US 6,569,661-Abr 20

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

1/34

( 1 2 ) United S t a t e s

Patent

Qin

e t a l .

US006569661B1

( 1 0 ) P a t e n t

N 0 . :

( 4 5 )

Date o f P a t e n t :

US 6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

May

7 ,

2 0 0 3

( 5 4 ) RECOMBINANT

( X - L - I D U R O N I D A S E ,

METHODS

FOR PRODUCINGAND

PURIFYING THE

SAMEAND METHODS

FOR

TREATING

ISEASES

CAUSED

BY

DEFICIENCIES

THEREOF

( 7 5 )

I n v e n t o r s : Minmin Q i n , P l e a s a n t o n , CA U S ) ;

Wai-Pan Chan, C a s t r o

V a l l e y ,

CA

( U S ) ; L i n C h e n , S a n F r a n c i s c o ,

CA

( U S ) ; P a u l A . F i t z p a t r i c k , A l b a n y , CA

( U S ) ;

J o h n M. H e n d s t r a n d , D a v i s ,

CA

( U S ) ; Dan . W e n d t , W a l n u t

C r e e k ,

CA

( U S ) ; G a r y N . Z e c h e r l e , N o v a t o ,

CA

( U S ) ; C h r i s t o p h e r M. S t a r r , S o n o m a ,

CA

U S ) ;

E m i l

D . K a k k i s ,

N o v a t o , CA

( U s )

( 7 3 ) A s s i g n e e : B i o M a r i n P h a r m a c e u t i c a l

I n c . ,

N o v a t o ,

CA

( U S )

(

*

)

N o t i c e : S u b j e c t

t o a n y d i s c l a i m e r , t h e

t e r m

o f

t h i s

p a t e n t

i s

e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5

U . S . C .

1 5 4 ( b )

b y

1 6 3

d a y s .

( 2 1 )

A p p l .

N o . :

0 9 / 7 1 1 , 2 0 2

( 2 2 )

F i l e d :

N o v . 9 , 2 0 0 0

R e l a t e d

US.

A p p l i c a t i o n Data

( 6 3 )

C o n t i n u a t i o n - i n - p a r t

o f

a p p l i c a t i o n

N o .

0 9 / 4 3 9 , 9 2 3 , ? l e d

o n

N o v .

1 2 , 1 9 9 9 ,

now

P a t . N o . 6 , 4 2 6 , 2 0 8 .

( 5 1 ) I n t . C l . 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. .

C12Q / 0 0 ; C12N / 0 0 ;

C12N 9 / 2 4 ; C07K 1 / 0 0 ; C07K 1 4 / 0 0 ; C07K 1 7 / 0 0 ;

A23]

1 / 0 0

( 5 2 )

US. l .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . 435/200; 4 3 5 / 4 ; 435/183;

5 3 0 / 3 5 0 ; 5 3 0 / 4 1 2 ; 5 3 0 / 4 1 6

( 5 8 ) Field of Search

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. 435/183, 200,

4 3 5 / 4 ; 5 3 0 / 3 5 0 , 4 1 2 ,

4 1 6

( 5 6 )

R e f e r e n c e s

C i t e d

U . S .

PATENT DOCUMENTS

3 , 4 7 2 , 9 3 1 A

1 0 / 1 9 6 9 S t o u g h t o n

3 , 8 9 1 , 7 5 7 A 6 / 1 9 7 5 H i g u c h i

5 , 2 7 0 , 0 5 1

A

1 2 / 1 9 9 3 H a r r i s

6,149 ,909 A 11/2000

Scott

e t

a l .

. . . . . . . . . . . . . .

4 2 4 / 9 4 6 1

6,238,662 B1 5/2001 Scott e t a l . . . . . . . . . . . . . . . 4 2 4 / 9 4 6 1

FOREIGN

PATENTDOCUMENTS

GB

1001949 8 / 1 9 6 5

GB

1 029

548 A 8/2002

W0 WO 3 / 1 0 2 4 4 5 / 1 9 9 3

W0 WO 7 / 1 0 3 5 3 3 / 1 9 9 7

W0 WO 9 / 5 1 7 2 4 1 0 / 1 9 9 9

W0 WO 9 / 5 8 6 9 1 1 1 / 1 9 9 9

OTHER

PUBLICATIONS

A n s o n ,

D .

S . , e t a l . ,

C o r r e c t i o n o f

Human M u c o p o l y s a c

c h a r i d o s i s TypeVI F i b r o b l a s t s

W i t h

R e c o m b i n a n t

NAcetylgalactosamine4Sulphatase, B i o c h e m J .

284:

7 8 9 7 9 4

( 1 9 9 2 ) .

B a r t o n , R . W . , e t a l . ,

T h e H u r l e r

C o r r e c t i v e F a c t o r , J . B i o l .

C h e m . 2 4 6 ( 2 4 ) : 7 7 7 3 7 7 7 9 ( 1 9 7 1 ) .

B i e l i c k i , J ,

e t

a l . , Recombinant Human

I d u r o n a t e 2 S u l p h a t a s e : C o r r e c t i o n

o f M u c o p o l y s a c c h a r i

d o s i s T y p e I I F i b r o b l a s t s a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e

P u r i

? e d

E n z y m e , B i o c h e m . J . 2 8 9 : 2 4 1 2 4 6

( 1 9 9 3 ) .

C l e m e n t s ,

e t

a l . , Human a l p h a L i d u r o n i d a s e 1 . P u r i ? c a

t i o n ,

m o n o c l o n a l

a n t i b o d y p r o d u c t i o n , n a t i v e a n d s u b u n i t

m o l e c u l a r

m a s s , E u r o p e a n

J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y ,

1 5 2 ( 1 ) : 4 3 4 9 ( 1 9 9 4 ) .

F r i e d m a n ,

T . , P r o g r e s s T o W a r d

Human

G e n e T h e r a p y ,

S c i e n c e 2 4 4 : 1 2 7 5 1 2 8 1 ( 1 9 8 9 ) .

H o o g e r b r u g g e , P . M . , e t

a l . ,

A l l o g e n e i c B o n e

MarroW

T r a n s p l a n t a t i o n f o r L y s o s o m a l S t o r a g e

D i s e a s e s ,

L a n

c e t 3 4 5 : 1 3 9 8

( 1 9 9 5 ) .

I o a n n o u , Y . A . , e t

a l . , O v e r e x p r e s s i o n

o f Human

0 , G a l a c

t o s i d a s e

A

e s u l t s

i n

I t s

I n t r a c e l l u l a r

A g g r e g a t i o n ,

C r y s t a l

l i z a t i o n

i n

L y s o s o m e s , a n d S e l e c t i v e

S e c r e t i o n , J . C e l l

B i o l . 1 1 9 ( 5 ) : 1 1 3 7 1 1 5 0 ( 1 9 9 2 ) .

K a k k i s , e t a l . , E n z y m e r e p l a c e m e n t t h e r a p y i n muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s 1 . , New E n g l a n d

J o u r n a l

o f M e d i c i n e ,

3 4 4 ( 3 ) : 1 8 2 1 8 8

( 2 0 0 1 ) .

K a k k i s , E . , e t

a l . ,

S t r o n g T r a n s c r i p t i o n a l

A c t i v a t i o n

o f

T r a n s l o c a t e d

CMyc

Genes O c c u r s W i t h o u t a

S t r o n g

Nearby E n h a n c e r

o r

P r o m o t e r ,

N u c l e i c A c i d s

R e s . 1 6 ( 1 ) : 7 7 9 6 ( 1 9 8 8 ) .

L e d l e y ,

F . D . , C l i n i c a l

A p p l i c a t i o n o f S o m a t i c G e n e

T h e r a p y

i n

I n b o r n

E r r o r s o f M e t a b o l i s m , J .

I n h e r i t . M e t a b .

D i s . 1 3 : 5 9 7 6 1 6 ( 1 9 9 0 ) .

L o W r y ,

RB,

t

a l . ,

An

U p d a t e o n

t h e

F r e q u e n c y

o f

M u c o p o l y s a c c h a r i d e

S y n d r o m e s

i n B r i t i s h C o l u m b i a ,

Human G e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 3 9 0 ( 1 9 9 0 ) .

M y e r o W i t z , R . ,

e t

a l . ,

M a t u r a t i o n o f 0 , L I d u r o n i d a s e i n

C u l t u r e d Human

F i b r o b l a s t s , J . B i o l .

C h e m . 2 5 6 ( 6 ) : 3 0 4 4 3 0 4 8 ( 1 9 8 1 ) .

M o s k o W i t z , S . M . , e t a l . , C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f cDNA

E n c o d i n g t h e Human L y s o s o m a l E n z y m e ,

0 , L I d u

r o n i d a s e ,

FASEB

. 6 :

A77

( 1 9 9 2 ) .

N e l s o n ,

1 . ,

I n c i d e n c e o f

t h e M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s i n

N o r t h e r n

I r e l a n d ,

Human

G e n e t i c s 1 0 1 : 3 5 5 3 5 8 ( 1 9 9 7 ) .

S c r i v e r , C . R . ,

B e a u d e t ,

A . L . ,

S l y , WS n d V a l l e , D .

E d s .

T h e

M e t a b o l i c B a s i s

o f

I n h e r i t e d

D i s e a s e p p 1 5 6 5 1 5 8 7 ,

McGraW i l l , NeW Y o r k ( 1 9 8 9 ) .

( L i s t c o n t i n u e d o n n e X t p a g e . )

P r i m a r y E x a m i n e r P o n n a t h a p u A c h u t a m u r t h y

A s s i s t a n t ExaminerManjunath

N .

Rao

( 7 4 )

A t t o r n e y , A g e n t ,

o r

F i r m A l b e r t P . H a l l u i n ; R o b i n

C .

