisal dobljene vrednosti (vnese naj znak kljukice, kjer je rezultat pozitiven)
Slika 2. Razpredelnica dobljenih vrednosti okultne krvavitve
pozitivno (+) negativno (-)
neznana snov B
neznana snov A
31
Vaja številka III. – Urin
Splošna navodila za vaje z urinskim vzorcem
a) Namen vaje b) Predznanje za vajo
32
Splošna navodila za vse vaje z urinskim vzorcem a) Namen vaje Temeljni cilji so: - prikaz različnih metod analize urina, - kvantitativna in kvalitativna analiza urina, - uporabiti že pridobljena znanja iz učbenikov in predavanj (Diagnostično terapevtski program z medicinsko proedevtiko, Fiziologija, Patologija in Mikrobiologija s parazitologijo) za razlago mehanizmov pravilnega odvzema, transporta in analize urinskih vzorec. b) Predznanje za vajo Študentje naj ponovijo naslednje teme: - fiziologija nastanka primarnega in sekundarnega urina, - normalna sestava mikroflore zunanjih genitalij, - fiziološka in patološka sestava urinskega vzorca - nanos kužnine na gojišče in mikroskopiranje. Dodatno naj preštudirajo naslednje teme: - vpliv nepravilnega odvzema in transporta kužnine na točnost analize, - vpliv vnosa hranljivih snovi na sestavo urina, - vpliv vnosa zdravil (antibiotiki) na sestavo urina.
33
Vaja številka III/a – Urin
(vaja se izvede samostojno)
34
Študent naj samostojno definira najpogostejšo simptomatiko pri boleznih sečil oligurija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ anurija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ poliurija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ nikturija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ retenca: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ inkontinenca: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ dizurija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ polakisurija: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ uretralni izcedek: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ledvena kolika: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ mikrohematurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ makrohematurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________
35
___________________________________________________________________________________________________ hemiglobinurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ levkociturija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ nitrurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ proteinurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ prelivna proteinurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ tubularna proteinurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ albuminurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ mikroalbuminurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ortostatska (postularna) proteinurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ketonurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ glukozurija ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________
36
Beležke k vaji številka III/a
37
Vaja številka III/b. – Urin
(vaja se izvede v laboratoriju)
Organoleptična – makroskopska analiza vzorca urina a) Pribor in material za organoleptično – makroskopsko analizo lastnega vzorca urina (kvalitativna analiza): b) Postopek organoleptične – makroskopske analize lastnega vzorca urina c) Izmerjene vrednosti
38
Organoleptična – makroskopska analiza vzorca urina a) Pribor in material za organoleptično – makroskopsko analizo lastnega vzorca urina (kvalitativna analiza): - lonček z urinskim vzorcem napolnjen od ¼ do ½. b)Postopek organoleptične – makroskopske analize lastnega vzorca urina Študent bo samostojno na lastnem vzorcu urina izvedel organoleptični – makroskopski pregled lastnega vzorca urina: - lasten vzorec urina makroskopsko primerjate s podatki, ki se nahajajo v Tabeli št. 1, - ustrezne vrednosti vnesete v zato primerne prostore, - dobljene vrednosti primerjate z referenčnimi vrednostmi,
- ustrezna odstopanja od referenčnih vrednosti ustrezno zabeležite. c)Izmerjene vrednosti Ustrezne vrednosti vpišete v Tabelo št. 1: - v Tabeli št. 1 pod točko 1. in 2. naj bodo vrednosti vnesene s kljukico (npr. če opazite, da je vaš vzorec urina bister in brez primesi pod točko 1., videz urina, vnesite kljukico) in v morebitne prazne prostore točke 1. vnesite Ø, - pod točko 2., besedno vpišite subjektivno zaznavo barve vašega vzorca urina, - pod točko 3., številčno vnesite vrednosti, ki ju boste dobili s kvalitativno (testni lističi) in kvantitativno (refraktometer) metodo, - pod komentar lahko vnesete vsa dodatna subjektivna opažanja.
Tabela št. 1. Organoleptična preiskava urina
Makroskopski pregled Rezultat Referenčne vrednosti
1. Videz (prozornost):
______________bister
čisto
______________ rahlo moten
______________ močno moten
______________ drugo
______________ opiši 2. Barva
______________
Slamnato rumene do jantarno rumene
3. Specifična teža
______________
1,005 – 1,030
Komentar: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________
39
Vaja številka III/c. – Urin
(vaja se izvede v laboratoriju)
Fizikalna in kemična analiza vzorca urina
a) Pribor in material za fizikalno in kemično analizo vzorca urina (kvalitativna analiza) b) Postopek fizikalne analize lastnega vzorca urina c)Postopek kemične analize lastnega vzorca urina
40
a) Pribor in material za fizikalno in kemično analizo vzorca urina (kvalitativna analiza): - lonček z urinskim vzorcem napolnjen (od ¼ do ½), - kapalka za enkratno uporabo, - testni lističi, - refraktometer, - staničevina. b) Postopek fizikalne analize lastnega vzorca urina Študent bo samostojno izvedel fizikalno in kemično analizo lastnega vzorca urina. - s kapalko za enkratno uporabo kanete kapljico lastnega urina na objektno stekelce refraktometra (glej sliko 10 - na konici refraktometra pod pokrovčkom se nahaja objektno stekelce), - objektno stekelce refraktometra pokrijete s pripadajočim pokrovčkom, - konico refraktometra usmerite proti svetlobi, - preko okularja refraktometra odčitate vrednost na skali, ki se nahaja na levi strani vidnega polja, - odčitano vrednost vnesete v ustrezno polje Tabele št. 1., po končani analizi sperete pod tekočo vodo samo konico refraktometra (objektno stekelce in pokrovček) in ga s staničevino osušite.
