UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA TANJA …

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

TANJA GNIDOVEC

VEZAVA IZBRANIH FLUORESCENČNO OZNAČENIH

EGEROLIZINOV, OSTREOLIZINA A IN ERILIZINA A NA

IN VITRO KULTURO NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC IN

ČLOVEŠKE CELICE USTNE SLUZNICE

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2017

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in kemija

TANJA GNIDOVEC

Mentorica: prof. dr. KRISTINA SEPČIĆ

Somentor: dr. MATEJ SKOČAJ

VEZAVA IZBRANIH FLUORESCENČNO OZNAČENIH EGEROLIZINOV,

OSTREOLIZINA A IN ERILIZINA A NA IN VITRO KULTURO

NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC IN ČLOVEŠKE CELICE USTNE

SLUZNICE

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2017

Gnidovec, T., Vezava izbranih fluorescenčno označenih egerolizinov, ostreolizina A in erilizina A na in vitro kulturo nediferenciranih živčnih celic in človeške celice ustne sluznice. Dipl. delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, 2017

ii

Diplomsko delo je zaključek dodiplomskega univerzitetnega študijskega programa

Dvopredmetni učitelj: biologija in kemija. Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za

biokemijo na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani ter na Institutu za

biologijo celice Medicinske fakultete v Ljubljani.

Študijska komisija Pedagoške fakultete je 7. maja 2017 odobrila predlagano temo

diplomske naloge z naslovom Vezava izbranih fluorescenčno označenih egerolizinov,

ostreolizina A in erilizina A na in vitro kulturo nediferenciranih živčnih celic in človeške

celice ustne sluznice.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Peter Maček

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Somentor: asist. dr. Matej Skočaj

Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biologijo

celice

Recenzentka: doc. dr. Andreja Erman

Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biologijo

celice

Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne

knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski

obliki, identična tiskani verziji.

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.


iii

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 577:6(043.2)

KG ostreolizin A/erilizin A/nediferencirane živčne celice/celice ustne sluznice

AV GNIDOVEC, Tanja

SA SEPČIĆ, Kristina (mentor)/SKOČAJ, Matej (somentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program Kemija in Biologija

LI 2017

IN VEZAVA IZBRANIH FLUORESCENČNO OZNAČENIH EGEROLIZINOV, OSTREOLIZINA A IN ERILIZINA A NA IN VITRO KULTURO NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC IN ČLOVEŠKE CELICE USTNE SLUZNICE

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP VIII, 34 str., 4 sl., 47 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Egerolizini so družina proteinov, katerih pomembna lastnost je vezava na specifične lipide in lipidne membranske mikrodomene, zato so primerno orodje za označevanje ali tarčno uničevanje specifičnih celičnih vrst. Ostreolizin A (OlyA) je egerolizin iz užitne gobe Pleurotus ostreatus. Za OlyA je značilno, da se specifično veže na naravne in umetne lipidne membrane, ki so obogatene s sfingomielinom in holesterolom. Pred kratkim so iz gobe Pleurotus eryngii izolirali protein erilizin A (EryA), ki se veže na ceramid fosfoetanolamin (CPE), sfingolipid prisoten v plazmalemi žuželk, v nekaterih parazitih in bakterijah. V okviru diplomskega dela smo preverili sposobnost vezave rekombinantnih fluorescenčno označenih egerolizinov OlyA-eGFP in EryA-mCherry na celice človeške ustne sluznice. Ugotovili smo, da se protein OlyA-eGFP veže na plazmalemo celic človeške ustne sluznice, medtem ko se EryA-mCherry na iste celice, za katere je znano, da ne vsebujejo CPE, ni vezal. Proučevali smo tudi vezavo OlyA-eGFP in EryA-mCherry na kulturo nediferenciranih živčnih celic, katerih plazmalema naj bi poleg prevladujočega sfingomielina in holesterola vsebovala tudi nizko količino CPE. Ugotovili smo, da se OlyA-eGFP veže na plazmalemo teh celic in da je torej primeren membranski označevalec s sfingomielinom in holesterolom obogatenih domen plazmaleme tudi nediferenciranih živčnih celic, medtem ko se protein EryA-mCherry zaradi verjetno prenizke količine CPE v plazmalemi nediferenciranih živčnih celic na te celice ni vezal in torej ni primerna molekula za označevanje CPE v plazmalemi.


iv

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dn

DC UDC 577:6(043.2)

CX ostreolysin A/erylysin A/ non-differentiated neurons/oral mucose cells

AU GNIDOVEC, Tanja

AA SEPČIĆ, Kristina (supervisor)/SKOČAJ, Matej (co-advisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University od Ljubljana, Faculty of Education, Biotehnical Faculty, Academic Study Programme Chemistry and Biology

PY 2017

TI BINDING OF FLUORESCENTLY LABELLED AEGEROLYSINS OSTREOLYSIN A AND ERYLYSIN A TO IN VITRO CULTURE OF NON-DIFFERENTIATED NEURONS AND ORAL MUCOSE CELLS

DT Graduation thesis (University studies)

NO VIII, 34 p., 4 fig., 47ref.

LA sl

AL sl/en

AB Members of the aegerolysins protein family are unique in their binding to specific lipids and lipid membrane domains. They can be used as specific membrane markers, or as tools for targeting specific cell types. Ostreolysin A (OlyA) is an aegerolysin from the edible oyster mushroom Pleurotus ostreatus. OlyA was shown to bind to biological and artificial lipid membranes enriched with sphingomyelin and cholesterol. Recently discovered erylysin A (EryA) from the mushroom Pleurotus eryngii specifically binds to ceramide phosphoethanolamine (CPE), a sphingolipid found in higher quantities in cell membranes of insects, some parasites and bacteria. We tested the lipid-binding activity of recombinant fluorescently-labelled aegerolysins OlyA-eGFP and EryA-mCherry to oral mucose cells. We found that OlyA-eGFP binds to plasma membrane of oral mucose cells, but the binding of EryA-mCherry on plasma membrane of oral mucose cells, which do not contain CPE, was not shown. We tested the binding specifity of OlyA-eGFP in EryA-mCherry on in-vitro culture of non-differntiated neurons, whose plasma membrane is enriched with sphingomyelin and cholesterol, and also contain trace amount of CPE. We found that OlyA-eGFP binds on plasma membrane of these cells and therefore could be used as a specific membrane marker for membrane rafts in neural cells. The binding of EryA-mCherry on non-differntiated neurons was not detected – probably because of too low amount of CPE in their plasma membranes - and thus EryA could not be used as specific membrane marker for CPE in these cells.


v

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ............................................................................................................................................... 9

1.1 OPREDELITEV PROBLEMA ........................................................................................................ 9

1.2 CILJI IN HIPOTEZE ................................................................................................................... 10

2 PREGLED OBJAV ............................................................................................................................. 12

2.1 EGEROLIZINSKA DRUŽINA PROTEINOV ................................................................................. 12

2.1.1 Biokemijske lastnosti egerolizinov ................................................................................ 12

2.1.2 Interakcije egerolizinov z lipidnimi membranami ......................................................... 13

2.1.3 Uporaba egerolizinov v biomedicini .............................................................................. 13

2.2 OSTREOLIZIN A ...................................................................................................................... 14

2.3 ERILIZIN A .............................................................................................................................. 15

