UV-Vis スペクトル法

円二色性スペクトル法

2008.5.20

奥村寿子

測定の原理

ラジオ波

マイクロ波

赤外線

紫外線可視光

可視・紫外線の波長

分子の電子状態

紫外

赤外 分子の振動状態

780nm

600

500

380

700

200nm

γ線

波長

108

106

102

104

100

10-2

X線

(nm)

紫外・可視光の吸収

ホルムアルデヒドの n→π*遷移

ホルムアルデヒドのπ→π*遷移

反結合性軌道

非結合性軌道

結合性軌道

σ*

π*

n

π

σ

LUMO

HOMO

hνΔE = hν

例σ → σ* n → σ*

π → π* n → π*

励起状態＝10-14～10-7秒安定

- H 255

π→π*遷移・・・

C=C、芳香族など

n →π*遷移・・・

C=O、N=Oなど（非共有電子対の存在）

共役系の拡張

π→π*遷移の軌道間のエネルギー差が減少 長波長シフト

波長 nm200 500

吸光度

RR

- OH 275

- NH2 280

λmax

可視領域

単色光

I0

透過光

I

セル長

I/Io

Lambertの法則

log I/I0 = - ε L

L

ΔL

L

182

1 14 2

1nI0

I＝

Beerの法則

II0 I

溶液濃度 C

I/Io

I

log I/I0 = -εC

I0 I0

21 1

4

L L L

21

nI0

I＝

濃度2倍基準濃度 濃度n倍

Lambert-Beerの法則

-log I/I0 ∝

I/I0 = 透過度 (T)

-log (I/I0 ) = 吸光度 (A)

ε= モル吸光係数

（溶質固有の定数）

セル長L、溶液濃度C

A = εCL

- log (I/I0 ) = εCL

波長 (nm)

(λmax , Amax)

0

1.5

250 600

Aスペクトル

(λmax , Amax) = ( 460 , 1.15)例

測定濃度

2.0×10-5M

1.0cm 石英セル使用

εmax =A

=1.15

2.0×10-5 × 1.0

= 57,500

C(mol/L) ×L(cm)

A = εCL

紫外可視吸収スペクトルでわかること

• 予想される物質のスペクトルと比較して同定が でき、不純物などの存在が推定できる。

• 吸収の強さは物質の濃度に比例するので、定 量分析が可能である。

• 吸収の位置、強度から立体構造が推論できる。

検量線法による定量方法

測定試料 吸光度

標準液 4.0 mg / L 0.410

標準液 3.0 mg / L 0.295

標準液 2.0 mg / L 0.198

標準液 1.0 mg / L 0.105

標準液 5.0 mg / L 0.502

0

0.25

0.50

1 52 3 4

吸光度

濃度(mg/L)

① 標準液の吸光度を測定する

② 結果より検量線をひく

④ 検量線より成分量を算出

③ 濃度未知の試料の吸光度測定

（検量線に合わせて濃度希釈）

試料（50倍希釈） 0.370

0.370

試料濃度(50倍希釈)= 3.7 mg/L

装置と測定について

回折格子

紫外可視分光計のしくみ

対照

試料

D2 ランプ (UV)

W ランプ (VIS)

スリット

ビームスプリッター

検出部

検出部

A

nm

A

nm

補正

A

nm

スペクトルデータ

溶媒、セル、機器などの外的因子に影響されない

試料＝溶質＋溶媒

対照＝溶媒

ベースライン補正

検出部

溶媒

溶媒

測定について

溶媒の選択

・溶解性

・溶質と相互作用しない

・測定波長領域に吸収がない

・揮発性が低い

A ：一般用、低沸点溶媒にはふたをするB ：希薄溶液用C ：吸光度が大きい場合D ：液量が少ない場合

A BC D

セルの種類

ガラスセル：可視部用（370nm以上の波長領域）プラスチック製セル：可視部用（370nm以上の波長領域）

石英セル：紫外、可視部用。高価で破損しやすいので注意して使用する

セルのとり扱い

①手で持つ時はすりガラスの面を持つ

②セルホルダーに収めるときも、透過面に指紋や異物のつかないように

注意する

④吸収セルの外側が濡れたときはキムワイプで拭う

③試料を入れるときは、まずセルを蒸留水で洗い、次いで試料溶液で2

～3回共洗いした後、セルに約６割の高さ（約3mL）まで入れる

⑤使用後、内容物が分かっているうちに洗浄する（通常は用いた溶媒、水に不溶の場合はアルコール、アセトンで洗う）

光学活性体

旋光分散（Optical Rotatory Dispersion ;ORD）

円偏光二色性（Circular Dichroism ; CD）

円二色性スペクトルでわかること

• 物質が光学活性であるか決定できる

• 特定官能基まわりの立体環境の推定

• 高分子の二次構造の推定

平面偏光

電磁波の電界ベクトルEと磁界ベクトルH自然光

偏光子

平面偏光

左円偏光 右円偏光

平面偏光 ＝右円偏光＋左円偏光

Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ

右円偏光

左円偏光

円偏光

光学活性物質層

光

左円偏光

右円偏光

α : 旋光度

旋光 左右の円偏光に対する屈折率の差（左右円偏光の速度の違い）

α

α

透過速度だけでなく吸光度も異なる

円偏光二色性

楕円偏光

ARAL

tanθ＝AL - AR／AL + AR

[θ] ＝

θ M／(cl) モル楕円率

θ : 実測の楕円角

M : 分子量

c : 濃度

(g/100cm3)

l : セル長

(dm)

Δε ＝ (εL - εR ) モル円二色性

[θ] ≒ 3300 (εL - εR ) = 3300

Δε

コットン効果

負のCotton効果 正のCotton効果

(A)タンパクの紫外可視吸収スペクトル

(B) タンパクの円二色性スペクトル

紫外可視吸収スペクトルでは大きな違いがないが， 円二色性スペクトルではrc ，α-Helix，β-sheet によって

特徴的円二色性パターンがでる

A B

生体高分子への応用