Slika 10. Shematični prikaz refraktometra
c) Postopek kemične analize lastnega vzorca urina: Študent bo samostojno izvedel kemično analizo lastnega vzorca urina: - za določen čas (čas je odvisen od proizvajalca – preveri) v vzorec urina potopite testni listič (vsi reagenti na testnem lističu morajo biti pomočeni v urinu, če je urina premalo pazljivo nagnete kozarček, da se vsi reagenti nahajajo v urinu), - po določenem času (čas je odvisen od proizvajalca – preveri) pazljivo izvlečete testni listič, nad lončkom ga postavite v horizontalno lego, da odvečni urin odteče in da se reagenti med seboj ne mešajo, - rezultate odčitate po določen času (čas je odvisen od proizvajalca – preveri) – odčitate spremembe v intenziteti barv na testen lističu, - morebitne spremembe v intenziteti barve reagentov na testnem lističu primerjate z ustrezno tabelo, - vrednosti vnesete v Tabelo št. 2 v obliki: neg (negativno), + (zerno pozitivno), ++ (zelo pozitivno), +++ (močno pozitivno). dobljene vrednosti primerjate z referenčnimi vrednostmi, pod rubriko komentar vpišete vsa morebitna odstopanja, odstopanja naj bodo tudi komentirana.
refraktometer
okular
pokrovček
objektno stekelce
41
Tabela št. 2. Kvalitativna preiskava urina
Reagent Rezultat Referenčne vrednosti
pH
______________
5,5 – 8,0
Proteini
______________
Negativno, v sledovih
Glukoza
______________
Negativno
Metil ketoni
______________
Negativno
Bilirubin
______________
Negativno
Urobilinogen
______________
0,1 – 1,0 EU/dL
Kri
______________
Negativno
Nitriti
______________
Negativno
Levkocitna esteraza
______________
Negativno
Relativna gostota
______________
1,005 – 1,030
Komentar: ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________
42
Beležke k vaji III/c
43
Vaja številka III/d. – Urin
(vaja se izvede v laboratoriju)
Priprava vzorca urna po metodi Sanford, priprava materiala za nanos na gojišče in barvanje preparata po Gramu
a) Pribor in material za pripravo vzorca urina po metodi Sanford b Postopek
44
a) Pribor in material za pripravo vzorca urina po metodi Sanford - plastični lonček napolnjen (od ¼ do ½) z urinom, - cepilna zanka za nanos kužnine na gojišče, - gorilnik, - 3 epruvete (v vsaki po 9 ml 0,9% NaCl - sterilne), - ustrezno umetno gojišče, - termostat, - pipeta/brizgalka, - barvila za barvanje po Gramu, - objektna in krovna stekelca, - vodoodporni flomaster. b) Postopek Študent bo samostojno izvedel postopek priprave urinskega vzorca po Sanfordu, nanos vzorca urina na gojišče in barvanje po Gramu (po 24-ih urah): - študenti se razdelijo v pare, - s flumastrom narišite razdelilna polja na spodnji površini petrijevke (gojišča),
- na razpolago so 3 epruvete (A, B, C) in v vsako epruveto natočite 9 ml sterilne 0,9% NaCl (uporabite pipeto/brizgalko) (Slika 11), - s pomočjo pipete iz lastnega vzorca urina posrkate 1 ml urina, - 1 ml urina vnesete v prvo epruveto (epruveta A), dobljena koncentracija je 10-1 , vsebino dobro pomešate, - iz epruvete A posrkate 1 ml raztopine in jo vnesete v epruveto B, dobljena koncentracija je 10-2, vsebino dobro premešate, - iz epruvete B posrkate 1 ml raztopine in jo vnesete v epruveto C, dobljena koncentracija je 10-3, vsebino dobro premešate, - iz epruvete C nanesete na umetno gojišče 0,1 ml raztopine in jo primerno tudi razmažete po mikrobiološki tehniki, - petrijevko položite v termostat za 24 ur, - v kolikor je prišlo do porasta kolonij po 24 urah iz (lastnega) gojišča/kvadranta odvzamete kužnino in jo nanesite na objektno stekelce, - kužnino na objektnem stekelcu fiksirate, - sledi barvanje kužnine po Gramu (glej naslednjo vajo).
Slika 11. Priprava urinskega vzorca po metodi Sanford
9 ml + 1 ml 10-1
9 ml + 1 ml 10-2
9 ml + 1 ml 10-3
0,1 ml
1 ml
urina
1 ml 1 ml
gojišče/agar
45
Vaja številka III/e – Urin
(vaja se izvede v laboratoriju)
Priprava razmaza, barvanje po Gramu in mikroskopiranje razmaza
a) Barvanje po Gramu b) Priprava razmaza c) Izvedba barvanja po Gramu
46
a) Barvanje po Gramu Z barvanjem biološkega materiala lahko razdelimo bakterije v dve skupini: po Gramu + in po Gramu. Po zaključeem barvanju po Gramu pozitivne celice ohranijo barvo, dočim pa se po Gramu negativne celice razbarvajo in jih moramo zato dodatno (diferencialno) obarvati s safraninom. Test je zasnovan na spoznanju, da majhna molekula kristalvijoličnega barvila prodre v celično steno bakterije. Po dodajanju joda postane kompleks barvilo-jod preveliko in težje zapušča celično steno. Pri Gram negativnih bakterijah, kjer je celična stena tanka, etanol deloma izpere kompleks barvilo-jod iz celične stene (razbarvanje). V primeru Gram pozitivnih bakterij, kjer je celična stena debelejša, pa etanol ne more izprati kompleksa barvilo-jod in celice ostanejo obarvane. Poznanih je več modifikacij osnovne procedure. Pomembno je, da je test standardiziran in da rezultate primerjamo z referenčno Gram + in pa Gram - kulturo. b) Priprava razmaza: Suspenzijo razmažete v tanki plasti na objektno stekelce.
Razmaz posušite na zraku ob gorilniku (do 40 °C). Posušeni razmaz fiksirate tako, da objektno stekelce z razmazom obrnjenim navzgor trikrat povlečete skozi plamen gorilnika. c) Izvedba barvanja po Gramu 1. Preparat na objektnem stekelcu prelijte s kristalvijoličnim barvilom – učinkuje naj 1 min. 2. Odvečno barvilo sperite z vodo – 5 sek. (ne direktno pod curkom vode). 3. Dodajte lugol (raztopina joda), ga odstranite in ponovno dodajte za 1 min. 4. Sperite lugol z vodo – 5sek (ne direktno pod curkom vode). 5. Dodajte 95% etanol za 5-15 sek., če je plast nanesene kulture tanka oz. 15-60 sek, če je plast debelejša. Sperite etanol z vodo – 5 sek (ne direktno pod curkom vode). 6. Dodajte safranin – 1 min. 7. Preparat posušite na zraku ali pazljivo popivnajte s papirjem. -Sperite safranin z vodo.