C h i a n g ; HoWrey Simon A r n o l d &

h i t e

LLP

( 5 7 )

ABSTRACT

The p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a r e c o m b i n a n t human

o t - L

i d u r o n i d a s e a n d b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

f r a g m e n t s a n d m u t a n t s

t h e r e o f , l a r g e

s c a l e m e t h o d s

t o p r o d u c e an d p u r i f y commer

c i a l g r a d e r e c o m b i n a n t

hu m a n

o t - L - i d u r o n i d a s e

enzyme

a s

W e l l

a s methods t o t r e a t c e r t a i n g e n e t i c d i s o r d e r s i n c l u d i n g


d e ? c i e n c y a n d

m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s

I

( M P S

1 ) .

1 0 C l a i m s , 1 4 Drawing

S h e e t s

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

2/34

US

6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

P a g e 2

OTHER

PUBLICATIONS

S h u l l , R . M . , e t

a l . , Enzyme

R e p l a c e m e n t i n a C a n i n e

Model

o f

H u r l e r

S y n d r o m e ,

P r o c .

N a t l .

A c a d .

S c i ,

U S A 9 1 : 1 2 9 3 7 1 2 9 4 1

( 1 9 9 4 ) .

S t o l t Z f u s ,

L . J . , e t a l . , C l o n i n g a n d

C h a r a c t e r i z a t i o n o f

cDNA

E n c o d i n g

C a n i n e a L I d u r o n i d a s e ,

J .

B i o l .

C h e m . 2 6 7 ( 1 0 ) : 6 5 7 0 6 5 7 5

( 1 9 9 2 ) .

T a y l o r , J . ,

e t

a l . , a L I d u r o n i d a s e i n N o r m a l a n d Muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s T y p e 1

Human S k i n

F i b r o b l a s t s ,

B i o

c h e m J . 2 7 4 : 2 6 3 2 6 8

( 1 9 9 1 ) .

T o l s t o s h e v , P . ,

e t

a l . ,

G e n e

E x p r e s s i o n

U s i n g R e t r o v i r a l

V e c t o r s ,

C u r r e n t

O p i n i o n s

B i o t e c h . 1 : 5 5 6 1

( 1 9 9 0 ) .

T u c k e r ,

P . W . e t a l . ,

Mouse IgA Heavy C h a i n

G e n e

S e q u e n c e : I m p l i c a t i o n s f o r E v o l u t i o n o f

I m m u n o g l o b u l i n

H i n g e

E X o n s , P r o c . N a t l . A c a d .

S c i .

U S A 7 8 ( 1 2 ) : 7 6 8 4 7 6 8 8

( 1 9 8 1 ) .

U n g e r ,

E . G . ,

e t

a l . ,

R e c o m b i n a n t

a L I d u r o n i d a s e : C h a r

a c t e r i Z a t i o n

o f

t h e

P u r i ? e d

EnZyme a n d

C o r r e c t i o n o f

Muco

p o l y s a c c h a r i d o s i s

T y p e

I F i b r o b l a s t s , B i o c h e m .

J . 3 0 4 : 4 3 4 9 ( 1 9 9 4 ) .

K a k k i s , e t a l . , L o n g T e r m

a n d

H i g h D o s e

T r i a l s o f

EnZyme

R e p l a c e m e n t T h e r a p y i n t h e C a n i n e Model

o f

M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s

I , B i o c h e m .

M o l .

M e d .

v o l .

5 8 , N o .

2 ,

p p . 1 5 6 1 6 7

( 1 9 9 6 ) .

N e u ? e l d , e t a l . , T h e M u c o p o l y s a c c h a r i d o s e s , T h e Meta

b o l i c B a s i s o f

I n h e r i t e d

D i s e a s e ,

S c r i v e r ,

C . R . , B e a u d e t , A .

L . ,

S l y ,

W . S . ,

a n d V a l l e , D . E d s . McGraW H i l l ,

NeW

o r k ,

p p . 1 5 6 5 1 5 8 7 ( 1 9 8 9 ) .

Rome, e t a l . ,

o t L I d u r o n i d a s e f o r

Human K i d n e y Meth

o d s i n E n z y m o l o g y , v o l . 8 3 , p p . 5 7 8 5 8 2 ( 1 9 8 2 ) .

Schuchman, e t

a l . , Human

o t L Id u r o n i d a s e : P u r i ? c a t i o n

a n d P r o p e r t i e s

o f

t h e H i g h

U p t a k e

( H i g h e r M o l e c u l a r

W e i g h t ) a n d

t h e

LoW

U p t a k e

( P r o c e s s e d )

F o r m s

J .

B i o .

C h e m ,

v o l .

2 5 9 , N o . 5 ,

p p .

3 1 3 2 3 1 4 0 ( 1 9 8 4 ) .

S c o t t ,

e t

a l . , Human o t L I d u r o n i d a s e : cDNA s o l a t i o n

a n d

E x p r e s s i o n , P r o c . N a t l . A c a d .

S c i .

USA

v o l . 8 8 , p p .

9 6 9 5 9 6 9 9 , ( 1 9 9 1 ) .

S c o t t , e t a l . ,

M u l t i p l e P o l y m o r p h i s m s

W i t h i n t h e o t L I d u

r o n i d a s e Gene ( I D U A ) : I m p l i c a t i o n s

f o r a

R o l e

i n

Modi?

c a t i o n o f

MPSI

D i s e a s e P h e n o t y p e ,

Hum.

M o l .

G e n e t .

v o l .

2 ,

N o . 9 , p p . 1 4 7 1 1 4 7 3 ( 1 9 9 3 ) .

S t o l t Z f u s , e t a l . , M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i s I :

c l o n i n g

a n d

c h a r a c t e r i Z a t i o n o f cDNA

e n c o d i n g c a n i n e o t L I d u

r o n i d a s e ,

Am. J . Hum.

G e n e t . ,

v o l . 4 7 , N o .

3 , p .

A 1 6 7 ,

( 1 9 9 0 ) .

C l e m e n t s ,

e t

a l . ,

I m m u n o p u r i ? c a t i o n

a n d

c h a r a c t e r i Z a t i o n

o f h uman o t L i d u r o n i d a s e W i t h t h e u s e o f

monoclonal

a n t i b o d i e s , B i o c h e m . J . v o l . 2 5 9 , p p . 1 9 9 2 0 8 ( 1 9 8 9 ) .

K a k k i s , e t a l . ,

O v e r e X p r e s s i o n

o f

t h e

human

l y s o s o m a l

enZyme o t L i d u r o n i d a s e

i n

C h i n e s e H a m s te r O v a r y C e l l s ,

P r o t . E x p .

P u r i f .

v o l . 5 ,

p p .

2 2 5 2 3 2 ( 1 9 9 4 ) .

S c o t t ,

e t a l . ,

Chromosomal

l o c a l i Z a t i o n

o f t h e

human

o t L i d u r o n i d a s e g e n e

(IDUA)

t o 4 p 1 6 . 3 Am. J .

Hum.

G e n e t .

v o l .

4 7 , p p . 8 0 2 8 0 7 ( 1 9 9 0 ) .

Z h a o , e t a l . , C a r b o h y d r a t e

s t r u c t u r e s

o f r e c o m b i n a n t human

o t L i d u r o n i d a s e s e c r e t e d b y

C h i n e s e

H a m s t e r O v a r y

c e l l s ,

J .

B i o l .

Chem. v o l . 2 7 3 , N o . 3 6 , p p . 2275822765

( 1 9 9 7 ) .

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

3/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

4/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

5/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

6/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

7/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

8/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

9/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

10/34

U.S.

P a t e n t

May 7 ,

2 0 0 3

S h e e t 8 0 f 1 4 U S

6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

F i g ,

2

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

11/34

U.S.

P a t e n t

May 7 ,

2 0 0 3

S h e e t 9 0 f 1 4 U S

6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

r o d u c t i v i t y ( m g / a y )

I d u r o n i d a s e

E n z y m e

A c t i v i t y

D u r i n g

P r o d u c t i o n

2 5 0 0 . 0 0

1 5 2 0 0 0 . 0 0

E A

5 5 0 0 0 0

B e g i n

P e r f u s i o n

P e a k

p e r f u s i o n

r a t e

E L e . c t y a n g e o t l t f r o m s e r u m

8 0 p r o e i n

r e e

'0 1000.00

5

/y

\

5 0 0 . 0 0 t

0 00 I I

l

I I I l I

l

l l l

I I I

I

l

I I l I | |

0 9 2 6 0 0 092900100200100500100800101100101400101700

D a t e

I d u r o n i d a s e P r o d u c t i o n L e v e l i n P r o d u c t i o n R u n P 0 2

5 0 0 0

+36

i t e r F l a s k A

{>36 i t e r

F l a s k

B

S e r u m P r o t e i n - F r e e M e d i u m |

1 0 0 0 * | |

C e l l G r o w t h S t a b l e

C e l l M a s s

w i t h P r o d u c t i o n

2000 P h a s e

6 0 0 0 - llllllllll

B u t y r a t e

I n d u c t i o n

E v e n t s

0 5 1 0 1 5

2 0

2 5

3 0 3 5

D a y s

o f P r o d u c t i o n

F / G . 5 5

U n i t s

f

d u r o n i d a s er

lf

e d i u m

O

4 :

O

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

12/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

13/34

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

14/34

U.S.

P a t e n t

May 7 ,

2 0 0 3

S h e e t

1 2

0 f 1 4

U S 6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

S l e e p A p n e a I m p r o v e s

0

w e e k s S A 0 2

A f t e r

6

w e e k s

S A O Z

4

.

.

.

.

. . . .

.

.

.

. . . .

.

.

.

. . . .

.

. . . I

. . .

. . .

.

. . . .

.

.

.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.

.

.

. .

..

A p n e a s

+

H y p o p n e a s D u r i n g

S l e e p

P r e a n d P o s t T r e a t m e n t

8 0

7 0 E l

P r e t r e a t m e n t3 2 6 w e e k s T r e a t m e n t

O

5 O

4 0

3 a

O

10

J O M O O 1

R C D 0 0 3 S W D O O S

J A N O O 7 C E L 0 0 9

A H C O O 2 S S H O O 4

GMDOO6

N-M0O8

B B G O 1 O

F / G . 9

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

15/34

U.S.

