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Untersuchungen zur tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-
Biosynthese in Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt am
Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie
von
Stephan Pollmann
aus
Gelsenkirchen
Bochum 2002
Für Maria
Gutachter:
Prof. Dr. E.W. Weiler
PD. Dr. J.-D. Schwenn
Tag der Abgabe der Arbeit: 07.10.2002
Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2002
Inhalt
I
Inhaltsverzeichnis I
Abbildungsverzeichnis VI
Tabellenverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis IX
1 Einleitung 1
2 Material und Methoden 10 2.1 Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien 10
2.1.1 Geräte 10
2.1.2 Verbrauchsmaterialien 12
2.1.3 Fein- und Radiochemikalien 13
2.2 Enzyme und Antikörper 15
2.2.1 Enzyme 15
2.2.2 Antikörper 15
2.3 Nukleinsäuren 16
2.3.1 Oligonukleotide 16
2.3.2 Plasmid-Vektoren 17
2.4 Biologisches Material 17
2.4.1 Bakterienstämme 17
2.4.2 Pflanzenmaterial 18
2.5 Anzucht und Lagerung des biologischen Materials 18
2.5.1 Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien 18
2.5.2 Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von Proteinen 18
2.5.3 Anzucht nicht steriler Pflanzen 19
2.5.4 Sterilisation des Saatguts 19
2.5.5 Aussaat und Anzucht auf Festmedium 19
2.6 Molekularbiologische Methoden 20
2.6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli 20
2.6.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen 20
2.6.3 Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren 20
2.6.4 Erzeugung von komplementärer DNA 21
2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion 21
2.6.6 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren 21
2.6.7 Sequenzierung doppelsträngiger DNA 21
2.7 Biochemische Methoden 22
2.7.1 Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin 22
Inhalt
II
2.7.2 Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan 22
2.7.3 Synthese von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 23
2.7.4 Synthese von [2H]5-Indol-3-acetamid 24
2.7.5 Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose 25
2.8 Präparationsmethoden 25
2.8.1 Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His)6-Fusions-proteine 25
2.8.2 Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase 26
2.8.3 Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium 27
2.8.4 Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte 27
2.8.5 Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe 27
2.9 Enzymatische Analysen 28
2.9.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter Ami- dase 28
2.9.2 Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels Hoch-leistungsflüssigkeitschromatographie 28
2.9.3 Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Protein- extrakten 29
2.9.4 Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen 29
2.9.5 Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität 30
2.9.6 Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Proteinextrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik 30
2.10 Chromatographische Trenntechniken 31
2.10.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 31
2.10.1.1 Präparative Reinigung von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan 31
2.10.1.2 Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanzgemischen 31
2.10.2 Flüssigkeitschromatographie 31
2.10.2.1 Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit 32
2.10.2.2 High Q-Anionenaustauschchromatographie 32
2.10.2.3 Hochdruckgelpermeationschromatographie 32
2.10.2.4 Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose 33
2.10.2.5 Affinitätschromatographische Reinigung von (His)6-Fusionsproteinen 33
2.10.2.6 Immunaffinitätschromatographie 33
2.11 Massenspektrometrie 34
2.11.1 Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters 34
2.11.2 Synthese von Diazomethan 34
Inhalt
III
2.11.3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid 34
2.11.4 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von Indol-3-essigsäure 34
2.11.5 Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-massen-spektrometrischer Methoden 35
2.11.6 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie 36
2.12 Elektrophoretische Trenntechniken 36
2.12.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 36
2.12.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37
2.12.3 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37
2.12.4 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese 38
2.12.5 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle 38
2.13 Immunologische Methoden 39
2.13.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose 39
2.13.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine 39
2.13.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren 40
2.13.4 Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine 40
2.13.5 Reinigung spezifischer Antikörper 40
2.14 Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-tryptophan und [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 41
2.15 Proteinbestimmung 41
2.16 Radioaktivitätsbestimmung 41
2.17 Rechnergestützte Sequenzanalysen 42
2.18 Auswertung 42
3 Ergebnisse 43 3.1 Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen-
spezies 43
3.2 Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Proteinfraktion aus Arabidopsis thaliana 44
3.2.1 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromatographie an Hydroxyapatit 45
3.2.2 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels High Q-Anionenaustauschchromatographie 46
3.2.3 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeationschromatographie 47
3.2.4 Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 48
Inhalt
IV
3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktionen durch native Gelelektrophorese 49
3.3.1 Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradientengele 49
3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels „Blau-Nativer“ Gelelektrophorese 51
3.4 Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der tryptophan-abhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese 54
3.4.1 Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur heterologen Expression eines (His)6-YUCCA-Fusionsproteins 55
3.4.2 Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine 58
3.4.3 Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt 59
3.4.4 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung von α-YUCCA-Antikörpern 60
3.5 Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-essigsäure-Biosynthese 62
3.5.1 Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Syn- thase-Aktivität 62
3.5.2 Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-Biosynthese 63
3.5.3 Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch Indol-3- acetamid 64
3.5.4 Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid 65
3.5.5 Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-Umsatz von Indol-3-acetamid zur Indol-3-essigsäure 68
3.5.6 Stereoselektivität der Indol-3-acetamid Synthese 70
3.6 Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 72
3.6.1 Endogener Indol-3-acetamid-Gehalt in sterilen Arabidopsis thaliana-Keim-lingen 72
3.6.2 Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion 74
3.7 Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis thaliana 76
3.7.1 Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-Hydro- lasen aus pflanzenpathogenen Bakterien 77
3.7.2 Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana 78
3.7.3 Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur heterologen Expression von Amidase-Proteinen 80
3.8 Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidasen aus Arabidopsis thaliana 84
3.8.1 Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusionsproteine 85
Inhalt
V
3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase 1 87
3.8.3 Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-Fusionsproteins 88
3.8.4 Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis thaliana 90
3.8.5 Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an Hydroxyapatit 92
3.9 Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 92
3.9.1 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung der α-AMI-Seren 93
3.9.2 Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes 95
3.10 Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essigsäure-Synthase 97
3.10.1 Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [3H]3-6-Azido- L-tryptophan 97
3.10.2 Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [3H]2-6-Azido- indol-3-acetamid 98
4 Diskussion 101
5 Zusammenfassung 121
6 Literaturverzeichnis 124
Anhang 141
Danksagung 145
Lebenslauf 146
Abbildungen
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Vereinfachtes Modell der Indol-3-essigsäure-Homöostase 2
Abb. 1.2: Mögliche Reaktionssequenzen zur tryptophan-abhängigen Indol-3- essigsäure-Biosynthese 5
Abb. 3.1: Spezifische Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen- spezies 44
Abb. 3.2: Chromatographie von Arabidopsis thaliana-Proteinextrakten an einer Hydroxyapatit-Matrix 45
Abb. 3.3: Anionenaustauschchromatographie an High Q-Matrix 46
Abb. 3.4: Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der IES-Synthase-Komplexes mittels Hochdruckgelpermeationschromatographie 48
Abb. 3.5: Strukturformel des synthetisierten Tryptophan-Konjugates 49
Abb. 3.6: Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen einer angereicherten Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktion 50
Abb. 3.7: Gelelektrophoretische Präparation einer angereicherten Enzymfraktion zur Mikrosequenzierung putativer Indol-3-essigsäure-Synthase-Komponenten 52
Abb. 3.8: Aminosäuresequenzvergleich der putativen Auxinbindestelle (BoxA) 54
Abb. 3.9: Strategie zur Klonierung (His)6-markierter YUCCA-Fusionsproteine 55
Abb. 3.10: Proteolytischer Abbau rekombinanter YUCCA-Proteine 56
Abb. 3.11: Affinitätschromatographische Reinigung bakteriell exprimierter, N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine an Ni-NTA-Agarose 57
Abb. 3.12: Reinigung von des bakteriell exprimierten YUCCA-Proteins zur Herstel- lung polyklonaler Antikörper 58
Abb. 3.13: Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt 60
Abb. 3.14: Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität im Überstand nach Immun- präzipitation mit spezifisch gereinigten α-YUCCA-Antikörpern 61
Abb. 3.15: Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure- Synthase-Aktivität 63
Abb. 3.16: Einfluß von Indol-3-acetamid auf die in-vitro-Umsetzung von [2H]5-L- Tryptophan zu [2H]5-Indol-3-essigsäure 65
Abb. 3.17: Hochleistungsflüssigkeitschromatographische Trennung indolischer Verbindungen 66
Abb. 3.18: Massenspektrometrischer Nachweis der enzymatischen [2H]5-Indol-3- acetamid-Synthese durch Arabidopsis thaliana-Proteinextrakte 68
Abb. 3.19: Massenspektrometrische Analyse des enzymatisch synthetisierten [2H]5- Indol-3-acetamids 69
Abb. 3.20: Verdünnung des in-vitro-Umsatzes von markiertem Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure durch Tryptophan 70
Abbildungen
VII
Abb. 3.21: Untersuchungen zur Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthese 71
Abb. 3.22: Detektion endogener Indol-3-essigsäure- und Indol-3-acetamid-Gehalte in sterilen Arabidopsis thaliana-Keimlingen 73
Abb. 3.23: Umsatz von Indol-3-acetonitril durch die Nitrilasen 1 – 3 aus Arabidopsis thaliana 75
Abb. 3.24: Aminosäuresequenzvergleich von fünf Indol-3-acetamid-Hydrolasen pflan- zenpathogener Bakterien 77
Abb. 3.25: Aminosäuresequenzvergleich des katalytischen Zentrums der Amido- hydrolase aus Rhodococcus sp. mit den putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana 78
Abb. 3.26: Lokalisation und genomische Organisation des AMI1- und AMI2-Gens auf den Chromosomen I bzw. V von Arabidopsis thaliana 79
Abb. 3.27: Amplifikation der AMI1 und AMI2 cDNA mittels RT-PCR 81
Abb. 3.28: Klonierungsstrategie zur Herstellung C- bzw. N-terminal markierter Ami- dasen aus Arabidopsis thaliana 83
Abb. 3.29: Bakterielle Überexpression und affinitätschromatographische Reinigung Strep-markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana 84
Abb. 3.30: Substratspezifität der rekombinanten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana 86
Abb. 3.31: Amidase 1-Aktivität in Abhängigkeit von Substrat, pH-Wert, Temperatur und Proteingehalt 87
Abb. 3.32: „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese des bakteriell exprimier- ten Strep-AMI1-Fusionsproteins 89
Abb. 3.33: Präparation von Antigenen zur Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen die putative Amidase 2 aus Arabidopsis thaliana 90
Abb. 3.34: Immunologischer Nachweis der putativen Amidasen in Proteinextrakten aus Arabidopsis thaliana 91
Abb. 3.35: Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels polyklonaler Amidase-Antikörper 94
Abb. 3.36: Versuche zur Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter Verwendung spezifischer α-AMI1-Immunglobuline 95
Abb. 3.37: Gelelektrophoretische Darstellung der immunaffinitätschromatographisch isolierten Proteine aus Arabidopsis thaliana 96
Abb. 3.38: Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine mit [3H]3-6-Azido- L-tryptophan 97
Abb. 3.39: Photoaffinitätsmarkierung Indol-3-acetamid-bindender Proteine unter Einsatz des Radioliganden [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid 99
Abb. 4.1: Massenspektrometrische Analyse des Sauerstoffeinbaus im Zuge von Indol-3-essigsäure-Synthase katalysierter Indol-3-essigsäure-Biogenese 119
Abb. 4.2: Vorgeschlagener katalytischer Mechanismus bakterieller Amidasen 120
Tabellen
VIII
Tabellenverzeichnis
Tab. 3.1: Massenspektrometrische Identifizierung gelelektrophoretisch isolierter Proteine aus Arabidopsis thaliana 53
Tab. 3.2: Produktverhältnisse der Nitrilase 1 – 3 katalysierten Indol-3-acetonitril-Umsetzung 76
Tab. 3.3: Biochemische Charakterisierung der heterolog exprimierten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana 88
Tab. 3.4: Massenspektrometrische Identifizierung [3H]3-6-Azido-L-tryptophan- markierter Proteine aus Arabidopsis thaliana 98
Abkürzungen
IX
Abkürzungsverzeichnis
Bezüglich der Standardmaßeinheiten, sowie der Vorsilben für dezimale Vielfache und
Teile von Einheiten gelten die Konventionen der IUPAC. Daneben gelten, soweit im Text
nicht anders angegeben, die folgenden Abkürzungskonventionen:
A Ampere
Accession Datenbankeintrag (“Accession number”)
AMV “Avian Myeloblastosis Virus”
A. thaliana Arabidopsis thaliana
(d)ATP (Desoxy-)Adenosin-5’-triphosphat
bzw. beziehungsweise
Bq Becquerel
°C Grad Celsius; T(°C) = T(K) + 273.16 K
ca. circa
CaMV Blumenkohl-Mosaikvirus („Cauliflower mosaic virus“)
cDNA zur Boten-RNA komplementäre DNA („complementary DNA“)
CI chemische Ionisation
(d)CTP (Desoxy-)Cytidin-5’-triphosphat
Da Dalton, Maßeinheit für die Molmasse eines Proteins
DC Dünnschichtchromatographie
d.Th. der Theorie
DTT Dithiothreitol
E Einstein
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure
EGTA Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-tetraessigsäure
Fg Frischgewicht
FPLC Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie
g Gramm
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung g = 9.81 2smkg ⋅
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie
GC-MS/MS Gaschromatographie-Tandemmassenspektrometrie
Abkürzungen
X
(d)GTP (Desoxy-)Guanosin-5’-triphosphat
h Stunde
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie („High Performance Liquid Chromatography“)
IAM Indol-3-acetamid
IAN Indol-3-acetonitril
IAOx Indol-3-acetaldoxim
IES Indol-3-essigsäure
IgG Immunglobulin G
IPTG Isopropylthiogalaktosid
IUPAC International Union for Pure and Applied Chemistry
kbp Kilobasenpaare
KD Dissoziationskonstante
KPi-Puffer Kaliumphosphat-Puffer (K2HPO4 und KH2PO4)
L-Trp L-Tryptophan
M Molar
m Meter
m/z Masse:Ladungs-Verhältnis eines Ionenfragmentes; relative Massenangabe bei der Massenspektrometrie
M+1 Masse des Molekülions +1 bei der Massenspektrometrie
mbar Millibar; 1 mbar = 10² Pa
min Minute
mRNA Boten-RNA („messenger RNA“)
nt Nukleotide
OD600 optische Dichte bei der Wellenlänge 600 nm
p.A. pro analysis; Bezeichnung einer Substanz mit analytischem Reinheitsgrad
PCR Polymerase-Kettenreaktion
pH Logarithmus der H3O+-Ionenkonzentration in mol/l
pkat picokatal; 1 pkat = 1 s
pmol
PVP Polyvinylpyrrolidon
Rf relative Wanderungsgeschwindigkeit einer Fraktion bei einer Dünnschichtchromatographie bezogen auf die Laufmittelfront
RSA Rinderserumalbumin
RT Raumtemperatur
Abkürzungen
XI
Rt Retentionszeit einer Fraktion auf einer Chromatographiesäule
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SDS Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
s Sekunde
s.o. siehe oben
s.u. siehe unten
TAM Tryptamin
TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung
TFAA Trifluoressigsäureanhydrid
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan
Triton X Octylphenol-polyethylenglykolether
(d)TTP (Desoxy-)Thymidin-5’-triphosphat
u.a. unter anderem
üN über Nacht
upm Umdrehungen pro Minute
UV-VIS Spektralbereich ultravioletter und sichtbarer elektromagnetischer Strahlung
v/v Volumen pro Volumen
vgl. vergleiche
W Watt
w/v Gewicht pro Volumen
z.B. zum Beispiel
Einleitung
1
1 Einleitung
Pflanzen sind, als sessile Lebewesen, standortgebunden und somit darauf angewiesen,
Wachstum und Differenzierung interaktiv an gegebene Umweltbedingungen anzupassen.
Die besondere Anpassungsfähigkeit Höherer Pflanzen beruht neben dem Erhalt toti-
potenter Zellen auf der hohen physiologischen Variabilität ihres Stoffwechsels, welcher
durch das komplexe Zusammenspiel chemischer Botenstoffe reguliert wird. Diese als
Phytohormone bezeichneten pflanzlichen Signalstoffe entsprechen nicht in allen Belangen
der allgemeinen Definition für Hormone. Im Gegensatz zu tierischen Hormonen ist ihr
Syntheseort nicht zwangsläufig vom Wirkort getrennt. Zudem besitzen Phytohormone eine
weitaus geringere Spezifität als ihre tierischen Pendants. Die Wirkung dieser hormon-
ähnlichen Substanzen wird vielmehr durch ihre Konzentration, die Kompetenz des
reagierenden Gewebes und durch ihre Interaktion mit Wirkstoffen anderer Phytohormon-
gruppen bestimmt. Zu den klassischen Gruppen der Phytohormone werden Auxine,
Cytokinine, Gibberelline, Abscisinsäure und Ethylen gezählt. Hinzu kommen einige neue
Gruppen von pflanzlichen Signalstoffen, wie die Jasmonsäure und ihre Biosynthese-
vorstufen, die Brassinosteroide sowie einige Peptide, welche Analogien zu tierischen
Hormonen aufweisen (FARMER & RYAN, 1992; YOKOTA, 1997; BISSELING, 1999). Die
Phytohormone werden gruppenspezifisch nach ihren wachstumsfördernden bzw. wachs-
tumshemmenden Eigenschaften unterteilt (MOORE, 1989).
Der erste chemische Signalstoff, welcher in Höheren Pflanzen identifiziert werden konnte,
ist die Indol-3-essigsäure (IES), die zu den wachstumsfördernden Auxinen gezählt wird.
Die IES, als Hauptvertreter dieser Gruppe, hat eine zentrale Funktion bei der Regulation
nahezu aller pflanzlicher Wachstums- und Differenzierungsprozesse. Hierzu zählen die
Förderung von Streckungswachstum, kambialer Zellteilungsaktivität, Adventiv- und
Seitenwurzelbildung und apikaler Dominanz. Darüber hinaus beeinflussen die Auxine
photo- wie auch gravitrope Bewegungen, die Fruchtentwicklung sowie die Seneszenz
(THIMANN, 1977).
Neben diesen substanzspezifischen Eigenschaften zeigen sich Auxine in Interaktion mit
anderen Phytohormongruppen wie den Cytokininen (EKLÖF et al., 1997), der
Abscisinsäure (DUNLAP & BINZEL, 1996) oder Ethylen (ROMANO et al., 1993) für ein
weites Spektrum pflanzlicher Entwicklungsprozesse verantwortlich.
Einleitung
2
Auxine bewirken Veränderungen, die Zellteilungen, Zellelongationen oder Zell-
differenzierungen nach sich ziehen. Diese Veränderungen werden durch die Verschiebung
von Plasmamembranpotentialen, bewirkt durch die Regulation von H+-ATPasen und
Ionenkanälen, oder durch die Induktion von Transkriptionsfaktoren und damit verbundener
Genregulation realisiert (MACDONALD, 1997). Entscheidend für den Verlauf der einzelnen
Prozesse ist der jeweilige Hormonstatus der Zelle.
Diese zelluläre IES-Homöostase wird durch ein komplexes Reaktionsgefüge in Balance
gehalten, wobei der IES-Gehalt mittels unterschiedlichster biochemischer und
physiologischer Faktoren moduliert wird (siehe Abb. 1.1).
Abb. 1.1: Vereinfachtes Modell der Indol-3-essigsäure-Homöostase Die Pfeile verweisen auf regulatorische Reaktionen, welche entwicklungsbiologischer oder aber gewebespezifischer Natur sein können (verändert nach NORMANLY, 1997).
Neben der de-novo-Synthese und dem Abbau der IES stellen Transport, Kompartimen-
tierung, Konjugation und Dekonjugation entscheidende Regelgrößen dar, welche die
Konzentration physiologisch wirksamer, freier IES auf zellulärer Ebene regulieren.
In den vergangenen Jahren wurde sehr intensiv an der Aufklärung der IES-Biosynthese
gearbeitet, wobei unterschiedliche Pflanzenspezies sowie pflanzenassoziierte Mikro-
organismen als Untersuchungsobjekte dienten. Obgleich verschiedenste methodische
Ansätze verfolgt wurden, führten diese Versuche bis heute nicht zu einem ganzheitlichen
Verständnis der Auxinbiosynthese. So konnten zwar einige relevante Reaktionsschritte in-
vitro aufgezeigt, sowie wichtige Hinweise auf putative Metaboliten, welche durch in-vivo-
Einleitung
3
Analysen, unter Erhalt der zellulären Kompartimentierung, geliefert werden, ohne aber ein
einheitliches und umfassendes Modell für die Biosynthese aufzuzeigen (BARTEL, 1997).
Obgleich der spontane Zerfall der Aminosäure L-Tryptophan (L-Trp) zu Indol-3-
essigsäure in wäßrigen Medien schon früh beschrieben wurde, und Doppel-
markierungsexperimente von ERDMANN & SCHIEWER (1971) sowie Fütterungsexperimente
mit deuteriertem L-Trp (BIALEK et al., 1992), welche eine IES-Synthese aus L-Trp
belegten, darauf verwiesen, daß hier das Bindeglied zwischen Hormonbiosynthese und
dem Primärstoffwechsel zu suchen ist, stellte eine Reihe weiterer Befunde L-Trp als
ausschließliche Vorstufe der IES-Synthese in Frage. Erste Hinweise für eine tryptophan-
unabhängige IES-Biosynthese lieferten Isotopenmarkierungsexperimente an IES über-
produzierenden Lemna gibba-Mutanten. Nach Fütterung dieser zu den Wasserlinsen-
gewächsen zählenden Pflanzen mit [15N]-Trp zeigten BALDI et al. (1991), daß nur ein
Bruchteil des zu 98 % isotopenmarkierten Trps zur IES umgesetzt wurde
(20 – 30 %), was auf eine alternative IES-Vorstufe verwies. Diese Schlußfolgerung wurde
durch Analysen an tryptophanauxotrophen Mutanten von Zea mays (WRIGHT et al., 1991)
und Arabidopsis thaliana (NORMANLY et al., 1993) untermauert. Diese Mutanten (orange
pericarp (orp) beim Mais; trp2-1 und trp3-1 bei A. thaliana) zeichnen sich durch
Mutationen in den Proteinen des Tryptophan-Synthase-Komplexes aus (RADWANSKI et al.,
1996), was zu stark herabgesetzten endogenen Trp-Gehalten führt. Dennoch ließ sich für
diese Mutanten eine starke Akkumulation von IES-Konjugaten und Indol-3-acetonitril
(IAN), einem putativen Metaboliten der IES-Biosynthese, aufzeigen (CHEN et al., 1988).
Die Konjugation der freien IES wurde hier als Indiz für einen tryptophanunabhängigen
Biosyntheseweg gewertet, da eine Verminderung des Substratgehaltes die Steigerung der
Produktsynthese unwahrscheinlich erscheinen ließ. Nachfolgend durchgeführte Revisionen
dieser Experimente konnten hingegen weder für Z. mays (GLAWISCHNIG et al., 2000), noch
für A. thaliana (MÜLLER & WEILER, 2000b) Belege für einen tryptophanunabhängigen
Biosyntheseweg der IES liefern. Vielmehr verdeutlichten die Experimente an der
A. thaliana trp3-1 Mutante, daß nicht IES-Konjugate, sondern die L-Trp-Vorstufe Indol-3-
glycerophosphat akkumuliert, welche durch die, von CHEN et al. (1988) verwendete,
alkalische Hydrolyse zur IES zerfällt. Die beschriebene Akkumulation von IES-
Konjugaten in den A. thaliana-Mutanten muß demnach als apparentes Artefakt erachtet
werden, was sowohl die Verwendbarkeit der Mutanten für die Aufklärung der IES-
Synthese, als auch generell das Vorhandensein einer tryptophanunabhängigen IES-
Einleitung
4
Biosynthese in Frage stellt. Zudem ließen sich bis heute ausschließlich Gene identifizieren,
welche für Proteine von tryptophanabhängigen Reaktionswegen codieren (LJUNG et al.,
2002), was L-Trp als einzige Ausgangssubstanz der IES-Biosynthese erscheinen läßt.
Einleitung
5
Abb. 1.2: (Vorherige Seite) Mögliche Reaktionssequenzen zur tryptophan-abhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese
Die gezeigten Biosynthesewege beschreiben sowohl pflanzliche als auch mikrobielle Reaktionssequenzen der IES-Biosynthese. Mögliche Reaktionsschritte, für die bisher noch keine pflanzlichen Enzyme gefunden werden konnten, sind durch gestrichelte Linien hervorgehoben. Einige Orte negativer Regulation sind durch stumpfe Pfeile (rot) gekennzeichnet: CYP83B1 wird durch Tryptamin inhibiert (BAK et al., 2001), die TDC Transkription wird durch IES inhibiert (GOODDIJN et al., 1992; PASQUALI et al., 1992), und die AAO1-Gehalte sind in der A. thaliana rty Mutante erhöht (SEKIMOTO et al., 1998; SEO et al., 1998). (AAO1: Indol-3-acetaldehyd-Oxidase; IAMH: Indol-3-acetamid-Hydrolase; IAOx N-oxid: Indol-3-acetaldoxim-N-oxid; IES: Indol-3-essigsäure; IPAD: Indol-3-pyruvat-Decarboxylase; MYR: Myrosinase; NIT: Nitrilase; RTY: rty Mutante (A. thaliana); TAM: Tryptamin; TDC: Tryptophan-Decarboxylase; TMO: Tryptophan-2-Monooxygenase; TRPA: Tryptophan- Aminotransferase).
Ausgehend vom L-Trp sind in den vergangen drei Dekaden unterschiedliche
Reaktionssequenzen für die IES-Bildung postuliert und kontrovers diskutiert worden,
wobei viele Befunde, und hier insbesondere die Unzugänglichkeit IES-defizienter
Mutanten, auf mehr als einen Biosyntheseweg hindeuten (ECKHARDT, 2001).
Eine Reihe dieser tryptophanabhängigen Biosynthesewege sind in Abbildung 1.2
zusammengefaßt dargestellt und werden nachfolgend diskutiert. Tryptamin wurde
aufgrund seiner charakteristischen Auxinwirkung im klassischen Avena-Koleoptilen-
Krümmungstest (WINTER, 1966) schon früh als mögliche biosynthetische Vorstufe der IES
betrachtet. Eine putative Reaktionssequenz über Tryptamin wurde von PHELPS &
SEQUERIA (1967) für Tabak vorgestellt. Durch eine einleitende Decarboxylierung und
anschließende Hydroxylierung des intermediären Tryptamins erfolgt die Umsetzung des
Tryptophans zu Indol-3-acetaldehyd. Das für eine Tryptophan-Decarboxylase [1]
codierende Gen konnte von DE LUCA et al. (1989) aus Catharanthus roseus kloniert und
die Tryptamin-Bildung im bakteriellen System (SONGSTAD et al. 1990) gezeigt werden.
Des weiteren konnte für die Tryptophan-Decarboxylase (TDC) eine Inhibierung der
Transkription durch exogen appliziertes Auxin (GOODDIJN et al., 1992; PASQUALI et al.,
1992) beobachtet werden. Da Tryptamin bislang nur in Lycopersicon esculentum
identifiziert wurde (COONEY & NONHEBEL, 1991), und somit nicht ubiquitär in Pflanzen
verbreitet zu sein scheint, wurde dieser Reaktionsweg lange als wenig relevant erachtet.
Neuerliches Interesse für diesen Biosyntheseweg weckte aber die Identifikation von
YUCCA [2], einer Flavin-Monooxygenase aus A. thaliana (ZHAO et al., 2001), welche in-
vitro Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin umsetzt. YUCCA überexprimierende Pflanzen
zeigen einen signifikanten Auxinphänotyp, mit verlängerten Hypocotylen, epinastischen
Einleitung
6
Kotyledonen und Blättern, verlängerten Blattstielen sowie erhöhter apikaler Dominanz.
Zudem weisen diese Mutanten einen um 50 % gesteigerten IES-Gehalt und eine erhöhte
Resistenz gegen phytotoxische Trp-Analoga auf, was darauf hinweist, daß die
akkumulierte IES in diesen Pflanzen aus L-Trp stammt. TDC überexprimierende
Tabakpflanzen akkumulieren zwar Tryptamin, aber weisen keinen Auxinphänotyp auf
(CHAVADEJ et al., 1994; GUILLET et al., 2000). Dies legt nahe, daß YUCCA den
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dieser Reaktionssequenz katalysiert. Da in
biochemischen Untersuchungen aber weder endogenes Tryptamin noch der Umsatz von
Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin in A. thaliana beobachtet werden konnte, und
YUCCA-defiziente Mutanten keinen signifikanten Phänotyp zeigen, ist der Stellenwert
dieses Biosyntheseweges noch unklar.
Unbekannt ist zudem, ob diese Reaktionssequenz Indol-3-aldoxim (IAOx) als Zwischen-
stufe beinhaltet. IAOx wird als mögliche Verzweigungsstelle innerhalb der IES-Synthese
diskutiert, da IAOx das Substrat für die Biosynthese von Indol-Glucosinolaten darstellt
(BAK et al., 2001). Diverse Studien, unter anderem an A. thaliana-Mutanten (superroot2
(sur2)), verweisen auf den Umsatz von IAOx zu Indol-3-aldoxim-N-oxid durch ein
cytosolisches Cytochrom P450 Protein, CYP83B1 [7] (DELARUE et al., 1998; WINKLER et
al., 1998), und eine Funktion des IAOx, als Intermediat, bei der Bildung der IES. Die
Überexpression einer Tryptophan-Decarboxylase in Brassica napus führte, neben der oben
schon erwähnten Akkumulation von Tryptamin, zu einer drastischen Reduktion des Indol-
Glucosinolat-Gehaltes (CHAVADEJ et al., 1994), was auf eine Inhibierung von CYP83B1
durch Tryptamin schließen läßt. Alternativ könnte IAOx hingegen auch direkt aus L-Trp
gebildet werden. In Chloroplasten konnten zwei weitere Cytochrom-P450-Mono-
oxygenasen (CYP79B2, CYP79B3 [6]) identifiziert werden, welche den in-vitro-Umsatz
von Trp zu IAOx katalysieren (HULL et al., 2000), was auf eine eher indirekte Verbindung
zur IES-Biosynthese, über eine Substrat-Kompetition, hindeuten würde.
Eine weitere mögliche Reaktionssequenz führt vom L-Trp über Indol-3-pyruvat zum Indol-
3-acetaldehyd. Hier erfolgt die Modifikation der L-Trp-Seitenkette sukzessiv durch Trans-
aminierung und Decarboxylierung. Entsprechende Transaminase- [3] als auch Decarboxy-
lase-Aktivitäten konnten für eine Vielzahl pflanzlicher (TRUELSEN, 1973; NONHEBEL et al.,
1993) sowie mikrobieller Organismen nachgewiesen werden. Gene, die für eine Indol-3-
pyruvat-Decarboxylase [4], das Schlüsselenzym dieser Reaktionsfolge, codieren, ließen
sich aus Enterobacter cloacae (KOGA et al., 1994) sowie Azospirillium brasilense
Einleitung
7
(COSTACURTA et al., 1994), nicht aber aus Pflanzen isolieren. Die abschließende Reaktion
vom Indol-3-acetaldehyd zur IES kann durch die Katalyse einer Indol-3-acetaldehyd-
Oxidase [5] vermittelt werden. Entsprechende Gene für zwei Isoformen dieses Enzyms
sind aus A. thaliana isoliert und charakterisiert worden (SEKIMOTO et al., 1997; SEO et al.,
1998). Für die A. thaliana-Mutante rooty (rty) (SEO et al., 1998), auch als sur1 (BOERJAN
et al., 1995), hookless3 (LEHMAN et al., 1996) und alf1 (CELENZA et al., 1995) bekannt,
konnte neben der Akkumulation der Indol-3-acetaldehyd-Oxidase Isoform AAO1 ein
deutlicher Auxinphänotyp beschrieben werden. Die rty-Mutante zeichnet sich durch eine
rezessive Mutation in einem Tyrosintransaminase-ähnlichen Protein (GOPALRAJ et al.,
1996) aus und zeigt erheblich gesteigerte Gehalte an freier und konjugierter IES (BOERJAN
et al., 1995; KING et al., 1995; LEHMAN et al., 1996). Dies deutete CELENZA (2001) als
eine putative Blockade einer Verzweigung der IES-Biosynthese. Da bisher keine Hinweise
auf pflanzliche Analoga der bakteriellen Indol-3-pyruvat-Decarboxylasen gefunden
werden konnten, schließen COSTACURTA & VANDERLEYDEN (1995) und NORMANLY et al.
(1995), daß diese Variante der IES-Biosynthese auf pflanzenassoziierte Mikroorganismen
zurückgeführt werden muß. Eine solche mikrobielle Komponente der Hormonbiosynthese
konnte bereits von LIBBERT et al. (1970) aufgezeigt werden.
Eine eher untergeordnete Rolle in der IES-Biosynthese spielt der Umsatz von Indol-3-
acetonitril (IAN) zur IES durch die Proteine NIT1 – 3 der Nitrilase-Familie [9] aus
A. thaliana (BARTLING et al., 1992; BARTEL & FINK, 1994), deren Aktivität in-vitro und in-
vivo aufgezeigt werden konnte (SCHMIDT et al., 1996; NORMANLY et al., 1997; VORWERK
et al., 2001; KUTZ et al., 2002). Der Umsatz von IAN konnte bereits früh durch THIMANN
& MAHADEVAN (1958) an Gerste demonstriert werden. Allerdings zeigten von 21
untersuchten Familien Höherer Pflanzen nur Poaceen, Brassicaceen und Musaceen diese
enzymatische Aktivität (THIMANN & MAHADEVAN, 1964a, b), was diese Art der de-novo-
Biosynthese auf wenige Pflanzenfamilien limitiert. Nach heutigem Stand der Wissenschaft
wird davon ausgegangen, daß Nitrilasen für die Umsetzung von IAN zu IES verantwortlich
sind, welches hydrolytisch, durch Myrosinasen [8], aus Indol-Glucosinolaten, insbesondere
aus Glucobrassicin, freigesetzt wird (BARTEL et al., 2001). Die Funktion der Nitrilasen
besteht wohl vornehmlich darin, in Abhängigkeit von unterschiedlichen biotischen wie
abiotischen Faktoren, zusätzliche IES-Pools zu aktivieren. So konnte beispielsweise für
NIT2 eine Induktion durch Pathogenbefall (BARTEL & FINK, 1994) bzw. für NIT3 eine
Einleitung
8
Induktion durch Sulphatmangel (KUTZ et al., 2002) beschrieben werden, welche mit einer
drastischen Abnahme des Glucobrassicin-Gehaltes einhergeht.
Der einzige bisher vollständig aufgedeckte IES-Syntheseweg ist der Indol-3-acetamid-
Weg. Dieser Syntheseweg ist aus Mikroorganismen der Gattungen Agrobacterium
(SCHRÖDER et al., 1984), Azospirillium (BAR & OKON, 1993), Pseudomonas (MAGIE et al.,
1963) sowie Streptomyces (MANULIS et al., 1994) bekannt, und wird durch das
Zusammenspiel einer Tryptophan-2-Monooxygenase [10], einem 62 kDa Flavoprotein
(HUTCHESON & KOSUGE, 1985), und einer etwa 49 kDa großen Indol-3-acetamid-
Hydrolase [11] vermittelt. Diese beiden Enzyme vermögen L-Trp zu Indol-3-acetamid
(IAM) zu oxidieren und dieses weiter zur IES zu hydrolysieren. Obgleich endogenes IAM
in einigen Pflanzen, wie z.B. Oryza sativa (KAWAGUCHI et al., 1991), Poncirus trifoliata
(KAWAGUCHI et al., 1993), Prunus jamasakura (SAOTOME et al., 1993) und Citrus unshiu
(IGOSHI et al., 1971; TAKAHASHI et al., 1975) nachgewiesen werden konnte, wird dieser
Biosyntheseweg als bakterienspezifisch angesehen, da die präsentierten Studien bakterielle
Kontaminationen nicht ausschließen konnten. Bestärkt wird diese Einschätzung dadurch,
daß bis dato keine spezifischen Tryptophan-2-Monooxygenasen respektive Indol-3-
acetamid-Hydrolasen in Pflanzen ausgemacht werden konnten.
Neben den oben angeführten Reaktionswegen beschreiben MÜLLER & WEILER (2000a)
einen Enzymkomplex (IES-Synthase) aus A. thaliana, der in-vitro eine vollständige
Umsetzung von Trp zu IES ermöglicht. Dieser etwa 160 – 180 kDa große, lösliche
Synthase-Komplex zeichnet sich durch seine Stereoselektivität für L-Trp und strikte
Sauerstoffabhängigkeit aus, ohne von weiteren Kofaktoren abhängig zu sein. Isotopen-
markierungsexperimente zeigten, daß sich beide Sauerstoffatome der entstehenden IES,
unter Verwendung von H218O, markieren ließen. Zusammen mit immunologischen
Befunden deutet dieses Ergebnis auf die Beteiligung einer Nitrilase bzw. eines nitrilase-
ähnlichen Enzyms hin. Unklar blieb indes die genaue enzymatische Zusammensetzung der
IES-Synthase, wie auch der biochemische Verlauf der Trp-Umsetzung, da keine inter-
mediären Metabolite identifiziert wurden, was darauf hindeutet, daß es sich hier um einen
enzymatisch kanalisierten Reaktionsverlauf handelt, wie er beispielsweise für den
Tryptophan-Synthase-Bienzymkomplex (α2β2) von Salmonella tryphimurium gezeigt
werden konnte (PAN et al., 1996).
