FIZIOLOGIJA MIKROBOV – LABORATORIJSKE VAJE

David Stopar, Polonca Čadež in Ivan Mahne

Ljubljana, 2005

1

PREGLED VAJ MORFOLOGIJA MIKROORGANIZMOV Izvedba: Opazovanje mikrobnih celic Enostavno barvanje mikroskopskega preparata Diferenciakno barvanje po Gramu RAST MIKROORGANIZMOV Izvedba: Sterilizacija, aseptična tehnika Razširjenost mikroorganizmov v okolju Minimalna inhibitorna koncentracija protimikrobne snovi Rast mikroorganizmov na selektivnih gojiščih Izolacija amilolitičnega mikroorganizma iz naravnega vzorca

Kvantifikacija mikroorganizmov

Izvedba: Direktne števne metode: razmaz, števna komora

Gojitvene števne metode: štetje na ploščah, MPN

Rast mikroorganizmov Izvedba: Rastna krivulja in generacijski čas Vpliv dejavnikov okolja na rast

Izvedba: temperatura, pH, kisik

Bakteriocini Izvedba: inhibitorni učinek bakterije Vibrio sp. Transformacija Izvedba: Transformacija E.coli z rezistenco na antibiotik

2

PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU 1. Pri delu z mikroorganizmi obravnavaj mikroorganizme kot pogojno patogene in

zato ves čas dela z mikroorganizmi uporabljaj aseptično tehniko. 2. Pred in po vsaki vaji si umij roke z razkužilom (detergent z biocidnim delovanjem). 3. Delovni pult razkuži pred in po uporabi mikrobne kulture (alkohol, Incidur). 4. V primeru manjših nezaščitenih ran na koži ne začni dela z mikrobnimi kulturami

brez dodatne zaščite (zaščitne rokavice, respiratorna maska) in predhodnega pogovora z asistentom oziroma predpostavljenim.V primeru večjih odprtih ran na koži je delo z mikrobnimi kulturami prepovedano.

5. Nikoli ne pipetiraj kulture mikroorganizmov z usti. Vedno uporabljaj mehansko napravo.

6. V primeru razlitja mikrobne kulture preliješ razlito kulturo z razkužilom (alkohol, 5% lizol) in nemudoma obvesti asistenta oziroma predpostavljenega. Če je prišlo do razlitja po telesu, inficirano mesto razkužimo in speremo s toplo vodo in milom. Če je prišlo do poškodbe kužnino odstranimo, iztisnemo kri v posodo z razkužilom in mesto poškodbe razkužimo ter rano sterilno obvežemo. V kolikor pridejo mikrobi v usta jih izpljunemo v posodo z razkužilom ter usta izpiramo z 0.2 % solno kislino.

7. Mikrobnih kultur nikoli ne odnašaj iz laboratorija. 8. Ves uporabljen material na vajah mora biti jasno in nedvoumno označen (vrsta

mikroorganizma, ime študenta, datum, vrsta vzorca, razredčitev) in odložen na dogovorjeno mesto.

9. S plinskim gorilnikom delaj zelo previdno. Če imaš dolge lase morajo biti povezani ali zaščiteni z zaščitno kapo. Plinski gorilec ugasni takoj po končanem delu in preveri ali je plinska napeljava zaprta.

10. Optični material (leče, objektivi) očisti pred in po uporabi. Leče čisti izključno s staničevino.

11. Po uporabi vse reagente in opremo (epruvete, petrijevke, pipete, mikroskop) vrni na dogovorjeno mesto. Material, ki je bil v stiku z mikrobno kulturo je potrebno sterilizirati in zato ločiti od ostalega materiala.

12. Nesreče pri delu (opekline, urezi, razlitje mikrobioloških kultur) takoj javi asistentu ali nadrejenemu.

3

MORFOLOGIJA MIKROORGANIZMOV Morfologija mikroorganizmov se ukvarja s proučevanjem celičnih in

znotrajceličnih struktur. Običajno si pri tem pomagamo s svetlobnim mikroskopom. Zaradi slabega kontrasta mikroorganizmov od njihovega okolja pred mikroskopskim pregledom mikroorganizme običajno obarvamo (metilensko modro, kristal vijolično, safranin). V pomoč pri identifikaciji mikroorganizmov so dodatna sestavljena barvanja in biokemijski testi (barvanje po Gramu, barvanje bičkov, endospor, kapsul in citoplazemskih vključkov, substratna specifičnost, encimski testi).

Sodobna morfologija mikroorganizmov zajema poleg klasičnega opisa mikrobne celice tudi proučevanje znotrajceličnih struktur. V ta namen celice razbijemo in celični material razstavljamo. Izolirane celične strukture uporabimo za proučevanje morfoloških lastnosti, poleg tega pa še za proučevanje biokemijskih, biofizikalnih in genetskih lastnosti. Pomembno je, da je celična frakcija homogena. Za preverjanje čistosti in homogenosti celične frakcije se največ uporablja elektronski mikroskop. Identifikacijo znotrajceličnih struktur olajša uporaba protiteles narejenih proti antigenom posameznih celičnih struktur. Protitelesa lahko fluorescenčno označimo zaradi lažje vidnosti, ali pa na protitelo konjugiramo encim in preverimo prisotnost encimske reakcije. V primeru uporabe elektronskega mikroskopa protitelesa označimo s koloidnim zlatom.

Morfološke lastnosti mikroorganizma (npr. oblika, površina, barva) so pomembne pri njegovi identifikaciji in klasifikaciji. Novejše klasifikacije mikroorganizmov poleg morfoloških in fizioloških znakov upoštevajo tudi molekularne karakteristike mikroorganizmov. Molekularno identifikacijo mikroorganizma omogoča antigenska sestava površine mikroorganizma (serološki testi, fagotipizacija). Zaradi vrstno specifične zastopanosti proteinov in lipidov v mikrobni celici lahko mikroorganizme identificiramo tudi s pomočjo proteinskega ali lipidnega profila mikrobne celice. Filogenetsko sorodnost med mikroorganizmi v novejšem času določamo z analizo DNA in RNA proučevanih mikroorganizmov (DNA hibridizacija, analiza 16S rRNA).

Pri preiskovanem mikroorganizmu proučimo fenotipske in genotipske lastnosti ter ga na podlagi ujemanja teh lastnosti z lastnostmi poznanih mikroorganizmov uvrstimo v sistematsko (taksonomsko) skupino. Glavna vodila pri sistematiki mikroorganizmov so fenotipska in genotipska podobnost pa tudi namembnost sistema. Pri tradicionalni taksonomiji mikroorganizme uvrščamo v skupine predvsem na osnovi podobnosti njihovih fenotipskih lastnosti. Poznavanje genotipskih lastnosti, posebej gradnje 16S RNA, pa omogočajo uvrščanje mikroorganizmov v skupine na osnovi njihove filogenetske (sorodstvene) povezanosti. Zaradi rutinske uporabe molekularnih tehnik v mikrobioloških laboratorijih temelji moderna klasifikacija vse bolj na molekularnih identifikacijskih znakih, ki pokažejo evolucijsko sorodnost mikroorganizmov in manj na klasičnih morfoloških znakih.

Skupna značilnost mikroorganizmov je njihova fizična majhnost. Morfološke značilnosti mikroorganizmov opisujemo na dveh nivojih: makromorfološki nivo (strukture, ki jih običajno vidimo s prostim očesom; npr. morfologija mikrobnih kolonij) in mikromorfološki nivo (strukture, ki jih običajno ne moremo videti s prostim očesom; npr. morfologija posameznih celic in znotrajceličnih struktur).

Oblika mikroorganizmov je zelo različna in lahko ostane v času podvojevanja mikroorganizma nespremenjena ali pa se zaradi genetskega potenciala in vplivov okolja spreminja (npr. sporulacija).

