Untersuchungen zur biologischen Wirkung von Onchocerca ...ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2560/pdf/MedDissertationFG... · Onchocerca-volvulus-Proteinen auf Monozyten / Makrophagen

Aus der Abteilung für klinische Chemie

(ehem. Leiter: PD. Dr. F. W. Tischendorf)

des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin Hamburg

Institutsdirektor: Prof. Dr. B. Fleischer

Untersuchungen zur biologischen Wirkung von

Onchocerca-volvulus-Proteinen auf

Monozyten / Makrophagen in vitro

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg

vorgelegt von

Florestan Gerald Höckh

geboren in Wiesbaden

Hamburg 2005

Inhaltsverzeichnis

Fragestellung 1

Einleitung 2

1. Ätiologie und Epidemiologie der Onchozerkose 2

2. Parasitologie des Erregers der Onchozerkose 3

3. Parasit-Wirt-Interaktion bei der Onchozerkose 6

4. Klinisches Erscheinungsbild der Onchozerkose 7

4.1 Hautveränderungen 8

4.2 Onchozerkombildung 9

4.3 Augenläsionen 10

5. Diagnostik der Onchozerkose 11

6. Bekämpfungs- und Therapiemaßnahmen bei der Onchozerkose 11

7. Immunantwort gegenüber Onchocerca volvulus 13

7. 1 Zelluläre Abwehrmechanismen 13

7. 2 Humorale Abwehrmechanismen 14

7. 3 Klassische und alternativ aktivierte Makrophagen 16

Material und Methodik 19

1. Reagenzien 19

2. Gewinnung von Onchocera-volvulus-Extrakt 23

2. 1 Materialgewinnung 23

2. 2 Nodulektomie und Isolierung von adulten O. volvulus 23

2. 3 Extraktherstellung 23

Inhaltsverzeichnis

3. Gewinnung humaner mononukleärer Zellen 24

3.1 Probanden 24

3.2 Blutabnahme 24

3.3 Erythrozytensediment und Gewinnung mononukleärer Zellen 24

4. Monozytenreinkultur 26

5. Zellkultur 26

6. Vollblutkultur 27

7. Durchflußzytometrie 28

8. ELISA 30

9. Auswertung und kommerzielle Computersoftware 33

Ergebnisse 34

1. Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 auf stimulierten Monozyten 34

1.1 Optimierung der Bedingungen der Expression von CD163

im Durchflußzytometer 34

1.2 Expression des Scavenger-Rezeptors CD163

nach Stimulation mit Lipopolysaccharid 37

1.3 CD163-Expression nach Stimulation mit dem Steroid Ecdyson 38

1.4 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 40

1.4.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt

von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren 44

1.5 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 45

1.6 CD163-Expression nach Stimulation mit den

Onchocerca-volvulus-Antigenen Ov17, Ovv17 und Ov33 48

1.7 CD163-Expression nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein

des Parasiten Dirofilaria immitis 49

Inhaltsverzeichnis

1.7.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Fragmenten des

Wolbachienproteins des Parasiten Brugia malayi 50

2. Interleukin-10-Freisetzung stimulierter Monozyten 51

2.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 51

2.1.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt

von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren 52

2.2 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 53

2.3 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein

des Parasiten Dirofilaria immitis 55

3. Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf Monozyten 55

3.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors

nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt 55

3.1.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation

von gereinigten Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt

von mit Doxycyclin behandelten Patienten 57

3.2 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors

nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt 59

3.3 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation

mit Wolbachienoberflächenprotein des Parasiten Dirofilaria immitis 60

4. Zentrale Ergebnisse 61

Diskussion 63

Zusammenfassung 73

Literaturverzeichnis 75

Anhang 95

1. Lebenslauf 95

2. Danksagung 96

3. Erklärung 97

Abkürzungen

AaM Alternativ aktivierte Makrophagen

AMAC-1 Asoziiertes CC-Chemokin alterantiv aktivierter Makrophagen

Bm V1 V1-Peptid des Wolbachienoberflächenantigens von Brugia malayi

Bm V3 V3-Peptid des Wolbachienoberflächenantigens von Brugia malayi

CD Cluster of Differentiation

DTH Immunantwort der verzögerten Überempfindlichkeit

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FCS Fetales Kälberserum

FITC Fluoresceinisothiocyanat

GM-CSF Granulozyten-/Makrophagenkolonie stimulierender Faktor

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulphonsäure

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

IL-10 Interleukin-10

IL-1 RA Interleukin-1-Rezeptorantagonist

LPS Lipopolysaccharid

MIF Makrophagen-inhibierender Faktor

MMR Makrophagen-Mannose-Rezeptor

NO Stickoxid

Ov Onchocerca volvulus

Ov17 Onchocystatin

Ovv17 Fragment des Onchocystatins

Ov33 Asparaginproteaseinhibitor, 33kDa-Antigen von O. volvulus

OvE Extrakt aus adulten Onchocerca volvulus unbehandelter Patienten

OvE/D Extrakt aus adulten Onchocerca volvulus von Patienten, die vor

Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren

OoE Onchocerca-ochengi-Extrakt

PAF Thrombozyten-aktivierender Faktor

PBS Phosphate Buffered Saline

PGE Prostaglandin E

PM Polymyxin B

R-PE / PE R-Phycoerythrin

RPMI Roswell Park Memorial Institute

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

TGF Tumor-Wachstums-Faktor

WSP Wolbachienoberflächenprotein (Wolbachia Surface Protein)

von Dirofilaria immitis

1

Fragestellung

Alternativ aktivierte Makrophagen spielen bei der Immunantwort gegen Helminthen

eine bedeutende regulierende Rolle (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003). Trotz hoher

Mikrofilariendichte kommt es bei der generalisierten Form der Onchozerkose nicht zu

einer massiven Inflammation, wie es bei der Sowda-Form der Onchozerkose zu

beobachten ist. Bei der Immunantwort der generalisierten Form der Onchozerkose stellt

sich die Frage, ob Proteine des Parasiten O. volvulus alternativ aktivierte Makrophagen

dahingehend stimulieren, daß diese eine antiinflammatorische Reaktion herbeiführen. In

der vorliegenden Arbeit sollte experimentell geprüft werden, ob Onchocerca-volvulus-

Proteine antiinflammatorische Faktoren in und auf Monozyten/Makrophagen induzieren

können.

Es sollten mononukleäre Zellen und Monozyten gesunder Probanden in Gegenwart von

Extrakt adulter O. volvulus und einzelnen rekombinant exprimierten Proteinen in vitro

kultiviert werden. Anschließend sollte die Expression von, für alternativ aktivierte

Makrophagen charakteristischen Rezeptoren (CD163, MMR) auf den Zellen gemessen

und im Überstand dieser Zellkulturen das Produkt von aaM, IL-10, bestimmt werden.

2

Einleitung

1. Ätiologie und Epidemiologie der Onchozerkose

Die Onchozerkose ist weltweit die zweithäufigste infektiöse Erblindungsursache

(WHO, 1995). So sind in der Republik Zentralafrika 2,2% von 6086 Individuen

erblindet (Schwartz et al., 1997). Die Mehrheit der Erblindungen ist dort durch

Onchozerkose bedingt (73,1%), der übrige Teil durch Katarakt (16,4%), Trachom

(4,5%) oder Glaukom (2,2%). Ursache dieser chronisch verlaufenden Erkrankung

(Flußblindheit) ist der Fadenwurm Onchocerca volvulus (Ordnung Spirurida,

Überfamilie Filaroidea); er stellt eine der wichtigsten humanpathogenen Filarien dar.

Onchocerca volvulus als Erreger der Onchozerkose wurde erstmals von einem

deutschen Missionar in Ghana beschrieben. 1893 gab Leuckart dem Parasiten seinen

Namen. Der Parasit kommt in 34 tropischen Ländern vor (Abb. 1). Vorwiegend kann

O. volvulus auf dem afrikanischen Kontinent, an der Südspitze der arabischen Halbinsel

sowie in Zentral- und Südamerika gefunden werden. Von den insgesamt über

120 Millionen weltweit in Risikogebieten lebenden Menschen sind ca. 18 Millionen mit

O. volvulus infiziert (WHO, 1995).

Abbildung 1:

Epidemiegebiete der

Onchozerkose

(freundlicherweise

von Prof. D. W.

Büttner zur

Verfügung gestellt)

Einleitung

3

2. Parasitologie des Erregers der Onchozerkose

Je nach Region sind unterschiedliche Arten von Simulien (Kriebelmücken) für die

Übertragung verantwortlich. In Westafrika wird O. volvulus durch Simulien des

Simulium damnosum-Komplexes übertragen. Innerhalb des Komplexes kann man

25 Typen unterscheiden (WHO, 1995). Simulien leben und brüten bevorzugt an schnell

fließenden Gewässern. Sie sind tagaktiv, exophil und können auf der Suche nach

Brutplätzen Entfernungen bis zu 500 km zurücklegen (Garms, Walsh and Davies,

1979). Normalerweise ernähren sich Simulien von Pflanzensäften. Zum Heranreifen

ihrer Eier benötigen die Weibchen jedoch Blut. Um an eine Blutmahlzeit zu gelangen,

orientieren sie sich an Duftstoffen im Schweiß von Säugetieren.

Bei der Blutmahlzeit nimmt das Simulienweibchen durch ihren kurzen Saugrüssel nach

Setzen von Gewebszerstörungen Mikrofilarien mit der Gewebsflüssigkeit des Wirtes

auf. Der Saugakt dauert ungefähr vier Minuten, bei dem die Simulie eine anästhetisch

wirksame Substanz abgibt, um vom Wirt nicht gestört zu werden. Die aufgenommene

Blutmenge beträgt ca. einen Mikroliter. Simulien fliegen dicht über der Erde und

stechen Erwachsene vorwiegend in den Unterkörper, Kinder auch in den Oberkörper

und Kopf (Duke & Beesley, 1958). Die Saugaktivität in Westafrika ist in den

Morgenstunden und am späten Nachmittag am höchsten, d.h. wenn die Außen-

temperatur zwischen 18°C und 35°C liegt. In einigen Gebieten sind mehr als 90% der

Erwachsenen mit O. volvulus infiziert (McMahon & Simonsen, 1996).

Bevor die aufgenommenen Mikrofilarien die Flugmuskulatur der Simulie erreichen,

müssen sie die Pharynxleiste und die peritrophische Membran des Insektenmagens

überwinden und in das Haemocoel gelangen. Dabei sterben ca. 25-33% der

Mikrofilarien (Brinkmann, 1982). In der Flugmuskulatur beginnen die Mikrofilarien

sich intrazellulär zu ernähren. Nach zwei Häutungen wandern die dritten infektiösen

Larvenstadien (L3) in den Kopf der Simulie. Von den Larvenstadien sterben ca. 15%.

Die Infektionslarven sammeln sich in den Mundwerkzeugen und werden bei einem

erneuten Blutmahl an den Wirt abgegeben. Die Entwicklung zur infektiösen Larve

dauert je nach Umgebungstemperatur ein bis zwei Wochen. Nach Beobachtungen von

B. Philippon und B. Quillevere (Philippon & Quillevere, 1977) sterben bis zu einem

Drittel der Parasiten bei Nachttemperaturen von unter 18°C.

Einleitung

4

Die L3 wandern durch das subkutane Fettgewebe des infizierten Menschen, häuten sich

innerhalb von zwei bis sechs Tagen zum vierten Larvenstadium (Bianco et al., 1989;

Strote & Bonow 1991). An dem komplexen Häutungsprozeß sind proteolytische

Enzyme beteiligt, die die alte Kutikula von der neuen trennen (Lustigman et al., 1996).

Aus dem vierten Larvenstadium entwickelt sich innerhalb von neun Monaten ein adulter

Parasit. Es bilden sich fibröse Knoten (Onchozerkome) um weibliche Filarien, die in der

Regel oberflächlich im Unterhautbindegewebe (Nelson, 1970; Albiez, 1978; Albiez et

al., 1978), aber auch in tieferen Gewebsschichten (Kilian, 1988) liegen können. In

diesen Knoten wachsen die weiblichen Filarien bis auf eine Länge zwischen 23 - 70 cm

und einen maximalen Durchmesser von ca. fünf Millimeter heran. Sie liegen allein oder

zu mehreren in diesen Knoten, die durch die Aggregation von Satellitenknoten im Lauf

der Zeit immer größer werden.

Tabelle 1: Entwicklungsstadien und Lebensdauer (Duke, 1990).

Männchen hingegen werden nur zwischen 6 - 13 cm lang und haben einen Durch-

messer von ca. 0,15 mm (Burchard & Bierther, 1978; Burchard et al., 1979; Franz,

1979; Omar & Büttner, 1979). Sie leben ebenfalls in den Knoten und wandern nach der

Befruchtung der Weibchen aus, um andere Knoten aufzusuchen. Der Mechanismus, der

den Männchen die Wanderung durch die Bindegewebskapsel ermöglicht, ist noch nicht

geklärt. Adulte Würmer leben bis zu 15 Jahre. In einem Zeitraum von 10 bis 15 Jahren

Stadium Vorkommen Lebensdauer

Adultes Weibchen Subkutanes Bindegewebe und

Onchozerkom (Mensch) bis zu 15 Jahre

Adultes Männchen Subkutanes Bindegewebe und

Onchozerkom (Mensch) bis zu 15 Jahre

Mikrofilarien Vorwiegend in der Haut und selten im

Bindegewebe (Mensch) ca. 1 bis 1,5 Jahre

1. Larvenstadium Flugmuskulatur (Simulie) ca. 4 Tage

2. Larvenstadium Flugmuskulatur (Simulie) ca. 2 Tage

3. Larvenstadium Kopf und Thorax (Simulie) ca. 2 bis 6 Tage

4. Larvenstadium Subkutanes Bindegewebe (Mensch) Präpatenz 1 Jahr

Einleitung

5

bildet ein Weibchen Millionen von Mikrofilarien (WHO, 1995). Diese ca. 0,3 mm

langen und im Durchmesser ca. 0,007 mm breiten Filarienlarven (Franz, 1979) können

in der Haut des Menschen 6 bis 24 Monate überleben. Eine Übersicht über das

Vorkommen und die Lebensdauer der Entwicklungsstadien von O. volvulus gibt die

Tabelle 1 wieder. Der Kreislauf beginnt von neuem, sobald Mikrofilarien bei einem

erneuten Saugakt von einer Kriebelmücke aufgenommen werden. Die Abbildung 2 zeigt

den Lebenszyklus von O. volvulus.

Lebenszyklus von O. volvulus

Abbildung 2: Lebenszyklus von O. volvulus (nach A. Renz, Universität Stuttgart und

WHO)

Einleitung

6

3. Parasit-Wirt-Interaktion bei der Onchozerkose

Die Mikrofilarie ist das am häufigsten vorkommende Stadium des Parasiten im

Menschen. Pro Tag und Weibchen schlüpfen durchschnittlich 700-1500 Mikrofilarien.

Die Anzahl der adulten Weibchen ist auf 60 beschränkt. Ein infizierter Mensch kann

über 12 Millionen Mikrofilarien beherbergen (Schulz-Key, 1990). In infizierten

Menschen nimmt die Mikrofilariendichte von den Füßen zum Kopf hin ab. Die

Mikrofilarien können durch die Kornea wandern und führen dort durch enzymale

Reaktionen zu einer Sklerosierung und Entzündung der Kornea.

Mikrofilarien von O. volvulus zeigen keine ausgeprägte Periodizität, wie sie bei anderen

Filarien bekannt ist (z.B.: Wuchereria bancrofti). Die maximale Dichte wurde in Afrika

und Guatemala mittags und am frühen Nachmittag gefunden (Duke, 1973; Duke &

Moore, 1974; Anderson et al., 1975). Die Krankheitsmanifestationen werden

überwiegend durch die inflammatorischen Reaktionen gegenüber Mikrofilarien

hervorgerufen. Veränderungen der Haut, der Augen sowie der Lymphknoten können

festgestellt werden. Erstaunlicherweise ist in den meisten Fällen trotz hoher

Mikrofilariendichte die inflammatorische Reaktion eher schwach ausgeprägt

(generalisierte Form der Onchozerkose; Ottesen, 1995). Die Sowda-Form der

Onchozerkose (Sowda aus dem Arabischen „aswad“= schwarz) mit stark ausgeprägter

Immunantwort gegen Antigene von Mikrofilarien tritt wesentlich seltener auf. Im

Vergleich zu der generalisierten Form ist bei der Sowda-Form die Mikrofilariendichte

weitaus geringer.

Ottesen (1995) unterscheidet drei exponierte Personengruppen:

I. Endemisch normale (mutmaßlich immune) Personen: Menschen, die in

Endemiegebieten gewohnt haben oder noch wohnen, bei denen jedoch keine

Infektion nachweisbar ist

II. Patienten mit generalisierter Mikrofilardermie (generalisierte Form) der

Onchozerkose: Sie zeigen Mikrofilarien in der Hautbiopsie, meist ohne

klinische Hautmanifestationen

III. Patienten mit chronisch-hyperreaktiver Form der Infektion (Sowda-Form):

Die Patienten weisen eine lokalisierte Entzündung der Haut mit geringer

Mikrofilariendichte auf

Einleitung

7

Die Abtötungsrate von Mikrofilarien in einem Patienten ist abhängig von der

bestehenden Parasitenlast, der Vitalität der Mikrofilarien und der Immunkompetenz des

Wirtes. Mikrofilarien können von Entzündungszellen attackiert werden (Büttner &

Rácz, 1983; Wildenburg et al., 1996). Die humorale Immunantwort auf parasitäres

Antigen ist weitaus prominenter als die zelluläre Zellantwort (Ottesen, 1995). Sterbende

Mikrofilarien lösen im Gegensatz zu lebenden Mikrofilarien lokale Entzündungs-

reaktionen aus. Es besteht eine Interaktion zwischen den Mikrofilarien und dem

Immunsystem des Wirts auf der Basis von exkretorischen und sekretorischen

Produkten.

