UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO · Diplomsko nalogo sem opravljal na Intitutu za biologijo (NIB), pod mentorstvom izr. prof. dr. Stanislava Gobca in somentorstvom dr

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

ALEKSANDER REKIČ

DIPLOMSKA NALOGA

PREUČEVANJE CITOTOKSIČNOSTI ANALOGOV KSANTOHUMOLA

UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE

Ljubljana, 2010

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

ALEKSANDER REKIČ

DIPLOMSKA NALOGA

PREUČEVANJE CITOTOKSIČNOSTI ANALOGOV KSANTOHUMOLA

CYTOTOXICITY OF XANTHOHUMOL ANALOGUES

Ljubljana, 2010

Diplomsko nalogo sem opravljal na Inštitutu za biologijo (NIB), pod mentorstvom

izr. prof. dr. Stanislava Gobca in somentorstvom dr. Irene Zajc. Knjiţnico spojin

strukturnih analogov ksantohumola smo naredili z računalniškim programom FTrees na

Fakulteti za farmacijo, Katedri za farmacevtsko kemijo. Rešetali smo banko spojin

National Cancer Institute (NCI), od koder smo izbrane spojine tudi naročili.

Zahvala

Zahvaliti se ţelim mentorju, izr. prof. dr Stanislavu Gobcu, mag. farm., za potrpeţljivost in

koristne nasvete. Zahvala gre tudi dr. Ireni Zajc za skrbno vodenje skozi laboratorijsko

delo ter koristne nasvete pri izdelavi diplomske naloge. Prav tako se ţelim zahvaliti

preostalim zaposlenim na NIB-u za prijaznost in pomoč pri delu v laboratoriju.

Zahvaljujem se tudi zaposlenim na Katedri za farmacevtsko kemijo za pomoč pri

pridobivanju knjiţnice spojin strukturnih analogov ksantohumola.

Predvsem pa se ţelim zahvaliti mojim staršem, ki so vedno podpirali, spodbujali in

razumevajoče spremljali mojo študijsko pot.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom

izr. prof. dr. Stanislava Gobca, mag. farm. in somentorice dr. Irene Zajc.

Aleksander Rekič

Predsednica komisije: prof. dr. Mirjana Gašperlin

Član komisije: doc. dr. Andrej Umek

i

Vsebina

VSEBINA .......................................................................................................................................................... I

SEZNAM OKRAJŠAV ................................................................................................................................. III

POVZETEK ................................................................................................................................................... IV

ABSTRACT ................................................................................................................................................... IV

KAZALO SLIK ............................................................................................................................................. VI

KAZALO PREGLEDNIC .......................................................................................................................... VII

KAZALO GRAFOV ....................................................................................................................................... X

1. UVOD ...................................................................................................................................................... 1

1.1. KSANTOHUMOL ............................................................................................................................... 2

1.1.1. Biološka uporabnost in presnova XN ........................................................................................ 3

1.1.2. Delovanje ksantohumola ........................................................................................................... 5

1.2. RAČUNALNIŠKE METODE PRI ODKRIVANJU NOVIH UČINKOVIN ........................................................ 6

1.2.1. Metoda Feature trees (drevo molekulskih značilnosti) ............................................................ 10

1.3. CELIČNE LINIJE ............................................................................................................................. 11

1.3.1. Celična linija jetrnega hepatoma: HepG2 ............................................................................... 11

1.3.2. Celična linija transformiranih endotelnih celic popkovnične vene: HUVEC .......................... 12

1.3.3. Celična linija humanega multiformnega glioblastoma: SNB19 .............................................. 12

1.3.4. Celična linija raka trebušne slinavke: MiaPaCa-2 ................................................................. 12

1.3.5. Celična linija humanega glioblastoma: U87 ........................................................................... 13

1.3.6. Celična linija pljučnega raka: NCI H1299 .............................................................................. 13

1.3.7. Celična linija nerakavih humanih astrocitov: NHA ................................................................ 13

1.4. PRESKUSI ZA UGOTAVLJANJE CITOTOKSIČNOSTI ........................................................................... 13

1.4.1. Preskus MTT za ugotavljanje citotoksičnosti .......................................................................... 14

2. NAČRT DELA ..................................................................................................................................... 16

3. MATERIALI IN METODE ................................................................................................................ 17

3.1. REAGENTI IN OPREMA ................................................................................................................... 17

3.2. PRIPRAVA VZORCEV ...................................................................................................................... 18

3.2.1. Priprava knjižnice spojin STA ................................................................................................. 18

3.2.2. Priprava osnovnih raztopin ..................................................................................................... 20

3.3. GOJENJE CELIC .............................................................................................................................. 21

3.3.1. Priprava medijev ..................................................................................................................... 22

3.3.2. Odmrzovanje celičnih linij ....................................................................................................... 23

3.3.3. Presajanje celic ....................................................................................................................... 23

3.3.4. Štetje celic ................................................................................................................................ 24

ii

3.3.5. Zamrzovanje celic .................................................................................................................... 25

3.4. MTT TEST ..................................................................................................................................... 25

3.4.1. Določanje citotoksičnosti......................................................................................................... 25

3.5. STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ................................................................................................ 27

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ........................................................................................................... 29

4.1. CITOTOKSIČNO DELOVANJE XN NA VSEH CELIČNIH LINIJAH ......................................................... 29

4.2. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI U87 .......................................................................................... 31

4.3. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJE HEPG2 ..................................................................................... 33

4.4. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI HUVEC .................................................................................... 34

4.5. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI MIAPACA2 ............................................................................... 36

4.6. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI NCI H1299 ............................................................................... 38

4.7. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI SNB19 ...................................................................................... 39

4.8. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI NHA ......................................................................................... 41

4.9. STRNJEN PREGLED REZULTATOV ................................................................................................... 42

5. SKLEP .................................................................................................................................................. 47

6. LITERATURA ..................................................................................................................................... 48

7. PRILOGE ............................................................................................................................................. 51

7.1. CITOTOKSIČNO DELOVANJE XN NA VSEH CELIČNIH LINIJAH ......................................................... 51

7.2. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI U87 .......................................................................................... 51

7.3. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJE HEPG2 ..................................................................................... 52

7.4. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI HUVEC .................................................................................... 53

7.5. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI MIAPACA2 ............................................................................... 54

7.6. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI NCI H1299 ............................................................................... 55

7.7. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI SNB 19 ..................................................................................... 55

7.8. PRESKUS MTT NA CELIČNI LINIJI NHA ......................................................................................... 56

iii

Seznam okrajšav

2-D - dvo dimenzionalen

3-D - tro dimenzionalen

DMSO - dimetil sulfo oksid

FBS - fetalni goveji serum (ang. fetal bovine serume)

FT - Feature trees (drevo molekulskih značilnosti)

HPLC - visokoločljiva tekočinska kromatografija

HTS - Rešetanje visokih zmogljivosti (ang. High-throughput screening)

HUVEC - ang. human umbilical vein endothelial cells

L-Glu - L-glutaminska kislina

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid

NEAA - neesencialne amino kisline

NHA - ang. normal human astrocites

PBS - fosfatna puferna raztopina

Pen/strep - penicilin/streptomicin

XN - ksantohumol

IXN - izoksantohumol

VS- virtualno rešetanje (ang. virtual screening)

iv

Povzetek

Ksantohumol (3-(3,3-dimetil alil) 2,4,4-trihidroksi-6-metoksihalkon) je glavni prenilirani

flavonoid hmelja (Humulus Lupulus L.). Ksantohumol je učinkovina, ki bi lahko

predstavljala novo protitumorsko učinkovino, saj mnoge študije dokazujejo, da zavira

presnovno aktivacijo prokarcinogenov, vpliva na razgrajevanje kancerogenih snovi, zavira

genotoksične učinke kancerogenov na sesalske celice in posledično lahko vpliva na

zaviranje rakavega obolenja. V diplomski nalogi smo na podlagi predpostavke, da imajo

podobne spojine podobno biološko aktivnost, pridobili strukturne analoge ksantohumola z

metodo dvo dimenzionalnega virtualnega rešetanja na osnovi liganda. Uporabili smo

računalniški program FTrees in rešetali smo banko spojin National Cancer Institute. Poleg

ksantohumola smo izbrali še devet strukturnih analogov, ki smo jim določali citotoksičnost

na petih tumorskih celičnih linijah (HepG2, NCI H1299, MiaPaCa 2, SNB19 in U87) in

dveh nerakavih celičnih linijah (HUVEC in NHA). Celice smo za 24 ur izpostavili

preiskovanim spojinam s koncentracijo 40*10-6 mol/l ali 100*10-

6 mol/l in nato s

kolorimetrično metodo MTT določili preţivelost celic. Rezultate smo statistično obdelali s

Studentovim t-testom. Strukturne razlike med ksantohumolom in strukturnimi analogi so

pokazale, da slednji zniţujejo odstotek preţivelih celic le na določenih celičnih linijah, kar

pa je lahko posledica morebitne različne občutljivosti posamezne celične linije na določen

strukturni analog. Preţivelost nerakave celične linije NHA je bila, v primerjavi z ostalimi

strukturnimi analogi, po izpostavitvi ksantohumolu niţja, vendar so bile razlike premajhne,

da bi lahko sklepali na selektivno citotoksičnost. Na podlagi naših rezultatov lahko

ovrednotimo strukturni analog 5 kot najbolj učinkovitega, saj je statistično značilno zniţal

preţivelost vseh celičnih linij, z izjemo nerakave celične linije HUVEC.