Einleitung
9
Die Regulation der Auxinhomöostase stellt ein äußerst komplexes Netzwerk pflanzlicher
Entwicklungssteuerung dar, für deren Verständnis ein umfassendes Wissen aller
metabolischer Vorgänge und deren Regulation unverzichtbar ist. Aus diesem Grund sollte
im Rahmen dieser Arbeit versucht werden, enzymatische wie auch biochemische
Charakteristika der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese in A. thaliana im Detail zu
untersuchen. Basierend auf der Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) bestand das Ziel
darin, den IES-Synthase-Komplex aus A. thaliana proteinbiochemisch hoch anzureichern,
um so die massenspektrometrische Identifikation enzymatischer Bestandteile des Multi-
enzymkomplexes zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde die Identifikation von Intermedi-
aten der IES-Synthase-katalysierten Trp-Umsetzung angestrebt.
Material & Methoden
10
2 Material und Methoden
2.1 Liste der verwendeten Geräte und Feinchemikalien
2.1.1 Geräte
Autoklav Vapoklav Typ 500 H+P Labortechnik, Oberschleißheim
Brutschrank UM 660 Memmert, Schwabach
Elektroporationsgerät
Capacitance Extender II, BioRad, München
Puls Controller II, Gene Pulser II
Flüssigkeits-Szintillationszähler LS 6000 TA Beckman, München
Elektro-Eluter Modell 422 Bio-Rad, München
FPLC-System
Peristaltikpumpe P 1 Pharmacia Biotech, Freiburg
Pumpen P 500
Programmgeber GP 250
Fraktionskollektor Frac-100
Leersäulen
Econo UV-Detektor Bio-Rad, München
GC- und GC-MS-Systeme
GC 3400 Gaschromatograph Varian, Darmstadt
MAT Magnum Massenspektrometer Finnigan MAT, Bremen
Varian Saturn 2000 Varian, Darmstadt
GC-Säulen:
DB-17 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm) Supelco, Bellefonte, USA
ZB-50 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm) Phenomenex, Aschaffenburg
Gelelektrophoresezubehör
Flachbettkammern für Agarosegele Universitätswerkstatt Bochum
Polyacrylamid Minigelkammern
Glasplatten und Zubehör für Minigele Biometra, Göttingen
Elektroblotkammer EB10 BiocomDirect, Bridge of Weir, UK
2D Gel-System Protean XL II BioRad, München
Elektroblotkammer Trans-Blot Cell
Gradientenformer Modell 385
Material & Methoden
11
Geltrockner Savant SGD 4050 Savant, München
HPLC-Systeme
Varian Dynamax SD-200 Varian, Darmstadt
Varian Dynamax UV-1
Waters 600E System Controller Waters, Milford, USA
Spektrophotometer Lambda Max 481
Waters 510 HPLC-Pumpen
HPLC-Säulen
ZorbaxSil (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) Knauer, Bad Homburg
Luna C18 (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) Phenomenex, Aschaffenburg
Inkubationsschüttler Modell G25 New Brunswick, Edison, USA
Netzgeräte
PS 304 Gibco BRL, Neu-Isenburg
PS 3002
EPS 3501 Pharmacia Biotech, Freiburg
PCR-Thermoblock Triblock Biometra, Göttingen
Perfusionschromatographieanlage BioCAD Sprint Perceptive BioSystems, Weiterstadt
mit Gelfiltrationssäule Bio-Silect SEC 125-5 Bio-Rad, München
Photoaffinitätsmarkierungsbedarf
Quecksilberhochdrucklampe HBO 500 W/2 Oriel, Darmstadt
mit Stromgeber und Quarzkollektor
Kühlaggregat FT 800 Fryka-Kühltechnik, Esslingen
Photometer
DU 7400 Beckman, München
ELISA-Photometer Easyreader EAR 400 AT SLT, Laborinstrumente, Overath
GeneQuant II Pharmacia Biotech, Freiburg
NovaSpec II
Uvikon 810 Kontron, Echingen
Phospho-Imager BAS-1500 mit Eraser und Raytest, Sprockhövel
Tina 2.09 Computerprogramm
Rotationsverdampfer Rotavapor RE III Büchi, Schweiz
Sterilbänke
Gelaire BSB3 Flow Laboratories, Meckenheim
danLAV VFR1206 GS Claus Damm, Lobebaek, Dänemark
Material & Methoden
12
Ultraschallgeräte
Sonorex RK 510 S Bandelin, Berlin
Sonifier B-17 Branson, Banburry, USA
Ultrazentrifugen
Tischultrazentrifuge TL 100 mit Rotor TLA 45 Beckman, München
OTD Kombi mit Rotor T 8.65 DuPont GmbH, Bad Homburg
UV-Handlampe HL-6-MK Bachofer, Reutlingen
UV-Stratalinker 1800 Stratagene, Heidelberg
Vakuumpumpe PC 5 Vakuubrand, Wertheim
Vakuumtrockner Speedvac Univapo 100H Uniequip, Martinsried
Zentrifugen
Sorvall RC-5B Plus DuPont, Bad Homburg
Rotoren: SS34, GSA Kontron, Neufahrn
Biofuge fresco Heraeus Sepatech, Hanau
Biofuge pico
Alle weiteren verwendeten Geräte entsprachen den üblichen Laborstandards.
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
Chromatographiematrizes
C18-Säulen (Bond-Elut) ITC-Handels-GmbH
CNBr-aktivierte Sepharose Pharmacia Biotech, Freiburg
Protein G Sepharose Pharmacia Biotech, Freiburg
Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatit Typ II; 20 µm
Bio-Rad, München
Macro-Prep High Q
Nitrilotriessigsäure-Agarose, Ni2+ beladen (Ni-NTA)
Qiagen, Hilden
PD-10 Entsalzungsäulen Pharmacia Biotech, Freiburg
Strep-Tactin-Sepharose IBA, Göttingen
Dialysemembran Typ 20, 12-16 kDa, 25 Å Biomol, Hamburg
Gel-Blotting-Papier GB 002 Schleicher & Schuell, Dassel
Glasfaserfilter GF 6 (25 mm Ø) Schleicher & Schuell, Dassel
Nitrocellulose, BA85, 0.45 µm Schleicher & Schuell, Dassel
Sterilfilter, 0.22 µM Millipore, Eschborn
Material & Methoden
13
Zentrifugen-Filtereinheiten
Centriprep YM-10, 10 kDa Millipore, Eschborn
Centriprep YM-30, 30 kDa
Centriprep YM-50, 50 kDa
Centricon YM-10, 10 kDa
2.1.3 Fein- und Radiochemikalien
Acetanilid Aldrich, München
Acrylamid Serva, Heidelberg; BioRad, München
Agar-Agar Merck, Darmstadt
Agarose Seakem LE, Rockland, USA
Ampicillin Serva, Heidelberg
Amino-n-capronsäure Sigma, München
Anhydrotetracyclin IBA, Göttingen
L-Asparagin Sigma, München
Bacto-Agar Difco, Hamburg
Bacto-Trypton Difco, Hamburg
Bacto-Hefeextrakt Difco, Hamburg
Bis-(2-hydroxyethyl)-imino-tris-(hydroxy- methyl-)methan (Bis-Tris)
Biomol, Hamburg
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal)
Biomol, Hamburg
5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Biomol, Hamburg
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
L-Canavanin Sigma, München
L-Citrullin Sigma, München
Desthiobiotin Sigma, München
Desoxynukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Roche Diagnostics, Mannheim
1,4-Dithiothreitol (DTT) Biomol, Hamburg
λ DNA-HindIII + ΦX174 DNA-HaeIII Mix DNA Standard
Finnzymes OY, Espoo, Finnland
Ethidiumbromid Sigma, München
Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure (EDTA) Roche Diagnostics, Mannheim
Freundsches Adjuvans, inkomplett Sigma, München
Gelrite Nordwald, Schweizerhall
Material & Methoden
14
L-Glutamin Lancaster Synthesis, UK
Glycylglycin Sigma, München
Guanidinthiocyanat Applichem, Darmstadt
Hydantoinsäure Sigma, München
Hydroluma Szintillator Baker, Deventer, Niederlande
4-Hydroxyazobenzen-2-carboxylsäure (HABA) Sigma, München
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES)
Biomol, Hambrg
5-Hydroxy-L-tryptophan Sigma, München
Indol-3-acetamid Aldrich, München
Indol-3-acethydrazid Aldrich, München
Indol-3-acetonitril Sigma, München
Indol-3-essigsäure Sigma, München
N-Lauroylsarcosin Sigma, München
Molekulargewichtsmarker LMW, HMW-nativ Pharmacia Biotech, Freiburg
3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS) Biomol, Hamburg
Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg
Nikotinsäureamid Sigma, München
p-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Biomol, Hamburg
Octylphenol-polyethylenglycolether (Triton X-100)
Sigma, München
Polyvinylpyrrolidon (Polyklar AT) Serva, Heidelberg
Ponceau S Sigma, München
Powerplay Proteinpulver Wander, Celle
Salicylsäureamid Aldrich, München
Serva-Blue G, Serva-Blue R Serva, Heidelberg
N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma, München
N-Tris-(hydroxymethyl)-methylglycin (Tricin) Biomol, Hamburg
[2H]2-Indol-3-essigsäure 98 % Promochem, Wesel
[2H]5-Indol-3-essigsäure 98 % Promochem, Wesel
[3H]3-L-Serin 98 % Promochem, Wesel
[2H]5-L-Tryptophan 98 % Promochem, Wesel
Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden in Analyse-Qualität von den Firmen
Biomol, Roche Diagnostics, Difco, Riedel de Haën, Serva und Sigma bezogen.
Material & Methoden
15
2.2 Enzyme und Antikörper
2.2.1 Enzyme
Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm Roche Diagnostics, Mannheim
AMV reverse Transkriptase Promega, Madison, USA
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I Roche Diagnostics, Mannheim
Lysozym Serva, Heidelberg
Restriktionsendonukleasen Roche Diagnostics, Mannheim
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Takara, Taufkirchen
New England Biolabs, Frankfurt
RNase A Serva, Heidelberg
T4-DNA-Ligase Roche Diagnostics, Mannheim
Taq-Polymerase (DyNAzyme) Finnzymes OY, Espoo, Finnland
Taq-Polymerase (DyNAzyme EXT) Finnzymes OY, Espoo, Finnland
Strep-Tactin alkalische Phosphatase Konjugat IBA, Göttingen
2.2.2 Antikörper
Antikörper Antigen Herkunft/Referenz
α-NIT1 Kaninchenserum (602) denaturiertes Nitrilase 1 Protein
SCHMIDT et al., 1996
α-NIT4 Kaninchenserum (641) natives Nitrilase 4 Protein Lehrstuhlbestand, unveröffentlicht
α-AMI1 Kaninchenserum (645) natives Amidase 1 Protein diese Arbeit
α-AMI2 Kaninchenserum (644) denaturiertes Amidase 2 Protein
diese Arbeit
α-YUC Kaninchenserum (643) denaturiertes YUCCA Protein diese Arbeit
α-RGS-(His)4 Maus-IgG XRGSH(4-6)X Epitop Qiagen, Hilden
Ziege-α-Maus-IgG gekoppelt an alkalische Phosphatase
schwere und leichte Ketten von Maus Immunglobulinen
Serva, Heidelberg
Ziege-α-Kaninchen-IgG gekop-pelt an alkalische Phosphatase
Fc-Abschnitte von Kaninchen Immunglobulinen
Serva, Heidelberg
Material & Methoden
16
2.3 Nukleinsäuren
2.3.1 Oligonukleotide
Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen synthetisiert.
Vorhandene Restriktionsschnittstellen sind markiert. Die Abkürzungen entsprechen der
IUPAC-Nomenklatur für Nukleinsäuren.
Name Sequenz Schnittstelle
NIT1-Strt 5’-TATACTAGTATGTCTAGTACTAAAGAT-3’ SpeI, ScaI
NIT1-IBA3-Rev 5’-TTATTACGTCTCTGCGCTTTTGTTTGAGTCATCCTCAG-3’ Esp3I
AMI1-IBA5-Start 5’-TATCGTGGTCTCGGCGCCGCGACCAATAATGATTTTGG-3’ Eco31I
AMI1-IBA5-Rev 5’-TATCGTGGTCTCGTATCATCAAATAAATGCAGCAAGGG-3’ Eco31I
AMI2-Eco31I 5’-GCTATAGGTCTCGAATGAGCGTTCTTGAACTC-3’ Eco31I
AMI2-Rev 5’-TTCTGAGGTCTCGGCGCTAATGTGTAACCTACGGGGAG-3’ Eco31I
AMI2-SphI 5’-TATAGTGCATGCAGCGTTCTTGAACTC-3’ SphI
AMI2-SalI 5’-TATATAGTCGACTCAAATGTGTAACCTACCGGG-3’ SalI
YUCCA-BamHI 5’-TAGTCCGGATCCATGGAGTCTCATCCTCAC-3’ BamHI
YUCCA-HindIII 5’-TATGGAAAGCTTTTAGGATTTAGAGGTAAAGAC-3’ HindIII
pASK-IBA-Forw 5’-GAGTTATTTTACCACTCCCT-3’
pASK-IBA-Rev 5’-CGCAGTAGCGGTAAACG-3’
Material & Methoden
17
2.3.2 Plasmid-Vektoren
Plasmid Herkunft/Referenz
pASK-IBA 3 IBA, Göttingen
pASK-IBA 5 IBA, Göttingen
pBluescript SK+ (pBS-SK+) Stratagene, Heidelberg
pET-NIT1 VORWERK et al., 2001
pET-NIT2 VORWERK et al., 2001
pET-NIT3 VORWERK et al., 2001
pLUT5 EMANUELE et al., 1995
pSTB7 MILES et al., 1989
pQE 30 Qiagen, Hilden
Einige dieser Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: Dr. Ilme
Schlichting, Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie, Dortmund (CB 149/pSTB7),
Prof. Dr. P.F. Fitzpatrick, Texas A&M Universität, College Station, USA (pLUT5).
2.4 Biologisches Material
2.4.1 Bakterienstämme
Stamm Genotyp Herkunft/Referenz
BL21 (DE3) F-, ompT, hsdSB (rB– mB–), gal, dcm (DE3)
pLysS (cmr)
Novagen, Madison, USA
CB 149 ∆trpEDCBA2, hsdR514 MILES el al., 1989
XL-1 Blue recA1, endA1, gyrA96, thi1, hsdR17 (rK-,
mK+), supE44, relA1, λ-, lac-, [F’, proAB,
lacIq, Z∆M15, Tn10 (tetr)]
BULLOCK et al., 1987
Material & Methoden
18
2.4.2 Pflanzenmaterial
Als Untersuchungsobjekt dieser Arbeit diente Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. C24.
Entsprechendes Saatgut wurde freundlicherweise von Prof. Dr. L. Willmitzer, Max-
Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, Golm, zur Verfügung gestellt.
2.5 Anzucht und Lagerung des biologischen Materials
2.5.1 Anzucht, Transformation und Lagerung von Bakterien
Die Anzucht von Escherichia coli erfolgte in 2YT-Flüssigkultur (AUSUBEL et al., 1995) in
einem Inkubationsschüttler bei 220 upm oder auf Festmedium (LB-Agarplatten, AUSUBEL
et al., 1995) im Brutschrank bei einer Standardtemperatur von 37 °C. Die Transformation
der Bakterien mit Plasmid-DNA erfolgte mittels Elektroporation (AUSUBEL et al., 1995).
Transformanden wurden unter Selektionsdruck mit Ampicillin (Amp, 100 µg/ml) ange-
zogen. Zur längerfristigen Aufbewahrung wurden die verwendeten Bakterienstämme in
Lagermedium [65% (v/v) Glycerin, 0.1 M MgSO4, 0.025 M Tris/HCl, pH 8.0] bei
- 20 °C verwahrt.
2.5.2 Anzucht von Escherichia coli zur heterologen Überexpression von
Proteinen
Die Anzucht von N-terminalen bzw. C-terminalen Strep-Fusionsproteinen erfolgte mittels
pASK-IBA Derivaten in Anlehnung an das Protokoll des Herstellers (IBA, Göttingen). Die
Überexpression wurde, wenn nicht gesondert ausgewiesen, durch die Gabe von 0.2 µg/ml
Anhydrotetracyclin induziert.
Zur Überexpression von Proteinen mittels pQE-30- (Qiagen, Hilden) bzw. pET21-b-
Derivaten (Novagen, Madison, USA) in E. coli wurden 30 ml 2YT-Medium (mit
100 µg/ml Ampicillin) 1:3000 aus einer Stammkultur inokuliert und über Nacht bei 37 °C
im Inkubationsschüttler inkubiert. Aus dieser Übernachtkultur wurden 300 ml 2YT-
Medium 1:10 unter entsprechendem Selektionsdruck beimpft. Nach zweistündiger
Inkubation bei 37 °C erfolgte die Induktion der (His)6-markierten Proteine durch die
Zugabe von IPTG (0.5 mM Endkonzentration). Nach weiteren 4 Stunden Inkubation
wurden die Bakterien durch Sedimentation geerntet und die überexprimierten Proteine
isoliert.
Material & Methoden
19
Die Expression einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas
savastanoi erfolgte mittels des Konstruktes pLUT5 im E. coli Stamm XL-1 Blue in
Anlehnung an EMANUELE et al. (1995). Zu diesem Zweck wurden 300 ml 2YT-Medium
(mit 100 µg/ml Ampicillin) 1:25 aus einer Übernacht-Kultur angeimpft. Nach 18 stündiger
Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugation (30 min, 5000 upm, 4°C)
geerntet und die Sedimente bei - 80 °C eingefroren.
Der Tryptophan-Synthase-Komplex von Salmonella typhimurium wurde unter Kontrolle
des Tryptophanoperons im Escherichia coli Stamm CB 149/pSTB7 überexprimiert. Die
Anzucht der Bakterien erfolgte nach MILES et al. (1989), wobei dem Medium jeweils
50 mg/l Ampicillin und dem Induktionsmedium zusätzlich 5 g/l Tryptophan zugegeben
wurden. Die geernteten Bakterien wurden bei - 80 °C gelagert.
2.5.3 Anzucht nicht steriler Pflanzen
Die Anzucht der Pflanzen erfolgte unter Gewächshausbedingungen bei einer
Lichtintensität von 150 µE m-2s-1 auf einer Mischung aus gesiebter Standarderde und Sand
im Verhältnis 2:1. In den ersten 4 – 5 Wochen wurden die Pflanzen unter
Kurztagbedingungen (8 h) gehalten, danach wurden sie in den Langtag (16 h) gesetzt. Das
Gewächshaus wurde auf eine konstante Temperatur von 22 – 24 °C am Tag bzw.
18 – 20 °C in der Nacht eingeregelt.
2.5.4 Sterilisation des Saatguts
Saatgut wurde für 2 min mit 70 % (v/v) Ethanol behandelt und anschließend für 5 min mit
5% (v/v) Natriumhypochlorid sterilisiert. Das Hypochlorid wurde durch fünfmaliges
Waschen mit sterilem Wasser entfernt und die Samen in sterilem Wasser mit 0.1% Agar
aufgenommen.
2.5.5 Aussaat und Anzucht auf Festmedium
Sterilisiertes Saatgut wurde auf festem MS-Medium (MURASHIGE & SKOOG, 1962) mit
2 % Saccharose unter sterilen Bedingungen ausgesät. Die Platten wurden mit Parafilm
verschlossen. Das Saatgut wurde bei 4 °C für 2 Tage stratifiziert. Die Anzucht erfolgte in
einer Phytokammer unter kontrollierten Bedingungen (8 h Photoperiode bei 24 °C und
105 µE s-1m-2, 16 h Dunkelheit bei 20 °C, 70 % relative Luftfeuchtigkeit). Nach 4 Wochen
wurden die Pflanzen in sterilisierte Weckgläser mit MS-Festmedium umgesetzt, erneut mit
Material & Methoden
20
Parafilm verschlossen und für weitere 4 – 6 Wochen unter den oben angeführten
Bedingungen kultiviert.
2.6 Molekularbiologische Methoden
2.6.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
Die schnelle Isolierung von Plasmiden aus E. coli erfolgte mittels alkalischer Lyse nach
BIRNBOIM & DOLY (1979) aus 1.5 ml einer über Nacht gewachsenen 4 ml 2YT-Kultur
(2.5.1).
2.6.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen
Zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus A. thaliana wurden 0.5 g Pflanzenmaterial geerntet
und nach BARKAN (1989) aufgearbeitet. Diese Methode beruht auf dem Aufschluß
pflanzlichen Materials unter proteindenaturierenden Bedingungen in Guanidinthiocyanat.
Die nach abschließender, selektiver Fällung mittels Lithiumchlorid erhaltene RNA wurde
in 60 µl nukleasefreiem Wasser resuspendiert und bei -80 °C gelagert. Die Quantifizierung
erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 254 nm. Die Qualität der gewonnenen
RNA wurde anhand der Unversehrtheit der ribosomalen RNAs mittels denaturierender
Agarosegelelektrophorese (2.6.6) kontrolliert.
2.6.3 Enzymatische Manipulation von Nukleinsäuren
Alle verwendeten Techniken, Puffer und Medien entsprachen den Standardprotokollen und
wurden nach AUSUBEL et al. (1995), bzw. SAMBROCK et al. (1989) durchgeführt oder
hergestellt.
Zur in-vitro-Rekombination wurde die DNA unter Verwendung von Typ II Restriktions-
endonukleasen nach den Herstellerempfehlungen restringiert und die DNA-Fragmente über
Horizontalgelelektrophorese (2.6.6) in Agarosematrizes separiert. Die gewünschten
Fragmente wurden mit Hilfe des NucleoSpin Extract Kits (Macherey & Nagel, Düren)
eluiert. Die Ligation von DNA-Fragmenten in kompatible Enden von Plasmid-Vektoren
erfolgte nach AUSUBEL et al. (1995). Zur Klonierung von Fragmenten mit kohäsiven,
inkompatiblen Enden wurden 5’- bzw. 3’-überhängende Enden unter Verwendung des
Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aufgefüllt bzw. verdaut (AUSUBEL et al., 1995).
Material & Methoden
21
2.6.4 Erzeugung von komplementärer DNA
Komplementäre DNA wurde durch reverse Transkription gewonnen. Dazu wurde RNA
(2 µg) aus Wurzeln oder grünen Blättern von A. thaliana-Pflanzen in cDNA umge-
schrieben. Die reverse Transkription erfolgte unter Verwendung eines AMV-RT Kits
(Promega, Madison, USA) und Oligo-d(T)25-Starteroligonukleotiden (Sigma, München)
nach den Vorgaben des Herstellers. Ein Aliquot (7 µl) der gewonnenen DNA-RNA-
Hybride wurde anschließend in einer Polymerase-Kettenreaktion (2.6.5) eingesetzt.
2.6.5 Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit der DyNAzyme DNA-Polymerase
(Finnzymes OY, Espoo, Finnland) in 50 µl DyNAzyme-Puffer und je 200 µM
Didesoxynukleotiden (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) durchgeführt. Die jeweils eingesetzte
Menge an DNA-Matrize und Oligonukleotiden sowie die verwendeten Reaktions-
bedingungen sind bei entsprechend aufgeführten Experimenten angegeben.
2.6.6 Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren
Die Trennung von DNA-Fragmenten erfolgte unter Verwendung von TA-Puffer [40 mM
Tris/Na-Acetat, pH 7.5, 20 mM Na-Acetat, 1 mM EDTA, 0.5 µg/ml Ethidiumbromid] in
Agarosegelen (0.8 % - 1.8 % (w/v) Agarose in TA-Puffer). Als Größenstandard diente ein
λ DNA - HindIII und ΦX174 DNA - HaeIII Mix der Firma Finnzymes OY (Espoo,
Finnland).
Gesamt-RNA wurde unter denaturierenden Bedingungen in Agarosegelen (1.8 % (w/v)
Agarose in MOPS-Puffer [0.2 M MOPS, pH 8.0, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA] mit
6 % (v/v) Formaldehyd) unter Verwendung von MOPS-Puffer (pH 7.0) als Laufpuffer,
aufgetrennt.
2.6.7 Sequenzierung doppelsträngiger DNA
Alle Sequenzierungen, welche in dieser Arbeit dargelegt werden, wurden von der Firma
Qiagen, Hilden durchgeführt.
Material & Methoden
22
2.7 Biochemische Methoden
2.7.1 Kopplung von 5-Hydroxy-L-tryptophan an Rinderserumalbumin
Das 5-Hydroxy-L-tryptophan wurde durch Diazokopplung über eine Brücke aus
p-Aminohippursäure an Rinderserumalbumin (RSA) kovalent gebunden (WEILER, 1980).
Dazu wurden 200 mg p-Aminohippursäure in 120 ml H2O gelöst und 200 mg RSA
hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8.2 eingestellt. Die Lösung wurde unter
Rühren für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit 200 mg 1-Ethyl-3-(3-
Dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDAC) versetzt, und der pH-Wert auf 6.8 eingestellt.
Der Reaktionsansatz wurde darauf für 6 h in Dunkelheit unter Rühren bei Raumtemperatur
inkubiert und anschließend mit zusätzlichen 100 mg EDAC versetzt. Nach einer weiteren
Inkubation über 15 h wurde der Ansatz gegen Wasser dialysiert (12 h) und lyophilisiert.
Zur Kopplung des substituierten RSAs an 5-Hydroxy-L-tryptophan wurden 30 mg des
gefriergetrockneten Proteins in 5 ml H2O gelöst, mit konzentrierter Salzsäure angesäuert
(pH 1.5), und im Eis / Kochsalzbad auf 0 °C abgekühlt. Sodann wurde dem Reaktions-
ansatz nacheinander eiskalte NaNO2- (60 mg in 0.5 ml H2O) und NH4SO3NH2-Lösung
(30 mg in 0.5 ml H2O) tropfenweise zugefügt, wobei sich der Ansatz gelblich färbte.
Abschließend wurde der gesamte, diazotierte Ansatz tropfenweise in 10 ml 0.1 M
Boratpuffer, pH 9.0, in dem 10 mg 5-Hydroxy-L-tryptophan gelöst waren, gegeben,
worauf sich die Farbe der Lösung schlagartig von gelb nach blutrot änderte. Der Ansatz
wurde über Nacht bei 4 °C gegen Wasser dialysiert und darauf in 2 ml Aliquots bei -20 °C
gelagert.
2.7.2 Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan
Die Synthese von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan erfolgte in Anlehnung an MELHADO et al.
(1982), hierzu wurden 50 mg 6-Nitroindol in ethanolischer Lösung an wasserfreiem
Raney-Nickel unter Rühren und ständiger H2-Zugabe (45 min) in 6-Aminoindol überführt.
Das Reaktionsprodukt wurde über Watte von dem Raney-Nickel befreit und unter N2
getrocknet. Anschließend wurden 40 mg des 6-Aminoindols in 3.2 ml 80 %-iger Essig-
säure gelöst und auf 0 °C (Eis / Kochsalzbad) abgekühlt. Dem Reaktionsansatz wurde
unter Rühren eiskalte NaNO2-Lösung (23 mg in 0.8 ml H2O) tropfenweise hinzugefügt.
Nach einer Inkubation von 5 min wurde der Ansatz tropfenweise mit eiskalter NaN3-
Material & Methoden
23
Lösung (21.7 mg in 0.8 ml H2O) versetzt und für weitere 2.5 h im Dunkeln unter Stickstoff
bei 0 °C inkubiert.
Die resultierende schwarzbraune Lösung wurde bei 30 °C Wasserbadtemperatur im
Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 5 ml Ethanol p.A.
aufgenommen und mit zwei Spatelspitzen Aktivkohle versetzt. Die Lösung wurde gut
durchmischt und auf eine Kieselgur-Säule (0.3 – 0.4 mm Korngröße, Länge: 6 cm,
Ø: 1 cm) gegeben. Das 6-Azidoindol wurde mit 10 ml heißem Ethanol p.A. von der Säule
eluiert und im Vakuum zur Trockne gebracht.
Abschließend wurde das 6-Azidoindol enzymatisch, unter Verwendung einer heterolog
exprimierten Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium (MILES et al., 1989), zum
6-Azido-L-tryptophan umgesetzt. Hierzu wurden 37 MBq (50 nmol) [3H]3-L-Serin
(spezifische Aktivität: 740 TBq/mmol) und 15.8 µg 6-Azidoindol in 10 µl Ethanol p.A.
gelöst und mit 190 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8.0 versetzt. Der Ansatz wurde mit ca. 5 mg
Tryptophan-Synthase (2.8.3) in 100 µl Puffer T [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 5 mM EDTA,
10 mM β-Mercaptoethanol, 0.1 mM Pyridoxalphosphat] versetzt, gut gemischt und für
4.5 h unter N2 in Dunkelheit bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden dem
Reaktionsansatz, zur Fällung der Proteine, 1.5 ml eiskaltes Methanol p.A. zugegeben,
worauf eine Inkubation bei 4 °C über Nacht folgte.
Die trübe Lösung wurde 3 min bei 13000 upm zentrifugiert und das Sediment dreimal mit
je 0.5 ml Methanol nachgewaschen. Die vereinigten Überstände wurden unter Stickstoff
bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 µl HPLC-Laufmittel
(50 % Methanol (v/v)) aufgenommen und über eine Luna C18-Säule (Phenomenex,
Aschaffenburg) gereinigt (2.10.1.1), wobei der Chromatographieverlauf über einen
Durchflußszintillationszähler verfolgt und die radioaktive Fraktion manuell gesammelt
wurde. Die Authentizität der photolabilen Azidogruppe wurde durch den Vergleich von
UV-Spektren des Reaktionsproduktes vor und nach Belichtung (305 nm) nachgehalten
(ohne Abbildung).
2.7.3 Synthese von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid
Ausgehend vom [3H]3-6-Azido-L-tryptophan konnte das [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid
enzymatisch dargestellt werden. Hierzu wurden 9.25 MBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan in
1 ml 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 aufgenommen. Der Ansatz wurde mit 2 ml einer
Material & Methoden
24
Tryptophan-2-Monooxygenase (TMO) Präparation (14 – 15 mg Protein/ml) (2.8.2) ver-
setzt und über 3 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde darauf mit
konzentrierter Salzsäure angesäuert (pH 2.0) und zweimal mit je 5 ml Ethylacetat
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet, in 200 µl HPLC-
Laufmittel ([60 % iso-Hexan, 40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 %
(v/v) Methanol) aufgenommen und über eine ZorbaxSil-Säule (5 µm, 4.0 x 250 mm)
gereinigt. Der Chromatographieverlauf konnte über einen Durchflußszintillationszähler
nachgehalten und die [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid Fraktion gesammelt werden. Wie
schon beim [3H]3-6-Azido-L-tryptophan (2.7.2) wurde die Photoaktivierbarkeit der
Azidogruppe durch den Vergleich der UV-Spektren vor und nach Belichtung mit UV-Licht
(305 nm) überprüft (ohne Abbildung).
2.7.4 Synthese von [2H]5-Indol-3-acetamid
Neben dem radioaktiven 6-Azidoindol-3-acetamid wurde auch pentadeuteriertes [2H]5-
Indol-3-acetamid als interner Standard für GC-MS-Analysen bzw. als markiertes Substrat
für enzymatische Untersuchungen dargestellt. Für die Synthese wurde 1 mmol [2H]5-L-
Tryptophan mit einer Isotopenreinheit von 98 % (Cambridge Isotope Laboratories,
Andover, MS, USA) in Wasser aufgenommen und, wie in Kap. 2.7.3 beschrieben, mit
Hilfe einer Tryptophan-2-Monooxygenase enzymatisch zu [2H]5-Indol-3-acetamid
umgesetzt und extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer
wurde der Rückstand in 1 ml Chloroform aufgenommen, zentrifugiert und das [2H]5-Indol-
3-acetamid auf Kieselgel mit dem oben angeführten Laufmittel (2.7.3) dünnschicht-
chromatograpisch vorgereinigt. Die UV-positive, indolische Lauffront (Rf = 0,19) wurde
mit 20 ml Methanol extrahiert und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Abschließend
wurde der Extrakt mittels HPLC an einer ZorbaxSil-Säule (siehe 2.10.1.2) ein weiteres
Mal gereinigt. Produkt- und Isotopenreinheit wurden nach Trifluoracetylierung mit Tri-
fluoressigsäureanhydrid gaschromatographisch-massenspektrometrisch anhand der Signal-
flächen der Fragmentionen m/z = 344, 328, 247 und 231 (chemische Ionisierung,
Rt = 8.70 min) (2.11.5) überprüft und die Stoffmenge photometrisch in Methanol (ε281 =
7.36 x 106 cm2 mol-1) bestimmt.
Material & Methoden
25
2.7.5 Kopplung von Immunglobulin G an Sepharose
Für die Kopplung von Antikörpern an CNBr-aktivierter Sepharose wurden ausschließlich
spezifisch gereinigte IgG-Fraktionen (2.13.5) verwendet. Dazu wurden 0.5 g CNBr-
aktivierte Sepharose 4 Fast Flow nach Angaben des Herstellers durch Säurebehandlung
aktiviert. Die Flüssigkeit wurde nach Absetzen der Matrix dekantiert, diese mit 2 x 50 ml
H2O bidest. gewaschen, und anschließend in Kopplungs-Puffer [0.1 M NaHCO3, pH 8.3,
0.5 M NaCl] aufgenommen. Die Kopplung erfolgte nach Zugabe von 5 ml IgG-Lösung
über Nacht bei 4 °C im Überkopfschüttler. Freie Bindestellen wurden durch Inkubation
(2 h) in 0.1 M Tris, pH 8.0 abgesättigt. Abschließend wurde die Matrix in 5 Zyklen mit
alternierendem pH-Wert gewaschen (Waschpuffer I [0.1 M NaAc, pH 4.0, 0.5 M NaCl],
Waschpuffer II [0.1 M Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCl]).
2.8 Präparationsmethoden
2.8.1 Gewinnung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II- und (His)6-
Fusionsproteine
Die Reinigung bakteriell überexprimierter Strep-tag-II-AMI1- und (His)6-NIT1-3-Fusions-
proteine erfolgte unter nativen Bedingungen durch Affinitätschromatographie unter
Verwendung von Strep-Tactin-Sepharose (AMI1), bzw. einer Ni2+-beladenen Nitrilotri-
essigsäure (Ni-NTA)-Agarose (NIT1-NIT3) nach Angaben der Hersteller (IBA, Göttingen
bzw. Qiagen, Hilden).
Strep-tag-II-AMI2-Fusionsproteine wurde in Anlehnung an KOBAYASHI et al. (1997) unter
denaturierenden Bedingungen aus Einschlußkörpern gewonnen. Dazu wurden die
Bakterien durch Ultraschallbehandlung (6 x 10 s) aufgeschlossen, zentrifugiert (12000 x g,
4 °C, 30 min) und die präzipitierten Zelltrümmer und Einschlußkörper in Lysis-Puffer
[50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % (v/v) Triton X-100]
resuspendiert. Auf diese Weise ließen sich solubilisierte Membranfragmente durch
Zentrifugation (17000 x g, 4 °C, 15 min) abtrennen. Das resultierende Sediment wurde in
5 ml Dialyse-Puffer [30 mM Tris/HCl, pH 7.5, 30 mM NaCl, 1 mM DTT] mit 8 M
Harnstoff resuspendiert und für 12 h bei 4 °C gegen Dialyse-Puffer mit 4 M Harnstoff
dialysiert. Anschließend folgte eine Dialyse gegen harnstofffreien Dialyse-Puffer (24 h,
4 °C). Die auf diese Weise renaturierten Proteine konnten nach Herstellerangaben (IBA,
Göttingen) über Strep-Tactin-Sepharose affinitätschromatographisch dargestellt werden.
Material & Methoden
26
Alternativ wurden (His)6-markierte Amidase-2-Proteine, welche angereichert in Einschluß-
körpern vorlagen, mit Hilfe präparativer Gelelektrophorese gereinigt. Hierzu wurden die
Bakteriensedimente fünfmal mit Lysispuffer [50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl,
1 mM EDTA, 0.5 % (v/v) Triton X-100] gewaschen und zentrifugiert (20 min, 15000 upm,
4 °C). Das resultierende Sediment wurde in 5 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgenommen
und die Proteine über präparative SDS-Polyacrylamid-Gele nach SCHARF & NOVER (1984)
aufgetrennt. Das (His)6-AMI2-Fusionsprotein wurde abschließend mittels Elektroelution
(2.12.5) aus dem Gel eluiert.
Die Reinigung bakteriell exprimierter (His)6-YUCCA-Fusionsproteine erfolgte unter
nativen Bedingungen nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden) unter Verwendung von Ni-
NTA-Agarose als Affinitätschromatographiematrix. Zur homogenen Darstellung des
rekombinanten YUCCA-Proteins wurde die affinitätschromatographisch angereicherte
Proteinfraktion über denaturierende SDS-Polyacrylamidgele (2.12.1) separiert und das
YUCCA-Protein durch Elektroelution (Electo-Eluter Modell 422, Bio-Rad, München)
nach Protokoll des Herstellers isoliert.
2.8.2 Präparation einer bakteriellen Tryptophan-2-Monooxygenase
Die Anreicherung der heterolog exprimierten Tryptophan-2-Monooxygenase (TMO) aus
Pseudomonas savastanoi erfolgte in Anlehnung an EMANUELE et al. (1995). Das gefrorene
Bakteriensediment (2.5.2) wurde auf Eis aufgetaut, in 1/10 Volumen Lysis-Puffer
[100 mM Tris/HCl, pH 8.3, 12 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA] resuspendiert und
mittels Ultraschallbehandlung (6 x 10 s) aufgeschlossen. Das Lysat wurde zentrifugiert
(20 min, 17000 upm, 4 °C), der Überstand dekantiert und tropfenweise ad 0.55 % (w/v)
mit Polyethylenimin (0.1 g/l) in 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 versetzt. Nach einer 60 min
Inkubation unter Rühren wurde der Ansatz zentrifugiert (20 min, 17000 upm, 4 °C) und
das Sediment verworfen. Der Überstand wurde portionsweise mit gepulvertem Ammoni-
umsulfat bis zu einer Sättigung von 60 % versetzt und für 60 min unter Rühren inkubiert.