4

Mikroorganizmi nimajo enotne velikosti. Okvirna velikost najpomembnejših skupin mikroorganizmov je:

virusi 30 - 300 nm mikoplazme 100 - 300 nm bakterije 0.1 - 5 µm kvasovke 1 - 5 µm alge 2 - 200 µm glive mm do nekaj metrov

Način rasti organizma je odvisen od agregatnega stanja substrata, na katerem rastejo mikroorganizmi. V tekočem gojišču opazimo rast mikroorganizma kot pojav motnosti, usedline, mrenice. Na trdnem substratu je najpogostejša oblika rasti kolonija. Kolonija je morfološka struktura, ki nastane z delitvijo ene ali več celic. Vse celice v koloniji, ki je zrasla iz ene celice, so v genetskem sorodstvu. V naravi najdemo makromorfološke tvorbe, v katerih rastejo fizično povezane celice sorodstveno zelo oddaljenih organizmov (npr. lišaj je tvorba, v kateri povezano rasteta alga ali cianobakterija in gliva).

Makromorfološke lastnosti kolonije opredeljuje oblika, površina, prerez, čvrstost. Glede na obliko ločimo točkaste, pravilne okrogle, rizoidne, nepravilne in nitaste kolonije. Glede na rob kolonije ločimo kolonije z gladkim ali nakodranim robom. Površina kolonij je lahko gladka (označimo jo z S “smooth”) ali hrapava (označimo jo z R “rough”). Prerez kolonije je lahko ploščat, dvignjen, izbokel, ali pa popkasto dvignjen. Glede na čvrstost pa ločimo: krhke, trde, mazave, sluzaste kolonije. Makromorfološke lastnosti (velikost, barva) lahko uporabimo pri identifikaciji mikroorganizmov. Makromorfološke strukture in lastnosti kolonij večinoma vidimo s prostim očesom.

Mikromorfoloških lastnosti mikroorganizmov (posameznih celic) s prostim očesom ne moremo videti. Oblika posamezne mikrobne celice je lahko različna: kok, palčka, vibrio, spiril, spiroheta. V tekočem substratu lahko mikrobne celice po celični delitvi ostanejo povezane v obliki verižic ali poliedrov (monokoki, diplokoki, tetrakoki, sarcine, streptokoki, stafilokoki, streptobacili, slika 1).

Ena izmed glavnih težav v mikrobiologiji je ta, da mikroorganizma, ki je aktiven

in opravlja določen proces, običajno ne vidimo. Ko postane prisotnost mikroorganizma vidna (npr. pojavljanje kolonij, pigmenta, sporulacija, pojav simptomov bolezni), je mikroorganizem običajno že opravil večino metabolnih transformacij. Z antropocentričnega stališča to pomeni, da je mikrob, ko ga opazimo s prostim očesom, glavni del koristi ali škode za človeka že opravil.

diplokoki:

5

streptokoki

stafilokoki

tetrade

sarcine

Slika 1: Celična ureditev mikroorganizmov po končani celični delitvi. Celice pri diplokokih se delijo v eni ravnini, celice pri streptokokih se delijo v eni ravnini in ostanejo povezane v obliki verižic, celice pri stafilokokih se delijo v treh ravninah, celice pri tetradah se delijo v dveh ravninah, celice pri sarcinah se delijo v treh ravninah in tvorijo kocke. Vaja 1: Opazovanje mikrobnih celic

Obnovili bomo znanje o delu z optičnim mikroskopom na meji njegovih zmogljivosti. Seznanili se bomo s tehnikami priprave mikroskopskih preparatov Mikroskopija

Mikroskop je gotovo eden najbolj značilnih inštrumentov v mikrobiološkem

laboratoriju. S sposobnostjo povečevanja nam omogoča, da vidimo mikrorganizme in njihove strukture, ki so sicer nevidne našim očem. Povečava, ki jo omogoča mikroskop je v območju 100-2.000 krat oz. 400.000 krat za elektronski mikroskop. Poleg tega nam še različne tehnike mikroskopiranja omogočajo izboljšave pri prikazu morfoloških značilnosti. Svetlobna mikroskopija zajema naslednje tehnike: • Svetlo polje • Temno polje • Fazni kontrast

6

• Fluorescenca

Elektronski mikroskop rabi žarek elektronov namesto svetlobe ter magnetne leče. Sliko gledamo na fluorescentnem zaslonu.

Optični deli mikroskopa so kondenzor, objektiv in okular. Kondenzor sprejema in uravnava snop svetlobe. Med lečami kondenzorja je vgrajena irisna zaslonka za oženje snopa svetlobe. Objektiv in okular omogočata nastanek povečane slike. Objektiv daje realno, povečano in obrnjeno sliko. Nameščen je neposredno nad predmetom. Označeno ima povečavo in NA (numerično aperturo). Pri suhih objektivih je med lečo in predmetom zrak, pri imerzijskih objektivih pa imerzijsko olje, označen je s črnim prstanom. Okular tudi sodeluje pri povečanju slike. Povečevalna moč je označena (5x, 10x, 12x, 16x, 20x). Za mikroskopiranje bakterij rabimo okularje s povečavo najmanj 10x. Skupna povečava je zmnožek obeh povečav, objektiva in okularja. Uporabna povečava svetlobnega mikroskopa je med 1.000 in 2.000. Pri večjih povečavah pride do popačenja slike in poslabšanja ločljivosti.

Ločljivost je zmožnost razlikovati dve točki ločeno. Odvisna je od valovne dolžine uporabljene svetlobe in numerične aperture leč. Čim večja ne NA, tem finejše podrobnosti lahko mikroskop ločuje. NA = n.sinα n……..lomni količnik

α………polovični kot, ki ga tvorita skrajna žarka Stopnja, do katere lahko poveVmesni prostor med predmetima podoben n kot steklo. Za Ločljivost je odvisna tudi od Vidna svetloba ima povprečn1,3, a je torej 0,21 µm. To je mikroskop. Če zmanjšamo valočljivost (10%). Z elektronskmakromolekularnih dimenzij

α

čujemo NA, je omejene z lomnim količnikom in α. om in frontalno lečo napolnimo z nekim sredstvom, ki suhe objektive je NA < 1, za imerzijske pa 1,2 – 1,4.

valovne dolžine uporabljene svetlobe a = λ/2NA. o valovno dolžino 0,55µm, NA imerzijskega objektiva je torej najmanjša razdalja, ki jo lahko ločuje svetlobni lovno dolžino (modra svetloba) se nam izboljša tudi im mikroskopom lahko opazujemo delce

.

7

Postopek pri mikroskopiranju 1. Priključi mikroskop na elektriko in vklopi svetlobo. 2. V os mikroskopa namesti objektiv z najmanjšo povečavo. 3. Na mizico vstavi predmetno stekelce in ga učvrsti. 4. Spuščaj objektiv z makrometrskim vijakom (groba nastavitev) dokler predmet ne

postane viden, nato izostri sliko s fino nastavitvijo (mikrometrski vijak). 5. V os mikroskopa namesti objektiv z večjo povečavo in izostri sliko s fino

nastavitvijo. Postopek za imerzijski objektiv: 1. na predmetno stekelce s preparatom nanesi kapljico imerzijskega olja 2. v os mikroskopa namesti imerzijski objektiv (črn prstan) 3. z makrometrskim vijakom dvigaj mizico dokler ne seže objektiv do predmeta

(pogled od strani!) 4. glej skozi okular in z makrometrskim vijakom spuščaj mizico, dokler predmet ne

postane viden 5. z mikrometrskim vijakom izostri sliko. Po uporabi obriši objektive!! Izvedba: a) Mikroskopski pregled jogurta (bakterije iz rodu Lactobacillus in Streptococcus)

Kapljico jogurta razmaži po objektnem stekelcu s cepilno zanko. Pred uporabo cepilno zanko nad plinskim gorilnikom prežari in jo v bližini gorilnika ohladi.

Preparat opazuj pod mikroskopom in skiciraj kulturo. Pri skiciranju bodi pozoren na obliko, barvo in strukturo preparata. visoko zmogljivi objektiv brez imerzije z imerzijo

jogurt povečava:

b) Mikroskopski pregled kulture pekovskih kvasovk (Saccharomyces caerevisiae)

Iz posušene kulture kvasnih celic pripravi v fiziološki raztopini suspenzijo kvasa.

8

Kapljico metabolno aktivnih kvasnih celic razmaži po objektnem stekelcu in kulturo pokrij s krovnim stekelcem.