Abstract

Xanthohumol is the principal prenylated flavonoid of the hop plant (Humulus Lupulus L.).

Several studies have shown that xanthohumol could represent a new antitumour substance,

due to its inhibiting effects on procarcinogen metabolic activation, effects on degradation

of carcinogens and inhibition of the genotoxic effect on mammalian cells. Thus XN could

inhibit cancer growth. Based on the assumption that similar compounds have similar

biological effects, we used the two-dimensional structure-based virtual screening method

to gather structural analogues of xanthohumol. We used FTrees software and screened the

National Cancer Institute's compund data bank. We have selected nine structural analogues

from our collection. These were tested, together with xanthohumol, for citotoxic effects on

five human cancer cell lines (HepG2, NCI H1299, MiaPaCa 2, SNB19 and U87) and also

on two normal human cell lines (HUVEC and NHA). Cells were exposed for 24 hours to

the chosen compounds in two different concentrations (40*10-6 mol/l and 100*10-

6 mol/l).

We assessed cell viability by colorimetric MTT method. For statistical analysis, we used

Student's t-test. The structural differences between xanthohumol and selected analogues

were most likely the reason, that analogues decrease the viability of certain cell lines, but

not the others. We assume that this could be due to the different sensitivity of cell lines to

v

structural analogues. Compared to structural analogues, cell viabilty of the normal cell line

NHA was lower after exposure to xanthohumol, , but the differences were not significant

enough to state any selective citotoxicity. Based on our results, we can conclude that the

structural analogue 5 was the most effective as it statistically significantly decreased cell

viability of all cell lines but HUVEC.

vi

Kazalo slik

SLIKA 1: STRUKTURA KSANTOHUMOLA IN IZOKSANTOHUMOLA. ....................................................................... 2

SLIKA 2: OSNOVNE STRUKTURE FLAVONOIDOV. ................................................................................................ 3

SLIKA 3: ROBOT ZA IZVAJANJE HTS. ................................................................................................................. 7

SLIKA 4: EN OD NAČINOV DEFINIRANJA FARMAKOFOROV. ................................................................................. 9

SLIKA 5: RAZLIČNI PRISTOPI K VIRTUALNEM REŠETANJU SPOJIN. ..................................................................... 10

SLIKA 6: PRIMER PREDSTAVITVE MOLEKULE KOT DREVESNE STRUKTURE. ...................................................... 11

SLIKA 7: SHEMATSKI PRIKAZ REDUKCIJE SUBSTRATA MTT. ............................................................................ 15

SLIKA 8: IZBRANI STA KI SO NAJVEČKRAT ZNIŢALI PREŢIVELOST CELIC. ........................................................ 43

vii

Kazalo preglednic

PREGLEDNICA I: SEZNAM UPORABLJENE OPREME. ........................................................................................... 17

PREGLEDNICA II: SEZNAM UPORABLJENIH REAGENTOV. .................................................................................. 18

PREGLEDNICA III: IZBRANI STRUKTURNI ANALOGI XN, KI SMO JIH VKLJUČILI V NAŠO RAZISKAVO. ................ 19

PREGLEDNICA IV: STRUKTURNI ANALOGI XN, USTREZNE MOLSKE MASE IN NATEHTE IZ KATERIH SMO

PRIPRAVILI OSNOVNE RAZTOPINE. .......................................................................................................... 20

PREGLEDNICA V: SESTAVA HRANILNIH MEDIJEV ZA CELIČNE LINIJE. ............................................................... 22

PREGLEDNICA VI: VOLUMEN RAZLIČNIH TEKOČIN ZA POSAMEZNE PLASTENKE, RAZLIČNIH POVRŠIN. ............ 24

PREGLEDNICA VII: ŠTEVILO OBRATOV IN ČAS PRI CENTRIFUGIRANJU POSAMEZNIH CELIČNIH LINIJ. ............... 24

PREGLEDNICA VIII: GOSTOTA NASAJANJA POSAMEZNE CELIČNE LINIJE ZA ENO VDOLBINICO NA

MIRKROTITRSKI PLOŠČI. .......................................................................................................................... 27

PREGLEDNICA IX: REZULTATI POSAMEZNEGA MTT PRESKUSA IN PRIKAZ ODSTOTKOV (STOLPEC %)

PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) POSAMEZNIH CELIČNIH LINIJ PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI XN S

KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI 100 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI).51

PREGLEDNICA X: PRIKAZ ODSTOTKOV (STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE U87,

PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN PRIMERJAVA S

KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH

PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU T TEST, SO PRIKAZANI

REZULTATI STUDENTOVEGA T-TESTA, S KATERIM SMO DOLOČILI STATISTIČNO ZNAČILNO ODSTOPANJE

OD KONTROLNIH VREDNOSTI (P<0,05). ................................................................................................... 51

PREGLEDNICA XI: PRIKAZ ODSTOTKOV (STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE U87,

PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 100 µMOL/L IN PRIMERJAVA S

KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH

PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU T TEST SO PRIKAZANI

REZULTATI STUDENTOVEGA T-TESTA, S KATERIM SMO DOLOČILI STATISTIČNO ZNAČILNO ODSTOPANJE

OD KONTROLNIH VREDNOSTI (P<0,05). ................................................................................................... 52

PREGLEDNICA XII: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE

HEPG2, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN

PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE ŠTIRIH

NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU T TEST SO

PRIKAZANI REZULTATI STUDENTOVEGA T-TESTA, S KATERIM SMO DOLOČILI STATISTIČNO ZNAČILNO

ODSTOPANJE OD KONTROLNIH VREDNOSTI (P<0,05). .............................................................................. 52

PREGLEDNICA XIII: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE HUVEC, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L

IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE TREH




viii

PREGLEDNICA XIV: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE HUVEC, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 100 µMOL/L

IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE TREH

NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU T TEST, SO



PREGLEDNICA XV: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE

MIAPACA-2, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN





PREGLEDNICA XVI: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE MIAPACA-2, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO

100 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE

REZULTATE ŠTIRIH NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU

T TEST SO PRIKAZANI REZULTATI STUDENTOVEGA T-TESTA, S KATERIM SMO DOLOČILI STATISTIČNO

ZNAČILNO ODSTOPANJE OD KONTROLNIH VREDNOSTI (P<0,05). ............................................................. 54

PREGLEDNICA XVII: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE NCI H1299, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO

40 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE

REZULTATE TREH NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. V STOLPCU T

TEST SO PRIKAZANI REZULTATI STUDENTOVEGA T-TESTA, S KATERIM SMO DOLOČILI STATISTIČNO

ZNAČILNO ODSTOPANJE OD KONTROLNIH VREDNOSTI (P<0,05). ............................................................. 55

PREGLEDNICA XVIII: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE SNB19, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN

PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE TREH




PREGLEDNICA XIX: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE

LINIJE SNB19, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 100 µMOL/L

IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). PREGLEDNICA PRIKAZUJE REZULTATE ŠTIRIH




PREGLEDNICA XX: PRIKAZ ODSTOTKOV (GLEJ STOLPEC %) PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE

NHA, PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN



ix



x

Kazalo grafov

GRAF 1: REZULTATI POSAMEZNEGA MTT PRESKUSA IN PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ±

SD) POSAMEZNIH CELIČNIH LINIJ PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI XN S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI

100 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). STOLPCI, KI SO OBARVANI Z

RDEČO BARVO, PRIKAZUJEJO POSAMEZNE CELIČNE LINIJE, KATERIH REZULTATI STATISTIČNO ZNAČILNO

ODSTOPAJO OD KONTROLE. ..................................................................................................................... 29

GRAF 2: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE U87, PO 24-URNI

IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO

(NETRETIRANIMI CELICAMI). GRAF PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V

PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. STOLPCI, KI SO OBARVANI Z RDEČO BARVO, PRIKAZUJEJO POSAMEZNE

STA, KATERIH REZULTATI STATISTIČNO ZNAČILNO ODSTOPAJO OD KONTROLE. .................................... 31

GRAF 3: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE U87, PO 24-URNI





GRAF 4: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC CELIČNE LINIJE U87 PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI

PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI 100 µMOL/L. .............................................. 33

GRAF 5: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE HEPG2 PO 24-URNI





GRAF 6: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE HUVEC, PO 24-URNI





GRAF 7: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE HUVEC PO 24-URNI


(NETRETIRANIMI CELICAMI GRAF PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V