Gefällte Proteine wurden sedimentiert (15 min, 15000 upm, 4 °C), in einem möglichst
geringen Volumen 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 aufgenommen, und über Nacht gegen
800 Volumen 100 mM Tris/HCl, pH 8.3 dialysiert. Die gewonnene TMO Präparation
(14 – 15 mg Protein/ml) wurde aliquotiert und bis zu ihrer Verwendung bei - 20 °C ge-
lagert.
Material & Methoden
27
2.8.3 Reinigung der Tryptophan-Synthase von Salmonella typhimurium
Zur Gewinnung der Tryptophan-Synthase aus Salmonella typhimurium wurden die
gefrorenen Bakteriensedimente (2.5.2) auf Eis aufgetaut, in 1/10 Volumen Puffer T
[50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 5 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0.1 mM
Pyridoxalphosphat] resuspendiert und unter Verwendung von Ultraschall (6 x 10 s)
aufgeschlossen. Der Enzymkomplex wurde, wie bei MILES et al. (1989) beschrieben, durch
sequentielle Kristallisation mit Polyethylenglykol 8000 angereichert. Die resultierenden
Kristalle wurden in 20 ml Puffer T resuspendiert, die Proteine mit Ammoniumsulfat
(85 g/l) über 60 min unter Rühren präzipitiert und sedimentiert (20 min, 17000 upm,
4 °C). Die isolierten Proteine wurden in 5 ml Puffer T aufgenommen und über PD-10
Einheiten (Pharmacia Biotech) entsalzt. Bis zur Verwendung konnten die Enzyme bei
- 20 °C gelagert werden.
2.8.4 Präparation pflanzlicher Enzymrohextrakte
Zur Gewinnung von Proteinextrakten wurde, wenn nicht anders angeführt, ausschließlich
Pflanzenmaterial verwendet, welches zuvor in Flüssigstickstoff zerstoßen wurde. Die
Homogenisierung des Pflanzenmaterials erfolgte entweder durch Mörsern mit Seesand
oder durch Mixen im „Waring blendor“ in Homogenisierungspuffer [50 mM HEPES,
pH 7.5, 200 mM Saccharose, 3 mM DTT, 3 mM EDTA, 5 g/l Polyvinylpyrrolidon]. Nach
Filtration des Extraktes über Verbandmull wurden Zelltrümmer, Seesand und Zellwände
durch Zentrifugation (10000 x g, 30 min, 4°C) sedimentiert und verworfen. Eine
Anreicherung der Proteine des Überstandes erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung (AS-
Fällung), bei der den Proteinextrakten unter Rühren bei 4 °C gepulvertes Ammoniumsulfat
(AS) portionsweise zugefügt wurde, bis die gewünschte AS-Sättigung (70 %) erreicht war.
Präzipitierte Proteine wurden nach 1 h Inkubation sedimentiert (12000 x g, 20 min, 4 °C),
in Puffer aufgenommen und mittels Dialyse oder Gelfiltration (PD-10, Pharmacia Biotech)
entsalzt. Wenn nicht anders angegeben, wurde die gesamte Dialyse-Fraktion bei
100000 x g zentrifugiert, und der Überstand für anschließende Experimente gewonnen.
2.8.5 Extraktion indolischer Verbindungen aus Pflanzengewebe
Zur qualitativen und quantitativen Analyse indolischer Verbindungen in Arabidopsis
thaliana wurde sowohl unter Gewächshausbedingungen (2.5.3), als auch steril
angezogenes Pflanzenmaterial (2.5.5) herangezogen. Für die Analyse wurden je 0.5 g
Material & Methoden
28
gequollene Samen oder ganze Pflanzen (Blatt und Wurzelgewebe) verwendet. Das Gewebe
wurde unverzüglich nach der Ernte in siedendes Methanol, welches 10 – 50 pmol [2H]5-
Indol-3-acetamid und 100 – 150 pmol [2H]2-Indol-3-essigsäure als interne Standards
enthielt, gegeben und für 10 min gekocht. Anschließend wurde das Gewebe zweimal mit je
20 ml Methanol bei Raumtemperatur reextrahiert (20 min) und die vereinigten Extrakte
filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne gebracht, in HPLC-Laufmittel ([60 %
iso-Hexan, 40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol)
aufgenommen und mittels HPLC (2.10.1.2) separiert. Die indolischen Komponenten
wurden isoliert (2.10.1.2), getrocknet und mittels GC-MS/MS (2.11.5) nach
entsprechender Derivatisierung analysiert. Bei ausschließlicher Analyse von Indol-3-
acetamid wurde der Extrakt, wie unter Kap. 2.8.5 beschrieben, dünnschicht-
chromatographisch vorgereinigt.
2.9 Enzymatische Analysen
2.9.1 Photometrische Bestimmung der Aktivität heterolog exprimierter
Amidase
Die Bestimmung der Amidase-Aktivität erfolgte nach der Methode von HILLER & VAN
SLYKE (1933) durch die Analyse des gebildeten Ammoniaks. In dieser sogenannten
Berthelot-Reaktion wird der Ammoniak zu Chloramin umgesetzt, welches mit Phenol eine
blaue Indophenol-Verbindung bildet (BOLLETER et al., 1961). Die Reaktion erfolgte, wenn
nicht gesondert angegeben, in 1 ml Ansätzen [100 mM KPi-Puffer, pH 8.0] mit je 5 µg
gereinigtem Protein und 10 mM Indol-3-acetamid (IAM). Die enzymatische Reaktion
wurde nach 4 h durch die Zugabe von je 0.33 M Natriumphenolat, 0.02 M
Natriumhypochlorid und 0.01 % (w/v) Natriumpentacyanonitrosylferrat (III) gestoppt, und
für 2 min bei 95 °C erhitzt. Nach Abkühlen konnte der Substratumsatz photometrisch bei
640 nm ermittelt werden.
2.9.2 Bestimmung der Aktivität bakteriell exprimierter Amidase mittels
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Bei erwarteten Substratumsätzen von weniger als 50 µM, oder bei Substraten, die bei ihrer
Hydrolyse kein Ammoniak freisetzten, erfolgte die Quantifizierung der Reaktions-
produkte der Amidase-Reaktion mittels HPLC. Zu diesem Zweck wurden
Material & Methoden
29
Reaktionsansätze, wie unter Kap. 2.9.1 beschrieben, nach 4 h mit 50 µl konzentrierter
Salzsäure versetzt, mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert und am Rotationsverdampfer
zur Trockne gebracht. Der Niederschlag wurde in HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan,
40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen
und über eine ZorbaxSil-Säule getrennt (2.10.1.2). Der Chromatographieverlauf ließ sich
anhand des UV280-Signals darstellen. Die Quantifizierung der Indol-3-essigsäure
(Rt = 2.65 min) erfolgte nach externer Standardisierung durch die Analyse der UV-
Signalflächen.
2.9.3 Nachweis des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Protein-
extrakten
Zur Untersuchung des Indol-3-acetamid-Umsatzes in pflanzlichen Proteinextrakten wurde
die Umsetzung von [2H]5-Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure untersucht, um das
gebildete Reaktionsprodukt von endogen vorhandener Indol-3-essigsäure unterscheiden zu
können. Der Standardreaktionsansatz (300 µl) enthielt in 50 mM KPi-Puffer, pH 8.0, 1 mM
[2H]5-Indol-3-acetamid und 200 µl Proteinrohextrakt (2.8.4) bzw. 100 µl einer
chromatographisch angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.1). Die Reaktionsprodukte
wurden nach einer vierstündigen Inkubation bei 30 °C nach Ansäuern auf pH 2.0 (HCl) mit
Ethylacetat extrahiert, die organische Phase getrocknet und mit Diazomethan methyliert
(WEILER, 1981). Nach Aufnahme in Chloroform und GC-MS-Analyse (2.11.4) konnte der
Substratumsatz anhand interner Standardisierung mit 250 pmol [2H]2-Indol-3-essigsäure
errechnet werden.
2.9.4 Aktivitätsbestimmung der Nitrilasen
Zur qualitativen wie auch quantitativen Analyse der Nitrilase-Aktivität wurden 500 µg
Proteinrohextrakt bzw. 1 µg affinitätschromatographisch gereinigtes Protein mit 5 µl 1 M
Indol-3-acetonitril Lösung versetzt und mit 100 mM KPi-Puffer, pH 8.0 ad 1 ml aufgefüllt.
Nach 12 h Inkubation bei 30 °C wurde der Ansatz mit konzentrierter Salzsäure (50 µl)
versetzt und mit einem Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde
abgenommen, im Vakuum zur Trockne gebracht, in HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan,
40 % Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen
und über eine ZorbaxSil-Säule chromatographiert (2.10.1.2). Die Trennung der indolischen
Komponenten wurde anhand des UV280-Signals verfolgt, und aus der Fläche der UV-
Material & Methoden
30
Signale wurde nach externer Standardisierung die Menge an Indol-3-essigsäure
(Rt = 2.65 min) bzw. Indol-3-acetamid (Rt = 5.28 min) abgeleitet.
2.9.5 Bestimmung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität
Wenn nicht anders angegeben, wurde ein auf pH 8.0 gepufferter Proteinextrakt ad 10 mM
Tryptophan mit wäßriger Tryptophan-Lösung (20 mM) versetzt und über 12 h bei 30 °C
inkubiert. Nach Ansäuern des Ansatzes mit 35 µl 12 M HCl wurde die Probe mit einem
halben Volumen Ethylacetat extrahiert. Ein Aliquot der organischen Oberphase (ca. 65 %
des Ausgangsvolumens an Ethylacetat) wurde abgenommen und unter Stickstoff vom
Lösungsmittel befreit. Die getrockneten Proben wurden mit Hilfe von Diazomethan
derivatisiert (WEILER, 1981), erneut eingeengt und in 35 µl Chloroform p.A. resuspendiert.
Der durch die Derivatisierung gebildete Indol-3-essigsäuremethylester konnte
anschließend gaschromatographisch-massenspektrometrisch dargestellt werden, wobei die
Menge an enthaltener Indol-3-essigsäure (IES) entweder anhand externer Kalibrierung aus
dem Massensignal (m/z) 190, oder durch interne Standardisierung mit 100 pmol [2H]2-
Indol-3-essigsäure abgeleitet wurde.
2.9.6 Analyse der Tryptophanmetabolisierung in pflanzlichen Protein-
extrakten mittels gekoppelter HPLC/GC-MS/MS-Technik
Die Identifizierung indolischer Metaboliten der Tryptophanumsetzung in pflanzlichen
Proteinextrakten erfolgte unter Verwendung einer hochauflösenden und zugleich sehr
sensitiven Technik, welche auf einer Kopplung von Hochleistungsflüssigkeits-
chromatographie und GC-MS/MS-Analytik beruht. Zur Analyse wurden je 400 µl
unterschiedlich stark angereicherte, und auf pH 8.0 gepufferte Proteinfraktionen (2.8.4,
2.10.2.1, 2.10.2.2) mit [2H]5-L-Tryptophan (5 mM Endkonzentration) versetzt, und für 5 h
bei 37 °C inkubiert. Die Ansätze wurden daraufhin auf pH 2.0 (HCl) eingestellt, mit einem
Volumen Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase im Vakuum zur Trockne
gebracht. Der Rückstand wurde in 400 µl HPLC-Laufmittel ([60 % iso-Hexan, 40 %
Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol) aufgenommen und
nach Zentrifugation in 100 µl Aliquoten chromatographiert (Flußrate 1.5 ml; UV-Vis
280 nm). Die indolderivathaltigen Fraktionen (vgl. Abb. 3.17) wurden isoliert und
getrocknet. Die IES-Fraktion wurde mit Diazomethan, die IAM-Fraktion mit Diazomethan
Material & Methoden
31
und anschließend mit Trifluoressigsäureanhydrid derivatisiert, in 10 µl Chloroform aufge-
nommen und gaschromatographisch-massenspektrometrisch untersucht (2.11.5).
2.10 Chromatographische Trenntechniken
2.10.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) stellt eine hochauflösende
Methode dar, um komplexe Stoffgemische voneinander zu trennen. Sie wurde hier zum
einen zur präparativen Produktaufreinigung der [3H]3-6-Azido-L-tryptophan- (2.7.2),
[3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid- (2.7.3) bzw. [2H]5-Indol-3-acetamid-Synthese (2.7.4)
genutzt, und zum anderen, um indolische Substanzgemische aus enzymatischen
Umsetzungen oder nach Extraktion aus pflanzlichen Geweben zu isolieren.
2.10.1.1 Präparative Reinigung von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan
Die Reinigung des synthetisierten [3H]3-6-Azido-L-tryptophans (Rt = 2.3 min) erfolgte
über eine Luna C18-Säule (4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) mit einer Flußrate von
1.5 ml/min in einem Laufmittel aus 50 % (v/v) Methanol. Der Chromatographieverlauf
konnte mit Hilfe eines Durchflußszintillationszählers verfolgt werden.
2.10.1.2 Isolierung indolischer Komponenten aus komplexen Substanz-
gemischen
Die Verwendung von Kieselgelsäulen stellt eine adäquate Methode dar, indolische
Verbindungen voneinander zu trennen, um sie isolieren (2.8.5, 2.9.6) oder aber
quantifizieren (2.9.2, 2.9.4) zu können. In den Experimenten wurde eine ZorbaxSil-Säule
(4 mm x 250 mm, stat. Phase 5 µm) mit einer Flußrate von 1.5 ml/min verwendet. Die
Chromatographie erfolgte isokratisch in einem Laufmittel aus [60 % iso-Hexan, 40 %
Ethylacetat gesättigt mit 0.5 M Ameisensäure], 10 % (v/v) Methanol. Die Retentionszeiten
der untersuchten indolischen Verbindungen können Abb. 3.17 entnommen werden. Die
Absorption der indolischen Komponenten wurde bei λ = 280 nm verfolgt.
2.10.2 Flüssigkeitschromatographie
Zur Trennung komplexer Proteingemische bzw. zur Reinigung von Fusionsproteinen
wurde eine Reihe unterschiedlicher Chromatographieverfahren eingesetzt. Der Chromato-
graphieverlauf wurde anhand der Absorptionsänderung bei 280 nm verfolgt. Abgesehen
Material & Methoden
32
von der Hochdruckgelpermeationschromatographie und den Affinitätschromatographien
wurde für die angeführten Chromatographien ein FPLC-System (P 500 mit GP 250,
Pharmacia Biotech) benutzt.
2.10.2.1 Präparative Ionenaustauschchromatographie an Hydroxyapatit
Die Hydroxyapatit-Matrix (MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit, Bio-Rad) wurde in einer
Trennsäule (30 x 1.6 cm ∅) mit 10 mM Tris/HCl, pH 8.0 äquilibriert. Der gewonnene
Proteinrohextrakt (2.8.4) wurde bei 100000 x g zentrifugiert und der Überstand
(40 – 50 ml) über die Hydroxyapatit-Matrix chromatographiert. Darauf wurde die Säule
mit 70 ml 5 mM KPi-Puffer, pH 8.0 gespült, und anschließend gebundene Proteine mit
Hilfe eines Stufengradienten mit ansteigender KPi-Puffer Konzentration
(60 ml 50 mM KPi-Puffer, pH 8.0; 60 ml 200 mM KPi-Puffer, pH 8.0; 60 ml 400 mM KPi-
Puffer, pH 8.0) eluiert. Die gesamte Chromatographie erfolgte bei 4 °C mit einer Flußrate
von 0.5 ml/min.
2.10.2.2 High Q-Anionenaustauschchromatographie
Zur weiteren Trennung enzymatisch aktiver Proteinfraktionen der Hydroxyapatit-
chromatographie (2.10.2.1) wurden diese schnellstmöglich über eine, in 50 mM Tris/HCl,
pH 8.0 äquilibrierte, High Q-Säule (15 x 1.0 cm ∅, MacroPrep High Q, Bio-Rad)
chromatographiert. Nicht gebundene Proteine wurden mit 70 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0
von der Säule gewaschen. Anschließend erfolgte die Elution spezifisch gebundener
Proteine unter Verwendung eines Stufengradienten mit ansteigender Ionenkonzentration
(60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl; 60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM
NaCl; 60 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 400 mM NaCl).
2.10.2.3 Hochdruckgelpermeationschromatographie
Als abschließender chromatographischer Reinigungsschritt zur Anreicherung der Indol-3-
essigsäure-Synthase aus Arabidopsis thaliana wurde eine Gelpermeationschromatographie
durchgeführt. Um die Chromatographie so schnell und schonend wie möglich durch-
zuführen, fand ein Perfusionschromatographiesystem (Perseptive Biosystems) in
Kombination mit einer Bio-Silect SEC-125-5 Säule (7.8 x 300 mm, Bio-Rad)
Verwendung. Die Chromatographie erfolgte isokratisch über 25 min in 50 mM Tris/HCl,
pH 8.0, 200 mM NaCl mit einer konstanten Flußrate von 1 ml/min (90 – 105 bar).
Enzymatisch aktive Proteinfraktionen der High Q-Chromatographie (2.10.2.2) wurden bei
Material & Methoden
33
100000 x g zentrifugiert und in 400 µl Aliquoten (0.75 mg Protein) chromatographiert.
Neben der Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase diente diese Technik zudem
dazu, das Molekulargewicht des Komplexes in erster Näherung zu bestimmen. Dazu
wurden je 100 µl der 1 ml Fraktionen mit 200 µl 20 mM L-Tryptophan und 100 µl 50 mM
Tris/HCl, pH 8.0 versetzt, unter Standardbedingungen inkubiert (2.9.5) und
gaschromatographisch-massenspektrometrisch analysiert. Die Größenkalibrierung der
Säule erfolgte mittels eines Proteinstandardmixes (Gel Filtration Standard, Bio-Rad).
2.10.2.4 Affinitätschromatographie an Strep-Tactin-Sepharose
Die Reinigung Strep-tag-II-markierter Proteine erfolgte, wenn nicht anders angegeben,
unter nativen Bedingungen. Bakterieller Rohextrakt (2.5.2) wurde, wenn nötig mittels
Ultrafiltration, auf ein Volumen von 10 ml eingeengt (Centriprep, Millipore) und
zirkulierend über 30 min mit einer Flußrate von 1 ml/min auf die Affinitätsmatrix (Strep-
Tactin-Sepharose, 1 ml Bettvolumen) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit
5 – 10 Volumen Waschpuffer [100 mM KPi-Puffer, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA]
wurden spezifisch gebundene Proteine mit 20 ml Elutionspuffer [100 mM KPi-Puffer,
pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM Desthiobiotin] eluiert.
2.10.2.5 Affinitätschromatographische Reinigung von (His)6-Fusionsproteinen
Die Reinigung bakteriell exprimierter (His)6-Fusionsproteine erfolgte unter nativen
Bedingungen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Ni2+-beladenen
Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)-Agarose nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden).
2.10.2.6 Immunaffinitätschromatographie
Zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von Proteinen wurden Antikörper-
beladene Sepharosematrizes hergestellt (2.7.5). Die Säulen wurden mit 100 ml Laufpuffer
[100 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl] äquilibriert und anschließend mit maximal
30 mg Protein beladen, wobei die Aufgabe der Proben zirkulierend über 1 h mit konstanten
Flußraten von circa 0.5 ml/min erfolgte. Unspezifisch gebundene Proteine wurden
anschließend mit 10 – 20 Säulenvolumen Laufpuffer von der Säule gewaschen. Die
Elution spezifisch gebundener Proteine wurde durch einen pH-Wechsel (Elutionspuffer
[200 mM Glycin, pH 2.8, 200 mM NaCl]) erzielt. Wenn nicht anders angeführt, wurden
die ersten 10 ml des Eluates aufgefangen und mit 1/10 Volumen 10 x PBS [1.4 M NaCl,
27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4] versetzt. Nachdem der pH-Wert der
Material & Methoden
34
Lösung auf pH 7.5 eingestellt wurde, konnte die Lösung durch Ultrafiltration (Centriprep
30 Einheiten, Millipore) konzentriert werden.
2.11 Massenspektrometrie
2.11.1 Darstellung des Indol-3-essigsäuremethylesters
Die quantitative GC-MS- und GC-MS/MS-Analyse der Indol-3-essigsäure erforderte die
Derivatisierung der Säure in ihren Methylester, da sich die freie Säure gaschromato-
graphisch nicht darstellen läßt. Die Methylierung erfolgte nach WEILER (1981) unter
Verwendung von Diazomethan, welches durch alkalische Hydrolyse aus N-Methyl-N-
nitroso-harnstoff synthetisiert wurde.
2.11.2 Synthese von Diazomethan
Zur Synthese des Diazomethans wurden pro ml Diethylether 0.3 ml 40 % (w/v) KOH im
Eisbad unter Rühren gemischt. N-Methyl-N-nitroso-harnstoff (ca. 100 mg) wurde
portionsweise zugefügt, bis die Diethyletherphase intensiv gelb erschien. Nach der
Reaktion wurde die organische Phase dekantiert und über KOH getrocknet.
2.11.3 Trifluoracetylierung des Indol-3-acetamid
Die Analyse des Indol-3-acetamids erfolgte nach Trifluoracetylierung mit Trifluor-
essigsäureanhydrid, da das Amid gaschromatographisch nur schlecht darstellbar ist. Zur
Derivatisierung wurden getrocknete Proben über 1 min mit 50 µl Trifluoressigsäure-
anhydrid behandelt und anschließend im Stickstoffstrom zur Trockne gebracht.
2.11.4 Gaschromatographisch-massenspektrometrische Darstellung von
Indol-3-essigsäure
Zur Untersuchung der Indol-3-essigsäure-Synthase- und der Amidase-Enzymaktivitäten
wurden gaschromatographisch-massenspektrometrische-Analysen (GC-MS-Analyse) ein-
gesetzt. Die zu untersuchende Probe wurde methyliert (2.11.1), getrocknet und in 30 µl
Chloroform aufgenommen. Die Messung erfolgte mittels eines Varian GC 3400
Gaschromatographen in Verbindung mit einem Massendetektor der Firma Finnigan MAT
(Bremen, Modell Magnum). Die GC-MS-Analyse erfolge mit maschineller Aufgabe der
Proben bei einem Injektionsvolumen von 1 µl unter nachfolgend aufgeführten
Chromatographie- und Detektionsbedingungen:
Material & Methoden
35
Splitlos, Injektor-Temperatur 260 °C; Helium als Trägergas (Vordruck 80 kPa);
Trennsäule DB-17 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm); Temperaturprogramm: 1 min
80 °C, 30 °C / min auf 200 °C, 5 °C / min auf 250 °C; Transferline-Temperatur 260 °C;
Scanbereich 50 – 400 u, 1 scan / s; chemische Ionisierung mit Methanol.
2.11.5 Analyse indolischer Verbindungen mittels gaschromatographisch-
massenspektrometrischer Methoden
Die Spurenanalyse indolischer Verbindungen aus pflanzlichen Extrakten (2.8.5) erforderte
eine besonders sensitive, gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse (GC-
MS/MS-Analyse). Zu diesem Zweck wurden die zu analysierenden Proben im Vakuum
getrocknet, in 20 µl Methanol aufgenommen und mit 100 µl etherischem Diazomethan
versetzt. Für die Analyse von Indol-3-acetamid (IAM) wurden die Proben erneut
getrocknet, mit 50 µl Trifluoressigsäureanhydrid versetzt, nach einminütiger Inkubations-
zeit im Stickstoffstrom getrocknet und in 10 µl Chloroform resuspendiert. Die Analysen
erfolgten an einem Varian Saturn 2000 Ionenfallen-Massenspektrometer, welches mit
einem Gaschromatographen (CP 3800) der Firma Varian, sowie einem CombiPal
Autoinjektor (Varian, Darmstadt) verbunden war. Das Massenspektrometer wurde im CI-
MRM Modus mit Methanol als gasförmigem Reaktionspartner und Detektion positiver
Ionen betrieben. Die Analyse erfolgte nach maschineller Probenaufgabe (1 µl) unter den
nachfolgenden Chromatographie- und Detektionsbedingungen:
Splitlos, Injektor-Temperatur 260 °C; Helium als Trägergas (1 ml / min); Trennsäule ZB-
50 (0.25 mm x 30 m, stat. Phase 0.25 µm); Temperaturprogramm: 1 min 50 °C,
20 °C / min auf 250 °C; Transferline-Temperatur 260 °C; Scanbereich 100 – 380 u,
3 scan / s; chemische Ionisierung mit Methanol.
Mutterionen ([M+H]+)
Trifluoracetyliertes IAM: [1H]-IAM m/z 367
[2H]5-IAM m/z 372
Methylierte IES: [1H]-IES m/z 190
[2H]2-IES m/z 192
Material & Methoden
36
Unmarkiertes IAM (Rt = 8.75 min) wurde durch die Fragmentionen m/z: 339, 323, 242 und
226, pentadeuteriertes IAM (Rt = 8.70 min, [2H]5-IAM) durch die Fragmentionen m/z: 344,
328, 247 und 231 charakterisiert. Die Indol-3-essigsäure konnten durch die Fragmentionen
m/z 130 (Rt = 11.85 min) und m/z 132 (Rt = 11.83 min, [2H]2-IES) identifiziert werden.
Die Quantifizierung endogener Verbindungen erfolgte über das Signalflächenverhältnis der
unmarkierten zu den markierten Verbindungen.
2.11.6 Peptidsequenzierung mittels ESI-QTOF-Massenspektrometrie
Coomassie-gefärbte Proteinbanden wurden nach SDS-PAGE gemäß JENSEN et al. (1998)
mit Trypsin (sequencing grade modified, Promega) im Gel verdaut. Nach Extraktion der
Peptidfragmente aus dem Gelstück wurde die Probe mittels ZipTips C18 (Millipore)
entsalzt. Die anschließenden massenspektrometrischen Untersuchungen wurden unter
Verwendung eines „quadrupole/time-of-flight“ Hybrid-Massenspektrometers (Q-TOF2,
Micromass) von Herrn Dr. Piotrowski (Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie) durchgeführt.
Die Ionisierung der Peptide erfolgte mittels Nano-Elektrospray. Die Messungen wurden im
Positiv-Modus durchgeführt und die Spektren im m/z-Bereich von 400 – 1600 mit 2.4 s
Integrationszeit aufgezeichnet. Doppelt oder dreifach geladene Moleküle wurden für eine
Fragmentierung im MS/MS-Modus ausgewählt. Die Interpretation der MS/MS-Daten
wurde durch den MaxEnt3 Algorithmus und das BioLynx Programm aus dem MassLynx
3.4 Software-Paket (Micromass) unterstützt.
2.12 Elektrophoretische Trenntechniken
2.12.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Trennung von Proteingemischen unter denaturierenden Bedingungen erfolgte über
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in Apparaturen nach STUDIER (1973)
mit diskontinuierlichen Gelsystemen nach LAEMMLI (1970) mittels 12.5 %-iger (w/v)
Trenngele, bzw. in exponentiellen Gradientengelen (10 – 20 % (w/v)) nach SCHARF &
NOVER (1982). Als Molekulargewichtsstandard diente der LMW („Low molecular weight-
Standard“) der Firma Pharmacia Biotech. Zur Detektion der Proteine wurden die Gele mit
Coomassie-Brilliantblau oder mittels Silber nach BLUM et al. (1987) gefärbt.
Material & Methoden
37
2.12.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) als erste Dimension einer zweidimensionalen
Elektrophorese wurde, wie bei O’FARRELL (1975) beschrieben, in 4 %-igen Polyacryl-
amid-Röhrchengelen (130 mm x 1.5 mm) unter Zusatz von 4 % (v/v) Ampholythen
pH 5 – 8 und 2 % Nonidet P-40 durchgeführt. Die Proteinproben (250 – 350 µg) wurden
mit drei Volumen eiskaltem Methanol versetzt und über 12 h bei -20 °C inkubiert.
Präzipitierte Proteine wurden durch Zentrifugation (13000 upm, 15 min, 4 °C) gewonnen
und im Vakuum getrocknet. Das Sediment wurde anschließend in 65 µl IEF-Probenpuffer
[30 % (v/v) Glycerol, 5 % Nonidet P-40, 2.5 % (w/v) SDS, 5 % (v/v) Ampholyte, 5 %
(v/v) β-Mercaptoethanol, 85 mM Tris, 9 M Harnstoff] resuspendiert. Die isoelektrische
Fokussierung fand in einer IEF-Kammer mit 20 mM NaOH (Anodenpuffer) und 5 mM
Phosphorsäure als Kathodenpuffer nach folgendem Programm statt:
Zeit Spannung
30 min 350 V
14 h 500 V
1 h 600 V
Anschließend wurde das Gel aus den silanisierten Röhrchen gespült, für 20 min in
Äquilibrierungspuffer [62.5 mM Tris/HCl, pH 6.8, 1 % (w/v) SDS, 1 % (v/v) Glycerin,
5 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0.002 % (w/v) Bromphenolblau] inkubiert, und in der
zweiten Dimension über ein 10 – 20 %-iges Gradientengel (exponentieller Gradient)
getrennt (2.12.1). Die so erhaltenen Gele wurden gefärbt oder für Western-Analysen
geblottet (2.13.1).
2.12.3 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung von nativen Polypeptiden erfolgte in exponentiellen Gradientengelen
(10 – 20 % (w/v)) in Anlehnung an SCHARF & NOVER (1982). Die Elektrophorese der
SDS-freien Polyacrylamid-Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) erfolgte bei 4 °C und einer
konstanten Stromstärke von 8 mA über einen Zeitraum von etwa 14 h. Die Proteinproben
wurden mit 1/5 Volumen 87 %-igem Glycerin sowie etwas Bromphenolblau versetzt und
als konzentrierte Lösung direkt auf das Gel aufgebracht.
Material & Methoden
38
Zur Darstellung von Proteinen in einer zweiten Dimension wurden entsprechende Spuren
des nativen Gels ausgeschnitten und für 20 min in Denaturierungspuffer [125 mM
Tris/HCl, pH 6.8, 1 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) Glycerin, 2 % (v/v) β-Mercaptoethanol,
0.002 % (w/v) Bromphenolblau] inkubiert. Die Trennung in der zweiten Dimension
erfolgte unter denaturierenden Bedingungen (2.12.1).
2.12.4 „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die „Blau-Native“ Elektrophorese erfolgte in Anlehnung an SCHÄGGER et al. (1994) in
einem 0 – 20 %-igen Glycerin, 8 – 18 %-igen Acrlyamidgradientengel mit 500 mM
Amino-n-capronsäure, 50 mM Bis-tris/HCl, pH 7.0 in einem Zweipuffersystem aus
50 mM Tricin, 15 mM Bis-tris, 0.002 % (w/v) Serva Blau G250 (Kathode) und 50 mM
Bis-Tris/HCl, pH 7.0 (Anode) bei einer konstanten Spannung von 125 V. Der Gellauf
erfolgte bei 4 °C in einem Zeitintervall von 14 – 16 h.
Zur Darstellung der getrennten Proteine in einer zweiten, denaturierenden Dimension
wurden auch hier entsprechende Gelstreifen ausgeschnitten und, wie unter 2.12.3
beschrieben, weiterverarbeitet.
2.12.5 Elektrophoretische Elution geladener Makromoleküle
Die Elution geladener Polypeptide aus nativen wie auch aus SDS-Polyacrylamid-Gelen
erfolgte unter Verwendung eines Membranfallensystems (Electro-Eluter Modell 422, Bio-
Rad) nach Herstellerangaben. Die quantitative Elektroelution nicht fixierter Proteine
erfolgte in nativem Elektroelutionspuffer [25 mM Tris/HCl, pH 8.8, 192 mM Glycin] mit
einer konstanten Spannung von 8 mM pro Membranfalleneinheit über einen Zeitraum von
14 h bei 4 °C. Bei der Elution fixierter bzw. Coomassie-gefärbter Proteine wurde ein SDS-
haltiger Elektroelutionspuffer [25 mM Tris/HCl, pH 8.8, 192 mM Glycin, 0.1 % (w/v)
SDS] verwendet. Vor der Entnahme der Proteinlösung wurde die Apparatur für 10 s bei
einer angelegten Spannung von 200 V umgepolt, um die Polypeptide von der
Membranoberfläche zu lösen.
Material & Methoden
39
2.13 Immunologische Methoden
2.13.1 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose
Die Überführung der mittels SDS-PAGE (2.12.1) aufgetrennten Proteine auf Nitrocellulose
(Western-Blot) erfolgte nach TOBWIN et al. (1979). Der elektrophoretische Transfer auf die
Nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85, Porenweite 0.45 µm) erfolgte in Blotpuffer
[20 mM Tris/HCl, 150 mM Glycin, 20 % (v/v) Methanol, 0.1 % (w/v) SDS] bei einer
Temperatur von 4 °C über Nacht bei 60 mA oder alternativ für 2 h bei 200 mA und RT.
Eine reversible Färbung transferierter Proteine auf der Nitrocellulose wurde mittels
Ponceau-S-Färbung [1 % (w/v) Ponceau-S, 2 % (v/v) Essigsäure] erzielt.
2.13.2 Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine
Zur immunologischen Detektion spezifischer Proteine nach Immobilisierung auf
Nitrocellulose (2.13.1) wurden zunächst unspezifische Bindestellen durch eine einstündige
Inkubation in TBSP [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 % (w/v)
Proteinpulver] abgesättigt. Die Bindung der spezifischen Antikörper erfolgte im gleichen
Puffer für 2 h oder alternativ über Nacht bei 4 °C; die Konzentrationen der eingesetzten
Antikörper sind nachfolgend angeführt. Unspezifisch gebundene Antikörper wurden durch
Waschen mit TBST [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.5 % (v/v)
Triton X-100] entfernt, darauf folgte eine einstündige Inkubation mit, an alkalischer
Phosphatase konjugiertem, Ziege-α-Maus- oder Ziege-α-Kaninchen-Immunglobulin-
Antikörper (1:10.000 verdünnt) in TBSP. Nach Entfernung unspezifisch gebundener
Antikörper (2 x 10 min mit TBST, 1 x 10 min TBS [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM
NaCl, 1 mM MgCl2]) wurde die alkalische Phosphatase mit 330 µg/ml p-Nitroblautetra-
zoliumchlorid und 165 µg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in AP-Puffer [100 mM
Tris/HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2] nachgewiesen.
Material & Methoden
40
Antikörper Spendertier Verdünnung
α-NIT1, Serum (602) Kaninchen 1:13000
α-AMI1, Serum (645) Kaninchen 1:1000
α-AMI2, Serum (644) Kaninchen 1:1000
α-YUCCA, Serum (643) Kaninchen 1:1000
α-RGS-His, Zellkulturüberstand Maus 1:2500
2.13.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren
Für die Gewinnung von polyklonalen Antikörpern gegen die native Amidase 1 aus
A. thaliana bzw. gegen denaturiertes Amidase 2- und YUCCA-Protein aus A. thaliana
wurde bakteriell überexprimierte Proteine (2.8.1) als Antigen verwendet. Die Immuni-
sierung der Kaninchen mit den gereinigten Proteinen sowie die Gewinnung der Antiseren
erfolgte nach WEILER (1986). Die Vorimmunisierung bestand aus vier intradermalen
Injektionen von je 200 µg, in inkomplettem Freundschen Adjuvans emulgiertem,
gereinigtem Protein im Abstand von je einer Woche. Nach weiteren zwei Wochen erfolgte
die Immunisierung durch intramuskuläre Injektion der gleichen Menge an Protein in
inkomplettem Freundschen Adjuvans. Die Blutabnahme erfolgte an einer Ohrenvene
10 Tage nach der Injektion. Nach Absonderung des Blutkuchens (12 h, 4 °C) konnte das
Serum gewonnen und bei - 20 °C gelagert werden.
2.13.4 Nachweis Strep-tag-II-markierter Fusionsproteine
Strep-tag II-markierte Fusionsproteine ließen sich nach SDS-PAGE und Transfer auf
Nitrocellulose unter Verwendung eines Strep-Tactin-alkalische-Phosphatase-Konjugates
(Strep-Tactin-AP, IBA, Göttingen) nach Vorgaben des Herstellers detektieren.
2.13.5 Reinigung spezifischer Antikörper
Die Isolierung von Immunglobulinen aus den gewonnenen Seren (2.13.3) erfolgte nach
MCKINNEY & PARKINSON (1987) durch kombinierte Ammoniumsulfat-/Carpryl-
säurefällung. Immunospezifische Antikörper wurden anschließend unter Verwendung von
Nitrocellulose gereinigt. Hierzu wurden etwa 400 µl einer gereinigten Antigenfraktion auf
ein 4 – 5 cm2 großes Stück Nitrocellulose getropft. Nachdem die Lösung auf der Membran
Material & Methoden
41
getrocknet war, wurde diese mit 5 ml TBSP [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl,
1 mM MgCl2, 2 % (w/v) Proteinpulver] gesättigt. Die Inkubation der Antikörper mit den
immobilisierten Antigenen erfolgte über 16 h bei 4 °C. Anschließend wurde die Membran
gewaschen (2 x 20 min TBST [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2,
0.5 % (v/v) Triton X-100], 1 x 20 min TBS [50 mM Tris/HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl,
1 mM MgCl2]) und gebundene Antikörper durch eine 10 minütige Inkubation in 2.5 ml
Elutionspuffer [200 mM Glycin, pH 2.8, 1 mM EGTA] von den Antigenen gelöst. Der
Elutionspuffer wurde darauf mit 250 µl 1 M Tris versetzt und der pH-Wert der Lösung auf
pH 7.5 eingestellt. Abschließend wurde der Antikörperlösung 1/10 Volumen 10 x PBS
[1.4 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4] hinzugefügt. Im Falle
längerer Lagerung der Lösung bei 4 °C wurden 0.02 % (w/v) Natriumazid zugesetzt.