Preparat opazuj pod mikroskopom in skiciraj kulturo.

kvas povečava:

c) Mikroskopski pregled krušne plesni ( Aspergillus niger)

Kulturo krušne plesni prenesi s cepilno zanko na objektno stekelce. Kulturo razmaži v kapljici vode.

Preparat opazuj pod mikroskopom in skiciraj kulturo. Bodo pozoren na micelij in spore v preparatu. krušna plesen povečava: Vaja 2: Enostavno barvanje mikroskopskega preparata

Večina neobarvanih preparatov je nekontrastnih ali pa slabo kontrastnih, zato so

celice težko opazne. Z obarvanjem preparata povečamo kontrast med celicami in ozadjem ter tako celice lažje vidimo. Opazujemo njihovo obliko, velikost, zunanjo in notranjo strukturo. S posebnim barvanjem lahko tudi ločujemo žive celice od mrtvih. Pred barvanjem preparata običajno pripravimo razmaz in ga fiksiramo.

Priprava razmaza:

Suspenzijo jogurta razmaži v tanki plasti na objektno stekelce. Razmaz posuši na zraku ob gorilniku (do 40 °C).

9

Posušeni razmaz fiksiraj tako, da objektno stekelce z razmazom obrnjenim navzgor trikrat povlečeš skozi plamen gorilnika.

Enastavno barvanje (kontrastiranje): Fiksirani razmaz prelij z raztopino metilensko modrega barvila (5 minut). Višek barvila na preparatu speri pod tekočo vodo. Posuši (popivnaj s staničevino). Preparat opazuj pod mikroskopom z uporabo visoko zmogljivega objektiva in imerzijskega olja in si skiciraj kulturo.

metilensko modro povečava: oblika celic: barva celic: Vaja 3: Sestavljena barvanja (diferencialna); barvanje bakterijske kulture po Gramu

Barvanje po Gramu je najpomembnejša tehnika diferencialnega barvanja za

bakterije. Z barvanjem po Gramu lahko vse bakterije razdelimo v dve skupini: po Gramu + in po Gramu. Tehniko je prvič publiciral Christian Gram leta 1884. Celice najprej obarvamo s kristalvijoličnim barvilom in jih nato obdelamo z raztopino joda. Preparat razbarvamo z etanolom. Po Gramu pozitivne celice ohranijo barvo, medtem ko se po Gramu negativne celice razbarvajo in jih moramo zato dodatno (diferencialno) obarvati s safraninom. Test je zasnovan na spoznanju, da majhna molekula kristalvijoličnega barvila prodre v celično steno bakterije. Po dodajanju joda postane kompleks barvilo-jod preveliko in težje zapušča celično steno. Pri Gram negativnih bakterijah, kjer je celična stena tanka, etanol deloma izpere kompleks barvilo-jod iz celične stene (razbarvanje). V primeru Gram pozitivnih bakterij, kjer je celična stena debelejša, pa etanol ne more izprati kompleksa barvilo-jod in celice ostanejo obarvane. Poznanih je več modifikacij osnovne procedure. Pomembno je, da je test standardiziran in da rezultate primerjamo z referenčno Gram + in pa Gram - kulturo.

10

Izvedba: Postopek za barvanje po Gramu:

Dve referenčni bakterijski kulturi razmaži po objektnem stekelcu in ju fiksiraj. Preparat na objektnem stekelcu prelij s kristalvijoličnim barvilom - učinkuje naj 1 min. Odvečno barvilo speri z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). Dodaj lugol, ga odstrani in ponovno dodaj za 1 min. Speri lugol z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). Dodaj 95 % etanol za 5-15 sek, če je plast nanesene kulture tanka, oziroma za 15-60 sek, če je plast nanesene kulture debelejša. Speri etanol z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). (Kritični korak v postopku!) Dodaj safranin - učinkuje naj 1 min. Zelo pazljivo speri safranin z vodo. Preparat osuši na zraku ali pazljivo popivnaj s papirjem. Zabeleži obarvanost celic bakterijskih referenčnih kultur.

referenčna kultura 1 referenčna kultura 2

reakcija po Gramu: barva celic:

11

RAST MIKROORGANIZMOV Rast mikroorganizmov na nivoju celice je večanje volumna in mase posamezne

celice ter podvojitev. Pogosteje pa rast mikroorganizmov obravnavamo na nivoju populacije ali združbe. Na tem nivoju je rast mikroorganizmov večanje števila celic oziroma mase vseh celic. Za rast je potrebna energija.

Različne vrste mikroorganizmov lahko izkoriščajo različne vrste energije: sončno energijo ali pa energijo vezano v različnih organskih spojinah. Posebnost metabolizma mikroorganizmov je njihova sposobnost izkoriščanja energije vezane v anorganskih spojinah ter elementih npr. H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-. Vsem

navedenim anorganskim skupinam in elementom je skupno, da so v relativno reduciranem stanju. Izkoriščanje energije v mikrobnih celicah je vezano na encimske oksidacijsko-redukcijske reakcije, kjer se sproščena energija porabi za produkcijo ATP-ja. Kemijsko vezana energija v obliki ATP je najbolj pogosta oblika energije, ki jo celica neposredno izkorišča pri energetsko zahtevnih biosintetskih reakcijah. Za kemijske reakcije, kjer je potrebno manj energije se lahko uporabljajo tudi drugi viri energije. Izkoriščanje energije je termodinamski proces in zato so pomembni dejavniki okolja, kjer se reakcija odvija (temperatura, pH, pritisk, prosta Gibsova energija, koncentracija reaktantov in produktov).

Poleg energije potrebuje mikroorganizem za rast ogljik in druge elemente, ki so sestavine novo sintetizirane biološke snovi. Te elemente opredeljujemo kot hranila in mikroorganizmi jih sprejemajo iz okolja v različnih oblikah. Ločimo makro-hranila (C, O, H, N, P, S, K, Mg, Na, Ca), ki jih organizem potrebuje v večjih količinah in mikro-hranila (npr. Fe, Co, Cr, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn), ki so za rast potrebna v manjših količinah. Posebnost nekaterih mikroorganizmov je zmožnost, da določeno hranilo v različnih redukcijskih stanjih, lahko uporabljajo za več namenov: za asimilativni metabolizem, to je za sintezo nove biološke snovi, kot donor elektronov oziroma vir energije (H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-) ali pa kot sprejemnik

elektronov pri dihanju - disimilativni metabolizem (npr. NO3-, SO4

2-, Fe3+, So). Mikroorganizme najdemo v vseh okoljih, kjer jim je na voljo dostopen vir energije

in hranil. Okolje s svojimi biotičnimi in abiotičnimi dejavniki daje prednost mikroorganizmu, ki je okolju najbolje prilagojen. V svojem naravnem okolju mikroorganizem po pravilu ne izkoristi v celoti svojega rastnega potenciala, ker običajno vsi dejavniki okolja niso v optimalnih območjih in hranila niso prisotna v optimalnih koncentracijah in ustreznih fizikalno-kemijskih stanjih.

Naravna okolja so običajno poseljena z večjim številom različnih mikroorganizmov in tudi drugih živih entitet (združbe sestavljene iz populacij različnih organizmov). Številne biotske in abiotske interakcije še povečujejo kompleksnost in zato opazovanja pojavov neposredno v takih okoljih ne nudijo veliko možnosti za opisovanje in vrednotenje posameznega mikroorganizma in še manj za vrednotenje vzročnih povezav med vlogo posameznega organizma in spremembami v okolju.

Lastnosti posameznega mikroorganizma in tudi njegove vloge v okolju tradicionalno proučujemo v poenostavljenih laboratorijskih modelih s čistimi kulturami. Čista kultura mikroorganizma je najbolj splošno opredeljena kot rast nekega mikroorganizma v odsotnosti vseh ostalih mikroorganizmov. Čista kultura je fenotipsko in genotipsko homogena. Ko so celice v čisti kulturi dokazljivo potomstvo

12

ene same celice jo imenujemo klon. Potomstvo ene ali več enakih celic pa imenujemo sev. Seve, ki so opredeljeni po antigenskih značilnostih, imenujemo serotipe.