P a t e n t

May 7 ,

2 0 0 3

S h e e t 1 3 0 f 1 4 U S

6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

P u l m o n a r y F u n c t i o n T e s t s

i n G M D O O 6

1 . 6

5 2 w k s

2 3 0

I m p r o v e m e n t

F E V 1

F / G .

7 0

I n c r e a s e d H e i g h t

G r o w t h V e l o c i t y

8 5 M e a n

I n c r e a s e

i n

G r o w t h R a t e

1

1O

Post-treatment

P e r c e n t

r i g i n a l

e i g h t

88 I I l I l l | I | I | | |

~ 2 0 8 1 8 2 1 5 6 1 3 0 1 0 4 7 8 5 2 2 6 0 2 6 5 2 7 8 1 0 4 1 3 0

W e e k s

F I G . 7 7

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

16/34

U.S.

P a t e n t

May 7 ,

2 0 0 3

S h e e t 1 4 o f 1 4

U S 6 , 5 6 9 , 6 6 1

B1

C h i n Z s e 2 H o m s t e r

O v o r y H o s t

P r o t e i n C o n t a m i n a t i o n b y E L I S A

A s s o y

S O U R C E A N D

B A T C H g g ? g ? j i ? g ? , P E R C E N T C H O P

P Q N R Z I Y Z E O Q Z E

N U M B E R

( m i c r o g r o m p e r

m i l l i g r a m )

C O N T A M I N A T I O N C H O P

P r i o r P r o c e s s

( C o r s o n / R E I )

C 9 0 0 2 1 4 1 . 4 9 8 . 6

C 9 0 0 3

2 4 2 . 4 9 7 . 6

09004 1 6 1 . 6 98.4

N e w

P r o c e s s ( G o l l i )

P 1 0 0 3 ( 1 . 3 < 0 . 1 3 > 9 9 . 9

P 1 0 0 6 1 . 2

0 . 1 2

9 9 . 9

P 1 0 0 7

< 0 . 6

( 0 . 0 6 > 9 9 . 9

P 1 0 0 8 ( 0 . 6 7

< 0 . 0 6 7 > 9 9 . 9

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

17/34

US 6 , 5 6 9 , 6 6 1 B1

1

RECOMBINANT

t-L-IDURONIDASE,

METHODS

FOR PRODUCING

AND

PURIFYING THE

SAMEAND METHODS

FOR TREATING

ISEASES

CAUSED BY

DEFICIENCIES

THEREOF

T h i s a p p l i c a t i o n i s a

c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t

o f US. p a t e n t

a p p l i c a t i o n S e r . No.

0 9 / 4 3 9 , 9 2 3 , ? l e d

on

N o v .

1 2 , 1999 now

US.

P a t . N o .

6 , 4 2 6 , 2 0 8 , J u l . 3 0 , 2 0 0 0 2 .

FIELD OF THE

INVENTION

The p r e s e n t i n v e n t i o n i s i n t h e ? e l d o f

m o l e c u l a r

b i o l o g y ,

e n Z y m o l o g y ,

b i o c h e m i s t r y

a n d c l i n i c a l m e d i c i n e . I n

p a r t i c u l a r ,

t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n

p r o v i d e s a human recom

b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e ,

m e t h o d s o f l a r g e - s c a l e p r o d u c t i o n

a n d p u r i ? c a t i o n o f

c o m m e r c i a l

g r a d e

human

r e c o m b i n a n t

o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme, and methods t o t r e a t

c e r t a i n

g e n e t i c

d i s o r d e r s i n c l u d i n g


d e ? c i e n c y a n d


I ( M P S I ) .

BACKGROUND

OF THE

INVENTION

C a r b o h y d r a t e s

p l a y

a

number

o f

i m p o r t a n t

r o l e s i n

t h e

f u n c t i o n i n g o f

l i v i n g

o r g a n i s m s . I n a d d i t i o n

t o t h e i r

m e t a

b o l i c

r o l e s , c a r b o h y d r a t e s a r e s t r u c t u r a l

c o m p o n e n t s

o f

t h e

hu m a n body

c o v a l e n t l y

a t t a c h e d t o

numerous

o t h e r e n t i t i e s

s u c h

a s p r o t e i n s a n d

l i p i d s

( c a l l e d g l y c o c o n j u g a t e s ) . F o r

e x a m p l e , human c o n n e c t i v e t i s s u e s

a n d

c e l l membranes

c o m p r i s e p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e s a n d a p r o t e o g l y c a n

m a t r i x .

T h e c a r b o h y d r a t e p o r t i o n o f t h i s p r o t e o g l y c a n m a tr i x p r o

v i d e s i m p o r t a n t p r o p e r t i e s t o

t h e

b o d y s s t r u c t u r e .

A e n e t i c d e ? c i e n c y

o f

t h e

c a r b o h y d r a t e - c l e a v i n g ,

l y s o

somal

enZyme o t - L - i d u r o n i d a s e c a u s e s a

lysosomal

s t o r a g e

d i s o r d e r

knoWn

a s


I

(MPS I )

( N e u f e l d

a n d M u e n Z e r , p p . 1 5 6 5 1 5 8 7 , i n T h e M e t a b o l i c

B a s i s o f

I n h e r i t e d

D i s e a s e ,

E d s .

C .

R . S c r i v e r , A . L .

B e a u d e t , W.

S . S l y ,

a n d

D .

V a l l e ,

M c G r a W - H i l l ,

NeW o r k

( 1 9 8 9 ) ) I n

a

s e v e r e

f o r m ,

MPS

i s commonly

knoWn a s

H u r l e r s y n d r o m e

a n d i s

a s s o c i a t e d W i t h m u l t i p l e p r o b l e m s

s u c h a s mental r e t a r d a t i o n , c l o u d i n g o f t h e

c o r n e a , c o a r s

e n e d f a c i a l f e a t u r e s , c a r d i a c d i s e a s e , r e s p i r a t o r y d i s e a s e ,

l i v e r a n d

s p l e e n

e n l a r g e m e n t ,

h e r n i a s , a n d j o i n t

s t i f f n e s s .

P a t i e n t s s u f f e r i n g

f r o m

H u r l e r s y n d r o m e

u s u a l l y d i e

b e f o r e

age 1 0 . I n

an

i n t e r m e d i a t e

form knoWn

a s Hurler-Scheie

s y n d r o m e , m e n t a l f u n c t i o n i s g e n e r a l l y n o t s e v e r e l y

a f f e c t e d , b u t p h y s i c a l

p r o b l e m s may l e a d

t o d e a t h

b y

t h e

t e e n s

o r t W e n t i e s .

S c h e i e

syndrome

i s

t h e m i l d e s t form

o f

MPS

.

I t

i s

c o m p a t i b l e Wi t h

a

normal

l i f e

s p a n , b u t

j o i n t

s t i f f n e s s , c o r n e a l

c l o u d i n g a n d h e a r t v a l v e

d i s e a s e c a u s e

s i g n i ? c a n t p r o b l e m s .

The

f r e q u e n c y

o f MPS

i s

e s t i m a t e d

t o b e 1 : 1 0 0 , 0 0 0

a c c o r d i n g t o a

B r i t i s h Columbia

s u r v e y o f a l l neWborns

( L o W r y , e t

a l . ,

Human

G e n e t i c s

8 5 : 3 8 9 3 9 0

( 1 9 9 0 ) )

a n d

1 : 7 0 , 0 0 0 ac c o r d i n g

t o

a n I r i s h

s t u d y ( N e l s o n , Human G e n e t

i c s

101:355358 ( 1 9 9 0 ) ) . T h e r e a p p e a r s

t o

be no e t h n i c

p r e d i l e c t i o n

f o r

t h i s

d i s e a s e . I t

i s l i k e l y t h a t W o r l d W i d e

t h e

d i s e a s e i s

u n d e r d i a g n o s e d e i t h e r b e c a u s e

t h e p a t i e n t d i e s

o f

a

c o m p l i c a t i o n

b e f o r e t h e d i a g n o s i s i s made

o r

b e c a u s e t h e

m i l d e r

f o r m s

o f

t h e syndrome may b e

m i s t a k e n

f o r

a r t h r i t i s

o r

m i s s e d

e n t i r e l y . E f f e c t i v e neWborn s c r e e n i n g f o r MPS

W o u l d

l i k e l y ? n d

some p r e v i o u s l y

u n d e t e c t e d

p a t i e n t s .

E x c e p t

f o r a

feW

p a t i e n t s

Which

q u a l i f y

f o r

bone

marroW

t r a n s p l a n t a t i o n , t h e r e a r e n o s i g n i ? c a n t

t h e r a p i e s a v a i l a b l e

f o r a l l

MPS

p a t i e n t s . H o b b s , e t a l . ( L a n c e t 2 : 709712

( 1 9 8 1 ) )

? r s t r e p o r t e d t h a t b o n e

marroW t r a n s p l a n t a t i o n

s u c

c e s s f u l l y

t r e a t e d a H u r l e r

p a t i e n t .

S i n c e t h a t t i m e , c l i n i c a l

s t u d i e s

a t

s e v e r a l t r a n s p l a nt c e n t e r s

h a v e

shoWn

i m p r o v e

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

2

ment

i n

p h y s i c a l

d i s e a s e a n d s l o W i n g o r s t a b i l i Z i n g o f

d e v e l o p m e n t a l

d e c l i n e

i f

p e r f o r m e d e a r l y . ( W h i t l e y , e t a l . ,

Am. . Med.

G e n e t . 4 6 : 209218

( 1 9 9 3 ) ; V e l l o d i , e t a l . , A r c h .

D i s . C h i l d . 7 6 :

9 2 9 9 ( 1 9 9 7 ) ; P e t e r s ,

e t

a l . ,

Blood

9 1 :

26012608

( 1 9 9 8 ) ;

G u f f o n ,

e t

a l . ,

J .