2.14 Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen unter Einsatz der
Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-tryptophan und [3H]2-6-Azido-
indol-3-acetamid
Die Photoaffinitätsmarkierung von cytosolischen Proteinen erfolgte in Anlehnung an
FEYERABEND & WEILER (1989) mit dem photosensitiven L-Trp-Derivat [3H]3-6-Azido-L-
tryptophan bzw. dem photosensitiven IAM-Derivat [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid. Dazu
wurde, wenn nicht anders angegeben, auf pH 8.0 gepufferte Proteinlösung in einem
Gesamtvolumen von 300 µl mit 63 kBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan bzw. 80.9 kBq [3H]2-
6-Azidoindol-3-acetamid für 45 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurde
der Ansatz in einer Quarzküvette 10 s bei 8 °C belichtet (Quecksilberhochdrucklampe
HBO 500 W/2, Filter 305 nm, ca. 400 W).
2.15 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung erfolgte nach BRADFORD (1976) gegen Rinderserumalbumin als
Proteinstandard.
2.16 Radioaktivitätsbestimmung
Für die Radioaktivitätsbestimmung wurde ein Flüssigkeits-Szintillationszähler (LS 6000
TA, Beckman) verwendet. Gelstückchen oder wäßrige Proben wurden dazu mit 4.5 ml
Szintillator (Hydroluma) versetzt.
Material & Methoden
42
2.17 Rechnergestützte Sequenzanalysen
Alle DNA- wie auch Aminosäuresequenzanalysen wurden mit der DNAMAN Software
(Version 5.2.2, Lynnon BioSoft, Vaudreuil, Quebec, Kanada) durchgeführt.
2.18 Auswertung
Die präsentierten Ergebnisse stammen, wenn nicht anders ausgewiesen, aus mindestens
zwei unabhängigen Versuchen, wobei jeder Meßpunkt als Mittelwert einer
Dreifachbestimmung ermittelt wurde.
Ergebnisse
43
3 Ergebnisse
Die Indol-3-essigsäure (IES), eines der wichtigsten pflanzlichen Wachstumshormone, ist
an der Regulation beinahe aller pflanzlicher Wachstums- und Entwicklungsprozesse
beteiligt. Obgleich in den vergangenen Jahren intensiv an der Aufklärung der IES-
Homöostase gearbeitet wurde, ist das Verständnis der IES-Biosynthese noch unvollständig.
Viele Hinweise, unter anderem die Unzugänglichkeit IES-defizienter Mutanten,
implizieren, daß mehr als ein Reaktionsweg an der IES-Synthese beteiligt ist (ECKHARDT,
2001).
Für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte in der Vergangenheit ein Enzym-
komplex (IES-Synthase) beschrieben werden (MÜLLER & WEILER, 2000a), welcher
spezifisch L-Tryptophan (L-Trp) zur IES umsetzt. Die enzymatische Zusammensetzung
dieses Komplexes und putative Metabolite der L-Trp-Umsetzung konnten aber nicht bis
ins Detail aufgeschlüsselt werden.
Im folgenden sind Versuche zur Charakterisierung der enzymatischen Komponenten der
IES-Synthase und zur Identifikation putativer Metabolite des Reaktionswegs dargestellt.
Weiterhin wird ein bisher nur von pflanzenpathogenen Bakterien bekannter
Biosyntheseweg über Indol-3-acetamid (IAM) für A. thaliana vorgestellt.
3.1 Vergleich der Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen
Pflanzenspezies
Um den IES-Synthase-Komplex aus pflanzlichem Gewebe anzureichern, wurde zunächst
nach einer Pflanzenspezies gesucht, die eine hohe Enzymaktivität aufweist. Besonderes
Augenmerk galt dabei Pflanzen, welche bereits genetisch gut charakterisiert waren, um
mittels reverser Genetik putative Bestandteile der IES-Synthase möglichst leicht isolieren
zu können.
Der Umsatz von L-Trp zur IES konnte in allen untersuchten Pflanzenspezies sowohl im
Rohextrakt als auch nach Konzentrierung der Proteine mittels Ammoniumsulfat
nachgewiesen werden (Abb. 3.1). Die höchsten spezifischen Aktivitäten ließen sich, nach
Konzentrierung der Proteine, bei Spinat (Spinacia oleracea), Buchweizen (Fagopyrum
esculentum) und der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) nachweisen.
Ergebnisse
44
Abb. 3.1: Spezifische Aktivität der IES-Synthase in unterschiedlichen Pflanzen-spezies
Die Messung der Enzymaktivität erfolgte über Produktquantifizierung mittels GC-MS (2.11.4). : Rohextrakt (12000 x g Überstand); : Aktivität nach Ammoniumsulfat-präzipitation (0 – 70 % Sättigung).
Als Ausgangsmaterial für die Untersuchung der IES-Synthase wurde A. thaliana-Pflanzen-
material gewählt, da die Enzymaktivität in dieser Spezies vergleichsweise hoch ist und das
Genom von A. thaliana, im Gegensatz zum Buchweizen und dem Spinat, bereits
vollständig sequenziert ist.
3.2 Anreicherung der tryptophanmetabolisierenden Protein-
fraktion aus Arabidopsis thaliana
Im Vorfeld dieser Arbeit beschrieben MÜLLER & WEILER (2000a) den enzymatischen
Umsatz von L-Trp zur IES in zellfreien Systemen (Proteinextrakte steril angezogener
Pflanzen, sowie steriler A. thaliana-Zellkulturen). Es konnte ein Proteinkomplex von
160 – 180 kDa Größe identifiziert werden, welcher selektiv das L-Enantiomer des
Tryptophans zur IES umsetzt. Weiterhin konnte die vorgeschlagene Methode zur
Anreicherung der IES-Synthase optimiert werden (POLLMANN, 1999). Basierend auf diesen
Ergebnisse
45
Daten sollte ein schonendes und schnelles Trennverfahren erarbeitet werden, um die IES-
Synthase weiter anzureichern.
3.2.1 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase mittels Chromato-
graphie an Hydroxyapatit
Zur Vorreinigung der IES-Synthase wurde eine Ionenaustauschchromatographie an einer
Hydroxyapatit-Matrix verwendet. Zu diesem Zweck wurde ein Proteinrohextrakt aus
2 – 3 kg Pflanzenmaterial gewonnen (2.8.4) und mit Ammoniumsulfat gefällt (0 – 70 %
Sättigung). Nach Entsalzung wurde der Extrakt im präparativen Maßstab (50 ml) über
Hydroxyapatit chromatographiert (2.10.2.1).
Abb. 3.2: Chromatographie von Arabidopsis thaliana-Proteinextrakten an einer Hydroxyapatit-Matrix
Ammoniumsulfatgefällte Proteine wurden mittels Dialyse entsalzt und über 45 min bei 100000 x g zentrifugiert. Der lösliche Überstand (50 ml) wurde über eine HR 16/20 Hydroxyapatit-Säule mit einer konstanten Flußrate von 0.5 ml/min chromatographiert (2.10.2.1). 200 µl Aliquots der 5 ml Fraktionen wurden mit je 200 µl 20 mM Tryptophan-Lösung versetzt und über 12 h bei 30 °C inkubiert. Die gebildete IES wurde mittels GC-MS-Analysen nachgewiesen (2.11.4). (( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).
Die spezifische IES-Synthase-Aktivität in der vereinigten Elutionsfraktion (80 – 120 ml)
betrug 1.7 pkat/mg. Die nachfolgenden Proteinfraktionen wurden verworfen. Die
spezifische Aktivität konnte auf diese Weise bei einer Ausbeute von 89 % um einen Faktor
1.6 angereichert werden.
Ergebnisse
46
3.2.2 Anreicherung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität mittels
High Q-Anionenaustauschchromatographie
Um die mittels Hydroxyapatitchromatographie (HYC) vorgereinigte Proteinfraktion
(80 – 120 ml Elutionsvolumen) weiter anzureichern, wurde die Proteinlösung über eine
starke Anionenaustauschmatix (Macro-Prep High Q, Bio-Rad) chromatographiert
(2.10.2.2). Unter den gewählten Parametern konnte die tryptophanmetabolisierende
Aktivität auf der Säule gebunden, und bei einer Ionenkonzentration von 200 mM Cl-
spezifisch eluiert werden.
Abb. 3.3: Anionenaustauschchromatographie an High Q-Matrix Die über HYC vorgereinigte Proteinlösung (35 – 40 ml) wurde auf eine HR 10/10 Macro-Prep High Q-Säule aufgebracht und anschließend mit 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 gespült. Die Elution gebundener Proteine erfolgte unter Verwendung eines Stufen-gradienten mit ansteigender Ionenkonzentration. Je 200 µl der 5 ml Fraktionen wurden in einem IES-Synthase-Aktivitätstest (2.9.5) eingesetzt, und die Menge der gebildeten IES mittels GC-MS-Analysen untersucht (2.11.4). ( ( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).
Die spezifische Aktivität der IES-Synthase ließ sich in der Elutionsfraktion (120 – 160 ml)
durch die beschriebene Ionenaustauschchromatographie auf 5.6 pkat/mg steigern; die
Ausbeute gegenüber der Ausgangsaktivität lag bei nur 33 %. Alle anderen Protein-
fraktionen wurden verworfen.
Ergebnisse
47
3.2.3 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung des Indol-3-
essigsäure-Synthase-Komplexes durch Hochdruckgelpermeations-
chromatographie
Die klassische Gelpermeationschromatographie erwies sich als wenig effektiv (POLLMANN,
1999; MÜLLER, 1999), da geringe Flußraten (0.2 ml/min) und hohe Bettvolumen (280 –
560 ml) zu sehr langen Chromatographiezeiten führten. Daraus resultierten Gesamt-
aktivitätsverluste, die zwischen 50 - 80 % lagen. Die Verwendung einer Hochdruckgel-
filtrationssäule (BioSilect SEC 125-5, Bio-Rad) erlaubte eine deutlich höhere Flußrate
(1 ml/min, bei 90 – 105 bar), und somit eine, bezogen auf die Enzymaktivität,
verlustfreiere Trennung der Proteine. Durch diese Hochdruckgelpermeation konnte eine
weitere Anreicherung des Proteinkomplexes erzielt werden. Weiterhin ließ sich mit Hilfe
dieser Methode das genäherte Molekulargewicht des IES-Synthase Komplexes von
160 kDa (MÜLLER & WEILER, 2000a) über einen Standardproteinmix (Thyroglobulin, 670
kDa; IgG, 158 kDa; Ovalbumin, 44 kDa; Myoglobin, 17 kDa, Vitamin B-12, 1.35 kDa;
Bio-Rad) bestätigen.
Proteine der Hauptaktivitätsfraktion (120 – 160 ml) der High Q-Anionenaustausch-
chromatographie wurden 100000 x g zentrifugiert und anschließend in 400 – 500 µl
Aliquoten (max.0.75 mg/Lauf) isokratisch in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl über
eine SEC 125-5 Säule (300 mm x 7.8 mm) getrennt (2.10.2.3). Es wurden jeweils 1 ml
Fraktionen gesammelt, wobei die entsprechenden Fraktionen der nacheinander
durchgeführten Chromatographien vereinigt wurden. Wie Abbildung 3.2 zu entnehmen ist,
eluierte das Aktivitätsmaximum in einem Massenbereich von 180 – 160 kDa (8 – 9 ml
Elutionsvolumen). Dieses Resultat deckt sich mit den bereits publizierten Daten (MÜLLER
& WEILER, 2000a). Im Zuge dieser Chromatographie konnte der Komplex um einen Faktor
von 150 – 180 angereichert werden. Die errechnete spezifische Aktivität der IES-Synthase
betrug 46.6 pkat/mg, wobei die Ausbeute bei 7 % der Ausgangsaktivität lag.
Ergebnisse
48
Abb. 3.4: Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der IES-Synthase-Komplexes mittels Hochdruckgelpermeationschromatographie
Maximal 0.75 mg der Hauptaktivitätsfraktion der High Q-Chromatographie wurden nach 100000 x g Zentrifugation ihrer Größe nach getrennt. Die Chromatographie wurde isokratisch mit einer konstanten Flußrate von 1 ml/min durchgeführt, als Laufmittel diente ein Puffer aus 50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl. Zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität wurden je 200 µl der einzelnen Fraktionen unter Standardbedingungen (2.9.5, 2.11.4) gaschromatogaphisch-massenspektro-metrisch untersucht. (( ): UV280-Signal; ( ): Relative Enzymaktivität).
3.2.4 Chromatographie an einer Tryptophanaffinitätsmatrix zur
Reinigung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes
Durch das oben angeführte Chromatographieverfahren ließ sich der IES-Synthase-
Komplex anreichern, jedoch nicht homogen darstellen. Eine affinitätschromatographische
Reinigung könnte einen entscheidenden Schritt zur homogenen Darstellung bedeuten. Eine
direkte Kopplung des Tryptophans an eine Säulenmatrix erbracht keinen Reinigungserfolg
(MÜLLER, 1999), weitere Versuche zeigten, daß eine Substitution an der Seitenkette des
Indolgerüstes ebenfalls zu unwirksamen Indolderivaten führte (POLLMANN, 1999). Daher
sollte hier das Substratanalogon 5-Hydroxy-L-tryptophan über einen möglichst langen und
beweglichen Abstandhalter („Spacer“) an eine Säulenmatrix gekoppelt werden. Zu diesem
Zweck wurde 5-Hydroxy-L-tryptophan über die 6-Position des Indolgerüstes mittels
Diazokopplung mit p-Aminohippursäure konjugiert, welche ihrerseits an Rinderserum-
albumin (RSA) substituiert vorlag (2.7.1).
Ergebnisse
49
Abb. 3.5: Strukturformel des synthetisierten Tryptophan-Konjugates Zur Konjugation des, mit p-Aminohippursäure substituierten, Rinderserumalbumins wurden 30 mg Protein in 5 ml H2O gelöst und mit 60 mg NaNO2 und 30 mg NH4SO2NH2 umgesetzt. Das diazotierte Reaktionsprodukt wurde anschließend in 10 ml 0.1 M Boratpuffer, pH 9.0 mit 10 mg 5 Hydroxy-L-tryptophan konjugiert und mittels Dialyse von niedermolekularen Bestandteilen befreit.
Ein Aktivitätstest unter Zusatz aufsteigender Mengen des Syntheseproduktes sollte
Auskunft über die Verwendbarkeit der Substanz als Affinitätsligand in einer
anschließenden Säulenchromatographie geben. Dazu wurden 200 µl einer High Q-Fraktion
(2.10.2.2) mit 200 µl 20 mM L-Trp sowie unterschiedlichen Mengen des RSA-5-Hydroxy-
L-tryptophan-Konjugates (0.25 µg – 20 µg) über 3 h bei 37 °C inkubiert, und anschließend
die enzymatisch gebildete Menge an IES gaschromatographisch-massenspektrometrisch
quantifiziert. Im Vergleich zu den mitgeführten Positivkontrollen (ohne Affinitätsligand)
konnte keine signifikante Hemmung der IES-Synthase-Aktivität ermittelt werden (ohne
Abbildung). Daher scheint das Tryptophan-Konjugat von der IES-Synthase als Substrat
nicht erkannt zu werden. Auch nach Bindung des Konjugates an eine Protein G-Matrix
(Pharmacia Biotech) konnte die Aktivität weder nachweislich gebunden werden noch
konnte die enzymatische Aktivität verzögert eluiert werden (nicht dargestellt). Bezüglich
dieser Resultate muß davon ausgegangen werden, daß das synthetisierte Konjugat als
Affinitätsligand nicht zu gebrauchen ist.
3.3 Trennung angereicherter Indol-3-essigsäure-Synthase-Frak-
tionen durch native Gelelektrophorese
3.3.1 Separation von Proteinkomplexen über exponentielle Gradienten-
gele
Durch native Gelelektrophorese in Anlehnung an SCHARF & NOVER (1982) ließ sich die
tryptophanumsetzende Enzymaktivität im Gel darstellen. Nach elektrophoretischer
Trennung wurden die Gele horizontal in 1 cm Streifen geteilt, und ein Aktivitätsnachweis
Ergebnisse
50
im Gel durchgeführt. Abschließend wurde der [2H]5-Indol-3-essigsäure-Gehalt mittels GC-
MS-Analyse (2.11.4) quantifiziert.
Abb. 3.6: Gelelektrophoretische Trennung von Proteinen einer angereicherten Indol-3-essigsäure-Synthase-Fraktion
Eine flüssigkeitschromatographisch (2.10.2.3) angereicherte IES-Synthase-Fraktion (5 mg) wurde über native Polyacrylamid-Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) aufgetrennt. Darauf wurden die Gele in 1 cm Streifen horizontal geschnitten. Zur Bestimmung der Enzymaktivität wurden die Gelstreifen in jeweils 5 ml Puffer [50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM [2H]5-L-Tryptophan] 16 h bei 30 °C im Schüttler inkubiert und anschließend der [2H]5-IES Gehalt bestimmt (2.11.4). Aus einem identischen Gel wurde der Bereich höchster Aktivität scharf ausgeschnitten und die Proteine aus dem Gelstreifen eluiert (2.12.5). Das Eluat wurde mit Centriprep 10 Konzentratoren auf ein Volumen von 50 µl eingeengt und in einer zweiten Dimension über ein 12.5 % SDS-Gel getrennt. (A): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der ersten elektrophoretischen Dimension; (B): Enzymaktivität in Gelsegmenten der ersten elektrophoretischen Dimension; (C): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der zweiten elektrophoretischen Dimension. Die Pfeile markieren Proteine, die für eine Mikrosequenzierung eingesetzt wurden.
Aus einem zweiten, simultan erstellten, Gel wurden die Proteine im Bereich der höchsten
Enzymaktivität isoliert und in einer zweiten Dimension über ein 12.5 % SDS-Polacryl-
amidgel separiert. Detektierbare Proteinbanden wurden im Gel verdaut, eluiert und
anschließend mikrosequenziert (2.11.6). Es konnten zwei Proteine identifiziert werden,
wobei in Bande (1) ein Protein mit Ähnlichkeit zum NADP-Malat-Enzym (Accession
NP_196728) und in Bande (3) die kleine Untereinheit der RubisCO (Accession P10798)
Ergebnisse
51
gefunden werden konnte. Beide Enzyme sind ihrer enzymatischen Natur nach nicht an der
IES-Biosynthese beteiligt.
3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung und Anreicherung der Indol-3-
essigsäure-Synthase-Aktivität mittels „Blau-Nativer“ Gelelektro-
phorese
Nach MÜLLER & WEILER (2000a) ließ sich die IES-Synthase durch native
Gelelektrophorese nach SCHÄGGER et al. (1994) darstellen. Die isolierte Proteinfraktion
war enzymatisch aktiv und wies ein Molekulargewicht von etwa 180 kDa auf. Ausgehend
von diesen Resultaten wurde eine hoch angereicherte Proteinfraktion (2.10.2.3) mittels
„Blau-Nativer“ Gelelektrophorese getrennt und Proteine des entsprechenden Molekular-
gewichtsbereiches isoliert. In einer zweiten Dimension wurden die isolierten Proteine über
denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12.5 %) weiter aufgetrennt.
Ergebnisse
52
Abb. 3.7: (vorherige Seite) Gelelektrophoretische Präparation einer ange-reicherten Enzymfraktion zur Mikrosequenzierung putativer Indol-3-essigsäure-Synthase-Komponenten
Eine enzymatisch aktive Proteinfraktion (2.10.2.3) wurde über präparative „Blau-Native“ Gele (160 mm x 200 mm x 1 mm) aufgetrennt. Die Proteine des Molekulargewichtsbereiches von 150 kDa – 180 kDa wurden eluiert (2.12.5), und mit drei Volumen eiskaltem Methanol gefällt. In einer zweiten Dimension wurden die eluierten Proteine mittels SDS-PAGE (12.5 %) unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Eine Auswahl von Banden wurde ausgeschnitten, tryptisch verdaut und nach Elution der Peptidfragmente massenspektrometrisch analysiert (2.11.6). (A): Coomassie-gefärbter Gelstreifen eines „Blau-Nativen“-Gels (erste Dimension). Der zur Elution ausgewählte Molekulargewichtsbereich ist markiert. (B): Coomassie-gefärbter Gelstreifen der zweiten, denaturierenden Dimension (SDS-PAGE, 12.5 %). (C): Auswahl von Proteinbanden zur Mikrosequenzierung.
Die anschließende massenspektrometrische Analyse der Proteinbanden (2.11.6) der
zweiten elektrophoretischen Dimension lieferte keine Hinweise auf Proteine, welche direkt
mit der IES-Biosynthese in Verbindung stehen, wie beispielsweise Flavin-
Monooxygenasen (ZHAO et al., 2001) oder Cytochrom P450 Proteine (HULL et al., 2000).
Bei einem Großteil der identifizierten Proteine handelte es sich um Enzyme des
Primärstoffwechsels, wie beispielsweise Proteine mit großer Ähnlichkeit zu Komponenten
des Glycin-Decarboxylase-Komplexes (Accession AAC31228 putative Glycin-
Dehydrogenase [decarboxylierend], Accession AAL24244 P-Protein ähnliches Enzym,
Accession NM_119455 P-Protein ähnliches Enzym), welche im Zuge der Photorespiration
an der Rückgewinnung von Ribulose-1,5-bisphosphat aus 2-Phosphoglycolat beteiligt sind.
Bei den beiden unbekannten Proteinen in Bande 2 (Accession NP_176869) und Bande 5
(Accession AAF98209) handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um identische
Proteine. Eine BLASTP-Suche unter Verwendung der vollständigen Proteinsequenzen der
beiden Enzyme erbrachte eine Homologie zu bakteriellen Glycerophosphoryldiester-
Phosphodiesterasen.
Ergebnisse
53
Tab. 3.1: Massenspektrometrische Identifizierung gelelektrophoretisch isolierter Proteine aus Arabidopsis thaliana
Bande Protein errechnetes
Molekulargewicht [kDa]
Datenbankeintrag (Accession)
1 putative Glycin-Dehydrogenase [decarboxylierend]
113 AAC31228
2 unbekanntes Protein 83.8 NP_176869
3 P-Protein ähnliches Enzym 75 AAL24244
4 Adenosylhomocysteinase 53.4 NP_193130
5 unbekanntes Protein 83.8 AAF98209
6 Alanin-Glyoxylat Aminotransferase
44.2 NP_178969
7 putative Fructose-bisphosphat Aldolase
42.9 NM_127705
P-Protein ähnliches Enzym 112.9 NM_119455
8 Germin-ähnliches Protein 21.8 NM_122070
Besonderes Interesse weckte das 21.8 kDa große Germin-ähnliche Protein (Accession
NM_122070), da eine BLASTP-Suche für dieses Protein eine sehr hohe Homologie zu den
Auxinbindeproteinen ABP19 (77 %) und ABP20 (78 %) aus Prunus persica (Pfirsich)
erbrachte. Die von OHMIYA et al. (1998) beschriebenen Auxinbindeproteine ABP19/20
zeigen in einer Region ihrer Aminosäuresequenz (Aminosäuren vom N-Terminus: 98 –
115) 40 % Homologie zu den Auxinbindeproteinen ABP1 aus Zea mays (INOHARA et al.,
1989) und ABP1 aus Arabidopsis thaliana (PALME et al., 1992). Dieser Bereich deckt sich
mit der putativen Auxinbindestelle (BoxA), welche durch immunologische Unter-
suchungen von VENIS et al. (1992) eingegrenzt werden konnte. Wie die Proteine
ABP19/20, zeigt auch das identifizierte Germin-ähnliche Protein in dieser Region
Homologien zu den Bindeproteinen aus Mais und A. thaliana.
Ergebnisse
54
Abb. 3.8: Aminosäuresequenzvergleich der putativen Auxinbindestelle (BoxA) Zum Vergleich der potentiellen Auxinbindestelle im Germin-ähnlichen Protein (Accession NM_122070) aus A. thaliana (GLP) wurden die korrespondierenden Sequenzen der Auxinbindeproteine aus Prunus persica (ABP19, ABP20) (OHMIYA et al., 1998), A. thaliana (AABP1) (PALME et al., 1992) und Zea mays (MABP1) (INOHARA et al., 1989) herangezogen. Die putative Auxinbindestelle (BoxA) ist unterstrichen.
Auf eingehendere Untersuchungen des identifizierten Germin-ähnlichen Proteins wurde im
Rahmen dieser Arbeit verzichtet, da kein direkter Bezug zur Auxinbiosynthese in
A. thaliana zu ersehen war.
3.4 Beteiligung einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA) an der
tryptophanabhängigen Indol-3-essigsäure-Biosynthese
Im Rahmen einer Mutantenanalyse gelang es ZHAO et al. (2001) mittels „Aktivierungs-
markierung“ eine A. thaliana-Mutante (yucca) zu finden, welche einen Auxinüber-
produktionsphänotyp (verlängerte Hypocotyle, epinastische Blätter) zeigte. Weiterhin
wurde gezeigt, daß dieser Auxinphänotyp aus der 35S-Promotor induzierten Über-
expression einer Flavin-Monooxygenase (YUCCA, Accession CAB79971) resultierte.
Pflanzenlinien, welche die YUCCA-mRNA überexprimieren, beinhalten bis zu 50 % mehr
freie IES und sind resistent gegen phytotoxische Tryptophan-Analoga, wie 5-Methyl-
tryptophan. Dies impliziert eine Beteiligung von YUCCA an der tryptophanabhängigen
IES-Biosynthese. Eine enzymatische Analyse der, durch das YUCCA-Gen kodierten,
Flavin-Monooxygenase (FMO) verwies auf einen in-vitro-Umsatz von Tryptamin zu
N-Hydroxytryptamin. Da Tryptamin in A. thaliana nicht nachgewiesen werden konnte und
Markierungsexperimente bei Tomaten, welche endogenes Tryptamin enthalten, keinen
Hinweis auf eine Beteiligung dieses Intermediates bei der Umsetzung von L-Trp gaben
(COONEY & NONHEBEL, 1991), bleibt die in-vivo-Funktion des YUCCA-Proteins ungeklärt.
Aufgrund dessen ist YUCCA als Komponente des IES-Synthase-Komplexes durchaus
Ergebnisse
55
denkbar. Um dieser Hypothese nachzugehen, sollte die YUCCA-cDNA kloniert und als
Fusionsprotein überexprimiert werden, um mittels immunologischer Methoden eine
Integration von YUCCA im IES-Synthase-Komplex zu überprüfen.
3.4.1 Konstruktion und Überprüfung eines Expressionssystems zur
heterologen Expression eines (His)6-YUCCA-Fusionsproteins
Die Klonierungsstrategie zur Erstellung N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine ist
in Abbildung 3.9 dargestellt.
Abb. 3.9: Strategie zur Klonierung (His)6-markierter YUCCA-Fusionsproteine Die YUCCA-cDNA wurde über RT-PCR mit den Oligonukleotiden YUCCA-BamHI und YUCCA-HindIII (2.6.4) amplifiziert und nach Restriktion gerichtet in den Klonierungsvektor pBS-SK+ eingebracht. Anschließend wurde das entsprechende BamHI/HindIII Fragment mit der (His)6-Sequenz im Expressionsvektor pQE-30 (Qiagen) fusioniert. Die mittels RT-PCR erhaltenen Fragmente wurden durch DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Sequenz hin überprüft.
Im Zuge der Klonierung des N-terminalen Fusionskonstruktes wurden die zusätzlichen
Aminosäuren MRGSHHHHHHGS (der Ni-NTA bindende Abschnitt ist unterstrichen)
Ergebnisse
56
hinzugefügt, ohne das eigene Startcodon der YUCCA-cDNA zu deletieren. Das entstandene
Plasmid erlaubte die Expression des Fusionsproteins in Escherichia coli. Der erstellte
Überexpressionsvektor pQE-YUC wurde in den E. coli Stamm XL1-blue transfiziert, und
die Proteinexpression durch Zugabe von 0.1 – 2 mM IPTG zu logarithmisch wachsenden
Bakterien bei Temperaturen von 18 – 37 °C über einen Zeitraum von 0.5 – 24 h induziert.
Zur Kontrolle wurden Bakterien mit dem Expressionsvektor (pQE-30) ohne klonierte
cDNA transformiert. Trotz dieser variablen Bedingungen konnte im Vergleich zum
Kontrollvektor keine, im SDS-PAGE erkennbare, Überexpression des Fusionsproteins
detektiert werden (ohne Abbildung). Immunologische Analysen unter Verwendung des
α-RGS-(His)4-Antikörpers, welcher spezifisch gegen den Fusionsanteil des rekombinanten
Proteins gerichtet ist, zeigten, daß das überexprimierte YUCCA-Protein in den Wirtszellen
proteolytischem Abbau unterworfen ist (Abb. 3.10).
Abb. 3.10: Proteolytischer Abbau rekombinanter YUCCA-Proteine Die Expression des (His)6-markierten YUCCA-Proteins wurde durch die Gabe von 0.5 mM IPTG induziert. In bestimmten Zeitintervallen wurden je 500 µl Bakterien-suspension entnommen und die Bakterien durch Zentrifugation geerntet (13000 upm, 1 min, RT). Die Bakteriensedimente wurden in je 50 µl SDS-Probenpuffer resuspendiert und für 20 min auf 95 °C erhitzt. Von dem bakteriellen Rohextrakt wurden 10 µl Aliquots über ein SDS-Gel (12.5 %) getrennt und die Proteine auf Nitrocellulose transferiert. Die Detektion der markierten Proteine erfolgte unter Verwendung eines α-RGS-(His)4-Antikörpers.
Im Anschluß an eine native Reinigung des putativen YUCCA-Proteins aus der Fraktion
löslicher Proteine mittels einer Ni2+-Nitrilotriessigsäure-Chromatographie über den, aus
dem Vektor stammenden, Fusionsanteil („(His)6-tag“) ließen sich geringe Mengen an
YUCCA-Protein reinigen. Immunologische und massenspektrometrische Analysen
erlaubten eine zweifelsfreie Identifizierung des YUCCA-Proteins. Wie in Abbildung 3.11
Ergebnisse
57
zu erkennen ist, führte die affinitätschromatographische Reinigung nicht zu einer
vollständig homogenen Darstellung des Fusionsproteins.
Abb. 3.11: Affinitätschromatographische Reinigung bakteriell exprimierter,
N-terminal (His)6-markierter YUCCA-Proteine an Ni-NTA-Agarose Nach Induktion der Proteinexpression (pQE-YUC) mit 0.5 mM IPTG und einer einstündigen Inkubation bei 30 °C wurde die lösliche Proteinfraktion aus einer 100 ml Bakteriensuspension gewonnen (2.5.2). Die löslichen Proteine wurden nach Herstellerangaben über eine Ni2+-beladene Nitrilotriessigsäure-Agarose-Säule chromatographiert. Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel (12.5 %). (1: 5 µl Proteinrohextrakt; 2: 7.5 µl Durchlauf; 3: 7.5 µl Waschfraktion; 4 – 9: Je 10 µl der Elutionsfraktionen 1 – 6)
Mit dem 47.3 kDa großen rekombinanten YUCCA-Protein koeluierte ein weiteres, etwa
60 kDa großes, Protein. Mittels Proteinsequenzierung ließ sich dieses Protein als ein
57 kDa großes bakterielles Hsp60-Protein (Accession 1OEL_A) identifizieren. Es handelt
sich hierbei um Proteine der Chaperon-Familie, welche an der Faltung von Proteinen
beteiligt sind (Übersicht siehe MARTIN & HARTL, 1997). Die angereicherte YUCCA-
Elutionsfraktion zeigte weder enzymatische Aktivität, noch die für Flavoproteine typisch
gelbliche Färbung, die beispielsweise bei der heterolog exprimierten OPR1 aus A. thaliana
(SCHALLER & WEILER, 1997) beobachtet werden kann. Aufgrund dieser Resultate kann
geschlußfolgert werden, daß rekombinante YUCCA-Proteine in dem erstellten
prokaryotischen Expressionssystem nicht korrekt gefalten werden, was dazu führt, daß
kein Flavin eingebaut wird. Weiterhin wird deutlich, daß die fehlgefaltenen Proteine sehr
schnell wieder abgebaut werden (Abb. 3.10).
Ergebnisse
58
3.4.2 Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen YUCCA-Proteine
Obgleich mit dem oben beschriebenen Expressionssystem keine funktionelle Analyse des
YUCCA-Proteins möglich war, ließen sich doch ausreichende Mengen an denaturiertem
Protein präparieren, um einen polyklonalen Antikörper gegen das Protein herzustellen. Da
das koeluierende, bakterielle Hsp60 Homologien von über 60 % mit mitochondrialen
Chaperonen aus A. thaliana aufwies, war eine weitere Reinigung des Antigens über SDS-
PAGE erforderlich, um spätere Kreuzreaktionen des Antikörpers zu minimieren. Zu
diesem Zweck wurde das markierte YUCCA-Protein in sechs 300 ml Kulturansätzen über
eine Stunde exprimiert und die löslichen Proteinfraktionen gewonnen (2.8.1).
Anschließend wurden die markierten Proteine mittels „Immobilisierter-Metall-
Affinitätschromatographie“ (IMAC) gereinigt. Die Elutionsfraktionen wurden durch SDS-
Gelelektrophorese ermittelt, vereinigt, und zur Konzentrierung gefriergetrocknet. Mittels
nachfolgender präparativer Gelelektrophorese nach SCHARF & NOVER (1984) und
Elektroelution der Proteine konnte das Antigen in ausreichender Menge und Reinheit
präpariert werden (Abb. 3.12).
Abb. 3.12: Reinigung von des bakteriell exprimierten YUCCA-Proteins zur Her-stellung polyklonaler Antikörper
Dargestellt sind Coomassie-gefärbte 12.5 % SDS-Gele (A, B) bzw. Western-Blot Analysen (C). A: Zur Mengenabschätzung wurden bekannte Mengen Rinderserum-albumin (RSA) mitgeführt. B: Nach Anreicherung des Antigens über Affinitäts-chromatographie (IMAC) und präparative Gelelektrophorese wurden zwei prominente Banden aus dem Gel eluiert. Je 10 µl der Gelelutionsfraktionen wurden über SDS-Polyacrylamidgele getrennt. Die Fraktionen 1 und 2 bzw. 3 und 4 entstammen jeweils einer Bande des präparativen Gels. C: Western-Blot Analyse der gereinigten Proteine nach Transfer auf Nitrocellulose (α-RGS-(His)4-Antikörper).
Ergebnisse
59
Das stark angereicherte YUCCA-Protein (Abb. 3.12 B, Spur 1 und 2) wurde zur
Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt (2.13.3). Unter Verwendung des Antiserums
konnte bakteriell exprimiertes YUCCA-Protein im bakteriellen Rohextrakt, sowie nach
affinitätschromatographischer Reinigung, bei einer Verdünnung des Serums von bis zu
1:20000 detektiert werden. Nach Trennung von 50 µg pflanzlichen Proteinrohextraktes und
Transfer der Proteine auf Nitrocellulose konnte auch bei Serumverdünnungen von 1:1000
kein Signal beobachtet werden (ohne Abbildung).
3.4.3 Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt
Endogenes YUCCA-Protein ließ sich mit dem α-YUCCA-Serum (643) im
Pflanzenrohextrakt nicht ohne weiteres nachweisen, obgleich der Antikörper bakteriell
exprimiertes YUCCA-Protein in pflanzlichem Proteinrohextrakt detektierte (ohne
Abbildung). Da schon im Zuge der RT-PCR beobachtet wurde, daß nur äußerst geringe
Mengen an YUCCA-mRNA in den Pflanzen vorliegen, muß davon ausgegangen werden,
daß die Expressionsrate des endogenen YUCCA-Proteins sehr gering ist. Um das Protein
immunologisch nachweisen zu können wurden zweidimensionale Gele (2.12.2)
angefertigt, die, im Vergleich zu konventionellen SDS-Polyacrylamidgelen, eine deutlich
höhere Trennschärfe und stärkere Fokussierung der Proteine ermöglichten. Ein
repräsentatives, zweidimensionales Gel ist in Abbildung 3.13 dargestellt. In Abb. 3.13 B
ist die Vergrößerung eines Teiles des Western-Blots dargestellt, auf dem drei
Proteinbanden auf Höhe von 45 kDa beobachtet werden können. Hierbei handelt es sich
mit großer Wahrscheinlichkeit um die von ZHAO et al. (2001) beschriebenen Proteine
YUCCA, YUCCA2 (Accession CAB4936) und YUCCA3 (Accession AAB80641).
YUCCA2 und YUCCA3 zeigen 53 % respektive 51 % Homologie zu dem zuvor
angeführten YUCCA-Protein. Die Überexpression aller drei Proteine in Pflanzen führt zu
vergleichbaren Phänotypen, was auf eine redundante Funktion der Proteine verweist.
Neben den drei Signalen bei 45 kDa läßt sich zudem noch eine Kreuzreaktion des Serums
gegen ein Protein bei etwa 62 kDa beobachten.
Ergebnisse
60
Abb. 3.13: Immunologischer Nachweis von YUCCA im Pflanzenrohextrakt Für die zweidimensionale gelelektophoretische Darstellung von YUCCA wurden 250 µg Proteinextrakt 14 Tage alter Keimlinge verwendet. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte in Röhrchengelen unter Verwendung einer Ampholytlösung, welche den pH-Bereich von pH 5.0 bis pH 8.0 abdeckte. A: Coomassie-gefärbtes, exponentielles Gradientengel (20 – 10 % Polyacrylamid).B: Western-Blot Analyse von (A). Unter Verwendung des α-YUCCA-Serums (643, 1:1000) als erstem Antikörper, ließen sich spezifische Signale auf Höhe von 44 kDa detektieren. Dargestellt ist ein Ausschnitt des Blots. Der dargestellte Bereich ist in Teil A markiert.
3.4.4 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter
Verwendung von α-YUCCA-Antikörpern
Geeignete molare Konzentrationsverhältnisse von bivalenten Antikörpern zu multivalenten
Antigenen führen in Lösung zu einer Vernetzung der Antikörper mit ihren Antigenen.