Substrate, ki omogočajo rast mikroorganizmov imenujemo gojišča. Za uspešno

gojitev mikroorganizmov, moramo poznati prehranske zahteve in dejavnike okolja, ki vplivajo na rast izbranega mikroorganizma. Pri dejavnikih okolja je pomembno poznavanje zahtev mikroorganizma glede temperature, prisotnosti ali odsotnosti kisika, dostopnost vode in pH. Glede na sestavo gojišča poznamo naravna gojišča (npr. mleko, sadni sok), sestavljena (pepton, mesni ekstrakt, kvasni ekstrakt), in sintetična gojišča, ki so sestavljena izključno iz kemijsko definiranih snovi, ki jih dodamo v znanih koncentracijah. Glede namembnosti ločimo hranljiva (hranljivi agar, hranljivi bujon), obogatena (dodatek krvi, rastlinskega soka), selektivna (NH4

+ kot

edini vir energije) in diferencialna gojišča (EMB, krvni agar). Glede na agregatno stanje uporabljamo tekoča gojišča, poltrdna gojišča (0.5 % agarja) in trdna gojišča (1.5 - 2 % agarja).

Rast mikroorganizmov lahko spremljamo na več načinov: s štetjem celic pod mikroskopom, z gojitvenimi števnimi metodami, s spektrofotometričnim določanjem optične gostote tekoče kulture (absorbcija pri valovni dolžini 660 nm), z merjenjem količine suhe snovi mikrobnih celic, s spremljanjem porabe substrata ali povečanja mikrobnega produkta, z merjenjem količine vgrajenega radioaktivnega substrata v mikrobno celico (npr. 3H, izotopno označen levcin), z merjenjem celičnih sestavin (DNA, proteini, biomasni ogljik in dušik, ATP). Števne metode so najbolj pogosto uporabljeni pristop za določanje velikosti mikrobne populacije. Uporabne so tako pri delu s čistimi kulturami, kot tudi za določanje velikosti mikrobnih populacij ali združb v heterogenih naravnih vzorcih (tekočih, trdnih ali plinastih). Ločimo direktne in indirektne oziroma gojitvene števne metode. Pri direktnih metodah preštejemo celice s pomočjo mikroskopa neposredno v vzorcu. Z indirektnimi - gojitvenimi prijemi pa določamo število živih celic oz. enot, ki so sposobne rasti na uporabljenih gojiščih in v razmerah inkubacije.

Za namene proučevanja lastnosti odbranega mikroorganizma je nujna njegova izolacija iz naravnega okolja. Pogosto je v postopek izolacije vključena stopnja obogatitve vzorca z odbranim mikroorganizmom. Na osnovi različnih prehranskih in okoljskih zahtev mikroorganizmov lahko z izbiro pogojev, ki pospešujejo rast odbranega mikroorganizma, le-tega številčno obogatimo glede na ostale mikroorganizme prisotne v vzorcu. Npr. fotoavtotrofni mikroorganizem lahko selektivno namnožimo v gojišču, ki ima potrebne makro in mikroelemente, vitamine, kofaktorje, nima pa vira organske ali anorganske energije. Z inkubacijo na svetlobi in ob prisotnosti CO2 kot edinega vira ogljika favoriziramo rast tistih mikroorganizmov, ki lahko izkoriščajo svetlobo kot vir energije. Selektivno obogatena kultura običajno še ni čista kultura.

Čisto kulturo lahko iz obogatene kulture izoliramo s pomočjo mikroskopa (direktna metoda). V tem primeru izberemo posamezno mikrobno celico in jo s primerno majhno kapilaro prenesemo na sterilno gojišče. Pri indirektnih metodah izoliramo celice iz posamezne kolonije (predpostavimo, da je kolonija nastala iz ene same ali maloštevilnih enakih celic) in jo aseptično prenesemo na novo gojišče. Pri izolaciji v tekočih kulturah predpostavimo, da je pri višjih razredčitvah v gojišču omejeno število mikrobnih celic željenega organizma (v posebnem primeru je lahko prisotna samo ena celica). Kulturo iz teh razredčitev precepimo v sveže gojišče.

13

Izolirano čisto kulturo moramo obdržati nespremenjeno in čisto. Pogosti vzrok napačnih zaključkov v mikrobiologiji je prav delo s kontaminiranimi kulturami. Vzdrževanje čiste kulture zajema ohranjanje živosti, preprečevanje kontaminacije in občasno preverjanje nespremenjenosti fenotipskih in genotipskih lastnosti mikroorganizma. Za krajšo dobo kulturo lahko ohranimo živo z občasnim precepljanjem na sveže gojišče in hranjenjem pri nizkih temperaturah (+4oC). Paziti moramo, da se nam kultura ne izsuši. Nekatere kulture lahko tudi zamrznemo do -20oC in jih tako ohranimo od dveh mesecev do dveh let, odvisno od mikroorganizma. Kulture mikroorganizmov, ki sporulirajo lahko hranimo v obliki spor v suhem stanju v želatini ali na papirju. Za daljše obdobje je primerno zmrzovanje kulture pri -70oC, ali v tekočem dušiku (-196oC) oziroma v dušikovih parah (-140oC). Mikrobno kulturo lahko ohranimo tudi v liofiliziranem stanju. Liofiliziranje je postopek sušenja v zmrznjenem stanju in pri močno znižanem tlaku. V takih razmerah voda iz vzorca sublimira v ohlajeno past. Liofilizirano kulturo shranimo v vakuumiranih ampulah.

Čiste kulture mikroorganizmov hranijo v različnih splošnih in specializiranih zbirkah: ATCC (American Type Culture Collection), DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), NCTC (National Collection of Type Cultures). Obstajajo specializirane zbirke za industrijske mikroorganizme, kmetijske mikroorganizme, rastlinske patogene organizme. V Sloveniji imamo MZKI (Mikrobiološko zbirko Kemijskga inštituta).

Vaja 4: Sterilizacija, aseptična tehnika

Mikroorganizmi so v naravnih okoljih splošno razširjeni. Iz tega sledi, da je potrebno za namnoževanje in proučevanje odbranega organizma v čisti kulturi, iz uporabljenih substratov predhodno odstraniti avtohtone mikroorganizme oziroma odstraniti njihovo živost. Postopkom uničenja živosti mikroorganizmov ali njihove odstranitve iz substratov pravimo sterilizacija. Zaradi svoje majhnosti in enostavnega prenosa po zraku, vodi, s prahom, s kožo ali z laboratorijsko opremo, je potrebno ves čas dela z odbranim mikroorganizmom preprečevati vnos drugih mikroorganizmov iz okolja (preprečevanje kontaminacije). Postopkom, ki preprečujejo kontaminacijo sterilnega rastnega medija z mikroorganizmi, pravimo aseptična tehnika. Aseptična tehnika zajema delo v sterilnem okolju: v aseptičnih komorah, delo ob plinskem gorilniku in uporabo sterilnega materiala.

Sterilizacija je proces, s katerim uničimo živost celic ali odstranimo vse žive

celice. Sterilnost je statistična funkcija, ki izraža verjetnost, da je populacija mikroorganizmov pri procesu sterilizacije odmrla. Načinov sterilizacije je več: suha sterilizacija (ožiganje s plamenom, vroč zrak 140-180°C za 2-3 ure); vlažna sterilizacija (standardno avtoklaviranje 1.3 bar, 121.1°C, 15 min, ali pa 110°C, 30 min), tindalizacija (100°C, 30 min, 3x v presledku 24 ur) filtracija (velikost por < 0.2 µm), zaplinjanje (formaldehid, etilen oksid); radiacija (UV sevanje, γ žarki). Razen filtracije se vse ostale sterilizacijske metode dajo matematično opisati s hitrostjo odmiranja mikrobne populacije. Število mikroorganizmov se zmanjšuje eksponencialno s kinetiko reakcije prvega reda (podobno kot kemijske reakcije prvega reda, N = No . e-kt). Običajno se za matematičen opis procesa uporablja parameter D (decimalni redukcijski čas), ki pomeni čas potreben za zmanjšanje mikrobne