GRAF 8: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC CELIČNE LINIJE HUVEC PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI

STRUKTURNIM ANALOGOM XN S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI 100 µMOL/L. .................................... 36

GRAF 9: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE MIAPACA-2 PO 24-URNI



xi



GRAF 10: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE MIAPACA-2 PO 24-URNI


(NETRETIRANIMI CELICAMI GRAF PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH PRESKUSOV, IZVEDENIH V



GRAF 11: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC CELIČNE LINIJE MIAPACA-2 PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI

PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI 100 µMOL/L. .............................................. 38

GRAF 12: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE NCI H1299 PO 24-URNI

IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L) IN PRIMERJAVA S KONTROLO




GRAF 13: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE SNB19 PO 24-URNI

IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJA 40 µMOL/L IN PRIMERJAVA S KONTROLO




GRAF 14: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE SNB19 PO 24-URNI

IZPOSTAVLJENOSTI PRESKUŠANIM SPOJINAM S KONCENTRACIJO 100 µMOL/L) IN PRIMERJAVA S

KONTROLO (NETRETIRANIMI CELICAMI). GRAF PRIKAZUJE REZULTATE TREH NEODVISNIH PRESKUSOV,

IZVEDENIH V PETIH VZPOREDNIH PONOVITVAH. STOLPCI, KI SO OBARVANI Z RDEČO BARVO, PRIKAZUJEJO

POSAMEZNE STA, KATERIH REZULTATI STATISTIČNO ZNAČILNO ODSTOPAJO OD KONTROLE. ................ 40

GRAF 15: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC CELIČNE LINIJE SNB19 PO 24-URNI IZPOSTAVLJENOSTI

STRUKTURNIM ANALOGOM XN S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L ALI 100 µMOL/L. .................................... 41

GRAF 16: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC (ODSTOTKI ± SD) CELIČNE LINIJE NHA PO 24-URNI





GRAF 17: PRIKAZ ODSTOTKOV PREŢIVELIH CELIC VSEH CELIČNIH LINIJ PO IZPOSTAVITVI PRESKUŠANIM

SPOJINAM S KONCENTRACIJO 40 µMOL/L. ............................................................................................... 42

Diplomska naloga Aleksander Rekič

1

1. UVOD

Rak je bolezen, ki jo definira nenadzorovano razmnoţevanje in širitev nenormalnih, telesu

lastnih celic. Maligni tumor in maligna neoplazma (ang. neoplasm, pomeni novo rast), sta

sinonima za besedo rak. Tumorje razdelimo na benigne in maligne. Oba imata sposobnost

nenadzorovane rasti celic, vendar je med njima razlika v dediferenciaciji celic, invazivnosti

in sposobnosti metastaziranja (širitev in vraščanje v druga tkiva). Rakave celice se

razlikujejo od normalnih v:

nenadzorovani rasti in razmnoţevanju,

dediferenciaciji celic in izgubi njihovih osnovnih funkcij,

invazivnosti,

metastaziranju.

Sprememba normalne celice v rakavo je posledica ene ali več mutacij v DNA (npr.

sprememba protoonkogena v onkogen), ki so lahko pridobljene (kemikalije, virusi,

sevanje) ali podedovane. Kancerogeneza je kompleksen večstopenjski proces, ki po navadi

vključuje več kot eno genetsko spremembo in skupaj z epigenetskimi faktorji (hormonski,

kokancerogeni, tumorpromotorski učinki) vodi v nastanek raka. Rak lahko zdravimo

kirurško, z obsevanjem ali kemoterapijo. Izbor terapije je odvisen od vrste in stopnje

razvoja raka. Kemoterapija je način sistemskega zdravljenja raka, ki se lahko uporablja v

kombinaciji z drugimi načini zdravljenja ali samostojno. Večina protitumorskih učinkovin

zavira rast in razmnoţevanje rakavih celic s poškodbo njihove DNA, kar vodi v apoptozo

rakavih celic. Zaradi njihovega vpliva na celično delitev pa te učinkovine prizadenejo tudi

normalne, hitro deleče celice, kot so celice kostnega mozga, spolne celice, celice lasnih

mešičkov in celice prebavnega trakta. Posledično imajo protitumorske učinkovine veliko

neţelenih učinkov (1).

Protitumorske učinkovine razdelimo v splošnem na alkilirajoče citostatike, zaviralce

celične presnove (antimetabolite), citotoksične antibiotike, protitumorske učinkovine

rastlinskega izvora in hormone (1).

Napredek razvoja moţnosti zdravljenja raka, v smislu pomembno značilnega zmanjšanja

umrljivosti, še vedno ni zadovoljiv. Zato obstaja velika potreba po nadaljnjem razvoju

novih zdravil in strategij za zdravljenja raka. Raziskave so potrdile mnogo učinkov

ksantohumola (ang. xanthohumol, XN) in vitro, kot sta antioksidativni in protivnetni


2

učinek. Poleg tega XN zavira rast in razmnoţevanje celic, angiogenezo ter spodbuja

apoptozo. Zaradi naštetih lastnosti bi v prihodnosti lahko imel tudi terapevtsko uporabnost.

Z novimi, računalniško podprtimi pristopi, kot je postopek virtualnega rešetanja (ang.

virtual screening, VS), so moţnosti odkrivanja novih zdravilnih učinkovin širše. Postopek

omogoča, da na podlagi strukture XN v razpoloţljivih knjiţnicah spojin, poiščemo

strukturne analoge z enakimi ali celo ugodnejšimi biološkimi učinki. Na ta način lahko

enostavno in ekonomsko ugodno poiščemo morebitne nove učinkovine in jih uporabimo v

poznejših laboratorijskih preskusih.

1.1. Ksantohumol

Ksantohumol (3-(3,3-dimetil alil) 2,4,4-trihidroksi-6-metoksihalkon) je glavni prenilirani

flavonoid hmelja. Strukturno je enostavno preniliran halkon, ki se v naravi pojavlja v

hmelju (Humulus Lupulus L., Cannabaceae). Lupulinske ţleze ţenskih cvetov hmelja

izločajo XN in preostale prenilirane flavonoide v obliki smole, skupaj z grenčinami in

eteričnimi olji. Poleg XN se v smoli nahaja še trinajst sorodnih halkonov. Največ je XN

(0.1 - 1 % suhe mase), v primerjavi z vsebnostjo ostalih sorodnih halkonov pa je 10 - 100-

krat večja. Strukturna značilnost halkonov je prosta hidroksilna skupina na mestu 2', zaradi

katere, preko izomerizacije, nastanejo ustrezni flavononi (2).

Raziskave potrjujejo protitumorsko delovanje flavonoidov in vitro. Flavonoidi so lahko

sintetičnega izvora, najdemo pa jih tudi v sadju, zelenjavi, semenih, oreščkih, začimbah,

čaju in rdečem vinu. Posledično so del vsakodnevne prehrane človeka. Do danes je znanih

več kot 4.000 različnih flavonoidov (3). Osnovno kemijsko strukturo sestavljata fenilna

obroča, ki sta med seboj povezana preko heterocikličnega pirana ali pa pirenskega obroča.

Na podlagi strukturnih značilnosti jih delimo na več razredov: flavone, izoflavone,

Ksantohumol Izoksantohumol

Slika 1: Struktura ksantohumola in izoksantohumola.


3

flavonole, flavanole, flavanone, halkone in antocianidine (Slika 2) (3). Med seboj se

razlikujejo v stopnji oksidacije heterocikličnega obroča, poloţaju in številu hidroksilnih ter

metoksi skupin. Prenilirani flavonoidi imajo namesto flavonoidnega obroča prenilne ali

geranilne skupine. Posledična večja lipofilnost molekule prispeva k visoki afiniteti do

bioloških membran (4). XN sodi med halkone, ki imajo odprt ogljikov obroč, fenilna

obroča pa sta povezana preko strukture treh ogljikov α, β nenasičenega karbonilnega

sistema (5).

Hmelj, ki je sestavina piva in mu poleg tega daje grenkobo in okus, je glavni in

najpomembnejši vir XN za človeka. Medtem ko v hmelju prevladuje glavni prenilirani

flavonoid XN, je v pivu to flavonon izoksantohumol (ang. isoxanthohumol, IXN). Zaradi

zvišanja temperature v postopku varjenja piva poteče izomerizacija na prosti hidroksilni

skupini XN in nastane flavonon IXN (2). Izomerizacija je tudi vzrok majhne vsebnosti XN

in velike vsebnosti IXN v pivih. Največja koncentracija XN v svetlih pivih je 0,15 mg/l,

medtem ko je koncentracija IXN med 0,04 - 3,44 mg/l. Biološka učinkovitost IXN je, v

primerjavi s XN, manjša (6). Ravno zaradi dokazanih ugodnih učinkov XN, znanstveniki

razvijajo raznovrstne postopke pridobivanja ekstraktov hmelja z veliko vsebnostjo XN in

tudi postopke proizvodnje piva, obogatenega s XN (7).