Diese Komplexe lassen sich durch Nephelometrie bzw. Turbidimetrie quantitativ erfassen
oder mittels Zentrifugation präzipitieren. Die Immunpräzipitation unter Verwendung
spezifisch gereinigter α-YUCCA-Antikörper wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob
YUCCA eine Komponente des IES-Synthase-Komplexes darstellt. Um Serumeffekte im
Vorfeld ausschließen zu können, wurden die spezifischen Antikörper zuvor über
Nitrocellulose isoliert (2.13.5), und vor ihrer Verwendung auf ihre Funktionalität hin
überprüft. Je 200 µl einer angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.2) wurden, bei einem
Gesamtansatzvolumen von 400 µl, mit aufsteigenden Volumina (50 µl, 100 µl und 150 µl)
Ergebnisse
61
der Antikörperlösung sowie 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 versetzt und über Nacht bei 4°C
inkubiert. Als Kontrolle dienten Reaktionsansätze, denen anstatt der Antikörperlösung
gleiche Volumen an 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 zugefügt wurden. Nach der Inkubation
wurden die Proben zentrifugiert (13000 upm, 30 min, 4 °C) und die Überstände von den
Sedimenten getrennt. Die Überstände wurden mit je 200 µl 20 mM L-Trp versetzt und für
5 h bei 37 °C inkubiert. Im Anschluß wurde die gebildete Menge an IES mittels GC-MS-
Analyse bestimmt.
Bei einer Beteiligung von YUCCA an dem IES-Synthase-Enzymkomplex sollte eine
solche Immunpräzipitation zur Abnahme der IES-Synthase-Aktivität im Überstand führen.
Abb. 3.14: Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität im Überstand nach Immun-präzipitation mit spezifisch gereinigten α-YUCCA-Antikörpern
Nach Vernetzung der Antikörper-Antigenkomplexe über Nacht (4 °C) und Präzipita-tion der Komplexe mittels Zentrifugation (13000 upm, 30 min, 4 °C) wurde die verbliebene IES-Synthase-Aktivität im Überstand mittels gaschromatographisch-massenspektrometrischen Analysen untersucht. Die Daten verstehen sich als Mittel-werte ± Standardabweichung von n = 2 unabhängigen Experimenten.
Entgegen den Erwartungen konnte die Aktivität der IES-Synthase im Überstand
geringfügig gesteigert werden (52 %) (Abb. 3.14), was darauf hinweist, daß die Proteine
der YUCCA-Familie keine integralen Bestandteile des IES-Synthase-Komplexes sind.
Ergebnisse
62
Diese Ergebnisse konnten auch durch Immunaffinitätschromatographien bestätigt werden,
in denen die IES-Synthase-Aktivität weder auf der Säule zurückgehalten, noch retardiert
eluiert wurde.
3.5 Analyse potentieller Metaboliten und Inhibitoren der Indol-3-
essigsäure-Biosynthese
Die Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) lieferte Hinweise auf die Beteiligung einer
Nitrilase an der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese. So konnte beispielsweise über
Markierungsexperimente gezeigt werden, daß beide Sauerstoffmoleküle der Carboxy-
gruppe der IES aus Wasser stammen, was für eine nitrilasekatalysierte Reaktion spricht. In
dieser einstufigen Reaktion wird Indol-3-acetonitril (IAN) unter Verbrauch von zwei
Molekülen Wasser zur korrespondierenden Säure hydratisiert. In weiterführenden
Untersuchungen konnte allerdings nicht gezeigt werden, daß aus markiertem Trp
sequentiell auch markiertes IAN entsteht. Detaillierte Kenntnisse hinsichtlich wirkungs-
voller Inhibitoren der IES-Synthase-katalysierten L-Trp Umsetzung bzw. der Nachweis
intermediär entstehender Metabolite könnten von großer Hilfe bei der näheren
Charakterisierung des IES-Synthase-Komplexes sein.
3.5.1 Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-
essigsäure-Synthase-Aktivität
Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) ist ein äußerst wirksamer Inhibitor der Auxinbio-
synthese bei pflanzenpathogenen Bakterien, wie z.B. Agrobacterium tumefaciens
(persönliche Mitteilung WEILER). Um die Wirkung dieses Indolderivates auf die IES-
Synthase zu überprüfen, wurden je 200 µl einer angereicherten IES-Synthase-Fraktion
(2.10.2.2) ad 10 mM mit 20 mM L-Trp-Lösung und aufsteigenden Mengen an Indol-3-
essigsäurehydrazid versetzt. Nach Inkubation der Ansätze wurde die gebildete IES
extrahiert und mittels GC-MS-Analysen quantitativ erfaßt.
Ergebnisse
63
Abb. 3.15: Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid auf die Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität
Dargestellt sind gaschromatographisch-massenspekrometrische Daten zur Wirkung von Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) auf die IES-Synthase-Aktivität. Nach Inkuba-tion (6 h, 37 °C) der Reaktionsansätze mit unterschiedlichen Mengen an IESH erfolgte die Quantifizierung der gebildeten IES mittels interner Standardisierung der Ansätze mit [2H]2-Indol-3-essigsäure (2.11.4). Die experimentellen Daten repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Experimenten.
In den durchgeführten Experimenten konnte für das IESH keine inhibitorische Wirkung
auf die in-vitro-Biosynthese der IES beobachtet werden (Abb. 3.15).
3.5.2 Tryptamin als putative Zwischenstufe der Indol-3-essigsäure-
Biosynthese
Die immunologischen Befunde deuteten darauf hin, daß YUCCA keine integrierte
Komponente des IES-Synthase-Komplexes darstellt. Dieses Resultat sollte durch
Verdünnungsexperimente mit Tryptamin (TAM) verifiziert werden. Nach ZHAO et al.
(2001) stellt TAM das native Substrat für die YUCCA-Proteine dar. Sollte TAM, obgleich
es für A. thaliana bisher nicht als endogenes Indolderivat beschrieben wurde, Intermediat
der IES-Synthase-katalysierten Trp-Umsetzung sein, müßte sich der L-Trp-Umsatz in-vitro
durch Zugabe von TAM verdünnen (reduzieren) lassen. Um die Wirkung von TAM
zweifelsfrei beurteilen zu können, wurde konzentrierter Proteinrohextrakt (2.8.4) mit
ansteigenden TAM-Mengen versetzt, und der Umsatz von [2H]5-L-Trp zu [2H]5-IES
Ergebnisse
64
verfolgt. Im Falle einer Umsetzung von TAM zur IES sollte der Gehalt an markierter
[2H]5-IES sinken.
Die Analyse der gebildeten Menge an [2H]5-IES bestätigte den immunologischen Befund
(ohne Abbildung). TAM zeigte im verwendeten in-vitro-System bei Konzentrationen von
bis zu 1 mM keinerlei Einfluß auf die Umsetzung von [2H]5-L-Trp und stellt somit kein
Intermediat der IES-Synthase-Reaktion dar.
3.5.3 Verdünnung der Indol-3-essigsäure-Synthase-Aktivität durch
Indol-3-acetamid
Der einzige bisher vollständig aufgeklärte IES-Biosyntheseweg ist der sogenannte Indol-3-
acetamid-Weg, welcher für viele Bakteriengattungen wie beispielsweise Agrobacterium
(WEILER & SCHRÖDER, 1987), Azospirillium (BAR & OKON, 1993), Pseudomonas (MAGIE
et al., 1963) und Streptomyces (MANULIS et al., 1994) beschrieben wurde. Im Zuge dieser
zweistufigen Reaktionssequenz wird L-Trp von einer Tryptophan-2-Monooxygenase
(TMO) zu Indol-3-acetamid (IAM) umgesetzt, welches abschließend durch eine Indol-3-
acetamid-Hydrolase zur IES metabolisiert wird. Obgleich diese Reaktionssequenz für
bakterienspezifisch erachtet wird, ließ sich in einigen Pflanzenspezies, wie beispielsweise
Oryza sativa (KAWAGUCHI et al., 1991) und Poncirus trifoliata (KAWAGUCHI et al., 1993),
eine IAM-Hydrolase-Aktivität nachweisen. Des weiteren konnte in Prunus jamasakura
(SAOTOME et al., 1993) und Citrus unshiu (IGOSHI et al., 1971; TAKAHASHI et al., 1975)
IAM als endogene Substanz detektiert werden. Basierend auf diesen Hinweisen erschien es
von besonderem Interesse, die Wirkung von IAM auf die IES-Synthase näher zu
untersuchen. Zu diesem Zweck wurde, wie schon zuvor beschrieben (3.5.2), der Umsatz
von [2H]5-L-Trp zu [2H]5-IES in pflanzlichen Proteinextrakten, diesmal unter Zusatz von
IAM analysiert. Wie in Abbildung 3.16 dargestellt ist, konnte für IAM ein deutlicher
Einfluß auf die [2H]5-L-Trp-Umsetzung gemessen werden. Bei gleichen molaren
Verhältnissen (1 mM) von IAM zu [2H]5-L-Trp ließ sich die in-vitro-Synthese von [2H]5-
IES aus markiertem L-Trp auf 63.3 % senken. Ein 10-facher Überschuß von IAM (10 mM)
führte zu einer Senkung des [2H]5-L-Trp-Umsatzes auf 21.5 %.
Ergebnisse
65
Abb. 3.16: Einfluß von Indol-3-acetamid auf die in-vitro-Umsetzung von [2H]5-L-Tryptophan zu [2H]5-Indol-3-essigsäure
Pflanzlicher Proteinrohextrakt (2.8.4) wurde unter Zusatz aufsteigender IAM-Mengen und [2H]5-L-Trp als markiertem Substrat über 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Ansäuerung (pH 2.0) der Ansätze wurden die indolischen Komponenten mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, die enthaltenen Carbonsäuren mit Diazomethan methyliert und die IES-Gehalte mittels GC-MS-Analysen quantitativ erfaßt. Die Menge an enzymatisch gebildeter [2H]5-IES ließ sich anhand interner Standardisierung der Proben mit bekannten Mengen an [2H]2-IES errechnen. Die gezeigten Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 3 unabhängigen Versuchen zu verstehen.
Die dargelegten Ergebnisse implizierten eine Beteiligung von IAM als Intermediat der
IES-Biosynthese. Eine inhibitorische Wirkung des IAM kann hingegen ausgeschlossen
werden, da die benötigten Konzentrationen zur effektiven Reduktion der IES-Synthese für
spezifische Inhibitoren untypisch hoch wären.
3.5.4 Tryptophan als biosynthetische Vorstufe von Indol-3-acetamid
Die Resultate der IAM-Verdünnungsexperimente (3.5.3) verwiesen auf eine intermediäre
Beteiligung von IAM an der IES-Biosynthese. Folglich müßte aus der biosynthetischen
Vorstufe, dem L-Trp, IAM gebildet werden. Für weiterführende Untersuchungen zur Rolle
von IAM als Intermediat der IES-Synthese mußte zunächst eine Methode erarbeitet
werden, die eine sensitive Analyse von IAM ermöglichte.
Ergebnisse
66
Da das Amid gaschromatographisch nur äußerst diffizil darstellbar ist, erfordert die
gaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse eine Derivatisierung mit Trifluor-
essigsäureanhydrid (TFAA). Eine Trifluoracetylierung unter Verwendung von TFAA
(2.11.3) liefert allerdings für IAM und IES identische Produkte. Daher ist eine Trennung
der entsprechenden indolischen Verbindungen im Vorfeld erforderlich. Eine, der GC-
MS/MS-Analyse (2.11.5) vorgeschaltete, hochleistungsflüssigkeitschromatographische
Trennung (2.10.1.2) ermöglichte die Separierung, und damit die selektive Derivatisierung
der indolischen Komponenten.
Abb. 3.17: Hochleistungsflüssigkeitschromatographische Trennung indolischer Verbindungen
Dargestellt ist das Elutionsverhalten von drei analysierten indolischen Verbindungen (je 100 ng) im Verlauf der HPLC-Trennung. Gezeigt sind relative Absorptions-einheiten, wobei das Peakmaximum gleich 100 % gesetzt wurde.
Durch externe Standardisierung der HPLC mit Referenzsubstanzen konnten die
Retentionszeiten von IES und IAM ermittelt werden (vgl. Abb. 3.17). Auf diese Weise
ließen sich die indolischen Komponenten manuell fraktionieren und die IAM-Fraktion
selektiv trifluoracetylieren. Zur Untersuchung des IAM wurde eine GC-Tandem-MS
Technik (2.11.5) erarbeitet, welche auf der Analyse der Fragmentionen m/z = 226, 242,
323 und 339 für IAM bzw. m/z = 231, 247, 328 und 344 für [2H]5-IAM beruhte (siehe
Abb. 3.18). Diese gekoppelte HPLC/GC-MS/MS-Methode ermöglichte eine außer-
ordentlich sensitive Darstellung von IAM.
Ergebnisse
67
Ergebnisse
68
Abb. 3.18: (vorherige Seite) Massenspektrometrischer Nachweis der enzymatischen [2H]5-Indol-3-acetamid-Synthese durch Arabidopsis thaliana-Proteinextrakte
Pentadeuteriertes L-Trp wurde von Proteinrohextrakten (2.8.4) bzw. angereicherten Proteinextrakten (2.10.2.2) aus A. thaliana in [2H]5-IAM umgesetzt. MS/MS Analysen der charakteristischen Mutterionen (m/z = 367 für unmarkiertes IAM (3.18.A.I) bzw. m/z = 372 für [2H]5-IAM (3.18.A.II)) erbrachten die spezifischen Fragmentierungs-muster, welche in (A) gezeigt sind. (B): Dargestellt sind die Chromatogramme für die unmarkierte IAM-Referenzprobe (3.18.B.I), das enzymatisch im Proteinrohextrakt gebildete [2H]5-IAM (3.18.B.II) und das durch eine angereicherte Proteinfraktion gebildete [2H]5-IAM (3.18.B.III). (C): Vorgeschlagene Fragmentierung und Struktur des trifluoracetylierten IAM.
Zur Analyse der IAM-Synthese durch pflanzliche Proteinextrakte wurden 400 µl der
entsprechenden Proteinfraktionen (Proteinrohextrakt (2.8.4) bzw. High Q-angereicherte
Fraktion (2.10.2.2)) mit [2H]5-L-Trp (5 mM Endkonzentration) versetzt und über
mindestens 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktion der Ansätze mit Ethylacetat ließen
sich die indolischen Komponenten, wie oben angeführt, mittels HPLC trennen (2.10.1.2).
Die anschließende GC-MS/MS-Analyse (2.11.5) der Ansätze belegte zweifelsfrei die
enzymatische Bildung von [2H]5-IAM aus dem markierten [2H]5-L-Trp. In hitzein-
aktivierten Kontrollreaktionen wurde kein [2H]5-IAM detektiert. Wie aus Abbildung 3.18
abgeleitet werden kann, konnte für die angereicherte Proteinfraktion ein etwa 120-fach
höherer [2H]5-IAM-Gehalt ermittelt werden (Abb. 3.18.A.I, II). Dieses Ergebnis korreliert
mit den Anreicherungsdaten für die IES-Synthase.
3.5.5 Einfluß von Tryptophan auf den in-vitro-Umsatz von Indol-3-
acetamid zur Indol-3-essigsäure
Die unter 3.5.4 präsentierten Daten können als Beleg für eine intermediäre Beteiligung von
IAM bei der IES-Biosynthese in A. thaliana gewertet werden. Für den vorgeschlagenen
Mechanismus müßte das IAM in einem letzten amidohydrolasekatalysierten Reaktions-
schritt zur IES umgesetzt werden. Für den eindeutigen Nachweis dieser Reaktion wurde
markiertes IAM als Substrat hergestellt. Unter Verwendung einer bakteriellen Tryptophan-
2-Monooxygenase (freundlicherweise von Prof. Fitzpatrick (Universität Texas A&M,
USA) zur Verfügung gestellt) ließ sich, wie in Kap. 2.7.4 beschrieben, [2H]5-IAM
enzymatisch aus [2H]5-L-Trp synthetisieren. Das [2H]5-IAM wurde mittels Dünnschicht-
chromatographie und anschließender HPLC-Reinigung, bei einer Ausbeute von 91 %
d.Th., homogen dargestellt. Dieses Resultat konnte durch GC-MS/MS-Analysen (Abb.
3.19) belegt werden.
Ergebnisse
69
Abb. 3.19: Massenspektrometrische Analyse des enzymatisch synthetisierten [2H]5-Indol-3-acetamids
[2H]5-L-Trp konnte mit hoher Ausbeute, unter Verwendung einer heterolog exprimierten Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas savastanoi, zu [2H]5-IAM umgesetzt werden. (A): Spezifisches Fragmentierungsmuster der MS/MS-Analyse (2.11.5) der charakteristischen Mutterionen (m/z = 367 für IAM; m/z = 372 für [2H]5-IAM). (B): Den Gaschromatogrammen kann entnommen werden, daß das Reaktionsprodukt, [2H]5-IAM, nach Rt = 525 s bzw. das unmarkiertes IAM nach Rt = 527 s eluiert.
Mit Hilfe des synthetisierten [2H]5-IAM ließ sich der in-vitro-Umsatz zur IES aufzeigen
(ohne Abbildung). Durch Supplementation der Reaktionsansätze mit L-Trp wurde
Ergebnisse
70
weiterhin untersucht, ob sich die endständige Amidohydrolasereaktion verdünnen läßt.
Wie in Abbildung 3.20 dargestellt ist, konnte durch aufsteigende Mengen an L-Trp der
Umsatz von [2H]5-IAM zu markiertem IES beeinflußt werden.
Abb. 3.20: Verdünnung des in-vitro-Umsatzes von markiertem Indol-3-acetamid zu [2H]5-Indol-3-essigsäure durch Tryptophan
Zur Analyse der Trp-Wirkung auf die IAM-Umsetzung wurden in in-vitro-Ansätzen je 400 µl einer angereicherten Proteinfraktion (2.10.2.2) mit 1 mM [2H]5-IAM (Endkonzentration) und aufsteigenden Mengen an L-Trp versetzt. Nach Inkubation der Reaktionsansätze über 6 h bei 37 °C wurden die enzymatisch entstandenen Carbon-säuren mittels Ethylacetat extrahiert und gaschromatographisch-massenspektro-metrisch untersucht (2.11.4). Dargestellt sind typische Ergebnisse, je eines von mindestens zwei unabhängigen Experimenten. ( : Aus L-Trp gebildete, nicht markierte IES; : markierte, aus [2H]5-IAM entstandene IES; : Kontrollreaktion, ohne [2H]5-IAM)
Der Einsatz gleicher Mengen von L-Trp und [2H]5-IAM führte zu einer Verringerung des
IAM-Umsatzes auf etwa 53.7 %. Vergleicht man dieses Resultat mit den Ergebnissen der
oben angeführten Verdünnungsexperimente (3.5.3), welche eine Reduktion des in-vitro-
[2H]5-L-Trp-Umsatzes auf 63.3 % nach Gabe aquimolarer Mengen an IAM und L-Trp
zeigten, so kann auf ein Zusammenhang dieser Reaktionen geschlossen werden.
3.5.6 Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthese
Der IES-Synthase-Komplex setzt, wie von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben,
stereoselektiv das L-Enantiomer des Tryptophans zur IES um. Um zu untersuchen, ob die
IAM-Synthese ebenfalls strikt stereoselektiv verläuft, wurde der Umsatz von [2H]5-L-Trp
Ergebnisse
71
bzw. D-Trp durch angereicherte Proteinextrakte (2.10.2.2) näher charakterisiert. In parallel
durchgeführten Experimenten wurden je 400 µl einer High Q-gereinigten Proteinfraktion
(2.10.2.2) mit 5 mM [2H]5-L-Trp, bzw. mit 5 mM [2H]5-L-Trp und 5 mM D-Trp versetzt,
und über 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Extraktion der indolischen Komponenten wurden
die IAM-Fraktionen manuell mittels HPLC isoliert (2.10.1.2) und durch GC-MS/MS-
Analysen (2.11.5) weiterführend untersucht. Abbildung 3.21 kann entnommen werden, daß
in dem angereicherten Proteinextrakt sowohl [2H]5-L-Trp, als auch D-Trp zu IAM
metabolisiert werden.
Abb. 3.21: Untersuchungen zur Stereoselektivität der Indol-3-acetamid-Synthe-se
Dargestellt sind die, mittels GC-MS/MS-Analyse, ermittelten Gehalte an IAM und [2H]5-IAM aus Reaktionsansätzen, welche mit [2H]5-L-Trp oder [2H]5-L-Trp und D-Trp inkubiert wurden. Die weißen Balken ( ) zeigen den Umsatz von [2H]5-IAM zu IAM in den Reaktionsansätzen ohne D-Trp. Die grauen Balken ( ) stellen die Bildung von [2H]5-IAM- bzw. IAM in Ansätzen mit [2H]5-L-Trp und D-Trp dar. Die Abbildung zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Experimenten.
Da bei Anwesenheit von D-Trp eine gesteigerte IAM-Synthese beobachtet werden kann,
scheint diese Reaktion nicht stereoselektiv zu sein. In den Reaktionsansätzen, die neben
dem markierten L-Trp noch D-Trp enthielten, wurde in Summe doppelt soviel IAM
gebildet ([2H]5-IAM + IAM).
Da es sich bei den verwendeten Proteinfraktionen nicht um homogene IES-Synthase-
Präparationen handelte, könnte eine kontaminierende Nebenreaktion eine Ursache für die
Ergebnisse
72
fehlende Stereoselektivität darstellen, wobei aber zumindest eine unspezifische,
peroxidasekatalysierte Umsetzung des Tryptophans ausgeschlossen werden kann, da unter
den gewählten Reaktionsbedingungen (50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 37 °C) auch mit sehr
sensitiven photometrischen Methoden (GALLATI & PRACHT, 1985) keine Peroxidase-
aktivität detektiert wurde (ohne Abbildung).
3.6 Vorkommen und Bildung von Indol-3-acetamid in Arabidopsis
thaliana
Basierend auf den Resultaten der in-vitro durchgeführten Experimente stellt IAM eine
putative IES-Vorstufe dar. Wie bereits erwähnt, konnte das endogene Vorkommen von
IAM in Höheren Pflanzen bislang nicht eindeutig gezeigt werden, da in allen bisher
veröffentlichten Studien zum Vorkommen von IAM (TAKAHASHI et al., 1975; SAOTOME et
al., 1993) eine bakterielle Kontaminationen des Pflanzenmaterials nicht ausgeschlossen
werden konnte. Bei der Analyse von IAM in Lösung muß zudem extrem sorgfältig auf die
Analysebedingungen geachtet werden, da in ammoniakhaltigen Lösungen IES-
Glykosylester spontan zu IAM zerfallen (ZENK, 1961).
Die Verwendung der, im Rahmen dieser Arbeit, etablierten HPLC/GC-Tandem-MS-
Analysetechnik (3.5.4, 3.5.5) lieferte, in Kombination mit steril angezogenem Pflanzen-
material, die Möglichkeit das Vorkommen von IAM in Höheren Pflanzen präzise
nachzuweisen. Im folgenden Kapitel werden Versuche zum Nachweis von IAM in
A. thaliana und eine mögliche Biosynthese aus IAN näher erörtert.
3.6.1 Endogener Indol-3-acetamid Gehalt in sterilen Arabidopsis
thaliana-Keimlingen
Zum quantitativen Nachweis von IAM in A. thaliana wurde ausschließlich steril angezoge-
nes Pflanzenmaterial eingesetzt, um bakterielle Kontaminationen ausschließen zu können.
Keimlinge verschiedenen Alters wurden geerntet und die indolischen Verbindungen me-
thanolisch extrahiert (2.8.5). Im Zuge der HPLC/GC-MS/MS-Analyse der Extrakte
konnten sehr geringe Mengen an IAM detektiert werden. Der Gehalt an IAM in 14 Tage
alten Pflanzen sank von 3.5 ng g-1 Frischgewicht auf etwa 130 pg g-1 Frischgewicht in
ausgewachsenen Rosettenpflanzen. Der höchste IAM-Gehalt wurde, wie in Abbildung 3.22
dargestellt, in gequollenen Samen gefunden, wobei die IAM-Menge im Verlauf von vier
Tagen sehr rasch abnimmt.
Ergebnisse
73
Abb. 3.22: Detektion endogener Indol-3-essigsäure- und Indol-3-acetamid-Gehalte in sterilen Arabidopsis thaliana-Keimlingen
Steril angezogene Keimlinge wurden geerntet und indolische Verbindungen isoliert (2.8.5). Die quantitative Analyse erfolgte mittels der unter 2.11.5 beschriebenen GC-MS/MS-Technik. Als interner Standard wurde den Extrakten zu Beginn der Aufarbeitung [2H]5-IAM (10 – 50 pmol) und [2H]2-IES (100 – 150 pmol) zugefügt. Die Zeitachse gibt Auskunft über die Wachstumsdauer unter Kurztagbedingungen. Für den Zeitpunkt t = 0 wurden die IES- und IAM-Gehalte in gequollenen und stratifizierten Samen vermessen. (A): Darstellung der IES- und IAM-Gehalte pro Gramm Frischgewicht. (B): IES- und IAM-Gehalte bezogen auf die Anzahl der untersuchten Individuen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen aus n = 5 unabhängigen Experimenten.
Der IAM-Gehalt in unsteril angezogenen Pflanzen (30.9 ± 5.0 pmol g-1 Fg) ist, verglichen
mit steril gezogenem Pflanzenmaterial (20.5 ± 9.1 pmol g-1 Fg), geringfügig höher. Diese
Diskrepanz könnte durch die unterschiedlichen Wachstumsbedingungen begründet sein.
Daß die erhöhten IAM-Gehalte der nicht steril angezogenen Pflanzen nicht auf eine
bakterielle Kontamination zurückzuführen ist, scheint wahrscheinlich, da der IAM-Gehalt
in ausgewachsenen, unsterilen Rosettenpflanzen (5 – 7 cm Durchmesser) weiter absank
(0.74 ± 0.03 pmol g-1 Fg). Dieser Befund wäre bei einer bakteriellen Kontamination nicht
zu erwarten.
Ergebnisse
74
Gequollenen Samen zeigen, verglichen mit den 14 Tage alten Keimlingen, etwa 40-fach
höhere IAM- bzw. circa 270-fach höhere IES-Gehalte, wobei die Mengen beider
Substanzen besonders in den ersten 24 h nach der Keimung drastisch abnimmt. Dies
verweist auf eine Freisetzung aus möglichen Speicherstoffen, wie beispielsweise
Glucosinolaten, während der Keimung.
3.6.2 Indol-3-acetamid als zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion
Nitrilasen (EC 3.5.5.1) katalysieren die Hydrolyse organischer Nitrile indem sie, in einer
einstufigen Reaktion, sukzessive zwei Moleküle Wasser anlagern. Die Nitrilasen sind aus
Bakterien (KOBAYASHI & SHIMIZU, 1994) und einigen Höheren Pflanzen (THIMANN &
MAHADEVAN, 1964a, b) bekannt. In A. thaliana besteht die Familie der Nitrilasen aus vier
Isogenen, von denen NIT1 – NIT3 tandemartig auf Chromosom III lokalisiert sind
(HILLEBRAND et al., 1998). NIT1 – NIT3 repräsentieren eine äußerst homologe Subfamilie,
deren Mitglieder den Umsatz von IAN zu IES in-vitro und in-vivo katalysieren können
(BARTLING et al., 1992; BARTLING et al., 1994; SCHMIDT et al., 1996; DOHMOTO et al.,
2000). NIT4 wird hingegen zu einer zweiten Subfamilie gezählt und codiert für eine β-
Cyano-L-alanin-Hydratase, welche an der Cyanidentgiftung der Zelle beteiligt ist
(PIOTROWSKI et al., 2000). Obgleich Nitrilasen vermutlich keine generelle Rolle in der
Auxinversorgung der Pflanzen spielen, verweisen eine Reihe von Belegen (Vorwerk et al.,
2001; KUTZ et al., 2002) auf ihre Funktion bei der IES-Synthese während bestimmter
Entwicklungsstadien. Anhand von Reportergen-Expressionsstudien ließ sich belegen, daß
NIT2 vornehmlich während der Keimung in den Samen exprimiert wird, wohingegen NIT3
vorwiegend während der ersten zwei Wochen nach der Keimung zu detektieren war.
Demzufolge werden diese Isoformen mit der Umsetzung von Nitrilen aus Glucosinolaten,
im besonderen aus Glucobrassicin, und der IES-Biogenese in Verbindung gebracht.
Weitere Untersuchungen lieferten Hinweise auf eine Bifunktionalität der Nitrilasen. So
zeigten KOBAYASHI et al. (1998a), daß die untersuchte bakterielle Nitrilase aus
Rhodococcus rhodochrous sowohl IAN als auch IAM als Substrat akzeptierte, wohingegen
PIOTROWSKI et al. (2000) beschrieben, daß Nitrilase 4 aus A. thaliana sowohl über eine
Nitrilase- als auch eine Nitrilhydratase-Funktion verfügt, was zu zwei echten Endproduk-
ten (Asparagin und Aspartat) der β-Cyano-L-alanin-Umsetzung führt. Um zu untersuchen,
ob die Nitrilasen 1 – 3 aus A. thaliana ebenfalls eine solche enzymatische Bifunktionalität
aufweisen und neben dem bekannten Endprodukt, der IES, auch IAM liefern, wurden die
Ergebnisse
75
Nitrilasen 1 – 3 im heterologen System überexprimiert und ihre enzymatische Aktivität
mittels HPLC analysiert.
Abb. 3.23: Umsatz von Indol-3-acetonitril durch die Nitrilasen 1 – 3 aus Arabi-dopsis thaliana
Jeweils 1 µg der affinitätschromatographisch gereinigten (His)6-Nitrilasefusions-proteine (2.8.2) wurden in gepufferter Lösung (50 mM Tris/HCl, pH 8.0) ad 5 mM mit IAN versetzt und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Die Quantifizierung der Re-aktionsprodukte erfolgte nach externer Standardisierung photometrisch (λ = 280 nm) mittels HPLC. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte aus n = 3 unabhängigen Exprimenten ± Standardabweichung. ( : IAM; : IES)
Die Analyse der enzymatischen Aktivität der affinitätschromatographisch dargestellten
(His)6-Nitrilasefusionsproteine zeigt, daß die drei untersuchten Nitrilasen IAN sowohl zu
IES als auch zu IAM umsetzen. Die Verhältnisse von IAM- zu IES-Synthese können
Tabelle 3.2 entnommen werden. Da zusätzliche Experimente belegten, daß IAM von den
Nitrilasen nicht umgesetzt wird (ohne Abbildung), muß davon ausgegangen werden, daß es
sich in diesem Fall um zwei wirkliche Endprodukte der Nitrilasereaktion handelt. Alle drei
Nitrilasen zeigten ein nahezu konstantes Produktverhältnis (IES:IAM), wobei alle drei
Enzyme IAN bevorzugt zu IES umsetzen.
Ergebnisse
76
Tab. 3.2: Produktverhältnisse der Nitrilase 1 – 3 katalysierten Indol-3-aceto-
nitril-Umsetzung
IAM:IES
(His)6-NIT1 1:5.4
(His)6-NIT2 1:3.2
(His)6-NIT3 1:1.9
Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß Indol-3-acetonitril als biosynthetische Vorstufe des
IAM, insbesondere während der Keimlingsentwicklung, nicht ausgeschlossen werden
kann.
3.7 Untersuchungen zur Metabolisierung von Indol-3-acetamid in
Arabidopsis thaliana
Eine wachstumsfördernde Wirkung des IAM (WIGHTMAN, 1962) wird schon seit langem
kontrovers diskutiert, konnte aber bislang nicht eindeutig belegt werden. Da der in-vitro-
Umsatz von [2H]5-IAM zu [2H]5-IES nachgewiesen werden konnte (3.5.5) und die in-vivo-
Daten der IAM-Gehalte in Keimlingen (Abb. 3.22 B) auf eine Dynamik des IAM-Spiegels
hinweisen, muß davon ausgegangen werden, daß IAM ein biosynthetisches Intermediat
darstellt. Amidohydrolasen (Amidasen), welche eine Umsetzung von IAM zu IES
vermitteln, konnten aber bisher nur aus einigen Prokaryoten, wie beispielsweise
Agrobacterium tumefaciens (WEILER & SCHRÖDER, 1987), isoliert werden.
Um zu überprüfen, ob ähnlich Proteine auch in Pflanzen gefunden werden können, wurden
in-silico-Analysen durchgeführt. Unter Verwendung der heute verfügbaren Protein-
datenbanken bietet sich die Möglichkeit, bei entsprechender Homologie, funktions-
verwandte Enzyme in verschiedenen Spezies zu identifizieren. Bei der nachfolgend
beschriebenen Identifikation und funktionellen Analyse einiger putativer Amidohydrolasen
aus A. thaliana konnte die hohe Sequenzhomologie bakterieller Indol-3-acetamid-
Hydrolasen (IaaH) ausgenutzt werden.
Ergebnisse
77
3.7.1 Analyse abgeleiteter Aminosäuresequenzen für Indol-3-acetamid-
Hydrolasen aus pflanzenpathogenen Bakterien
Zur Identifikation putativer Amidohydrolasen aus A. thaliana, wurden fünf bekannte Indol-
3-acetamid-Hydrolasen (Amidohydrolasen) aus pflanzenpathogenen Bakterien miteinander
verglichen. Auf diese Weise ließ sich auf Aminosäureebene ein Bereich von etwa 118
Aminosäuren ausmachen, welcher eine Homologie von etwa 73 % aufwies (Abb. 3.24).
Dieser Sequenzbereich wurde zur BLASTP-Suche in der TAIR BLAST Datenbank
(www.arabidopsis.org) verwendet.
Abb. 3.24: Aminosäuresequenzvergleich von fünf Indol-3-acetamid-Hydrolasen pflanzenpathogener Bakterien
Dargestellt ist ein Ausschnitt eines Aminosäuresequenzvergleiches von fünf Indol-3-acetamid Hydrolasen aus unterschiedlichen Bakterien. Die Schattierung gibt Auskunft über die Homologie innerhalb der Gruppe: schwarz: 100 %, grau: 75 %. Bei den verglichenen Proteinen handelt es sich um: Atum: Agrobacterium tumefaciens (Accession P25016); Avit: Agrobacterium vitis (Accession Q04557); Eher: Erwinia herbicola (Accession Q47860); Psav: Pseudomonas savastanoi (Accession P06618) und Psyr: Pseudomonas syringae (Accession P52831).
Die Datenbankrecherche lieferte vier unterschiedliche putative A. thaliana Amidasen
(Accession: AAG35612, CAA71371, NP_196504, BAB02718) mit einer Sequenz-
homologie von 39.1 % bis 60.4 % (identische plus ähnliche Aminosäuren) zu dem
eingesetzen Aminosäuresequenzabschnitt bakterieller Amidase-Proteine, welche im
folgenden mit AMI1 – AMI4 bezeichnet werden.
Ergebnisse
78
3.7.2 Analyse der Aminosäuresequenzen der vier putativen Amidasen
aus Arabidopsis thaliana
Das katalytische Zentrum bakterieller Amidasen ist bereits eingehend untersucht worden
(KOBAYASHI et al., 1997). Experimente an der Rhodococcus sp. Amidohydrolase
(EC 3.5.1.4, Accession M74531) verwiesen auf eine, in allen untersuchten Amidasen
hochkonservierte, katalytische Triade (Asp-170, Ser-174, Cys-182) im aktiven Zentrum
des Enzyms. Im Gegensatz zu der, von den Nitrilasen bekannten katalytischen Triade,
erwies sich das Cystein im Zentrum der Amidasen als weniger essentiell, was auf einen
anders gearteten Reaktionsmechanismus hindeutete.
Ein Vergleich der identifizierten Proteine aus A. thaliana (AMI1 – AMI4) mit der Amino-
säuresequenz der Amidohydrolase aus Rhodococcus sp. wurde durchgeführt, um die
pflanzlichen Proteine näher zu analysieren und innerhalb der Gruppe putative Amidasen zu
identifizieren.
Abb. 3.25: Aminosäuresequenzvergleich des katalytischen Zentrums der Amido-hydrolase aus Rhodococcus sp. mit den putativen Amidasen aus Arabidopsis thaliana
Die homologen, Glycin-Serin-reichen Teile der Aminosäuresequenz der identifizierten Proteine aus A. thaliana wurden mit dem katalytischen Zentrum der Amidohydrolase aus Rhodococcus sp. verglichen. Die Aminosäuren des aktiven Zentrums (Asp-170), Ser-174) und zudem das Cystein-182 sind durch Pfeile markiert. Rho: Amidohydrolase Rhodococcus sp., Accession M74531) (KOBAYASHI et al., 1997); AMI1: Accession AAG35612; AMI2: Accession CAA71371; AMI3: Accession NP_196504; AMI4: Accession BAB02718.
Nur die AMI1-Sequenz beinhaltetet alle essentiellen Aminosäuren des katalytischen
Zentrums (Asp und Ser), wohingegen allen anderen putativen Amidasen aus A. thaliana
zumindest eine dieser katalytisch essentiellen Aminosäuren fehlte. In der AMI2-Sequenz
ist das katalytisch relevante L-Aspartat (Asp-133, AMI1) gegen das funktionell
vergleichbare L-Glutamat (Glu-166, AMI2) ausgetauscht. Da es sich hier um einen
Ergebnisse
79
konservativen Aminosäureaustausch handelt, wurden die Proteine AMI1 und AMI2 für
weitergehende Analysen ausgewählt.