Študent naj shematično nariše opazovane strukture pod mikroskopom:
47
Vaja številka III/f – Urin
(vaja se izvede v laboratoriju)
Mikroskopska analiza sedimenta urina d) Pribor in material za mikroskopsko analizo sedimenta urina (kvantitativna analiza) e) Postopek mikroskopske analize vzorca urina
48
a) Pribor in material za mikroskopsko analizo sedimenta urina (kvantitativna analiza): Uvod - Mikroskopski pregled sedimenta urina Mikroskopsko analizo urina lahko izvedemo samo s pomočjo sedimenta urina. Mikroskopska analiza sedimenta urina je kvantitativna analiza formiranih (neraztopljenih) in s centrifugiranjem koncentriranih sestavin urina. To so eritrociti, levkociti, cilindri, bakterije, glive, paraziti, epitelne celice, soli, kristali a amorfni obliki, sluz (mukopolisahardi) in lipidi. Običajno zadostuje 10 ml urina, ki ga centrifugiramo 5 min pri 1500 do 2000 obratih/min. Supernatant odlijemo, kapljico premešanega sedimenta pa s pipeto kanemo na objektno stekelce. Sediment sprva mikroskopiramo pri 10 do 20-kratni povečavi, da a robovih preparata lažje najdemo cilindre in druge elemente, nato pa še pri 400-kratni povečavi. Pribor in material: - plastični lonček napolnjen (od ¼ do ½) z lastnim urinom, - kapalka za enkratno uporabo, - urinska epruveta, - objektno in krovno stekelce, -centrifuga, - staničevina. b) Postopek mikroskopske analize vzorca urina - na urinsko epruveto napišemo lastno ime in priimek, - odprete epruveto in s kapalko za enkratno uporabo, vanjo pokapajte približno 10 ml urina, - epruveto rahlo zatisnete, - preden bodo epruvete vnesene v centrifugo jih morate prehodno paralelno stehtati na mikro – tehtnici, - po dve epruveti postavite na tehtnico in počakate, da se tehtnica kalibrira, - preverite katera od epruvet je težja, - iz težje epruvete s kapalko odvzamete določeno količino urina (ponavadi zadostuje le par kapljic) in počakate da se tehtnica ponovno kalibrira, - postopek odvzemanja ali dodajanja urina ponavljate toliko časa dokler ne dosežete, da sta si epruveti po teži povsem podobni oziroma dokler ne dosežete ravnovesje na tehtnici, - ko vam je uspelo doseči ravnovesje oziroma enakost po teži, epruveti močno zatisnete s pokrovčki in jih nato paralelno postavite v centrifugo (samo skalibirane epruvete lahko paralelno postavimo v centrifugo), - centrifugo namestite 1500 do 2000 obratov/min za 5 min., - po 5 min. odvzamete epruvete iz centrifuge, - pri prenosu epruvet pazite, da jih držite zmeraj v vertikalni legi in jih tudi nato na mizi postavite v stojalce – vertikalno, - pazljivo odprete epruveto, - s kapalko, supernatan pazljivo odstranite in ga zavržite urinski lonček, - s kapalko posrkate sediment in ga kanete (v razmeroma majhni količini) na objektno stekelce – ponavadi zadostuje
že, če s kapalko naredite drobno kapljico, le to ne pokapate, temveč le kapljico rahlo naslonite na objektno stekelce, - snov nato z objektnim stekelcem pokrijete in mikroskopiramo, - na mikroskopu nastavite svetlobo (naj ne bo preveč intenzivna), - mikroskopirate po že znanih navodilih (glej Pravila za mikroskopiranje), - dobljene vrednosti vpišete v Tabelo št. 3. Pravila za mikroskopiranje z imerzijskim objektivom: 1. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico imerzijskega olja. 2. V os mikroskopa postavimo imerzijski objektiv, ki ima vgraviran črn prstan. 3. Z makrometrskim vijakom spuščamo objektiv do predmetnice (pogled od strani ne skozi okular!). 4. Gledamo skozi okular in z makrometrskim vijakom dvigamo objektiv, dokler se ne pojavi slika. 5. Z mikrometrskim vijakom izostrimo sliko. 6. Po uporabi obrišemo objekt
49
Tabela 3. Mikroskopski pregled (lastnega)sedimenta urina
Enota Rezultat Referenčne vrednosti
Levkociti
______________
0 – 4
Eritrociti
______________
Redki
Epitelne celice
______________
Občasno (↑ pri ženskah)
Cilindri
______________
Občasno, hialini
Vrsta cilindra
______________
Glive
neg. 1+ 2+ 3+ 4+
Negativno
Bakterije
neg. 1+ 2+ 3+ 4+
Negativno
Sluz
neg. 1+ 2+ 3+ 4+
neg. do 2+
Kristali
____negativno, ____ prisoten
Vrsta kristala
______________
Drugo
______________
50
Študent bo shematično narisal in označil strukture lastnega sedmineta urina (neobarvani), ki jih je opazoval v vidnem mikroskopskem polju:
Študent bo shematično narisal in označil strukture lastnega sedmineta urina (obarvani), ki jih je opazoval v vidnem mikroskopskem polju:
51
Vaja št. IV – Venozna kri
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Namen vaj b) Predznanje za vaje c) Izvedba vaj
52
Splošna navodila, ki veljajo za celotno poglavje vaj z venozno krvjo a) Namen vaje Temeljni cilji so: - prikaz načina odvzema venozne krvi, - uporabiti že pridobljeno znanje iz učbenikov in predavanj (Diagnostično terapevtski program z medicinsko propedevtiko, Fizilogija in Anatomija) za razlago pravilnega odvzema, transport in rezultate analize venozne. b) Predznanje za vajo: Študentje naj ponovijo naslednje teme: - anatomija srčnožilnega sistema, - anatomija arterije in vene, - topografski potek arterij in ven (nadlahtni, kubitalni, podplahtni predel; predel gležnja in hrbtnega dela stopala) - fiziologija krvi. Dodatno naj preštudirajo tudi teme: - fiziologija krvnih celic, - vpliv fiziološkega in spremenjenega ekstracelularnega prostora na celico, - intracelularni in ekstracelularni prostor in njihov vpliv na delovanje celice. c) Izvedba vaj Študent bo samostojno: - izvedel venozni odvzem krvi, - izvedel merjenje hematokrita, - izvedel merjenje sedimentacije, - določil krvno skupino in Rh faktor, - pripravil krvni razmaz (pod normalnimi pogoji) in ga mikroskopiral, - pripravil krvni razmaz za opazovanje eirtocitov v hipoosmolarnem in hiperosmolarnem okolju - priipravil krvni razmaz za diferencialno krvno sliko.