14

populacije pri izbrani temperaturi za 10 krat. Vrednost D dobimo grafično, če nanesemo logaritem preživelih mikroorganizmov v odvisnosti od časa sterilizacije. O uspešni sterilizaciji govorimo tedaj, ko je verjetnost, da bomo našli preživeli organizem manjša od 10-6. Preživelost organizma določamo z gojitvenimi metodami. Včasih lahko pride do odstopanja od logaritemskega zmanjšanja mikrobne populacije (različna odpornost, agregiranost celic, sestava gojišča). V takih primerih standardizirani postopki ne bodo zagotovili sterilnega materiala in je potrebno uspešnost sterilizacije preveriti z odsotnostjo rasti mikroorganizmov. Zaradi dolgotrajnega postopka ugotavljanja preživelosti mikroorganizmov (nekaj ur do nekaj tednov) si pomagamo z indikatorji sterilnosti (negativen test z indikatorjem ni zagotovilo da je material sterilen!). Kot biološki indikator uporabimo spore mikroorganizmov, ki so toplotno zelo odporne (npr. Bacillus stearotermophilus, Bacillus subtilis). Sterilizacijo smatramo za uspešno, če spore po prenosu na izbrano gojišče ne vzkalijo in mikroorganizem ne začne rasti. Pri postopku sterilizacije z avtoklaviranjem pa lahko uporabimo kemične indikatorje, ki se talijo pri določeni temperaturi (jantarjeva kislina) ali pa spremenijo barvo pri določeni temperaturi (avtoklavirnimi trakovi).

-7-6-5-4-3-2-1012345

0 1 2 3 4 5 6

čas (min)

Log

štev

ila p

reži

velih

cel

ic

D parameter

Slika 2: Eksperimentalna določitev D parametra in verjetnost preživetja

Število živih mikroorganizmov lahko zmanjšamo tudi s postopkom pasterizacije.

Pasterizacija ni sterilizacija! Uporablja se za mleko, pivo, razne sadne napitke. Pri pasterizaciji segrejemo snov na 60 do 80 oC za nekaj sekund do nekaj minut. Na ta način inaktiviramo encime in uničimo večino mikroorganizmov. Če pasteriziran material hranimo pri nižji temperaturi (4 oC) je zaradi zmanjšanega števila mikroorganizmov aktivnost zmanjšana in lahko pasterizirani substrat ohranimo dlje časa nespremenjen.

Mikrobno rast lahko kontroliramo tudi s kemijskimi sredstvi. Antimikrobna

sredstva zaustavijo rast (statična sredstva) ali pa ubijejo mikroorganizme (cidna

15

sredstva). Glede na vrsto mikroorganizma ločimo bakteristatična, fungistatična, algistatična oziroma baktericidna, fungicidna ali algicidna sredstva. Razlika med bakteristatičnim in baktericidnim sredstvom je velikokrat odvisna od koncentracije. Pri majhni koncentraciji je neko sredstvo lahko bakteristatično pri višji koncentraciji pa baktericidno.

Namen vaje je spoznavanje splošne razširjenosti mikroorganizmov v okolju in pridobivanje znanja o pojmu sterilnosti. a) Razširjenost mikroorganizmov v okolju

Z uporabo trdnega gojišča v petrijevkah, ki vsebuje pepton, kvasni ekstrakt in agar (gojišče PKE), bomo poskušali pokazati prisotnost in raznolikost mikroorganizmov v različnih okoljih: zrak, voda, tla, koža in rastline.

Izvedba

Pred začetkom dela si umij roke z detergentom z biocidnim delovanjem in površino na kateri boš delal razkuži z alkoholom. Vse postopke izvajaj z upoštevanjem aseptične tehnike z uporabo plinskega gorilnika. Pri delu s plinskim gorilnikom upoštevaj navodila za varno delo.

Vodno okolje: vzorec nacepi s pomočjo cepilne zanke na ploščo z gojiščem. Preden uporabiš cepilno zanko jo prežari v plamenu gorilnika in jo v bližini gorilnika ohladi (štej do deset). Cepilno zanko omoči v vodi, odpri pokrov petrijeve posodice in nacepi vzorec po površini trdnega PKE gojišča. Pri tem cepilne zanke ne utiraj v gojišče, ampak z njo drsiš po površini. Talno okolje: najprej pripravi talno suspenzijo (10 g tal v 90 ml fiziološke raztopine) in jo stresaj 1 uro na stresalniku (100 nihajev/min). S cepilno zanko nacepi vzorec tekoče faze po površini trdnega gojišča. Zrak: petrijevo posodico odpri in jo 30 minut izpostavi zraku. Koža: odpri petrijevo posodico v bližini plinskega gorilnika in se trdnega gojišča dotakni s prstom. Po dotiku petrijevo posodico takoj zapri. Rastline: uporabi zelene dele rastline (listi, steblo). S testiranim delom rastline se dotakni trdnega gojišča. Delaj v bližini gorilnika. Po končanem nacepljanju petrijevke obrni s pokrovom navzdol in aerobno

inkubiraj 1 teden pri 28oC. Po končanem delu si umij roke z detergentom z biocidnim delovanjem in razkuži z

etanolom površino mize, na kateri si delal. Po enotedenski inkubaciji ugotavljaj prisotnost kolonij na ploščah in opiši njihove

značilnosti.

16

Vodno okolje Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Talno okolje Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Zrak Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij:

17

Koža Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Rastline Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Okolje po izbiri Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij:

18

b) Sterilizacija vzorcev

Pred nacepljanjem z alkoholom razkuži površino mize, na kateri boš delal. Ves čas delaj blizu plinskega gorilnika.

Uporabi tekoča gojišča PKE in čisto kulturo mikroorganizma. Izvedba:

S pomočjo avtomatskih pipet nacepi epruvete, ki vsebujejo po 5 ml gojišča PKE z 0,1 ml testne čiste kulture

Nacepljena gojišča nadalje obdeluj: a) epruveto z nacepljeno čisto kulturo inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; b) epruveto z nacepljeno čisto kulturo avtoklaviraj v avtoklavu 1.3 bar, 121 oC, 15

min in jo po končanem avtoklaviranju inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 0C; c) epruveto z nacepljeno čisto kulturo pasteriziraj 30 sek v vodni kopeli na 60 oC in

jo po končani pasterizaciji inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; d) epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 60 sek v vodni kopeli ogreti na 100

oC in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; e) epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 5 min v vodni kopeli ogreti na 100

oC in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; f) vsebino iz epruvete z nacepljeno čisto kulturo filtriraj skozi sterilni 0.2 µm filter

v sterilno epruveto. Filtrat aseptično zamaši in inkubiraj aerobno 7 dni na 28 oC. Po inkubaciji preveri, kje je prišlo do pojava rasti (motnost gojišča). Razloži

rezultate.

Tabela 1: Rast mikroorganizmov v gojišču PKE, po predhodni termični ali mehanski obdelavi vzorcev. Obdelava vzorca avtoklaviranje filtriranje pasterizacija 60oC segrevanje 100oC kontrola

19

Vaja 5: Minimalna inhibitorna koncentracija protimikrobne snovi

Z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) vrednotimo protimikrobno aktivnost kemijskega sredstva. Ugotavljamo najmanjšo količino snovi, ki je potrebna za preprečevanje rasti testnega organizma. MIK ni absolutna vrednost, ampak je odvisna od testnega organizma, sestave gojišča ter dejavnikov okolja kot so temperatura, pH in prezračevanje.

Izvedba:

Uporabi tekoča gojišča PKE (6 epruvet 16 x 160 mm, po 4 ml). V epruvete s tekočim gojiščem aseptično dodaj 1 % raztopino Izosana G

(dezinfekcijsko sredstvo) tako, da je končna koncentracija Izosana G v gojišču 0.2 %, 0.1 %, 0.05 %, 0.025 %, 0.0125 % in 0 %.

Gojišča nacepi z avtomatsko pipeto z 0.1 ml testnega mikroorganizma (S. marcescens).

Nacepljeno in označeno serijo gojišč z različno koncentracijo Izosan G inkubiraj 7 dni pri 28 oC.

Po končani inkubaciji ugotovi, kje je prišlo do rasti mikroorganizmov (motnost) in določi minimalno inhibitorno koncentracijo protimikrobne snovi.