2.4 BIOLOŠKE MEMBRANE IN NJIHOVA SESTAVA ....................................................................... 16

2.4.1 Glavne skupine lipidov v bioloških membranah ............................................................ 17

2.4.2 Membranski rafti ........................................................................................................... 17

2.4.3 Holesterol ...................................................................................................................... 18

2.4.4 Sfingomielin in ceramid fosfoetanolamin ..................................................................... 18

3 MATERIALI IN METODE ................................................................................................................. 20

3.1 MATERIALI ............................................................................................................................. 20

3.1.1 Kemikalije ...................................................................................................................... 20

3.1.2 Laboratorijska oprema .................................................................................................. 20

3.2 METODE ................................................................................................................................. 21

3.2.1 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A NA ČLOVEŠKE

CELICE USTNE SLUZNICE ................................................................................................................ 21

3.2.2 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA NA CELIČNO

KULTURO NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC .............................................................................. 22

4 REZULTATI...................................................................................................................................... 24


vi

4.1 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A NA ČLOVEŠKE

CELICE USTNE SLUZNICE .................................................................................................................... 24

4.2 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A NA

NEDIFERENCIRANE ŽIVČNE CELICE .................................................................................................... 24

5 RAZPRAVA ..................................................................................................................................... 26

6 SKLEPI ............................................................................................................................................ 27

7 POVZETEK ...................................................................................................................................... 28

8 SEZNAM LITERATURE .................................................................................................................... 29

9 VIRI SLIK ......................................................................................................................................... 34


vii

KAZALO SLIK

Slika 1: Model tekočega mozaika po Singerju in Nicolsonu (1972). ........................................ 16

Slika 2: Razlike v strukturi ceramid fosfoetanolamina in sfingomielina. ................................. 19

Slika 3: Z OlyA-eGFP in EryA-mCherry označene človeške celice ustne sluznice. .................... 24

Slika 4: Z OlyA-eGFP (A) in EryA-mCherry (B) označene nediferencirane živčne celice. .......... 25


viii

SEZNAM KRATIC

AK

Asp-hemolizin

CPE

EryA

EryB

Hol

MACPF

Oly A

Oly B

PlyB

SM

aminokislina

hemolizini iz organizma Aspergillus furmigatus

ceramid fosfoetanolamin

erilizin A

erilizin B

holesterol

kompleks, ki napade membrano/perforin

ostreolizin A

ostreolizin B

pleurotolizin B

sfingomielin


9

1 UVOD

1.1 OPREDELITEV PROBLEMA

Glive so vir najrazličnejših organskih molekul, zato se jih s pridom izkorišča za prehrano ljudi

in živali. Njihove farmakološko aktivne spojine se uporablja v medicinske namene in kot

biotehnološka orodja (Nayak in sod., 2013). Ekonomsko so torej zelo pomembne, prav tako

pa vzbujajo veliko zanimanj v raziskovanju, še posebej njihovi proteini (Ngai in Ng, 2006).

Berne in sod. so leta 2002 iz užitnih gob bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) in

topolovke (Agrocybe aegerita) izolirali in biokemijsko opredelili citolitična proteina

ostreolizin (Oly) in egerolizin. Po slednjem je poimenovana egerolizinska družina proteinov.

Shibata in sod. (2010) so iz možininega ostrigarja (Pleurotus eryngii) izolirali bikomponentni

hemolizin, ki je sestavljen iz proteinov erilizina A (EryA) in erilizina B (EryB). Naknadno so

ugotovili, da je tudi Oly sestavljen iz dveh komponent, ki so jih poimenovali OlyA in

pleurotolizin B (PlyB) (Tomita in sod., 2004, Ota in sod., 2013). EryA in OlyA na podlagi

biokemijskih značilnosti uvrščamo med egerolizine. Egerolizini so družina proteinov, veliki

med 13 in 20 kDa, z značilno strukturo β-plošče in so razširjeni med različnimi bakterijskimi in

evkariontskimi (živali, rastline, glive) taksoni ter celo pri virusih (Berne in sod., 2009).

Egerolizini iz rodu Pleurotus spp. (pleurotolizin A (PlyA), OlyA in EryA) sami po sebi niso

hemolitični in se na lipidne membrane le vežejo. Za hemolizo in tvorbo funkcionalne pore v

membranah tarčnih celic potrebujejo dodaten protein in sicer takega, ki ima domeno

MACPF/CDC (ang. Membrane Attack Complex/Perforin/Cholesterol Dependant Cytolysins)

(Ota in sod., 2014; Novak in sod., 2015).

Poglavitna lastnost egerolizinov je njihova selektivna vezava na specifične lipide ali specifične

membranske mikrodomene. Sepčić in sod. (2004) so dokazali, da se naravni izolat Oly veže

na biološke in umetne lipidne membrane, ki so obogatene s sfingomielinom in holesterolom

ali z nasičenimi glicerofospolipidi in holesterolom. Kasneje je ista skupina tudi pokazala, da se

rekombinantni OlyA označen s fluorescenčnim proteinom mCherry (OlyA-mCherry)


10

specifično veže na plazmalemo ledvičnih pasjih epitelnih celic MDCK (ang. Madin-Darby

canine kidney) (Skočaj in sod., 2014). Skupina iz Japonske (Bhat in sod., 2015) je v

nadaljevanju s pomočjo raziskav na liposomih ugotovila, da se EryA specifično veže na

kombinacijo lipidov ceramid fosfoetanolamina (CPE) in holesterola (1 : 1), medtem ko ne

prepozna lipidne kombinacije sfingomielin : holesterol (1 : 1), kar je značilno za OlyA, ki

prepozna obe omenjeni lipidni kombinaciji. Egerolizini so torej primerne molekule za

označevanje in raziskovanje lipidov in membranskih lipidnih domen. Njihovo značilno

citolitično delovanje (ob prisotnosti partnerskega MACPF/CDC proteina) lahko služi za tarčno

uničevanje specifičnih tipov celic, z njimi lahko omogočimo tudi tarčni vnos molekul v

notranjost celic, protitelesa proti egerolizinom pa lahko uporabimo v imunološki diagnostiki

(Novak in sod., 2015).

1.2 CILJI IN HIPOTEZE

Ceramid fosfoetanolamin je poglavitni sfingolipid lipid v plazmalemi nekaterih

nevretenčarjev, medtem ko v plazmalemi sesalcev močno prevladuje sfingolipid

sfingomielin. Na podlagi ugotovitve Slotte-ja in sod. (2013), da je v živčnih celicah

vretenčarjev poleg dominantno prisotnega sfingomielina, v majhnih količinah opaziti tudi

CPE, smo želeli preveriti interakcijo fluorescenčno označenih rekombinantnih egerolizinov

EryA-mCherry in OlyA-eGFP z membranami nediferenciranih živčnih celic in vitro. Ugotoviti

smo želeli, ali se po kemijski fiksaciji celic fluorescenčno označena OlyA in EryA vežeta na

nediferencirane živčne celice v kulturi. Prav tako smo želeli preveriti vezavo obeh

fluorescenčno označenih proteinov na celice ustne sluznice, ker v njihovi plazmalemi ni CPE.

Hipoteze:

o Predvidevamo, da se bo fluorescenčno označeni rekombinantni OlyA (OlyA-eGFP)

vezal na plazmalemo nediferenciranih živčnih celic, saj je za ta egerolizin značilno, da

se specifično veže na s sfingomielinom in holesterolom obogatene membranske

domene, ki so v plazmalemi tega celičnega tipa prisotne.