54
53
Vaja št. IV/a – Punkcija vene
(vaja se izvede v laboratoriju)
54
a) Pribor in material za venozni odvzem krvi: - razkužilo, - sterilne zloženčke/tampone, - zaščitne rokavice, - Vacutainer nastavki, - sterilne igle, - žilno podvezo, - ustrezne epruvete, - mikropor, - ledvička, - kontejner za odpadke – Septobox. b) Postopek venoznega odvzema krvi Študent bo samostojno izvedel venozni odvzem krvi: Pacienta pripravimo na odvzem venske krvi. Pred odvzemom ga identificiramo (pacienta in vse odvzete vzorce lahko natančno in zanesljivo identificiramo le z ustreznim informacijskim sistemom in s črtno kodo) Preverimo zahtevano dieto, predpisano antikoagulatno terapijo, alergijo na lateks. Pripravimo ustrezne pripomočke in pribor.
Pacienta ustrezno namestimo. Namestimo žilno prevezo, pacienta prosimo naj stisne pest in izberemo veno. Nataknemo si rokavice. Mesto vboda očistimo in razkužimo. Vbodemo v veno in v nosilec vstavimo epruveto: pacient naj sprosti pest. Krvi odvzamemo v epruvete po predpisanem vrstnem redu. Sprostimo in odstranimo žilno prevezo. Na vbodno mesto namestimo tampon. Izvlečemo iglo iz žile in aktiviramo zaščitni sitem na igli. Močno pritisnemo na vbodno mesto, preverimo, če je krvavitev prenehala in vbodno mesto prevežemo ali prelepimo. Epruvete z odvzeto krvjo označimo z nalepkami in označimo čas odvzema krvi. Če laboratorijski test zahteva, epruvete postavimo v led ali v termostat. Pravilno označene epruvete čim prej prenesemo v ustrezen laboratorij. Iglo odvržemo v posebno posodo.
55
Vaja št. IV/b – Priprava krvnega razmaza in mikroskopiranje
(vaja se izvede v laboratoriju)
56
a) Pribor in material za krvni razmaz - pacienta pripravimo na odvzem venske krvi. - epruveta z vzorcem krvi (epruveta z vijoličastim zamaškom), - razmaščena objektna stekla, brušeno objektno ali krovno steklo, - krovno stekelce, - staničevina, - vodoodporen flomaster, - 70—80 % etanol, - plinski gorilnik, plastični pladenj za shranjevanje krvnih razmazov b) Postopek priprave krvnega razmaza Ustrezen krvi razmaz je (Slika21) tisti, ki ima v najtanjšem delu redko posejane eritrocite (posejane v otočkih). Temu nato sledi pas celic, ki mu pravimo pas s pravo gostoto celic. Del s pravo gostoto celic mora biti čim bolj širši, preostali del pa zavzema pregosti del. Analiziramo lahko le tiste krvne razmaze, ki jih predodno tudi obarvamo. Primerno mesto za opazovanje celic je del s »pravo gostoto celic«. V tem delu lahko opazujemo eritrocite (eritrociti so nanizani drug zraven drugega). Polje s pravo gostoto je primerno mesto za opazovanje celic za razliko od pregostega dela krvnega razmaza, kjer se celice med seboj prekrivajo pri čemer je oteženo (nemogoče) opazovanje njihove morfologije. Ustrezen je tisti krvni razmaz, ki je po površini homogen, na konceh zaobljen, ustrezne dolžine in na začetku gost ter na koncu tanek sloj krvi. Ustrezni krvni razmaz je tisti na kateremu lahko makroskopsko opazujemo mejo med gostim in tankim delom. Slika 21. Mesto, ki je primerno za mikroskopiranje.
Navodilo za pripravo krvnega razmaza Epruveto s krvnim venskim vzorcem 3 do 4 enakomerno premešamo, epruveto na to odpremo, s kapalko aspiriramo določeno količino krvi in le to kanemo na začetek objektnega stekla (nekoliko stran od roba stekelca). Objektna stekla morajo biti popolnoma čista in razmaščena (uporabimo 70% alkohol). Pred kapljo venozne krvi postavimo rob brušenega (razmaznega) stekla, stekelce na to potegnemo nazaj, da se lahko kapljica krvi enakomerno razporedi po celem robu, stekelce na hitro potegnemo pod kotom od 30 do 45 stopinj z desne proti levi (če smo desničarji) (Slika 22). Postopek lahko izvedemo tako, da objektno stekelce držimo v rokah ali pa ga razmaz naredimo na mizi. Po končanem postopku odstranimo kri iz roba razmaznega stekelca. Krvni razmaz označimo in gaposušimo na zraku. Sušenje in shranjevanje krvnih razmazov Krvni razmazi sušijo do ene ure. Spodnja meja časa sušenja pa je odvisna od temperature in vlažnosti okolja. Neenakomerno obarvanost krvnega razmaza zasledimo takrat, kadar le ta ni bil pravilno posušen na zraku. Krvni razmaz se najbolje se obarva, če ga na zraku sušimo od štiri do pet ur (nekateri avtorji priporočajo 24 urno sušenje na zraku). Neobarvane krvne razmaze lahko ohranimo dlje časa, če jih predhodno fiksiramo 30 minut v absolutnem metanolu (namesto metanola lahko uporabimo sterilni etanol s koncentracijo najmanj 75%). S fiksacijo krvnih razmazov ne čakamo več kot pet ur po izdelavi. Delo 1. Objektno steklo razmastimo z alkoholom in ga previdno osušimo v plamenu plinskega gorilnika. 2. Na objektno steklo kanemo eno kapljico premešane krvi (volumen kaplje krvi je 10 μL). 3. Naredimo krvni razmaz (glej navodila priprave krvnega razmaza). 4. Pod mikroskopom preverite pravo gostoto celic (kriterij naj bo ogled pod 100-kratno povečavo). Na najtanjši del obarvanega krvnega razmaza kanemo kapljico imerzijskega olja in poiščemo sliko pod imerzijsko povečavo.