P e d i a t r i c s 1 3 3 :

1 1 9 1 2 5

( 1 9 9 8 ) )

H o W e v e r ,

t h e

s i g n i ? c a n t

m o r b i d i t y

a n d

m o r t a l i t y ,

a n d

t h e n e e d f o r

matched

d o n o r m a r r o W , l i m i t s t h e

u t i l i t y o f

b o n e marroW

t r a n s p l a n t s . An a l t e r n a t i v e

t h e r a p y

a v a i l a b l e t o a l l a f f e c t e d p a t i e n t s Would p r o v i d e

a n

i m p o r t a n t

b r e a k t h r o u g h i n

t r e a t i n g a n d

m a n a g i n g

t h i s d i s e a s e .

EnZyme

r e p l a c e m e n t t h e r a p y h a s

b e e n c o n s i d e r e d a

p o t e n t i a l t h e r a p y f o r M PS I f o l l o W i n g t h e d i s c o v e r y t h a t

o t - L - i d u r o n i d a s e c a n c o r r e c t t h e

enZymatic

d e f e c t i n H u r l e r

c e l l s i n

c u l t u r e , b u t

t h e d e v e l o p m e n t

o f

human

t h e r a p y h a s

been

t e c h n i c a l l y

u n f e a s i b l e u n t i l

n o W .

I n th e c o r r e c t i v e

p r o c e s s ,

t h e enZyme

c o n t a i n i n g

a m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t e

r e s i d u e i s t a k e n u p

i n t o c e l l s

t h r o u g h r e c e p t o r - m e d i a t e d

e n d o c y t o s i s a n d t r a n s p o r t e d t o

t h e

l y s o s o m e s W h e r e i t

c l e a r s

t h e

s t o r e d s u b s t r a t e s ,

h e p a r a n s u l f a t e

a n d d e r m a t a n

s u l f a t e .

A p p l i c a t i o n o f

t h i s

t h e r a p y

t o

humans

h a s

p r e v i o u s l y n o t

b e e n

p o s s i b l e

d u e

t o i n a d e q u a t e

s o u r c e s

o f o t - L - i d u r o n i d a s e

i n t i s s u e s .

For o t - L - i d u r o n i d a s e

enZyme t h e r a p y

i n

MPS

,

a recom

b i n a n t

s o u r c e

o f

enZyme h a s

been needed i n o r d e r t o

o b t a i n

t h e r a p e u t i c a l l y s u f f i c i e n t

s u p p l i e s

o f

t h e

e n Z y m e . T h e cDNA

f o r t h e

c a n i n e

enZyme

Was

c l o n e d i n 1 9 9 1 ( S t o l t Z f u s , e t a l . ,

J .

B i o l . Chem. 2 6 7 : 6 5 7 0 6 5 7 5 ( 1 9 9 2 ) a n d f o r t h e human

enZyme

i n

t h e same

y e a r .

( S c o t t , e t a l . ,

P r o c .

N a t l .

A c a d . S c i .

USA. 8 8 : 9 6 9 5 9 6 9 9

( 1 9 9 1 ) ,

M o s k o W i t Z , e t

a l . ,

FASEB

J

6 : A 7 7 ( 1 9 9 2 ) ) . F o l l o W i n g t h e c l o n i n g o f cDNA o r o t - L

i d u r o n i d a s e ,

t h e

p r o d u c t i o n o f a d e q u a t e

q u a n t i t i e s o f r e c o m

b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e a l l o W e d t h e s t u d y o f enZyme

r e p l a c e m e n t

t h e r a p y

i n

c a n i n e MPS . ( K a k k i s ,

e t a l . , P r o t e i n

E x p r .

P u r i f

5 :

2 2 5 2 3 2

( 1 9 9 4 ) )

E n Z y m e

r e p l a c e m e n t

s t u d i e s

i n

t h e

c a n i n e MPS model d e m o n s t r a t e d t h a t i n t r a v e n o u s l y

a d m i n i s t e r e d

recombinant


d i s t r i b u t e d

W i d e l y a n d r e d u c e d l y s o s o m a l s t o r a g e

f r o m many

t i s s u e s .

( S h u l l ,

e t a l . , P r o c .

N a t l . A c a d .

S c i . U . S . A .

9 1 :

1293712941

( 1 9 9 4 ) ; K a k k i s ,

e t a l . ,

B i o c h e m . M o l .

M e d . 5 8 :

1 5 6 1 6 7

( 1 9 9 6 ) ) .

BRIEF SUMMARY OF THE

INVENTION

I n

one a s p e c t , t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a method

t o

mass p r o d u c e human r e c o m b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e i n l a r g e

s c a l e

a m o u n t s W i t h

a p p r o p r i a t e

p u r i t y t o e n a b l e

l a r g e

s c a l e

p r o d u c t i o n

f o r

l o n g t e r m p a t i e n t u s e o f

t h e

enZyme t h e r a p y .

I n

a b r o a d e m b o d i m e n t ,

t h e method c o m p r i s e s t h e s t e p o f

t r a n s f e c t i n g

a

cDNA

ncoding

f o r

a l l

o r

p a r t

o f a n

o t - L

i d u r o n i d a s e i n t o a c e l l

s u i t a b l e

f o r t h e e x p r e s s i o n t h e r e o f . I n

some embodiments,

a

cDNA

ncoding f o r a complete o t - L

i d u r o n i d a s e i s

u s e d , p r e f e r a b l y

a human

o t - L - i d u r o n i d a s e .

HoWever, i n o t h e r

embodiments,

a cDNA n c o d i n g f o r a

b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

f r a g m e n t o r

m u t a n t

t h e r e o f may b e u s e d .

S p e c i ? c a l l y , one

o r

more amino

a c i d

s u b s t i t u t i o n s may be

made

W h i l e

p r e s e r v i n g o r e n h a n c i n g t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y

o f

t h e

enZyme. I n o t h e r

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s ,

a n

e x p r e s

s i o n

v e c t o r i s used

t o

t r a n s f e r t h e

cDNA

n t o a su i t a b l e

c e l l

o r

c e l l l i n e f o r e x p r e s s i o n t h e r e o f .

I n

o n e p a r t i c u l a r l y p r e

f e r r e d embodiment,

t h e cDNA

s t r a n s f e c t e d i n t o a C h i n e s e

h a m s t e r o v a r y

c e l l t o

c r e a t e c e l l l i n e

2 . 1 3 1 .

I n y e t

o t h e r

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,

t h e

p r o d u c t i o n p r o c e d u r e f e a t u r e s

one

o r

more

o f

t h e

folloWing

c h a r a c t e r i s t i c s

W hich

have

d e m o n s t r a t e d

p a r t i c u l a r l y

h i g h p r o d u c t i o n

l e v e l s :

( a ) t h e

pH

o f

t h e

c e l l

g r o W t h c u l t u r e may e

l o W e r e d t o a b o u t

6 . 5

t o 7 . 0 ,

p r e f e r a b l y

t o

a b o u t

6 . 8 7 . 0 d u r i n g

t h e p r o d u c t i o n

p r o c e s s ,

( b ) a s many a s

2

t o

3 . 5 c u l t u r e volumes

o f

t h e medium

m a y

b e c h a n g e d

d u r i n g

e a c h 2 4 - h o u r

p e r i o d

b y c o n t i n u o u s

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

18/34

US 6 , 5 6 9 , 6 6 1 B1

3

p e r f u s i o n , ( c ) o x y g e n

s a t u r a t i o n may

b e o p t i m i z e d t o

a b o u t

4 0

b u t may b e a s

h i g h

a s

80 ,

( d ) m a c r o p o r o u s c e l l u l o s e

m i c r o c a r r i e r s

W i t h

a b o u t 5 erum i n t h e

medium

i n i t i a l l y ,

m a y b e u s e d t o p r o d u c e c e l l

mass

f o l l o W e d

by a

r a p i d

W a s h o u t s h i f t t o

p r o t e i n - f r e e

medium

f o r p r o d u c t i o n ,

( e )

a

p r o t e i n - f r e e o r

loW

protein-medium such

a s a

JRH Bio

s c i e n c e s PF-CHO p r o d u c t may

b e o p t i m i Z e d

t o i n c l u d e

supplemental

amounts

o f

one o r more i n g r e d i e n t s s e l e c t e d

f r o m t h e

g r o u p c o n s i s t i n g

o f :

g l u t a m a t e ,

a s p a r t a t e , g l y c i n e ,

r i b o n u c l e o s i d e s ,

a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ;

a

s t i r r e d t a n k

s u s p e n s i o n c u l t u r e may b e

p e r f u s e d i n a

c o n t i n u o u s

p r o c e s s

t o

p r o d u c e i d u r o n i d a s e .

I n a

s e c o n d

a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a

t r a n s f e c t e d c e l l l i n e W h i c h f e a t u r e s t h e

a b i l i t y

t o

p r o d u c e

o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts Which e n a b l e u s i n g t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y . I n p r e f e r r e d


t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n f e a t u r e s

a recombinant Chinese hamster ovary

c e l l

l i n e s u c h

a s t h e

2 . 1 3 1 c e l l l i n e t h a t

s t a b l y

a n d

r e l i a b l y

p r o d u c e s

a m o u n t s o f


W h i c h e n a b l e u s i n g

t h e

enZyme

h e r a p e u t i c a l l y .

I n

some

p r e f e r r e d


t h e

c e l l

l i n e m a y c o n t a i n

more

t h a n

1 copy

o f a n

e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t . I n even more p r e f e r r e d embodiments, t h e c e l l l i n e

e x p r e s s e s

recombinant o t - L - i d u r o n i d a s e i n

amounts o f

a t

l e a s t 2 0

m i c r o g r a m s

p e r 1 0 7 c e l l s p e r

d a y .

I n

a

t h i r d a s p e c t , t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s

n o v e l

v e c t o r s

s u i t a b l e t o produce


i n amounts

W h i c h

e n a b l e

u s i n g

t h e

e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y .

I n

p r e f e r r e d


t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s

a n

e x p r e s s i o n

v e c t o r

c o m p r i s i n g a c y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h an c e r

e l e m e n t , a

5

i n t r o n c o n s i s t i n g o f a

murine

C O .

i n t r o n ,

a

cDNA ncoding a l l

o r

a fragment o r

mutant

of an a

o t - L

i d u r o n i d a s e ,

a n d

a

3

b o v i n e

g r o W t h

hormone

p o l y a d e n y l a

t i o n s i t e . A l s o ,

p r e f e r a b l y

t h e

cDNA n c o d i n g

a l l

o r

a

fragment

o r

mutant

o f

an


i s

a b o u t

2 . 2

kb

i n

l e n g t h .