11

o Predvidevamo, da se bo fluorescenčno označeni rekombinantni EryA (EryA-mCherry)

vezal na plazmalemo nediferenciranih živčnih celic, saj se v njih nahaja majhna

količina CPE.

o Predvidevamo, da se bo OlyA-eGFP vezal na plazmalemo celic ustne sluznice, saj je za

ta egerolizin značilno, da se specifično veže na s sfingomielinom in holesterolom

obogatene membranske domene, ki so v plazmalemi tega celičnega tipa prisotne.

o Predvidevamo, da se EryA-mCherry ne bo vezal na plazmalemo celic ustne sluznice,

saj se v njih ne nahaja CPE.


12

2 PREGLED OBJAV

2.1 EGEROLIZINSKA DRUŽINA PROTEINOV

Proteinska družina egerolizinov je poimenovana po egerolizinu, izoliranem iz užitne gobe

Agrocybe aegerita (Berne in sod., 2002), ki ga kodira gen Aa-PriA1 (Fernandez Espinar in

Labarere, 1997). Prvi hemolitično aktiven egerolizinski protein, izoliran leta 1975 iz patogene

gobe Aspergillus furmigatus, je bil Asp-hemolizin (Sakaguchi in sod., 1975). Do sedaj je bilo

odkritih in v družino egerolizinov (Pfam 06355, InterPro IPR009413) uvrščenih preko 350

proteinov (Novak in sod., 2015). Večina genov, ki kodirajo egerolizine, je prisotnih v genomih

predstavnikov debel Ascomycota in Basidiomycota, ki pripadata kraljestvu gliv (Vidic in sod.,

2005). Največ egerilizin-kodirajočih genov naj bi imele vrste iz rodu Aspergillus (Galagan in

sod., 2003).

Visoko koncentracijo egerolizinov kot so OlyA, Aa-PriA1 in EryA so dokazali v primordijih in

plodiščih gliv (Berne in sod., 2002, Fernandez Espinar in Labarere, 1997, Joh in sod., 2007,

Kurahashi in sod., 2014, Lee in sod., 2002, Vidic in sod., 2005). Biološka vloga egerolizinov še

ni povsem jasna, verjetno pa igrajo pomembno vlogo v razvoju gliv (Berne in sod., 2009,

Nayak in sod., 2013, Ota in sod., 2014, Vesper in Vesper, 2004) in so kot pleiotropni proteini

vključeni v različne fiziološke procese. Ravno zaradi njihove raznolike funkcionalnosti so

potencialno biotehnološko orodje (Novak in sod., 2015).

2.1.1 Biokemijske lastnosti egerolizinov

Egerolizini so proteini, ki jim je skupna relativno majhna molekulska masa (13 - 20 kDa) ter

relativno nizka izoelektrična točka. Pri višjih temperaturah so nestabilni, njihovo

membransko aktivnost pa zaznamo v širokem območju pH lestvice (Berne in sod., 2009,

Novak in sod., 2015).

V egerolizinski proteinski domeni so zelo pomembni aromatski (10 %) in nabiti aminokislinski

ostanki (20-24 %). Pri egerolizinih iz debel Ascomycota in Basidiomycota so prisotni še skupki

negativno nabitih aminokislinskih ostankov (Berne in sod., 2009). Kudo in sod. (2002) so


13

pokazali, da se Asp-hemolizin, ki vsebuje te negativno nabite aminokislinske ostanke, veže z

oksidiranimi lipoproteini majhne gostote in lizofosfatidilholinom. Kot so predlagali Sakurai in

sod. (2004), bi lahko bili ti skupki ključni pri prepoznavanju holinskega dela sfingomielina.

Preostali del egerolizinske proteinske domene predstavljajo cisteinski in določeni triptofanski

aminokislinski ostanki, ki jim pripisujemo zelo verjetno funkcionalno in strukturno vlogo. Za

hemolitično delovanje Oly in Asp-hemolizina je pomemben cisteinski ostanek (Berne in sod.,

2002, Kudo in sod., 2002).

2.1.2 Interakcije egerolizinov z lipidnimi membranami

Prvi izoliran egerolizin Asp-hemolizin je hemolitičen protein, saj v membranah eritrocitov

tvori značilne pore, kar vodi v hemolizo (Sakaguchi in sod., 1975). Kasneje so dokazali, da se

tudi OlyA (Ota in sod., 2013), PlyA (Tomita in sod., 2004) in EryA (Shibata in sod., 2010)

vežejo na površino tako umetnih kot naravnih membran, vendar pa sami po sebi niso

hemolitično aktivni. Našteti proteini (OlyA, PlyA in EryA) namreč delujejo hemolitično le v

primeru tvorbe bikomponentnega citolitičnega kompleksa, ki ga oblikujejo s proteinskim

partnerjem B, ki ima domeno MACPF/CDC (Anderluh in sod., 2014, Ota in sod., 2013, Shibata

in sod., 2010, Tomita in sod., 2004). Bikomponentni kompleks pleurotolizina je na primer

sestavljen iz 26 molekul PlyA, ki na lipidnih membranah prepoznajo in se vežejo na domene

obogatene s sfingomielinom in holesterolom, in 13 molekul pleurotolizina B (PlyB). Po

oligomerizaciji teh podenot nastane proteinski kompleks (700 kDa), ki tvori

transmembransko poro (Lukoyanova in sod., 2015).

2.1.3 Uporaba egerolizinov v biomedicini

Ker so egerolizini sposobni vezave na specifične lipide in specifične membranske domene,

lahko služijo kot proti-tumorske, proti-proliferacijske ali protibakterijske spojine (Berne in

sod., 2009). Mnoge glive, v katerih so egerolizini, povzročajo okužbe gostiteljskih

organizmov.. Protitelesa, ki zavirajo aktivnost egerolizinov, lahko uporabimo kot

biotehnološka orodja v imunološki diagnostiki (Novak in sod., 2015). Tako je na primer Asp-

hemolizin smrtno nevaren toksin, ki pri osebah s šibkim imunskim sistemom lahko privede


14

do zapletov pri aspergilozi (Berne in sod., 2009). Z uporabo protiteles proti Asp-hemolizinu

so na laboratorijskih miškah preprečili takšno infekcijo. Potencialno bi torej protitelesa proti

Asp-hemolizinu lahko uporabljali tudi pri osebah z oslabelim imunskim sistemom (Ebina in

sod., 1994). Velik potencial in uporabno vrednost pa imajo egerolizini tudi kot membranski

označevalci, kar je posledica njihove selektivnosti za različne lipide in kombinacije lipidov.

OlyA, ki se veže na membranske lipidne domene obogatene s sfingomielinom in

holesterolom ter EryA, ki prepozna lipid CPE, spadata med egerolizinske membranske

označevalce, ki ju bom v nadaljevanju podrobneje predstavila (Sepčić in sod., 2004, Skočaj in

sod., 2014, Bhat in sod., 2015).