Der Parasit O. volvulus lebt in einer Symbiose mit Wolbachien, die zur Familie der

Rickettsien gehören (Taylor & Hoerauf, 1999). Diese intrazellulär lebenden,

gramnegativen Bakterien werden in der Hypodermis, den Oozyten, allen embryonalen

Stadien und im Uterus des adulten Wurms sowie in Mikrofilarien gefunden und führen

bei ihrem Fehlen oder ihrer Eliminierung nach Behandlung mit Doxycyclin zu einer

langanhaltenden Sterilität des weiblichen Wurms (Hoerauf et al., 2000). Fast alle

Filarienspezies beherbergen Wolbachien, die vertikal übertragen werden (Taylor et al.,

1999). Es gibt vier Wolbachiengruppen, die mit A-D benannt werden. Verschiedene

Individuen einer Untergruppe der gleichen Wirtsspezies zeigen eine identische

Gensequenz des Wolbachienoberflächenproteins (WSP). In Nematoden kommen die

Gruppen C und D vor (Bazzocchi et al., 2000).

4. Klinisches Erscheinungsbild der Onchozerkose

Die Onchozerkose zeigt klinisch ein breites, fließend ineinander übergehendes

Formenspektrum (Ottesen 1995, Brattig 2004), von der häufigen hyporeaktiven

generalisierten Form mit geringer bis hoher Mikrofilariendichte der Haut bis hin zur

seltenen hyperreaktiven Sowda-Form mit niedriger Mikrofilariendichte. Die

Onchozerkose geht mit Knotenbildung (Onchozerkomen), Hautveränderungen wie

Depigmentierung (Leopardenhaut), Atrophie (Papierhaut) und Pruritus einher. Der

Korneabefall mit Mikrofilarien kann zur Erblindung führen, weshalb die Erkrankung

auch den Namen Flußblindheit bekommen hat (Schäfer & Gümbel, 2004).

Einleitung

8

4.1 Hautveränderungen

Die Hautveränderungen stehen in direkter Beziehung zur Mikrofilariendichte der Haut

(Kreshaw et al., 1954). Das erste Zeichen ist oft starker Juckreiz und eine akute

unspezifische Dermatitis mit stecknadelkopfgroßen, gleichförmigen Papeln. Bei

längerem Bestehen der Infektion kann sich eine chronische Dermatitis ausbilden. „Craw

Craw“ ist der ursprüngliche afrikanische Name dieses Krankheitsbildes, auch „Gale

filarienne“ oder Onchodermatitis genannt. In Zentralamerika, wo die Veränderungen

bevorzugt im Gesicht auftreten, nennt man dieses Krankheitsbild „Erisipela de la costa“.

Abbildung 3: Verän-

derung der Haut bei

Onchozerkose

(www.who.int)

Bei der Papierhaut

handelt es sich im

wesentlichen um eine

Schädigung und Ver-

minderung der retikulären und elastischen Fasern in der oberflächlichen Kutisschicht.

Eine dadurch bewirkte Lockerung der Haftstellen zwischen Epidermis und Kutis

verursacht Reliefveränderungen, die makroskopisch zunächst als sogenannte „lizard

skin“ und später bei ausgeprägter Atrophie mit papierdünner Haut das Bild der „crushed

tissue paper skin“ bietet (Abb. 3). In Liberia traten diese Veränderungen ähnlich der

normalen Hautalterung ohne gleichzeitige oder vorherige Dermatitis auf (Reber &

Hoeppli, 1964; Schumacher, 1965). Wenn die Hautfaltenbildung über den ursprünglich

vergrößerten inguinalen und femoralen Lymphknoten besonders ausgeprägt ist, spricht

man von „hanging groins“ (Nelson, 1958; Büttner, 1998). Am Eindrucksvollsten ist die

unregelmäßige Depigmentierung der Haut, vorwiegend prätibial (Browne, 1960).

Differentialdiagnostisch müssen eine tuberkuloide Lepra, Depigmentierungen bei

Treponematosen, insbesondere Framboesia tropica, eine Vitiligo, ein Arzneimittel-

exanthem und andere Dermatitiden abgegrenzt werden.

Einleitung

9

4.2 Onchozerkombildung

Onchozerkome sind linsen- bis pflaumengroße Tumore, die über der Unterlage

verschieblich und als rundliche bis ovale Knoten getastet werden können (Abb. 4). Die

Sensitivität des palpatorischen Befundes von Onchozerkomen liegt bei 94-99% (Weiss,

1978; Albiez, 1978). Sie sind meist fester als Lymphknoten und Lipome, jedoch nicht

so fest wie verkäsende Lymphknoten. Onchozerkome kommen in nahezu allen

Körperregionen vor. Je nach Endemiegebiet wurden typische Verteilungsmuster

beschrieben. An den Händen und Füßen, sowie im Gesicht kommen Onchozerkome

praktisch nicht vor. Auch sind sie äußerst selten im Bereich der Unterschenkel und im

Bereich der Bauchhaut anzutreffen. Vorwiegend im Hüftbereich verschmelzen oft

mehrere Knoten zu größeren

Konglomeraten mit unregelmä-

ßiger Oberfläche. Geschwollene

Lymphknoten können inguinal,

femoral und auch axillär (Senker

et al., 1973) oder generalisiert

(Browne, 1959; Connor et al.,

1970) vorkommen und die Folge

einer lokalen Lymphadenitis sein.

Abbildung 4: Vier bis fünf cm großes Onchozerkom über den linken Rippen eines ca.

vier Jahre alten Jungen. (www.who.int)

Einleitung

10

4.3 Augenläsionen

Lebende und tote Mikrofilarien können mittels Spaltlampe in der Kornea beobachtet

werden (Boithias, 1958; Anderson & Fuglsang, 1973). Der Tod von Mikrofilarien in der

Kornea führt zu einer begrenzten entzündlichen Reaktion, die eine unscharf begrenzte

graue Trübung hinterläßt (Garner, 1976; Thylefors, 1978; Schäfer & Gümbel, 2004).

Beschrieben als „flockige“ oder „schneeflockenartige“ Trübung präsentiert sich das

Bild einer Keratitis punctata. Im frühen Stadium ist diese Augenveränderung noch

reversibel (Lagraulet, 1971). Massive Invasion führt zur irreversiblen sklerosierenden

Keratitis (Garner, 1976). Sie beginnt gewöhnlich am unteren Limbus der Kornea als

grauer ödematöser Bezirk, in dem zahlreiche Mikrofilarien enthalten sind. Erreicht die

sklerosierende Fläche die zentrale pupilläre Zone und wächst darüber hinaus, so

erblindet das Auge (Abb. 5). Meist leiden Patienten mit einer sklerosierenden Keratitis

gleichzeitig an einer Uveitis der vorderen Abschnitte (Anderson & Fuglsang, 1977).

Abbildung 5: Sklerosierende Keratitis (www.stanford.edu)

Einleitung

11

5. Diagnostik der Onchozerkose

Neben der Klinik sind die Palpation von Onchozerkomen sowie „skin snips“ (kleine

Hautbiopsien) mittels Sklerastanze nach Walser zur Diagnoseerhebung entscheidend.

Nach der Entnahme wird die Biopsie für 24 Stunden in 0,9 % NaCl-Lösung gegeben.

Die Mikrofilarien verlassen das Biopsat und können anschließend mittels Mikroskop

ausgezählt werden (Braun-Munzinger et al., 1977).

Wenn die Hautbiopsie und die Palpation von Onchozerkomen negativ ausfallen, könnte

man bei bestehendem Verdacht auf Onchozerkose den Mazzotti-Test (Mazzotti, 1948)

anwenden. Dieser Test wird mittels einer einmaligen Dosis von 50 mg

Diäthylcarbamazin (DEC) durchgeführt. Nach frühestens 15 Minuten, spätestens jedoch

nach einem Tag, tritt ein starker Juckreiz und eventuell eine Urtikaria mit

asymmetrischem Erythem auf. Die Reaktion ist an den Stellen am stärksten ausgeprägt,

an denen die Konzentration der Mikrofilarien am höchsten ist. Gelegentlich kommt es

zu leichtem Fieber, Unwohlsein und Schwellung der örtlichen Lymphknoten. Die

Hauterscheinungen und der Juckreiz lassen im Verlauf von 3 bis 5 Tagen nach. Der Test

ist negativ, sofern keine Mikrofilarien vorhanden sind. Bei hoher Filariendichte der

Haut sollte aufgrund des massiven Untergangs von Mikrofilarien und einer daraus

resultierenden Gefährdung des Patienten durch Schwindel, Atemnot und Kollaps kein

Test angewandt werden. Der Test ist nicht spezifisch für O. volvulus.

6. Bekämpfungs- und Therapiemaßnahmen bei der Onchozerkose

1974 wurde in dem von Onchozerkose am schwersten betroffenen Gebiet Westafrikas

(ca. 1 235 000 km2) ein Onchozerkose-Kontrollprogramm (OCP) gestartet. Die

Bevölkerung des OCP-Gebietes betrug zu Beginn des Programms (1974) ca.

10 Millionen Einwohner, von denen mehr als eine Million an Onchozerkose litten; über

100 000 zeigten schwere Augenmanifestationen, 35 000 weitere waren bereits an den

Parasiten erblindet. 1986 wurde das OCP-Gebiet erweitert.

Die Strategie der WHO bezweckt die Reduktion der Simulienpopulation. Durch die

Minimierung des Vektors wird die Häufigkeit der Transmission von Mikrofilarien auf

Einleitung

12

den Menschen verringert. Per Flugzeug wurden über einen Zeitraum von 14 Jahren

regelmäßig Insektizide über den Brutplätzen versprüht. Sieben Insektizide (Toxin von

Bacillus shaericus und Bacillus thuringiensis var israelensis (B.t und H-14), Temephos

(Abate), Pyraclofos, Phoxim, Permethrin, Carbosulfan und Vectron) wurden unter

ständiger Kontrolle von Flora und Fauna in dem Programm eingesetzt. 1988 wurde das

Programm auf Guinea, Sierra Leone, Südghana, Togo und Benin ausgeweitet, um die

Reinvasion der Simulien in die OCP-Gebiete zu eliminieren. In den achtziger Jahren

tauchte erstmals das Problem der zunehmenden Resistenz der Simulien gegen die

verwendeten Insektizide auf. Daraufhin wurden als Konsequenz verbesserte Insektizide

abwechselnd verwendet.

In den frühen achtziger Jahren begann das erste medizinisch kontrollierte Therapie-

programm mit Ivermectin (Mectizan® Merck). Es wurde mit der Intention verabreicht,

einer Erblindung der Erkrankten vorzubeugen. Im Jahre 1996 sind mehr als 2,6 Mil-

lionen Menschen mit Ivermectin im Gebiet des Programms behandelt worden

(www.who.int). Hierbei kommt es zu einer Eliminierung der Wolbachien im weiblichen

Wurm sowie zu einer massiven Abnahme der Mikrofilariendichte in der Haut. Nach

18 Monaten zeigten sich bei 90% der so behandelten Patienten keine Mikrofilarien mehr

in der Haut (Hoerauf et al., 2001). Bei der Verabreichung von 150 µg/kg Körpergewicht

Ivermectin werden nur Mikrofilarien, nicht aber adulte Filarien abgetötet. Da die

geschlechtsreifen Würmer erneut Mikrofilarien hervorbringen, muß meist nach

6-12 Monaten erneut mit Ivermectin behandelt werden (Eddelston & Pierini, 1999).

Nach neueren klinischen Studien führt eine Gabe von 100 mg/Tag Doxycyclin über

sechs Wochen, verbunden mit einer einmaligen Gabe von 150 µg/kg Körpergewicht

Ivermectin, zu einer weitgehenden Sterilisation des weiblichen Wurms (Hoerauf et al.,

2001).

Einleitung

13

7. Immunantwort gegenüber Onchocerca volvulus

7.1 Zelluläre Abwehrmechanismen

Die Immunmechanismen gegen O. volvulus sind komplex. Bei unbehandelten Patienten

mit variierender Mikrofilariendichte der Haut kann eine massive Infiltration von

eosinophilen Granulozyten und Makrophagen im Gewebe um sterbende oder tote

Mikrofilarien beobachten werden (Büttner & Rácz, 1983). Die ansteigende

Akkumulation von eosinophilen Granulozyten in Onchozerkomen hängt von der

Mikrofilarienpräsenz ab (Wildenburg et al., 1996). Immunreaktionen gegen lebende,

agile Mikrofilarien treten in histologischen Hautbiopsien von Patienten mit

Mikrofilardermie meist nur nach mikrofilarizider Medikation auf (Darge et al., 1991).

Neben eosinophilen Granulozyten und Makrophagen wird die Beteiligung von

neutrophilen Granulozyten an der zellulären Immunantwort auf Mikrofilarien in der

Haut beschrieben (Gutiérrez-Peña et al., 1996). Anhand der erhöhten Bluteosinophilie

und der steigenden Konzentration zirkulierender kationischer eosinophiler Proteine

(Tischendorf et al., 1996) kann die Beteiligung des Immunsystems am täglichen Umsatz

von Mikrofilarien gezeigt werden.

Bei Patienten mit gesicherter Sowda-Form zeigt sich im Gegensatz zur generalisierten

Form ein Untergang von Mikrofilarien auch ohne mikrofilarizide Medikation (Büttner

& Rácz, 1983). Sowda-Patienten haben eine verminderte Parasitenlast sowie wenige

große Onchozerkome mit einem charakteristischerweise massiven inflammatorischen

Infiltrat von Lymphozyten, Mastzellen, eosinophilen Granulozyten, neutrophilen

Granulozyten und Makrophagen (Korten et al., 1998). Ein ähnliches Muster zeigt sich

auch in den vergrößerten Lymphknoten. Eosinophile Granulozyten, neutrophile

Granulozyten und Makrophagen besitzen die Fähigkeit, Mikrofilarien abzutöten

(Büttner & Rácz, 1983; Korten et al., 1998).

Bei der Sowda-Form, im Gegensatz zur generalisierten Form, kommt es zum Untergang

von Mikrofilarien in vivo durch das Zusammenspiel von aktivierten inflammatorischen

Zellen. Bei der generalisierten Form ist die Immunantwort supprimiert. T-Zellen und

Antigen-präsentierende Zellen spielen offensichtlich eine wichtige Rolle in der

Wegweisung der Immunantwort.

Einleitung

14

Verschiedene In-vitro-Studien bestätigen das Vermögen eosinophiler und neutrophiler

Granulozyten, Mikrofilarien und L3 zu bekämpfen (Greene et al., 1981; Johnson et al.,

1994). Während eosinophile Granulozyten nach Aktivierung L3 direkt immobilisieren,

werden zur Adhärenzreaktion an Mikrofilarien spezifische Antikörper zur Opsonierung

benötigt. Nach der Häutung von L3 werden die L4-Stadien nicht mehr attackiert

(Brattig et al., 1991). Im Tiermodell führen antikörperabhängige eosinophile

Granulozyten kurz nach ihrem Eindringen in den Wirt zur Zerstörung von L3. Das

Vorhandensein von Antikörpern und Effektorzellen scheint essentiell für die

Immunantwort zu sein. Die Abhängigkeit von Interleukin-4 (IL-4) und IL-5

kennzeichnet diese Reaktion als T-Helfer2-Antwort (Th2-Antwort). Unter Berück-

sichtigung der vorherrschenden T-Helferzellen bei der Regulation der Immunantwort

gegen Mikrofilarien und L3 zeigte sich ein Unterschied bei putativ Immunen (PI),

Patienten mit Sowda und Patienten mit generalisierter Onchozerkose. Bei der

generalisierten Form dominierte eine Th2-Antwort. Einzelne Berichte beschrieben eine

Th1-Antwort für putativ Immune (PI; Elson et al., 1995). Die Mehrzahl der

Publikationen beschreibt jedoch für PI oder endemisch unauffällige Personen eine

gemischte Th1/Th2- Antwort (Soboslay et al., 1997; Brattig et al., 1997; Doetze et al.,

1997; Turaga et al., 2000). Interferon-γ (IFN-γ) und IL-5 sind die bei PI am häufigsten

gefundenen Zytokine.

Im Vergleich zu Patienten mit der Sowda-Form und putativ immunen Personen

zeichnen sich Patienten mit einer generalisierten Onchozerkose, besonders bei Patienten

mit hoher Parasitenlast, durch einen Status der Suppression des Immunsystems aus

(Cooper et al., 1998). Bei Patienten mit generalisierter Form wurde, im Gegensatz zu

Patienten mit Sowda und putativ immunen Personen, eine geringe Proliferation

peripherer mononukleärer Blutzellen als Antwort auf Onchocerca-volvulus-Extrakt

(OvE) beobachtet (Steel & Nutman, 1993; Elson et al., 1995; Soboslay et al., 1997;

Doetze et al., 2000).

7.2 Humorale Abwehrmechanismen

Die Aufgabe der humoralen Abwehr ist die Neutralisierung und Eliminierung

körperfremder Antigene und Pathogene. Bei der Aktivierung der B-Zellen zu

Einleitung

15

Plasmazellen spielen Th2-Zellen eine entscheidende Rolle. Die Antigenbindungsstellen

bestimmen die Spezifität der Antikörper. Die Isotypen der konstanten Domäne der

schweren Ketten bestimmen hingegen die Wirkungsfunktion. Zunächst werden IgM und

IgD, gefolgt von IgG und IgE exprimiert. Bereits einen Monat nach Infektion mit

O. volvulus können Immunglobuline nachgewiesen werden (Taylor, 1994). Isotypen

von IgG weisen Unterschiede in ihrer funktionellen Eigenschaft auf. IgG1 und IgG3

können die Komplementkaskade aktivieren und reagieren nach Bindung des

spezifischen Antigens mit Fc-Rezeptoren auf der Effektorzelle der antikörper-

abhängigen zellulären Zytotoxizität (Van de Winkel & Capel, 1993). Komplement-

proteine (C3b) spielen eine wichtige Rolle bei der Adhäsionsreaktion von eosinophilen

und neutrophilen Granulozyten (Medina de la Garza et al., 1990; Brattig et al., 1991).