1.1.1. Biološka uporabnost in presnova XN

V raziskavah protitumorskega delovanja XN so sočasno preučevali tudi presnovne

lastnosti, biološko uporabnost in porazdelitev preniliranih flavonoidov ter halkonov iz

Flavanon Flavon Flavonol Izoflavon

Flavanonol Flavanol Halkon Anotocianidin

Slika 2: Osnovne strukture flavonoidov.


4

hmelja. V študijah so med drugim preučevali presnovo XN in vitro z uporabo podganjih in

človeških jetrnih mikrosomov in odkrili štiri presnovke. Mednje sodi XN z dodatno

hidroksilno skupino in dehidro-cikloksantohumol, ki predvidoma nastaneta v mešanih

encimskih in kemičnih poteh biotransformacije (8). V reakciji glukuronidacije XN in vitro

nastaneta dva pomembnejša monoglukuronida XN. Poglavitni presnovek glukuronidacije

XN (pribliţno 89 % vseh nastalih monoglukuronidov) nastane s konjugacijo glukuronske

kisline na hidroksilno skupino na mestu C-4'. Glavnino preostalih 10 % presnovkov

glukuronidacije pa predstavlja spojina, ki nastane s konjugacijo glukuronske kisline na

kisik na mestu C-4 (9).

Nookandeh in sodelavci so preučevali presnovo XN pri podganah (ang. Sprague - Dawley

rats). S spektroskopskimi metodami so iz blata podgan izolirali in ovrednotili 22

presnovkov XN v različnih časovnih presledkih. Pri tem je 89 % vseh presnovkov

predstavljal XN, ki so ga izolirali v miligramskih količinah. Ostale presnovke so izolirali v

mikrogramskih količinah. Nastali presnovki so bile ciklične prenilne spojine s hidroksilno

skupino na mestu C-4' ali C-2', ne-ciklične prenilirane spojine z oksigeniranimi

substituenti, XN-4'-O-glukuronid, XN-4-O-metil eter, XN-4-O-acetat in IXN (10).

Gerhäuser in sodelavci so s kinetičnim preskusom določali biološko uporabnost XN po

peroralnem dajanju. Podganjim samicam so odvzeli vzorce plazme v različnih časovnih

presledkih (v razponu od 1 ure do 48 ur) in nato z metodo tekočinske kromatografije

visoke ločljivosti z obrnjeno fazo (ang. reverse phase high performance liquid

chromatography, RP-HPLC) analizirali presnovke XN. Glavni presnovek je bil XN-4'-O-

glukuronid z največjo plazemsko koncentracijo (Cmax ) 3,1 µmol/l. Cmax nepresnovljenega

XN je bil 0,34 µmol/l, in sicer 4 ure po odmerjanju. IXN se je pojavil v plazmi v

zanemarljivo nizkih koncentracijah (11).

Avula in sodelavci so določali farmakokinetiko XN na podganjih samcih (ang. Wistar

rats). V prvem preskusu so podganam dali XN intravensko ali per os v odmerku 20 mg/kg

telesne mase. V drugem preskusu pa so podgane prejele enkratni peroralni odmerek XN, in

sicer 500 mg/kg telesne mase. Z uporabo HPLC so analizirali plazmo, blato in urin, ki so

jih vzorčili v različnih časovnih presledkih. Dokazali so, da se XN in njegovi presnovki

izločijo predvsem skozi gastrointestinalni trakt z blatom, v 24 urah po prejetem odmerku.

Prav tako so dokazali, da se plazemska koncentracija XN po intravenskem dajanju po 60

minutah hitro zniţa (12). Dosedanji preskusi so razkrili, da je biološka uporabnost XN po


5

peroralnem dajanju zelo majhna, najverjetneje zaradi zelo učinkovite presnove črevesnih

mikroorganizmov (2).

1.1.2. Delovanje ksantohumola

V zadnjih letih se je zanimanje za fenolne spojine začelo povečevati, predvsem zaradi

domnevno ugodnega delovanja, v smislu zaščite pred boleznimi, kot so rakava obolenja in

srčno-ţilne bolezni. Veliko raziskav (zlasti in vitro) je bilo narejenih predvsem na eni od

sestavin hmelja, to je XN. Do danes so poročali o protivnetnem in antioksidativnem učinku

XN ter o njegovem vplivu na rast in razmnoţevanje celic, zato učinke XN povezujejo s

protitumorskim delovanjem (7).

Raziskave potrjujejo učinkovitost XN zoper okuţbe, ki jih povzročajo mikroorganizmi, kot

so bakterije, virusi, glive in plazmodiji, saj zavirajo njihovo rast. XN zavira razvoj

stafilokoknih in streptokoknih bakterij. Protivirusno delovanje so dokazali pri okuţbi z

govejim virusom diareje (ang. bovine viral diarrhea virus), citomegalovirusu, herpes

simpleksu tipa 1 in 2 ter virusu humane imunske pomanjkljivosti 1 (HIV-1). Prav tako XN

zelo učinkovito zavira razmnoţevanje plazmodijev (Plasmodium falciparum), ki pri

človeku povzročajo malarijo (16).

1.1.2.1. Antioksidativno delovanje

Ţivi organizmi so nenehna tarča reaktivnih kisikovih spojin (ang. reactive oxygen species,

ROS), med katere sodijo hidroksilni radikal, peroksid in superoksid, ki lahko preko lipidne

peroksidacije sproţijo nastanek ateroskleroze, rakavega obolenja in nevrodegenerativnih

bolezni. Predpostavljen mehanizem antioksidativnega delovanja flavonoidov je lovljenje

ROS (2), ki ga potrjujejo tudi študije.

Gerhäuser in sodelavci so z metodo ORAC (ang. oxygen radical absorbance capacity)

dokazali, da je XN kar 8.9- in 2.9-krat bolj učinkovit lovilec hidroksilnega in peroksilnega

radikala, v primerjavi z referenčno spojino trolox (vodotopen vitamin E). Poleg tega je XN

učinkovit lovilec superoksidnih radikalov, nastalih z ksantin-oksidazo, ne da bi encim

neposredno zaviral. IXN v obeh preskusih ni pokazal antioksidativnih lastnosti (13). V

predhodnih raziskavah so dokazali tudi zaviralni učinek XN na oksidacijo humanih

nizkomolekularnih lipoproteinov (LDL) in vitro, sproţenih z Cu2+

ter na lipidno

peroksidacijo podganjih jetrnih mikrosomov, sproţenih z Fe2+

- askorbatom ali terc-

butilnim hidroperoksidom (14, 15).


6

1.1.2.2. Protitumorsko delovanje

XN je najbolje raziskana učinkovina rastlinskega izvora s protitumorskimi lastnostmi. S

temi lastnostmi vpliva na različne poti kancerogeneze, s čimer zavira nastanek novotvorb.

XN deluje protitumorsko na tri načine:

zavira presnovo snovi, ki vzpodbujajo rast in razvoj rakavih celic

(prokarcinogenov),

inducira encime za razstrupljanje karcinogenov,

zavira rast tumorja v zgodnjih fazah razvoja (2).

V začetni fazi kancerogeneze XN učinkovito vpliva na delovanje izoencimskega

kompleksa CYP P450, ki je udeleţen v presnovni aktivaciji prokarcinogenov (17). XN

inducira NAD(P)H:kinon-reduktazo v gojenih mišjih celicah Hepa1c1c7. To je encim, ki

pretvarja kinone v hidrokinone in s tem zmanjša njihovo toksičnost (13).

Učinek XN na rast in razmnoţevanja celic ter citotoksične učinke XN so naprimer

preskušali in vitro na celicah raka dojke (MCF-7), raka debelega črevesa (HT-29) in

celicah raka jajčnikov (A-2780). Uspešno je zavrl rast in razmnoţevanje celičnih linij

MCF-7 in A-2780. Poleg tega nima dokazanih citotoksičnih učinkov na mišjih hepatocitih,

kar je pomembno za razvoj nove zdravilne učinkovine na osnovi XN (5). Nenadzorovana

rast in razvoj tumorskih celic povzročata vnetje. S tem se poveča nastanek

prostaglandinov, ki so mediatorji vnetja. XN je učinkovito protivnetno sredstvo, saj zavira

delovanje encimov ciklooksigenaze-1 in ciklooksigenaze-2 (COX-1 in COX-2) in tako

zmanjša nastanek prostaglandinov (13). Za razvoj tumorja je ključnega pomena

angiogeneza. Angiogeneza pomeni nastanek in razrast novih krvnih ţil, ki zagotavljajo

dostavo hranilnih snovi in kisika do delov rastočega tumorja. Znani sproţilci angiogeneze

so prostaglandini in dušikov oksid (NO). Študije modelov in vitro dokazujejo, da XN

zavira njihovo sintezo, zato je učinkovit zaviralec angiogeneze (1, 7, 13, 18, 19).

