Upload
dangthu
View
219
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Úvod do
MIKROBIOLOGIE
Filip Růžička
Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně
Přednáška pro II. r. ZL 2012
Lékařská mikrobiologie
soubor věd o mikroorganismech čili mikrobech, které mají význam v medicíně humánní, případně i veterinární
• patogenní mikroby, které vyvolávají onemocnění lidí nebo zvířat
• mikroby, které se u nich nalézají jen jako tzv. normální mikroflóra
• vzájemné vztahy mezi mikroby a jejich hostitelem
• vztahy mezi mikroby a prostředím
Klinická mikrobiologie
část lékařské mikrobiologie, zabývající se etiologií, patogenezí a diagnostikou onemocnění vyvolaných mikroby
Orální mikrobiologie – úzce změřená část lékařské mikrobiologie na mikroorganizmy dutiny ústní
Další mikrobiologie
• sanitární
• prostředí (půdní, vody apod.)
• rostlinolékařská
• potravinářská
• průmyslové mikrobiologie
bakterie bakteriologie
mikromycety (plísně a kvasinky) mykologie
(řasy) (algologie)
parazité parazitologie prvoci protozoologie
helminti helmintologie
členovci entomologie
viry virologie
mikrobiologie obecná × mikrobiologie speciální
Co nutno znát o agens
„Představení“ mikroba: jak vypadá, co způsobuje a proč, jak se infekce diagnostikuje, jak se léčí
1. Klasifikace a charakteristika Zařazení + typ buňky (eukaryotická/prokaryotická), příp. nebuněčný organizmus či protein) Je to bakterie, kvasinka, plíseň, či prvok? Morfologie + barvení Je bakterie kok, tyčinka, vlákno, spirála? G+, G-, nebo se barví jinak? Jak jsou buňky
navzájem uspořádány? Tvoří spory, pouzdra, granula? Je virus obalený? Jakou má kapsidu? Aj.
2. Fyziologie, biochemie, genetika, odolnost Typ metabolismu Je to aerob/anaerob aj.? Odolnost Je odolný, či choulostivý? Růstová náročnost jak se kultivuje - je-li specifická, významná (např. T.pallidum/ nekultivovatelná, H.
influenzae růstové faktory atd.), viry – jen na živých buňkách, S. aureus 10% NaCl…) Biochemie
je-li specifická, významná pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae) Antigeny Je jediný antigenní typ, či je typů několik? Je to významné pro diagnostiku (př. Enterobacteriaceae, streptokoky atd.)
Genetika je-li významná pro rezistenci na ATB, faktory patogenity a virulence apod.
4. Patogenita
Které choroby či syndromy vyvolává?
česká a latinská (!) jména chorob, nejvýznamnější příznaky(př. varicella-zoster virus – plané neštovice – vyrážka/puchýřky, reaktivace jako herpes zoster u oslabených...)
5. Patogeneze
Brána vstupu, šíření tělem, vylučování?
Jak vznikají příznaky?
Které jsou faktory patogenity?
6. Imunita
Vzniká vůbec?
Krátkodobá, nebo doživotní, humorální, či celulární?
7. Epidemiologie
Zdroj infekce: člověk, zvíře, nebo prostředí?
Jak se přenáší?
9. Prevence, případně profylaxe
Očkuje se, nebo se imunizuje pasivně?
O jaký typ očkovací látky jde?
10. Terapie
Co je lékem volby? (klíčové příklady – S.pyogenes - PNC apod.)
Pokud antibiotikum, tak které?
8. Laboratorní diagnostika
Průkaz přímý - průkaz příslušného agens
(mikroskopie, kultivace, antigeny, NK) – viz praktika
nepřímý - průkaz protilátek – viz praktika
Co se nemocnému odebírá?
Jak se to vyšetřuje?
Když kultivací, nechce to zvláštní půdu?
Jak se izolát blíže určí?