T h i s e x p r e s s i o n

v e c t o r may

b e t r a n s f e c t e d a t ,

f o r

e x a m p l e , a 50 t o 1 r a t i o

W i t h

any a p p r o p r i a t e

common

s e l e c t i o n v e c t o r s u c h a s pS V2NEO, t o e n h a n c e m u l t i p l e

c o p y

i n s e r t i o n s .

A l t e r n a t i v e l y ,

g e n e a m p l i ? c a t i o n

may

b e

u s e d t o i n d u c e m u l t i p l e

copy i n s e r t i o n s .

I n

a f o u r t h

a s p e c t , t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n

p r o v i d e s

n o v e l


p r o d u c e d

i n a c c o r d a n c e

W i t h

t h e m e t h o d s

o f t h e


a n d t h e r e b y

p r e s e n t i n

a m o u n t s

W h i c h

e n a b l e

u s i n g t h e e n Z y m e t h e r a p e u t i c a l l y . T h e s p e c i ? c

a c t i v i t y

o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n i s i n e x c e s s o f 2 0 0 , 0 0 0 u n i t s p e r m i l l i g r a m p r o t e i n .

P r e f e r a b l y , i t i s i n e x c e s s o f a b o u t

2 4 0 , 0 0 0

u n i t s

p e r

m i l l i

gram

p r o t e i n . T h e m o l e c u l a r W e i g h t o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e

o f

t h e


i s

a b o u t

8 2 , 0 0 0

d a l t o n s ,

a b o u t

7 0 , 0 0 0

d a l t o n s b e i n g

a m i n o a c i d , a n d

a b o u t

1 2 , 0 0 0

d a l t o n s

b e i n g c a r b o h y d r a t e s .

I n a ? f t h a s p e c t , t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

f e a t u r e s a n o v e l

method t o p u r i f y o t - L - i d u r o n i d a s e .

According

t o a ? r s t

embodiment, a

c e l l

mass m a y be

groWn

i n a b o u t 5

s e r u m - c o n t a i n i n g medium, f o l l o W e d by a

s W i t c h

t o a modi

? e d

p r o t e i n - f r e e p r o d u c t i o n medium W i t h o u t a n y

s i g n i ? c a n t

a d a p t a t i o n

t o p r o d u c e a h i g h s p e c i ? c a c t i v i t y s t a r t i n g

m a t e

r i a l f o r p u r i ? c a t i o n . I n o n e p r e f e r r e d embodiment, a

t h r e e

s t e p

c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y

may

b e u s e d

t o p u r i f y t h e

enZyme.

Such

a t h r e e s t e p column

c h r o m a t o g r a p h y

may

i n c l u d e u s i n g a b l u e s e p h a r o s e F F , a

Cu++

c h e l a t i n g

s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y

a n d a p h e n y l

s e p h a r o s e

HP

h r o

m a t o g r a p h y .

I n

a n o t h e r

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t ,

a n

a c i d

p H

t r e a t m e n t

s t e p i s u s e d

t o

i n a c t i v a t e

p o t e n t i a l v i r u s e s

W i t h o u t

h a r m i n g t h e e n Z y m e .

C o n c a n a v a l i n

A - S e p h a r o s e ,

H e p a r i n

S e p h a r o s e

a n d

S e p h a c r y l

200 columns a r e

removed a n d

B l u e - S e p h a r o s e

a n d

c o p p e r c h e l a t i n g c o l u m n s a d d e d t o

i n c r e a s e t h e c a p a c i t y

o f

t h e l a r g e s c a l e p u r i ? c a t i o n p r o c e s s ,

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

4

t o r e d u c e u n d e s i r a b l e l e a c h a b l e s

i n a p p r o p r i a t e

f o r

l o n g t e r m

p a t i e n t u s e , a n d t o

i m p r o v e

t h e p u r i t y o f t h e p r o d u c t .

I n

a

s i x t h a s p e c t ,

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e l

methods o f t r e a t i n g d i s e a s e s c a u s e d

a l l

o r i n p a r t by a

d e ? c i e n c y i n o t - L - i d u r o n i d a s e . I n o n e e m b o d i m e n t , t h i s

method

f e a t u r e s

a d m i n i s t e r i n g

a

recombinant

o t - L

i d u r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o r mutant

t h e r e o f

a l o n e

o r

i n combination W ith a

p h a r m a c e u t i c a l l y

s u i t a b l e

c a r r i e r . I n o t h e r


t h i s method

f e a t u r e s

t r a n s f e r r i n g

a

n u c l e i c

a c i d encoding

a l l

o r a p a r t o f

a n


i n t o one o r more

h o s t

c e l l s i n v i v o . Pre

f e r r e d

e m b o d i m e n t s i n c l u d e o p t i m i Z i n g t h e d o s a g e t o

t h e

n e e d s o f t h e o r g a n i s m t o

b e t r e a t e d ,

p r e f e r a b l y mamma ls

o r

h u m a n s , t o e f f e c t i v e l y a m e l i o r a t e

t h e

d i s e a s e s y m p t o m s .

I n

p r e f e r r e d


t h e d i s e a s e i s

M u c o p o l y s a c c h a r i d o

s i s

I

(MPS ) ,

H u r l e r

s y n d r o m e ,

H u r l e r - S c h e i e s y n d r o m e o r

S c h e i e

s y n d r o m e .

I n

a s e v e n t h

a s p e c t ,

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e l

p h a r m a c e u t i c a l c o m p o s i t i o n s c o m p r i s i n g o t - L - i d u r o n i d a s e

u s e f u l

f o r t r e a t i n g a

d i s e a s e

c a u s e d

a l l

o r

i n

p a r t

by

a

d e ? c i e n c y i n

o t - L - i d u r o n i d a s e . S u c h

c o m p o s i t i o n s

may

b e

s u i t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n

i n a number

o f

Ways such

a s

p a r e n t e r a l ,

t o p i c a l , i n t r a n a s a l ,

i n h a l a t i o n o r o r a l a d m i n i s t r a

t i o n . Within t h e

s c o p e

o f

t h i s a s p e c t

a r e

embodiments

f e a t u r i n g

n u c l e i c

a c i d s e q u e n c e s encoding

a l l

o r a p a r t o f a n

o t - L - i d u r o n i d a s e Which m a y b e

a d m i n i s t e r e d

i n v i v o i n t o

c e l l s a f f e c t e d

W i t h a n


d e ? c i e n c y .

DESCRIPTION OF

THE

FIGURES

F I G . 1 r e p r e s e n t s t he

n u c l e o t i d e a n d

deduced amino a c i d

s e q u e n c e s o f

cDNA

n c o d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e (SEQ I D

NOS:1 a n d 2 ) .

N u c l e o t i d e s

1 t h r o u g h

6 2 0 0

a r e p r o v i d e d .

Amino a c i d s

a r e

p r o v i d e d s t a r t i n g W i t h

t h e ? r s t

m e t h i o n i n e

i n

t h e

o p e n

r e a d i n g

f r a m e .

F I G . 2 r e p r e s e n t s

t h e r e s u l t s

from

SDS-PAGE

u n s o f

e l u a t e

o b t a i ne d a c c o r d i n g t o

t h e

p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e d

b e l o W .

The

t o p p a n e l

shoWs t h e

SDS-PAGE r e s u l t s o f

p u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s e ( 3

m i c r o g r a m s )

a n d

c o n t a m i n a n t s

from

t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n

scheme d i s c l o s e d

i n

K a k k i s , e t a l . , P r o t e i n x p r .

P u r i f

5 : 2 2 5 2 3 2 ( 1 9 9 4 ) .

I n

t h e

bottom p a n e l , S DS - PA GE r e s u l t s o f p u r i ? e d

o t - L

i d u r o n i d a s e W i t h c o n t a m i n a n t s

f r o m

a n u n p u b l i s h e d p r i o r

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s ( U S . p a t e n t a p p l i c a t i o n S e r .

N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9 and 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 )

r e f e r r e d

t o a s t h e C a r s o n

m e t h o d

i n L a n e s 2 ( 7 . 5 m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e ) a n d

L a n e

3

( 5 . 0 m i c r o g r a m o t - L - i d u r o n i d a s e ) a r e c o m p a r e d t o

t h a t

o f t h e

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n

p r o c e s s o f t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n

r e f e r r e d

t o

a s t h e G a l l i

P r o c e s s

( L a n e 4

5

m i c r o

grams o t - L - i d u r o n i d a s e ) . Lane 1 c o n t a i n s t h e m o l e c u l a r

W e i g h t m a r k e r . F I G . 2 s h o W s t h a t

t h e G a l l i

p r o d u c t i o n /

p u r i ? c a t i o n m e t h o d o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n y i e l d s a

h i g h l y

p u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s e p r o d u c t Wi t h f e W e r c o n t a m i n a n t s

i n

c o m p a r i s o n W i t h p r i o r

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n s c h e m e s .

F I G S .

3 A ,

3B d e m o n s t r a t e s

t h e o t - i d u r o n i d a s e

p r o d u c t i o n

l e v e l

o v e r

a 30-day

p e r i o d ,

d u r i n g

Which

t i m e

c e l l s a r e

s W i t c h e d a t day

5 from a serumcontaining

medium

t o a

s e r u m - f r e e

medium.

o t - I d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n Was

c h a r a c

t e r i Z e d b y :

( 1 ) a b s e n c e

o f

a n e e d f o r

a d a p t a t i o n

When c e l l s

a r e s W i t c h e d from s e r u m - c o n t a i n i n g t o s e r u m - f r e e medium

a t 1 0 0 2 0 0 ( t o p

a n d

b o t t o m p a n e l s )

W i t h a n u n i n t e r r u p t e d

i n c r e a s e i n p r o d u c t i v i t y ( t o p p a n e l ) ; ( 2 ) a h i g h l e v e l o f

p r o d u c t i o n

i n

e x c e s s o f

4

mg

e r

l i t e r

( 1 0 0 0

p e r

mL)

i n a

p r o t e i n - f r e e medium

( b o t t o m

p a n e l ) ; a n d

( 3 )

a b o o s t i n

o t - i d u r o n i d a s e

p r o d u c t i o n

W i t h

b u t y r a t e i n d u c t i o n e v e n t s

( b o t t o m p a n e l ) .