1.2. Računalniške metode pri odkrivanju novih učinkovin

Rešetanje visoke zmogljivosti (ang. High-throughput screening, HTS) in virtualno

rešetanje (ang. Virtual screening, VS), sta pomembna pristopa pri sodobnem odkrivanju

novih učinkovin. Metodi se razlikujeta predvsem v načinu pristopa, kjer je HTS

eksperimentalno naravnan, medtem ko je VS bolj teoretičen. V preteklih letih je bilo

predstavljeno veliko novih statističnih, računalniških in presejalnih metod, s katerimi lahko


7

zdruţimo eksperimentalno ter in silico rešetanje. S tem povečamo njun doprinos k

odkrivanju novih učinkovin. Čeprav mnogo idej še ni doseglo praktične izvedbe, je v

literaturnih podatkih ţe moţno zaslediti nekaj uspešnih rezultatov tovrstnega zgodnjega

odkrivanja novih učinkovin (20).

Pri odkrivanju novih spojin vodnic ima glavno vlogo tehnologija HTS. Gre za fizično

rešetanje obseţnih knjiţnic spojin, kjer z biokemijskimi metodami merimo aktivnost spojin

proti določeni tarči. Uporabna je v primerih, ko nimamo predhodnega znanja o strukturi

tarče ali razmerju med strukturo in aktivnostjo (ang. structure activity relationship, SAR)

referenčne spojine. Na uspešnost HTS je močno vplival napredek v avtomatizaciji in

miniaturizaciji procesa, saj se pri samem procesu uporabljajo roboti, ki lahko v enem

dnevu preverijo aktivnost več kot 10.000 spojin na določeni tarči. Kljub vsem napredkom

je HTS še vedno ekonomsko neugoden in časovno zahteven postopek (20, 21, 22).

Alternativni pristop pri odkrivanju novih učinkovin so različni računalniški pristopi, med

katerimi je najbolj priljubljeno VS. Metoda je namenjena rešetanju obseţnih knjiţnic

spojin in silico in izbiranju manjšega števila kandidatnih molekul za nadaljnje preskuse, s

katerimi lahko potrdimo ţeleno biološko aktivnost. Tako se lahko s pomočjo VS iz

nadaljnje raziskave izključi spojine, ki zagotovo niso aktivne ter pripravi ustreznejše

knjiţnice spojin za HTS. VS v osnovi razdelimo na:

1. filtriranje s pomočjo osnovnih deskriptorjev (1-D rešetanje),

Slika 3: Robot za izvajanje HTS.


8

2. dvodimenzionalno (2-D) rešetanje na osnovi liganda

3. tridimenzionalno (3-D) rešetanje na osnovi liganda in

4. strukturno podprto virtualno rešetanje (ang. docking) (20, 21).

Filtriranje na osnovi preprostih deskriptorjev

Najbolj preprosta metoda, ki temelji na uporabi enostavnih molekulskih deskriptorjev.

Molekulski deskriptor je končni rezultat logičnega in matematičnega postopka, ki pretvori

kemijsko informacijo, zapisano (kodirano) v simbolni kemijski formuli, v uporabno

številčno vrednost. Uporabna je v najbolj zgodnjih fazah priprave knjiţnice spojin z

ţelenimi lastnostmi. Prav tako omogoča izključitev spojin z lastnostmi, ki niso primerne za

nadaljnje raziskave.

2-D rešetanje na osnovi liganda

Metoda temelji na predpostavki, da imajo spojine s podobno strukturo tudi podobno

aktivnost. Uporabna je, kadar struktura tarče ni znana in omogoča dodatno obogatitev

knjiţnice za HTS. Pri 2-D rešetanju iščemo spojine, ki so strukturno podobne vhodni

spojini. Spojine so predstavljene kot binarni zapis (ang. fingerprint), v katerega so zajeti

podatki o molekularni strukturi posamezne spojine. Primerjavo dveh binarnih zapisov

ovrednotimo z Tanimotovim koeficientom, ki je merilo za podobnost (20).

3-D rešetanje na osnovi liganda

V naravi so molekule 3-D predmeti. Za rešetanje je potrebna knjiţnica spojin, ki vsebuje

podatke o molekulah v 3-D obliki. Običajno je potrebno napraviti pretvorbo iz 2-D v 3-D

obliko s pomočjo molekulske dinamike. Tako najdemo konformacijo, ki je najbolj ugodna

(energetski minimum). Najbolj običajen način rešetanja poteka z upoštevanjem

farmakofornih točk. Farmakofor pomeni prostorsko razporeditev funkcionalnih skupin,

ključnih za aktivnost molekule. Največkrat so farmakoforni modeli sestavljeni iz treh ali

štirih točk. Po določitvi farmakofora različni računalniški programi poiščejo vse spojine, ki

mu ustrezajo. Tako pridobljeni zadetki se lahko med seboj zelo razlikujejo, vendar je

pomembna njihova skladnost s farmakoforom. Čeprav je 3-D rešetanje veliko bolj

natančno v primerjavi z 2-D rešetanjem in omogoča obogatitev knjiţnice spojin s

strukturno različnimi spojinami, ima metoda nekaj slabosti. Je časovno bolj zahtevna in ne

upošteva dejstva, da aktivna konformacija ni vedno enaka minimizirani (20, 22).


9

Strukturno podprto virtualno rešetanje - sidranje (ang. docking)

Za strukturno podprto virtualno rešetanje potrebujemo 3-D strukturo tarče. Slednje so

posnete s pomočjo rentgenske kristalografije ali jedrske magnetne resonance. Za strukturno

podprto virtualno rešetanje se uporabljajo metode sidranja, kjer se s pomočjo računalniških

metod vstavlja spojino v aktivno mesto tarče (ta je lahko ali receptor ali encim). Na podlagi

podatkov o vezavni energiji je moţna medsebojna primerjava spojin in razdelitev na tiste z

najbolj in tiste z najmanj ugodnimi lastnostmi. Tako lahko zoţimo izbor kandidatnih

molekul za nadaljnja preskušanja aktivnosti (21).

Določevanje

centrov

funkcionalinih

skupin

Odmikanje

strukturnega

skeleta

Prepoznavanje

farmokofora

Slika 4: En od načinov definiranja farmakoforov.


10

1.2.1. Metoda Feature trees (drevo molekulskih značilnosti)

Kadar 3-D struktura tarče ni znana, je glavni način iskanja novih molekul na osnovi

poznavanja strukture liganda (opisano zgoraj). Obstajajo tudi drugi načini, s katerimi

ovrednotimo podobnosti med dvema molekulama, kot je naprimer metoda Feature Trees

(FT) (23).

Namesto da predstavimo molekule v knjiţnici spojin kot linearni binarni zapis, je za

predstavitev molekule potreben izračun oziroma t.i. »feature tree«. Pri FT predstavimo

molekulo kot drevesno strukturo hidrofobnih fragmentov in funkcionalnih skupin, na način

kot so med seboj povezani. Kolenca (ang. node) drevesne strukture predstavljajo fragmente

molekule, kjer vsako kolence označuje niz značilnosti (ang. set of features) pripadajočega

fragmenta. Podatke o značilnostih lahko vnesemo s pomočjo posebnih računalniških

algoritmov za vsako kolence, ki opisujejo strukturo kot tudi fizikalno-kemijske lastnosti

Slika 5: Različni pristopi k virtualnem rešetanju spojin.


11

posameznega fragmenta. Vejice (ang. edges) povezujejo kolenca, tako kot so ti fragmenti

povezani v 2-D strukturi molekule. Vsak atom v molekuli mora biti predstavljen z vsaj

enim kolencem. Za dobro definirano drevesno strukturo je potreben pazljiv izbor niza

atomov, ne da bi se pri tem slednji povezovali v cikle (23).

Primerjava dveh FT poteka z različnimi algoritmi, ki cepijo glavno drevesno strukturo na

manjše poddrevesne strukture (ang. subtree). Z računalniškim programom izračunamo

ujemanje med podstrukturami in izpeljemo številčno vrednost podobnosti (ang. similarity

values). V osnovi gre za poravnavo ene drevesne strukture z drugo, s čimer lahko hitro

prepoznamo SAR. Tak koncept primerjave, kjer poenostavimo predstavitev molekule, je

uporaben predvsem pri iskanju strukturno podobnih spojih v ţe znanih podatkovnih bazah

spojin. Poleg tega je FT zelo hitra metoda, s katero lahko prav tako obogatimo knjiţnice

spojin s strukturno različnimi spojinami (ang. scaffold hopping) (23).

1.3. Celične linije

1.3.1. Celična linija jetrnega hepatoma: HepG2

Jetrni rak je maligni tumor v jetrih. Lahko je primaren (izvira iz jeter), ali sekundaren (se je

razširil v jetra z drugega mesta nastanka). Primarni tumor jeter delimo na dve poglavitni

vrsti: hepatom, ki se razvije iz jetrnih celic ter holangogiokarcinom iz celic, ki prekrivajo

notranjost ţolčnih izvodil. Najpogostejši jetrni rak pri otrocih je hepatoblastom (24).