57
Slika 22. Priprava krvnega razmaza pod kotom 30 do 450
Slika 23. Krvni razmaz (100x povečava) Slika 24. Krvni razmaz – morfološko spremenjen eritrocit, Legenda: (a) eritrocit, (b) levkocit, (c) trombocit eritrocit »Mikimiška«(100x povečava)
c) Rezultati Študent bo shematično narisal in označil eritrocite, levkocite in trombocite pod 100x povečavo:
kapljica krvi
300 - 400 ADHEZIJA
PREMIK
a
b
c
58
Vaja št. IV/c – Merjenje hematokrita
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Pribor in material za merjenje hematokrita: b) Postopek merjenja hematokrita c) Izmerjene vrednosti in izračun
59
Uvod Hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov) se lahko določa z meritvijo razmerja med dobljenim stolpcem stisnjenih eritrocitov in stolpcem celotne krvi (Slika 25). Potrebno je opozoriti, da se med stisnjenimi eritrocitnimi celicami (številčno jih je največ) nahajajo tudi levkociti in trombociti. Po zaključku centrifugiranja ostane med krvnimi celicami tudi razmeroma majhen volumen plazme. Vzorok nastanka majhnega volumna plazme je zaradi tega, ker vseh celic ne moremo stisniti v stolpec. Izračun hematokrita po centrifugiranju:
krvi stolpca dolžina
veritrocito stolpca dolžinaHt
Hematokritna vrednost označuje idealno vrednost hematokrita, ki bi jo dobili, če med centrifugiranjem ne bi ostalo nič plazme. Hematokritne vrednosti vedno nekoliko nižje od hematokrita, dobljenega s centrifugiranjem. Hematološki analizatorji izračunajo hematokritno vrednost na podlagi izmerjene vrednosti številčne koncentracije eritrocitov in njihovega povprečnega volumna (MCV): Hematokritna vrednost = MCV · št. konc. Erci.
Hematokrit je dober kazalec slabokrvnosti. Če je nižja številčna koncentracija eritrocitov, bo tudi vrednost hematokrita znižana. a) Pribor in material za merjenje hematokrita: premešana venska kri, rokavice za enkratno uporabo, heparinizirane hematokritne kapilare, kit, staničevina, merilec dolžine (geotrikotnik), centrifuga. b) Postopek merjenja hematokrita Z vensko krvjo napolnimo heparizirano kapilaro napolnimo do 2/3 ali 3/4. Napolnite jo tako, da nagnete epruveto s krvjo, v njo pomočite kapilaro in kri steče v njo sama od sebe. Kapilaro nežno od strani obrišemo s staničevino in jo zamašite s posebnim kitom. Delamo v paraleli, kar pomeni, da za vsak vzorec krvi potrebujemo dve kapilari. Kapilare vstavimo v centrifugo z zamašenim delom zunaj. Kapilari z istim vzorcem krvi postavite v centrifugo nasproti. Centrifugiramo 5 minut pri 10 000 vrt./min in na to izmerimo dolžino stolpca eritrocitov ter dolžino stolpca celotne krvi. Izračunamo razmerje in povprečno vrednost obeh meritev. c) Izmerjene vrednosti in izračun Prva paralela: Ht = ……………; Druga paralela: Ht = ……………; Rezultat: povprečna vrednost Ht =
…………… Slika 25. Prikaz merjenja Ht - razmerja med stolpcem eritrocitov in stolpcem celotne krvi.
100% = 1,0
50% = 0,5
0
60
Vaja št. IV/d – Merjenje hitrosti sesedanja eritrocitov - sedimentacija
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Pribor in material za merjenje sesedanja eritrocitov - sedimentacije b) Postopek merjenja sedimentacije c) Izmerjena vrednost
61
Uvod Hitrost sedimentacije eritrocitov je nespecifična preiskava, ker rezultati sedimentacije ne pokažejo za katero patološko stanje ali bolezen gre. Sprva so hitrost sedimentacije eritrocitov izvajali z metodo po Westergrenu (antikoagulant je bil Na citrat, razmerje med krvjo in antikoagulantom pa 4 + 1). Metodo po Westergrenu so nato modificirali, uporabljali EDTA-kri in jo poimenovali po Dowsonu. Ponovno je uvlejavljena metoda po Westergrenu, vendar vse več se prakticira s pomočjo analizatorjev (merjenje kinetike agregacije eritrocitov). Odčitavanje rezultatov se pri starjših in novejših metodah zelo razlikujejo: a) starejše metode sedimentacije eritrocitov: odčitavanje rezultata v roku ene ure; b)analizatorji: v nekaj minutah. Na vajah bomo za merjenje hitrosti sedimentacije eritrocitov uporabili metodo po Dowsonu: ne potrebujemo poseben odvzem venozne krvi, namesto citratne krvi bomo uporabili s fiziološko raztopino razredčeno EDTA-kri. Referenčne vrednosti: 0–15 mm/h
a) Pribor in material za merjenje sedimentacije eritrocitov – SR - plastična graduirana pipeta, stojalo za sedimentacijo, - venska kri, - merilnik časa, - rokavice za enkratno uporabo. b) Postopek merjenja sedimentacije Odprete epruveto z vensko krvjo in vanjo vtaknete plastično graduirano pipeto – pipeto porinete na dno epruvete. Epruveto in pipeto namestite v stojalce (vertikalni položaj) za sedimentacijo. Vrednost odčitate točno po 1 uri. Vrednost zabeležite v mm/uro Delo 1. Pripravite ves material in pribor. 2. Nastavite sedimentacijo v skladu z navodili. 3. Odčitajte stolpec sedimentiranih eritrocitov in vpišite rezultat.