Abb. 3.26: Lokalisation und genomische Organisation des AMI1- und AMI2-Gens auf den Chromosomen I bzw. V von Arabidopsis thaliana
Die Lokalisation der beiden Gene erfolgte mit Hilfe der AGI (Arabidopsis Genomic Initiative) Chromosomenkarten unter Verwendung der TAIR Datenbank (www.arabidopsis.org). Die mit ATG überschriebenen Pfeile markieren die 5’ – 3’ Richtung und den Transkriptionsstartpunkt der Gene. Introne sind in weiß, Exone in schwarz dargestellt. Folgende Gene umgeben AMI1 (A) (At1g08980): At1g8900, putatives Zuckertransportprotein, ERD6 (Accession BAA25989); At1g08910, hypothetisches Protein (genefinder); At1g08920 putatives Zuckertransportprotein, ERD6 (Accession BAA25989); At1g08930, Zink-Finger Protein ATZF1, putativ; At1g08940, Ähnlichkeit zu Saccharomyces hypothetischem Protein YDR051c (Accession Z49209) [hypothetischer ORF]; At1g08950, t-RNA Pro; At1g08960, Ähnlichkeit zu Caenorhabditis hypothetischem Protein CO7A9 11 (Accession Z29094) [Na/Ca, K Antiporter]; At1g08970, Ähnlichkeit mit Schizosaccharomyces
Ergebnisse
80
CCAAT Bindefaktor (Accession U88525); At1g08990, unbekanntes Protein; At1g09000, Ähnlichkeit mit Nicotiana Proteinkinase-2 (NPK-1); At1g09010, Ähnlichkeit zu Bos ß-Mannosidase (Accession U46067) [Capra hircus ß-Mannosidase]. Die nachfolgenden Gene umgeben das AMI2 Gen (B) (At5g07360): At5g07300, Copin-ähnliches Protein; At5g07310, putativer Transkriptions-faktor: At5g07320, Ähnlichkeit zu einem löslichen Ca-abhängigen Carrier-Protein aus Oryctolagus cuniculus (Accession AF004161); At5g07330, putatives Protein; At5g07340, Calnexin homologes Protein; At5g07350, putatives Protein; At5g07370, putatives Protein; At5g07380, hypothetisches Protein; At5g07390, putatives Oxidase A Protein; At5g07400, hypothetisches Protein; At5g07410, Ähnlichkeit zu Pektin- Methylesterase Protein aus Medicago truncatula (Accession AJ249611).
Das AMI1-Gen ist auf dem linken Arm von Chromosom I in der Annotationseinheit
F7G19, in einem Abstand von 2.884 Mbp vom Telomer, lokalisiert. Das AMI2-Gen findet
sich in der Annotationseinheit T2I1 auf dem linken Arm von Chromosom V in einem
Abstand von etwa 2.1 Mbp zum Telomer. Die Intron-Exon-Struktur beider Gene kann
Abbildung 3.26 entnommen werden. Die Untersuchung der umgebenden Genregionen
zeigte, daß weder AMI1 noch AMI2 eine funktionelle Verwandtschaft zu den umgebenden
Genen aufweisen. Hieraus wurde geschlossen, daß die Gene AMI1 und AMI2 nicht in
Genfamilien organisiert sind.
3.7.3 Konstruktion und Verifikation von Plasmid-Vektoren zur
heterologen Expression von Amidase-Proteinen
Bakterielle Amidasen setzen neben ihrem eigentlichen Substrat auch Fettsäureamide
(CRAVATT et al., 1996) und möglicherweise auch Aminosäuren mit Amidfunktionen, wie
Asparagin und Glutamin um. Dies könnte, bedingt durch eine Ansäuerung des
Cytoplasmas, zu Vergiftungen der Zellen, bzw. zur Störung der Proteinbiosynthese führen.
Um größtmögliche Kontrolle über die heterologe Expression der pflanzlichen cDNA in
den Wirtsbakterien zu erhalten, wurde das pASK-IBA Expressionssystem (IBA,
Göttingen) verwendet. Dieses System verfügt über ein hochdichtes tet-Promotor/Operator
System (SKERRA, 1994), was die, von T5-Promotor-Systemen (z.B. pQE, Qiagen)
bekannte, nichtinduzierte Basalexpression der Fusionsproteine verhindert.
Unter Verwendung der TAIR-Datenbank (www.arabidopsis.org) ließen sich die cDNA-
Sequenzen für die Proteine AMI1 und AMI2 ermitteln und entsprechende Starter-
oligonukleotide zur Amplifikation der cDNAs mittels RT-PCR erstellen. Für beide Gene
ließen sich cDNA-Fragmente aus A. thaliana-Blattmaterial, jedoch nicht aus Wurzel-
gewebe (nicht dargestellt), isolieren.
Ergebnisse
81
Abb. 3.27: Amplifikation der AMI1 und AMI2 cDNA mittels RT-PCR Zur Amplifikation der Amidase cDNAs wurden je 2 µg Gesamt-RNA in RNA-DNA-Hybride überführt (2.6.4). Von diesen Ansätzen wurden jeweils 7 µl in einer nachfolgenden PCR (2.6.5) mit je 50 pmol der sequenzspezifischen Starter-oligonukleotidepaare AMI1-IBA5-Start, AMI1-IBA5-Rev (AMI1) und AMI2-Eco31I, AMI2-Rev (AMI2) eingesetzt. Als interne Kontrolle diente das, in Blättern konstitutiv exprimierte, NIT1-Gen (Oligonukleotide: NIT1-Strt und NIT1-IBA3-Rev).
Aus dem Vergleich der AMI1- und AMI2-Transkriptmenge mit der konstitutiv exprimierten
NIT1-cDNA (HILLEBRAND et al., 1998) als internen Marker geht hevor, daß beide
putativen Amidase-Gene in Blattgewebe ebenfalls konstitutiv exprimiert werden. In beiden
Fällen wurde, verglichen mit NIT1, eine deutlich geringere Expressionsstärke beobachtet.
Das AMI1-PCR-Fragment konnte, nach Restriktion mit der Restriktionsendonuklease
Eco31I, direkt in den Expressionsvektor pASK-IBA5 (ebenfalls Eco31I-geschnitten)
inseriert werden. Für die N-terminale Strep-Fusion wurde das AMI1-Startcodon deletiert
und eine Nukleinsäuresequenz, welche für die zusätzlichen Aminosäuren
MASWSHPQFEKGA (der bindungsvermittelnde Bereich ist unterstrichen) codiert,
hinzugefügt. Positive Transformanden wurden über ihre Antibiotikaresistenz selektioniert
und mit Hilfe der Sequenzierungsoligonukleotide pASK-IBA-Forw und pASK-IBA-Rev
(IBA, Göttingen) mittels DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Nukleinsäuresequenz hin
überprüft. Die AMI2-cDNA wurde zunächst in Standardklonierungsvektoren (pBS-SK+)
eingefügt. Mit Hilfe dieser Konstrukte wurden zwei verschiedene Überexpressionssysteme
erstellt. Für die Klonierung eines C-terminalen AMI2-Fusionskonstruktes wurde, vermittelt
durch den Expressionsvektor pASK-IBA3, die Nukleinsäuresequenzinformation für die
zusätzlichen Aminosäuren SAWSHPQFEK (der Strep-Tactin bindende Abschnitt ist
unterstrichen) direkt der letzten Base der AMI2-cDNA angefügt. Zusätzlich wurde ein N-
terminales (His)6-AMI2-Fusionskonstrukt hergestellt. Wie bei der N-terminalen AMI1-
Fusion wurde auch hier das eigene Startcodon der AMI2-cDNA deletiert und gegen eine
Ergebnisse
82
DNA-Sequenz ersetzt, die die N-terminale Verlängerung des AMI2-Polypeptides um die
Aminosäuren MRGSHHHHHHGSAC (der Ni-NTA bindende Teil ist unterstrichen)
vermittelt.
Eine Übersicht der Klonierungsstrategie, die der Klonierung C- und N-terminal markierter
Amidasen aus A. thaliana zu Grunde liegt, ist in der nachfolgenden Graphik dargestellt.
Ergebnisse
83
Abb. 3.28: (vorherige Seite) Klonierungsstrategie zur Herstellung C- bzw. N-terminal markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana
Dargelegt ist die Herstellung von Vektoren zur Expression von C- bzw. N-terminal markierten Amidasen im bakteriellen System. Die AMI1 cDNA wurde über RT-PCR (2.6.4) unter Verwendung der Oligonukleotide AMI1-IBA5-Start und AMI1-IBA5-Rev amplifiziert, mit Eco31I restringiert und direkt mit der linearisierten DNA (Eco31I) des pASK-IBA5 Vektors fusioniert (N-term. Strep-AMI1 Fusion: pASK-AMI1). Die AMI2 cDNA wurde mit den Oligonukleotidpaaren AMI2-Eco31I, AMI2-Rev und AMI2-SphI, AMI2-SalI ebenfalls mittels RT-PCR amplifiziert und zunächst in den Klonierungsvektor pBS-SK+ (SmaI-geschnitten) eingefügt. Anschließend wurden die entsprechenden cDNA-Fragmente herausgeschnitten und mit den komplementären Enden der gewünschten Expressionsvektoren fusioniert (C-term. Strep-AMI2 Fusion: pASK-AMI2; N-term. (His)6-AMI2 Fusion: pQE-AMI2). Alle mittels RT-PCR gewonnenen Fragmente wurden durch DNA-Sequenzierung auf ihre korrekte Basenfolge hin überprüft. Die kommerziellen Vektoren, die im Verlauf der Klonierungen benutzt wurden, sind gelblich unterlegt.
Die erstellten Plasmid-Vektoren (pASK-AMI1, pASK-AMI2 und pQE-AMI2) sollten die
Expression der rekombinanten Amidasen aus A. thaliana im bakteriellen System (E. coli)
und deren Aufreinigung ermöglichen.
Die Expression der Strep-markierten AMI1-Proteine erfolgte im E. coli Stamm XL1-blue
nach Induktion logarithmisch wachsender Bakterien mit 0.04 µg/ml Anhydrotetracyclin
über 6 h bei 30 °C (2.8.1). Wie in Abbildung 3.29A dargestellt, ließen sich die bakteriell
exprimierten AMI1-Fusionsproteine aus der Fraktion löslicher Proteine mittels Affinitäts-
chromatographie (Strep-Tactin-Sepharose, IBA, Göttingen) isolieren. Im Gegensatz dazu
ließen sich die AMI2-Konstrukte unter nativen Bedingungen nicht darstellen. Sowohl die
Expression der AMI2-cDNA als C-terminal Strep-markiertes, als auch als N-terminal
(His)6-markiertes Fusionsprotein lieferten ausschließlich Proteine, welche in
Einschlußkörpern („inclusion bodies“) eingelagert waren. Zur Gewinnung von Antikörpern
gegen das denaturierte AMI2-Protein wurden die Einschlußkörper einer (His)6-AMI2-
Präparation isoliert (2.8.1) und die markierten Proteine mittels SDS-PAGE gereinigt
(2.12.5). Um Aussagen über die enzymatische Aktivität der putativen Amidase 2 machen
zu können, wurden Einschlußkörper einer Strep-AMI2-Präparation gereinigt und die
enthaltenen Proteine unter Einsatz vom 8 M Harnstoff denaturiert. In Anlehnung an
KOBAYASHI et al. (1997) folgte darauf eine stufenweise durchgeführte Renaturierung der
Proteine mittels sequentieller Dialyse (2.8.1). Aus den Dialysaten ließen sich geringe
Mengen an rekonstituiertem AMI2-Protein, wie in Abbildung 3.29B dargestellt,
affinitätschromatographisch isolieren.
Ergebnisse
84
Abb. 3.29: Bakterielle Überexpression und affinitätschromatographische Reini-gung Strep-markierter Amidasen aus Arabidopsis thaliana
Dargestellt sind Coomassie-gefärbte, 12.5 %-ige SDS-Gele (A.I, B.I). Aufgetragen sind Fraktionen der affinitätschromatographischen Reinigung der Strep-markierten Proteine AMI1(A) und AMI2 (B). Die Isolierung der AMI1-Polypeptide erfolgte, wie unter 2.8.1 beschrieben, nach Herstellerangaben (IBA, Göttingen) aus der löslichen Proteinfraktion. Die markierten AMI2 Proteine wurden aus Einschlußkörpern gewonnen und erst nach Denaturierung/Renaturierung über Strep-Tactin-Sepharose angereichert. A.II und B.II zeigen Western-Blot Analysen der durchgeführten Reinigung. Die Detektion erfolgte unter Verwendung eines Strep-AP Konjugates. Beladung der Gele: 1: Rohextrakt (5 µl); 2: Säulendurchlauf (5 µl); 3: Waschfraktion (7.5 µl); 4 – 9: Elutionsfraktionen (10 µl) 1 – 6 (2 ml Fraktionen).
3.8 Enzymatische Charakterisierung der heterolog exprimierten
Amidasen aus Arabidopsis thaliana
Obgleich die, auf Sequenzvergleichen zu bakteriellen Indol-3-acetamid-Hydrolasen (3.7.1)
basierende, Identifikation der putativen Amidasen Hinweise auf eine Funktions-
verwandtschaft der Enzyme zu den bakteriellen IAM-Hydrolasen hindeutet, konnte nur
eine detaillierte Analyse der enzymatischen Charakteristika der klonierten Fusionsproteine
einen Nachweis ihrer Funktionalität erbringen. Nachfolgend sind Experimente zur
Bestimmung der enzymatischen Parameter der Amidase-Fusionsproteine dargelegt.
Ergebnisse
85
3.8.1 Substratspezifität der bakteriell exprimierten Amidase-Fusions-
proteine
Um die Substratspezifität der affinitätschromatographisch gereinigten Amidasen (Abb.
3.29) zu analysieren, wurde der Umsatz einer Reihe möglicher Substrate durch die
Amidasen 1 und 2 untersucht.
Ergebnisse
86
Abb. 3.30: (vorherige Seite) Substratspezifität der rekombinanten Amidase 1 aus Arabidopsis thaliana
Dargestellt ist der relative Umsatz von 13 unterschiedlichen Substraten durch je 5 µg der gereinigten Amidase 1 (2.10.2.4). Die Reaktionsansätze wurden bei pH 8.0 und 30 °C über einen Zeitraum von 4 h mit jeweils 10 mM Substrat inkubiert. Abgesehen vom Indol-3-acetyl-L-aspartat erfolgte die Bestimmung des enzymatischen Umsatzes aller anderen Substrate photometrisch bei 640 nm durch Quantifizierung des freigesetzten Ammoniaks nach Kopplung an einen Indophenol-Komplex (2.9.1). Da bei der Hydrolyse des Indol-3-acetyl-L-aspartats keine Ammoniakfreisetzung zu erwarten war, wurde die enzymatische Aktivität in diesem Fall mittels HPLC-Analyse untersucht. Der Umsatz des am besten umgesetzten Substrates (IAM) wurde gleich 100 % gesetzt und alle anderen Substratumsätze als prozentuale Anteile dargestellt. Alle Umsätze wurden durch Subtraktion der nicht enzymatischen Umsätze in abgekochten Kontrollen korrigiert. Die abgebildeten Daten verstehen sich als Mittelwerte von n = 4 unabhängigen Messungen ± Standardabweichung.
AMI2 setzte nach der Rekonstitution aus Einschlußkörpern und Reinigung über Strep-
Tactin-Sepharose keines der untersuchten Substrate um. Dies legt den Schluß nahe, daß
das rekombinante Protein seine enzymatische Aktivität verloren hat, oder ein anderes
Substrat bevorzugt. Abbildung 3.30 zeigt die Aktivität der AMI1 in Bezug auf 13
unterschiedliche Substrate.
Die Amidase 1 setzte unter den untersuchten Substraten bevorzugt IAM um. Eine
deutliche, wenn auch geringere Umsetzung konnte auch für die Substrate L-Asparagin
(41.5 %) und 1-Naphthylacetamid (25.5 %) ermittelt werden. Letzteres wurde zu
1-Naphthylessigsäure (1-NAA), einem nicht natürlich vorkommenden Auxin umgesetzt.
Von den Aminosäuren L-Glutamin und L-Asparagin wurde L-Asparagin deutlich besser
umgesetzt, jedoch konnte eine Kontamination der AMI1-Präparation durch eine bakterielle
Asparaginase ausgeschlossen werden. In identisch durchgeführten Aufarbeitungen von
Bakterien, welche den Leervektor pASK-IBA5 enthielten konnte, nach Affinitäts-
chromatographie keinerlei Amidase- bzw. Asparaginase-Aktivität detektiert werden.
Da die Amidase 1 sowohl die Aminosäure L-Asparagin, als auch IAM als Substrat
akzeptierte, bestand die Möglichkeit, daß AMI1 auch die Hydrolyse von IES-Aminosäure-
konjugaten, wie beispielsweise Indol-3-acetyl-L-aspartat (IES-L-aspartat) katalysiert.
Diese Auxin-Konjugate sind in Pflanzen weit verbreitet und fungieren in
A. thaliana als IES-Speicher (ANDERSSON & SANDBERG, 1982; ÖSTIN et al., 1998). Wie
aus der Graphik 3.30 abgeleitet werden kann, konnte für das Substrat IES-L-aspartat keine
hydrolytische Spaltung in IES und L-Aspartat gefunden werden. In Übereinstimmung mit
der fehlenden Hydrolyse-Aktivität zeigte die Aminosäuresequenz der AMI1 keine
Verwandtschaft zu den bekannten IES-Amidkonjugat-Hydrolasen aus Enterobacter
Ergebnisse
87
agglomerans (CHOU et al., 1998) und A. thaliana (DAVIES et al., 1999; LECLERE et al.,
2002) (nicht dargestellt).
3.8.2 Ermittlung enzymatischer Parameter der Amidase 1
Die Untersuchung zur Substratspezifität der Amidase 1 aus A. thaliana zeigte, daß es sich
bei diesem Enzym um eine spezifische IAM-Amidohydrolase handelt. Aus diesem Grund
wurde in allen weiterführenden Experimenten IAM als Substrat verwendet.
Abb. 3.31: Amidase 1-Aktivität in Abhängigkeit von Substrat, pH-Wert, Tempe-ratur und Proteingehalt
Die Messung der Aktivität des Strep-AMI1-Fusionsproteins erfolgte wie unter 2.9.1 beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Experimente mit je 5 µg gereinigtem Protein (2.10.2.4) und 10 mM IAM als Substrat durchgeführt. (A): Substratabhängigkeit. Die enzymatischen Reaktionen wurden nach 3 h gestoppt und die gebildete Menge an IES mittels HPLC analysiert. Die Quantifizierung erfolgte
Ergebnisse
88
anhand externer Standardisierung mit bekannten Mengen an IES. (B): pH-Abhängigkeit. Für die Bestimmung der pH-Abhängigkeit wurden folgende Puffersysteme verwendet: Citratpuffer ( ) pH 3.0 – 6.0; Natriumphosphatpuffer ( ) pH 6.0 – 8.0; Natriumcarbonatpuffer ( ) pH 8.0 – 10.5; Natriumphosphatpuffer ( ) pH 11.0 – 12.0. (C): Temperaturabhängigkeit. (D): Abhängigkeit der AMI1-Aktivität von der eingesetzten Proteinmenge. Dargestellt ist der Umsatz von IAM durch aufsteigende Mengen an gereinigtem AMI1-Protein. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardabweichung von n = 3 unabhängigen Experimenten.
Aus doppelt-reziproken Darstellungen konnte für die AMI1 ein apparentes Michaelis-
Menten-Verhalten für IAM-Konzentrationen zwischen 0 und 1 mM abgeleitet werden.
Eine Sättigung der Reaktion auch bei Konzentrationen von 25 mM IAM wurde nicht
erzielt. Aufgrund des schlechten Lösungsverhaltes von IAM ließen sich höhere Substrat-
konzentrationen nicht realisieren. Eine Übersicht der Ergebnisse der enzymatischen
Charakterisierung der AMI1 ist in Tabelle 3.3 zusammengestellt.
Tab. 3.3: Biochemische Charakterisierung der heterolog exprimierten Ami-
dase 1 aus Arabidopsis thaliana
Parameter Wert
Spezifische Aktivität bei 25 mM IAM [nkat mg-1 Protein] 7.5
Apparentes Molekulargewicht [kDa] 46.2
pH-Optimum 7.0
Temperatur-Optimum [°C] 35 - 37
IAM (0 – 1 mM)
Km [µM] 972
Vmax [nkat mg-1 Protein] 10.5
3.8.3 Untersuchungen zur Tertiärstruktur des Strep-Amidase 1-
Fusionsproteins
Bakterielle Amidasen, wie beispielsweise die Amidase aus Rhodococcus rhodochrous J1,
fungieren obligat als Homodimere, wobei jedes Monomer ein apparentes Molekular-
gewicht von 55 kDa besitzt (KOBAYASHI et al., 1993). Um einen Vergleich der heterolog
Ergebnisse
89
exprimierten Amidase 1 aus A. thaliana mit den bakteriellen Enzymen diesbezüglich zu
ermöglichen, wurde 1 µg des affinitätschromatographisch angereicherten Proteins mittels
„Blau-Nativer“ Gelelektrophorese (2.12.4) untersucht. Die native Gelelektrophorese sollte
eine Einschätzung des Oligomerisierungsgrades über die Bestimmung des apparenten
Molekulargewichtes ermöglichen, da unter den gewählten Bedingungen die native
Tertiärstruktur von Proteinkomplexen erhalten bleibt.
Abb. 3.32: „Blau-Native“ Polyacrylamid-Gelelektrophorese des bakteriell expri-mierten Strep-AMI1-Fusionsproteins
Strep-markierte Amidase 1 wurde im E. coli Stamm XL1-blue exprimiert (2.8.1) und mittels Chromatographie an Strep-Tactin-Sepharose gereinigt (2.10.2.4). Die gelelektrophoretische Darstellung erfolgte unter Verwendung eines „Blau-Nativen“ Gradientengelsystems (linear, 8 – 18 %) (2.12.4). Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes Gel, über das 1 µg gereinigtes Protein getrennt wurde.
Im Gegensatz zu der oben angeführten Amidohydrolase aus Rhodococcus rhodochrous J1
zeigt das markierte AMI1-Protein keine Dimerisierung. Das apparente Molekulargewicht
von circa 45 kDa entspricht in etwa dem errechneten Molekulargewicht des Monomers von
46.2 kDa. Eine Dimerisierung der Amidase in-vivo kann allerdings nicht ausgeschlossen
werden, da die heterolog gereinigte Amidase über einen Strep-Fusionsanteil verfügt,
welcher durchaus Einfluß auf das Oligomerisierungsverhalten des Enzyms nehmen kann.
Ergebnisse
90
3.8.4 Immunologischer Nachweis der Amidase 1 und 2 aus Arabidopsis
thaliana
Zur intrazellulären Lokalisation der pflanzlichen Amidasen war es von besonderem
Interesse, polyklonale Antikörper gegen die bakteriell überexprimierten Amidase-Proteine
zu gewinnen. Zudem würden diese Antikörper Versuche erlauben, die mögliche
Beteiligung der beiden putativen Amidasen am IES-Synthase-Komplex zu studieren.
Die Expression von AMI1 und AMI2 erfolgte im E. coli Stamm XL1-blue. Zellen, die mit
dem Plasmid pASK-AMI1 (Abb. 3.28) transformiert waren, exprimierten, nach Induktion
mit 0.04 µg/ml Anhydrotetracyclin, geringe Mengen des markierten AMI1-Proteins, das
anschließend affinitätschromatographisch gereinigt (Abb. 3.29 A) und mittels Gefrier-
trocknung konzentriert wurde. Die Proteine wurden in Wasser aufgenommen und zur
Immunisierung eines Kaninchens verwendet. Bakterien, die über das Ampicillinresistenz-
vermittelnde Plasmid pQE-AMI2 (Abb. 3.28) verfügten, lieferten nach Induktion der
Expression mit 0.5 mM IPTG große Menge des Fusionsproteins, das angereichert in
Einschlußkörpern vorlag und nachfolgend, mittels präparativer Gelelektrophorese der
Einschlußkörper, in ausreichender Menge und Reinheit (Abb. 3.33) isoliert werden konnte.
Abb. 3.33: Präparation von Antigenen zur Gewinnung eines polyklonalen Anti-körpers gegen die putative Amidase 2 aus Arabidopsis thaliana
Die heterolog exprimierte Amidase 2 aus A. thaliana wurden über präparative Gelelektrophorese, aus Einschlußkörpern isoliert (2.8.1) und aus dem Gel isoliert. (A) Coomassieblau-gefärbtes SDS-Gel (12.5 %), auf das verschiedene Volumina der gewonnenen Gelelutionsfraktion aufgetragen wurden (1, 5 und 7.5 µl). Zur
Ergebnisse
91
Mengenabschätzung wurden bekannte Mengen Rinderserumalbumin mitgeführt. (B) Immundetektion des SDS-Polyacrylamid Gels (A) unter Verwendung von α-RGS-His4-IgG.
Die Immunisierung der Kaninchen erfolgte nach WEILER (1984) mit Antigenmengen von
etwa 200 µg Protein pro Injektion. Die gewonnenen Seren (643: AMI1; 644: AMI2)
erlaubten die Detektion von 0.5 µg gereinigtem Protein bis zu einer Verdünnung der Seren
von 1:20000. Für die intrazelluläre Immunlokalisation der beiden Proteine wurde
pflanzlicher Proteinrohextrakt gewonnen (2.8.4), und durch 100000 x g Zentrifugation
lösliche bzw. membranständige und membranassoziierte Proteine voneinander getrennt.
Nach Resuspendierung der Sedimente in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 wurden je 150 µg
Protein mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch separiert und auf Nitrocellulose
übertragen. Die immunologische Detektion der putativen Amidasen erfolgte unter
Verwendung der gewonnenen Seren, wobei die Inkubation mit den primären Antikörpern
über Nacht bei 4 °C und Serumverdünnungen von 1:1000 erfolgte.
Abb. 3.34: Immunologischer Nachweis der putativen Amidasen in Protein-extrakten aus Arabidopsis thaliana
Die Enzyme eines Proteinrohextraktes (2.8.4) aus A. thaliana wurde mittels 100000 x g Zentrifugation in lösliche und membranständige Fraktionen getrennt. Die Sedimente wurden in 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgenommen und jeweils 150 µg Protein über SDS-Gele nach SCHARF & NOVER (1984) gelelektrophoretisch getrennt.
Ergebnisse
92
Die Proteine wurden auf Nitrocellulose transferiert und anschließend immunologisch analysiert. (A): Coomassie-gefärbtes SDS-Gel (20 – 10 %); (B): Western-Blot Analyse der transferierten Proteine unter Verwendung der gewonnenen Seren 643 (α-AMI1) und 644 (α-AMI2). (C: Cytosolische Fraktion; M: Membranständige Fraktion).
AMI1 und AMI2 konnten auf der erwarteten Höhe von 44.8 kDa bzw. 50.2 kDa nur in der
löslichen Proteinfraktion detektiert werden. Aufgrund der schwachen Signale kann
gefolgert werden, daß beide Proteine nur gering exprimiert werden. Für Enzyme, welche
möglicherweise an der Auxinhomöostase beteiligt sind, wäre eine solch geringe Abundanz
(„low abundant protein“) zu erwarten, da auch das Auxin nur in Spuren in der Zelle zu
finden ist.
3.8.5 Bestimmung der Amidaseaktivität im Pflanzenrohextrakt und
Anreicherung der Enzymaktivität durch Chromatographie an
Hydroxyapatit
Wie unter Kapitel 3.5.5 bereits dargelegt, setzten Proteinextrakte aus A. thaliana IAM zu
IES um. Mittels GC-MS-Analyse konnte für diesen Umsatz eine spezifische Aktivität von
0.14 ± 0.01 pkat mg-1 Protein ermittelt werden, wobei [2H]5-IAM als Substrat verwendet
wurde, um artifizielle Produkteinträge ausschliessen zu können.
Versuche zur flüssigkeitschromatischen Anreicherung der Amidaseaktivität zeigten, daß
sowohl AMI1 als auch AMI2 an Hydroxyapatit (2.10.2.1) gebunden werden konnten,
wobei das Elutionsprofil der Proteine immunologisch verfolgt wurde (nicht dargestellt).
Die putativen Amidasen eluierten spezifisch bei einer KPi-Konzentration von 50 mM.
Nach Vereinigung der entsprechenden Elutionsfraktionen (80 – 120 ml) belegte eine GC-
MS-analytische Aktivitätsbestimmung des [2H]5-IAM-Umsatzes die Anreicherung der
spezifischen Aktivität auf 2.22 ± 0.71 pkat mg-1 Protein.
Hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang, daß beide putativen Amidasen gemeinsam
mit der IES-Synthase-Aktivität koeluieren und die ermittelten spezifischen Enzym-
aktivitäten (IES-Synthase 1.7 pkat mg-1 Protein) vergleichbar hoch sind.
3.9 Amidasen als Bestandteil des Indol-3-essigsäure-Synthase-
Komplexes
Aus den biochemischen Untersuchungen der tryptophanabhängigen IES-Biosynthese ging
hervor, daß IAM mit großer Wahrscheinlichkeit ein Intermediat dieser Reaktionssequenz
Ergebnisse
93
darstellt (3.5.3 ff.), was die Beteiligung einer Amidase als integrale Komponente des IES-
Synthase-Enzymkomplexes nahelegt.
Nach heutigem Wissensstand ist die, im Rahmen dieser Arbeit vorgestellte, Amidase 1 aus
A. thaliana das bisher einzige pflanzliche Enzym mit nachweislicher IAM-Hydrolase-
Aktivität (3.8.2). Vor diesem Hintergrund erschien es denkbar, daß es sich bei dem AMI1-
Protein um eine putative Komponente des IES-Synthase-Komplexes handelt. Um diese
Fragestellung weiterführend zu untersuchen, wurden immunologische Analysen
durchgeführt, welche nachfolgend dargelegt sind.
3.9.1 Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synthase unter
Verwendung der α-AMI-Seren
Wie schon unter 3.4.4 beschrieben, wurde auch im Falle der Amidasen die präzipitierende
Wirkung der α-AMI-Seren (643, 644) in Bezug auf die IES-Synthase-Aktivität untersucht.
Zu diesem Zweck wurden angereicherte IES-Synthase-Proteinpräparationen (2.10.2.2) mit
Antiserum versetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Sedimentation (13000 upm,
30 min, 4 °C) der vernetzten Antikörper-Antigen-Komplexe wurde die in-vitro-Synthese
der IES im Überstand analysiert. Als Kontrolle dienten Ansätze, denen Präimmunserum
anstelle der α-AMI-Seren hinzugefügt wurde.
Ergebnisse
94
Abb. 3.35: (vorherige Seite) Immunpräzipitation der Indol-3-essigsäure-Synth-ase-Aktivität mittels polyklonaler Amidase-Antikörper
Zur Ermittlung der IES-Synthase-präzipitierenden Wirkung der gewonnenen α-AMI-Seren 643 (α-AMI1) und 644 (α-AMI2) wurden je 200 µl einer flüssigkeits-chromatographisch angereicherten IES-Synthase-Fraktion (2.10.2.2) mit 50 bzw. 100 µl Antiserum versetzt, und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Zentrifugation der Ansätze (13000 upm, 30 min, 4 °C) wurde der Überstand abgenommen und mit 300 µl 20 mM L-Trp versetzt. Darauf wurden die Reaktionsansätze für 4 h bei 37 °C inkubiert und die enzymatisch gebildete IES bestimmt (2.11.4). Als Kontrolle dienten Ansätze mit identischen Volumen an Präimmunserum. (A): Immunpräzipitation durch α-AMI1 Serum. (B): Immunpräzipitation durch α-AMI2 Serum. Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Versuchen. ( : Antiserum; : Präimmunserum)
Das α-AMI2-Serum zeigte in den Versuchen keinen signifikanten Einfluß auf die IES-
Synthase-Aktivität (Abb. 3.35B). Im Gegensatz dazu ließ sich die in-vitro-Synthese der
IES durch die Gabe des α-AMI1-Serums um durchschnittlich 48.7 % reduzieren, was auf
eine Beteiligung des AMI1-Proteins am IES-Synthase-Komplex hinweist. Um sicher zu
stellen, daß es sich hier um eine spezifische Wirkung der AMI1-Antikörper handelt, wurde
die Immunglobulin-Fraktion mittels kombinierter Ammoniumsulfat-/Caprylsäurefällung
vom Serum befreit und die spezifischen α-AMI1-Antikörper isoliert (2.13.5). Die so
gereinigte α-AMI1-IgG-Fraktion wurde anschließend in aufsteigender Konzentration zur
Präzipitation der IES-Synthase-Aktivität in angereicherten Proteinpräparationen (2.10.2.2)
verwendet.
Ergebnisse
95
Abb. 3.36: (vorherige Seite) Versuche zur Immunpräzipitation der Indol-3-essig-säure-Synthase unter Verwendung spezifischer α-AMI1-Immunglo-buline
Spezifische α-AMI1-Immunglobuline wurden aus dem Serum isoliert (2.13.5) und zur Präzipitation des IES-Synthase-Komplexes in High Q-angereicherten Proteinfrak-tionen (2.10.2.2) verwendet. Hierzu wurden jeweils 200 µl der Proteinfraktion mit aufsteigenden Volumina der α-AMI1-IgG-Lösung versetzt, ad 400 µl mit 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 aufgefüllt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsansätze zentrifugiert (13000 upm, 30 min, 4 °C), die Überstände abgenommen und die Sedimente in 200 µl 50 mM Tris/HCl, pH 8.0 resuspendiert. Die enzymatische Reaktion erfolgte nach Zugabe von je 200 µl 20 mM L-Trp über einen Zeitraum von 16 h bei einer Temperatur von 37 °C. Die gebildete IES wurde mittels GC-MS-Analyse quantifiziert. Die Enzymaktivität in den Kontrollreaktionen ohne Antikörperlösung wurde gleich 100 % gesetzt. Alle Werte wurden um die entsprechenden, nicht enzymatischen Umsätze in den mitgeführten hitzedenaturierten Kontrollen korrigiert. Die Graphik zeigt die Mittelwerte ± Standardabweichung aus n = 2 unabhängigen Experimenten. : Kontrolle Überstand; : Kontrolle Sediment; : Enzymaktivität im Überstand; : Enzymaktivitäten im Sediment.
Für die gereinigten α-AMI1-Immunglobuline konnte keine präzipitierende Wirkung
nachgewiesen werden (Abb 3.36). Entgegen den Erwartungen steigerte die Gabe der
spezifischen Immunglobuline die IES-Synthese im Überstand um bis zu 700 %. In den
untersuchten Sedimenten konnte hingegen mit steigenden Antikörpermengen eine
Reduktion der IES-Synthase-Aktivität beobachtet werden.
Die enorme Steigerung der IES-Synthese in den in-vitro-Reaktionsansätzen (Abb. 3.36,
hellgraue Balken) belegt, daß eine Interaktion der α-AMI1-Antikörper mit der
tryptophanumsetzenden Enzymaktivität besteht, obgleich diese Interaktion nicht zu der
erwarteten Präzipitation der IES-Synthase-Aktivität führte. Möglicherweise vermögen die
α-AMI1-IgGs die IES-Synthase-Aktivität über einen längeren Zeitraum zu stabilisieren.
Offensichtlich steigern die Antikörper die Löslichkeit der IES-bildenden Enzymaktivität,
da mit steigenden Antikörpermengen immer weniger IES-Synthase-Aktivität in den
Sedimenten detektiert wurde.
3.9.2 Versuche zur immunaffinitätschromatographischen Anreicher-
ung des Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes
Eine Immunaffinitätschromatographie unter Einsatz der gereinigten α-AMI1-Antikörper
erschien aufgrund der starken Interaktion zwischen den α-AMI1-Immunglobulinen und der
IES-synthetisierenden Enzymaktivität ein geeignetes Mittel zu sein, um den IES-Synthase-
Komplex weiter anzureichern.
Ergebnisse
96
Zu diesem Zweck wurde ein Aliquot der bereits im Vorfeld gereinigten Antikörper an 1 ml
CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt (2.7.5), und 15 mg einer vorgereinigten IES-
Synthase-Fraktion (2.10.2.3) an der hergestellten Säulenmatrix chromatographisch getrennt
(2.10.2.6). Die ersten 6 ml des Eluates wurden vereinigt und mit 1/10 Volumen 10 x PBS
versetzt, mit Centriprep 30 Einheiten konzentriert und abschließend über ein 12.5 %-iges
SDS-Polyacrylamidgel separiert.
Abb. 3.37: Gelelektrophoretische Darstellung der immunaffinitätschromatogra-phisch isolierten Proteine aus Arabidopsis thaliana
Dargestellt ist ein Coomassie-gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel (12.5 %), über welches das konzentrierte Eluat einer Immunaffinitätschromatographie getrennt wurde. Als Affinitätsliganden dienten hier gereinigte α-AMI1-Antikörper, welche vor der Kopplung an die CNBr-aktivierte Sepharose auf ihre Funktionalität hin untersucht wurden. Die Pfeile markieren die beiden Proteinbanden, welche für eine Protein-mikrosequenzierung ausgewählt wurden.
Nach gelelektrophoretischer Trennung der Proteine konnten zwei prominente
Proteinbanden detektiert werden, wobei eine massenspektrometrische Analyse zeigte, daß
es sich bei diesen Proteinen jeweils um die große Untereinheit der Ribulose-1,5-
bisphosphat Carboxylase/Oxygenase handelte (Bande 1: RubisCO, Accession NP_051067;
Bande 2: N-term. verkürzte RubisCO, Accession NP_051067). Alle weiteren erkennbaren
Proteinbanden ließen sich nicht eindeutig massenspektrometrisch untersuchen, da ihre
Proteinkonzentrationen für eine Mikrosequenzierung zu gering waren.
Ergebnisse
97
3.10 Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung der Indol-3-essig-
säure-Synthase
Die Photoaffinitätsmarkierung erlaubt den autoradiographischen Nachweis markierter
Proteine nach SDS-PAGE. Unter Einsatz der photolabilen Radioliganden [3H]3-6-Azido-L-
tryptophan (2.7.2) und [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid (2.7.3) sollten in Anlehnung an
FEYERABEND & WEILER (1989) Proteine des IES-Synthase-Komplexes aus A. thaliana
selektiv kovalent markiert werden.
3.10.1 Markierung der Indol-3-essigsäure-Synthase mit [3H]3-6-Azido-L-
tryptophan
Durch die Photoaffinitätsmarkierung mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan (2.14) ließen sich
einige radioaktivmarkierte Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa
nachweisen.