IgG4 kann weder Komplement aktivieren noch vermag es Fc-Rezeptoren von

Effektorzellen nach Bindung von Antigendeterminanten zu aktivieren.

Die Konzentration der Fc-Rezeptor- und Komplement-bindenden IgG3 sind bei putativ

immunen Personen in einer höheren Konzentration nachweisbar als bei Patienten mit

der generalisierten Form der Onchozerkose (Boyer et al., 1991). Patienten mit

generalisierter Onchozerkose bilden hingegen charakteristischerweise in hoher

Konzentration IgG4, die mit Hilfe von Extrakt der Onchocerca-volvulus-Würmer (OvE)

nachgewiesen wurden (Bradley & Unnasch, 1996). Patienten mit hoher Mikrofilarien-

dichte zeigen hohe IgG4-Titer, die mit einer supprimierten T-Zellantwort korrelieren

(Maizels et al., 1995). Die Bildung von IgG4 wird durch IL-4 induziert, das von

Th2-Zellen sezerniert wird (Wierenga et al. 1990). Im Gegensatz zu putativ immunen

Patienten mit einer gemischten Th1/Th2-Antwort wurde eine stark ausgeprägte

Th2-Antwort gegen OvE in Sowda-Patienten beobachtet (Brattig et al., 1997; Turaga et

al., 2000). Sowda-Patienten produzieren hohe Konzentrationen von IgG1, IgG3 (Brattig

et al, 1994) und IgE (Mpagi et al., 2000) gegen Onchocerca-volvulus-Antigene. Die

IgG3-Antwort gegen OvE korrelierte negativ mit der Mikrofilariendichte (Dafa’alla et

al., 1992). Es wird angenommen, daß eine Th2-vermittelte, Antikörper- und

Granulozyten-abhängige Immunantwort zur Zerstörung von Mikrofilarien, aber auch

zur Inflammation der Haut wie bei der Sowda-Form führt.

Einleitung

16

7.3 Klassische und alternativ aktivierte Makrophagen

Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DZ) haben den ersten Kontakt mit

Parasiten und reagieren daraufhin mit generischen Reaktionen, wie z.B. Zytokin-

freisetzung und Antigenpräsentation, mit denen eine T-Zellantwort eingeleitet wird

(Reis e Sousa, 2001). Die klassische Aktivierung von Makrophagen wird durch

Interferon-γ (IFN-γ) induziert, welches getriggert durch mikrobiologische Substanzen

wie Lipopolysaccharid zu einer Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie

Interleukin-6, Tumor-Nekrose-Faktor und IL-1 sowie Stickoxid (NO) führt. Neben

klassisch aktivierten, Immunantwort-stimulierenden DZ ist auch seit einigen Jahren

bekannt, daß die Immunantwort supprimierende Zellen bei chronisch infizierten

Menschen (Piessens et al., 1980) und Tieren (Lammie & Katz, 1983) aufweist. Spätere

Studien zeigten die Rolle von IL-10, das bei der Suppression der Immunreaktion von

Makrophagen freigesetzt wird (Allen & Loke, 2001). Akzessorische Zellen, wie

Makrophagen, die keine Antigen-spezifischen Rezeptoren exprimieren, üben eine

immunmodulierende Wirkung auf die Antigen-spezifische Immunantwort von

Lymphozyten aus. Durch Nematoden aktivierte Makrophagen sind größer, haben mehr

Vakuolen und ein anderes Profil exprimierter Gene als klassische Makrophagen

(Maizles & Yazdanbakhsh, 2003). An Stelle der Produktion von inflammatorischem

NO wird in diesen Zellen die Expression von Arginase (die mit dem Substrat der

Stickstoffoxidsynthase konkurriert) hochreguliert.

Eine alternative Aktivierung von Monozyten/Makrophagen (aaM) wird im Gegensatz

zur klassischen Aktivierung durch antiinflammatorische Substanzen wie IL-4 (Stein et

al., 1992; Schebesch et al., 1997), Glukokortikoide, wie Dexamethason (Kodelja et al.,

1994; Djemadji-Oudjiel et al., 1996; Sorg et al., 2000), IL-10 (Zlotnik & Moore, 1992;

Kodelja et al., 1998; Williams et al., 2002), IL-13 (Gordon, 2003) und TGF-ß (Takeuchi

et al., 1997) ausgelöst. AaM sezernieren funktionell relevante Moleküle und

exprimieren Rezeptoren mit Spezifität für Pathogen-assoziierte molekulare Muster

(PAMP). Diese Muster werden dem angeborenen Immunsystem zugerechnet (Gordon

2003).

Der cysteinreiche Scavenger-Rezeptor Typ1 CD163 (Djemadji-Oudjiel et al., 1996;

Kodelja et al., 1997; Högger et al., 1998; Droste et al., 1999), der ß-Glukan-Rezeptor

Einleitung

17

(Mosser & Handman, 1992) sowie der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (Stein et al.,

1992; Kodelja et al., 1997) werden bei diesen Makrophagen vermehrt exprimiert und

sind Marker für aaM.

CD163 ist ein membranständiger Rezeptor von aaM, der auch in löslicher Form

vorkommen kann (Droste et al., 1999). IL-6, Glukokortikoide wie Dexamethason und

antiinflammatorisches IL-10 induzieren die Expression von CD163 auf Monozyten/

Makrophagen. Herunterreguliert wird der Rezeptor von proinflammatorischen

Mediatoren wie LPS, IFN-γ und TNF-α (Högger et al., 1998; Büchler et al., 2000). Der

cysteinreiche Scavenger-Rezeptor CD163 besteht aus einem aminoterminalen

Signalelement, einer transmembranen Domäne von 24 Aminosäuren und neun kurzen,

zytoplasmatischen Domänen (Van den Heuvel et al., 1999; Møller et al., 2002). CD163

ist beteiligt bei der Adhäsion des Monozyten an Endothelzellen (Wenzel & Sorg, 1996;

Van den Heuvel et al., 1999) sowie bei der Kalzium-Mobilisation, der Inositol-

triphosphatproduktion und Sekretion von IL-6 und GM-CSF (Van den Heuvel et al.,

1999). CD163 wirkt als Schlüsselmolekül, wie das Plasmaprotein Haptoglobin bei der

Clearance und Wiederverwertung von Hämoglobin zerstörter Erythrozyten. An CD163

gebundenes Haptoglobin und Hämoglobin wird vom Makrophagen endozytiert (Madsen

et al., 2001). Die Rezeptor-Ligand-Interaktion ist kalziumabhängig und weist eine hohe

Affinität auf (Kristiansen et al., 2001). CD163 ist am stärksten auf Makrophagen und

nur zu 50% auf den peripheren Blutmonozyten exprimiert (Sulahian et al., 2000).

Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) gehört zu der Gruppe der c-Typ-Lectine

und dient der Erkennung, Bindung und Phagozytose von einfachen exprimierten

Zuckern von Pathogenen (Lipoglykane und Glykoproteine) (Stein et al., 1992). MMR

bestehen aus fünf Domänen. Eine lektinreiche Domäne, die aus 8-10 Kohlenhydrat-

bindenden Regionen besteht, ist für die Erkennung von Mannose und Fruktose

verantwortlich (Stahl et al., 1998; Napper et al., 2001). MHC Klasse II-Moleküle

werden zusammen mit dem MMR durch Stimulation des Makrophagen mit IL-4

heraufreguliert (Stein et al., 1992; Kodelja et al., 1997). Die Erhöhung der Expression

beider Rezeptoren führt zu einer Verbesserung der Antigenpräsentation. Weitere

Mediatoren und Induktoren von aaM sind in der Diskussion dargestellt (Tabelle 2).

Einleitung

18

Zur Identifizierung von aaM in vitro können monoklonale Antikörper, z.B. gegen

CD163 oder MMR eingesetzt werden. Es zeigte sich ein gehäuftes Vorkommen von

aaM in der Plazenta (Mues et al., 1989) und Lunge (Fireman et al., 1988), während der

Heilphase akuter Entzündungen, bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie

Psoriasis und rheumatischem Fieber, in Wundheilungsgewebe (Schebesch et al., 1997)

und in Fremdkörpergranulomen (Goerdt & Kodelja, 1994). Es wird angenommen, daß

aaM eine systemische Gegenregulation zu inflammatorischen Prozessen darstellt. So

scheint bei einer Sepsis die massive Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine

(IL-1 und TNF-α) durch Freisetzung von Glukokortikoiden, welche zu einer

alternativen Aktivierung von Makrophagen führt, unter Kontrolle gebracht zu werden

(Wilckens & de Rijk, 1997).

19

Material und Methodik

1. Reagenzien

Medien und Zusätze:

HEPES Sigma-Aldrich Company, Deisenhofen

RPMI 1640 Sigma

Ficoll-Hypaque ICN Biomedicals Inc. Ohio, USA

Percoll Pharmacia Biotech, Amsterdam,

Niederlande

Penicillin 100 IU/ml

und Streptomycin 100µg/ml GIBCO/BRL, Karlsruhe

Fetales Kälberserum Biochrom KG, Berlin

Plasmasteril Fresenius Kabi Deutschland GmbH

PBS Sigma

Humanes Serum AB-Serum, Universitätsklinikum Eppendorf,

Hamburg

Polymyxin Sigma

Stimulanzien:

Interleukin-4 Biomol, Hamburg,

Interleukin-10 R&D Systems, Wiesbaden

GM-CSF Borstel, Hamburg

LPS von E. coli Sigma

PGE2 Cayman, Ann Arbor, USA

Dexamethason und Ekdyson Sigma


20

Parasitenextrakte und -proteine:

Onchocerca volvulus-Extrakt (OvE) BNI, Hamburg

Onchocerca ochengi-Extrakt (OoE) BNI, Hamburg

Aspartylproteaseinhibitor (Ov33) Dr. R. Lucius, Humboldt Universität, Berlin

Onchocystatin (Ov17) Dr. R. Lucius

Ov17-Fragment (Ovv17) Dr. R. Lucius

O. volvulus-Extrakt von Patienten mit

Doxycyclinbehandlung vor Nodulektomie Drs. A. Hoerauf & D. W. Büttner, BNI

OvE-Lipid Dr. D. Steinhart, BNI

Wolbachienoberflächenproteine (WSP) Dr. C. Bandi, Istituto di Patologia

aus Dirofilaria immitis Generale Veterinaria, Mailand, Italien

Fragment V1 und V3 des Wolbachien- Dr. G. Tzertzinis, New England Bioleps,

oberflächenproteins aus Brugia malayi Beverly, USA

Monoklonale Antikörper:

Anti-CD163-Antikörper und RM 3/1 BMA Biomedicals AG, Augst, Schweiz

Anti-Makrophagen-Mannose-Rezeptor Becton Dickinson PharMingen, USA

Anti-Human-IL-10-Antikörper Becton Dickinson PharMingen,

Anti-CD14-Antikörper Cymbus Biotechnology, Hants, UK

Antikörper-Enzym-Konjungate:

Biotinylierter Ratten-Antikörper gegen humanes IL-10, konjungiert mit Avidin-

Meerrettichperoxidase (Becton Dickinson PharMingen)


21

Weitere Reagenzien:

Essigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland

Salzsäure Merck

Tween20 Sigma

Substrat für ELISA, Reagenz A und B Becton Dickinson PharMingen

0,1 M Carbonat, pH 9,5 Merck

Plastik- und Glaswaren:

Koagulationsröhrchen Monovette, Sarstedt, Nümbrecht, D

Serumröhrchen Monovette, Sarstedt

Heparinröhrchen Monovette, Sarstedt

Einwegpipetten Monovette, Sarstedt

FACS-Röhrchen Becton Dickinson, Mountain View, USA

Mikrotiterplatten Nunclon, Dänemark

96-Napf Polystyrol-Flachboden-

Mikrotiterplatte Maxi-Sorp, NUNC, Wiesbaden

Einwegpipetten Greiner Labortechnik, Frickenhausen

Kanülen Becton Dickinson, Dublin, Irland

Kryotube NUNC, Wiesbaden

Pipettenspitzen Sarstedt

Spritzen Sarstedt

Sterilfilter 0,2µm Schleicher & Schuell, Dassel

50ml, 14ml, 1ml Reagenzröhrchen Falcon, N.J., USA


22

Laborgeräte und Software:

Brutschrank Inkubator IG 150, Jouan

FACscan Flow Cytometer (Durchflußzytometer) Becton Dickson, Mountain View

CellQuest (V3.3) FACS-Software Becton Dickson

Glashomogenisator Ten Broek-Homogenisator

Mikroskop HBO 50 Zeiss

ph-Meter CG 840 Schott

Plattenphotometer Dynatech MR 5000, Denkendorf

Pipette Eppendorf, Hamburg

Schüttler MTS 2 Janke & Kunkel

StatView SAS Institute Inc.,

www.statview.com

Sterile Arbeitsbank NUNC, Wiesbaden

Zentrifugen Hettich, Rotanta/RP & Eppendorf


23

2. Gewinnung von Onchocerca-volvulus-Extrakt

2.1 Materialgewinnung

Die Onchozerkomata wurden in Benin in der Feldforschungsstation Covè des Bernhard-

Nocht-Instituts für Tropenmedizin operativ entfernt. Die Patienten wurden vor Nodul-

ektomie in ihrer Sprache über den Verbleib der Knoten informiert.

2.2 Nodulektomie und Isolierung von adulten Onchocerca volvulus

Onchozerkomata wurden chirurgisch entfernt und die Würmer durch Kollagenaselösung

nach der Methode von Schulz-Key et al. 1977 bei 35°C auf dem Schüttler zur

Verdauung der Bindegewebskapsel inkubiert. Je nach Knotendurchmesser wurde bei

<1,5 cm großen Knoten 0,5%-ige, bei Knoten mit einem Durchmesser von >1,5 cm

1%-ige Kollagenaselösung verwendet. Aus kleineren Knoten wurden Würmer nach

achtstündiger Inkubation, bei größeren erst nach 12-20 h vorsichtig durch Wegspülen

der Knotenreste unter dem Stereomikroskop isoliert.

Die Würmer wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und in Stickstoffcontainern direkt

nach Hamburg in das Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin transportiert.

2.3 Extraktherstellung

40 Weibchen wurden einzeln unter der Sterilbank jeweils vier Stunden in sterilem PBS

gewaschen, um die noch übriggebliebene Kollagenase zu entfernen. Nach dem

Waschen wurden die Weibchen auf ein steriles Filterpapier gelegt, um abtropfende PBS

zu minimieren. Danach wurden die Weibchen in einem mit Stickstoff gekühlten Mörser

unter wiederholter Zugabe von flüssigem Stickstoff zerrieben und anschließend als

Pulver in 2 ml PBS gelöst.


24

Nach 30 Minuten Kühlung und Überführung in ein gekühltes, 4,5 ml fassendes

Kryotube wurde das Tube 10-mal mit Ultraschall jeweils mit einer Minute Pause

behandelt. Die Suspension wurde 3-mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und wieder

aufgetaut.

Schließlich wurde die Wurmsuspension für eine Stunde bei 4°C mit 100 000 x g in der

Ultrazentrifuge zentrifugiert und der Überstand entnommen, die Proteinkonzentration

nach Bradford bestimmt und der Extrakt bei einer Konzentration von 1 mg/ml bei minus

30°C in Portionen eingelagert. Der Extrakt wurde auf einer Blutagarplatte auf Sterilität

geprüft.

3. Gewinnung humaner mononukleärer Zellen

3.1 Probanden

Das Blut von gesunden Probanden zwischen 23 und 40 Jahren wurde zur Blutkultur

verwendet.

3.2 Blutabnahme

Dem Probanden wurden 30 bis 40 ml Blut in „Coagulation-9NC-Röhrchen“ sowie

10 ml Blut in Serumröhrchen abgenommen. Das nicht koagulierte Blut wurde unter der

Sterilbank in zwei 50 ml fassende Tubes unter sterilen Bedingungen überführt und

1:2 mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt.

3.3 Erythrozytensediment und Gewinnung mononukleärer Zellen

Das verdünnte Blut wurde unter der Sterilbank vorsichtig auf 15 ml einer 58%-igen

sterilen Percoll-Suspension in PBS geschichtet und in einer Zentrifuge (Rotanta/RP,


25

Hettich) bei 600 x g und bei 4°C für 20 bis 30 Minuten ohne Bremse auslaufend in drei

Phasen aufgetrennt. Die obere Phase enthält das Plasma, oberhalb der mittleren Phase

(Percoll) liegen die mononukleären Zellen. Diese wurden mittels einer Einwegpipette

aus Plastik in ein 50 ml fassendes Tube gegeben. Die untere Phase stellt die Fraktion

der Erythrozyten dar und konnte verworfen werden.

RPMI 1640 wurde unter sterilen Bedingungen mit Penicillin 100 IU/ml und

Streptomycin 100 µg/ml sowie 5%-igem autologen humanen Serum versehen. Das Tube

mit den vom Percollgradienten abpipettierten Zellen wurde mit diesem Kulturmedium

bei 400 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur in der Laborzentrifuge gewaschen,

das Sediment in ein 12 ml fassendes Tube unter der Sterilbank überführt und mit

Kulturmedium auf 10 ml aufgefüllt. Die Zellen wurden ein weiteres Mal bei 400 x g für

zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, das Sediment steril mit zwei Milliliter

Kulturmedium resuspendiert und auf Eis gelagert.

In den ersten Versuchen wurden die Zellen mit Hilfe eines Ficollgradienten aufgetrennt.

Unter diesen Bedingungen setzten die isolierten, unstimulierten Zellen verstärkt

Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1-RA) frei. Ficoll wurde auf Grund dessen

nicht weiter zum Auftrennen der Zellen verwendet.