Interpretace (Co se považuje za pozitivní nález, význam)
Jak tedy na zkoušku…
Trojotázky – příklad:
• Biofilm a jeho medicínský význam
• Streptococcus pyogenes
• Rod Hepatovirus
Obecná mikrobiologie
Etiologické otázky – strukturovat odpověď, vybrat vhodné
příklady
Orální otázky – viz letní semestr, etiologie parodontitid,
zubního kazu atd., správné názvy mikrobů
Speciální mikrobiologie – viz výše
Doporučená literatura
Biofilm a jeho význam
Filip Růžička
Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně
Přednáška pro II. r. ZL 2012
HISTORIE
• 1676 Antony van Leeuwehoek sledoval bakterie v zubním povlaku
• Od dob Pasteura a Kocha 100 let nikoho nenapadlo, že mikrobi v přírodě rostou jinak, než jako volně se vznášející plankton v tekutinách nebo jako kolonie na pevných půdách
• 1935 C. E. Zobel první popis biofilmu u mořských bakterií
• 1950 – 1960 první zprávy o problémech s biofilmem
• 1978 J. W. Costerton upozornění na všudypřítomnost biofilmu a jeho možná účast na perzistentních infekcích
Biofilm
Planktonická forma
Biofilm – adheze, kooperace, gradient
Mechanická ochrana
Vliv na účinek ATB
Ochrana před chem. látkami
Šíření mikroorganizmů
Způsob života mimo
rozhraní fází
Výměna genetické informace
Homeostáza - mikroprostředí
Kooperace a specializace buněk
Ochrana před imunitním systémem
BIOFILM
Mikrobiální biofilm je společenství mikroorganizmů,
které se tvoří na rozhraní fází.
Pevně lne k inertním i živým povrchům.
Vedle mikrobiálních buněk bývá důležitou
stavební složkou biofilmu i mezibuněčná
hmota.
V biofilmu probíhá komunikace a kooperace mezi jednotlivými buňkami i celými
populacemi
TVORBA BIOFILMU
ČASNÁ FÁZE - atraktace a
adheze buněk k povrchu
STŘEDNÍ FÁZE - tvorba
mikrokoloní (akumulace
buněk), příp. tvorba
pseudo/hyf, produkce
extracellulární matrix
MATURACE - vytvoření silné
vrstvy biofilmu s
etracellulární matrix
DISPERSE - odlučování buněk
Regulace tvorby biofilmu hustota populace, složení společenstva, koncentraci živin aj.
Systém quorum-sensing – malé extracelulární signální molekuly
→ akumulace → transkripce cílových genů.
Jeden druh může mít více QS systémů a více signálních molekul
FARNESOL – vliv na expresi min. 274 genů inhibice biofilmu
tvorba klíčků, časná fáze tvorby biofimu - TYROSOL
G- bakterie - N-acyl-L-homoserin laktony
G+ bakterie - signální peptidy
(s cyklickou thionolaktonovou strukturou)
Kandidy -
X
Biofilm – významný faktor virulence
mechanická ochrana buněk (adheze k povrchům a matrix)
Vrstva biofilmu tvoří vhodné mikroprostředí v okolí mikrobů
Kooperace a specializace buněk, přenos genů
Ochrana před účinky imunitního systému
Vliv na účinek antimikrobiálních látek
− Snížená difúze do biofilmové vrstvy, vazba na struktury biofilmu,
− Zvýšená degradace ATB účinkem enzymů
− Změny vlastností mikroba, exprese odlišných genů (multidrug efflux pumps CDR, MDR)
− Heterogenita populace (genetická variabilita), perzistoři
−Změny mikroprostředí
− Změny rychlosti růstu
BIOFILMOVÁ ONEMOCNĚNÍ
pomalý, chronický průběh
často bez výraznějších příznaků
občas akutně exacerbují
antibiotická terapie mívá omezený efekt
po vysazení antibiotik infekce rekurují
izolovaná agens se mohou jevit dle MIC jako citlivá
Biofilmové infekce spojené s přítomností implantátů
biofilmové infekce krevního řečiště (katétrové
sepse, infekce chlopenních náhrad, aj. ….),
endotracheální kanyly, chirurgické stehy,
infekce močových katetrů,
inf. kloubních náhrad,
kontaktní čočky
aj…
aj...
kolpitidy,
zubní kaz, rány
otitis, osteomyelitidy,
pneumonie u cystické fibrózy
subakutní endokarditidy, cholecystitidy
Biofimové infekce nativních povrchů
BIOFILM V MAKROORGANISMU
HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI
normální mikroflóra tvoří vrstvu biofilmu na
sliznicích
Problémy s biofilmem jsou i mimo medicínu
Znečištění povrchů
Zvýšení turbulence protékající tekutiny
Zúžení průsvitu až ucpání potrubí
Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech
Černání tekutin redukovanými kovy
Tvorba izolační vrstvy v tepelných výměnících
Zvýšení odporu lodního trupu při plavbě
aj.