2.2 OSTREOLIZIN A

Bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus) je nepatogena, užitna lesna gliva, ki je razširjena v

gozdovih Evrope, Severne Amerike in Azije (Cohen in sod., 2002). Iz plodnih teles bukovega

ostrigarja so Berne in sod. (2002) izolirali 15 kDa velik protein egerolizin OlyA. Po

aminokislinski sekvenci se skoraj popolnoma ujema s PlyA, ki ga prav tako uvrščamo v

egerolizinsko družino proteinov (Tomita in sod., 2004). Ugotovili so, da se PlyA in OlyA

vežeta na celične membrane, vendar sama po sebi nista citolitična. Sepčić in sod. (2004) so

pokazali, da se nativni izolat Oly veže na umetne in biološke membrane obogatene s

sfingomielinom in holesterolom. Pozneje so ugotovili, da je bil ta naravni izolat hemolitičen,

ker je poleg OlyA vseboval tudi primesi komponente PlyB. Hemolitično aktivnost OlyA le v

obliki bikomponentnega kompleksa so potrdili s ponovno izolacijo in čiščenjem ter pripravo

rekombinantnih proteinov (Ota in sod., 2013).

Ker je OlyA za žive celice netoksična molekula, predstavlja izvrsten označevalec

membranskih raftov, torej lipidnih domen, ki so obogatene s sfingomielinom in

holesterolom (Ota in sod., 2013). Skočaj in sod. (2014) so na pasjih ledvičnih epitelnih celicah

MDCK in umetnih membranskih sistemih preverjali vezavo fluorescenčno označenega OlyA

(OlyA-mCherry) na membranske domene, ki vsebujejo sfingomielin in holesterol. Pokazali so,

da se OlyA-mCherry veže na kombinacijo dveh najpomembnejših raftnih lipidov,

sfingomielina in holesterola, in da je za celice netoksičen. Ugotovili so tudi, da se v živih


15

celicah MDCK, OlyA-mCherry internalizira preko kaveol in po 90 min pride v bližino jedra. Na

podlagi zgornjih ugotovitev lahko zaključimo, da je OlyA-mCherry obetaven označevalec

membranskih domen, obogatenih s sfingomielinom in holesterolom, tako v živih kot tudi v

predhodno fiksiranih celicah. Kasneje so Bhat in sod. (2015) ugotovili, da so tarča vezave

OlyA tudi membrane sestavljene iz CPE : holesterola (1 : 1).

2.3 ERILIZIN A

Ngai in Ng (2006) sta iz glive Pleurotus erygii izolirala domnevno hemolitičen protein

eringeolizin. Na podlagi N-sekvencioniranja prvih 40 aminokislin so pokazali kar 80%

ujemanje z N-terminalnim koncem OlyA in egerolizina. Leta 2010 so Shibata in sod. iz iste

gobe izolirali nov egerolizin poimenovan Ery. Hemolitično aktivnost le tega so opazili le ob

hkratni prisotnosti proteinov EryA in EryB.

EryA je prisoten v obliki 15 kDa velikega proteina, komponenta B tj. EryB pa je velika 52 kDa.

EryA in EryB sta zelo podobna PlyA in PlyB po molekulski masi in aminokislinski sekvenci

(Shibata in sod., 2010).

Bhat in sod. (2015) so pokazali vezavo EryA na umetne lipidne vezikle sestavljene iz CPE :

holesterola (1 : 1), medtem ko se na vezikle s sestavo sfingomielin : holesterol (1 : 1) EryA ni

vezal. EryA so v tej študiji pripravili kot rekombinantni fluorescenčno označeni fuzijski

protein EryA-eGFP. EryA-eGFP so v nadaljevanju uspešno uporabili kot označevalec parazita

Tripanosoma brucei, za katerega je znano, da vsebuje CPE ne pa tudi sfingomielina.


16

2.4 BIOLOŠKE MEMBRANE IN NJIHOVA SESTAVA

Plazmalema je za celico ključna, saj jo obdaja, definira njeno obliko in jo zamejuje od okolice.

S svojo selektivno prepustnostjo vzdržuje razlike med citoplazmo in okolico ter tako omogoči

normalno delovanje celic (Alberts in sod., 2002). Leta 1972 sta Singer in Nicolson predstavila

model tekočega mozaika bioloških membran, ki ponazarja sestavo celične membrane. Vse

biološke membrane v osnovi sestavlja fosfolipidni dvosloj, med lipidne molekule pa so

zasidrani skupki proteinov, ki so lahko periferni ali transmembranski. Posamezne molekule

znotraj dvosloja lahko difundirajo, zato označimo lipidni dvosloj kot fluiden (Alberts in sod.,

2002). V devetdesetih letih prejšnjega stoletja pa je bil postavljen model membranskih

mikrodomen, ki kaže na to, da v membranah obstajajo lateralne zgostitve lipidov t.i. lipidne

domene ali membranski rafti, katerih sestava in fizikalno stanje nista enaka povprečnemu

stanju v membrani (Simons in Ikonnen, 1997).

Slika 1: Model tekočega mozaika po Singerju in Nicolsonu (1972).

Povzeto po Singer in Nicolson, 1972.


17

2.4.1 Glavne skupine lipidov v bioloških membranah

V membranah vretenčarjev zasledimo med deset tisoč in sto tisoč različnih vrst lipidnih

molekul (Lingwood in Simons, 2010). Glede na kemijsko zgradbo lahko lipide v osnovi

razdelimo na tri glavne skupine. V membranah evkariontov največji delež lipidov

predstavljajo glicerofosfolipidi, med katere uvrščamo fosfatidilholin, fosfatidilserin,

fosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol in fosfatidno kislino. Glicerofosfolipidi so kemijsko estri

dveh maščobnih kislin (s 14 do 20 ogljikovimi atomi) in glicerola, na katerega je vezana še

fosfatna skupina. Pri evkariontih več kot 50 % membranskih glicerofosfolipidov predstavlja

fosfatidilholin. Molekule fosfatidilholina so pri sobni temperaturi v tekočem stanju, saj imajo

v svoji strukturi pogosto vključeno vsaj eno cis-nenasičeno acilno verigo (van Meer in sod.,

2008). Druga pomembna skupina lipidov so sfingolipidi, kamor uvrščamo sfingomielin in

glikosfingolipide. Sfingolipidi imajo za razliko od glicerofosfolipidov nasičene ali trans-

nenasičene nepolarne acilne verige. Zaradi svoje strukture se lahko urejajo bližje skupaj in pri

sobni temperaturi preidejo v gel-stanje, v kolikor niso prisotni steroli, ki so tretji pomemben

razred lipidov v evkariontskih membranah (van Meer in sod., 2008).

2.4.2 Membranski rafti

Membranski rafti so nanometrske domene plazmaleme celice, obogatene s sfingolipidi,

holesterolom in specifičnimi proteini. Lipidne molekule so med sabo tesno pakirane, vendar

je kljub temu znotraj membranskih raftov prisotna velika lateralna difuzija (Simons in

Ikonnen, 1997; Pike, 2004). Dinamičnost in spremenljiva sestava membranskih raftov na

časovni skali manjši od sekunde je velik izziv pri njihovem preučevanju (Kenworthy in sod.,

2000; Hancock, 2006).

Membranski rafti so udeleženi v številnih, za organizem poglavitnih bioloških procesih.

Delujejo kot platforme za ustaljene signalizacijske poti, sodelujejo pri prenosu bioloških

signalov, pri membranskem transportu, vpleteni so v proces vstopa patogenih

mikroorganizmov v celice in pri vezavi specifičnih ligandov (Simons in Ikonnen, 1997;

London, 2002; Lingwood in Sions, 2010; Simons in Gerl, 2010).