Beim Ficollgradienten wurde das Blut 1:2 in zwei 50 ml fassenden Tubes unter der

Sterilbank mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt. Es wurden 15 ml Ficoll in ein

50 ml fassendes Tube gefüllt und das verdünnte Blut unter der Sterilbank vorsichtig auf

das Ficoll pipettiert. Der Gradient wurde bei 600 x g und 20°C für 20 bis 30 Minuten in

der Laborzentrifuge (Rotanda/RP, Hettich) ungebremst auslaufend zentrifugiert. Die

mononukleären Zellen oberhalb der Ficollphase wurden mit einer Einwegpipette unter

sterilen Bedingungen abgesaugt, mit Kulturmedium (RPMI 1640) verdünnt, bei 400 x g

für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und auf Eis gelagert. 20 µl der Zell-

suspension wurden mit 3%-iger Essigsäure in einer Neubauer-Zählkammer (Boxer)

gezählt.


26

4. Monozytenreinkultur

Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) wurden im Forschungszentrum Borstel (AG

Dr. M. Ernst) aus heparinisiertem Vollblut gesunder Blutspender mittels Ficoll

(1,077 g/ml, Pharmacia, Freiburg) und Dichtegradientenzentrifugation (465 x g,

45 Min., 22°C) isoliert (Grage-Griebenow et al., 1993). Die mononukleären Zellen

wurden über der Ficollphase abgenommen, in HBSS (Biochrom) (465 x g, 15 Min.,

4°C) gewaschen und ein zweites Mal in HBSS mit fetalen Kälberserum (FCS, 298 x g,

15 Min., 4°C) zentrifugiert, um die Zellfragmente von intakten Zellen zu trennen.

PBMC wurden in Monozyten und Lymphozyten unter Verwendung des LE-6B-

Elutriationssystems (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA, USA) durch

Gegenstromzentrifugation getrennt. Maximal 2 Millionen Zellen/ml wurden in HBSS

mit 0,1% BSA verdünnt und in einer standardisierten Kammer bei initialer

Durchflußrate von 25 ml/Min., 1720 x g und 12°C zentrifugiert. Im Anschluß daran

wurde die Durchflußrate schrittweise gesenkt, um elutriierte Lymphozyten- und

Monozytenfraktionen zu erhalten.

Die isolierten Monozyten wurden innerhalb von drei Stunden kultiviert. Als

Kulturmedium wurde FCS oder humanes AB-Serum verwendet.

5. Zellkultur

Die Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte im Kulturmedium mit Antibiotika und 5%

FCS (reine Monozyten) oder mit autologem Serum (mononukleäre Zellen) kultiviert. Zu

den Zellen wurde GM-CSF in einer finalen Konzentration von 1000 U/ml (Van den

Heuvel et al., 1999) hinzugefügt. Pro Kavität wurden anfangs 0,6 Millionen

mononukleäre Zellen, später die gleiche Anzahl gereinigter Monozyten in 100 µl

verwandt.

Zu Optimierung der Kultivierungsbedingungen wurden Petrischalen mit hydrophober

Bodenfolie „PetriPerm“ (Vivascience, Göttingen) getestet (Buechler et al., 2000). Sie

ergaben in den Versuchen jedoch keine Verbesserung. Es wurden der jeweilige


27

Stimulus unter der Sterilbank und anschließend 0,6 Millionen Zellen pro Ansatz steril in

das Mikrotiterloch pipettiert. Diese Zellen wurden bei 37°C und einem Luftanteil im

Brutschrank von 5% Kohlendioxyd für einen Zeitraum von ein bis sechs Tagen

inkubiert (Van den Heuvel et al., 1999).

In den meisten Fällen wurden die Kulturen nach drei oder sechs Tagen beendet, die

Mikrotiterplatte mit den Zellen auf Eis gelagert und durch Zentrifugation bei 400 x g für

10 Minuten der Überstand von den zellulären Bestandteilen getrennt. Der Überstand

wurde bei minus 28°C eingefroren, um später für den ELISA zur Verfügung zu stehen.

Sofern die Zellen nicht anschließend im Durchflußzytometer zur Rezeptorbestimmung

verwendet wurden, erfolgte eine Fixierung mit 8% Paraformaldehyd.

Anfangs wurde mit mononuklearen Zellen gesunder Spender gearbeitet, mit denen

Testdurchläufe der verschiedenen Stimuli durchgeführt wurden. Im Anschluß an die

Testdurchläufe und bei Stimuli, wie z. B. Wolbachienproteine, wurden gereinigte

Monozyten aus dem Forschungszentrum Borstel verwendet.

6. Vollblutkultur

Zu 10 ml Heparinblut wurden 90 ml Iscove Medium mit 50 IU/ml Na-Heparin und

0,1% Humanserum unter der Sterilbank hinzugegeben. Anschließend wurden je 200 µl

in eine Mikrotiterplatte pipettiert und mit den jeweiligen Stimulanzien versehen. Die

Kultur wurde drei und sechs Tage im Brutschrank bei 37°C mit 5% Kohlendioxydanteil

der Luft und gesättigter Raumfeuchtigkeit inkubiert. Um grobe bakterielle Verunrei-

nigungen auszuschließen, wurde die Titerplatte mikroskopiert. Nach dem Zentrifugieren

der Zellen wurde der Überstand abgenommen und bei minus 28°C eingefroren. Die

Zellen wurden 15 Minuten im Dunkeln und bei 4°C mit 10 µl des Antikörpers inkubiert,

danach wurde 0,5 ml FACS Lyselösung (1:10) zugegeben, die Erythrozyten im Dunkeln

15 Minuten lysiert und anschließend im Durchflußzytometer gemessen.


28

7. Durchflußzytometrie

Das Durchflußzytometer mißt die Intensität der Fluoreszenz, die von einer Zelle mit

Fluorescein-markierten Antikörpern ausgeht. Die Intensität reflektiert die Expression

des getesteten Rezeptors.

Nach dem Waschen in PBS mit anschließendem Abzentrifugieren wurden die Zellen in

ein 5 ml fassendes Reagenzröhrchen überführt und mit dem jeweiligen Antikörper

inkubiert. Pro Ansatz wurden folgende mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und

R-Phycoerythrin (R-PE) markierte Antikörper (10 µl pro Ansatz) verwendet:

(1) FITC-markierte Antikörper gegen CD14 und CD163 sowie Kontroll-FITC-

Reagenz

(2) R-PE-markierte Antikörper gegen CD163, RM3/1 und Makrophagen-Mannose-

Rezeptor sowie Kontroll-PE-Reagenz.

Inkubiert wurde auf dem Schüttler über 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank. Die

ungebundenen Antikörper wurden danach ausgewaschen und der Überstand nach

Zentrifugieren (400 x g / 10 Minuten) verworfen. Das Pellet wurde aufgeschüttelt und

die Intensität der Fluoreszenz je Zelle mit dem Durchflußzytometer (FACS:

Fluorescence Activated Cell Sorter) gemessen. Die Zellen wurden zuvor auf eine

Konzentration von ca. 0,1 Millionen Zellen pro ml gebracht.

Bei der Messung im FACS werden die Zellen über ein Schlauchsystem durch einen

Meßkopf (Abb. 6) gedrückt, der eine enge Kapillare (zwischen 50 und 100 µm) besitzt.

Der laminare Flüssigkeitsstrom ermöglicht nur jeweils einer einzelnen Zelle die Passage

der Öffnung. Etwa in die Mitte dieses Flußkanals wird ein Laserstrahl fokussiert, der

auf die vorbeifließenden Zellen trifft. Er wird durch die Zellen kleinwinklig oder

großwinklig abgelenkt. Dabei werden durch den Laserstrahl Fluoreszenz- oder

Lumineszenzerscheinungen aktiviert.


29

Abbildung 6: Durchflußzytometer (FACS)


30

Verarbeitet werden die Ablenkungen des Laserstrahls durch einen nachgeschalteten

Digital-Analogwandler zusammen mit einem Computer, der mit der dafür notwendigen

Software (ZellQuest) ausgestattet ist. So können die Größe, das Volumen und die

Struktur der Zellen sowie Oberflächenbindungen wie Rezeptorbindungen mit

fluoreszierenden Antikörpern gemessen werden. Die Daten werden im Computer

aufgearbeitet und können auf dem Bildschirm in unterschiedlicher Darstellung,

beispielsweise als Histogramm oder als „Dot Blot“ dargestellt und gespeichert werden.

Hierbei wird der quantitative Anteil eines Parameters in Relation zur Stärke des Signals

dargestellt. Weiter können diese Histogramme untereinander zu sogenannten

Zytogrammen kombiniert werden, wobei die unterschiedlichsten Parameter miteinander

kombiniert werden können.

Durch das Ausblenden mittels „Gaten“, d.h. isoliertes Betrachten der Monozyten/

Makrophagen- und Granulozytenpopulation im Zytogramm wurden Zelltrümmer

weitgehend bei der Messung ausgegrenzt. Somit konnte die Rezeptorexpression auf

unzerstörten Zellen genauer ermittelt und Störeffekte beseitigt werden. Die Granularität

der Zellen wird durch den Sideward-Scatter und die Größe der Zellen mit dem Forward-

Scatter dargestellt, die in einem „Dot Blot“ zur Beurteilung der Zellen dienen. Das

Ergebnis wurde jeweils mit dem unstimulierten Wert, einer Positivkontrolle und einer

Negativkontrolle, betrachtet.

8. ELISA

Immunchemisch wurde IL-10 in Zellkulturüberständen mit Hilfe der semiquantitativen

ELISA-Technik („enzyme linked immunosorbent assay“, Abb. 7) nachgewiesen. Bei

diesem Verfahren wird in der Probe vorhandenes Interleukin durch spezifische

Antikörper („coating antibody“) an die Wand einer 96-Well-Flachboden-Mikrotiter-

platte gebunden (1). Über einen biotinylierten Ratten-Antikörper gegen andere Epitope

des humanen IL-10 wird die IL-10-Konzentration semiquantitativ durch die Absorption

im Plattenphotometer (Dynatech MR 5000, Denkendorf) gemessen. Der biotinylierte

Ratten-Antikörper wird mit Avidin-Meerrettichperoxidase kombiniert (2), um nach


31

Abbildung 7: ELISA-Technik („enzyme linked immunosorbent assay“)

Inkubation und Waschen das Substrat hinzuzugeben (3). Das Enzym des Konjungates

führt mit dem Substrat zu einer meßbaren Farbstoffreaktion (4).


32

Zur Konzentrationsbestimmung der Probe wurden IL-10-Eichkurven verwendet. Als

Positivkontrolle wurde eine Probe einer über drei Tage stimulierten Kultur mit 1 ng/ml

LPS verwendet. Es wurden 10 µl, 50 µl und 75 µl der Probe pro 100 µl Kavität

eingesetzt und Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Beschichtung der Mikrotiter-

platten erfolgte jeweils am Vortag des Testes. Der monoklonale Anti-Human-IL-10-

Antikörper der Ratte wurde in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,5 verdünnt. Je Kavität

wurden 100 µl in die Mikrotiterplatte pipettiert und über Nacht inkubiert. Nach

anschließendem dreimaligen Waschen mit PBS/Tween (0,05% Tween-20 in PBS)

wurden mit 200 µl 10% FCS in PBS pro Kavität freie Bindungsstellen geblockt und

über eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Proben- bzw. Antigenzugabe (1) erfolgt nach weiterem dreimaligen Waschen mit

200 µl PBS/Tween pro Kavität. Anschließend wurde die absteigende Verdünnungsreihe

des Standards pipettiert. Zwei Kavitäten dienten als Leerkontrolle für das Substrat. Von

den Proben wurden jeweils 50 µl und 10 µl verwendet. Die Proben inkubierten zwei

Stunden bei Raumtemperatur, bevor die Platte wieder mit 200 µl PBS/Tween pro

Kavität dreimal gewaschen wurde.

Als Konjugat wurden pro Kavität 100 µl Lösung verwendet. Das Konjugat setzt sich

zusammen aus biotinyliertem Ratten-Antikörper gegen humanes IL-10 gebunden an

Avidin-Meerrettichperoxidase als Enzym in 10% FCS in PBS im Verhältnis von 1:250.

Nach einer weiteren Stunde Inkubation wurde die Mikrotiterplatte siebenmal mit je

200 µl PBS/Tween gewaschen. Nach dem Waschen wurden pro Kavität 100 µl Substrat

eingesetzt. Die nach ca. 10 Minuten einsetzende Enzymreaktion, erkennbar an der

Blaufärbung, wurde mit je 50 µl 1M Salzsäure gestoppt. Es trat eine sichtbare

Farbreaktion von blau zu gelb ein. Innerhalb von 10 Minuten nach der Säurezugabe

wurde die Extinktion des Produkts bei 450 nm und der Referenzwellenlänge von

570 nm gemessen. Mit Hilfe der Referenzansätze von Interleukin-10 wurde aus den

Extinktionswerten die jeweilige Konzentration bestimmt. Je Probe und Konzentration

wurden Doppelbestimmungen durchgeführt, deren Mittelwert verwendet wurde.

Mittelwerte verschiedener Versuchsreihen mit gleichen Ansätzen wurden berechnet und

als Durchschnittswert angegeben.


33

9. Auswertung und kommerzielle Computersoftware

Die Mittelwerte der verschiedenen Versuchsreihen wurden tabellarisch nach

Kulturdauer und Zellart aufgelistet. Zur Auswertung und Berechnung der Daten wurde

das Programm STAT View (Abacus Concepts, USA) und als Werte die Mittelwerte des

jeweiligen Stimulus verwendet. Die Darstellung erfolgte über Box Plot mit

Standardabweichung sowie deskriptiver Statistik. Die Validität wurde mittels gepaarten

t-Tests überprüft. Ausgedruckte FACS-Histogramme die im FACS-Computer durch das

Programm CellQuest (USA) erstellt wurden, wurden wie Bilder mittels Scanner (Epson

Perfection 1260) als Dateien im Computer mit Photoshop 6.0 (USA) verarbeitet.

34

0

50

100

150

200

0 100 200 300 400

Dexamethason (ng/ml)

Rez

epto

rexp

ress

ion

(U)

Ergebnisse

1. Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 auf stimulierten Monozyten

1.1 Optimierung der Bedingungen der Expression von CD163 im

Durchflußzytometer

Eine Exposition von mononukleären Zellen mit Dexamethason führt zur signifikanten

Expression von CD163 auf der Zellmembran von Monozyten und diente in den

folgenden Versuchen als Positivkontrolle. Die optimale Dexamethasonkonzentration

wurde mit Hilfe von Verdünnungsreihen mit den Konzentrationen 10, 20, 40, 100, 200,

300 und 400 ng/ml ermittelt. Nach drei und sechs Tagen Kultur mit Dexamethason

wurde die Intensität der Rezeptorexpression auf Monozyten bestimmt (Van den Heuvel

et al., 1999). Die optimale Konzentration von Dexamethason liegt zwischen 40 und

200 ng/ml (Abb. 8; Van den Heuvel et al., 1999; Büchler et al., 2000). Für die

Konzentration 40 ng/ml war die Expression nach drei Tagen am stärksten (Abb. 9).

Abbildung 8: Dargestellt ist

die Dosiswirkungskurve der

Expression von CD163 nach

zwei Tagen Kultur von

mononukleären Zellen mit

dem Stimulus Dexametha-

son. Es wurde der Median

der CD163-Expression in

Abwesenheit von Dexa-

methason vom jeweiligen

Median nach Stimulation mit Dexamethason subtrahiert, so daß die induzierte

Expression abzüglich der konstitutiven Expression dargestellt wird.

Ergebnisse

35

Abbildung 9: Die Abbildungen präsentieren Boxplots mit Perzentilen (10, 25, 50, 75

und 90%) und Ausreißerwerten (o) der Medianwerte der FACS-Analyse der CD163-

Rezeptorexpression. Mononukleäre Zellkulturen wurden mit 40 ng/ml und 200 ng/ml

Dexamethason (Dex) über drei (linke Abbildung) und sechs Tage (rechte Abbildung)

stimuliert und im Vergleich zu unstimulierten Zellkulturen dargestellt. Links: t-Test: Dexamethason 40 P: 0,059; Dexamethason 200 P: 0,043; rechts: t-Test: Dexamethason 40

P: 0,232; Dexamethason 200 P: 0,025

In den Histogrammen der Abbildungen 10 und 11 sieht man eine Rechtsverlagerung des

Fluoreszenz-Peaks, d.h. die Zunahme der Fluoreszenz und somit der Rezeptorex-

pression nach Stimulation mit Dexamethason. Nach Stimulation mit 40 ng/ml und

200 ng/ml Dexamethason über drei Tage ist die Rezeptorexpression von CD163

annähernd gleich (Abb. 10).

Abbildung 10: Die mittels FACS bestimmte Rezeptorexpression von CD163 auf

Monozyten mononukleärer Zellkulturen nach drei Tagen Stimulation mit 40 ng/ml

Dexamethason (rote Fläche), 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) im Verhältnis zu

unstimulierten Zellen (schwarze Linie) ist in dieser Abbildung dargestellt. Versuchsnummern: Links 140400 404+405+403; Mitte 170400 504+505+503; rechts 140700

006+008+001

1

10

100

1000

0 40 200 Dexamethason (ng/ml)

Expression (U)

1

10

100

1000

0 40 200 Dexamethason (ng/ml)

Expression (U)

Ergebnisse

36

200 ng/ml Dexamethason über sechs Tage Kultur ergab die größte Rechtsverschiebung

der CD163-Expression auf Monozyten mononukleärer Zellkulturen (Abb. 11).

Abbildung 11: Die CD163-Expression von gereinigten Monozyten nach sechs Tagen

Stimulation mit 40 ng/ml (rote Fläche) und 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) sind

hier dargestellt. Das rechte Histogramm zeigt die Expression nach Stimulation mit

10 ng/ml LPS (rote Fläche) und 5 ng/ml IL-4 (grüne Linie) im Vergleich zu

unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: links 170400 204+205+203; Mitte

270400 106+107+103; rechts 190201 014+013+008

Dexamethason 200 ng/ml mit zusätzlich 5 ng/ml IL-10 oder IL-4 bzw. 5 ng/ml IL-4

zusammen mit IL-10 wurden in den Versuchen ebenso wie 5 ng/ml IL-4 (Abb. 11

rechts) getestet. Die mit den genannten Stimulanzien kultivierten Monozyten

exprimierten deutlich mehr CD163, als unstimuliert kultivierte Monozyten. Des

weiteren wurden 400 ng/ml Cortison mit 2,5 pg/ml IL-4 als Positivkontrolle erfolgreich

verwendet. Cortison mit IL-4 hatte jedoch keinen so starken Effekt auf die Rezeptor-

expression wie Dexamethason 40 oder 200 ng/ml (Abb. 12). Dexamethason ergab in

den Konzentrationen 40-200 ng/ml die besten Ergebnisse (Abb. 9) und wurde in diesen

Konzentrationen als Positivkontrolle verwendet.