F I G .

4 d e m o n s t r a t e s

a d e c r e a s e

i n l i v e r volume

d u r i n g

enZyme

t h e r a p y

i n M P S

p a t i e n t s .

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

19/34

US 6 , 5 6 9 , 6 6 1 B1

5

F I G . 5

d e m o n s t r a t e s u r i n a r y GAG e x c r e t i o n

d u r i n g

e n z y m e t h e r a p y .

F I G . 6 d e m o n s t r a t e s elbow and knee e x t e n s i o n i n

HAC002 d u r i n g

e n Z y m e

t h e r a p y .

F I G . 7 d e m o n s t r a t e s s h o u l d e r ?exion o 104 Weeks i n

f o u r

p a t i e n t s

W i t h

t h e

m o s t

r e s t r i c t i o n

d u r i n g

e n Z y m e

t h e r a p y .

F I G . 8 d e m o n s t r a t e s

i m p r o v e m e n t

i n s l e e p a p n e a b e f o r e

a n d

a f t e r s i x Weeks

o f t h e r a p y .

F I G .

9

d e m o n s t r a t e s t h e improvement

i n

a p n e a s a n d

h y p o p n e a s d u r i n g s l e e p

W i t h

e n Z y m e t h e r a p y

i n

e a c h

i n d i

v i d u a l p a t i e n t .

F I G .

1 0

d e m o n s t r a t e s

t h e

i m p r o v e m e n t i n p u l m o n a r y

f u n c t i o n t e s t s

b e f o r e and a f t e r 12

and 52

Weeks o f

enZyme

t h e r a p y

i n o n e p a t i e n t .

F I G . 1 1 d e m o n s t r a t e s

i n c r e a s e d

h e i g h t g r o W t h v e l o c i t y

W i t h enZyme t h e r a p y .

F I G . 1 2 s h o W s

t h e

d e g r e e

o f

c o n t a m i n a t i o n

by C h i n e s e

H a m s t e r

O v a r y P r o t e i n (CHOP)

a n d d e g r e e

o f p u r i t y

o f

o t - L - i d u r o n i d a s e ,

p r o d u c e d

b y ( 1 ) t h e

C a r s o n m e t h o d , a n

u n p u b l i s h e d

p r i o r

p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n

p r o c e s s

( U S .

p a t e n t

a p p l i c a t i o n S e r . N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9

a n d 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 a n d

( 2 )

t h e

G a l l i m e t h o d ,

t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n p r o c e s s o f

t h e p r e s e n t i n v e n t i o n . T h u s ,

F I G .

1 2 shoWs t h a t o t - L

i d u r o n i d a s e p r o d u c e d

a n d

p u r i ? e d b y

t h e

G a l l i m e t h o d h a s

a h i g h e r d e g r e e

o f p u r i t y

a n d l o W e r d e g r e e o f

CHOP

c o n t a m i n a t i o n i n

c o m p a r i s o n

t o

t h a t

o f

t h e C a r s o n m e t h o d .

DETAILED

DESCRIPTION

OF THE

INVENTION

I n one a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a method

t o

p r o d u c e


i n

a m o u n t s W h i c h e n a b l e u s i n g t h e

enZyme

t h e r a p e u t i c a l l y .

I n g e n e r a l ,

t h e

m e t h o d

f e a t u r e s

t r a n s f o r m i n g a s u i t a b l e

c e l l

l i n e W i t h t h e cDNA n c o d i n g f o r

a l l o f o t - L - i d u r o n i d a s e o r

a b i o l o g i c a l l y

a c t i v e

fragment

o r

mutant

t h e r e o f . Those o f

s k i l l i n t h e a r t m a y

p r e p a r e e x p r e s

s i o n c o n s t r u c t s o t h er t h a n t h o s e e x p r e s s l y d e s c r i b e d h e r e i n

f o r o p t i m a l p r o d u c t i o n

o f


i n s u i t a b l e

c e l l

l i n e s t r a n s f e c t e d t h e r e W i t h .

M o r e o v e r ,

s k i l l e d a r t i s a n s may

e a s i l y

d e s i g n f r a g m e n t s o f cDNA e n c o d i n g b i o l o g i c a l l y

a c t i v e f r a g m e n t s

a n d

m u t a n t s o f t h e n a t u r a l l y o c c u r r i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e Which p o s s e s s t h e

same o r

s i m i l a r

b i o l o g i

c a l a c t i v i t y t o t h e n a t u r a l l y

o c c u r r i n g f u l l - l e n g t h e n Z y m e .

To c r e a t e a recombinant

source

f o r o t - L - i d u r o n i d a s e , a

l a r g e s e r i e s o f

e x p r e s s i o n

v e c t o r s may b e c o n s t r u c t e d

a n d

t e s t e d f o r

e x p r e s s i o n o f

a o t - L - i d u r o n i d a s e c DNA.

Based

on

t r a n s i e n t

t r a n s f e c t i o n

experiments,

a s

Well

a s s t a b l e

t r a n s f e c t i o n s ,

a n e x p r e s s i o n

c o n s t r u c t m a y b e i d e n t i ? e d

t h a t

p r o v i d e s a p a r t i c u l a r l y

h i g h

l e v e l o f e x p r e s s i o n . I n

o n e

embodiment o f t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ,

a C h i n e s e h a m s t e r c e l l

l i n e 2 . 1 3 1 d e v e l o p e d

b y

t r a n s f e c t i o n o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e

e x p r e s s i o n c o n s t r u c t a n d

s e l e c t i o n

f o r a h i g h e x p r e s s i o n

c l o n e

p r o v i d e s p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l e x p r e s s i o n . S u c h a

C h i n e s e h a m s t e r c e l l l i n e

a c c o r d i n g t o t h i s

embodiment

o f

t h e


may s e c r e t e

a b o u t 5 , 0 0 0 t o 7 , 0 0 0 f o l d

more


t h a n

n o r m a l . The o t - L - i d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

t h e r e b y

may b e

p r o p e r l y p r o c e s s e d , t a k e n

u p i n t o

c e l l s

W i t h

h i g h

a f ? n i t y

a n d

i s c o r r e c t i v e

f o r o t - L - i d u r o n i d a s e

d e ? c i e n t c e l l s , s u c h a s t h o s e f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n g

f r o m

H u r l e r s

S y n d r o m e .

The method

f o r

p r o d u c i n g


i n

amounts

t h a t e n a b l e

u s i n g

t h e enZyme t h e r a p e u t i c a l l y f e a t u r e s

a

p r o d u c t i o n p r o c e s s s p e c i ? c a l l y d e s i g n e d

t o

m a s s

p r o d u c e

c o m m e r c i a l g r a d e e n Z y m e , W h e r e i n t h e q u a l i t y o f t h e

enZyme h a s

b e e n

deemed a c c e p t a b l e

f o r

a d m i n i s t r a t i o n t o

humans b y

r e g u l a t o r y

a u t h o r i t i e s o f v a r i o u s c o u n t r i e s .

The

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

6

l a r g e

s c a l e

p r o d u c t i o n o f

c o m m e r c i a l

g r a d e enZyme n e c e s

s i t a t e s m o d i ? c a t i o n s

o f

t h e c e l l c u l t u r e s c a l e ,

m i c r o c a r r i e r

s y s t e m s ,

a n d

p u r i ? c a t i o n

scheme.

I n p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s , t h e c e l l c u l t u r e

s c a l e i s

i n c r e a s e d

f r o m 4 5

l i t e r s t o

110

l i t e r s o r more, With a

change

t o continuous

p e r f u s i o n .

The

i n c r e a s e

i n

s c a l e

i s

n e c e s s a r y

t o

p r o d u c e

s u f ? c i e n t m a t e r i a l

f o r p o t e n t i a l l a r g e s c a l e

p r o d u c t i o n

f o r

l o n g t e r m p a t i e n t u s e . A c c o r d i n g t o

p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s

of

such a process, microcarriers a r e

used

a s a l o W c o s t

s c a l a b l e s u r f a c e on Which

t o groW

a d h e r e n t c e l l s . I n p a r

t i c u l a r l y p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , s u c h m i c r o c a r r i e r s a r e

m a c r o p o r o u s

a n d

a r e

s p e c i ? c a l l y

composed o f modi?ed

c a r b o h y d r a t e s s u c h a s c e l l u l o s e , e . g . , C y t o p o r e b e a d s manu

f a c t u r e d

b y P h a r m a c i a .

M a c r o p o r o u s

c e l l u l o s e


a l l o W

i m p r o v e d c e l l

a t t a c h m e n t a n d p r o v i d e a l a r g e r

s u r f a c e

a r e a f o r

a t t a c h m e n t ,

Which s

e x p e c t e d t o

y i e l d

a n i n c r e a s e d

c e l l

d e n s i t y

d u r i n g t h e c u l t u r e p r o c e s s .

H i g h e r

c e l l d e n s i t i e s

a r e e x p e c t e d t o

i n c r e a s e

p r o d u c t i v i t y . I n

p r e f e r r e d


h e p a r i n - S e p h a r o s e a n d S e p h a c r y l 2 0 0

c o l

umns

a r e

r e p l a c e d

W i t h B l u e - S e p h a r o s e

a n d

Copper

c h e l a t

i n g c o l u m n s

t o i n c r e a s e t h e c a p a c i t y

o f

t h e l a r g e s c a l e

p u r i ? c a t i o n p r o c e s s a n d t o i m p r o v e

t h e p u r i t y

o f

t h e

p r o d u c t .