Tabela 2: Rast S. marcescens na gojišču PKE z različnim odstotnim deležem (%)Izosan G. % Izosan G 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.0000 ml 1% Izosana G 1 0,4 0,2 0,1 0,05 0 rast bakterije

Vaja 6: Šteje mikroorganizmov s pomočjo mikroskopa

Celice v vzorcu preštejemo s pomočjo mikroskopa v majhnem alikvotu posušenega

ali tekočega vzorca. Pomanjkljivosti direktnih števnih metod so: ne ločimo živih in mrtvih celic, majhna natančnost, primerne so le za vzorce z večjim številom celic > 106/ml, zaradi slabega kontrasta mikrobne celice težje opazimo.

Izvedba: a) štetje mikroorganizmov v posušenem razmazu vzorca

Znani volumen vzorca (0.01 ml jogurta) razmaži po objektnem stekelcu na

površino 1cm2. Razmaz posuši na zraku.

20

Preparat fiksiraj s plamenom in obarvaj z metilenskim modrim (barvilo naj učinkuje 5 minut), speri z vodo in osuši.

Z mikroskopom preštej mikrobne celice v več naključno izbranih vidnih poljih (5-20, odvisno od gostote celic).

Iz povprečnega števila mikrobnih celic na eno vidno polje izračunaj število celic v 1 ml vzorca:

N = X ⋅FM ⋅100

kjer je N število celic/ml, X je število celic/vidno polje, 100 je faktor alikvotnega dela vzorca in FM je faktor mikroskopa. Faktor mikroskopa je:

FM = P/ πr2

kjer je P površina razmaza (1 cm2) in r polmer vidnega polja. Pri šolskih mikroskopih, razmazu na površini 1 cm2 in uporabi 100X objektiva ter 10X okularja je FM v območju od 2000 do 2500.

Število celic v jogurtu (celic/ml):

b) štetje mikroorganizmov v tekočem vzorcu s števno komoro (Thoma, Neubauer) Števna komora je posebej oblikovano objektno steklo, ki ima na poglobljenem delu

vgravirano mrežo kvadratov. Globina špranje med dnom komore in krovnim stekelcem je 0.1 mm. Mreža števne komore je razdeljena na kvadrate:

- površina večjega kvadrata je 1/25 mm2, - površina manjših kvadratov je 1/400 mm2. Na vgravirano mrežo števne komore nanesi kapljico vzorca (suspenzija kvasovk). Vzorec na mreži prekrij s krovnim stekelcem. Počakaj 5 min, da se celice usedejo. Preštej celice na več (5) kvadratih (1/25 mm2) v diagonali mreže. Izračunaj povprečno število celic na en kvadrat. Izračunaj število celic v mililitru vzorca s pomočjo naslednje zveze

N = X ⋅ 25 ⋅ 104

kjer je X povprečno število celic na en kvadrat, 25 je število kvadratov na mm2, 104 je faktor za preračunavanje na 1 ml vzorca.

Število celic v suspenziji kvasovk (celic/ml):

21

Slika 3: Mrežica števne komore po Neubauerju s povečanim sredinskim kvadratom (levo) Vaja 7: Določanje števila mikroorganizmov na ploščah agariziranega gojišča (Štetje na ploščah)

Namen vaje je seznanjanje z najpogosteje uporabljeno metodo za ugotavljanje

števila živih celic v vzorcu. Ugotavljamo število enot (CFU- Colony Forming Units), ki na trdnem gojišču tvori kolonije. Kolonijo lahko tvori samo živa celica. Število kolonij je odvisno od velikosti nacepljenega vzorca, sestave gojišča, razmer med inkubacijo (temperatura, kisik, trajanje inkubacije). S to metodo odkrijemo aerobne heterotrofne mikroorganizme, kar predstavlja samo 0.1 - 10 % vseh mikroorganizmov v tleh in 1 - 20 % vseh organizmov v vodnem okolju (v mleku 80%). Ploščo lahko nacepimo z razmazovanjem vzorca (0.1 ml) po površini trdnega gojišča ali pa z vmešavanjem vzorca (0.1 - 1.0 ml) v raztaljeno gojišče (45 °C).

Izvedba: a) Priprava razredčin:

Vzorec tal, potočne vode in vodovodne vode najprej razredči (pripravi zaporedne razredčitve od 10-1 do 10-6 za tla, 10-1 do 10-5 za potočno vodo in 10-1 do 10-2 za vodovodno vodo) v sterilni fiziološki raztopini. Delamo aseptično ob plamenu plinskega gorilniku.

Aseptično odpipetiraj 1 ml vzorca in ga prenesi v 9 ml fiziološke raztopine. Označi razredčitev z 10-1 (desetkratna razredčitev).

Pripravljeno razredčitev dobro premešaj (uporabi mešalec ali pa epruveto vrti med dlanmi).

22

Naslednjo razredčitev pripravi tako, da 1ml razredčitve 10-1 preneseš v 9 ml fiziološke raztopine s čisto sterilno pipeto. Dobro premešaj in označi razredčitev z 10-

2 (stokratna razredčitev). Na enak način pripravi še ostale razredčitve. Ko si pripravil razredčitve vzorca v fiziološki raztopini pripravi sterilne petrijevke

z gojiščem in jih označi enako kot razredčitve (vzorec, razredčitev, ime, datum).

b) Nacepljanje: S pipeto aseptično prenesi 0,1 ml najvišje razredčitve (10-5) v petrijevko z oznako

10-5.Na enak način nacepi še dve manjši razredčitvi. Nacepljene plošče inkubiraj s pokrovom navzdol. Inkubacija traja toliko časa, da se število kolonij ne spreminja več (običajno 8-14

dni). Preštej kolonije na števni plošči. Števne so plošče s 30 do 300 kolonij. Rezultat izrazimo v CFU/ml ali CFU/g; CFU je enota, ki zraste v kolonijo in je

lahko ena ali več celic.

Tabela 3: Število mikroorganizmov v vzorcu izraženo v CFU enotah/ml. Vzorec razredčitev: razredčitev: razredčitev: tla rečna voda vodovodna voda

Vaja 8: Ugotavljanje najbolj verjetnega števila mikroorganizmov (MPN)

Namen vaje je seznanjanje z gojitveno metodo za ugotavljanje najbolj verjetnega

števila živih mikroorganizmov v tekočem gojišču. Metodo uporabljamo v tistih primerih, ko mikroorganizmov ni možno gojiti na trdnem gojišču ali, če je kinetika rasti med mikrobnimi vrstami zelo različna in obstoja nevarnost preraščanja kolonij. Zlasti pa jo uporabljamo takrat, ko želimo v kompleksnem sistemu določiti številčno zastopanost izbrane skupine mikroorganizmov. V teh primerih uporabljamo selektivno gojišče, ki omogoča rast samo določeni skupini mikroorganizmov. Lahko uporabimo tudi diferencialna gojišča, v katerih razpoznavamo prisotnost ožje skupine mikroorganizmov preko spremenjene rasti, tvorbe specifičnega produkta ali s preverjanjem porabe substrata.

23

Izvedba: Vzorec tal, potočne vode in vodovodne vode vode razredči kot je opisano pri vaji

9, le razredčitve pripravi od 10-1 do 10-8 za tla, 10-1 do 10-7 za potočno vodo in 10-1 do 10-4 za vodovodno vodo.

Razredčitve vzorca nacepljamo v epruvete s tekočim gojiščem PKE v treh ponovitvah (dobro označi ponovitve in razredčitve). Nacepljaš tako, da s sterilno pipeto odpipetiraš 1 ml razredčitve 10-7 v gojišče z oznako 10-7. Na enak način narediš vse tri ponovitve.

Ko si trikrat nacepil 10-7 razredčitev z isto pipeto odpipetiraj 1 ml razredčitve 10-6 v gojišče z oznako 10-6 ter to ponovi še dvakrat.