Jak diagnostikovat infekce s přítomností biofilmu?
Jak interpretovat schopnost agens tvořit biofilm?
Jak léčit infekce spojené s přítomností biofilmu?
Laboratorní diagnostika biofilmových infekcí
Pevné přilnutí k povrchu - záchytu mikroba.
Je přítomen biofilm? Jakou hraje roli v patogenezi?
Jak ovlivní biofilm terapii?
Průkaz infekce implantátu
A) Nevyžadující vyjmutí implantátu
B) Průkaz kolonizace implantátu po jeho vyjmutí
Průkaz schopnosti tvořit biofilm
Účinnost antimikrobiální terapie na biofilm
Fenotypové metody průkazu tvorby biofilmu
Vizualizace
Kultivační průkaz
Průkaz klíčových složek biofilmu
Povrchové vlastnosti mikroba
Adheze
Biofilmová
vrstva
Kultivační průkaz tvorby biofilmu
Modifikace Christensenovy metody (Christensen et al., 1982,1985)
1) Kultivace mikroba v přítomnosti vhodného kutivačního povrchu Zkumavková metoda Mikrodestičková metoda Disková metoda
2 ) Promytí - odstranění planktonických buněk
3) Průkaz vytvořené
biofilmové vrstvy
Zjištění počtu CFU
Barvení + spektrofotometrické měření
Sušina
Kolorimetrická média (redukce tetrazoliových
solí, resazurin aj.)
a další
++ + 0
-
Průkaz stavebních složek biofilmu (extracelulární matrix)
Charakteristický růst na agaru s Kongo červení (Freeman 1985)
Povrchové vlastnosti – zodpovědné za adhezi
Hydrofobita
Adheze buněk na rozhraní uhlovodík/voda (Rosenberg et al., 1980)
Suspenze testovaného + Uhlovodík (xylen, oktan aj.)
Vortexování → OD vodní fáze
Hydrofobicita redukci OD původní susp.
Měření kontaktního úhlu
Povrchový náboj a izoelektrický bod (pI)
kapilární izoelektrická fokusace (Růžička et al., 2009; 2010)
Genotypové metody průkazu schopnosti
tvořit biofilm
detekce genů kódujících tvorbu biofilmu
Průkaz ica operonu u stafylokoků pomocí PCR
124 bp – S. epidermidis
546 bp - ica operon
ica R ica A ica D ica B ica C
Primer-F Primer-R
Klinický význam průkazu tvorby biofilmu
Marker klinické významnosti kmene
Je kmen izolovaný z hemokultur klinicky relevantní?
Nejde o kontaminaci?
Průkaz tvorby biofilmu může přinést cenné klinické informace
Prognóza. Jak postupovat v další léčbě?
Citlivost biofilmu k antimikrobiálním látkám
Jaké antimikrobiální látky použít na katétrovou infekci?
MIKROBY V BIOFILMU JSOU
VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ
MIC neodpovídá koncentracím antimikrobiálních látek schopných zasáhnout biofilm (MBIC a MBEC)
Zvýšená odolnost se týká dezinfekčních látek i antibiotik/antimykotik
Rozdíly v citlivost činí až několik řádů
Předpokládá se více mechanizmů, které se na rezistenci BF podílí
MIC nemá přímý vztah k MBIC a MBEC
MBIC - minimální biofilm inhibující koncentrace
MBEC - minimální biofilm eradikující koncentrace
ZHORŠENÝ PRŮNIK
EXTRACELULÁRNÍ MATRIX - PENETRAČNÍ BARIÉRA
SNÍŽENÍ DIFÚZE ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY
nelze však vždy prokázat
VLIV POVRCHOVÉHO NÁBOJE zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+)
se vážou na alginát (-) P. aeruginosa SNÍŽENÁ DIFÚZE ENZYMŮ jako jsou ß-laktamázy Snazší degradace antibiotik
ZMĚNA PROSTŘEDÍ
vyčerpání O2 v určitých oblastech
zvýšení osmotického tlaku
nahromadění kyselých zplodin metabolismu
přímý účinek - potlačení účinku antibiotika
chinolony, aminoglykosidy
nepřímý účinek - snížení růstové rychlosti
beta-laktamy, glykopeptidy
ZMĚNA MIKROBIÁLNÍ POPULACE
toxická látka
zabije většinu mikrobů v biofilmu
zůstane subpopulace buněk
k dané látce vysoce rezistentních „Biofilmový fenotyp“ - exprese genů zodpovědných za rezistenci
tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu
PREVENCE BIOFILMOVÝCH INFEKCÍ
JE VÝHODNĚJŠÍ NEŽ LÉČBA
Společný zájem pacienta, lékaře i ekonomů
Typ implantátu (mechanické, konstrukční a fyzikálně-chem.