I n

a p a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t ,

t h e

c o p p e r c h e l a t i n g

column

s u s e d

t o

r e d u c e

C h i n e s e h a m s t e r o v a r y

c e l l

p r o t e i n

c o n t a m i n a n t s

t o

v e r y

loW

l e v e l s a p p r o p r i a t e

f o r l a r g e s c a l e

d i s t r i b u t i o n . U s i n g e m b o d i m e n t s o f t h e p r e s e n t m e t h o d

f e a t u r i n g m o d i ? c a t i o n s

a n d

i n d u c t i o n d e s c r i b e d b e l o W ,

a p p r o x i m a t e l y 1 5 mg e r l i t e r o f c u l t u r e p e r

d a y ,

o r more

a t

p e a k c u l t u r i n g

d e n s i t y c a n b e

p r o d u c e d

s t a r t i n g W i t h a 1 1 0

l i t e r c u l t u r e

s y s t e m .

A c c o r d i n g t o o t h e r p r e f e r r e d

e m b o d i m e n t s

o f t h e

method

f o r

p r o d u c i n g

o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n , a c u l t u r e system i s

o p t i m i Z e d .

I n a ? r s t

e m b o d i m e n t ,

t h e c u l t u r e

p H

s

l o W e r e d

t o

a b o u t

6 . 5

t o 7 . 0 ,

p r e f e r a b l y t o a b o u t 6 . 7 7 . 0 d u r i n g

t h e

p r o d u c t i o n p r o c e s s .

One a d v a n t a g e o f s u c h a p H i s t o e n h a n c e a c c u m u l a t i o n o f

lysosomal enZymes t h a t a r e more s t a b l e a t

a c i d i c

pH. I n a

second embodiment, a s m a n y a s 2 t o

3 . 5

c u l t u r e volumes

o f

t h e

medium may b e c h a n g e d d u r i n g

e a c h 2 4 - h o u r

p e r i o d b y

c o n t i n u o u s p e r f u s i o n .

One a d v a n t a g e o f

t h i s

p r o c e d u r e

i s

t o

enhance t h e

s e c r e t i o n r a t e o f r e c o m b i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e

and

t o

c a p t u r e more

a c t i v e

enZyme. I n a t h i r d embodiment,

oxygen s a t u r a t i o n i s

o p t i m i Z e d

a t

a b o u t

40 . I n a f o u r t h

e m b o d i m e n t , m a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s

W i t h

a b o u t 5

serum i n i t i a l l y i n t h e medium, a r e used t o produce a c e l l

mass

f o l l o W e d

by a r a p i d Washout s h i f t t o a p r o t e i n - f r e e

medium

f o r p r o d u c t i o n ( F I G. 3 ) .

I n

a ? f t h e m b o d i m e n t , a

p r o t e i n - f r e e

g r o W t h

medium,

s u c h

a s a

JRH

B i o s c i e n c e s

PF-CHO r o d u c t , may e o p t i m i Z e d t o i n c l u d e s u p p l e m e n t a l

amounts of one

o r

more i n g r e d i e n t s s e l e c t e d

from

t h e

group

c o n s i s t i n g o f :

g l u t a m a t e , a s p a r t a t e ,

g l y c i n e , r i b o n u c l e o s i d e s

and

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s . I n a

s i x t h

embodiment, a s

m a n y

a s

2 t o

3 . 5 c u l t u r e volumes o f t h e

medium

m a y

be

changed

d u r i n g

e a c h

2 4 - h o u r p e r i o d b y

c o n t i n u o u s

p e r f u s i o n .

S u c h

an i n d u c t i o n p r o c e s s

m a y

p r o v i d e a b o u t

a

t W o - f o l d i n c r e a s e

i n p r o d u c t i o n W i t h o u t

s i g n i ? c a n t l y a l t e r i n g p o s t

t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g .

P a r t i c u l a r l y

p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f

t h e

m e t h o d f o r

p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g

t o

t h e

p r e s e n t i n v e n

t i o n f e a t u r e o n e , more t h a n o n e ,

o r

a l l o f

t h e

o p t i m i Z a t i o n s

d e s c r i b e d h e r e i n and m a y b e employed a s d e s c r i b e d

i n

more

d e t a i l

b e l o W .

The

p r o d u c t i o n

method

o f

t h e

p r e s e n t

i n v e n

t i o n m a y , t h e r e f o r e ,

p r o v i d e

a

p r o d u c t i o n c u l t u r e

p r o c e s s

h a v i n g

t h e

f o l l o W i n g f e a t u r e s :

1 .

A m i c r o c a r r i e r b a s e d

c u l t u r e u s i n g

m a c r o p o r o u s

m i c r o

c a r r i e r

beads m a d e o f modi?ed c e l l u l o s e o r a n

e q u i v a l e n t

t h e r e o f i s p r e f e r a b l y

u s e d i n

l a r g e s c a l e c u l t u r e ? a s k s

W i t h

8/10/2019 US 6,569,661-Abr 20

20/34

US 6 , 5 6 9 , 6 6 1 B1

7

o v e r h e a d s t i r r i n g o r

a n e q u i v a l e n t t h e r e o f . Attachment o f

c e l l s t o t h e s e b e a d s m a y e

a c h i e v e d

by c u l t u r e i n a

5 e t a l

bovine

serum

may

be added

t o

DME/F12

: 1

o r

a

p r o t e i n

f r e e medium modi?ed W i t h i n g r e d i e n t s i n c l u d i n g

r i b o n u c l e o s i d e s , d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s , p y r u v a t e , n o n

e s s e n t i a l

a m i n o

a c i d s ,

a n d

HEPES.

A f t e r

a b o u t

3 6

d a y s

i n

t h i s medium, a W a s h o u t p r o c e d u r e i s b e g u n i n W h i c h


e p l a c e s

t h e s e r u m - c o n t a i n i n g medium

a t a n i n c r e a s i n g p e r f u s i o n r a t e d e p e n d e n t

on t h e

g l u c o s e

c o n t e n t

a n d

c u l t u r e c o n d i t i o n . S u b s e q u e n t l y , a n d

t h r o u g h o u t

t h e e n t i r e

r e m a i n i n g

c u l t u r e

p e r i o d ,

t h e

c e l l s

a r e c u l t i v a t e d

i n

a p r o t e i n - f r e e

medium.

The

u s e o f

a p r o t e i n - f r e e

medium

i n

enZyme

p r o d u c t i o n

i s

b e n e ? c i a l i n r e d u c i n g t h e e x p o s u r e

r i s k o f

b o v i n e

s p o n g i f o r m e n c e p h a l o p a t h y ( B S E ) a n d o t h e r

i n f ec t i o u s b i o l o g i c a g e n t s s u c h

a s

v i r u s e s t o

p a t i e n t s

b e i n g

t r e a t e d W i t h t h e enZyme, Wherein t h e r i s k

o f

BSE

r

o t h e r

h a r m f u l a g e n t s

i s d e p e n d e n t on t h e

amount o f p o t e n t i a l

s e r u m

e x p o s u r e .

I n p r i o r p u b l i s h e d s t u d i e s , t h e c a r r i e r s u s e d

t o groW t h e

c e l l s Were b o v i n e

g e l a t i n

m i c r o c a r r i e r s , u s e d a t

1

gram

p e r

l i t e r

o r

100

t i m e s

t h e

p r o d u c t

c o n c e n t r a t i o n .

L e a c h i n g

o f 1 o f t h e

g e l a t i n

p r o t e i n f r o m t h e


Would

r e p r e s e n t

a

r e l a t i v e 100 c o n t a m i n a t i o n a n d

t h e r e b y

c o n t r i b u t e t o t h e r i s k

o f

BSE.

Thus,

n e W c a r r i e r s a r e e i t h e r

d e x t r a n

o r

c e l l u l o s e - b a s e d

a n d c o n s i s t

o f c a r b o h y d r a t e s, and

n o t

a n i m a l - d e r i v e d m a t e r i a l s .

F I G .

3

shoWs t h a t t h e c e l l s a r e groWn

t o

a d e n s i t y i n 5

serum

c o n t a i n i n g

medium a n d

t h e n s W i t c h e d

W i t h o u t

any

a d a p t a t i o n t o

a

p r o t e i n - f r e e medium.

F I G . 3

s p e c i ? c a l l y

shoWs

t h a t :

1 ) C e l l s

s u r v i v e

a n d

c o n t i n u e

t o

p r o d u c e

i d u

r o n i d a s e When s h i f t e d W i t h o u t

a d a p t a t i o n .

I n c o n t r a s t , o t h e r

s t u d i e s

Would s u g g e s t

t h a t a d a p t a t i o n t o a p r o t e i n - f r e e

medium s

n e c e s s a r y .

I n t h e method

o f

t h e p r e s e n t

i n v e n t i o n ,

enZyme p r o d u c t i o n

c o n t i n u e s

a t l e v e l s c o m p a r a b l e t o serum

c o n t a i n i n g

m e d i u m .

2 )

o t - L - I d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

i n a


r e t a i n s a

l e v e l o f

p r o d u c t i o n i n e x c e s s

o f 4 mg

e r

l i t e r o r

1 , 0 0 0 u n i t s

p e r m l . 3 )

o t - L - I d u r o n i d a s e

p r o d u c e d

i n

a p r o t e i n - f r e e medium h a s

h i g h u p t a k e i n d i c a t

i n g

t h a t

t h e

s h i f t i n medium a n d , h e n c e , a s h i f t i n c a r b o h y

d r a t e s b e i n g

f e d

t o

c e l l s , d o e s n o t

a d v e r s e l y

a f f e c t

t h e

h i g h

u p t a k e

c h a r a c t e r o f t h e

e n Z y m e .

E i g h t l o t s o f o t - L

i d u r o n i d a s e

h a v e

been p r o d u c e d

a n d r e l e a s e d i n

t h i s

manner

W i t h a n u p t a k e h a l f

maximal

v a l u e

o f l e s s t h a n 2 nM

n

a l l

l o t s .