Celično linijo HepG2 so izolirali leta 1979 z biopsijo jeter iz primarnega hepatoblastoma

11-letnega dečka. Morfološko so celice podobne epitelnim jetrnim celicam. Sintetizirajo in

izločajo mnoge plazemske proteine, ki so značilni za zdrave človeške jetrne celice.

Slika 6: Primer predstavitve molekule kot

drevesne strukture.


12

Primerne so za številne preskuse mutagenosti, citotoksičnosti, ekspresije genov,

transkripcije in študije mehanizmov virusnih infekcij. HepG2 celice imajo ohranjeno

aktivnost presnovnih encimov I. in II. faze biotransformacije, ki so ključnega pomena pri

aktivaciji in detoksikaciji DNA reaktivnih karcinogenov. Ti encimi običajno izgubijo

aktivnost v postopku kultivacije celic in vitro (26). Značilnost celic HepG2 je, da rastejo v

skupkih, ki jih moramo pred nasajanjem na ploščo razbiti. Tako si zagotovimo homogeno

suspenzijo, kar je ključnega pomena v preskusih ugotavljanja citotoksičnosti.

1.3.2. Celična linija transformiranih endotelnih celic popkovnične vene: HUVEC

Celice HUVEC (ang. human umbilical vein endothelial cells) so endotelne celice, ki se

pogosto uporabljajo v raziskavah angiogeneze, migracije in adhezije levkocitov in vitro.

Celice imajo normalen kariotip in so nerakave. V bioloških testih se uporabljajo

transformirane celične linije, kot so celice HUVEC. Njihova prednost je, v primerjavi z

izvornimi celicami, nesmrtnost (spontana imortalizacija) (27). V nadzorovanih in vitro

pogojih rastejo celice v eni plasti in zelo hitro, zato je potrebna previdnost, da ne doseţejo

preraščenosti oziroma konfluence, ker tedaj odmrejo.

1.3.3. Celična linija humanega multiformnega glioblastoma: SNB19

Multiformni glioblastom je zelo agresiven, hitro rastoč in invaziven moţganski tumor.

Zdravljenje obsega kirurški poseg, obsevanje in kemoterapijo, vendar je uspešnost

zdravljenja majhna. Pričakovana doba preţivetja bolnikov z multiformnim glioblastomom

je pribliţno eno leto (28). Celično linijo SNB19 so leta 1980 izolirali iz multiformnega

glioblastoma 47-letnega moškega. Celična linija je vseskozi obdrţala biološko aktivnost,

primerljivo z multiformnim glioblastomom in vivo. Za SNB19 celice je značilna hitra rast,

sinteza angiogenega dejavnika in visoka proteazna aktivnost. Uporablja se jih predvsem v

raziskavah osnovnih patofizioloških lastnosti multiformnega glioblastoma (29).

1.3.4. Celična linija raka trebušne slinavke: MiaPaCa-2

MiaPaca-2 je slabo diferencirana celična linija, izolirana iz raka trebušne slinavke. Rak

trebušne slinavke je eden izmed agresivnejših oblik raka. Visoka smrtnost je večinoma

posledica prepoznega odkritja bolezni. Večina do danes znanih zdravljenj ne ustavi

njegovega razvoja (31). Celice so, morfološko gledano, velike in bogate s citoplazmo in

imajo visoko stopnjo aneuplodije (nenormalno število kromosomov) (30).


13

1.3.5. Celična linija humanega glioblastoma: U87

Celična linija U87 je visoko maligna celična linija primarnega človeškega tumorja moţgan,

multiformnega glioblastoma. Celična linija ima spremenjeno število kromosomov oziroma

je hipodiploidna (48 % celic iste linije ima kromosomsko število 44). Celice so pridobili iz

malignega multiformnega glioblastoma 44-letne bolnice. Celice U87 so morfološko

epitelijske celice, rastejo pritrjene na podlago in imajo značilno zvezdasto obliko (32).

1.3.6. Celična linija pljučnega raka: NCI H1299

Pljučni rak je najpogostejše rakavo obolenje pri moških in drugo najpogostejše pri

ţenskah. Poznamo več različnih vrst pljučnega raka. Drobnocelični rak pljuč najhitreje

raste, se zelo zgodaj širi v okolico in zaseva v oddaljene dele telesa. V drugi skupini so

vrste raka, ki ga sestavljajo ploščate, ţlezne ali velike celice.. Celična linija NCI H1299 so

celice karcinoma velikih celic, pridobljene iz pljučnega raka 43-letnega moškega (0).

1.3.7. Celična linija nerakavih humanih astrocitov: NHA

NHA (ang. normal human astrocites) je celična linija nerakavih humanih astrocitov, ki

izvira iz moţganskih celic, 22 tednov starega darovalca. Celice NHA rastejo v enem sloju

in imajo podolgovato, zvezdasto, vlaknasto obliko. Astrociti so pomembni gradniki krvno-

moţganske pregrade ter vplivajo na vazokonstrikcijo in vazodilatacijo kapilar. Med

posameznimi celicami astrocitov se nahajajo presledkovni stiki, po katerih poteka

neposredna komunikacija med celicami (35).

1.4. Preskusi za ugotavljanje citotoksičnosti

Za in vitro in in vivo ugotavljanje ţivosti in sposobnosti rasti in razmnoţevanja celic

(proliferacije) so bile razvite številne metode. V splošnem jih razdelimo v štiri skupine:

reprodukcijski preskusi,

preskusi prepustnosti,

preskusi ugotavljanja presnovne aktivnosti,

neposredni preskusi proliferacije.

Reprodukcijske preskuse uporabljamo za določanje števila celic v kulturi, ki so sposobne

tvorbe kolonij in vitro. Pri takih preskusih v gojišče nasadimo suspenzije celic z nizko

gostoto in po določenem času preštejemo število kolonij. Tak način je najbolj zanesljiv za

http://sl.wikipedia.org/w/index.php?title=Presledkovni_stik&action=edit


14

določanje števila ţivih in za razmnoţevanje sposobnih celic, vendar je tudi najbolj

zamuden (34).

Preskusi prepustnosti temeljijo na barvanju celic z barvili, kot je naprimer tripan modro.

Ţive celice, katerih membrana ni poškodovana, se ne obarvajo, pri poškodovanih pa

barvilo, ki je negativno nabit kromofor, prodre v notranjost celice. Iz razmerja števila

obarvanih in ne obarvanih celic po dodatku barvila določimo preţivelost. Štetje celic

izvedemo s hemocitometrom. Ta metoda se pogosto uporablja za določanje gostote ţivih

celic v celičnih suspenzijah, saj je hitra in ekonomsko ugodna, za izvedbo preskusa pa

potrebujemo le majhen del celične populacije (34).

Presnovno aktivnost določamo na osnovi pretvorbe tetrazolijevih soli v obarvane

formazane ob uporabi spektroskopskih metod (34), kot je naprimer kolorimetrična metoda

MTT.

V neposrednih preskusih proliferacije se kot indikator celične rasti uporablja sinteza

deoksiribonukleinske kisline (DNA). Za ugotavljanje sposobnosti rasti in razmnoţevanja

celic se uporabljajo radioaktivni analogi ali analogi nukleotidov, ki nimajo radioaktivnih

lastnosti. Določamo njihovo vključevanje v molekulo DNA (34).

Najbolj primerni so preskusi, ki jih lahko izvajamo na mikrotitrskih ploščah s 96

vdolbinicami. Z njimi lahko hitro ter sočasno analiziramo veliko vzorcev, porabimo manj

medija, celic in mikrotitrskih plošč. Kolorimetrični preskusi nam omogočajo, da vzorce v

mikrotitrskih ploščah ovrednotimo neposredno s spektrofotometrom (34).

1.4.1. Preskus MTT za ugotavljanje citotoksičnosti

Preskusi za ugotavljanje citotoksičnosti na podlagi merjenja presnovne aktivnosti temeljijo

na dejstvu, da se poškodba celice neizogibno izrazi z izgubo zmoţnosti ohranjanja ter

zagotavljanja energije za presnovno funkcijo in rast. Običajno merimo aktivnost

mitohondrijev v prisotnosti kolorimetričnega substrata (naprimer MTT). Za ugotavljanje

citotoksičnosti spojin in vpliva na rast in razmnoţevanje celic se pogosto uporablja

tetrazolijeva sol 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid ali krajše MTT.

Mitohondrijska sukcinat-dehidrogenaza presnovno aktivnih celic reducira MTT v

nevodotopne vijoličaste kristale formazana. Tega določamo spektrofotometrično in je v

linearnem razmerju s številom ţivih celic (34).


15

Slika 7: Shematski prikaz redukcije substrata MTT.


16

2. Načrt dela

Številni viri opisujejo širok spekter protitumorskega delovanja XN. Na podlagi

predpostavke, da imajo strukturno sorodne spojine podobno biološko aktivnost, smo se

odločili preučiti citotoksičnost XN in njegovih strukturnih analogov in vitro. Presejalni

preskusi citotoksičnosti na humanih rakavih celičnih linijah so prvi korak pri vrednotenju

spojin s protitumorskim delovanjem.