Abbildung 12: Gereinigte

Monozyten wurden über

drei (linkes Histogramm)

bzw. sechs Tage (rechtes

Histogramm) mit 10 ng/ml

Lipopolysaccharid (LPS,

rote Fläche) oder 400 ng/ml Cortison mit 2,5 pg/ml IL-4 (grüne Linie) stimuliert und im

Vergleich mit unstimulierten Zellen (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: links 230201 008+007+001; rechts 190201 014+013+008

Ergebnisse

37

1.2 Expression des Scavenger-Rezeptors CD163 nach Stimulation mit

Lipopolysaccharid

Als Negativkontrolle wurde Lipopolysaccharid (LPS) in der Konzentration 1 und

10 ng/ml verwendet (Djemadji Ondjiel et al., 1996; Van den Heuvel, 1999; Büchler et

al., 2000). Lipopolysaccharid ergab in der Konzentration von 1 ng/ml nach drei Tagen

eine leichte und nach sechs Tagen keine signifikante CD163-Rezeptorexpressions-

erhöhung mehr (Abb. 13 und 14).

Abbildung 13: Dargestellt sind die Boxplots der CD163-Expression auf Monozyten der

mononukleären Zellfraktion nach dreitägiger (linke Abbildung) und sechstägiger

Stimulation (rechte Abbildung) mit LPS 1 ng/ml (LPS), Dexamethason 200 ng/ml

(Dex) und ohne Stimulus (Leerwert). Rechts: t-Test: LPS P: 0,875; Dex P: 0,043; links: t-Test: LPS P: 0,319; Dex P: 0,025

1

10

100

1000

Leerwert LPS Dex

Expression (U)

1

10

100

1000

Leerwert LPS Dex

Expression (U)

Ergebnisse

38

Abbildung 14: Keine erhöhte CD163-Expression auf Monozyten der mononukleäre

Zellfraktion zeigte sich nach dreitägiger (obere drei Histogramme) bzw. sechstägiger

(untere drei Histogramme) Stimulation mit 1 ng/ml LPS (rote Fläche) im Vergleich zu

unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 070400 213+203; oben Mitte 170400 511+503; oben rechts 140400

111+103; unten links 160300 062+058; unten Mitte 170400 211+203; unten rechts 050500 111+103

1.3 CD163-Expression nach Stimulation mit dem Steroid Ecdyson

Neben Dexamethason wurde geprüft, ob das Steroid Ecdyson zu einer vermehrten

CD163-Expression führt. Verwendet wurden die Konzentrationen 20 bis 400 ng/ml in

bis zu sieben Tage dauernden Kulturen. Nach Stimulation ergab sich jedoch nur eine

geringe CD163-Rezeptorexpressionserhöhung auf Monozyten der mononukleären

Zellfraktion. Die Stimulation mit 40 ng/ml bzw. 200 ng/ml Ecdyson in sechstägiger

Kultur zeigte im Durchschnitt die höchste Expression des CD163-Rezeptors auf den

Monozyten der mononukleären Zellkulturen (Abb. 15).

Ergebnisse

39

Abbildung 15: Medianwerte und Boxplots nach dreitägiger (links) und sechstägiger

Kultur (rechts) mononukleärer Zellen stimuliert mit Ecdyson (Ecd) Links: t-Test: Ecd 20 P: 0,719; Ecd 40 P: 0,338; Ecd 200 P: 0,374; rechts: t-Test: Ecd 20 P: 0,759;

Ecd 40 P: 0,285; Ecd 200 P: 0,206

Die Histogramme zeigen nach sechs Tagen Stimulation mit 200 ng/ml Ecdyson in

Einzelfällen eine geringfügige Expressionszunahme für CD163 auf Monozyten der

mononukleären Zellfraktion. Nach dreitägiger Kultur war keine signifikante Zunahme

erkennbar (Abb. 16). Dexamethason, das ein potenteres Glukokortikoid als Ecdyson ist,

ergab nach Stimulation mononukleärer Zellen eine erhöhte Expression des Rezeptors

CD163 auf Monozyten. Aufgrund der geringfügigen Erhöhung der CD163-Expression

(Abb. 16) nach drei und sechs Tagen Stimulation mononukleärer Zellen mit

verschiedenen Ecdysonkonzentrationen wurde Ecdyson nicht bei Versuchen mit

gereinigten Monozyten verwendet.

1

10

100

Expression (U)

Leer 20 40 200Ecdyson (ng/ml)

1

10

100

1000

0 20 40 200 Ecdyson (ng/ml)

Expression (U)

Ergebnisse

40

Abbildung 16: CD163-Rezeptorexpression auf Monozyten der mononukleären

Zellfraktion nach dreitägiger Stimulation (obere drei Histogramme) mit 200 ng/ml

Ecdyson (rote Fläche) im Vergleich zu 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie) und

unstimulierten Zellen (schwarze Linie)

Versuchsnummern: oben links 140400 109+105+103; oben Mitte 140400 409+405+403; oben rechts

240400 305+307+303; unten links 160300 035+027+025; unten Mitte 170400 209+205+203; unten

rechts 270400 105+107+103

1.4 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt

Onchocerca-volvulus-Extrakt stimulierte dosisabhängig die Expression von CD163 auf

Monozyten. Sie war am deutlichsten ausgeprägt bei den Konzentrationen 20 bis

50 µg/ml. Nach einer Kultivierungsdauer von drei und sechs Tagen ergab sich eine

erhöhte Expression des Rezeptors CD163 auf Monozyten der mononukleären

Zellfraktion sowie auf gereinigten Monozyten, die deutlich über dem Kontrollwert,

jedoch unter der Positivkontrolle (Dexamethason 40 ng/ml) lag (Abb. 17). Der

Mittelwert der Rezeptorexpression von CD163 auf Monozyten der mononukleären

Zellfraktion nach drei und sechs Tagen Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-volvulus-

Extrakt war rund viermal höher als der Mittelwert der Leerwerte (Abb. 17). Ebenso

Ergebnisse

41

1

10

100

1000

Leerwert OvE Dex

Expression (U)

1

10

100

1000

Leerwert OvE Dex

Expression (U)

1

10

100

Leerwert OvE

Expression (U)

zeigte sich nach Stimulation von reinen Monozyten mit 20-30 µg/ml Onchocerca-

volvulus-Extrakt über drei Tage eine statistisch signifikante Erhöhung der CD163-

Expression um das Vierfache des Leerwertes, wobei sich nach sechstägiger Kultur nur

das Dreifache des Leerwertes darstellte (Abb. 17).

Abbildung 17: CD163-Expression auf Monozyten der mononukleären Zellfraktion

(obere Abbildung) nach Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE)

und auf gereinigter Monozyten nach Stimulation mit 20-30 µg/ml OvE (untere

Abbildung) über drei Tage (links) bzw. sechs Tage (rechts) im Vergleich zu

Medianwerten unstimulierter (Leerwert) und Medianwerten mit Dexamethason

40 ng/ml (Dex) stimulierter Zellen

Oben links: t-Test: OvE P: 0,569; Dex P: 0,087; oben rechts: t-Test: OvE P: 0,369; Dex P: 0,544; unten

links: t-Test: OvE P: 0,059; unten rechts: t-Test: OvE P: 0,193

1

10

100

Leerwert OvE

Expression (U)

Ergebnisse

42

In den Histogrammen erkennt man eine Rechtsverschiebung der Fluoreszenz, d. h. eine

Zunahme der Expression des CD163-Rezeptors auf den kultivierten Monozyten. Sie

war nach sechstägiger Kultur stärker ausgeprägt als nach drei Tagen Kultur (Abb. 18).

Des Weiteren kann man häufig eine Zweigipfligkeit nach Stimulation von Monozyten

mit OvE erkennen, die auf zwei Monozytenpopulationen, eine mit hoher und eine mit

geringer CD163-Expression hindeutet.

Abbildung 18: Die Histogramme zeigen die monozytäre CD163-Rezeptorexpression

jeweils dreier Versuche nach dreitägiger (obere Histogramme) bzw. sechstägiger

Stimulation (untere Histogramme) von reinen Monozytenkulturen mit 30 µg/ml (links

und Mitte, rote Fläche) und 20 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (rechts, rote Fläche)

im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 230201 004+001; oben Mitte 081200 002+001; oben rechts 240800

031+029; unten links 050301 013+009; unten Mitte 260201 006+001; unten rechts 111200 002+001

In der Zellverteilung reiner Monozyten verlagert sich nach Stimulation mit Onchocerca-

volvulus-Extrakt im Verlauf von sechs Tagen die Hauptzellpopulation in einen Bereich

höherer Granularität. Es fällt auf, daß sich nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-

Extrakt eine CD163-exprimierende Population abgespalten hat (Abb. 19 und 20), die im

Vergleich zu den anderen zwei Populationen eine größere Granularität (FSC-H)

aufweist.

Ergebnisse

43

Abbildung 19: Die drei Bilder

links zeigen jeweils die Zell-

verteilung von unstimulierten

Monozyten. Auf der rechten

Seite ist die Verteilung der

Zellen nach Stimulation mit OvE

(oben und Mitte 30 µg/ml, unten

100 µg/ml) nach dreitägiger

Kultur dargestellt.

FSC-H: Zellgröße; SSC-H:

Zellgranularität

Abbildung 20: Gereinigte

Monozyten wurden mit Oncho-

cerca-volvulus-Extrakt (jeweils

rechtes Bild) über sechstägig

kultiviert, wobei das jeweilig

linke Histogramm unstimuliert

kultivierte Zellen repräsentiert.

FSC-H: Zellgröße; SSC-H:

Zellgranularität

Ergebnisse

44

1.4.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von

Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren

Für gereinigte Monozyten, die mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von Doxycyclin

behandelten Patienten über drei und sechs Tage stimuliert worden waren, ergab sich

keine vermehrte Expression des CD163-Rezeptors auf Monozyten (Abb. 21).

Abbildung 21: Abgebildet sind die Medianwerte der CD163-Rezeptorexpression nach

Stimulation von gereinigten Monozyten über drei Tage mit 20-30 µg/ml Extrakt aus

Würmern unbehandelter Patienten mit Onchozerkose (OvE) und Extrakt von mit

Doxycyclin behandelten Patienten (OvE/D) im Vergleich zu unstimulierten Zellen

(Leerwert)

Links: t-Test: OvE P: 0,059; OvE/D P: 0,357; rechts: t-Test: OvE P: 0,193; OvE/D P: 0,109

Die unterschiedliche Expression des CD163-Rezeptors nach Stimulation mit

Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE) und Extrakt von Patienten, die mit Doxycyclin

behandelt wurden (OvE/D), wird in den Histogrammen der Abbildung 22 verdeutlicht.

Es zeigt sich keine deutliche Rechtsverschiebung des Fluoreszenzmaximums und somit

keine Erhöhung der Expression von CD163 auf Monozyten nach Stimulation mit

OvE/D, während sie nach Stimulation mit OvE vorhanden ist.

1

10

100

Leerwert OvE OvE/D

Expression (U)

1

10

100

Leerwert OvE OvE/D

Expression (U)

Ergebnisse

45

Abbildung 22: Gereinigte Monozyten wurden über drei Tage mit Onchocerca-

volvulus-Extrakt von Patienten, die mit Doxycyclin behandelt wurden (OvE/D, rote

Fläche) bzw. mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von unbehandelten Patienten (OvE,

grüne Linie) in einer Konzentration von 30 µg/ml (oben links und unten Mitte),

20 µg/ml (oben Mitte und unten rechts) bzw. 50 µg/ml (oben rechts) stimuliert und mit

den unstimulierten Zellen (schwarze Linie) verglichen. Versuchsnummern: oben links 081200 003+002+001; oben Mitte 240800 034+031+029; oben rechts

240800 033+030+029; unten links 111200 003+002+001; unten Mitte 260201 005+006+001; unten

rechts 120301 015+014+010

1.5 CD163-Expression nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt

Nach Stimulation mit Extrakt aus O. ochengi (OoE) zeigte sich eine geringe Expression

von CD163 auf den stimulierten Monozyten. Die CD163-Rezeptorexpression war nach

drei Tagen Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt ca. Zweieinhalbmahl höher als

die unstimulierter Monozyten. Nach sechs Tagen hatten die Expression von CD163

wieder abgenommen und belief sich auf das Zweifache des Leerwertes (Abb. 23, 24 und

25).

Ergebnisse

46

Abbildung 23: Dargestellt sind die Medianwerte der CD163-Expression von

gereinigten Monozyten nach drei Tagen (linke Abbildung) und sechs Tagen Kultur

(rechte Abbildung) mit 30-50 µg/ml (linke Abbildung) bzw. 30 µg/ml (rechte

Abbildung) OoE im Vergleich zu unstimulierten Kulturen (Leerwert). Links: t-Test: OoE P: 0,083; rechts: t-Test: OoE P: 0,280

Abbildung 24: Expression von CD163 auf gereinigten Monozyten, die über drei (obere

Histogramme) und sechs Tage (untere Histogramme) mit 30 µg/ml (rechtes oberes

Histogramm mit 50 µg/ml) mit OoE stimuliert worden waren (rote Fläche). Die

Expression von CD163 auf unstimulierten Zellen, ebenfalls über sechs Tage kultiviert,

ist durch die schwarze Linie dargestellt. Versuchsnummern: oben links 240800 037+029; oben rechts 230201 006+001; unten links 260201

007+001; unten Mitte 190201 012+008; unten rechts 050301 014+009

1

10

100

Leerwert OoE

Expression (U)

1

10

100

Leerwert OoE

Expression (U)

Ergebnisse

47

Abbildung 25: Die linke Abbildung zeigt die Expression von CD163 auf Monozyten

der mononukleären Zellfraktion nach sechstägiger Stimulation mit 50 µg/ml OoE, die

rechte Abbildung, die gereinigte Monozyten mit 30-50 µl/ml OoE. Die Medianwerte

werden mit denen unstimulierter Zellen (Leerwert) und denen der Positivkontrolle

Dexamethason 40 ng/ml (Dex), verglichen. Links: t-Test: OoE P: 0,369; Dex P: 0,544; rechts: t-Test: OoE P: 0,095

Monozyten mononukleärer Zellfraktionen zeigten gegenüber dem Leerwert nach drei

und sechs Tagen Kulturdauer keine signifikante Erhöhung der Rezeptorexpression von

CD163 nach Stimulation mit 50 µg/ml Onchocerca-ochengi-Extrakt (Abb. 26).

Abbildung 26: Es wurden mononukleäre Zellen über drei Tage (oben) bzw. sechs Tage

(unten) mit OoE (oben links 10 µg/ml; unten links 20 µg/ml; oben rechts, unten Mitte

und unten rechts 50 µg/ml, rote Fläche) und 200 ng/ml Dexamethason (grüne Linie)

stimuliert und im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: oben links 140400 414+405+403; oben rechts 140400 415+405+403; unten links

040900 004+001; unten Mitte 210200 004+002; unten rechts 210200 008+006

1

10

100

Leerwert OoE Dex

Expression (U)

1

10

100

Leerwert OoE

Expression (U)

Ergebnisse

48

1.6 CD163-Expression nach Stimulation mit den Onchocerca-volvulus-Antigenen

Ov17, Ovv17 und Ov33

Die als Stimuli eingesetzten Onchocerca-volvulus-Antigene Onchocystatin bzw.

Onchocystatinfragment (Ov17 bzw. Ovv17) und Asparaginproteaseinhibitor (Ov33)

ergaben keine signifikante Erhöhung der Expression von CD163 auf gereinigten

Monozyten nach zwei, drei und sechs Tagen Stimulation (Abb. 27) in den

Konzentrationen 5, 50, 100, 150 und 200 nM pro Kulturansatz. Aufgrund dessen

wurden diese Onchocerca-volvulus-Antigene aus den Versuchen herausgenommen.

Abbildung 27: Dargestellt ist die CD163-Expression nach drei Tagen Kultur von

gereinigten Monozyten mit Ov17 (oben) bzw. Ovv17 (Mitte) und Ov33 (unten, rote

Fläche) zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Als Stimuli wurden jeweils 5 nM

(linkes Histogramm) und 150 nM (rechtes Histogramm) der Antigene verwendet. Versuchsnummern: oben links 161299 069+067; oben rechts 161299 068+067; Mitte links 161299

074+067; Mitte rechts 161299 075+067; unten links 161299 071+067; unten rechts 161299 072+067

Ergebnisse

49

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25

WSP (µg/ml)

Expr

essi

on (U

)

1.7 CD163-Expression nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein des

Parasiten Dirofilaria immitis

Die CD163-Rezeptorexpression wurde auch auf mit Oberflächenprotein von

Wolbachien (WSP) stimulierten Monozyten untersucht. Wolbachien sind in Symbiose

mit der Filarie O. volvulus lebende Endobakterien. WSP von Dirofilaria immitis zeigt

eine mit Onchocerca identische Gensequenz (Bazzocchi et al., 2000). Gereinigte

Monozyten wurden mit WSP in den Konzentrationen 3, 10, 20 µg/ml über drei Tage

stimuliert. Bei der Konzentration 10 µg/ml ergab sich nach drei Tagen die höchste

CD163-Expression (Abb. 28). Nach sechs Tagen Stimulation mit einer Konzentration

von 20-25 µg/ml WSP waren die Mediane der CD163-Rezeptorexpression bedeutend

höher, bei der Konzentration von 10 µg/ml WSP nur leicht höher als die des Leerwertes

(Abb. 29).

Abbildung 28: Dosiswirkungs-

kurve von WSP. Es wurden

Monozyten über drei Tage mit

3, 10 und 20 µg/ml WSP

stimuliert und anschließend die

Rezeptorexpression von CD163

bestimmt.