18

2.4.3 Holesterol

Holesterol je eden najpomembnejših lipidov v celicah sesalcev. Njegova prisotnost v

plazmalemi poveča njihovo urejenost, hkrati pa omogoča tvorbo urejene lipidne faze ter s

tem lateralnih lipidnih domen. Holesterol je ključna komponenta pri mnogih celičnih

dogodkih, kot so prenosi signalov, ter procesi endocitoze in eksocitoze (Wüstner, 2007). Je

prekurzor sintezne poti žolčnih kislin, steroidnih hormonov, oksisterolov in nevrosteroidov

(Porter in Herman, 2011). Ravno zaradi njegove vloge pri vitalnih celičnih procesih ga

povezujejo z nekaterimi obolenji kot so Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen (Liu in sod.,

2010), Niemann-Pickov sindrom (Schulze in Sandhoff, 2011), ateroskleroza in

kardiovaskularna obolenja ter različne genetsko pogojene bolezni (Porter in Herman, 2011).

2.4.4 Sfingomielin in ceramid fosfoetanolamin

Membrane celic se med živalskimi vrstami razlikujejo po vsebnosti različnih sfingolipidov. Pri

vretenčarjih je najpomembnejši sfingolipid sfingomielin, ki je vključen predvsem v zunanji

sloj plazmaleme (Ohanian in Ohanian, 2001). Poleg tega, da je osnovni gradnik plazmaleme,

ima pomembno vlogo tudi pri znotrajcelični komunikaciji, saj ob hidrolizi sfingomielina

nastaja ceramid, ki ima funkcijo sekundarnega obveščevalca v celici (Hannun, 1996). Pri

nekaterih nevretenčarjih in parazitih je najpomembnejši membranskih sfingolipid ceramid

fosfoetanolamin (CPE), ki ga v celicah sesalcev zaznamo le v sledovih (Bhat in sod., 2015).

CPE in sfingomielin se razlikujeta v kemijski strukturi polarne glave. Polarna glava je v

primeru CPE sestavljena iz fosfoetanolamina, pri sfingomielinu pa polarno glavo predstavlja

fosfoholin. Posledica razlike v kemijski strukturi je je večja sposobnost tvorbe močnejših

medmolekulskih interakcij v membranah z več CPE kot med lipidnimi molekulami

sfingomielina, kar se odraža tudi v lastnostih plazmaleme. Sfingomielin se v membranskih

raftih povezuje z molekulami holesterola, medtem ko je interakcija CPE s holesterolom

slabša (Térová in sod., 2005). Na primeru vinske mušice Drosophila melanogaster so

dokazali, da je za sintezo CPE v veliki večini ogovorna CPE sintaza (CPES) v Golgijevem

aparatu, ki pri svojem delovanju kot donor funkcionalnih skupin uporabi citidin difosfat

etanol-amin (Vacaru in sod., 2013). Sintezo CPE v celicah sesalcev pa katalizirata encima

SMSr (ang. SM synthase-related) in SM sintaza 2 (Vacaru in sod., 2009, Ternes in sod., 2009)


19

v endoplazemskem retikulumu. SMSr omogoča prenos polarne glave fosfatidiletanolamina

do ceramida in s tem tvorbo CPE samo v sledovih kot negativni regulator količine ceramida v

endoplazemskem retikulumu (Bhat in sod., 2015).

Slika 2: Razlike v strukturi ceramid fosfoetanolamina in sfingomielina.


20

3 MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

3.1.1 Kemikalije

- fosfatni pufer - 0.2 M NaH2PO4 in 0.2 M Na2HPO4 v razmerju 1:4 (Merck)

- sredstvo proti bledenju Vectashield z dodatkom 4',6-diamiino-2-fenilindol (DAPI)

(Vector laboratories, Združene države Amerike)

- paraformaldehid (Sigma)

- destilirana voda

- 2 % raztopina paraformaldehida v fosfatnem pufru

- OlyA-eGFP

- EryA-mCherry

3.1.2 Laboratorijska oprema

- pipeta (Eppendorf, Nemčija)

- objektna in krovna stekelca (Brand, Nemčija)

- 2 ml centrifugirke (Eppendorf, Nemčija)

- kapalke (Brand, Nemčija)

- fluorescenčni mikroskop AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Nemčija)

- digestorij (Weemann, GMBH)

- lesena palčka (ZARYS, Poljska)

- hladilnik (Gorenje, Slovenija)

- zamrzovalnik (Gorenje, Slovenija)

- kadička – stojalo za stekelca

- čaše

- parafilm (Bemis, Združene države Amerike)

- petrijevka

- filtrirni papir

- steklena palčka

- prozoren lak za nohte


21

3.2 METODE

3.2.1 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A NA

ČLOVEŠKE CELICE USTNE SLUZNICE

3.2.1.1 PRIPRAVA VZORCA ČLOVEŠKIH CELIC USTNE SLUZNICE

Človeške celice ustne sluznice smo pridobili s pomočjo lesene palčke, s katero smo naredili

bris ustne sluznice s predela lica. Vzorec celic smo nanesli na objektno stekelce in počakali,

da se posuši na zraku. Celice smo nato v digestoriju fiksirali z 2 % raztopino

paraformaldehida v fosfatnem pufru (PBS) za 5 min. Po končani fiksaciji smo preparat

večkrat sprali s fosfatnim pufrom.

3.2.1.2 OZNAČEVANJE CELIC ČLOVEŠKE USTNE SLUZNICE S FLUORESCENČNO

OZNAČENIMA EGEROLIZINOMA ERILIZINOM A IN OSTREOLIZINOM A

Tako fiksirane in pripravljene človeške celice ustne sluznice smo najprej izpostavili

rekombinantnemu fluorescenčno označenemu egerolizinu EryA (EryA-mCherry). S pipeto

smo na celice nanesli 100 µL 1 µM EryA-mCherry in jih prenesli v temno vlažno komoro. Po

10 min inkubacije smo preparat dvakrat spirali s fosfatnim pufrom. Na spran preparat smo

nato nanesli še z 100 µL 1 µM rekombinantnega fluorescenčno označenega OlyA (OlyA-

eGFP) in inkubirali še nadaljnjih 10 min v temni vlažni komori. Po končani inkubaciji smo

preparat ponovno spirali s fosfatnim pufrom in nato nanesli sredstvo proti bledenju

Vectashield z barvilom DAPI, ki obarva celična jedra modro. Preparat smo pokrili s krovnim

stekelcem, ki smo ga utrdili z lakom za nohte. Pripravljen preparat smo shranili v hladilniku

pri 4° C.

3.2.1.3 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA ČLOVEŠKIH CELIC USTNE SLUZNICE PO

OZNAČEVANJU S FLUORESCENČNO OZNAČENIMA EGEROLIZINOMA ERILIZINOM A

IN OSTREOLIZINOM A

Fiksirane in označene celice človeške ustne sluznice smo nato opazovali z epifluorescenčnim

mikroskopom AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Nemčija). Zasledovali smo vezavo rekombinantnih


22

fluorescenčno označenih egerolizinov OlyA in EryA na plazmalemo. Preverili smo, ali je

plazmalema obarvana s fluorescenčnim zelenim barvilom (vezava OlyA-eGFP), ali/in je

plazmalema celic obarvana rdeče (vezava EryA-mCherry). Mikroskopske posnetke smo

analizirali s programom AxioVision (Carl Zeiss, Nemčija).