c) Izmerjena vrednost: hitrost sedimentacije eritrocitov je ………… mm/h
Slika 26. Merjenje hitrosti sesedanja eritrocitov – sedimentacija
Mesto, kjer odčitamo vrednosti SR (meja med trdim in tekočim delom
krvi)
62
Vaja št. IV/e – Določanje krvne grupe in Rh faktorja
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Pribor in material za določevanje krvne grupe b) Postopek določevanja krvne grupe c) Rezultat
63
Uvod V našem organizmu se na zunanji membrani eritrocitov nahajajo neenakomerno razporejeni specifični proteini, ki nosijo zapis krvne skupine. Specifične proteine imenujemo aglutinogeni. V plazmi pa se nahajajo specifična protitelesa t.i. aglutinini, katerih funkcija je prepoznavanje tuje proteine – antigene in uničevanje le teh. Če se na zunanji membrani eritrocitov nahajajo A – aglutinogeni, potem ima človek zapis za krvno skupino A. V plazmi pa se nahajajo b – aglutinini. Če se na zunanji membrani eritrocitov nahajajo B – aglutinogeni, potem ima človek zapis na krvno skupino B. V plazmi pa se nahajajo a – aglutinini. Če se na zunanji membrani eritrocitov nahajajo A,B – aglutinogeni, potem ima človek zapis na krvno skupino AB. V plazmi pa se ne nahajajo aglutinini (posledica bi bila avtoimuna bolezen). Če se na zunanji membrani eritrocitov ne nahajajo aglutinogeni, potem ima človek zapis za krvno skupino 0. V plazmi pa se nahajajo a,b – aglutinini. Krvne skupine določamo na keramični ploščici (ali krva skupina na ploščici). Za določanje krvne skupine uporabljamo specifične serume, ki vsebujejo specifična protitelesa - aglutinini za detekcijo določeni aglutinogenov. Poznamo štiro vrste serumov: serum anti – A, anti – B, anti – AB in anti – RhD. V kolikor bo določen serum detektiral specifični aglutinogen bo prišlo do specifične reakcije, t.i. aglutinacija (zlepljenje eritrocitov) (npr. serum anti–A detektira aglutinogen A oziroma detektira krvno skupino A, na ploščici vidimo kot aglutinacijo). Če bodo aglutinogeni nosili zapis za krvno skupino AB, potem bomo na ploščici videli aglutinacijo tam, kjer smo pokapljali anti-A, anti-B in anti-AB (praktično na vseh treh). Če pa na zunanji membrani eritrocitov ni aglutinogenov, potem tudi na krvni ploščici ne bomo zasledili aglutinacije, saj serum (aglutini) ne bodo morali ničesar detektirati. a) Pribor in material za določanje krvne skupine epruveta s krvnim vzorcem, kapalko za enkratno uporabo, sterilno iglo,
serume/reagente za določanje krvne skupine in Rh faktorja, keramično ploščo za določevanje krvne skupine, kontejner za odpadni "ostri" material – Septobox. b) Postopek določanja krvne grupe iz epruvete s krvnim vzorcem s kapalko posrkate nekaj kapljic krvi, s kapalko pokapljate po eno kapljico krvi v 3 oz. 4 ločene prostore na keramični ploščici za določevanje krvne skupine, na vsako kapljico (v svojem prostoru na keramični ploščici) krvi pokapljate po 1 kapljico seruma/reagenta; na eno kapljico krvi pokapljate le 1kapljico ENEGA seruma/reagenta (npr. na eno kapljico krvi pokapljamo le 1 kapljico seruma/reagenta anti – A) in pazite, da se reagenti med seboj ne mešajo, ko ste na vsako kapljico pokapljali svoj serum/reagent anti – A, anti – B, anti – AB in anti – RhD, potem vsako kapljico krvi s serumom tudi premešate, prvo kapljico krvi s serumom lahko premešate s kapalko (saj kapalka še ni prišla v stik z drugimi serumi) – po mešanju kapalko odvržete v Septobox, za pomešanje krvi s serumom v 2., 3. in 4. prostoru, se poslužujete sterilne igle s pokrovčkom, plastični pokrovček igle pazljivo snamete, z enem koncem plastičnega pokrovčka pomešate kri in serum v prostoru 2., pokrovček obrnete in pomešate kri s serumom v prostoru 3., plastični pokrovček nato odvržete v Sepobox, z iglo pa nato premešate še v 4.prostoru in iglo nato tudi odvržete v Septobox. c) Rezultat Študent naj v Tabelo 10. vpiše izsledke testiranja lastne krvne skupine. V omenjeni tabeli se v prvi vrsti (serum) nahajajo zapisi, kateri serum ste v posameznem prostoru na krvni ploščici porabili oziroma pokapljali. V drugi vrstici (Aglutinacija) naj študent opiše (označi), kje je prišlo do aglutinacije – če je do aglutinacije sploh prišlo. V tretji vrstici (Krvna skupina) naj študent napiše katero krvno skupino in Fh faktor je detektiral.
Tabela 10. Vpis izmerjenih vrednosti krvne grupe in RhD faktorja
Serum anti-A anti-B anti-AB anti-RhD
Aglutinacija
Krva skupina
64
Vaja št. IV/f – Krvni razmaz celic v hiperosmolarni in hipoosmolarni raztopini
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Pribor in material za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju b) Postopek za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju c) Rezultati
123
Uvod V normalnih pogojih se se v našem organizmu oziroma krvi, eritociti nahajajo v t.i. izotoničnem okolju (intracelularno in ekstracelularno sta enake koncentracije oziroma sta v ravnovesju – normalen prehod in podajanje snovi, inovo, molekul itd.). Zaradi patoloških stanj pa se lahko ekstracelularno okolje sprmeni v njegovi koncentrirarnosti. Lahko nastopi hipertonično okolje (npr. utopitev v slani vodi), kar pomeni, da se eritrociti (in ostale celice) nahajajo v bolj koncentriranem mediju – koncentracija snovi v ekstracelularnem prostoru je bistveno večja kakor je koncentracija snovi intracelularno. Zaradi večje koncentriranosti ekstracelularnega prostora se voda (ter ostali ioni) prično seliti iz celice navzven. Posledica tega je razmeroma hitra apoptoza in morfološka sprememba eritrocita (odžet/posušen eritrocit). Taki eritrociti so pod mikroskopom dokaj dobro vidni, saj ni prišlo do vevečjih poškodb molekule hemoglobina in njihove obarvaosti). Druga skrajnost pa je, da se eritrociti pojavijo v hipotoničnem okolju (npr. utopitev v sladki vodi), kar pomeni, da se eritrociti (in ostale celice) nahajajo v
manj koncentriranem mediju, kakor je v njih samih – koncetracija snovi v ekstracelularnem prostoru je bistveno manjša kakor je koncentracija snovi intracelularno. Zaradi manjše koncentriranosti ekstracelularnega prostora se voda (in ostali ioni) prično masovno vdirativ celico. Posledica tega pa je, razmeroma hitr aapoptoza in morfološka sprememba eritrocita (napihnjen eritrocit). Taki eritrociti so pod mikroskopom dokaj slabo vidni, saj z vdorom vode pride tudi do "razredčenja" molekule hemoglobina in s tem do njihovega razbarvanja. Pod mikroskopom vidimo razbarvane in povečane celice oziroma vidimo le celularno membrano napihnjenih celic (Slika 27, 28, 29).