vlastnosti, zvl. charakter povrchu aj.)
Stav pacienta (imunosuprese, věk, další onemocnění)
Agens a jeho faktory virulence (adheze aj.)
Způsob zavedení a péče o implantát
Prevence biofilmových infekcí
Vhodná volba implantátu a způsob zavedení (asepticky!)
Zkušený personál + kvalitní následná péče
Preventivní/preemptivní podání ATB u rizikových
pacientů ???
Vhodný materiál (charakter povrchu: druh materiálu,
povrchová energie, povrchový náboj, hrubost aj.)
Impregnace implantátů - antimikrobiální látky a
antiseptika (chlorhexidin, Ag)
www.rajsmichu.cz
Terapie infekcí spojených
s tvorbou biofilmu
Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu
Ponechání infikovaného implantátu
Méně závažné infekce
patogenními mikroby (např. CoNS),
riziko disseminace
Stabilizovaný pacient, benigní průběh,
bez komplikací
Reaguje na ATB terapii
Pokus o likvidaci ložiska biofilmu
(Vysoká pravděpodobnost selhání)
(Doporučení IDSA - Mermel et al, 2009)
Likvidace
ložiska
odstranění
implantátu
+
následná
ATM terapie
Budoucnost
Prevence katétrových infekcí
Interference se signály typu quorum sensing (furanony, RNAIII-IP,
AIP)
Ovlivnění povrchových vlastností katétru
Inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů
Vakcinace
?
Terapie katétrových infekcí
Rozvolnění mezibuněčné hmoty
enzymaticky (lyasy polysacharidů)
fyzikálně (ultrazvukem, elektromagnetickým polem)
Molekuly vyvolávajících autodestrukci biofilmu
regulátory tvorby biofilmu (quorum sensing - furanony, RNAIII-IP, AIP)
?
Úvod do orální mikrobiologie
Filip Růžička
Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně
Přednáška pro II. r. ZL 2012
Mikroflóra dutiny ústní
Vše začalo Leeuwenhoekem…
(a) Původní kresba A.L., (b) Campylobacter rectus, (c) Selenomonas sputigena , (d) ústní koky (e) Treponema denticola, (f) Leptotrichia buccalis
Mikroflóra dutiny ústní Jedno z nejrozsáhlejších mikrobiálních
společenství, přes 700 rodů, některé dosud nepopsané
Stálá – komenzálové, nebo přechodná
Ekologický systém
Tvorba biofilmu
Významný vliv na zdraví lokálně i celkově
Vztah k etiologii zubního kazu a parodontitidy
Prostředí dutiny ústní
• Vícevrstevný dlaždicový epitel
– Rty
– Bukální sliznice
– Sliznice patra
– Hřbet jazyka
– Dásňové sulky
• Dále
– Povrch zubů
– Protetické náhrady a ortodontické aparáty
Rty
Mikroflóra přechodem mezi mikroflórou kůže a ústní sliznice.
Na retní sliznici převážně streptokoky , např. Str. vestibularis.
Bukální sliznice
Sliznice dutiny ústní je osídlena relativně řídce – na jednu epitelii připadá jen 5 – 25 bakterií.
Na bukální sliznici nalézáme hlavně Str. sanguinis a Str. mitis, H. parainfluenzae a částečně i ústní neisserie.
Sliznice patra
Hlavními zástupci streptokoky a aktinomycety, méně hemofily a gramnegativní anaeroby.