Abb. 3.38: Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan
Je 100 µg einer High Q-angereicherten IES-Synthase-Fraktion (2.10.2.2) wurden mit 63 kBq [3H]3-6-Azido-L-tryptophan photoaffinitätsmarkiert. Anschließend wurden je 50 µg Protein mittels SDS-PAGE getrennt. (A) Radioaktivitätsverteilung innerhalb der SDS-Polyacrylamid Gelspur. Die Detektion der Strahlung erfolgte am Flüssigkeits-Szintillationszähler. (B) Polypeptidprofil der Proteine (50 µg, Coomassie-gefärbt). (C) Autoradiographie der SDS-Polyacrylamid Gelspur aus (B). Der massenspektrometrisch untersuchte Molekulargewichtsbereich ist markiert.
Ergebnisse
98
Die massenspektrometrische Analyse der Proteine in dem markierten Molekulargewichts-
bereich führte zur Identifikation der in Tabelle 3.4 aufgelisteten Proteine. Für die vier
aufgeführten Proteine ließ sich kein Zusammenhang mit der Tryptophan-Umsetzung in
A. thaliana erkennen, zudem ließ sich die radioaktive Markierung im Bereich von 30 kDa
nicht durch eine Kompetition von [3H]3-6-Azido-L-tryptophan mit einem Überschuß an
L-Trp (150 µM) aufheben, und muß daher als unspezifisch erachtet werden.
Tab. 3.4: Massenspektrometrische Identifizierung [3H]3-6-Azido-L-tryptophan-
markierter Proteine aus Arabidopsis thaliana
Protein errechnetes
Molekulargewicht [kDa]
Datenbankeintrag
(Accession)
Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase 42.4 S74719
Superoxid-Dismutase 26.5 CAB36752
Triosephosphat-Isomerase 27.2 2009415A
putative Carboxymethylenbutenolidase 25.9 AAC25934
Nachfolgend durchgeführte Versuche zur Markierung eines angereicherten Tryptophan-
Synthase-Komplexes (2 µg) aus Salmonella typhimurium (2.8.3) in Proteinextrakten aus
A. thaliana (50 µg) führten nicht zu einer spezifischen Markierung (ohne Abbildung) der
tryptophanbindenden β-Untereinheit des Tryptophan-Synthase-Komplexes. Da hier eine
spezifische Makrierung zu erwarten gewesen wäre, wurde auf weitere Versuche zur
Photoaffinitätsmarkierung von Proteinen mit dem radioaktiven Azidoderivat des
Tryptophans verzichtet.
3.10.2 Photoaffinitätsmarkierung unter Verwendung von [3H]2-6-Azido-
indol-3-acetamid
In Ergänzung zu den oben dargestellten Versuchen zur Photoaffinitätsmarkierung von
Proteinen mit [3H]3-6-Azido-L-tryptophan wurde radioaktiv markiertes 6-Azidoindol-3-
acetamid als weiterer möglicher Photoaffinitätsligand hergestellt (2.7.3). Wie Abbildung
3.39 A, B entnommen werden kann, konnte, in Vorversuchen, unter Verwendung dieses
Ergebnisse
99
Radioliganden die heterolog exprimierte Amidase 1 in bakteriellem Rohextrakt spezifisch
markiert werden. Die Spezifität dieser Markierung ließ sich anhand der Abnahme des
radioaktiven Signals nach Kompetition von [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid ([3H]2-6-Az-
IAM) mit einem Überschuß an IAM (100 µM) nachweisen.
Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnten Proteinmengen unterhalb von
0.75 µg auch mit erhöhten [3H]2-6-Az-IAM Mengen nicht detektiert werden (nicht
dargestellt).
Abb. 3.39: Photoaffinitätsmarkierung Indol-3-acetamid-bindender Proteine unter Einsatz des Radioliganden [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid
Zur Photoaffinitätsmarkierung IAM-bindender Proteine wurden jeweils 80.9 kBq [3H]2-6-Az-IAM eingesetzt. (A) SDS-PAGE (12.5 %) heterolog exprimierter Strep-AMI1-Proteine. (B) Autoradiogramm des dargestellten SDS-Gels (A). Es ist lediglich der Bereich zwischen 66.0 und 30.0 kDa abgebildet. Folgende Ansätze wurden über das Gel getrennt: 1: 2 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt); 2: 2 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt), 100 µM IAM; 3: 4 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt); 4: 4 µg AMI1, 30 µg Protein (Bakterienrohextrakt), 100 µM IAM; 5: 2 µg AMI1; 6: 2 µg AMI1, 100 µM IAM. (C) SDS-PAGE (20 – 10 %) einer High Q-angereicherten Proteinfraktion (175 µg). In den Spuren 7 und 8 sind jeweils identische Proben aufgetragen. (D) Autoradiogramm zu Abbildungsteil C.
Versuche zur Photoaffinitätsmarkierung löslicher Proteine aus A. thaliana unter
Verwendung von [3H]2-6-Az-IAM führte nicht zur Identifikation IAM-bindender Proteine.
Bei den autoradiographischen Signalen (Abb. 3.39 D) handelte es sich lediglich um
Ergebnisse
100
unspezifische Bindungen des Radioliganden an Massenproteinen. Die Gabe von geringen
Mengen an IAM (50 µM) vor Belichtung des Ansatzes resultierte in der Auslöschung der
unspezifischen radioaktiven Signale (ohne Abbildung). Daraus wurde geschlossen, daß der
Gehalt IAM-bindender Proteine in den verwendeten Proteinpräparationen unterhalb der
Detektionsgrenze lag. Demzufolge ist für eine spezifische Markierung von IAM-bindenden
Proteinen eine deutlich höhere Anreicherung der Proteinpräparate notwendig.
Diskussion
101
4 Diskussion
Der pflanzliche Lebenszyklus wird, von der Keimung bis zur Reproduktion, durch das
komplexe Zusammenspiel chemischer Botenstoffe reguliert. Die Existenz solcher
Signalstoffe wurde schon vor mehr als 120 Jahren von den Pflanzenphysiologen DARWIN
(1880) und SACHS (1887) postuliert, da nach ihrem Dafürhalten die koordinierte
Morphogenese und Funktionalität multizellulärer Organismen die Kommunikation von
Zellverbänden, aber auch einzelnen Zellen untereinander, voraussetzt. Es dauerte weitere
50 Jahre, bis WENT & THIMANN (1937) die erste dieser Signalsubstanzen, welche sie
aufgrund der wachstumsfördernden Eigenschaften als Auxin (von griech. auxano,
wachsen) bezeichneten, identifizieren und den Einfluß dieser Substanz auf die pflanzliche
Entwicklung beschreiben konnten. Seit dem konnte eine ganze Reihe solcher pflanzlicher
Signalmoleküle gefunden werden (LETHAM et al., 1978; KENDE & ZEEVAART, 1997).
Diese als Phytohormone bezeichneten Signalsubstanzen sind für den koordinierten Ablauf
pflanzlicher Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse verantwortlich, und werden,
nach ihren unterschiedlichen Eigenschaften, in sieben Klassen unterteilt: Auxine,
Cytokinine, Gibberelline, Abscisinsäure, Ethylen, Jasmonate und Brassinosteroide
(MOORE, 1987, YOKOTA, 1997). Hinzu kommen einige niedermolekulare
Peptidverbindungen, wie z.B. CLAVATA3 (CLV3), welche ebenfalls Signal-
molekülcharakter zeigen (BISSELING, 1999; ROJO et al., 2002). Phytohormone sind bereits
bei äußerst geringen Konzentrationen (10-6 bis 10-8 M) wirksam. Ihre Wirkung ist aber
nicht ausschließlich konzentrationsabhängig, sondern wird vielmehr über ein komplexes
Regelwerk gesteuert, welches sich aus der Interaktion mit Substanzen anderer Phyto-
hormonklassen sowie der Kompetenz betreffender Gewebe zur Beantwortung dieser
chemischen Signale konstituiert.
Unter dem Sammelbegriff Auxine werden neben der Indol-3-essigsäure (IES), als
wichtigstem natürlichen Vertreter dieser Gruppe, zahlreiche natürlich vorkommende wie
auch synthetische Verbindungen zusammengefaßt, wobei allen Auxinen wachstums-
fördernde Eigenschaften gemein sind. Auxine induzieren unter anderem pflanzliches
Streckungswachstum und kambiale Zellteilungsaktivität. Darüber hinaus zeigen sie im
Verbund mit Substanzen anderer Phytohormonklassen multiple Wirksamkeit (SWARUP et
al., 2002). So wird beispielsweise die Proliferation von Markzellen beim Tabak
synergistisch durch den Auxin- und Cytokinin-Gehalt reguliert (SKOOG & TSUI, 1948;
Diskussion
102
MILLER et al., 1956). In Interaktion mit Gibberellinen fördern Auxine das Sproßwachstum
bei Erbsen (ROSS et al., 2000), während Auxin und Ethylen kooperativ an der
Wurzelhaardifferenzierung beteiligt sind (MASUCCI & SCHIEFELBEIN, 1994).
In den vergangenen Jahren ließ sich ein umfangreiches Wissen in Bezug auf die
physiologische Rolle und den Stellenwert der Auxine für die pflanzliche
Entwicklungssteuerung zusammentragen. Dennoch ist das Verständnis der gewebe-
spezifischen Regulation endogener IES-Gehalte sowie dem Zusammenhang dieser
Hormonhomöostase und den dadurch bedingten zellulären Reaktionen noch rudimentär.
Obgleich mikrobielle Systeme Hinweise auf mögliche IES-Synthesewege in Pflanzen
lieferten (BANDURSKI et al., 1995, BARTEL, 1997), läßt sich, nach heutigem Stand der
Wissenschaft, kein einheitliches Modell zur de-novo-Biosynthese der IES in Pflanzen
aufzeigen, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, daß multiple Synthesewege,
unter der Beteiligung funktionell redundanter Enzyme, existieren (NORMANLY & BARTEL,
1999). Untermauert wird diese Theorie durch die Unzugänglichkeit auxinauxotropher
Mutanten.
Bereits die Frage nach dem Edukt der IES-Biosynthese führte in der Vergangenheit zu
äußerst kontrovers geführten Diskussionen. Auf Mutantenanalysen basierende Arbeiten
(NORMANLY et al., 1993) etablierten, neben einer tryptophanabhängigen Biogenese, eine
tryptophanunabhängige Variante der IES-Synthese, welche ihren Ursprung in Tryptophan-
Vorstufen, wie Indol oder Indol-3-glycerophosphat haben sollte. In der Zwischenzeit
konnten allerdings Belege dafür gesammelt werden, daß es sich hier um artifizielle
Ergebnisse handelte, welche zu Fehlinterpretationen in Bezug auf die Ausgangssubstanz
der IES-Biosynthese führten (MÜLLER & WEILER, 2000b). Vergleichbare Resultate lieferte
die Arbeit von GLAWISCHNIG et al. (2000). Auch hier ließen sich in dem untersuchten
Mais-Endosperm keine Anzeichen für eine tryptophanunabhängige Variante der IES-
Biosynthese finden, was Tryptophan, als einziges Edukt der IES-Bildung, in den
Mittelpunkt rückt. Ungeachtet dieser Ergebnisse kann ein tryptophanunabhängiger
Reaktionsverlauf nicht kategorisch ausgeschlossen werden. MICHALCZUK et al. (1992)
konnten eine tryptophanabhängige Auxinbiosynthese als primäre IES-Quelle in Daucus
carota Zellkulturen nachweisen. Nach Aufhebung der Supplementation des Nährmediums
mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, welches zur Induktion der Embryobildung eingesetzt
wurde, erwies sich eine tryptophanunabhängige Biosynthesevariante als dominierend. In
Anbetracht dieser metabolischen Varianz erscheint eine Regulation der unterschiedlichen
Diskussion
103
Biosynthesewege, in Abhängigkeit von entwicklungsbiologischen Faktoren, durchaus
möglich.
Vor Beginn dieser Arbeit konnte bereits ein breites Spektrum an Daten zusammengetragen
werden, welche Belege für die Existenz einer sauerstoff- und tryptophanabhängigen IES-
Biogenese in Arabidopsis thaliana lieferten (MÜLLER et al., 1998; MÜLLER, 1999;
POLLMANN, 1999). So ließ sich ein Proteinkomplex (IES-Synthase) aus zellfreien
A. thaliana-Proteinextrakten identifizieren, um einen Faktor 15 – 20 anreichern, und in
Ansätzen biochemisch charakterisieren. Dieser etwa 160 – 180 kDa große IES-Synthase-
Komplex katalysiert den stereoselektiven Umsatz von L-Tryptophan zur IES, wobei
Isotopenmarkierungsexperimente aufzeigten, daß beide Sauerstoffmoleküle der Carboxyl-
funktion der IES überwiegend aus zwei Molekülen H2O inkorporiert werden (s.u.).
Bestärkt durch immunologische Befunde legte ein solcher Reaktionsverlauf die
Beteiligung einer Nitrilase bzw. eines nitrilaseähnlichen Enzyms an der Umsetzung des
Tryptophans nahe, da diese Enzyme dazu befähigt sind, ausgehend von Indol-3-acetonitril
(IAN) unter Abspaltung von Ammoniak, zwei Moleküle Wasser anzulagern (MÜLLER &
WEILER, 2000a). IAN, wie auch andere denkbare Intermediate dieser Reaktionssequenz
wie z.B. Indol-3-acetaldoxim, ließen sich aber, trotz Einsatz hochsensitiver massenspektro-
metrischer Techniken, nicht detektieren, was vor diesem Hintergrund als ein Indiz für
einen enzymatisch kanalisierten Reaktionsverlauf erachtet wurde. In weiterführenden
Untersuchungen ließ sich die Beteiligung einer Nitrilase allerdings nicht bestätigen. Gegen
die Beteiligung der Nitrilase-Isoformen 1 – 3 an der IES-Biosynthese sprachen Immun-
präzipitationsversuche unter Verwendung von α-Nitrilase-Antikörpern, welche nicht zu
der erwarteten Präzipitation der tryptophanmetabolisierenden Enzymaktivität führten
(PIOTROWSKI & MÜLLER, persönliche Mitteilung). Des weiteren konnte, in deutlich höher
angereicherten Enzympräparationen (~ 120-fach), nach zweidimensionaler Gelelektro-
phorese, keine Nitrilase-Immunreaktivität nachgewiesen werden (POLLMANN, 1999). Diese
Befunde schließen die generelle Beteiligung einer Nitrilase indes nicht aus, da die
Integration von bisher noch nicht beschriebenen Nitrilase-ähnlichen Proteinen im IES-
Synthase-Komplex in Betracht gezogen werden muß.
Der Umsatz von Tryptophan (Trp) zu IES war, wie bereits erwähnt, aus einigen
Pflanzenspezies wie beispielsweise A. thaliana und Zea mays bekannt, doch wurden diese
Enzymaktivitäten bisher nicht quantitativ miteinander verglichen. Aufgrund dessen
erschien es von besonderem Interesse, die enzymatischen Aktivitäten verschiedener
Diskussion
104
Pflanzenspezies quantitativ zu erfassen, um sie gegenüberstellen zu können. Darüber
hinaus sollten diese Experimente Aufschluß darüber geben, ob es sich bei zellfreien
Systemen aus A. thaliana um geeignetes Ausgangsmaterial für eine proteinbiochemische
Reinigung handelt.
Die tryptophanmetabolisierende Aktivität konnte in allen untersuchten Pflanzenspezies
nachgewiesen werden (3.1). Durch die Verwendung eines isotopenmarkierten Substrates
konnte zudem ein artifizieller Produkteintrag aus dem Pflanzenextrakt ausgeschlossen
werden. Hierbei zeigte sich eine deutliche Varianz der spezifischen Enzymaktivitäten
(Abb. 3.1), welche in den einzelnen untersuchten Pflanzenextrakten bis zu einem Faktor
von 18 schwankten. Es kann demnach davon ausgegangen werden, daß die Enzymaktivität,
welche den Umsatz von Trp zur IES vermittelt, eine ubiquitäre Komponente im
metabolischen Repertoire von Pflanzen darstellt. Obwohl bei der Analyse der spezifischen
Aktivitäten einige Spezies, wie z.B. Spinacia oleracea, positiv herausstachen, wurden für
alle weiteren Versuche Proteinextrakte aus A. thaliana verwendet, da diese „Modellpflanze
der Botanik“ genetisch bereits vollständig charakterisiert ist und zudem eine
vergleichsweise hohe enzymatische Aktivität zeigt.
Die IES-Synthase aus A. thaliana-Proteinextrakten konnte in drei aufeinanderfolgenden
flüssigkeitschromatographischen Reinigungsschritten um einen Faktor von etwa 180
angereichert werden. Hierbei erwies sich eine schnelle Hochdruckgelpermeations-
chromatographie als besonders effektiv (3.2.3). Neben der deutlichen Trennung der
enzymatischen Aktivität von der Massenproteinfraktion (Abb. 3.4) erlaubte diese Technik
eine angenäherte Molekulargewichtsbestimmung des IES-Synthase-Komplexes. Wie schon
von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben, eluierte die IES-Synthase-Aktivität in einem
Molekulargewichtsbereich von 160 – 180 kDa. Die angereicherte Enzymaktivität ließ sich
weiterführend mittels nativer Gelelektrophorese darstellen, wobei sich „Blau-Native“
Gelsysteme nach SCHÄGGER et al. (1994) bzw. exponentielle Gradientengele in Anlehnung
an SCHARF & NOVER (1982) als besonders geeignet erwiesen. Obwohl sich nach der
nativen Trennung der Proteine eine distinkte Aktivitätsverteilung im Gel zeigte (Abb. 3.6),
ließ sich der IES-Synthase-Komplex nicht in funktioneller Form aus dem Gel eluieren
(3.2.5). In Folge dessen wurden die Proteine aus den Bereichen höchster Aktivität aus dem
Gel gewonnen, in einer zweiten Dimension mittels SDS-PAGE separiert, und nachfolgend
mikrosequenziert. Als integrale Komponenten des IES-Synthase-Komplexes sind,
biochemisch betrachtet, nur wenige Enzymklassen denkbar. Im Zuge der Proteinmikro-
Diskussion
105
sequenzierung wurde vor allem nach flavinhaltigen Monooxygenasen (FITZPATRICK,
2001), Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CHAPPLE, 1998), Dioxygenasen
(PRESCOTT & JOHN, 1996), Tryptophan-Decarboxylasen und Transaminasen gesucht, da
diese Enzyme die einleitende Reaktion der Trp-Umsetzung katalysieren könnten. Die
Mikrosequenzierung der isolierten Polypeptide lieferte keine direkten Hinweise auf
mögliche Komponenten des IES-Synthase-Komplexes. Bei den identifizierten Proteinen
handelte es sich überwiegend um Proteine des pflanzlichen Primärstoffwechsels, wie
beispielsweise Proteine mit großer Ähnlichkeit zu Komponenten des Glycin-
Decarboxylase-Komplexes, welche an der Regeneration von Produkten der Photorespira-
tion beteiligt sind (VAUCLARE et al., 1996; DOUCE et al., 2001). Die erzielte Anreicherung
des IES-Synthase-Komplexes reicht demnach nicht aus, um Informationen bezüglich
integraler Bestandteile des Komplexes mittels massenspektrometrischer Methoden zu
erhalten, da trotz der erzielten Anreicherung Kontaminationen mit Massenproteinen
vorliegen. Möglicherweise müssen große Mengen an Gelen erstellt und entsprechende
Proteinbanden vereinigt werden, um massenspektrometrische Aussagen bezüglich
unterrepräsentierter Proteine treffen zu können. Neben den Primärstoffwechselproteinen
konnte ein 21.8 kDa großes, Germin-ähnliches Protein identifiziert werden, welches
signifikante Homologien (77 % bzw. 78 %) zu auxinbindenden Proteinen aus Prunus
persica (Pfirsich) zeigte (3.3.2). Die Auxinbindeproteine ABP19/20 aus Pfirsich (OHMIYA
et al, 1998) verfügen über eine konservierte, als BoxA bezeichnete Auxinbindedomäne
(JONES, 1994), und weisen für IES eine Dissoziationskonstante von 4.1 x 10-5 M auf. Auf
Proteinebene zeigen sie allerdings deutlich höhere Verwandtschaft zu Proteinen der Cupin-
Superfamilie, als zu bekannten Auxinbindeproteinen aus A. thaliana (PALME et al., 1992)
bzw. Zea mays (INOHARA et al., 1989). Die Cupine, zu denen auch die Germine zu rechnen
sind, werden mit einer ganzen Reihe von entwicklungsbiologischen Funktionen in
Verbindung gebracht. So sollen sie unter anderem an der Embryogenese und der Keim-
lingsentwicklung beteiligt sein (DUNWELL et al., 2000). Obgleich im Rahmen dieser Arbeit
auf eine eingehendere Untersuchung dieses Proteins verzichtet wurde, da kein direkter
Zusammenhang mit der IES-Biosynthese zu erkennen war, kann eine funktionelle Analyse
dieses Germin-ähnlichen Proteins von großem Interesse sein, da es sich hier möglicher-
weise um eine bisher nicht identifizierte Komponente in der Auxinsignaltransduktionskette
handeln könnte.
Diskussion
106
In der Vergangenheit sind eine Reihe von Proteinen beschrieben worden, welche mit hoher
Wahrscheinlichkeit Einfluß auf die Auxinbiosynthese in A. thaliana nehmen, wobei die
Identifikation eines Flavin-Monooxygenase-ähnlichen Proteins (YUCCA) besonderes
Interesse weckte (BARTEL et al., 2001). Abgesehen von YUCCA handelt es sich hierbei
um Cytochrom P450 Enzyme bzw. Indol-3-acetaldehyd-Oxidasen. Eine Integration dieser
Enzyme im IES-Synthase-Komplex kann anhand der nachfolgend aufgeführten Gründe
jedoch ausgeschlossen werden. Die Indol-3-acetaldehyd-Oxidasen fungieren obligat als
Homo- bzw. Heterodimere, wobei die Monomere Molekulargewichte von 145 kDa und
150 kDa aufweisen (SEKIMOTO et al., 1997; SEKIMOTO et al., 1998; SEO et al., 1998). Da
das Molekulargewicht der IES-Synthase nur 160 – 180 kDa beträgt, können diese Enzyme
schon aufgrund ihrer Größe nicht beteiligt sein. Diese theoretische Überlegung ließ sich
durch immunologische Analysen unter Verwendung der Antikörper atAO-1 und atAO-2
(AKABA et al., 1999), welche gegen die zwei Aldehydoxidasemonomere aus A. thaliana
gerichtet sind, bestätigen, da keine Immunreaktivität beobachtet werden konnte (MÜLLER,
1999; POLLMANN, 1999).
Die Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen CYP79B2 und CYP79B3 setzten zwar
in-vitro Trp effektiv zu Indol-3-acetaldoxim um, können aber nicht integrale Bestandteile
der IES-Synthase sein, da sie im Gegensatz zur IES-Synthase ausschließlich in
Chloroplasten zu finden sind (HULL et al., 2000; MIKKELSEN et al., 2000). Neben diesen
beiden Monooxygenasen ließen sich weitere Mitglieder dieser Proteinfamilie, CYP83B1
(BARLIER et al., 2000), CYP79F1 und CYP79F2, identifizieren, welche ebenfalls mit der
Modulation der IES-Biosynthese in Verbindung gebracht wurden. Inzwischen konnte
diesen Cytochrom P450-Isoformen aber eine eindeutige Funktion in der Indol-
Glucosinolat-Biosynthese zugeordnet werden (BAK et al., 2001; REINTANZ et al., 2001).
Daneben benötigen Cytochrom P450-abhängige Monooxygenasen, im Gegensatz zur IES-
Synthase, im allgemeinen Kofaktoren wie NADPH oder NADH, um ihre enzymatische
Aktivität zu entfalten, daher ist eine Beteiligung von Proteinen dieser Superfamilie am
IES-Synthase-Komplex als unwahrscheinlich zu erachten.
Im Rahmen eines Mutageneseprojektes identifizierten ZHAO et al. (2001), nach
ungerichteter Integration von CaMV 35S-Promotoren in das A. thaliana-Genom, eine
Mutante mit stark ausgeprägtem Auxinphänotyp, welche sie, bedingt durch eine auffällig
an Yucca-Pflanzen (Agave sp.) erinnernde Blattmorphologie, als yucca bezeichneten.
Neben den phänologischen Anzeichen für einen erhöhten Auxinpegel, wie beispielsweise
Diskussion
107
verlängerte Hypocotyle, epinastische Kotyledonen und kürzere, mit deutlich mehr
Wurzelhaaren besetzte Wurzeln, zeigten die yucca-Mutanten eine gesteigerte Resistenz
gegen toxische Trp-Derivate, wie 5-Methyltryptophan. Gaschromatographisch-massen-
spektrometrische Analysen konnten die phänologischen Befunde verifizieren. In den
Mutanten konnte ein um 50 % erhöhter Gehalt an freier IES gemessen werden. Als
genetische Ursache der Auxinüberproduktion ließ sich eine deutliche Expressions-
steigerung eines Gens ausmachen, das für ein Flavin-Monooxygenase-ähnliches Protein
(YUCCA) codiert. Nach Rekombination der YUCCA-cDNA in ein Maltose-Bindeprotein
(MBP) Expressionssystem und heterologer Expression der YUCCA-MBP-Fusionsproteine
verwiesen in-vitro-Experimente auf eine enzymatische Beteiligung von YUCCA bei der
NADPH-abhängigen Hydroxylierung von Tryptamin zu N-Hydroxytryptamin. Zusammen-
gefaßt verdeutlichten diese Resultate eine funktionelle Beteiligung von YUCCA an der
tryptophanabhängigen IES-Biosynthese in-vivo. Aufgrund der wenig überzeugenden
enzymatischen Daten (pro Reaktion wurden 350 µg gereinigtes YUCCA-MBP-
Fusionsprotein eingesetzt) und der Tatsache, daß Tryptamin als endogene Komponente in
A. thaliana bisher nicht beschrieben wurde, muß die in-vivo-Funktion von YUCCA als
spezifische Tryptamin-Hydroxylase in Frage gestellt werden. Basierend auf den Arbeiten
von UMHAU et al. (2000) und PAWELEK et al. (2000), die einen Kofaktor-unabhängigen
Reaktionsmechanismus für flavinhaltige L- und D-Aminosäure Oxidasen aufzeigten, er-
schien die Integration von YUCCA in dem IES-Synthase-Komplex denkbar. Zur Über-
prüfung dieser Hypothese wurde ein (His)6-YUCCA-Expressionssystem erstellt (3.3.1),
um potentielle Enzymaktivitätsverluste aufgrund des Fusionsanteiles des Maltose-
Bindeproteins (42.5 kDa) vorab ausschließen zu können. Hierbei erwies sich sowohl die
Klonierung der cDNA, als auch die heterologe Expression des rekombinanten Proteins als
schwierig. In der verwendeten Gesamt-RNA-Fraktion aus Blattmaterial unterschiedlich
alter A. thaliana-Pflanzen fanden sich nur sehr geringe Mengen reifer YUCCA-mRNA. Die
geringe Transkriptionsrate von YUCCA in dem untersuchten Blattmaterial ließ sich mittels
immunologischer Analysen erwartungsgemäß auch auf Translationsebene (3.4.3)
demonstrieren. Für Proteine, die die zelluläre Hormonhomöostase maßgeblich
beeinflussen, ist ein solches Expressionsmuster nicht grundlegend auszuschließen, doch
weisen die Expressionsdaten auf eine gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Funktion
dieses Proteins hin. Die Expression des rekombinanten Fusionskonstruktes ermöglichte
keine funktionelle Analyse des Proteins, da im bakteriellen Expressionssystem kein Einbau
Diskussion
108
von Riboflavin in das Enzym erzielt werden konnte (3.4.1). Eine Koelution von YUCCA
mit einem bakteriellen Hitzeschockprotein (Hsp60) verwies zudem auf einen möglichen,
Chaperon-vermittelten Einbaumechanismus für das Flavinmolekül. Ungeachtet dieser
Resultate ließen sich ausreichende Mengen an gereinigtem Protein präparieren (3.4.2), um
einen polyklonalen Antikörper (Serum 645) gegen das YUCCA-Protein herzustellen.
Entgegen den Erwartungen führte die Verwendung einer YUCCA-spezifischen
Antikörperfraktion (3.4.4) nicht zu einer Immunpräzipitation der IES-Synthase-Aktivität.
Die Versuche zur Immunpräzipitation der IES-Synthase zeigten lediglich einen geringen
Einfluß der gereinigten IgG-Fraktion auf die IES-Synthase-Aktivität im Überstand der
Reaktionsansätze. Darüber hinaus führten Versuche zur immunaffinitätschromatogra-
phischen Reinigung der IES-Synthase unter Verwendung der spezifischen
α-YUCCA-Antikörper nicht zu einer spezifischen Bindung der IES-Synthase-Aktivität auf
der Säulenmatix. Daher muß eine Integration von YUCCA in dem Synthasekomplex
ausgeschlossen werden. Bestärkt wird diese Aussage durch Substratverdünnungsexperi-
mente, bei denen für Tryptamin kein Einfluß auf den Umsatz von isotopenmarkiertem Trp
demonstriert werden konnte (3.5.2). Daneben gelang es TOBEÑA-SANTAMARIA et al.
(2002) die Funktion eines, zu YUCCA orthologen, Gens (FZY (FLOOZY)) aus Petunien
(Petunia miliflora) aufzudecken. Anhand von Mutantenanalysen und in-situ-Lokalisation
der FZY-mRNA demonstrierten die Autoren die funktionelle Beteiligung von FLOOZY bei
der Initiation der Blütenbildung, und der Regulation der Entwicklung vasculären Gewebes
in Blättern. Die hier präsentierten Daten legen in Verbindung mit der Beobachtung, daß
YUCCA-defiziente Mutanten einen Wildtyp-Phänotyp aufweisen, nahe, daß YUCCA nicht
ubiquitär in allen Zellen an der de-novo-Biosynthese der IES beteiligt ist. Vielmehr kann
davon ausgegangen werden, daß YUCCA, wie auch FLOOZY, zu der gewebespezifischen
Synthese zusätzlicher Auxin-Pools beiträgt, die, einem genetischem Programm folgend,
gezielt entwicklungsbiologische Prozesse steuern.
Versuche zur affinitätschromatographischen Reinigung des IES-Synthase-Komplexes unter
Verwendung eines, an Rinderserumalbumin gekoppelten, Trp-Derivates (5-Hydroxy-L-
tryptophan) führten zu keiner spezifischen Anreicherung der Enzymaktivität (3.2.4). Die
Substratbindestelle der IES-Synthase scheint demnach schwer zugänglich zu sein.
Weiterhin scheint eine Substitution an der 6-Position des Indolringes in Bezug auf die
Substratbindung nicht toleriert zu werden. Da neben Substraten oftmals auch Inhibitoren
bzw. Intermediate enzymatischer Reaktionen geeignete Liganden für affinitätschromato-
Diskussion
109
graphische Trennungen komplexer Proteingemische darstellen, wurde zur weiterführenden
biochemischen Charakterisierung der angereicherten IES-Synthase die Wirkung eines
putativen Inhibitors sowie verschiedenster, denkbarer Intermediate der Trp-Umsetzung
untersucht. Indol-3-essigsäurehydrazid (IESH) stellt in-vitro einen äußerst effektiven
Inhibitor der bakteriellen, Agrobacterium tumefaciens vermittelten, IES-Synthese dar
(persönliche Mitteilung WEILER). Unter der Prämisse, daß bei der pflanzlichen IES-
Biosynthese ein vergleichbarer enzymatischer Reaktionsmechanismus Verwendung findet,
könnte das IESH auch hier inhibitorische Wirkung zeigen. Gaschromatographisch-
massenspektrometrische Analysen zum Einfluß von IESH auf die Synthase-Aktivität in
angereicherten Proteinfraktionen belegten indes, wie schon für das Tryptamin (s.o.), keinen
Einfluß dieses IES-Derivates auf den in-vitro-Umsatz von Trp zur IES (3.5.1). Das Fehlen
des inhibitorischen Einflusses kann in diesem Zusammenhang nicht in direkter Linie als
Beleg für einen generell anders gearteten Reaktionsmechanismus gewertet werden, da
insbesondere allosterische Inhibitor-Enzym-Interaktionen einen hochaffinen Charakter
haben können, welche allein durch geringfügige Modifikationen in der Proteintertiär-
struktur unterbunden werden können.
Für die tryptophanabhängige IES-Biosynthese in A. thaliana wird ein Indol-3-acetonitril-
Biosyntheseweg favorisiert, bei dem Trp sukzessiv über Indol-3-acetaldoxim (IAOx) zu
IAN, und in einer endständigen, nitrilasekatalysierten Reaktion weiter zur IES, umgesetzt
wird. Bei einem solchen Reaktionsverlauf sollte sich die Umsetzung von
isotopenmarkiertem Trp sowohl durch die Gabe von IAOx, als auch von IAN nachhaltig
verdünnen lassen, bzw. sollten sich isotopenmarkierte Zwischenstufen detektieren lassen.
Wie vorstehend schon angeführt, konnte beides in Bezug auf IAOx und IAN nicht
beobachtet werden (MÜLLER, 1999), was dazu anregte, diese Reaktionssequenz kritisch zu
hinterfragen. Die einzige bis dato vollständig verstandene Reaktionssequenz zur IES-
Biogenese ist der bakterielle Indol-3-acetamid-Biosyntheseweg. Hierbei wird das Trp
einleitend durch eine Tryptophan-2-Monooxygenase zum Indol-3-acetamid (IAM), und
weiter, katalysiert durch eine Indol-3-acetamid-Hydrolase, zur IES umgesetzt. Das
Vorkommen von IAM, als mögliche Vorstufe der IES-Synthese in Höheren Pflanzen,
wurde aber lange Zeit nicht untersucht. Frühe Arbeiten zu diesem Thema zweifelten die
Existenz von in-vivo-gebildetem IAM an, da beobachtet werden konnte, daß pflanzliche
Sekundärmetaboliten wie z.B. IES-Glykosylester in-vitro in ammoniakhaltigen Lösungen
zur Ammonolyse neigen und dementsprechend spontan zu IAM zerfallen (ZENK, 1961).
Diskussion
110
Spätere Arbeiten konnten endogenes IAM in jungen Früchten von Citrus unshiu
(TAKAHASHI et al., 1975) und Hypocotylen von japanischer Kirsche (Prunus jamasakura)
(SAOTOME et al., 1993) nachweisen, doch wurde hier nicht strikt auf die Verwendung
sterilen Pflanzenmaterials geachtet, wodurch das Auftreten des IAMs durch bakterielle
Kontaminationen nicht eindeutig ausgeschlossen werden konnten. Basierend auf diesen
Arbeiten, und der Beschreibung von IAM-Hydrolase-Aktivitäten in Oryza sativa
(KAWAGUCHI et al., 1991) und Poncirus trifoliata (KAWAGUCHI et al., 1993), wurde hier
der Einfluß von IAM, als putative IES-Vorstufe, auf die IES-Synthese in
Verdünnungsexperimenten in-vitro untersucht. Unter Einsatz massenspektrometrischer
Methoden ließ sich hierbei erstmalig eine signifikante Wirkung eines Indol-Derivates auf
den Trp-Umsatz nachweisen. Insbesonders bei [2H]5-L-Trp:IAM Verhältnissen von 1:1
bzw. 1:10 konnte mit Hilfe der Quantifizierung der, enzymatisch aus [2H]5-L-Trp
entstandenen, [2H]5-IES eine eindeutige Verdünnung der enzymatischen Umsetzung um
36.7 % respektive 78.5 % beobachtet werden (Abb. 3.16), was als Beleg für eine
intermediäre Beteiligung des Amids an der IES-Bildung erachtet werden muß. Um das
IAM als Intermediat der IES-Biosynthese nachweisen zu können, wurde ein Analyse-
verfahren zum qualitativen Nachweis von IAM etabliert. Da zur gaschromatographischen
Darstellung des IAMs eine Derivatisierung mit Trifluoressigsäureanhydrid nötig ist, diese
aber für die IES ein identisches Endprodukt (siehe Abb. 3.18 C) liefert, bestand das
primäre Ziel darin, die betreffenden Indolderivate vorab voneinander zu trennen, was
durch den Einsatz einer geeigneten hochleistungsflüssigkeitschromatographischen
Trennung gewährleistet werden konnte (Abb. 3.17). Im Anschluß an die Isolation der
Indolderivate ließen sich die einzelnen Fraktionen selektiv derivatisieren, und mittels einer
hochsensiblen gaschromatographisch-tandemmassenspektrometrischen Technik (3.5.4)
analysieren. Die durchgeführten Experimente vermochten den enzymatischen Umsatz von
Trp zu IAM, als auch die Steigerung dieser enzymatischen Aktivität im Zuge der
proteinbiochemischen Anreicherung des IES-Synthase-Komplexes zweifelsfrei zu belegen
(Abb. 3.18 B). Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem die Identifikation markierten IANs
angestrebt. Unter Einsatz der hier präsentierten Analysetechnik hätte sich intermediär
entstehendes IAN selektiv nachweisen lassen müssen, doch konnte unter keinen
Umständen isotopenmarkiertes IAN detektiert werden, was zu dem Schluß führt, daß IAN
kein direktes Intermediat der IES-Synthase-Reaktion darstellt. Darüber hinaus konnte unter
Verwendung von isotopenmarkiertem IAM, welches, im Rahmen dieser Arbeit, mit Hilfe
Diskussion
111
einer Tryptophan-2-Monooxygenase aus Pseudomonas savastanoi synthetisiert und
gereinigt wurde (2.7.4), sowohl der enzymatische Umsatz von IAM zur IES in pflanzlichen
Proteinpräparationen, als auch die Verdünnung dieses Umsatzes durch die Gabe von L-Trp
demonstriert werden, wobei bei einem Verhältnis von 1:1 an L-Trp zu [2H]5-IAM eine
Reduktion des IAM-Umsatzes auf 53.7 % beobachtet werden konnte (3.5.5). De-facto
lassen diese Resultate einen Zusammenhang von IAM-Synthese und Umsatz, sowie der
IES-Synthase-katalysierter IES-Biosynthese erkennen.