Z računalniškim programom FTrees bomo iz banke prosto dostopnih spojin NCI (National

Cancer Institute), na podlagi strukture XN, pridobili knjiţnico spojin strukturnih analogov

(STA) XN. Glede na dostopnost spojin pri NCI, bomo izbrali 9 STA in preskusili njihovo

citotoksično delovanje.

Citotoksičnost bomo določali na izbranih petih tumorskih celičnih linijah (HepG2, NCI

H1299, MiaPaCa2, SNB19 in U87) in dveh nerakavih celičnih linijah (HUVEC in NHA).

Vsako celično linijo bomo najprej namnoţili. Nato bomo z uporabo ustreznega celičnega

medija pripravili raztopine preskušanih spojin različnih koncentracij (40 ali 100 µmol/l).

Na podlagi umeritvenih krivulj za preskus MTT bomo za vsako celično linijo določili

gostoto celic, ki pri kolorimetričnem preskusu omogoča meritev v ustreznem območju.

Suspenzije celic z ustrezno gostoto bomo nanesli na mikrotitrske plošče in jih izpostavili

mediju z raztopinami preskušanih spojin. Po 24 urah inkubacije bomo z MTT

kolorimetričnim preskusom določili število preţivelih celic. Preučili bomo odziv celic na

različne koncentracije XN in njegovih STA ter rezultate slednjih primerjali z rezultati za

XN. Na podlagi tako pridobljenih rezultatov bomo ovrednotili citotoksičnost XN in

njegovih STA ter s tem preučili morebitno učinkovitost protitumorskega delovanja.


17

3. Materiali in metode

3.1. Reagenti in oprema

Pri delu smo uporabljali naslednjo opremo (Error! Reference source not found.).

Preglednica I: Seznam uporabljene opreme.

Oprema Proizvajalec

Pipete Biohit

Nastavki za pipete Costar

Mikrotitrske plošče z 96 vdolbinicami in

pokrovom Costar; Nunc

Brezprašna komora z laminarnim pretokom

zraka PIA

Centrifuga Tehtnica Ţelezniki

Vorteks IKA

Tehtnica Metler Toledo

Plastenke za gojenje s perforiranim zamaškom

(25 in 75 cm2)

Costar

Centrifugirge (15 in 50 ml) Costar

Epice Costar

Svetlobni mikroskop Reiches - Jung

Hemocitometer Mikropals

Inkubator Sanyo (37º C, 5% CO2)

Stripete (5, 10, 25 in 50 ml) Costar

Hladilnik Gorenje

Zmrzovalna skrinja Gorenje

Spektrofotometer s programom Magellan Tecan (kombiniran merilec absorbance,

florescence in iluminiscence)


18

Preglednica II: Seznam uporabljenih reagentov.

Reagenti Proizvajalec

DMSO (dimetil sulfoksid) Sigma

Tripan modro Sigma

DMEM Sigma

MEM Sigma

RMPI 1640 PPA

Williams medium E Sigma

FBS (fetalni goveji serum) PPA

PBS (fosfatna puferna raztopina) PPA

MTT Gibco

NEAA (neesencialne aminokisline) Invitrogen

Hepes Buffer Sigma

L-Glu (L glutaminska kislina) PPA

Pen/Strep (penicilin/streptomicin) PPA

Tripsin Invitrogen

3.2. Priprava vzorcev

3.2.1. Priprava knjiţnice spojin STA

Strukturne analoge XN smo pridobili z 2-D virtualnim rešetanjem na osnovi liganda.

Uporabili smo računalniško program FTrees, za katerega je značilno, da strukturo

molekule predstavi kot drevesno strukturo (FT). S programom smo, na podlagi strukture

XN, rešetali knjiţnico spojin NCI. Za to bazo smo se odločili, ker je prosto dostopna, poleg

tega pa ima NCI tudi prosto dostopne ţe sintetizirane spojine. Med vsemi rezultati

rešetanja na osnovi XN smo izbrali devet analogov.


19

Preglednica III: Izbrani strukturni analogi XN, ki smo jih vključili v našo raziskavo.

Kemijska struktura Oznaka NCI Naša oznaka Podobnost gleda na XN v odstotkih

16720 1 0,93

75528 2 0,93

114645 3 0,93

55798 4 0,93

73260 5 0,92

636790 6 0,92

78638 7 0,91

51351 8 0,91

102053 9 0,91


20

3.2.2. Priprava osnovnih raztopin

Preglednica IV: Strukturni analogi XN, ustrezne molske mase in natehte iz katerih smo pripravili osnovne

raztopine.

Kemijska struktura

Oznaka

NCI

Naša

oznaka

Molska

masa

(g/mol)

Masa

natehte

(mg)

Koncentracija

(mol/l)

16720 1 270 18 40*10-3

75528 2 300 20,5 40*10-3

114645 3 255 20,8 40*10-3

55798 4 268 14,67 40*10-3

73260 5 393 23,7 40*10-3

636790 6 256 20,4 40*10-3

78638 7 284 22,1 40*10-3

51351 8 284 23,3 40*10-3


21

102053 9 254 21,8 40*10-3

Za testiranje citotoksičnosti smo opravljali preskuse s strukturnimi analogi XN pri

koncentraciji 40*10-6

M, na izbranih celičnih linijah pa še koncentracijo 100*10-6

M.

Koncentracijo 40*10-6

M smo izbrali, ker XN pri tej koncentraciji kaţe dovolj visoko

citotoksično aktivnost na različnih rakavih celičnih linijah, z drugo koncentracijo pa smo

ţeleli preučiti delovanje analogov v odvisnosti od odmerka. Najprej je bilo potrebno

pripraviti osnovne raztopine strukturnih analogov, s koncentracijo 40*10-3

M.

Na analitski tehtnici smo natehtali maso izbranih analogov in z upoštevanjem molske mase

izračunali potreben volumen DMSO za ţeleno koncentracijo po enačbi 1.

Enačba 1: m je masa natehte, M je molska masa STA in c (40*10-3

mol/l) je ţeljena koncentracija osnovnih

raztopin.

𝑉 𝐷𝑀𝑆𝑂 =𝑚

𝑀 ∗ 𝑐

Natehtane STA smo prenesli v epice in nato z merilnimi pipetami dodali izračunan

volumen DMSO. Tako pripravljene raztopine smo sterilizirali s filtriranjem skozi

membranske filtre s premerom por 0,22 µm. Nato je delo s STA potekalo le še v brezprašni

komori z laminarnim pretokom zraka v aseptičnih pogojih. Med posameznimi preskusi

smo hranili osnovne raztopine v zamrzovalniku. Odmrznili smo jih, tik preden smo

ponovno izvedli posamezni preskus. XN je bil pripravljen v koncentraciji 70*10-3

M in smo

ga prav tako hranili v zamrzovalniku.

3.3. Gojenje celic

Celice potrebujejo za svojo rast in preţivetje v in vitro sistemih ustrezne hranilne medije.

Te sestavljajo hranilne snovi, rastni faktorji in antibiotiki. Rastejo lahko le v mediju, ki ima

ustrezno pH vrednost (7,4) in temperaturo, ki je enaka telesni temperaturi organizma, iz

katerega so bile celice izolirane. Izbrane celične linije smo gojili v inkubatorju, ki je

zagotavljal temperaturo 37 ºC ter atmosfero s 5 % CO2. Celice smo gojili v sterilnih

plastenkah z ventilacijskim zamaškom in v ustreznem hranilnem mediju. Pri delu s


22

celicami smo vedno postopali aseptično. Delo smo opravljali z ustrezno zaščitno opremo

(halja, rokavice) v brezprašni komori z laminarnim pretokom zraka.

3.3.1. Priprava medijev

Hranilne medije za celične linije, smo pripravljali sproti, in sicer v 50 ml centrifugirkah.

Na ta način smo zagotovili uporabo vedno sveţe pripravljenega medija. Medije smo

pripravljali v aseptični tehniki. Pripravljene medije smo hranili v hladilniku in jih pred

uporabo segreli v vodni kopeli s stalno temperatur 37 ºC.

Preglednica V: Sestava hranilnih medijev za celične linije.