3.2.2 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA NA CELIČNO

KULTURO NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC

3.2.2.1 PRIPRAVA PREPARATA NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC

Celična linija nediferenciranih živčnih celic SH-SY5Y (ATCC® CRL- 2266™) je bila vzgojena na

Odseku za biotehnologijo Inštituta Jožef Stefan, ker smo celice fiksirali z 2 % raztopino

paraformaldehida v fosfatnem pufru (PBS) in jih nato prenesli na Inštitut za biologijo celice

Medicinske fakultete v Ljubljani. Tam smo nadaljevali z označevanjem fiksiranih celic z

rekombinantnima fluorescenčno označenima egerolizinoma OlyA-eGFP in EryA-mCherry.

3.2.2.2 OZNAČEVANJE CELIČNE KULTURE NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC S

FLUORESCENČNO OZNAČENIM EGEROLIZINOM ERILIZINOM A

Fiksirano celično kulturo nediferenciranih živčnih celic, ki je porasla krovno stekelce, smo

naprej dobro sprali s fosfatnim pufrom (5 min). Celice v vlažni temni komori smo nato

izpostavili 100 µL 1 µM EryA-mCherry (za 10 min). Po inkubaciji smo vzorec sprali s fosfatnim

pufrom in nato spirali še nadaljnjih 5 min. Na tako označene celice smo kanili sredstvo proti

bledenju Vectashield z barvilom DAPI, ki obarva celična jedra modro. Krovno stekelce s

celično linijo smo obrnjenega utrdili z lakom za nohte na objektno steklo. Pripravljen

preparat smo shranili v hladilniku pri 4° C.

3.2.2.3 OZNAČEVANJE CELIČNE KULTURE NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC S

FLUORESCENČNO OZNAČENIM EGEROLIZINOM OSTREOLIZINOM A

Fiksirano celično kulturo nediferenciranih živčnih celic, ki je rastla na krovnem stekelcu, smo

sprali s fosfatnim pufrom (5 min). Celice v vlažni temni komori smo nato izpostavili 100 µL

1µM OlyA-eGFP (za 10 min). Za tem smo preparat dobro sprali s fosfatnim pufrom in nanj


23

kanili še sredstvo proti bledenju Vectashield z barvilom DAPI, ki obarva celična jedra modro.

Krovno stekelce s celično linijo smo obrnjenega utrdili z lakom za nohte na objektno steklo.

Pripravljen preparat smo shranili v hladilniku na 4° C.

3.2.2.4 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA KULTURE NEDIFERENCIRANIH ŽIVČNIH CELIC PO

OZNAČEVANJU S FLUORESCENČNO OZNAČENIMA EGEROLIZINOMA ERILIZINOM A

IN OSTREOLIZINOM A

S pomočjo epifluorescenčnega mikroskopa AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Nemčija) smo

opazovali fiksirane in označene nediferencirane živčne celice. Osredotočili smo se na vezavo

rekombinantnih fluorescenčno označenih egerolizinov OlyA-eGFP in EryA mCherry na

plazmaleme celic. Na podlagi fluorescenčne označbe značilne obarvanosti plazmaleme smo

ugotavljali, ali se je na njo vezal OlyA-eGFP ali EryA-mCherry in naredili mikroskopske

posnetke, ki smo jih analizirali s programom AxioVision (Carl Zeiss, Nemčija).


24

4 REZULTATI

4.1 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A

NA ČLOVEŠKE CELICE USTNE SLUZNICE

Rezultati mikroskopske analize so pokazali, da se OlyA-eGFP veže na plazmalemo človeških

celic ustne sluznice (Slika 3), ki so bile enakomerno označene. V primeru inkubacije z EryA-

mCherry pa vezave nismo zaznali.

Slika 3: Z OlyA-eGFP in EryA-mCherry označene človeške celice ustne sluznice.

Reprezentativna fluorescenčna slika človeških celic ustne sluznice po inkubaciji z EryA-mCherry in OlyA-eGFP.

Zelena označba - OlyA-eGFP , modra označba - jedra (DAPI), rdečega signala (EryA-mCherry) ni. Merilo: 20 µm.

4.2 VEZAVA FLUORESCENČNO OZNAČENIH ERILIZINA A IN OSTREOLIZINA A

NA NEDIFERENCIRANE ŽIVČNE CELICE

S fluorescenčnim mikroskopom smo zasledili zeleno fluorescenčno označbo celic in s tem

tudi vezavo egerolizina OlyA-eGFP (Slika 4A). Rdečega signala na plazemskih membranah

celic pa nismo zaznali, torej do vezave EryA-mCherry ni prišlo (Slika 4B).


25

Slika 4: Z OlyA-eGFP (A) in EryA-mCherry (B) označene nediferencirane živčne celice.

Reprezentativni fluorescenčni sliki fiksiranih celic človeške ustne sluznice po 10 minutni inkubaciji z OlyA-eGFP

(A) ali EryA-mCherry (B). Modro; jedra (DAPI), zeleno; OlyA-eGFP; rdečega signala (EryA-mCherry) ne zaznamo.

Merilo: 20 µm.

A B


26

5 RAZPRAVA

V nalogi smo želeli preveriti vezavo rekombinantnih fluorescenčno označenih egerolizinov

OlyA-eGFP in EryA-mCherry na plazemske membrane človeških celic ustne sluznice in

ugotoviti, ali sta tako pripravljena egerolizina primerna tudi za označevanje nediferenciranih

živčnih celic.

Celice sesalcev obdaja plazmalema, v kateri sta zelo pomembna lipida sfingomielin in

holesterol (Ohanian in Ohanian, 2001). Po inkubaciji fiksiranih celic človeške ustne sluznice z

rekombinantnim fluorescenčno označenim egerolizinom OlyA-eGFP, smo s fluorescenčno

mikroskopijo zaznali vezavo le tega na plazmalemo teh celic. Tako pripravljen protein je

torej primeren za označevanje membranskih mikrodomen obogatenih s sfingomielinom in

holesterolom. Vezave egerolizina EryA-mCherry na plazmalemo celic ustne sluznice nismo

opazili, kar potrjuje, da v plazmalemi teh celic ni CPE, kar je v skladu z našimi pričakovanji. Za

EryA so namreč že dokazali, da se specifično veže le na membrane, v katerih je prisoten lipid

ceramid fosfoetanolamin, ki ga najdemo pri žuželkah ter pri nekaterih parazitih in bakterijah

(Bhat in sod., 2015; Yamaji-Hasegawa in sod., 2016). Človeške celice ustne sluznice so nam

lahko torej služile kot negativna kontrola za vezavo EryA-mCherry.

V plazmalemi živčnih celic vretenčarjev je poleg sfingomielina v nizkih količinah prisoten tudi

lipid CPE (Slotte in sod., 2013). Zato smo želeli preverili, ali se EryA-mCherry, ki se veže na

CPE (Bhat in sod., 2015) in OlyA-eGFP, ki se veže na membranske domene, bogate s

sfingomielinom in holesterolom (Skočaj in sod., 2014), vežeta na plazmalemo

nediferenciranih živčnih celic. Po inkubaciji celične kulture z OlyA-eGFP smo s fluorescenčno

mikroskopijo potrdili vezavo OlyA-eGFP na plazemske membrane testiranih celic. Nasprotno

pa vezave proteina EryA-mCherry na plazemsko membrano nediferenciranih živčnih celic

nismo zaznali, čeprav naj bi bila po podatkih iz literature v njej prisotna nizka koncentracija

lipida CPE (Slotte in sod., 2013). Naši rezultati fluorescenčne mikroskopije so torej pokazali,

da za označevanje plazemskih membran nediferenciranih živčnih celic egerolizin EryA-

mCherry ni primeren. Sklepamo lahko, da je vsebnost tega lipida prenizka, da bi s pomočjo

EryA-mCherry, ki se specifično veže na CPE, dokazovali vsebnost tega lipida v plazmalemi

nediferenciranih živčnih celic in vitro.