Nacepljanje ostalih razredčitev opravi po enakem postopku. Nacepljene vzorce in kontrolno nenacepljeno gojišče inkubiraj 7 dni pri 28°C. Po inkubaciji ugotovi rast mikrobov v posameznih nacepitvah. Znaki rasti v

tekočem gojišču so: motnost, usedlina, mrenica, sprememba barve, sprememba pH vrednosti gojišča (pokaže jo dodani pH indikator). Spremembe v nacepljenih gojiščih ugotavljaj na osnovi primerjave s kontrolnimi nenacepljenimi gojišči. Primere z znaki rasti označimo kot pozitivne (+), tiste, kjer je rast izostala pa negativno (-). Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število, ki je trimestno pri izvedbi s tremi ponovitvami.

Karakteristično število je sestavljeno iz števila pozitivnih primerov v rangu

razredčitev od vseh pozitivnih ponovitev do vseh negativnih ponovitev (glej primer): Primer:

ponovitve razredčitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

a + + + - - - b + + + + + - c + + + + - - 3 2 1 (karakteristično število)

Najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu določimo na osnovi karakterističnega

števila in z uporabo primernih statističnih tabel (npr. Mc Crady-jeva tabela). Vrednost v tabeli nam pove verjetno število mikroorganizmov v razredčitvi, kjer je

prva številka trimestnega karakterističnega števila. Z upoštevanjem te razredčitve določimo najbolj verjetno število mikrobov v 1 ml vzorca. Za prikazani primer je tabelarična vrednost 15 za razredčitev 10-3; torej je MPN 15x103/ml = 1,5x104/ml

Rezultat: Število mikroorganizmov v vzorcu tal: potočne vode:

vodovodne vode:

24

Vaja 9: Rastna krivulja bakterijske kulture in podvojevalni čas

Namen vaje je spoznati dinamiko rasti bakterijske populacije in določiti njen generacijski ali podvojevalni čas. Čisto kulturo bakterijskih celic nacepimo v sterilno gojišče in inkubiramo pri optimalnih pogojih okolja (temperatura, pH, aerobne oz. anaerobne razmere).

Rast bakterijske populacije v zaprtem (batch) sistemu ponazarja rastna krivulja, ki jo lahko razdelimo na štiri faze: lag fazo, logaritemsko ali eksponencialno fazo, stacionarno fazo in fazo odmiranja.

Po prenosu celic v sveže gojišče, so celice sicer metabolično aktivne, prilagajajo se na nove hranljive vire oz. sintetizirajo razne koencime, vendar se ne delijo. Govorimo o lag fazi. Lag faza izostane samo v primeru, če prenesemo mlado kulturo iz logaritemske faze v sveže gojišče enake sestave. Velikost celic se veča, dokler ne doseže kritično velikost za delitev in od tu naprej govorimo o eksponencialni fazi. Celice veselo rastejo in se delijo ustrezno svojemu genetskemu potencialu, sestavi gojišča in pogojem rasti (temperatura, pH). Pogosto proizvajajo tudi rezervne snovi iz obilice hranil v okolici.

Ko se hranljivi viri izčrpajo, ali pa se akumulirajo toksični odpadni produkti (aerobom lahko začne primanjkovati kisika, ki je slabo topen), celice spremenijo svojo fiziologijo. Lahko dodajo novo plast celične stene, upočasnijo metabolizem in delitev, ali pa začnejo rabiti rezervne snovi.. Rastna krivulja preide v stacionarno fazo. Dolžina stacionarne faze je odvisna od posameznega organizma. Talni mikrobi, ki so navajeni na hitro spreminjajoče se okolje, imajo zelo učinkovite mehanizme za vzdrževanje med pomanjkanjem hranil. Mnogi tvorijo spore in ciste.

Končno preide populacija v fazo odmiranja. Smrt nastopi zaradi izstradanja ali toksičnih odpadnih snovi. V tej fazi se število celic ne spreminja, če jih določamo z mikroskopom ali turbidimetrično (razen če celice lizirajo), če pa jih določamo z gojitvenimi tehnikami, se število celic zmanjšuje. Generacijski ali podvojevalni čas

V eksponencialni fazi se celice delijo v konstantnih intervalih. V določenem času se torej populacija podvoji. Povprečni podvojevalni čas lahko določimo iz rastne krivulje, ki jo prikažemo na semilogaritemskem diagramu. Izvedba:

Nacepi 2 ml kulture bakterijskih celic v sveže termostatirano (37°C) gojišče PKE v erlenmajerici (100ml) ter daj na stresanje v termostatirani prostor (37°C).

V časovnih intervalih, kot so navedeni v tabeli odvzemi aseptično 1 ml vzorca in ga daj v 9 ml sterilne fiziološke raztopine. Istočasno odvzemi tudi vzorec v kiveto in zmeri absorbenco v fotometru pri 650 nm. Pripravi 10 kratne razredčitve ustrezno tabeli. 0.1 ml zadnjih treh razredčitev nacepi na plošče z gojiščem in jih enakomerno razmaži s sterilno epruveto. Plošče inkubiraj pri 37°C.

25

Po inkubaciji preštej zrasle kolonije in nariši graf, kjer nanašaš absorbenco in log števila celic v odvisnosti od časa.

Izračunaj rastno konstanto za zaprt sistem in generacijski čas za Bacillus subtilis iz spodnjih enačb ter iz grafa. Primerjaj obe vrednosti. logX2 - logX1 1 k = tgen = 0.301 . t k TABELA čas inkubacije nacepljene razredčitve A660 (min) 0 10-3 10-4 10-5

20 10-4 10-5 10-6

40 10-4 10-5 10-6

60 10-5 10-6 10-7

80 10-5 10-6 10-7

100 10-6 10-7 10-8

120 10-6 10-7 10-8

140 10-7 10-8 10-9

160 10-7 10-8 10-9

180 10-7 10-8 10-9

Grafikon:

26

Vaja 10: Dejavniki okolja Namen vaje je prikazati vpliv temperature, pH in kisika na rast mikroorganizmov.

Za vsakega od omenjenih dejavnikov ima mikroorganizem svoj minimum, optimum in maksimum. Pod minimalno temperaturo rast mikroorganizma ni možna, ker je transport snovi prepočasen, membrane želirajo, ali pa je kinetika kemijskih reakcij upočasnjena. Nad maksimalno temperaturo rast ni možna, ker pride do denaturacije proteinov in propada plazemske membrane. Glede na temperaturna območja, v katerih so encimske reakcije in rast optimalna, ločimo: obligatne psihrofile, ki najbolje rastejo pri temperaturi 15oC, psihrofile, ki rastejo najbolje pri temperaturah od 20 oC do 30 oC, mezofile, rastejo v območju 20-40oC (rastlinski saprofiti imajo T optimum pri 20-30 oC, toplokrvni gostitelji pa od 35-40 oC) in termofile, ki najbolje rastejo v območju 45-50oC (v naravi so taka okolja tudi zgornja plast tal poleti, kompost in silaža). Extremni termofili imajo temperaturni optimum pri 80oC.

Glede pH območja, v katerem mikroorganizmi optimalno uspevajo, ločimo acidofile (pH 2-5, paradižnik, kislo zelje, kisla tla), pH nevtralne (~ pH 7) in alkalofile (pH 10-11, tla z visoko vsebnostjo karbonatov).

Mikroorganizmi se razlikujejo glede na tolerantnost oz. potrebo po kisiku. Kisik je eden najpomembnejših regulacijskih dejavnikov pri usmerjanju metabolizma celice. Organizmi, ki uporabljajo kisik kot končni sprejemnik elektronov iz dihalne verige, so aerobni mikroorganizmi. Organizmi, ki ne morejo uporabiti kisika kot končnega sprejemnika elektronov iz dihalne verige so anaerobni mikroorganizmi. Če anaerobni mikroorganizmi tolerirajo kisik, jih imenujemo aerotolerantne, če pa je kisik za mikroorganizem toksičen jih imenujemo obligatne ali striktne anaerobe. Če mikroorganizem lahko raste tako ob prisotnosti, kot tudi v odsotnosti kisika ga imenujemo fakultativni aerob ali pa fakultativni anaerob, odvisno od prednostnega načina rasti. Npr. fakultativni anaerob preferenčno raste aerobno. Mikroaerofili rastejo v mikroaerobnem okolju, kjer je kisik prisoten v nižjih koncentracijah kot v atmosferi.