Slika 27. Shematični prikaz variacij v koncentraciji ekstracelularnega prostora.
H2O H2O
H2O
H2O
celica
Koncentracija v
ekstracelularem
prostoru
Hiperosmolarna raztopina
(visoka koncentracija snovi
v ekstracelularnem okolju)
Hipoosmolarna raztopina
(nizka koncentracija snovi v
ekstracelularnem okolju)
Izotonična raztopina
(enakomerna koncetracija
snovi v ekstracelularnem in
intracelularnem okolju)
67
Slika 28. Eritrociti v hipoosmolarni raztopini I. Slika 29. Eritrociti v hipoosmolarni raztopini II. (40x povečava) (100x povečava)
Slika 30. Eritrociti v hiperosmolarni raztopini I. (100x povečava)
Slika 31. Eritrociti v hiperosmolarni raztopini II. (40x povečava)
a) Pribor in material za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju epruveta s krvnim vzorcem, kapalka za enkratno uporabo, krovno in objektno stekelce, staničevina, hipertonična in hipotonična raztopina.
b) Postopek za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju iz epruvete s krvnim vzorcem s kapalko posrkate nekaj kapljic krvi, krvni vzorec kanete v hipertonično in nato hipotonično raztopino, obe raztopini s stekleno palčko narahlo premešate, počakate približno 5 min., s kapalko posrkate nekaj vsebine iz hipertonične raztopine in eno kapljico le te kanete na objektno stekelce, naredite krvni razmaz za eritrocite v hipertoničnem okolju, razmaz posušite na zraku,
124
enak postopek naredite tudi za hipotonično raztopino, študent naj pod mikroskopom (vključno z imerzijsko povečavo) opazuje eritrocite v hipertoničnem in hipotoničnem okolju,
opazovane eritrocite iz posameznega okolja naj tudi pod razdelkom rezultati tudi skicira.
67
c) Rezultati Študent bo shematično narisal in označil eritrocite v hiperosmolarni raztopini, ki jih je opazoval v vidnem mikroskopskem polju: Študent bo shematično narisal in označil eritrocite v hipoosmolarni raztopini, ki jih je opazoval v vidnem mikroskopskem polju:
68
Vaja št. IV/g – Kapilarni odvzem krvi
(vaja se izvede v laboratoriju)
a) Pribor in material za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju b) Postopek za pripravo krvnega razmaza za opazovanje eritrocitov v hipotoničnem in hipertoničnem okolju c) Rezultati
123
Uvod Vzorec krvi, dobljen s kapilarnim odvzemom je mešanica venske in arterijske kapilarne krvi ter intracelularne in ekstracelularne tekočine. Sestava kapilarnega vzorca krvi se torej nekoliko razlikuje od vzorca krvi, dobljenega z venskim odvzemom. Odvisna je od pretoka krvi v podkožju med kapilarnim odvzemom ter od relativnega razmerja med arterijsko in vensko krvjo. V sestavi kapilarne krvi je delež arterijske krvi večji, ker je tlak v arterijolah in arterijskih vejah kapilar višji kot v venulah in v vejah venskih kapilar. Vendar, pa je venska kri v koži bolj kot kjerkoli v telesu podobna arterijski krvi, še posebno, če je mesto odvzema dobro ogreto. Kapilarni odvzem ni primeren za koagulacijske teste (izjema je protrombin pri bolnikih z antikoagulacijsko terapijo), SR, krvno kulturo in vse tiste analize, ki zahtevajo večji volumen seruma ali plazme. Kapilarni odvzem ne uporabljamo pri dehidriranih pacientih ali pri pacientih v šoku, ker zaradi slabe periferne cirkulacije ne moremo dobiti reprezentativnega vzorca krvi. Odvzemno mesto mora biti nepoškodovano, rožnato in toplo. Pri majhnih otrocih je lahko venski odvzem krvi tehnično zahteven ali celo tvegan poseg: - odvzem večje količine krvi lahko povzroči nastanek anemije, - vbodi v velike vene utegnejo povzročiti srčni zastoj, vensko trombozo, refleksni spazem arterij ali gangreno okončin, - pri nemirnih otrocih lahko ob odvzemu pride do poškodbe okolnega tkiva. Sestava kapilarne krvi: venska kapilarna krvi, arterijska kapilarna krvi, medcelična tekočina, celična tekočina. Sestava vzorca odvzete s kapilarnim odvzemom je odvisna od pretoka krvi v podkožju v trenutku odvzema krvi. Če je vbodno mesto dobro ogreto je venska kri v koži na tem delu podobna arterijski. Mesta vboda pri kapilarnem odvzemu krvi iz prsta Palmarna površina zadnjega segmenta prstov na roki (pri desničarjih na levi, levičarjih na desni). Izogibamo se vboda na utore prstnih odtisov. Vbodemo pravokotno na utore prstnih odtisov.
Primerna mesta za odvzem kapilarne krvi Palmarna površina zadnjega segmenta prstov na roki pri starejših otrocih in odraslih. Lateralna in medialna površina stopala. Plantarna površina palcev na nogi. Zunanji in notranji rob pete pri otrocih do enega leta (Slika 63).