Kandidy - snímací totální a parciální náhrady.
Hřbet jazyka
V prostorách mezi papilami mohou zůstávat odloupané epitelie; mikrobů proto daleko více.
Nízký redox potenciál - růst anaerobů.
Kromě Str. sanguinis nalézáme na jazyku i Str. salivarius, Stomatococcus mucilaginosus, neisserie (zejména u malých dětí) a hemofily, ale i veillonely, aktinomycety a prevotely.
Sulci gingivales
Hlavně anaeroby a fakultativně anaerobní bakterie
Z prvoků se v sulci gingivales vyskytují Entamoeba gingivalis a Trichomonas tenax.
ANAEROBY
Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Actinomyces – A. gerencseriae, A. georgiae Fusobacterium – F. nucleatum, F. alocis, F. sulci Prevotella nigrescens Porphyromonas gingivalis, P. endodontalis Treponema denticola, T. vincentii, pectinovarum, socranskii Tannerella forsythia Wolinella succinogenes Selenomonas sputigena
fakultativní AEROBY
Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharyngis, Streptococcus intermedius
Subgingivální plak
převládají anaeroby, např. Peptococcus anaerobius,
Peptococcus magnus a Peptococcus micros, různé
druhy eubakterií, Propionibacterium propionicum,
Bifidobacterium dentium, veillonely, Porphyromonas
gingivalis a Porphyromonas endodontalis, Prevotella
nigrescens a Leptotrichia buccalis.
Povrch zubů
Zubní plak - liší se dle lokalizace.
Hladké supragingivální povrchy jsou osídleny
menším počtem mikrobů, a to vesměs aerobních, než
rozmanité štěrbiny a mezizubní prostory,
Subgingivální plak poskytuje výhodnější podmínky
mikrobům anaerobním.
Supragingivální plak - na povrchu zubů zejména
Streptococcus mutans a Streptococcus sobrinus.
Ve vyvinutém plaku pak též Streptococcus sanguinis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis,
Streptococcus oralis a Streptococcus peroris,
většinou ale ne S. salivarius.
Dále mohou být různé druhy laktobacilů a hemofilů,
Rothia dentocariosa, Eikenella corrodens,
Capnocytophaga haemolytica a Capnocytophaga
granulosa.
Protetické náhrady a ortodontické aparáty
Na dentálních pomůckách velmi snadno vzniká
biofilm – plak, na jehož vzniku se kromě
vyjmenovaných spíše aerobních mikrobů podílejí
ještě stafylokoky, a to i Staphylococcus aureus, a
především kvasinky, zvláště Candida albicans.
V případě špatně udržovaných protetických náhrad
mohou tyto kvasinky vyvolat stomatitidu.
Mikroflóra dutiny ústní má významnou úlohu při vzniku a
vývoji onemocnění dásní a parodontu i při patogenezi
celkových onemocnění
Rod Streptococcus
• α-hemolytické druhy streptokoků, rozděleny na skupiny
• Skupina S. mutans:
Nejčastěji se izoluje S. mutans, méně často S. sobrinus, vzácně S. cricetus a S. rattus. Ze sacharózy tvoří lepkavé glukany a fruktany, rychle tvoří kyseliny ze sacharidů
• Skupina S. salivarius: S. salivarius, S. vestibularis - ve slinách a na povrchu jazyka. Sacharózu metabolizuje na fruktan levan, na půdách s tímto cukrem roste v mukózních koloniích, může vyvolat endokarditidu.
• Skupina S. mitis: S. mitis , S. oralis a S. peroris - na sliznici i v zubním plaku a s výjimkou S. mitis vyvolávají loudavou sepsi…+
S. sanguinis a S. gordonii - na jazyku, na bukální sliznici a v zubním plaku. S. sanguinis dovede štěpit sekreční IgA.
Oba druhy jsou významnými původci subakutní bakteriální endokarditidy (sepsis lenta) !!
• Skupina S. anginosus rostoucí v drobných koloniích - S. anginosus (v brit. literatuře S. milleri), S. constellatus se dvěma poddruhy, constellatus a pharyngis, a S. intermedius.
Kromě nosohltanu se nalézají zejména v gingiválních sulcích. Působí dentoalveolární a endodontické infekce.