27

6 SKLEPI

Rekombinantni fluorescenčno označen egerolizin OlyA-eGFP se veže tako na plazemsko

membrano človeških celic ustne sluznice kot nediferenciranih živčnih celic. Tako pripravljen

protein je torej primeren označevalec membranskih lipidnih domen bogatih s

sfingomielinom in holesterolom.

Rekombinantni fluorescenčno označeni egerolizin EryA-mCherry se ne veže niti na

plazmalemo človeških celic ustne sluznice niti nediferenciranih živčnih celic. Ta protein torej

ni primeren označevalec membranskih lipidnih domen teh celic brez ali premalo CPE.

Vezava rekombinantnega fluorescenčno označenega egerolizina OlyA-eGFP na

nediferencirane živčne celice in celice ustne sluznice človeka je potrdila prisotnost

membranskih lipidnih domen bogatih s sfigomielinom in holesterolom v plazmalemah

testiranih tipov celic.

Ker se rekombinantni fluorescenčno označeni egerolizin EryA-mCherry ni vezal na celice

ustne sluznice človeka, to potrjuje, da v plazmalemi teh celic ni lipidnih domen obogatenih s

CPE, kar je v skladu z našimi predvidevanji.

Ker se rekombinantni fluorescenčno-označeni egerolizin EryA-mCherry ni vezal na

nediferencirane živčne celice, sklepamo, da v nasprotju z našimi pričakovanji in podatki iz

literature da v plazmalemi teh celic ni lipidnih domen bogatih s CPE, ali da je tega lipida

premalo.


28

7 POVZETEK

Egerolizini so družina proteinov, katerih pomembna lastnost je vezava na specifične lipide in

lipidne membranske mikrodomene, zato so primerno orodje za označevanje ali tarčno

uničevanje specifičnih celičnih vrst. OlyA je egerolizin iz užitne gobe Pleurotus ostreatus. Za

OlyA je značilno, da se specifično veže na naravne in umetne lipidne membrane, ki so

obogatene s sfingomielinom in holesterolom. Pred kratkim so iz gobe Pleurotus eryngii

izolirali protein EryA, ki se veže na lipid CPE, ki je v plazmalemskih membranah žuželk, v

nekaterih parazitih in bakterijah. V okviru diplomskega dela smo preverili sposobnost vezave

rekombinantnih fluorescenčno označenih egerolizinov OlyA-eGFP in EryA-mCherry na celice

človeške ustne sluznice. Ugotovili smo, da se protein OlyA-eGFP veže na plazmalemo celic

človeške ustne sluznice, medtem ko se EryA-mCherry na iste celice, za katere je znano, da ne

vsebujejo CPE, ni vezal. Proučevali smo tudi vezavo OlyA-eGFP in EryA-mCherry na kulturo

nediferenciranih živčnih celic, katerih plazmalema naj bi poleg prevladujočega sfingomielina

in holesterola vsebovala tudi nizko količino CPE. Ugotovili smo, da se OlyA-eGFP veže na

plazmalemo teh celic in da je torej primeren membranski označevalec s sfingomielinom in

holesterolom obogatenih domen plazmaleme tudi nediferenciranih živčnih celic, medtem ko

se protein EryA-mCherry zaradi verjetno prenizke količine CPE v plazmalemi

nediferenciranih živčnih celic na te celice ni vezal in torej ni primerna molekula za

označevanje CPE v plazmalemi.


29

8 SEZNAM LITERATURE

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. in Walter, P. (2002). Molecular biology

of the cell: Membrane Structure. 4th ed. New York, Garland Science.

Anderluh, G., Kisovec, M., Kraševec, N. in Gilbert, RJC. (2014). Distribution of MACPF/CDC

proteins. Subcell Biochem, 80, 7–30.

Berne, S., Križaj, I., Pohleven, F., Turk, T., Maček, P., Sepčić, K. (2002). Pleurotus and

Agrocybe hemolysins, new proteins hypothetically involved in fungal fruiting.

Biochim. Biophys. Acta,. 1570, 153–159.

Berne, S., Lah, L. in Sepčić, K. (2009). Aegerolysins: structure, function, and putative

biological role. Protein Sci 18, 694–706.

Bhat, H. B., Ishitsuka, R., Inaba, T., Murate, M., Abe, M., Makino, A., in drugi. (2015).

Evaluation of aegerolysins as novel tools to detect and visualize ceramide

phosphoethanolamine, a major sphingolipid in invertebrates. The FASEB J, 3920-

3934.

Bhat, H. B., Kishimoto, T., Abe, M. M., Murate, M., Dohmae, N., Kurahashi, A., in drugi.

(2013). Binding of a pleurotolysin ortholog from Pleurotus eryngii to sphingomyelin

and cholesterol-rich membrane domains. J Lipid Res, 2933-2943.

Ebina, K., Sakagami, H., Yokota, K. in Kondo, H. (1994). Cloning and nucleotide sequence of

cDNA encoding Asp-hemolysin from Aspergillus fumigatus. Biochim Biophys Acta,

1219,148–150.

Fernandez Espinar, M. in Labarere, J. (1997) Cloning and sequencing of the Aa-Pri1 gene

specifically expressed during fruiting initiation in the edible mushroom Agrocybe

aegerita, and analysis of the predicted amino-acid sequence. Curr Genet, 32, 420–

424.

Galagan, J.E., Calvo, S.E., Borkovich, K.A., Selker, E.U., Read, N.D., Jaffe, D. … Purcell S.

(2003). The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa. Nature,

422, 859–868.


30

Hancock, J.F. (2006). Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints. Nat. Rev. Mol.

Cell Biol., 7, 456–462.

Hannun, Y.A. (1996). Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress.

Science, 274, 1855–1859.

Hao, M., Lin, S.X., Karylowski, O.J., Wüstner, D., McGraw, T.E. in Maxfield, F.R. (2002).

Vesicular and non-vesicular sterol transport in living cells. The endocytic recycling

compartment is a major sterol storage organelle. J. Biol. Chem., 277, 609–617.

Hassall, D.G. in Graham, A. (1995). Changes in free cholesterol content, measured by filipin

fluorescence and flow cytometry, correlate with changes in cholesterol biosynthesis

in THP-1 macrophages. Cytometry Part A, 21, 352–362.

Kenworthy, A.K., Petranova, N., in Edidin M. (2000). High-Resolution FRET Microscopy of

Cholera Toxin B-Subunit and GPI-anchored Proteins in Cell Plasma Membranes. Mol.

Biol. Cell, 11, 1645–1655.

Kurahashi, A., Sato, M., Kobayashi, T., Nishibori, K. in Fujimori F. (2014). Homologous genes,

Pe.pleurotolysin A and Pe.ostreolysin, are both specifically and highly expressed in

primordia and young fruiting bodies of Pleurotus eryngii. Mycoscience, 55, 113–117.