Abbildung 29: In dieser Abbildung

sind die Medianwerte der CD163-

Expression von Monozyten nach

sechs Tage Kultur mit WSP in den

Konzentrationen von 10 µg/ml und

20-25 µg/ml und von unstimulierten

Zellen dargestellt. t-Test: WSP 10 P: 0,39; WSP 20-25 P: 0,194

Nach Stimulation mit 10 µg/ml WSP über sechs Tage zeigt sich eine

Rechtsverschiebung der Fluoreszenz und somit eine vermehrte Expression des CD163-

1

10

100

0

10

20-25 WSP (µg/ml)

Expression (U)

Ergebnisse

50

Rezeptorens auf Monozyten (Abb. 30). Eine zweigipflige Expression deutet auf das

Vorliegen zweier Monozytenpopulationen hin, wie sie auch nach Stimulation mit OvE

auftreten. Eine dieser Populationen zeigt eine hohe CD163-Expression.

Abbildung 30: Abgebildet sind die Ergebnisse von drei Versuchen mit reinen

Monozyten, die über sechs Tage mit WSP (rote Fläche) in einer Konzentration von

10 µg/ml stimuliert wurden. Zum Vergleich sind unstimulierte Zellen eingesetzt

(schwarze Linie). Versuchsnummern: links 260201 003+001; Mitte 190201 010+008; rechts 120301

015+014+010

1.7.1 CD163-Expression nach Stimulation mit Fragmenten des Wolbachien-

proteins des Parasiten Brugia malayi

Die Fragmente V1 und V3 des Wolbachienoberflächenproteins von Brugia malayi (Bm

V1 und Bm V3) ergaben nach Stimulation von mononukleären Zellen sowie gereinigten

Monozyten in der Konzentration 4, 5, 20 und 50 µg/ml über drei und sechs Tage Kultur

(Abb. 31) keine vermehrte Expression des Scavenger-

Rezeptors CD163 auf Monozyten. Der Versuch wurde

deshalb nicht weiter verfolgt.

Abbildung 31: Gereinigte Monozyten wurden über

sechs Tage mit Bm V1 (oberes Histogramm) und

Bm V3 (unteres Histogramm) in einer Konzentration

von 50 µg/ml (rote Fläche) stimuliert. Die CD163-

Rezeptorexpression unstimulierter Zellen ist zum Ver-

gleich (schwarze Linie) dargestellt. Versuchsnummern: oben 11120 005+001; unten 11120 006+001

Ergebnisse

51

2. Interleukin-10-Freisetzung stimulierter Monozyten

2.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt

Mononukleäre Zellen wurden

über fünf Tage mit Onchocerca-

volvulus-Extrakt (OvE) stimu-

liert. Nach einem bzw. drei Tagen

war die Konzentration des

Interleukins im Überstand am

stärksten ausgebildet. Im Verlauf

nahm die Konzentration von

IL-10 im Überstand wieder ab

(Abb. 32). Monozyten der mono-

nukleären Zellfraktion sowie

gereinigte Monozyten bilden nach Stimulation mit OvE vermehrt IL-10. Nach einem

Tag Stimulation von gereinigten Monozyten gesunder Spender ist die Expression am

höchsten und lag im Mittel bei 450 pg/ml. Die Konzentration von IL-10 im

Kulturüberstand von gereinigten Monozyten, die mit OvE stimuliert wurden, lag unter

dem Mittelwert der IL-10-Konzentration nach Stimulation mit 10 ng/ml

Lipopolysaccharid (Abb. 33).

Abbildung 33: Es wurden die IL-10-

Konzentrationen im Kulturüberstand

von über einen Tag mit 20-30 µg/ml

Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE)

bzw. 10 ng/ml Lipopolysaccharid

(LPS) stimulierten Monozyten ge-

messen. t-Test: LPS P: 0,008; OvE P: 0,103

0,1

1

10

100

1000

10000

Leerwert LPS OvE

IL-10 (pg/ml)

4h 1d 3d 5d 0

100

200

300

400

500

IL-10 (pg/ml)

OvE

Std./Tage

Abbildung 32: IL-10-Produktion

von Monozyten nach Stimulation

mit 20 µg/ml OvE

Ergebnisse

52

Die mittlere Konzentration von IL-10 nahm nach drei bzw. sechs Tagen Kultur reiner

Monozyten ab (Abb. 34).

Abbildung 34: Dargestellt ist die IL-10-Expression von Monozyten, die über drei

(linke Abbildung) und sechs Tage (rechte Abbildung) mit 20-30 µg/ml Onchocerca-

volvulus-Extrakt (OvE) bzw. 10 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden, im

Verhältnis zur Expression unstimulierter Zellen (Leerwert). Links: t-Test: OvE P: 0,059; LPS P: 0,405; rechts: t-Test: OvE P: 0,120; LPS P: 0,047

2.1.1 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von

Patienten, die mit Doxycyclin behandelt worden waren

Monozyten wurden mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von unbehandelten Patienten

(OvE) sowie von Patienten, die vor der Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt

worden waren (OvE/D), stimuliert. Der Mittelwert der IL-10-Konzentration im

Überstand war nach Stimulation mit OvE über einen Tag um etwa 900 pg/ml höher als

bei Verwendung von OvE/D. Eindrucksvolle Ergebnisse ergaben Kulturen von

gereinigte Monozyten, die über einen Tag kultiviert wurden (Abb. 35). Der Mittelwert

der IL-10-Konzentration im Überstand nach Stimulation der Monozyten mit OvE/D lag

nach einem und drei Tagen Kultur unter der IL-10-Konzentration nach Stimulation mit

OvE (Abb. 35).

0,1

1

10

100

1000

Leerwert OvE LPS

IL-10 (pg/ml)

1

10

100

1000

Leerwert OvE LPS

IL-10 (pg/ml)

Ergebnisse

53

Abbildung 35: Gereinigte Monozyten wurden mit jeweils 20-30 µg/ml OvE und mit

OvE/D über einen (linke Abbildung) bzw. drei Tage (rechte Abbildung) kultiviert und

zum Vergleich mit unstimulierten Zellen (Leerwert, LW) dargestellt. Links: t-Test: LW-OvE P: 0,103; LW-OvE/D P: 0,244; OvE-OvE/D P: 0,114; rechts: t-Test: OvE

P: 0,176; OvE/D P: 0,384

Mononukleäre Zellen zeigen nach drei Tagen Stimulation mit OvE eine höhere IL-10-

Konzentration im Überstand als nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von

Patienten, die vor Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren (Abb. 36).

Abbildung 36: Dargestellt

sind die IL-10-Konzentratio-

nen der Überstände mono-

nukleärer Zellen nach drei-

tägiger Stimulation mit

20 µg/ml OvE bzw. OvE/D. t-Test: OvE P: 0,234; OvE/D

P: 0,368

0,1

1

10

100

1000

Leerwert OvE OvE/D

IL-10 (pg/ml)

0,01

0,1

1

10

100

1000

Leerwert OvE OvE/D

IL-10 (pg/ml)

0,1

1

10

100

1000

Leerwert OvE OvE/D

IL-10 (pg/ml)

Ergebnisse

54

2.2 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt

Die Stimulation mit Onchocerca-ochengi-Extrakt (OoE) führte zu stark erhöhten IL-10-

Konzentrationen im Überstand gereinigter Monozyten nach einem Tag Kultur. Der

Mittelwert lag bei 392 pg/ml (Abb. 37). Analoge Konzentrationen wurden nach drei

Tagen Kultur gemessen. Die IL-10-Konzentrationen im Überstand stimulierter Mono-

zyten lag nach sechs Tagen niedriger als nach ein bis drei Tagen Kultur (Abb. 37).

Abbildung 37: IL-10-Konzentrationen der Überstände von Monozyten nach einem Tag

(linke Abbildung) und sechs Tagen Kultur (rechte Abbildung), stimuliert mit

20-30 µg/ml OoE, 10 ng/ml LPS bzw. unstimuliert (Leerwert). Links: t-Test: OoE P: 0,011; LPS P: 0,008; rechts: t-Test: OoE P: 0,024; LPS P: 0,047

Mononukleäre Zellen gesunder Spender zeigten nach einem Tag Kultur mit OvE bzw.

LPS, im Vergleich zu unstimulierten Zellen, ebenfalls einen erhöhten IL-10-Spiegel.

Die Mediane der IL-10-Konzentrationen mit 10 ng/ml LPS stimulierter mononukleärer

Zellen lag höher als nach Stimulation mit OoE (Abb. 38), anders als bei reinen

Monozyten, die gleich hohe Medianwerte für beide Stimuli zeigten (vgl. Abb. 37).

Abbildung 38: IL-10-Konzentrationen

mononukleärer Zellen nach eintägiger

Stimulation mit 20-30 µg/ml OoE bzw.

10 ng/ml LPS. t-Test: OoE P: 0,189; LPS P: 0,023

0,1

1

10

100

1000

10000

Leerwert OoE

IL-10 (pg/ml)

LPS

1

10

100

1000

10000

Leerwert OoE LPS

IL-10 (pg/ml)

1

10

100

1000

Leerwert OoE LPS

IL-10 (pg/ml)

Ergebnisse

55

2.3 IL-10-Freisetzung nach Stimulation mit Wolbachienoberflächenprotein des


Wolbachienoberflächenprotein (WSP) stimuliert dosisabhängig nach einem Tag Kultur

die IL-10-Expression in Monozyten (Abb. 39). Nach sechs Tagen Kultur nahm die

IL-10-Konzentration im Überstand der Monozyten bei Stimulation mit 20 µg/ml WSP

auf etwa 300 pg/ml zu (Abb. 39).

Abbildung 39: Darstellung der IL-10-Konzentrationen im Zellüberstand. Gereinigte

Monozyten wurden mit 3, 10 und 20-25 µg/ml WSP (linke Abbildung) bzw. 20 µg/ml

WSP (rechte Abbildung) und ohne Stimulus (Leerwert) über einen Tag kultiviert. Links: t-Test: WSP 3 P: 0,237; WSP 10 P: 0,065; WSP 20-25 P: 0,360; rechts: t-Test: WSP P:0,273

3. Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf Monozyten

3.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation mit

Onchocerca-volvulus-Extrakt

Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR) gehört wie der CD163-Rezeptor zu den

Markern von alternativ aktivierten Makrophagen (Stein et al., 1992; Kodelja et al.,

1997). Die Stimulation von Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt über drei

Tage führte zu einer nachweisbaren Expression von MMR. Die Expression des MMR

auf den Zellen war am dritten Tag stärker ausgeprägt als nach sechstägiger Kultur

(Abb. 40). Die erhöhte Expression zeigt sich im Histogramm (Abb. 41) als Rechts-

1

10

100

1000

10000

Leerwert WSP

IL-10 (pg/ml)

0.1

1

10

100

1000

0 3 10

20-25 WSP (ng/ml)

IL-10 (pg/ml)

Ergebnisse

56

verschiebung entsprechend einer Zunahme der Fluoreszenz und damit der

Rezeptorexpression auf Monozyten.

Abbildung 40: Dargestellt sind Medianwerte der MMR-Expression auf Monozyten,

über drei (linke Abbildung) bzw. sechs Tage (rechte Abbildung) stimuliert mit

30 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (OvE) bzw. 10 ng/ml LPS (LPS) oder ohne

Stimulus (Leerwert). Links: t-Test: OvE P: 0,165; LPS P: 0,136; rechts: t-Test: OvE P: 0,221

Abbildung 41: Abgebildet ist die MMR-Expression auf Monozyten, die über drei

(oben) bzw. sechs Tage (unten) mit 30 µg/ml Onchocerca-volvulus-Extrakt (rote

Fläche) stimuliert worden waren. Die schwarze Linie gibt das Expressionsverhalten

unstimulierter Zellen wieder. Versuchsnummern: oben links 230201 012+009; oben rechts 081200 010+009; unten links 111200

010+009; unten Mitte 260201 015+010; unten rechts 170701 018+017

1

10

100

Leerwert OvE LPS

Expression (U)

1

10

100

Leerwert OvE

Expression (U)

Ergebnisse

57

3.1.1 Expression des Makrophagen-Mannose-Rezeptors nach Stimulation von

gereinigten Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von mit

Doxycyclin behandelten Patienten

Bei den Versuchen mit Onchocerca-volvulus-Extrakt von Patienten, die vor

Nodulektomie mit Doxycyclin behandelt worden waren (OvE/D), konnte keine

Expressionserhöhung des MMR auf Monozyten nachgewiesen werden (Abb. 42). Nach

Stimulation von Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt unbehandelter Patienten

(OvE) war die Differenz der Expression des MMR nach drei Tagen deutlich größer als

nach sechs Tagen Kultur (Abb. 40).

Abbildung 42: Die Abbildung zeigt die Medianwerte der Expression für den

Makrophagen-Mannose-Rezeptor auf drei (linke Abbildung) bzw. sechs Tage (rechte

Abbildung) mit 30 µg/ml OvE/D stimulierten reinen Monozyten im Vergleich zu OvE

und zu unstimulierten Zellen (Leerwert). Aufgrund der Begrenztheit des Materials

konnten nur drei Bestimmungen durchgeführt werden. Links: t-Test: OvE P: 0,240; OvEoB P: 0,204; rechts: t-Test: OvE P: 0,221; OvE/D P: 0,416

1

10

100

Leerwert OvE OvE/D1

10

100

Leerwert OvE OvE/D

Expression (U)Expression (U)

Ergebnisse

58

Die folgenden Histogramme zeigen die Fluoreszenzwerte kultivierter Monozyten, die

mit OvE über drei, sechs und sieben Tage stimuliert wurden (Abb. 43 und 44). Mit

OvE/D stimulierte und unstimulierte Monozyten zeigten eine äquivalente MMR-

Expression. Auch nach sieben Tagen Stimulation mit OvE/D von gereinigten

Monozyten zeigt sich keine erhöhte MMR-Expression (Abb. 44).

Abbildung 43: Dargestellt ist die MMR-Expression nach drei (obere Histogramme)

und sechs Tagen Stimulation (untere Histogramme) von gereinigten Monozyten mit

30 µg/ml OvE/D (rote Fläche) bzw. Onchocerca-volvulus-Extrakt unbehandelter

Patienten (grüne Linie) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummern: oben links 081200 011+010+009; oben rechts 230201 013+012+009; unten links

111200 011+010+009; unten rechts 260201 014+015+010

Abbildung 44: Dargestellt ist die MMR-Expression

nach Stimulation von gereinigten Monozyten über

sieben Tage mit 30 µg/ml OvE (rote Fläche) bzw.

OvE/D (grüne Linie) im Vergleich zu unstimulierten

Zellen (schwarze Linie). Versuchsnummer: 271200 015+014+013

Ergebnisse

59


Onchocerca-ochengi-Extrakt

Gereinigte Monozyten zeigten in Relation zu unstimulierten Monozyten nach sechs

Tagen Kultur mit Onchocerca-ochengi-Extrakt (OoE) keine signifikante Erhöhung der

Expression des MMR (Abb. 45 und 46).

Abbildung 45: Dargestellt

sind die Medianwerte der

MMR-Expression auf gerei-

nigten Monozyten, die über

sechs Tage mit 30 µg/ml

OoE stimulierten worden

waren, verglichen mit unsti-

mulierten Monozyten (Leer-

wert). t-Test: OoE P: 0,159

Histogramm 46: Stimulation von gereinigten Monozyten mit 30 µg/ml OoE über sechs

Tage (rote Fläche) im Vergleich zu unstimulierten Zellen (schwarze Linie) Versuchsnummern: links 260201 016+010; Mitte 170701 019+017; rechts 260302 057+051

1

2

3

4

5

6

7

8

Leerwert OoE

Expression (U)

Ergebnisse

60


Wolbachienoberflächenprotein des Parasiten Dirofilaria immitis

Der Makrophagen-Mannose-

Rezeptor (MMR) wurde auf

mit Wolbachienoberflächen-

protein (WSP) stimulierten

gereinigten Monozyten ver-

mehrt exprimiert. Mononukle-

äre Zellen sowie gereinigte

Monozyten wurden über sechs

Tage mit Konzentrationen zwischen 3 und 30 µg/ml stimuliert (Abb. 48); hierbei ergab

sich die stärkste Expression bei 10 µg/ml (Abb. 47).

Abbildung 48: MMR-Expression auf gereinigten Monozyten nach sechstägiger

Stimulation mit 3 µg/ml (links), 10 µg/ml (Mitte) und 20 µg/ml WSP (rechts; rote

Fläche) sowie MMR-Expression unstimulierter gereinigter Monozyten nach sechs

Tagen Stimulation (schwarze Linie) Versuchsnummer: links 260201 013+010; Mitte 260201 012+010; rechts 260201 011+010

Abbildung 47: Dosiswirkungskurve von WSP

0

2

4

6

8

Expression (U)

0 10 20 WSP (µg/ml)

Ergebnisse

61

4. Zentrale Ergebnisse

Monozyten zeigen nach drei-

tägiger Stimulation mit Oncho-

cerca-volvulus-Extrakt (OvE)

eine erhöhte Expression des

Scavenger-Rezeptors CD163 und

des Makrophagen-Mannose-Re-

zeptors (MMR, Abb. 49). Im

Gegensatz zu OvE führt Oncho-

cerca-volvulus-Extrakt aus Wür-

mern von Patienten, die vor

Nodulektomie mit Doxycyclin

behandelt worden waren, zu

keiner bzw. nur geringer

Erhöhung der Rezeptoren. Im

Überstand stimulierter Mono-

zyten läßt sich eine erhöhte IL-10-Konzentration nach Stimulation mit OvE nachweisen.

OvE/D führt nicht zu einer erhöhten Expression von CD163, MMR und IL-10.

Nach Stimulation reiner Mono-

zyten mit Wolbachienober-

flächenprotein (WSP) des


zeigte sich eine Expressions-

erhöhung der Rezeptoren

CD163 und MMR sowie eine

Erhöhung der Konzentration

von IL-10 im Kulturüberstand

(Abb. 50). Der MMR zeigt

nach Stimulation mit WSP eine

geringere Expression als der

Scavenger-Rezeptor CD163.