2 . The c u l t u r e

c o n d i t i o n s

a r e

p r e f e r a b l y

maintained a t a

d i s s o l v e d oxygen

o f

4 0

o f

a i r s a t u r a t i o n a t

a pH

f

a b o u t

6 . 8 7 . 0

and a t

a t e m p e r a t u r e o f

a b o u t 3537

C .

T h i s m a y

b e a c h i e v e d u s i n g a

c o n t r o l

u n i t , m o n i t o r i n g u n i t

a n d

a p p r o

p r i a t e

p r o b e s s u c h

a s

t h o s e

p r o d u c e d

b y A p p l i k o n

o r

M e t t l e r .

H o W e v e r ,

s k i l l e d

a r t i s a n s

W i l l r e a d i l y a p p r e c i a t e

t h a t t h i s c a n e a s i l y

b e

a c h i e v e d

by

e q u i v a l e n t

c o n t r o l

s y s

t e m s p r o d u c e d

by

o t h e r m a n u f a c t u r e r s . An

i r s a t u r a t i o n

o f

a b o u t 4 0

r e s u l t s i n i m p r o v e d

o t - L - i d u r o n i d a s e s e c r e t i o n

t h o u g h

up t o 80 i r s a t u r a t i o n may b e u s e d .

HoWever,

f u r t h e r

i n c r e a s e s i n

oxygen t o , f o r

e x a m p l e , 90 a i r

s a t u r a t i o n ,

d o n o t

p r o v i d e

s i g n i ? c a n t l y

e n h a n c e d

s e c r e t i o n

o v e r 80 a i r s a t u r a t i o n . The d i s s o l v e d oxygen m ay be

s u p p l i e d b y i n t e r m i t t e n t o r c o n t i n u o u s o x y g e n s p a r g i n g

u s i n g a 5

micron

s t a i n l e s s s t e e l

o r

l a r g e r o p e n i n g

s p a r g e r , o r

e q u i v a l e n t

t h e r e o f .

ApH

f a b o u t 6 . 8 7 . 0

i s

o p t i m a l f o r

t h e

a c c u m u l a t i o n o f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme.

The

enZyme

i s p a r t i c u l a r l y

u n s t a b l e

a t pHs a b o v e a b o u t 7 . 0 . BeloW a p H

o f a b o u t

6 . 7 ,

t h e

s e c r e t i o n

r a t e

may

d e c r e a s e ,

p a r t i c u l a r l y

beloW

a

pH

f a b o u t

6 . 5 . The

c u l t u r e

i s t h e r e f o r e

m a i n t a i n e d

o p t i m a l l y b e t W e e n a

p H o f

a b o u t 6 . 8 7 . 0 .

3 .

The

p r o d u c t i o n

c u l t u r e medium m a y

b e a

modi?ed

f o r m o f t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p r o p r i e t a r y medium

from JR i o s c i e n c e s

c a l l e d E x c e l l PF CHO.

T h i s

medium

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

8

s u p p o r t s l e v e l s

o f

s e c r e t i o n

e q u i v a l e n t

t o t h a t

o f

serum

u s i n g

a c e l l l i n e

such a s t h e 2 . 1 3 1

c e l l

l i n e .

I t

m a y be p r e f e r a b l y

modi?ed t o

i n c l u d e

a n a c i d i c

p H

o f

a b o u t 6 . 8 7 . 0 ( 1 0 . 1 ) ,

and

u f f e r e d With

HEPES

t 7 . 5 mM r 15 mM. h e medium

m a y c o n t a i n

0 . 0 5

t o 0.1

o f

P l u r o n i c s

F - 6 8

(BASF),

a

n o n - i o n i c

s u r f a c t a n t o r

a n

e q u i v a l e n t t h e r e o f

Which

f e a t u r e s

t h e a d v a n t a g e

o f

p r o t e c t i n g c e l l s f r o m s h e a r f o r c e s a s s o c i

a t e d

W i t h

s p a r g i n g . The

medium may f u r t h e r c o n t a i n a

p r o p r i e t a r y

s u p p l e m e n t

t h a t

i s

i m p o r t a n t i n i n c r e a s i n g

t h e

p r o d u c t i v i t y

o f t h e medium o v e r

o t h e r

p r o t e i n - f r e e media

t h a t a r e p r e s e n t l y a v a i l a b l e . Those s k i l l e d

i n

t h e a r t W i l l

r e a d i l y u n d e r s t a n d t h a t t h e c h o i c e o f c u l t u r e medium may e

o p t i m i Z e d

c o n t i n u a l l y a c c o r d i n g t o p a r t i c u l a r

c o m m e r c i a l

e m b o d i m e n t s a v a i l a b l e a t p a r t i c u l a r p o i n t s i n t i m e . S u c h

c h a n g e s

encompass

no more t h a n r o u t i n e e x p e r i m e n t a t i o n

and a r e i n t e n d e d

t o

be W i t h i n t h e s c o p e o f t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n .

4 .

The

p r o d u c t i o n

medium

may

b e a n a l y Z e d

u s i n g a n

a m i n o a c i d a n a l y Z e r c o m p a r i n g

s p e n t

medium

W i t h s t a r t i n g

medium.

Such a n a l y s e s h a v e

d e m o n s t r a t e d

t h a t t h e 2 . 1 3 1

c e l l

l i n e d e p l e t e s

a s t a n d a r d PF

CHO

medium

o f

g l y c i n e ,

g l u t a m a t e a n d a s p a r t a t e t o a l e v e l o f a r o u n d 1 0

o f

t h e

s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o n

o f

t h e s e a m i n o

a c i d s

t o h i g h e r l e v e l s may e s u l t i n

e n h a n c e d

c u l t u r e d e n s i t y

a n d

p r o d u c t i v i t y

t h a t may

l e a d

t o

a

23 f o l d h i g h e r p r o d u c

t i o n t h a n

a t

b a s e l i n e . S k i l l e d a r t i s a n s W i l l a p p r e c i a t e t h a t

o t h e r

c e l l

l i n e s

W i t h i n t h e s c o p e o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n

may

b e e q u a l l y u s e f u l

f o r


t o t h e

p r e s e n t m e t h o d . Hence,

more

o r

l e s s s u p p l e m e n t a l

n u t r i e n t s may b e r e q u i r e d t o o p t i m i Z e t h e medium. Such

o p t i m i Z a t i o n s a r e i n t e n d e d

t o

be W i t h i n t h e s c o p e o f t h e


a n d may b e p r a c t i c e d

W i t h o u t

u n d u e

e x p e r i m e n t a t i o n .

5 .

The

medium

may

b e su p p l e m e n t e d

W i t h

t h e f o u r

r i b o n u c l e o s i d e s a n d

f o u r

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s e a c h a t

a b o u t 1 0 m g / l i t e r t o s u p p o r t t h e d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e

d e ? c i e n t

c e l l l i n e

2 . 1 3 1 .

S k i l l e d a r t i s a n s W i l l

a p p r e c i a t e

t h a t

o t h e r

c e l l

l i n e s

W i t h i n

t h e

s c o p e o f

t h e


may

b e e q u a l l y u s e f u l

f o r


t o

t h e

p r e s e n t

method. Hence,

more o r

l e s s r i b o n u c l e o s i d e s

a n d

d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s

may b e r e q u i r e d

t o

o p t i m i Z e

t h e

medium,

a n d a l t e r n a t i v e

s o u r c e s o f p u r i n e s

a n d p y r m i d i n e s

f o r

n u c l e i c

a c i d

s y n t h e s i s

may e u s e d s u c h a s h y p o x a n t h i n e

a n d t h y m i d i n e . Such o p t i m i Z a t i o n s

a r e

i n t e n d e d W i t h i n t h e

s c o p e

o f

t h e

p r e s e n t

i n v e n t i o n

a n d may b e

p r a c t i c e d

W i t h o u t

u n d u e e x p e r i m e n t a t i o n .

6 . A f t er r e a c h i n g c o n ? u e n c e a t

a b o u t

3 6 d a y s o f c u l t u r e ,

a n

i n c r e a s i n g

r a t e

o f c o n t i n u o u s

p e r f u s i o n

i s

i n i t i a t e d . A

c h a n g e

o f

medium may

e

a c c o m p l i s h e d , f o r e x a m p l e , u s i n g

a s l a n t

f e e d t u b e c o n s t r u c t e d and p o s i t i o n e d t o

a l l o W t h e

u p t a k e

o f

medium W i t h o u t removal

o f

t h e m i c r o c a r r i e r s e v e n

W h i l e t h e c u l t u r e i s s t i r r e d . By pumping o u t medium t h r o u g h

t h e s l a n t f e e d t u b e , m i c r o c a r r i e r s s e t t l e W i t h i n t h e body o f

t h e

t u b e

i n s i d e t h e c u l t u r e

and

a r e n o t removed

from t h e

c u l t u r e d u r i n g t h e

c h a n g e

o n medium. I n

t h i s

m a n n e r , t h e

m i c r o c a r r i e r s W i t h t h e c e l l mass

a r e

s e p a r a t e d from s u p e r

n a t a n t c o n t a i n i n g t h e

e n Z y m e .

7 . The r a p i d

a n d f r e q u e n t

t u r n o v e r

o f t h e medium

h a s

b e e n

shoWn b y p r o d u c t i v i t y

s t u d i e s

t o r e s u l t i n

i m p r o v e d

o v e r a l l c o l l e c t i o n o f enZyme

from t h e

c e l l c u l t u r e . L e s s

t u r n o v e r o f

medium r e s u l t s

i n l e s s t o t a l p r o d u c t i o n o f

enZyme on

a

d a i l y

b a s i s .

U s i n g

t h e

p e r f u s i o n o f 2 3 . 5

c u l t u r e volumes

p e r d a y ,

t h e

c e l l s

may b e m a i n t a i n e d

i n

e x c e l l e n t

c o n d i t i o n W i t h h i g h

d e g r e e s o f i a b i l i t y a n d a h i g h

l e v e l

o f

p r o d u c t i v i t y .

8 . P r o d u c t i o n

o f o t - L - i d u r o n i d a s e

may e e n h a n c e d by t h e

u s e o f

s o d i u m b u t y r a t e

i n d u c t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n ( F I G .

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