Izvedba: a) Vpliv temperature

Na trdno gojišče PKE z dodatkom škroba (1.5 g/l) nacepi čisto kulturo bakterije Serratia marcescens, čisto kulturo bakterije Pseudomonas fluorescens in izolat amilolitičnega mikroorganizma, ki si ga izoliral iz talne suspenzije (vaja 7).

Petrijevko razdeli na tretjine in v vsako tretjino nacepi s cepilno zanko po en mikroorganizem. Nacepitve opravi v treh ponovitvah od katerih po eno petrijevko inkubiraj pri 4oC, 20oC in 37oC.

Po končani inkubaciji preveri rast mikroorganizmov.

27

Tabela 4: Vpliv temperature na rast S. marcescens, P. fluorescens in amilolitični izolat

Organizem 4oC 20oC 37oC S. marcescens P. fluorescens amilolitični izolat

b) Vpliv kisika

V trdno gojišče PKE z dodatkom glukoze (1.5 g/l) nacepi čisto kulturo Clostridium

sporogens, Saccharomyces cerevisiae in Serratia marcescens. Petrijevko razdeli na tretjine in v vsako tretjino nacepi s cepilno zanko po en

mikroorganizem. Nacepljanje opravi v dveh ponovitvah. Eno petrijevko inkubiraj aerobno pri 28 oC. Drugo petrijevko inkubiraj anaerobno pri 28 oC v vakumskem loncu, kjer si

atmosfero zraka zamenjal z dušikom. Po končani inkubaciji preglej, kje je prišlo do rasti mikroorganizmov.

Tabela 5: Vpliv kisika na rast C. sporogens, S. cerevisiae in S. marcescens Organizem aerobno anaerobno C. sporogens S. cerevisiae S. marcescens

c) Vpliv pH V tekoča gojišča PKE , ki imajo pH 5, pH 7, in pH 9 aseptično s cepilno zanko

nacepi Pseudomonas fluorescens. Kulture inkubiraj aerobno pri 28oC. Po končani inkubaciji opazuj motnost v posameznih gojiščih Tabela 6: Vpliv pH na rast amilolitičnega izolata (A660 nm). Organizem pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 Pseudomonas fluorescens

28

Vaja 11: Bakteriocini

Mnoge bakterije izdelujejo snovi, ki zavirajo ali preprečujejo rast drugim vrstam mikroorganizmov. Bakteriocini so proteinski produkti s protimikrobnim delovanjem. Razlikujejo se v velikosti, mehanizmih delovanja, spektru protimikrobne aktivnosti in mehanizmih imunosti. Njihovo protimikrobno delovanje je omejeno na ozko sorodne bakterijske vrste in je največkrat posledica nastanka por v celični membrani občutljivih celic. Dve glavni razliki, ki bakteriocine razlikujejo od antibiotikov, pa sta specifičnost protimikrobne aktivnosti in ribosomska sinteza v času aktivne rasti. Antibiotiki so sekundarni metaboliti, ki nastajajo v stacionarni fazi rasti.

Protimikrobne učinkovine predstavljajo prednost za bakterijo pri tekmovanju za hranila v okolju, kjer se bakterija nahaja. Poimenujemo jih po vrsti organizma, ki jih proizvaja (E. coli - kolicin, Bacillus subtilis – subtilizin, Vibrio – vibricin).

Pri testih, s katerimi sledimo protimikrobno aktivnost, je pomemben izbor indikatorskega organizma, gostota kulture in difuzijska sposobnost bakteriocina. Indikatorsko kulturo lahko vzdržujemo v tekočem gojišču ali na trdnih gojiščih, kamor položimo diske z bakteriocinom. Aktivnost je določena s conami zbistritve indikatorske kulture v mm.

Pri bakteriji Vibrio sp., ki je bil izoliran iz morske vode v Piranskem zalivu, je bila opažena protimikrobna aktivnost na nekatere bakterijske vrste, pravtako izolirane iz tega okolja. Učinkovino bakterija izloča v gojišče. Izvedba:

Celice Vibrio sp. DSM 14379, namnožene do začetka prehoda v stacionarno fazo rasti (8ur), odstranimo s centrifugiranjem in supernatant prefiltriramo skozi 0,2 µm membranski filter v sterilno posodo. Filtrat označimo z IG (izrabljeno gojišče).

Protimikrobno aktivnost določimo z difuzijskim testom na trdnem gojišču.

Indikatorsko kulturo B13 razmažemo (100 µl) na ploščo PKS. Nato položimo 5 sterilnih papirnatih diskov (7mm) na površino in dodamo na vsak disk 3, 5, 10, 15 oz. 20 µl IG. Inkubiramo pri 28°C in nato izmerimo bistro cono okrog diskov. Rezultat: Izrabljeno gojišče IG (3µl) IG (5µl) IG (10µl) IG (15µl) IG (20µl) Bistra cona (mm)

29

Vaja12: Genetska transformacija

Proces, pri katerem prosta DNA vstopi v celico in pri tem povzroči genetsko spremembo, imenujemo transformacija. Številne bakterije (Gram+ in Gram-) so sposobne tvoriti transformante. Celica navadno sprejme samo en ali nekaj DNA fragmentov tako da lahko s transformacijo le majhen delček genoma ene celice prenesemo v drugo.

Celice, ki so sposobne sprejeti DNA molekulo, imenujemo kompetentne celice. Samo nekatere vrste (Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) so sposobne razviti naravno kompetenco, ki je reguliran proces, pri katerem celica zgradi poseben proteinski aparat za vezavo in sprejem zunajcelične DNA. Po vstopu v celico se DNA s pomočjo proteina RecA integrira v kromosom (homologna rekombinacija) ali v primeru plazmida ostane v celici kot samostojni replikacijski element.

Bakterija Escherichia coli ni zmožna razviti naravne kompetence. Poznani pa so

postopki, kjer tudi to, za genski inženiring izredno pomembno bakterijo, znamo inducirat v umetno kompetentno stanje. Najpogosteje se uporabljata dva postopka:

• prvi se izvede ob prisotnosti visoke koncentracije kalcijevih ionov in inkubaciji

pri nizkih temperaturah, • drug način je elektroporacija, kjer celice izpostavimo pulzirajočemu električnemu

polju, ki sproži nastanek majhnih por v celični membrani za prehod DNA. Na vaji bomo v kompetentne celice E. coli uvedli plazmid, ki nosi zapis za

rezistenco na antibiotik ampicilin. Plazmid je nekromosomski genetski element. Je majhna, večinoma krožna molekula dvoverižne DNA, ki se podvojuje samostojno. Nekateri plazmidi vsebujejo gene, katerih proteinski produkti pomembno karakterizirajo celico, ki jih nosi (rezistenca na antibiotike, težke kovine, tvorba toksinov, katabolizem nenavadnih substratov).

Izvedba: Da ohranijo sposobnost transformacije, moramo kompetentne celice E. coli hraniti na ledu. Po dodatku plazmidne DNA izvedemo kratek toplotni šok. Plazmidna DNA vsebuje gene, ki nosijo zapis za rezistenco na ampicilin. Celice, ki sprejmejo plazmid, bodo torej rezistentne na ta antibiotik. Po inkubaciji v gojišču se bo njihovo število povečalo in dokazali jih bomo, če bodo zrasle na trdni plošči z dodanim ampicilinom. 1. Vsak si pripravi 2 epici s celicami, v eno doda plazmid ( 5 µl). 2. Epici inkubiraj na ledu 20 min. 3. Pripravi 2 plošči s trdnim gojiščem, ki vsebuje ampicilin. 4. Po inkubaciji postavi epici na 42°C za 60 sekund. 5. Takoj postavi nazaj na led za 2-5 minut. 6. Dodaj 1 ml gojišča v epici in postavi v kopel na 37°C za 45 minut. 7. Nacepi 500µl na trdni plošči z antibiotikom in enakomerno razmaži. 8. Inkubiraj na 37°C preko noči, nato pa preštej zrasle kolonije.

30

Dodatek:

Mc Crady-jeva tabela za 3 ponovitve

Karakter. št.

Št. mikrobov

Karakter. št.

Št. mikrobov

Karakter. št.

Št. mikrobov

000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110.0 130 1.6 300 2.5 333 140.0 200 0.9 301 4.0

31