Abbildung 49: Stimulation gereinigter Monozyten mit OvE führt zu einer erhöhten

Expression von CD163 und MMR auf diesen Zellen (nach drei Tagen) und zu einer

erhöhten IL-10-Freisetzung im Monozytenüberstand (nach einem Tag).

1

10

100

CD163 MMR IL-10

unstimulierte Zellenstimuliert mit 20-30 µg/ml OvE/Dstimuliert mit 20-30 µg/ml OvE

Abbildung 50: Erhöhung der Rezeptorexpression für CD 163 und

MMR bw. IL-10-Freisetzung nach Kultur gereinigter Monozyten mit WSP über sechs Tage (CD163, MMR) und einen

Tag (IL-10)

1

10

100

CD163 MMR IL-10

unstimulierte Zellenstimulierte Zellen mit 20-25 µg/ml WSP

Ergebnisse

62

Die Gensequenz des WSP von Dirofilaria immitis ist identische mit der des WSP aus

Onchocerca (Bazzocchi et al., 2000).

Onchocerca-ochengi-Extrakt

(OoE) führte nach dreitägiger

Stimulation von Monozyten zu

einer vermehrten Expression

des CD163-Rezeptors. Nach

einem Tag Stimulation mit

OoE zeigt sich im Überstand

eine signifikate IL-10-Erhö-

hung (Abb. 51).

Abbildung 51: Darstellung der Ergebisse der Rezeptorexpression und IL-10-

Freisetzung auf bzw. durch gereinigte Monozyten nach drei (CD163), sechs Tagen (MMR) bzw. einem Tag (IL-10)

Stimulation mit OvE

1

10

100

1000

CD163 MMR IL-10

unstimulierte Zellen

stimuliert mit 30-50 µg/ml OoE

63

Diskussion

Die klinischen Manifestationen der Infektion mit Onchocerca volvulus variieren stark.

Unterschiede umfassen die generalisierte und die seltenere Sowda-Form, die fließend

ineinander übergehen können (Spektrum). Es zeigen sich bei der generalisierten Form

keine oder nur geringe Entzündungsreaktionen, obwohl z. T. eine große Anzahl von

Mikrofilarien in der Haut vorhanden sein kann. Die Sowda-Form präsentiert sich

hingegen als hyperreaktive, klinisch ausgeprägte Form der Erkrankung, meist mit einer

an den Gliedmaßen lokalisierten, juckenden, papulösen, hyperpigmentierten

chronischen Dermatitis mit regionaler Lymphadenopathie. Sowda-Patienten zeigen im

Unterschied zur generalisierten Form in vitro stark ausgeprägte zelluläre Reaktionen. Es

stellt sich die Frage, weshalb das Immunsystem von Patienten mit der generalisierten

Form vitale Filarien von O. volvulus toleriert und nicht bekämpft, wie es bei der Sowda-

Form zu beobachten ist.

Patienten mit der generalisierten Form der Onchozerkose zeigen eine nur geringe

Lymphozytenproliferation und geringe Konzentrationen inflammatorischer Zytokine

wie IL-2, Tumor-Nekrose-Faktor und IL-6 bei Stimulation mit Onchocerca-volvulus-

Extrakt (Ottesen, 1995). Immunreaktionen gegenüber adulten Filarien und Mikro-

filarien sind kaum nachweisbar. Degenerierte Mikrofilarien führen jedoch auch bei der

generalisierten Form vor allem bei hoher Mikrofilariendichte zu massiven Entzün-

dungsreaktionen (Ottesen, 1995). Eine Abtötung der Mikrofilarien erfolgt insbesondere

nach Gabe des mikrofilariziden Therapeutikums Diethylcarbamazin. Dies bedeutet, daß

die eingeschränkte Immunreaktivität unter bestimmten Bedingungen durchbrochen

werden kann. Die Entzündungsreaktion scheint von endobakteriellen Molekülen sowie

von prädominanten Th2-aktivierenden Molekülen von Filarien hervorgerufen zu

werden, die auf das native Immunsystem aktivierend einwirken. Die stetige Exposition

des Wirts mit Onchocerca-assoziierten Molekülen sowohl von Filarien als auch

filariellen Endobakterien provoziert mit steigender Filarienanzahl inflammatorische

Mechanismen. Immunpathologische Schäden werden durch T-Zellen und alternativ

aktivierten Makrophagen (aaM) minimiert (Hoerauf & Brattig, 2002; Brattig, 2004).

Von den lebenden Parasiten scheint eine immunmodulierende Aktivität auszugehen. So

kommt es zum Beispiel bei den Infektionen mit Brugia malayi, Nippostrongylus und

Diskussion

64

Toxocara canis zu einer Hemmung der T-Zellproliferation und Th2-Zellantwort. Die

Hemmung dieser Antworten wirkt einer Entzündungsreaktion durch die Freigabe von

IL-4, IL-10, Prostaglandinen und Proteinen wie Fizz1 und Ym1 entgegen (Maisels et

al., 2003).

Ein großer Fortschritt war die Entdeckung einer neuen Form von Makrophagen bzw.

dendritischen Zellen, die bei Infektionen mit Nematoden beobachtet wurde. Diese

Makrophagen schlagen einen IL-10 unabhängigen Weg ein (MacDonald et al., 1998;

Allen & Loke, 2001). Mit B. malayi infizierte Mäuse präsentierten diese Makrophagen

im Peritoneum. Im Mausmodell verhindern Makrophagen die Proliferation von

T-Zellen und wirken durch einen kontaktabhängigen Mechanismus. Der Mechanismus

ist unabhängig von den bekannten Inhibitoren wie NO, Prostaglandinen oder Zytokinen

wie IL-10 und TGF-ß (Loke et al., 2000). Diese Makrophagen induzieren die

Differenzierung von naiven T-Zellen zu Th2-Zellen (Allen et al., 1996) und können

möglicherweise als Typ-2-Makrophagen klassifiziert oder als ein wichtiges In-vivo-

Beispiel von alternativ aktivierten Makrophagen (aaM) dargestellt werden (Gordon,

2003). Durch Helminthen stimulierte dendritische Zellen aus dem Knochenmark von

Mäusen zeigten eine vermehrte Expression von CD80, CD86 und MHC Klasse II

(Jankovic et al. 2001; MacDonald et al., 2001). Für die Th2-Antwort spricht auch die

vermehrte Expression des OX40-Liganden auf humanen dendritischen Zellen, welche

ausschlaggebend für die OX40-vermittelte Th2-Differenzierung ist (Flynn et al., 1998).

Später wurden auch ähnliche Zellen bei anderen Tieren, welche verschiedenen

Nematoden und deren sekretorischen Produkten ausgesetzt wurden, gefunden (Allen &

MacDonald, 1998).

Ym1, ein Protein, das zur Familie der Chitinase-Proteine gehört und von Makrophagen

zur Bindung von Glykosaminoglykanen wie Heparin im Rahmen einer Inflammation

poduziert wird, wurde als chemotaktischer Faktor für eosinophile Granulozyten

identifiziert (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003). Die begleitende lokale Infiltration

eosinophiler Granulozyten bei Onchozerkose kann somit durch die chemotaktische

Wirkung von Ym1 entstehen. Immunmodulierende Moleküle wie z. B. Filarien-

Cystatin, Migrations-inhibierender-Faktor und ein dem TGF-ß-ähnliches Molekül,

führen mit zu einer Suppression des Immunsystems. Nach Injektion von OvE zeigte

sich eine Einschränkung der Immunantwort der verzögerten Überempfindlichkeit

Diskussion

65

(DTH) (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003); diese war jedoch nicht bei Patienten mit einer

Sowda-Form sowie putativ Immunen zu beobachten (Burchard et al., 1999). Die

Antigen-induzierte DTH gilt als Th1-vermittelte Immunreaktion (Burchard et al., 1999).

Neueste Studien zeigen, daß bei Th2-abhängigen Reaktionen eine DTH des Typs II mit

einem klinischen Bild ähnlich dem der klassischen DTH auftreten kann. Frühere

Versuche, die verminderte Immunantwort bei der generalisierten Form der

Onchozerkose als eine Th2-Antwort zu beschreiben, werden heute als eine zu große

Vereinfachung angesehen. Gegen eine ausschließliche Th2-Antwort spricht das

Auftreten verschiedener Zellreaktionen bei putativ Immunen sowie die Zunahme der

zellulären Proliferation nach mikrofilarizider Behandlung mit Ivermectin bei Patienten

mit der Sowda-Form (Soboslay et al., 1997, Henry et al., 2001).

Neben Th1- und Th2-Antworten wurde kürzlich die Antwort einer dritten Th-

Zellpopulation, der Th3- oder regulatorischen T-Zelle Typ 1 (Tr1) beschrieben. Bei

Onchozerkose war die Th3-Antwort mit der OvE-spezifischen Verminderung der

Zellproliferation assoziiert. Th3-Reaktionen können die Th1- und Th2-Antwort

unterdrücken (Doetze et al., 2000). Th3-Zellen produzieren IL-10 und TGF-ß und sind

möglicherweise für eine Toleranzinduktion verantwortlich (Kapselberg et al., 1999).

Die Produktion von IL-10 ist assoziiert mit der verminderten zellulären

Antwortfähigkeit (Elson et al., 1995; Brattig et al., 1997; Soboslay et al., 1997; Cooper

et al., 1998; Doetze et al., 2000; Henry et al., 2001). Sie ist bei Patienten mit

generalisierter Form nach mikrofilarizider Behandlung mit Ivermectin vermindert, und

es läßt sich als Konsequenz eine verstärkte Zellproliferation nachweisen (Henry et al.,

2001). Die Neutralisation von IL-10 durch spezifische Antikörper ergab in vitro noch

keine Zunahme der Lymphozytenproliferation bei Patienten mit generalisierter

Onchozerkose (Soboslay et al, 1999; Doetze et al., 2000). Erst bei gleichzeitiger Zugabe

von Antikörpern gegen TGF-ß zeigte sich eine Zunahme der Zellproliferation (Doetze

et al., 2000). Onchozerkose-spezifische T-Zellklone bilden bei Patienten mit

generalisierter Onchozerkose Zytokine, die für den Th3-Suppressorzelltyp

charakteristisch sind (Doetze et al., 2000). Bei lymphatischen Filariosen und bei

Schistosomiasis ist die T-Zellantwort durch gemischte Th1- und Th2-Zellreaktionen

(Sartono et al., 1997; Grogan et al., 1998) sowie durch eine durch IL-10 und TGF-ß

vermittelte verminderte Zellproliferation gekennzeichnet (King et al., 1993; Mahanty et

al., 1996). Die Abbildung 52 zeigt ein Modell, wie man sich aufgrund der neueren

Diskussion

66

Forschungsergebnisse die Balance zwischen den Effektor- und Suppressormechanismen

bei der generalisierten Form der Onchozerkose im Vergleich zur Sowda-Form und zu

putativ Immunen vorstellt.

Abbildung 52: Balancemodell

zwischen den Effektor- und

Suppressormechanismen bei

Onchozerkose. (nach Hoerauf

& Brattig 2002)

1. Bei generalisierter Onchozerkose werden die Th1- und Th2-abhängigen

Effektorreaktionen durch IL-10 und TGF-ß supprimiert, und antigenspezifische

supprimierende Zellen (Th3/Tr1) treten auf.

2. Bei putativ immunen Individuen und Patienten mit der hyperreaktiven Form der

Onchozerkose (Sowda) zeigt sich eine ausgeprägte Th1/2-Effektorantwort, die zu einer

Immunantwort gegen infektiöse Larven bei putativ Immunen oder gegen Mikrofilarien

bei Sowda führt.

Somit kann durch freigesetztes IL-10 (z. B. aus aaM) eine Th3/Tr-1-Antwort ausgelöst

werden (Gomez-Escobar et al. 1998; Pastrana et al. 1998; Schönemeyer et al. 2001;

Hoerauf & Brattig, 2002). Th1- und Th2-Immunantworten können durch Fragmente

untergehender Mikrofilarien oder in Symbiose mit O. volvulus lebender Wolbachien

verursacht werden. Noch nicht identifizierte Wolbachienprodukte führen zunächst zu

proinflammatorischen Reaktionen (Brattig et al 2000; Taylor et al. 2000). Oligo-

saccharide (Fucosyl) und Phosphorylcholin hingegen lösen eher eine zelluläre Th2-

Antwort aus (Velupillai et al. 1996; Al-Qaoud et al. 1998; Whelan et al. 2000). Eine

Diskussion

67

Modulation der Immunantwort scheint auch durch In-utero-Exposition mit dem

parasitären Antigen bedingt zu sein, wobei entweder eine Toleranzbildung oder eine

verstärkte humorale Immunreaktion stattfindet. Im Rahmen von inflammatorischen

Reaktionen werden sequentiell auch antiinflammatorische Mechanismen hochreguliert,

um einer unkontrollierten sich verstärkenden Entzündungsreaktion entgegenzuwirken

(Kodelja & Goerdt, 1994; Kodelja et al., 1997; Goerdt & Orfanos 1999; Gratchev et al.,

2001). Hierbei spielen alternativ aktivierte Monozyten/Makrophagen (aaM) eine Rolle

(Kodelja et al., 1997; Gordon 2003), die bei chronischen Entzündungsreaktionen

vermehrt nachgewiesen wurden (Kodelja & Goerdt, 1994; Djemadji-Ondjiel et al.,

1996; Schebesch et al., 1997).

Da es für die Onchozerkose kein Tiermodell gibt, habe ich In-vitro-Untersuchungen mit

menschlichen Zellen durchgeführt. Vollblut zu kultivieren war wegen des geringen

Anteils an Monozyten ungeeignet (nur 2-6% der peripheren Leukozyten im Blut). Aus

diesem Grund wurden mononukleäre Zellen isoliert oder gereinigte Monozyten

eingesetzt. Untersucht wurden zwei wichtige Rezeptoren von aaM (CD163 und MMR)

sowie das Zytokin IL-10, das von aaM vermehrt gebildet wird. Die Rezeptorexpression

von CD163 und MMR wurde im Durchflußzytometer (FACS), die IL-10-Konzentration

im Kulturüberstand mittels ELISA analysiert. Der MMR wurde erst zu einem späteren

Zeitpunkt der Versuche als charakteristischer Marker hinzugenommen. Um das In-vivo-

Vorkommen von aaM zu überprüfen wären auch immunhistologische Untersuchungen

von Hautbiopsien für den Nachweis der Expression von CD163 und MMR interessant

gewesen.

Immunchemische Untersuchungen der kultivierten Zellen unter Anwendung der

Zytospinmethodik waren aufgrund des hohen Zellverbrauchs nicht ökonomisch.

Außerdem erwiesen sich die Ergebnisse der Rezeptorbestimmung durch die

Durchflußzytometrie als objektiver im Vergleich zur Zytospinmethodik. Die Selektion

der zu untersuchenden Zellpopulation durch das sogenannte „gaten“ stellt eine mögliche

Fehlerquelle beim FACS dar. Hierdurch werden Zelltrümmer und andere

Zellpopulationen aus der Analyse mit möglichem Informationsverlust ausgegrenzt. Bei

den Versuchen wurden Negativ- und Positivkontrollen eingeschlossen. Bei jedem

Versuch wurde stets ein Leerwert ohne Einsatz der monoklonalen Antikörper gegen die

Rezeptoren mitgeführt. Die MMR-Ergebnisse stellen aufgrund der Materialknappheit

Diskussion

68

der Reagenzien zum Teil nur einen Trend dar. Alternativ aktivierte Makrophagen

werden im Gegensatz zu klassisch aktivierten Makrophagen durch antiinflammatorische

Substanzen wie IL-4, Glukokortikoide, IL-10, IL-13 und TGF-ß aktiviert und

präsentieren ein bestimmtes Muster an Zytokinen wie IL-10 und TGF-ß sowie

Rezeptoren wie MMR und CD163. Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der bis jetzt

bekannten biologischen Eigenschaften alternativ aktivierter Makrophagen. Diese gehen

aus mit IL-4 und Glukokortikoiden stimulierten Monozyten hervor. Bestimmte weitere

Stimuli induzieren in diesen Monozyten eine präferentielle Freisetzung oder Expression

von z. B. Zytokinen, Chemokinen, Rezeptoren, Enzymen und anderen Produkten.