Zur weitergehenden Charakterisierung der hier vorgestellten IAM-Hydrolase-Aktivität aus
A. thaliana wurde versucht, die Stereoselektivität dieser Reaktion eingehender zu
untersuchen. Die IES-Synthase zeigt, wie von MÜLLER & WEILER (2000a) beschrieben,
eine strikte Stereoselektivität für ihr bevorzugtes Substrat, das L-Trp. Folgerichtig sollte
sich, für den Fall eine Beteiligung einer Amidasereaktion an der IES-Biosynthese, eine
solche Selektivität auch für die IAM-Synthese aus Trp finden lassen. Die Untersuchungen
ließen diesbezüglich aber keine eindeutige Schlußfolgerung zu. Im Gegensatz zu der IES-
Synthase-katalysierten IES-Biosynthese wurde bei der Bildung des IAMs auch D-Trp als
Substrat akzeptiert, wobei der Zusatz von unmarkiertem D-Trp jedoch nicht zu einer
Reduktion des [2H]5-L-Trp-Umsatzes führte, sondern vielmehr zu einer nachweislichen
Verdoppelung des IAM-Gehaltes ([2H]5-IAM + IAM), was wiederum auf eine
enzymatische Nebenreaktion hindeutet (3.5.6). In diesem Kontext könnte eine Peroxidase-
katalysierte Decarboxylierung von Trp zu IAM eine denkbare Nebenreaktion darstellen.
Eine solche, von RIDDLE & MAZELIS (1964, 1965) bereits früh postulierte, Reaktion ließ
sich in den untersuchten Ansätzen allerdings mit großer Wahrscheinlichkeit ausschließen,
da unter den gewählten Reaktionsparametern keine Peroxidaseaktivität detektiert werden
konnte (Daten nicht gezeigt).
Da die in-vitro-Experimente konsistent auf die intermediäre Beteiligung von IAM an der
IES-Biosynthese hinwiesen, sollte im folgenden untersucht werden, ob IAM in-vivo in
A. thaliana nachzuweisen ist. Unter Verwendung der hier präsentierten, gekoppelten
HPLC/GC-MS/MS-Technik, in Verbindung mit pentadeuteriertem IAM als internem
Standard, konnte endogen enthaltenes IAM in strikt steril angezogenen A. thaliana-
Pflanzen zweifelsfrei quantifiziert werden (3.6.1). Der Gehalt an IAM in 14 Tage alten
Rosettenpflanzen erwies sich als äußerst gering (3.5 ng g-1 Frischgewicht), und sank im
weiteren Verlauf der Entwicklung auf etwa 130 pg g-1 Frischgewicht in ausgewachsenen
Pflanzen ab. Tendenziell war der IAM-Gehalt in nicht steril gezogenen Pflanzen
Diskussion
112
(30.9 ± 5.0 pmol g-1 Fg), im Vergleich zu sterilem Pflanzenmaterial gleichen Alters
(20.5 ± 9.1 pmol g-1 Fg), geringfügig höher. Von einer bakteriellen Kontamination des
Pflanzenmaterials kann aber abgesehen werden, da die IAM-Gehalte in den nicht steril
gezogenen Pflanzen mit dem Alter nicht konstant blieben oder anstiegen, sondern vielmehr
mit der Zeit auf 0.74 ± 0.03 pmol g-1 Fg (vegetative Pflanzen mit 5 – 7 cm Rosetten-
durchmesser) absanken. Diese Ergebnisse belegen, daß IAM als endogener Metabolit in
A. thaliana angesehen werden muß.
In weiteren Untersuchungen wurden die endogenen Gehalte an IES und IAM in steril
angezogenen Keimlingen innerhalb der ersten 14 Tage der Keimlingsentwicklung
analysiert. Die höchsten Meßwerte für IES sowie IAM konnten in gequollenen Samen
aufgezeigt werden (Abb. 3.22 A), wobei, verglichen mit 14 Tage alten Keimlingen, hier
270-fach höhere IES- bzw. 40-fach höhere IAM-Mengen detektiert wurden. Die Zeitprofile
des Auftretens beider indolischer Komponenten zeigen klare Analogien, so sinken
beispielsweise die endogenen Gehalte von IAM und IES innerhalb der ersten 3 – 5 Tage
der Keimung parallel ab.
Die Wirkung und Herkunft von Auxinen im Verlauf der Keimlingsentwicklung wird
bereits seit langem untersucht (GOODWIN, 1978). Nach heutigem Wissensstand wird davon
ausgegangen, daß in den ersten Tagen der Keimung Auxine aus zuvor angelegten
Speichern freigesetzt werden (ELLIOT & STOWE, 1971; BODNARYK & PALANISWAMY,
1990). Mit der Freisetzung von IES aus sekundären Metaboliten, wie z.B. Glucobrassicin
(PETERSEN et al., 2002), während der Keimung werden, in A. thaliana, zwei Nitrilase-
Isoformen (NIT2, NIT3) in Verbindung gebracht (VORWERK et al., 2001; KUTZ et al.,
2002), da sie ausschließlich während der Embryo- (NIT2) und frühen
Keimlingsentwicklung (NIT3) exprimiert werden. Der parallele Verlauf der Indolderivat-
Profile läßt einen Zusammenhang der IAM-Synthese mit der Aktivität dieser Nitrilase-
Isoformen vermuten. Darüber hinaus lieferten Arbeiten von KOBAYASHI et al. (1998a),
PIOTROWSKI et al. (2000) und OSSWALD et al. (2002) Hinweise auf eine enzymatische
Bifunktionalität der Nitrilasen. Die Nitrilase 4 aus A. thaliana setzt beispielsweise ihr
Substrat β-Cyano-L-alanin nicht ausschließlich zu Aspartat um, sondern liefert, wenn auch
nur in geringerem Maße, zudem Asparagin als zweites Endprodukt der enzymatischen
Reaktion. Um zu überprüfen, ob eine nitrilasekatalysierte Reaktion womöglich die Ursache
für die hohen IAM-Mengen in den ersten drei Tagen der Keimlingsentwicklung sein
könnte, wurden die Nitrilase-Isoformen 1 – 3 heterolog überexprimiert, über ihren (His)6-
Diskussion
113
Fusionsanteil gereinigt, und die Produkte der enzymatischen Umsetzungen, nach
Inkubation mit IAN als Edukt, analysiert. Für alle drei untersuchten Isoformen konnte
neben der erwartungsgemäßen Bildung von IES auch die Synthese von IAM gezeigt
werden (3.6.2). Da in zusätzlichen Experimenten keine detektierbarer Umsatz von IAM
durch die rekombinanten Nitrilasen gemessen werden konnte, deutet alles darauf hin, daß
es sich hier um ein zweites Endprodukt der Nitrilasereaktion handelt. Zusammengefaßt
implizieren die Resultate der in-vitro-Analysen die Hypothese, daß zumindest ein Teil des
während der Keimlingsentwicklung gebildeten IAMs einer nitrilasekatalysierten Reaktion
entstammt. Voreifrige Rückschlüsse auf die in-vivo-Situation können aber irreführend sein,
da bisher unbekannte Regulationsmechanismen die enzymatische Aktivität der Nitrilasen
in-planta modifizieren könnten. Weitergehende Experimente an nitrilasedefizienten
Mutanten bzw. Fütterungsversuche mit isotopenmarkierten Biosynthesevorstufen sind
notwendig, um Klarheit über die Quelle des IAMs in Keimlingen und die Rolle der
Nitrilasen in diesem Prozeß zu erbringen.
Eine weitere Untersuchung der IAM-Gehalte in einzelnen Individuen demonstrierte eine
Metabolisierung des Amids in Abhängigkeit vom Entwicklungszustand der Keimlinge. Der
absolute Gehalt an IAM betrug 11.8 pg pro gequollenem Samen, und fiel innerhalb der
ersten 1 – 3 Tage der Keimung auf 2.8 pg pro Keimling ab. Zwischen Tag 5 und 14 ließ
sich ein erneuter Anstieg des IAM-Gehaltes auf 27.9 pg pro Keimling errechnen (Abb.
3.22 B). Auf Grundlage dieser Beobachtung wurden im folgenden Versuche zur
Identifikation von Proteinen unternommen, welche an der Umsetzung von IAM beteiligt
sein könnten. Die spezifische IAM-Umsetzung könnte beispielsweise von sogenannten
Amidohydrolase (Amidasen) katalysiert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit keine pflanz-
lichen Amidohydrolasen bekannt waren, wurden die abgeleiteten Aminosäuresequenzen
bakterieller IaaH Gene miteinander verglichen. Mit Hilfe dieser Aminosäuresequenz-
analyse ließ sich ein etwa 118 Aminosäuren umfassender, konservierter, Sequenzbereich
ermitteln (Abb. 3.24), welcher eine Homologie von 73 % aufwies und zur Sichtung einer
A. thaliana Protein Datenbank verwendet wurde. Anhand dieser in-silico-Untersuchungen
wurden vier putative Amidohydrolasen (AMI1 – AMI4) im Proteom von A. thaliana
ausgemacht (3.7.1). Die Homologie dieser Proteine mit dem 118 Aminosäuren langen
Sequenzbereich der bakteriellen Amidohydrolasen lag zwischen 39.1 % und
60.4 %.
Diskussion
114
Die katalytischen Eigenschaften bakterieller Amidohydrolasen sind in der Vergangenheit
bereits umfassend untersucht worden. Im Vordergrund standen hierbei die Identifikation
des katalytischen Zentrums sowie die Analyse enzymatischer Reaktionsmechanismen
industriell genutzter Enzyme, wie der Amidohydrolase (EC 3.5.1.4) aus Rhodococcus sp.
(Accession M74531) bzw. Rhodococcus rhodochrous J1 (Accession D16204). KOBAYASHI
et al. (1997) gelang es mit Hilfe gerichteter Mutagenese zwei essentielle Aminosäuren
(L-Asp, L-Ser) im katalytischen Zentrum dieser Enzyme zu identifizieren. Entgegen der
Erwartung der Autoren zeigten die untersuchten Amidohydrolasen keine, für Sulfhydryl-
Enzyme typische, Beteiligung eines Cysteinrestes im aktiven Zentrum des Enzyms, welche
z.B. von Nitril-Hydrolasen bekannt ist (BORK & KOONIN, 1994). Der Vergleich der
putativen Amidasen aus A. thaliana mit den Rhodococcus Amidohydrolasen erlaubte eine
weitere Eingrenzung der Gruppe. Lediglich die, im folgenden als AMI1 bezeichnete,
Amidohydrolase aus A. thaliana (Accession AAG35612), verfügt über beide essentiellen
Aminosäuren des aktiven Zentrums (Abb. 3.25). In der zweiten putativen Amidase (AMI2,
Accession CAA71371) ist das katalytisch relevante L-Aspartat (Asp-133, AMI1)
konservativ gegen L-Glutamat (Glu-166, AMI2) ausgetauscht. Die beiden anderen Enzyme
(AMI3 und AMI4) enthielten anstelle des L-Serins (Ser-137, AMI1) funktionell nicht
vergleichbare L-Glycine (Gly-180, AMI3; Gly-167, AMI4), weshalb auf eine weitere
Untersuchung der beiden letztgenannten Proteine verzichtet wurde.
Bioinformatische Recherchen, unter Verwendung gängiger Datenbanken (AGI,
Arabidopsis Genomic Initiative), ermöglichten die chromosomale Lokalisation der beiden
Amidasen sowie die Sichtung der umliegenden Genregionen (Abb. 3.26). Die Nuklein-
säuresequenzen von AMI1 bzw. AMI2 zeigten keine Gemeinsamkeiten mit umliegenden
Genen. Eine Organisation der putativen Amidasen in Genfamilien kann demzufolge
ausgeschlossen werden.
Die vollständigen cDNA-Fragmente für AMI1 und AMI2 ließen sich mittels RT-PCR
amplifizieren, und anschließend in geeignete Expressionssysteme inserieren. Hierbei zeigte
sich, daß beide Amidasen in Blättern konstitutiv (Abb. 3.27), in Wurzeln hingegen nicht
nachweisbar exprimiert werden (3.7.3). Die Fusionskonstrukte ließen sich in Escherichia
coli exprimieren, wobei sich lediglich AMI1 unter nativen Bedingungen reinigen ließ. Die
heterologe Expression von AMI2 führte in zwei unabhängig voneinander erstellten
Expressionssystemen jeweils zur Einlagerung der Fusionsproteine in Einschlußkörpern.
Ähnliche Beobachtungen wurden bereits für die Amidase aus Rhodococcus rhodochrous
Diskussion
115
J1 gemacht. Hier konnte das Protein aber mittels Denaturierung und sequentieller
Renaturierung, unter Erhalt der enzymatischen Aktivität, aus den Einschlußkörpern
gereinigt werden (KOBAYASHI et al., 1997). In Anlehnung an diese Vorgehensweise konnte
schließlich auch ein Teil der AMI2-Fusionsproteine gewonnen und affinitätschromato-
graphisch gereinigt werden (Abb. 3.29 B).
Ein schlüssiger Funktionsnachweis der putativen Amidasen aus A. thaliana stand noch aus.
Folglich erschien es erstrebenswert, die Substratspezifität der heterolog exprimierten und
gereinigten Proteine zu überprüfen (3.8.1). Hierbei stellte sich heraus, daß AMI2 keines
der angebotenen Substrate umsetzte. Unter Berücksichtigung der Aufarbeitungsprozedur
darf, in Bezug auf die Amid-Umsetzung, jedoch nicht ohne weiteres auf eine fehlende
enzymatische Aktivität dieses Proteins geschlossen werden, da eine Denaturierung/
Renaturierung von Proteinen oftmals mit dem Verlust der enzymatischen Aktivität
einhergeht. Das nativ gereinigte AMI1-Fusionsprotein zeigte hingegen signifikante IAM-
Hydrolase-Aktivität. Von den angebotenen Substraten wurde IAM mit Abstand am besten
umgesetzt (Abb. 3.30). Hinzu kamen, verglichen mit dem IAM-Umsatz, geringere
Umsätze für L-Asparagin (41.5 %), 1-Naphthylacetamid (25.2 %), und Nikotinsäureamid
(10 %), wobei 1-Naphthylacetamid kein natives Substrat darstellt, da es in Pflanzen nicht
vorkommt. Im Gegensatz zu bakteriellen Amidasen (KOBAYASHI et al., 1998b), setzte
AMI1 nahezu kein IAN um.
Weil AMI1 neben IAM auch die Aminosäure L-Asparagin als Substrat akzeptierte, wurde
eine Beteiligung dieses Enzyms bei der Hydrolyse von Auxin-Konjugaten in Betracht
gezogen. Experimentell fand diese Hypothese jedoch keine Bestätigung, da eine
enzymatische Freisetzung von IES aus Indol-3-acetyl-L-aspartat nicht detektiert werden
konnte. In Verbindung mit dem Fehlen struktureller Ähnlichkeiten zu bisher bekannten
Auxin-Konjugat-Hydrolasen aus Enterobacter agglomerans (CHOU et al., 1998) und
A. thaliana (DAVIES et al., 1999; LECLERE et al., 2002) erlauben diese Daten den
Ausschluß einer solchen Funktion für AMI1.
Weiterführende Versuche zielten darauf ab, eine grundlegende Charakterisierung des
rekombinanten AMI1-Polypeptids durchzuführen (3.8.2). Das Reaktionsverhalten des
Enzyms war unter Standardbedingungen (T = 30 °C, pH = 7.5, 5 µg gereinigtes Protein,
10 mM IAM) mehr als 4 h stabil. Das pH-Optimum lag bei pH 7.0, wobei die
enzymatische Aktivität bei pH-Werten > 8 bzw. < 6 drastisch abnahm. Bei pH 7.0 wies
AMI1 ein Temperatur-Optimum von 35 – 37 °C aus. Temperaturen oberhalb von 37 °C
Diskussion
116
führten zu einer signifikanten Reduktion der Aktivität. Für das Strep-AMI1-Fusionsprotein
ließ sich ein apparenter Km-Wert von 972 µM (0 – 1 mM IAM) bestimmen, ein exakter
Wert für die Michaelis-Menten-Konstante konnte jedoch unter den gegebenen
Bedingungen nicht ermittelt werden, da sich die Reaktion nicht sättigen ließ. Mit
steigender Substratkonzentration nahm die spezifische Aktivität des rekombinanten
Proteins stetig zu, so ließ sich bei einer Substratkonzentration von 10 mM IAM eine
spezifische Aktivität von 4.1 nkat mg-1 Protein ermitteln, welche bei 25 mM IAM auf
7.5 nkat mg-1 Protein anstieg. Höhere Substratkonzentrationen ließen sich nicht berück-
sichtigen, da sich die Löslichkeit von IAM in Methanol limitierend auswirkte, und der
Einsatz größerer Methanolvolumina quenchende Effekte auf das photometrische
Analyseverfahren zeigte. Eine solche Substratkinetik (Abb. 3.31 A) wird häufig bei
Proteinen beobachten, welche allosterisch durch ihr Substrat oder einen Effektor aktiviert
werden, was oftmals mit einer Konformationsänderung des Proteins einhergeht (MONOD et
al., 1965). Als vielleicht prominentestes Beispiel für einen solchen Mechanismus sei in
diesem Zusammenhang nur die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase
erwähnt, deren Aktivität in-vivo durch ein komplexes Zusammenspiel von Carbamy-
lierung, Mg2+-Konzentration, und einer RubisCO-Aktivase reguliert wird (JENSEN & BAHR,
1977; HARTMAN & HARPEL, 1994; SPREITZER & SALVUCCI, 2002). In Bezug auf die
generelle Charakterisierung des rekombinanten AMI1-Polypeptids konnte festgestellt
werden, daß die Amidase 1 aus A. thaliana in-vitro als Monomer fungiert (3.8.3), was vor
dem Hintergrund, daß viele bakterielle Amidasen obligat als Homodimere (KOBAYASHI et
al., 1993) bzw. Homotetramere (SOUBRIER et al., 1992) agieren, bemerkenswert erscheint.
Im weiteren Verlauf konnten polyklonale Antikörper gegen die beiden vollständigen
Proteine hergestellt werden, welche den Nachweis beider Proteine in cytosolischen
Proteinfraktionen aus A. thaliana erlaubten (Abb. 3.34). Auffällig war in diesem
Zusammenhang eine verhältnismäßig geringe Expression der Proteine. Die Messung der
IAM-Hydrolase-Aktivität in pflanzlichen Rohextrakten spiegelte die niedrige Expression
wider, da Enzymaktivitäten von lediglich 0.14 ± 0.01 pkat mg-1 Protein gemessen werden
konnten (3.8.5). Mit Fortführung der Experimente konnte eine spezifische Anreicherung
der Amidasen nach Chromatographie an Hydroxyapatit erzielt werden, welche durch die
Verwendung der α-Amidase-Seren (643 & 644) verfolgt werden konnte. Die chromato-
graphische Anreicherung führte zur Steigerung der enzymatischen Aktivität im
pflanzlichen Proteinextrakt auf 2.22 ± 0.71 pkat mg-1 Protein.
Diskussion
117
Abschließend stellte sich die Frage, ob die isolierten Amidasen aus A. thaliana mögliche
Komponenten des IES-Synthase-Komplexes darstellen. Unter Einsatz der gewonnenen
Antikörper gegen AMI1 und AMI2 wurde diese Fragestellung bearbeitet. Vorversuche zur
Immunpräzipitation der IES-Synthase aus angereicherten Proteinfraktionen ließen für das
α-AMI1-Serum eine Präzipitation der IES-Synthase erkennen, wohingegen die Gabe des
α-AMI2-Serums keinen Einfluß auf IES-Synthase zeigte (3.9.1). Zur weiterführenden
Untersuchung dieses Effektes wurden spezifische α-AMI1-Immunglobuline gereinigt, und
erneut zur Präzipitation der IES-Synthase verwendet. Entgegen den Erwartungen konnte in
diesen Versuchen keine Präzipitation der Synthase-Aktivität beobachtet werden, vielmehr
zeigte sich mit steigender IgG-Konzentration eine drastische Zunahme der IES-Synthase-
Aktivität um bis zu 700 % (Abb. 3.36). Daraus ließ sich schließen, daß das verwendete
Antikörper/Antigenverhältnis außerhalb des Äquivalenzbereiches (Heidelberger-Kurve)
lag und die Antikörper/Antigen-Komplexe somit nicht ausreichend miteinander vernetzen,
die Antikörper jedoch in erheblichem Maße mit der IES-Synthase interagieren. Hierbei
könnte die Steigerung der Aktivität durch eine Erhöhung der Löslichkeit des Synthase-
Komplexes bedingt sein, was zudem durch die Abnahme der tryptophanmetabolisierenden
Aktivität in den Sedimenten nahe gelegt wird. Darüber hinaus ist eine Stabilisierung des
Enzymkomplexes durch die Antikörper denkbar, welche hier als proteolytische
Schutzgruppen fungieren könnten. Eine immunaffinitätschromatographische Separation
einer angereicherten IES-Synthase Fraktion (2.10.2.3) mit anschließender Mikrosequenz-
ierung isolierter Polypeptide erlaubte jedoch keine näheren Aussagen zur Beteiligung von
AMI1 im IES-Synthase-Komplex. Augenscheinlich beinhaltete die untersuchte Protein-
fraktion zu hohe Mengen an Enzymen, welche unspezifisch mit der Sepharosematrix
interagierten, und so die spezifisch gebundenen Proteine überlagerten (3.9.2).
Interessanterweise ließen sich in einer sehr schwachen Proteinbande auf Höhe von 66 kDa
Hinweise auf eine Myrosinase (Accession NP_197972) finden. Diese Proteine sind, unter
anderem, an der enzymatischen Freisetzung von IES aus Glucobrassicin beteiligt und
stehen somit direkt mit der IES-Biosynthese in Verbindung. Eine kritische Betrachtung
dieser Ergebnisse ist indes unabdingbar, da es sich hier ebensogut um eine unspezifische
Bindung handeln könnte. In weiterführenden Experimenten könnte, nach weiterer im-
munologischer Reifung der α-AMI1-Immunglobuline, die Präzipitation spezifischer Anti-
körper/Antigen-Komplexe nach Bindung an einer Protein G-Matrix erzielt werden.
Diskussion
118
Möglicherweise können auf diesem Weg proteinmassenspektrometrische Informationen
bezüglich AMI1-assoziierter Proteine gesammelt werden.
In einer abschließenden Reihe von Experimenten zur Identifikation von Proteinen des IES-
Synthase-Komplexes wurde versucht, tryptophan- bzw. indol-3-acetamidbindende Proteine
mittels Photoaffinitätsmarkierung zu identifizieren (3.10). Zu diesem Zweck wurden ent-
sprechende photoaktivierbare Substanzen ([3H]3-6-Azido-L-tryptophan, [3H]2-6-Azido-
indol-3-acetamid) hergestellt. Obgleich die Funktionalität beider Verbindungen zweifels-
frei demonstriert werden konnte, ermöglichte die Verwendung dieser Azidoderivate keine
spezifische Markierung von pflanzlichen Enzymen. Insbesondere die Markierungs-
experimente mit [3H]2-6-Azidoindol-3-acetamid belegten, daß für eine eindeutige
Markierung von Proteinen mit ihrem Substrat unerwartet hohe Proteinmengen (> 0.75 µg)
notwendig waren (3.10.2). Die Photoaffinitätsmarkierung konnte sich bei der Identifikation
von Rezeptoren häufig bewähren, da Ligand/Rezeptor-Interaktionen in aller Regel einen
hochaffinen Charakter aufweisen, sowie mit einer kovalenten Bindung des Liganden an
den Rezeptor einhergehen. Von einer solchen Interaktion kann bei dem untersuchten
Substrat/Enzym-System indes nicht ausgegangen werden. Darüber hinaus sind die
gesuchten Zielproteine mit großer Wahrscheinlichkeit zu den sogenannten „unterrepräsen-
tierten“ Proteinen („low abundant proteins“) zu zählen, so daß diese Methode hier als nicht
praktikabel erachtet werden muß.
In Summe deuten die im Verlauf dieser Arbeit zusammengetragenen Daten konsistent auf
einen IES-Biosyntheseweg hin, der, analog zu dem bakteriellen Indol-3-acetamid-
Biosyntheseweg, ausgehend vom Trp via IAM zur IES führt. Untermauert wird diese
Aussage durch Arbeiten an dem Agrobacterium tumefaciens IaaM Gen, welches für eine
Tryptophan-2-Monooxygenase codiert. KLEE et al. (1987) beobachteten nach Über-
expression dieses Gens in Tabak und Petunien drastische Symptome einer Auxin-
überproduktion. Neben einem erwartet hohen IAM-Gehalt konnten auch enorm erhöhte
IES-Gehalte gemessen werden, was die Autoren zu der Schlußfolgerung führte, daß in
beiden Spezies ein enzymatischer Umsatz von IAM zur IES möglich sei, obgleich ein
autokatalytischer Zerfall des IAMs nicht ausgeschlossen werden konnte. Vor diesem
Hintergrund durchgeführte Aminosäuresequenzanalysen erbrachten keine präzisen Hin-
weise auf Tryptophan-2-Monooxygenase-ähnliche Enzyme im Proteom von A. thaliana.
Darüber hinaus läßt der beachtliche Einfluß der α-AMI1-Antikörper auf die IES-Synthase-
Aktivität mit großer Wahrscheinlichkeit auf eine Integration von AMI1 bzw. eines
Diskussion
119
amidaseähnlichen Proteins im Synthase-Komplex schließen. Dieser Befund scheint in
eklatanter Diskrepanz zu der Arbeit von MÜLLER & WEILER (2000a) zu stehen, die anhand
von Isotopenmarkierungsexperimenten den Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus
Wasser in die IES postulierten, da die hier vorgeschlagene Indol-3-acetamid-
Reaktionssequenz lediglich zum Einbau eines Sauerstoffmoleküls in die IES führt.
Abb. 4.1: Massenspektrometrische Analyse des Sauerstoffeinbaus im Zuge von Indol-3-essigsäure-Synthase katalysierter Indol-3-essigsäure-Biogenese
Das Massenspektrum belegt den Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus Wasser in die IES. Zur Kontrolle wurde die Reaktion (16 h, 30 °C) unter Zusatz von unmarkierter IES (0.5 mM) durchgeführt, um den nicht-enzymatischen Sauerstoffaustausch zwischen der Carboxygruppe und dem 18O-markierten Wasser zu untersuchen (verändert nach MÜLLER & WEILER, 2000a).
Bei genauerer Betrachtung der Primärdaten (Abb. 4.1) läßt sich hingegen erkennen, daß
der IES-Synthase-vermittelte Sauerstoffeinbau nicht vornehmlich zur Bildung von [18O]2-
IES (m/z = 199) führt, sondern die Produkte IES (m/z = 195), [18O]-IES (m/z = 197) und
[18O]2-IES (m/z = 199) in einem Verhältnis von 0.8 : 3.2 : 6 liefert, was von den Autoren
auf die nur 94 %-ige Isotopenanreichung des eingesetzten H218O zurückgeführt wurde.
Eine nitrilasekatalysierte Reaktion sollte jedoch einen deutlich höheren Anteil an zweifach 18O-markierter IES (m/z = 199) liefern, da bei einer solchen Hydratisierung, in einer
einstufigen Reaktion, simultan zwei Moleküle Wasser angelagert werden. Unter der
Prämisse einer Amidasebeteiligung erlaubt der, von KOBAYASHI et al. (1998b)
vorgeschlagene, katalytische Mechanismus (Abb. 4.2) bakterieller Amidasen eine anders
geartete Erklärung für die detektierte Isotopenverteilung von 32 % einfach 18O-markierter
zu 60 % doppelt 18O-markierter IES.
Diskussion
120
Abb. 4.2: Vorgeschlagener katalytischer Mechanismus bakterieller Amidasen Das tetraedrische Intermediat ist mit [I], die Imino-Übergangsform mit [II] bezeichnet (verändert nach KOBAYASHI et al., 1998b).
Hierbei würde das Substrat (IAM) unter Ausbildung eines tetraedrischen Intermediates (I)
an das Enzym binden. Diese Konformation erlaubt ein Oszillieren zwischen der tetrae-
drischen Hydroxyamino-Form (I) und einer Imino-Übergangsform (II), wobei in einer
Gleichgewichtsreaktion H2O angelagert bzw. abgespalten wird, ohne dabei entsprechende
Nitrilverbindungen freizusetzen. Auf diese Weise könnte, der aus dem Amid stammende,
nicht markierte Sauerstoff abgespalten und dafür ein 18O-markiertes Sauerstoffmolekül
eingeführt werden. Im Zuge der amidasekatalysierten Reaktion könnte schließlich ein
weiteres 18O-markiertes Sauerstoffmolekül (III) in die IES inseriert werden.
Letztendlich können nur Untersuchungen an Amidase-defizienten bzw. Amidase-über-
exprimierenden Mutanten Klarheit über den Stellenwert dieses Enzymes innerhalb der
IES-Biogenese erbringen. Zudem ist die Analyse AMI1-homologer Proteine anderer
Pflanzenspezies erstrebenswert, da sich so die Herkunft dieser enzymatischen Aktivität
aufklären ließe, welche einerseits ihren Weg von Höheren Pflanzen in pflanzenassoziierte
Bakterien gefunden haben könnte, oder aber andererseits prokaryotischer Natur sein
könnte und im Verlauf der Koevolution in das Genom Höhere Pflanzen integriert wurde.
Zusammenfassung
121
5 Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, zum Verständnis der tryptophan-
abhängigen Auxinbiosynthese in Arabidopsis thaliana beizutragen. Die Beschreibung
eines tryptophanumsetzenden Indol-3-essigsäure-Synthase-Komplexes (MÜLLER &
WEILER, 2000a) diente dabei als Ausgangspunkt.
Es wurden Versuche unternommen, diesen IES-Synthase-Komplex proteinbiochemisch zu
reinigen. Unter Verwendung flüssigkeitschromatographischer Methoden ließ sich der
Komplex um einen Fakor von 180 anreichern, doch führten nachfolgende Photoaffinitäts-
markierungsversuche und proteinmassenspektrometrische Analysen nicht zu einer
Identifikation putativer Bestandteile des Enzymkomplexes.
Darüber hinaus wurde die Integration eines Flavin-Monooxygenase-ähnlichen Proteins
(YUCCA) in der IES-Synthase untersucht, wobei eine Beteiligung dieses Enzyms an der
IES-Synthase-vermittelten Auxin-Synthese nicht demonstriert werden konnte. Welche
Funktion diesem Protein in-vivo zuzuordnen ist wird diskutiert.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der biochemischen Charakterisierung der
Indol-3-essigsäure (IES) Biogenese. In diesem Zusammenhang wurde der Einfluß
unterschiedlicher Inhibitoren und Indol-Derivate auf den in-vitro-Umsatz von Tryptophan
(Trp) zur IES untersucht. Im Rahmen dieser Experimente konnte erstmalig ein
Verdünnungseffekt auf die in-vitro-IES-Synthese für eine indolische Verbindung (Indol-3-
acetamid) beobachtet werden, der zu der Hypothese einer intermediären Beteiligung dieser
Substanz im Verlauf der IES-Biosynthese führte. Dieser Annahme folgend, ließ sich in
weiterführenden Versuchen zweifelsfrei nachweisen, daß Indol-3-acetamid (IAM)
enzymatisch aus Trp entstehen kann und weiter zur IES umgesetzt wird. Nach Etablierung
eines hochsensitiven, gekoppelten, HPLC/GC-MS/MS-Analyseverfahrens konnte die
Quantifizierung von IAM in steril angezogenen Arabidopsis thaliana-Keimlingen
erfolgreich durchgeführt werden. Hierbei ließ sich eine entwicklungsbedingte Fluktuation
der IAM-Gehalte beobachten, was auf eine Metabolisierung von IAM in-planta verwies.
Daneben konnte ein putativer Syntheseweg für IAM in-vitro aufgezeigt werden, welcher
auf den enzymatischen Eigenschaften von Nitrilasen beruht. Der Stellenwert dieser
enzymatischen Quelle wird in Bezug auf die Keimlingsentwicklung diskutiert.
Zusammenfassung
122
Abschließend wurde die Identifikation IAM-umsetzender Enzyme im Proteom von
A. thaliana angestrebt. Es konnten vier putative Proteine identifiziert werden, von denen
zwei kloniert und untersucht wurden. Hierbei erwies sich, nach eingehender Charak-
terisierung, eines der Proteine (AMI1) als spezifische IAM-Hydrolase. Der Einsatz
spezifischer Antikörper, welche gegen das rekombinante AMI1-Protein gerichtet waren,
verdeutlichten in Immunpräzipitationsversuchen einen signifikanten Einfluß der
Antikörper auf die IES-Synthese-Aktivität. Dieses Ergebnis führte zu der Hypothese, daß
AMI1 oder ein amidaseähnliches Protein in dem IES-Synthase-Komplex integriert ist und
dort die Umsetzung von IAM zur IES, also die abschließende Teilreaktion, katalysiert. Ein
möglicher Mechanismus, welcher in Hinblick auf eine amidasekatalysierte Reaktion den
Einbau von zwei Molekülen Sauerstoff aus Wasser vermitteln würde, wird vorgestellt.
Zusammenfassung
123
Teile dieser Arbeit wurden bereits präsentiert bzw. veröffentlicht:
MÜLLER, A., POLLMANN, S., WEILER, E.W. and PIOTROWSKI, M. (2000). Properties of an IAA-synthase complex from Arabidopsis thaliana (Posterpräsentation). DFG Schwerpunktprogramm “Molecular Analysis of Phytohormone Action”. 1st International Conference.
POLLMANN, S., MÜLLER, A., PIOTROWSKI, M., WEILER, E.W. (2002). Auxin biosynthesis in Arabidopsis thaliana (mündliche Präsentation). DFG Schwerpunktprogramm “Molecular Analysis of Phytohormone Action”. 2nd International Conference.
POLLMANN, S., WEILER, E.W. (2002). Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana (Posterpräsentation). Botanikertagung der Deutschen botanischen Gesellschaft 2002.
POLLMANN, S., MÜLLER, A., PIOTROWSKI, M., WEILER, E.W. (2002). Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana. Planta 216 (1), 155-161
POLLMANN, S., NEU, D., WEILER, E.W. (2003). Molecular cloning and characterization of a novel amidase from Arabidopsis thaliana capable of converting indole-3-acetamide into the plant growth hormone, indole-3-acetic acid. Phytochemistry (in Druck).
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Anhang
141
Anhang A
Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz der, im Rahmen dieser Arbeit,
klonierten cDNA-Fragmente
i. YUCCA
Anhang
142
ii. AMI1
Anhang
143
iii AMI2
Anhang
144
Anhang B
Homologievergleich bekannter Amidasen bzw. amidaseähnlicher Proteine. Pflanzliche
Proteine sind fett unterlegt. Der Verwandtschaftsgrad ist entsprechend angegeben.
145
Danksagung
Nun ist es vollbracht und mir bleibt nur noch diese eine Seite, um meinem Dank Ausdruck
zu verleihen.
Ganz besonders danken möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. E.W. Weiler für
sein Vertrauen, das er mir mit der Überlassung des Themas entgegengebracht hat. Zudem
möchte ich mich für die Gewährleistung optimaler Arbeitsbedingungen, seine
fortwährende Diskussionsbereitschaft sowie sein großes Interesse am Fortgang dieser
Arbeit bedanken.
Herrn PD Dr. J.-D. Schwenn danke ich für die Übernahme des Korreferates.
Meinen wissenschaftlichen Dank richte ich an Axel Müller, der mir stets zur Seite stand
und insbesondere bei analytischen Problemen eine große Hilfe war und Markus
Piotrowski, ohne dessen Kooperationsbereitschaft die massenspektrometrischen
Proteinanalysen nicht möglich gewesen wären.
Persönlich möchte ich mich bei meinem studentischen Helfer und S-Blöckler Daniel Neu
bedanken, der mir durch sein freundliches Wesen, sein Interesse und seine Zuverlässigkeit
viel Freude bereitete. Sabine Schönfelder, Julia Förster und Tim Janowitz danke ich für die
nette Arbeitsatmosphäre im Labor 3/29. Steffen Reinbothe danke ich für die wahrhaft
„meisterliche“ Unterweisung in Bezug auf die zweidimensionale Gelelektrophorese und
die vielen fruchtbaren Diskussionen. Des weiteren danke ich allen anderen Mitarbeitern
des Lehrstuhls für Pflanzenphysiologie für ihre Unterstützung.
Ganz besonders bedanke ich mich bei Florian Schaller und Alexandra Kutz für die vielen
inspirierenden Gespräche und die kritische Durchsicht dieses Manuskripts.
Zuallerletzt möchte ich es nicht versäumen, meiner ganzen Familie für ihre Unterstützung
und anspornenden Worte zu danken. Ohne ihre Hilfe wäre es mir sicherlich bedeutend
schwerer gefallen, mich nach experimentellen Rückschlägen neu zu motivieren.
146
Lebenslauf
Name: Stephan Pollmann
Geburtsdatum: 18. Februar 1970
Geburtsort: Gelsenkirchen
Eltern: Karl-Heinz und Hannelore Pollmann, geb. Kosczinski
Familienstand: verheiratet
Erlangung der Hochschulreife: Mai 1989
Studium der Biologie:
Oktober 1993 – Dezember 1999 an der Ruhr-Universität Bochum. Abschluß des
Biologie-Hauptstudiums mit der Diplomarbeit:
„Reinigung und Charakterisierung einer Indol-3-
essigsäure Synthase aus Arabidopsis thaliana (L.)
HEYNH.“ am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie
unter der Betreuung von Prof. Dr. E.W. Weiler.
Seit Januar 2000 Doktorand und wissenschaftlicher Mitarbeiter am
Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie an der Ruhr-
Universität Bochum (Prof. Dr. E.W. Weiler).