Kudo, Y., Ootani, T., Kumagai, T., Fukuchi, Y., Ebina, K. in Yokota, K. (2002). A Novel Oxidized

Low-Density Lipoprotein-Binding Protein, Asp-Hemolysin, Recognizes

Lysophosphatidylcholine. Biol Pharm Bull, 25, 787–790.

Lingwood, D. in Simons K. (2010). Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science,

327, 46–50.

Liu, J.-P., Tang, Y., Zhou, S., Toh, B.H., McLean, C. in Li, H. (2010). Cholesterol involvement in

the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Mol Cell Neuroscience, 43, 33–42.

London, E. (2002). Insights into lipid raft structure and formation from experiments in model

membranes. Curr Opinion in Struct Biol, 12, 480–486.


31

Lukoyanova N., Kondos, S.C., Farabella, I., Law, R.H.P., Reboul, C.F., Caradoc-Davies, T.T., in

drugi (2015). Conformational changes during pore formation by the perforin-related

protein pleurotolysin, PLOS Biol. 13, e1002049.

van Meer, G., Voelker, D.R. in Feigenson G.W. (2008). Membrane lipids: where they are and

how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 112–124.

Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I. in Maxfield, F.R. (1998). Cholesterol distribution in living

cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol

analog. Biophys. J., 75, 1915–1925.

Nayak, A.P., Green, B.J., in Beezhold D.H. (2013). Fungal hemolysins. Med. Mycol, 51, 1–16.

Ngai, P.H.K., in Ng, T.B. (2006). A hemolysin from the mushroom Pleurotus eryngii. Appl.

Microbiol. Biotechnol, 72, 1185–1191.

Novak, M., Kraševec, N., Skočaj, M., Maček, P., Anderluh, G., in Sepčić, K. (2015). Fungal

aegerolysin-like proteins: distribution, activities, and applications. Appl. Microbiol.

Biotechnol, 99, 601-610.

Ohanian, J. in Ohanian, V. (2001). Sphingolipids in mammalian cell signalling. Cell. Mol. Life

Sci., 58, 2053–2068.

Ota, K., Leonardi, A., Mikelj, M., Skočaj, M., Wohlschlager, T., Künzler, M., .... Maček, P.

(2013). Membrane cholesterol and sphingomyelin, and ostreolysin A are obligatory

for pore-formation by a MACPF/CDC-like pore-forming protein, pleurotolysin B.

Biochimie, 95, 1855–1864.

Ota, K., Butala, M., Viero, G., Dalla Serra, M., Sepčić, K. in Maček P. (2014). Fungal MACPF-

like proteins and aegerolysins: bi-component pore-forming proteins? Subcell

Biochem, 80, 271–291.

Peter Slotte, J. (2013). Molecular properties of various structurally defined sphingomyelins –

Correlation of structure with function. Prg. Lipid Res., 52, 206-219.

Pike, L.J. (2004). Lipid rafts: heterogeneity on the high seas. Biochem J, 378, 281–292.


32

Porter, F.D. in Herman, G.E. (2011). Malformation syndromes caused by disorders of

cholesterol synthesis. J. Lipid Res., 52, 6–34.

Sakaguchi, O., Shimada, H. in Yokota K. (1975). Proceedings: Purification and characteristics

of hemolytic toxin from Aspergillus fumigatus. Jpn. J. Med. Sci. Biol., 28, 328–331.

Sakurai, N., Kaneko, J., Kamio, Y. in Tomita T. (2004). Cloning, expression, and pore forming

properties of mature and precursor forms of pleurotolysin, a sphingomyelin- specific

two-component cytolysin from the edible mushroom Pleurotus ostreatus. Biochimica

et Biophysica Acta, 1679, 65–73.

Sato, S.B., Ishii, K., Makino, A., Iwabuchi, K., Yamaji-Hasegawa, A., Senoh, Y., … Kobayashi, T.

(2004). Distribution and transport of cholesterol-rich membrane domains monitored

by a membrane-impermeant fluorescent polyethylene glycol-derivatized cholesterol.

J. Biol. Chem., 279, 23790–23796.

Sepčić, K., Berne, S., Potrich, C., Turk, T., Maček, P. in Menestrina G. (2003). Interaction of

ostreolysin, a cytolytic protein from the edible mushroom Pleurotus ostreatus, with

lipid membranes and modulation by lysophospholipids. FEBS J., 270, 1199–1210.

Sepčić, K., Berne, S., Rebolj, K., Batista, U., Plemenitaš, A., Šentjurc, M., Maček, P. (2004).

Ostreolysin, a pore-forming protein from the oyster mushroom, interacts specifically

with membrane cholesterol-rich lipid domains. FEBS Lett 575, 81–85.

Shibata, T., Kudou, M., Hoshi, Y., Kudo, A., Nanashima, N., Miyairi, K. (2010). Isolation and

characterization of a novel two-component hemolysin, erylysin A and B, from an

edible mushroom, Pleurotus eryngii. Toxicon, 56, 1436–1442.

Simons. K., in Ikonen E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569–572.

Simons, K., in Gerl, M.J. (2010). Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat.

Rev. Mol. Cell Biol., 11, 688–699.

Singer, S.J. in Nicolson, G. L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of cell

membranes. Science 175(4023): 720-731


33

Skočaj, M., Resnik, N., Grundner, M., Ota, K., Rojko, N., Hodnik, V., in drugi. (2014). Tracking

Cholesterol/Sphingomyelin-Rich Membrane. PLoS ONE, 9: e92783.

Tomita, T., Noguchi, K., Mimuro, H., Ukaji, F., Ito, K., Sugawara-Tomita, N., in Hashimoto Y.

(2004). Pleurotolysin, a novel sphingomyelin-specific two-component cytolysin from

the edible mushroom Pleurotus ostreatus, assembles into a transmembrane pore

complex. J. Biol. Chem., 279, 26975–26982.

Vacaru, A.M., van den Dikkenberg, J., Ternes, P. in Holthuis, J.C.M. (2013). Ceramide

Phosphoethanolamine Biosynthesis in Drosophila Is Mediated by a Unique

Ethanolamine Phosphotransferase in the Golgi Lumen. J. Biol. Chem., 288, 11520–

11530.

Vesper, S. in Vesper, M. (2004). Possible role of fungal hemolysins in sick building syndrome.

Adv Appl Microbiol, 55, 191–208.

Vidic, I., Berne, S., Drobne, D., Maček, P., Frangež, R., Turk, T. … Sepčić K. (2005). Temporal

and spatial expression of ostreolysin during development of the oyster mushroom

(Pleurotus ostreatus). Fungal Biol., 109, 377–382.

Wüstner, D. (2007). Plasma membrane sterol distribution resembles the surface topography

of living cells. Mol. Biol. Cell, 18, 211–228.

Yamaji-Hasegava A., Hullin Matsuda F., Greimel P., Kobayashi T. (2016). Pore forming toxins:

Properties, diversity and uses as tools to image sphingomyelin and ceramide

phosphoethanolamine. Biochim. Biophys. Acta, 1858:576-592.


34

9 VIRI SLIK

Structure of Ceramide phosphoethanolamine. Pridobljeno s http://www.genome.jp/dbget-

bin/www_bget?cpd:C06062

Structure of Sphingomyelin. Pridobljeno s http://www.genome.jp/dbget-

bin/www_bget?cpd:C00550

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA TANJA …