Auslösender Stimulus Rezeptorexpression

Glukokortikoide, IL-4 (Kodelja & Goerdt, 1994; Djemadji-

Ondjiel et al., 1996; Kodelja et al., 1997; Van den Heuvel et

al., 1999)

Scavenger-Rezeptor CD163

IL-4, Dexamethason (Cowan et al., 1992; Stein et al., 1992 ;

Kodelja et al., 1997)

IgG2a (Stein et al., 1992)

Bacille-Calmette-Guerin, Endotoxin/Phorbolester (Cowan

et al., 1992)

Glukokortikoide (Cowan et al., 1992; Stein et al., 1992)

Makrophagen-Mannose-Rezeptor

Glukokortikoide (Woiciechowsky et al., 1999)

IL-10 (Steinbrink et al., 1997)

Erniedrigte Expression von HLA-

DR,CD83,CD86,CD58

Auslösender Stimulus Produktexpression

IL-4 (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003) Fizz1

IL-4 (Loke et al., 2002; Nair et al., 2003) Eosinophiles Dermotoxin Ym1/2

IL-4 (Chizzolini et al. 2000) Matrix-Metalloproteinase MMP-1

Auslösender Stimulus Enzymexpression

IL-4, IL-13 (Gordon, 2002) L-Arginase 1

Glukokortikoide, IL-4 (Kodelja et al. 1997) 15-Lipoxigenase

Auslösender Stimulius Chemokinfreisetzung

IL-13, IL-10 u. IL-4 (Kodelja et al., 1998) AMAC-1 (CCL18)

Karzinome, Allergien und inflammatorische

Erkrankungen (Psoriasis u. Asthma), HIV

(Guan et al., 1999)

MIP-4/DC-CK1

Tabelle 2: Charakteristika von alternativ aktivierten Makrophagen

Diskussion

69

Auslösender Stimulus Zytokinfreisetzung

TNF-α (Asadullah et al., 1999 ; Ito et al., 1999)

cAMP (Asadullah et al., 1999)

Glukokortikoide (Franchimont et al., 1999)

UV-Stahlen (Asadullah et al., 1999; Ullrich, 1994)

Katecholamine (Woiciechowsky et al., 1998 & 1999)

Leishmania major, Toxoplasma gondii, Listeria

monocytogenes, Mykobacterium tuberculosis

(Carrera et al., 1996)

Neuropeptide : α-Melanocten-stimulierendes Hormon

β-Endorphin (Carrera et al., 1996)

IL-10

IFN-β (Lin et al., 1998)

IL-4 /LPS (Lin et al., 1998; Fenton et al., 1992)

IL-10 (Jenkins et al., 1994)

TNF-α (Giri et al., 1994 ; Franchimont et al., 1999)

IL-1-Rezeptorantagonist

Phagozytose von apoptotischen Zellen (Fadok et al., 1998) TGF-β

ACTH, geringe Konzentration von Glukokortikoiden

(Calandra et al., 1995)

Brugia-malayi-Larve, Wucheria bancrofti, Onchocerca

volvulus (Pastrana et al., 1998)

MIF (Bm-MIF)

IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β (Sutterwale et al., 1997)

Leishmania major, Toxoplasma gondii, Listeria

monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis

(Carrera et al., 1996)

Schistosoma-mansoni-Eier (Kalinski et al., 1999)

Fcγ-Bindung, HIV (Sutterwale et al., 1997)

PGE, Cholecalciferol (Kapsenberg et al., 1999)

Erniedrigte Freisetzung von IL-12

Phagozytose apoptotischer Zellen (Fadok et al., 1998) PAF

Tabelle 2: Charakteristika von alternativ aktivierten Makrophagen

AaM besitzen keine Fähigkeit, Mikroorganismen abzutöten. Das von aaM verstärkt

exprimierte Enzym Arginase ist ein Gegenspieler der NO-Synthase; beide konkurrieren

um das limitierte Substrat L-Arginin (Modolell et al., 1995). Die Arginase bildet

L-Ornithin aus L-Arginin und führt über die Erhöhung von Prolin mittels der

Ornithinaminotransferase zur Kollagenproduktion (Gordon, 2003). Eine erhöhte

Kollagenproduktion findet sich auch als Antwort auf O. volvulus in Onchozerkomen.

Die Sauerstoff- und NO-Synthaseproduktion ist erniedrigt. Von besonderer Bedeutung

Diskussion

70

ist die zunehmende Hemmung der Proliferation CD4-positiver T-Zellen im peripheren

Blut durch aaM, die zur Immunsuppression führt (Schebesch et al., 1997).

Alle drei in dieser Studie untersuchten Marker (MMR, CD163 und IL-10) kennzeichnen

eine alternative Aktivierung von Makrophagen bei Onchozerkose. Nach Stimulation

isolierter peripherer Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt zeigte sich nach

eintägiger Kultur eine Erhöhung der IL-10-Konzentration im Überstand. Neben der

IL-10-Konzentration im Kulturüberstand erhöhte sich auf den stimulierten Monozyten

nach dreitägiger Stimulation die Expression des Scavenger-Rezeptors CD163

signifikant. Die Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt hatte ebenfalls eine

geringfügige Erhöhung des Makrophagen-Mannose-Rezeptors auf den Zellen zur Folge.

Die gesteigerte Expression dieser Rezeptoren sowie die geringe IL-6- und TNF-α-

Konzentration nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt in vitro unterstützen

die Annahme der alternativen Aktivierung von Monozyten/Makrophagen bei der

generalisierten Form der Onchozerkose. Exposition der Monozyten mit Extrakt von

O. ochengi führte nach drei Tagen zu einer vermehrten Expression von CD163 und

einer deutlich stärkeren Sekretion von IL-10 im Vergleich zu mit Onchocerca-volvulus-

Extrakt stimulierten Zellen. Der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR), der nach

sechs Tagen gemessen wurde, ergab nach Exposition mit Extrakt von O. ochengi keine

signifikante Erhöhung. Es ist nicht auszuschließen, daß nach drei Tagen Stimulation

eine erhöhte Expression eintritt, wie es bei der Expression des CD163-Rezeptors nach

Stimulation mit Onchocerca-volvulus-Extrakt der Fall war.

In weiteren Untersuchungen wurden Monozyten mit rekombinanten Antigenen von

O. volvulus getestet. Dazu gehörten Onchocystatin (Ov17) (Schönemeyer et al., 2001;

Schierack et al., 2003), ein verkürztes Ov17-Fragment (Ovv17) sowie der Aspartyl-

proteaseinhibitor Ov33 (Lucius et al., 1992). Onchocystatin führte zu einer Hemmung

der T-Zellproliferation und zu einer verstärkten Freisetzung von IL-10 (Hartmann et al.,

1997). Es ließ sich in den Versuchen mit Onchocystatin nur der Trend zu verstärkter

CD163-Expression nachweisen. Weiterhin wurden einige Versuche mit Ecdyson,

welches unter anderem bei O. volvulus gefunden wurde (Mereer et al., 1989; Yates et

al., 1995), durchgeführt. Ecdyson ist ein weniger potentes Steroid als Dexamethason

und kommt vor allem bei Insekten und Würmern vor. Es löste eine geringe Erhöhung

Diskussion

71

der CD163-Expression aus, die sich am stärksten bei einer Konzentration zwischen

40-200 ng/ml nach einem Zeitraum von sechs Tage Stimulation zeigte.

Beim Zerfall von Mikrofilarien, der eine ausgeprägte inflammatorische Immunreaktion

auslösen kann, werden Moleküle aus den Filarien und Wolbachien freigesetzt

(Bryceson et al., 1977; Francis et al., 1985; Ali et al., 2003). Kürzlich wurde wiederholt

gezeigt, daß Oberflächenantigene der Wolbachien eine inflammatorische Immun-

antwort auslösen, deren Ausprägung mit der Menge der zirkulierenden bakteriellen

DNA und von TNF-α korreliert (Keiser et al., 2002; Brattig, 2004). Die Stimulation von

Monozyten mit dem Wolbachienoberflächenprotein WSP aus Dirofilaria immitis, das

eine identische Gensequenz wie WSP aus Onchocerca aufweist (Bazzocchi et al.,

2000), ergab eine ausgeprägte Erhöhung der Expression aller drei Marker, was auf eine

alternative Aktivierung von Makrophagen hindeutet. Die stärkste Expression fand sich

für eine Konzentration von 10 µg/ml WSP. Interessanterweise zeigte sich im Gegensatz

zum Extrakt von unbehandelten Patienten bei Stimulation mit Onchocerca-volvulus-

Extrakt von Patienten, die zur Eliminierung der Wolbachien mit Doxycyclin behandelt

worden waren, keine erhöhte Expression der untersuchten Marker. Wolbachien-

moleküle scheinen daher neben proinflammatorischen Eigenschaften auch an der

Differenzierung von Monozyten zu aaM beteiligt zu sein.

Die Onchozerkose ist eine chronische Erkrankung der Haut und führt zu Granulom-

bildung in der Subkutis. AaM wurden in Fremdkörpergranulomen und bei chronischen

Erkrankungen wie der Psoriasis vermehrt beobachtet (Djemadji-Oudjiel et al., 1996).

Sie regulieren unter anderem die Fibroblastenaktivität durch Induktion von Zytokinen

und Wachstumsfaktoren, die die Proliferation und Kollagensynthese von Fibroblasten

modulieren (Sang et al., 2000). AaM können daher auch an der starken Fibrosierung bei

der Onchozerkose beteiligt sein. Scavenger-Rezeptoren sind charakteristisch für

sogenannte Schaumzellen, welche sich auch bei Arteriosklerose in der Gefäßwand aus

einwandernden Monozyten entwickeln. Diese Makrophagen nehmen oxydierte Lipide

auf und speichern sie. Schaumzellen sind ebenfalls bei der Onchozerkose beobachtet

worden (Burchard et al., 1979; de Villiers & Smart, 1999; Madsen et al., 2001).

IL-10 weist nicht nur immunsuppressive, sondern auch B-Lymphozyten-fördernde

Effekte auf. IL-10 führt nicht zu einer Hemmung der IL-4-induzierten IgE-Sekretion,

Diskussion

72

sondern zu einer verstärkten B-Zellproliferation. Die Expression von CD40, IL-4 und

IL-10 bewirkt neben der verstärkten B-Zellproliferation eine Immunglobulinsekretion

und einen Isotypenwechsel zur IgE-Synthese (Rousset et al., 1992). Hohe

Konzentrationen von IgE stellen ein Hauptcharakteristikum der Filarieninfektion wie

Onchozerkose dar (Ottesen, 1995; Tischendorf et al., 1999).

Gordon (2003) unterscheidet fünf Aktivierungsformen von Makrophagen, wobei neben

Glukokortikoiden nur IL-4 und IL-13 Makrophagen alternativ aktivieren. IL-10, TGF-ß,

IL-1-Rezeptor-Antagonist führen danach zu einer Deaktivierung von Makrophagen, die

ihrerseits IL-10 und TGF-ß bilden. CD163 wird von Gordon als Charakteristikum

alternativ aktivierter Makrophagen aufgeführt. In anderen Veröffentlichungen führen

IL-10, Glukokortikoide und IL-4 in Verbindung mit Glukokortikoiden zu einer

Induktion von CD163 (Kodelja & Goerdt, 1994; Kodelja et al., 1997; Högger et al.,

1998). Über die Rolle von IL-4 und IL-13 als Stimuli gibt es sich widersprechende

Berichte. Die Veröffentlichung von Djemadji-Ondjiel et al. (1996) beschreibt eine

vermehrte Expression des Rezeptors, die unter IL-4 nicht so stark ausfällt wie nach

Stimulation mit IL-10. In anderen Artikeln (van den Heuvel et al., 1999; Sulahian et al.,

2000) wird IL-4 und IL-13 hingegen kein Einfluß auf die Induktion des CD163-

Rezeptors eingeräumt. IL-10 führt laut Gordon zur Deaktivierung von Makrophagen,

was im Gegensatz zur vermehrten CD163- und MMR-Expression steht (Djemadji-

Ondjiel et al., 1996; Büchler et al., 2000; Sulahian et al., 2000).

Insgesamt sprechen die Ergebnisse meiner In-vitro-Studie erstmalig für die Ausbildung

von alternativ aktivierten Makrophagen unter Stimulation mit Onchocerca-volvulus-

und Onchocerca-ochengi-Extrakt. Die Frage, ob und inwieweit WSP in vivo an der

Immunreaktion beteiligt ist, ist noch zu klären. In vitro bewirkt die Exposition von

Monozyten mit Onchocerca-volvulus-Extrakt und Wolbachienoberflächenprotein eine

erhöhte Expression von CD163, MMR und IL-10. Immunhistologische Studien haben

gezeigt, daß Mikrofilarien das WSP enthalten und daß Gewebsmakrophagen

Mikrofilarien bzw. Fragmente der Mikrofilarien und mit diesen WSP aufnehmen

können und dieses auch tatsächlich enthalten (Brattig et al., 2004). Eine mögliche

intensive Interaktion zwischen Makrophagen, Mikrofilarien und Wolbachien ist daher

bei der Auseinandersetzung des Wirts mit der Filarie O. volvulus auch in vivo

anzunehmen.

73

Zusammenfassung

Die Onchozerkose ist eine chronische Infektionskrankheit, bei der die Stadien der

Filarie O. volvulus im immunkompetenten Wirt für lange Zeit überleben. Entzündliche

Reaktionen werden durch ein System von antiinflammatorischen Mechanismen

kontrolliert. Ein Mechanismus repräsentiert dabei die Differenzierung von Monozyten

in alternativ aktivierte Makrophagen. Die durch Suppressormechanismen alternativ

aktivierter Makrophagen bedingte eingeschränkte Immunantwort ist charakteristisch für

die Chronizität der Parasitose.

In der vorliegenden Studie wurden periphere mononukleäre Zellen und gereinigte

Monozyten gesunder Spender mit Onchocerca-volvulus- und Onchocerca-ochengi-

Extrakt stimuliert und die Expression bestimmter Rezeptoren auf Monozyten/

Makrophagen sowie das immunmodulierende Zytokin IL-10 bestimmt. Untersucht

werden sollte, ob es durch Onchocerca-volvulus-Antigene zu einer erhöhten Expression

des Scavenger-Rezeptors CD163, des Makrophagen-Mannose-Rezeptors sowie von

IL-10 kommt. Diese Merkmale sind Indikatoren von alternativ aktivierten

Makrophagen. Die Membranrezeptoren CD163 und MMR wurden auf den stimulierten

Monozyten mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern im Durchflußzytometer (FACS)

untersucht. IL-10 wurde im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt.

Die Expression von CD163 auf Monozyten/Makrophagen und die Konzentration von

IL-10 im Zellkulturüberstand waren nach Stimulation mit Onchocerca-volvulus- und

Onchocerca-ochengi-Extrakt signifikant erhöht. Eine höhere Expression des MMR war

unter den Testbedingungen nur als Trend nachweisbar.

Diese Ergebnisse sprechen für eine Onchocerca-assoziierte Stimulation von Monozyten

zu alternativ aktivierten Makrophagen. Weiterhin konnte nach Stimulation der

gereinigten Monozyten mit dem endobakteriellen Wolbachienoberflächenprotein WSP

nach drei Tagen auf den Zellen eine stark erhöhte CD163-Rezeptorexpression und eine

nur leicht erhöhte Expression des MMR sowie eine erhöhte IL-10-Konzentration im

Kulturüberstand festgestellt werden. Die Stimulation von gereinigten Monozyten mit

Onchocerca-volvulus-Extrakt, der von mit Doxycyclin behandelten Patienten stammte

(Eliminierung der Endobakterien), zeigte dagegen eine signifikant niedrigere

Zusammenfassung

74

Rezeptorexpression und IL-10-Freisetzung als die Stimulation mit Extrakt von

unbehandelten Patienten.

Die Ergebnisse weisen daraufhin, daß WSP eine wesentliche Rolle bei der Induktion

einer alternativen Aktivierung von Monozyten/Makrophagen durch Onchocerca-

volvulus-Extrakt spielt. Alternativ aktivierte Makrophagen können nach diesen neuen

Ergebnissen neben regulatorischen T-Zellen (Th3/Tr1) eine Rolle bei der verminderten

Immunreaktivität der generalisierten Form der Onchozerkose spielen.

75

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Anhang

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Curriculum vitae

Name: Florestan Gerald Höckh

Geburtsdatum: 19. März 1976

Geburtsort: Wiesbaden / Sonnenberg

Schulen und Studium

1982 bis 1986 Grundschule Musberg, Leinfelden-Echterdingen

1986 bis 1992 Albert-Schweitzer-Realschule, Tübingen,

Abschluß: Mittlere Reife

1992 bis 1995 Wirtschaftsgymnasium Tübingen,

Abschluß: Allgemeine Hochschulreife

1997 bis 2003 Studium der Humanmedizin, Universität Hamburg

März 1999 Physikum

März 2001 Erstes Staatsexamen

März 2003 Zweites Staatsexamen

2003 bis 2004 Studium der Humanmedizin, Universität Freiburg

Praktisches Jahr:

Innere Medizin, Universitätsklinikum Freiburg

Chirurgie, Universitätsklinikum Sevilla/Spanien

Wahlfach: Pädiatrie, Universitätsklinikum Freiburg

Nov. 2004 Drittes Staatsexamen

1999 Beginn der Medizinischen Doktorarbeit am Bernhard-Nocht-

Institut für Tropenmedizin, Abteilung für Klinische Chemie

Auslandsaufenthalte

Feb. bis Mai 2004 Chirurgie, Hospital Virgen de Macarena, Univ. Sevilla / Spanien

Sept. 2003 Praktikum, Hospital for Tropical Diseases, London / England

Sept. 1999 Famulatur Pädiatrie, Hospital Heodra, León / Nicaragua

Sprachen

Englisch und Spanisch fließend, Französisch: Anfängerniveau

Anhang

96

Danksagung:

Herrn Priv.-Doz. Dr. med. F. W. Tischendorf danke ich für seine Unterstützung meiner

Arbeit und für die hilfreiche und kritische Beratung bei der Anfertigung der

Dissertation.

Herrn Priv.-Doz. Dr. N. W. Brattig danke ich für die durchgehende Betreuung dieser

Arbeit sowie für die anregenden Gespräche und Diskussionen.

Herrn Prof. Dr. H. Schmitz, Leiter der Abteilung Virologie, danke ich für die

Bereitstellung des Arbeitsplatzes am Durchflußzytometer.

Herrn Dr. M. Ernst, des Forschungszentrums Borstel in Hamburg, danke ich für die

Versorgung mit gereinigten Monozyten.

Besonderer Dank geht an meine Mitdoktoranden Arline Schwohl und Antje Wagner

sowie an Maren Lintzel, Wilfried Grönwoldt und Frank Geisinger für ihre technische

Hilfe und das freundliche Arbeitsklima sowie den Kaffee zwischendurch.

Mein spezieller Dank gilt meiner Familie, die mir nicht nur das Studium der Medizin

ermöglichte. Ein weiterer Dank gilt meinem Freundeskreis für die anregenden

Gespräche und den Zusammenhalt im Studium.

Anhang

97

Eidesstattliche Versicherung

Ich versichere ausdrücklich, daß ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe

verfaßt, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und

die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln

nach Ausgabe, Auflage und Jahr des Erscheinens des benutzten Werkes kenntlich

gemacht habe.

Ferner versichere ich, daß ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer

anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung

zur Promotion beworben habe.

Tübingen, den 12. Februar 2005

Documents

Untersuchungen zur biologischen Wirkung von Onchocerca ...ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2560/pdf/MedDissertationFG... · Onchocerca-volvulus-Proteinen auf Monozyten / Makrophagen