70
Mesta, kjer se izogibamo jemanju kapilarne krvi - Novorojenčka ne zbadamo v prstke na roki, v sredino pete in v zadnjo krivino pete, ker lahko zabodemo v kost. - Ne priporoča se odvzem iz ušesne mečice. - Ne vbadamo v mezinec in palec na roki. Vbodno mesto ne sme biti poškodovano ali oteklo. Kapilarni odvzem je posebno pomemben v pediatriji, predvsem za novorojenčke in dojenčke. V posebnih primerih ga uporabljamo tudi pri odraslih. Pri odraslih se priporoča kapilarni odvzem v primerih, ko so površinske vene težko dostopne ali so zelo občutljive: - pri zelo debelih ljudeh, - obsežne opekline, - maligna obolenja, - nagnjenja k trombozam, - zelo stari ljudje, - za (samo)kontrolo glukoze pri diabetikih. Če potrebujemo krvne vzorce za različne preiskave odvzamemo: - najprej vzorec za plinsko analizo ali hemokulturo, - sledi vzorec za hematološke preiskave (epruveta z EDTA); za DKS lahko neposredno pripravimo krvni razmaz, - sledijo vzorci s kakšnimi drugim dodatkom, - nazadnje odvzamemo kri za serumski vzorec. Kadar se odločimo odvzeti kri za določitev pH vrednosti in krvnih plinov, zberemo za to posebne heparinizirane kapilare. Vbodno mesto pred odvzemom moramo dobro ogreti. Ob odvzemu pazimo, da v kapilarah ni zračnih mehurčkov. Stik krvi z zrakom, tudi za kratek čas (10 – 30 sek), povzroči značilne spremembe na vzorcu. Kri za določitev mikrohematokrita moramo odvzeti direktno v heparinizirane kapilare. Napolniti jih smemo od 2/3 do ¾. Takoj, ko kapilaro napolnimo jo moramo na eno strani zamašiti s posebnim kitom ali s posebnimi, za to določenimi zamaški. Za ugotavljanje morfologije celic odvzamemo direktno iz vbodne površine na čisto objektno stekelce. Če uporabljamo vzorec krvi z EDTA1 za določitev DKS2, moramo pripraviti krvni razmaz v 1 uri od odvzema. Pripravimo tanek razmaz in ga na zraku posušimo. Kljub temu da so koncentracije kemičnih sestavin v serumu ali plazmi kapilarne krvi dobro primerljive s koncentracijami v venski krvi, obstajajo nekatere statistično in/ali klinično pomembne razlike v koncentracijah glukoze, K+, Ca2+, skupin proteinov in hemoglobina, pri vrednostih hematokrita in v številu trombocitov. Te koncentracije so, razen glukoze v kapilarni krvi nižje.
1 Ethylenediaminetetraacetic acid; oznaka za
Etilendiaminotetraocetno kislino 2 Diferencialna krvna slika.
Hemoliza, izražena s koncentracijo prostega hemoglobina v krvi je v serumu, dobljenem iz venske krvi manj opazna kot v serumu, odvzetem iz kapilarne krvi. Hemolizo lahko povzročijo: ostanek alkohola na koži, premočno stiskanje okolice vbodnega mesta, da bi kri tekla, krhkost eritrocitov in visok hematokrit pri novorojenčkih. Rezultati hemoliziranih vzorcev so napačni. Ob jemanju kapilarne krvi upoštevamo vsa navodila za delo s kužnim materialom – uporabljamo rokavice! a) Postopek jemanja kapilarne krvi Vbodno mesto mora biti toplo (ogrevanje do 7x poveča pretok arterijske krvi). Vbodno mesto očistimo in razkužimo z ustreznim razkužilom. Počakamo, da se površina posuši na zraku. Prst primemo s posebno tehniko (Slika 30). Slika 30. Tehnika prijema3 pri kapilarnem odvzemu krvi
Zbodemo s sterilno lanceto ali z rezilom za enkratno uporabo (konica lancete ali rezila ne sme biti daljša od 2 mm) (Slika 31). Slika 31. Kapilarni odvzem krvi
Prvo kapljo krvi odstranimo s sterilno gazo (vsebuje preveč tkivne tekočine). Druga kapljica se zlije po površini kože – dotaknemo se je s konico kapilarnega mikrokolektorja in kri mora steči v kolektor sama po principu kapilarnega vleka. Iztok krvi pospešimo, če nežno pritisnemo na okolno tkivo ali če mesto vboda obrnemo navzdol. Če kri preneha teči, moramo vbod ponoviti, vendar v drugi prst ali na drugo stran pete. Po končanem odvzemu mesto vboda sterilno pokrijemo.
3 Prikazana tehnika nam omogoča brezbolečinsko pridobitev kapljice krvi
71
Mikroepruveto z antikoagulantom ali z drugim dodatkom takoj premešamo tako, da epruveto 10x nežno obrnemo. Z enim uspelim vbodom dobimo od 0,5 do 2 ml krvi. Koncentracija snovi v kapilarni krvi Koncentracije snovi v serumu in plazmi kapilarne krvi so dobro primerljive s koncentracijami v venski krvi. Obstajajo nekatere majhne razlike v koncentracijah v vzorcih kapilarne krvi: - glukoza, št. levkocitov, delež nevtrofilcev in monocitov so višji, - K1+, Ca2+, celotni proteini, eritrociti, hemoglobin, hematokrit, trombociti so nižji, - v plinski analizi lahko pričakujemo nižje vrednosti pO2 kot ih dobimo v vzorcu arterijske krvi. Vendar, razlike med vensko in kapilarno krvjo ne smejo vplivati na odločitev za kapilarni odvzem krvi. Kljub temu moramo jasno označiti, da gre za rezultate iz kapilarne krvi Napake pred odvzemom kapilarne krvi Otrok, ki se brani in joka, ni primeren za odvzem kapilarne krvi (↑ levkociti, nevtrofilci, CRP). Otroka najprej pomirimo. Pomembna je izbira mesta odvzema, lancete in dobra lokalna prekrvavitev. Stiskanje in »ožemanje« mesta odvzema povzroči nastanek majhnih koagulov. Neustrezna oskrba vbodnega mesta. Nepravilno mešanje (koaguliran ali hemoliziran vzorec). Zaščita vzorca: - zaščita pred svetlobo: bilirubin, - čas mirovanja pred analizo: EDTA.
a
72