Celična linija Sestava medija Količina

U87 - DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

10 %

2 mM

1 %

HepG2 - Williams medium E

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

15 %

2 mM

1 %

NHA - DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

- Hepes pufer

10 %

2 mM

1 %

20 mM

HUVEC - MEM (Minimum Essential Medium Eagle)

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

- NEAA

10 %

2 mM

1 %

1 %

MiaPaCa-2 - DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

- Hepes pufer

10 %

2 mM

1 %

20 mM

SNB19 - MEM (Minimum Essential Medium Eagle)

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

- NEAA

10 %

2 mM

1 %

1 %

NCI H1299 - RPMI 1640

- FBS

- L-Glu

- Pen/Strep

- Hepes

- NaHCO3

5 %

2 mM

1 %

20 mM

0,69 mg/ml

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html




23

3.3.2. Odmrzovanje celičnih linij

Celične linije smo hranili zamrznjene in smo jih pred delom odmrznili. Celice smo

odmrzovali pri sobni temperaturi. Vialo s celicami smo obrisali z etanolom in jo nato v

laminariju hitro odtajali. Odtajevanje je moralo biti hitro in ni smelo trajati dlje od treh

minut, da ne bi prišlo do poškodb celic. Takoj ko se je suspenzija s celicami odtajala, smo

jo prenesli s pipetami volumna 1 ml v plastenko za gojenje, ki je imela površino 25 cm2

(T25). Previdno smo dodali 5 ml segretega hranilnega medija in jih shranili v inkubator za

24 ur. Ker so zamrznjene celice shranjene v 10 % DMSO, ki je citotoksičen, smo po 24

urah celicam zamenjali hranilni medij in s tem odstranili DMSO.

3.3.3. Presajanje celic

Celice smo presajali pri 70-80 % konfluenci (oziroma preraščenosti). Na vsako plastenko

smo napisali ime celične linije, pasaţo (število presajanj; ob vsakem presajanju se vrednost

poveča za eno) in datum presajanja.

Splošen postopek presajanja celic:

1. Odstranili smo medij z aseptično tehniko;

2. z 1x PBS (1 % raztopina) sprali celice (dolili, pazljivo pretresli in odpipetirali);

3. odlepili celice od dna plastenke z 0,25 % tripsinom/0,2 % EDTA1 (dodali tripsin in

pazljivo stresali plastenko) ter pod mikroskopom preverili, če so celice res

odlepljene. Tripsin lahko deluje le 5 minut, potem začnejo celice odmirati;

4. suspenziji v plastenki dodali vsaj 3,5 ml hranilnega medija in prenesli celotno

vsebino plastenke v 15 ml cetrifugirko;

5. cetrifugirali 5 min pri številu obratov, določenem za posamezno celično linijo;

6. supernatant odpipetirali, usedlino pa ponovno suspendirali s pipeto v 1 mL sveţega

hranilnega medija,

7. celice prešteli in ustrezen volumen suspenzije celic prenesli v novo, pravilno

označeno plastenko in dopolnili s hranilnim medijem do predpisanega volumna;

8. plastenko hranili v inkubatorju.

Pri delu smo uporabljali plastenke dveh različnih velikosti. Glede na površino plastenke

smo uporabili ustrezne volumne tekočin.

1 Za HepG2 smo uporabljali 0,1 % tripsin


24

Preglednica VI: Volumen različnih tekočin za posamezne plastenke, različnih površin.

Površina plastenke 25 cm2 75 cm

2

PBS 5 ml 5 ml

Tripsin 1,5 ml 3 ml

Volumen medija 5 ml 10 ml

Celične linije so potrebovale nekaj dni, da so si opomogle po odmrznitvi in pričele

normalno rasti. Vse celične linije, z izjemo NHA, so rasle hitro, tako da smo jih presejevali

vsake 2 do 3 dni, dokler jih ni bilo dovolj za izvedbo poskusa. Celično linijo NHA smo

presajali vsakih 21 dni.

Preglednica VII: Število obratov in čas pri centrifugiranju posameznih celičnih linij.

Celična linija Število obratov na minuto Čas centrifugiranja (min)

U87 1000 5

HepG2 800 5

HUVEC 1000 5

MiaPaCa2 1000 5

SNB19 1000 5

NCI H1299 1000 5

NHA 800 5

3.3.4. Štetje celic

Za štetje celic smo uporabili metodo barvanja celic s tripan modrim. Tripan modro je

barvilo, ki obarva samo mrtve celice. Vitalne celice se svetijo, saj je njihova membrana

nepoškodovana in neprepustna za barvilo. Za štetje celic smo ponovili splošni postopek

presajanja celic do šeste točke (podpoglavje Presajanje celic). Odpipetirali smo 10 µl

celične suspenzije in ji primešali 40 µl tripan modrega v sterilni epici. 10 µl mešanice s

tripan modrim smo nanesli na hemocitometer in pod svetlobnim mikroskopom prešteli ţive

celice. Število celic/ml smo izračunali po enačbi 2.


25

Enačba 2: n je število celic v štirih kvadratih hemocitometra, N je število celic v 1 ml celične suspenzije.

Število 5 predstavlja petkratno redčitev celic v tripan modrem, z 104 pa mnoţimo, ker je volumen suspenzije

na področju kvadrata 1/10000 ml

𝑁 =𝑛

4∗ 5 ∗ 104

3.3.5. Zamrzovanje celic

Z zamrzovanjem doseţemo dolgotrajno shranjevanje celičnih linij. Celice lahko hranimo

pri temperaturi -80ºC več mesecev ali pa pri temperaturi do - 175ºC (ob uporabi tekočega

dušika) več let. Tako shranjene kulture imajo vlogo banke, s pomočjo katere lahko

obnovimo celično, kadar je to potrebno.

Izbrane celične linije smo zamrzovali v hranilnem mediju in 10 % DMSO, ki deluje kot

krioprotektant. Pri zamrzovanju je postopek enak kot pri splošnem postopku presajanja

celic (poglavje Presajanje celic) do točke 6. V posamezno kriogeno vialo smo odpipetirali

900 µl sveţega hranilnega medija, v katerem je bilo suspendirano ustrezno število celic.

Nato smo v vialo dodali še 100 µl DMSO, kar je ustrezalo končni koncentraciji DMSO

(10 %). Vialo smo pravilno opremili z imenom linije, pasaţo, datumom zamrznitve in jo

prenesli v zamrzovalno skrinjo s temperaturo -80ºC.

3.4. MTT test

MTT (1-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolijev bromid) je rumena vodotopna snov,

ki jo mitohondrijska dehidrogenaza presnovno aktivnih celic reducira v vijoličaste netopne

kristale formazana. Nastali formazan je topen v DMSO. Njegovo količino smo merili

spektrofotometrično pri valovni dolţini 570 nm in z referenčnim filtrom valovne dolţine

690 nm. MTT preskus je enostavna, natančna in kvantitativna kolorimetrična metoda za

določanje števila celic. Razmerje med količino nastalega formazana in številom ţivih celic

je linearno in specifično za vsako celično linijo. Uporabljamo ga lahko za določevanje

citotoksičnosti snovi in njihovega vpliva na rast in razmnoţevanje celic.

3.4.1. Določanje citotoksičnosti

Na vsaki celični liniji smo opravili po tri preskuse, vsakokrat pri drugi pasaţi. Posamezen

preskus je trajal tri dni in je vseboval naslednje stopnje: nasajanje celic na mikrotitrske

plošče z 96 vdolbinicami, priprava analogov in XN za tretiranje celičnih linij, dodajanje

MTT in meritev. Preskuse smo za vsako koncentracijo delali posamično.


26

Nasajanje celic na mikrotitrske plošče

Celice smo odlepili z dna plastenke s tripsinom in jih prešteli, po predhodno opisanih

postopkih.

Število celic je moralo zadostovati, da smo lahko na vsaki plošči naenkrat opravili

preskus v petih paralelah - vse STA, XN v dveh različnih koncentracijah (40 in

100 µmol/l) in dve kontroli. Kontrol nismo tretirali z analogi in so pripomogle k

preračunavanju preţivelosti celic. Za vsak preskus smo napolnili 80 vdolbinic.

V 50 ml centrifugirko smo odmerili 16 ml hranilnega medija, kar je zadostovalo za naš

preskus. V ta hranilni medij smo dodali ustrezni volumen celične suspenzije, katerega

število celic je zadostovalo za razporeditev na naši mikrotitrski plošči.

Vsebino v centrifugirki smo med nanašanjem mešali s pomočjo vorteksa. S tem smo

dosegli enakomernost gostote celic v vsaki vdolbinici.

V vsako vdolbinico smo s pipeto vbrizgali 200 µl celične suspenzije ustrezne gostote.

Gostote nasajanja celičnih linij na mikrotitrske plošče so prikazane v Preglednici V.

Po končanem nasajanju smo mikrotitrsko ploščo pokrili, označili z datumom in

prenesli v inkubator za pribliţno 20 ur oziroma toliko časa, dokler se celice niso

prilepile na dno vsake vdolbinice.

Priprava analogov in XN za obravnavo celičnih linij

Najprej smo na sobni temperaturi odmrznili STA in XN.

Delovanje STA smo testirali na vseh celičnih linijah pri koncentraciji 40*10-6

M. Na

celičnih linijah MiaPaCa2, U87, HUVEC in SNB19 smo preskusili še koncentracijo

100*10-6

M. XN smo preskusili v koncentracijah 40*10-6

M in 100*10-6

M na vseh

celičnih linijah.

Osnovne raztopine STA smo razredčili s hranilnim medijem do ţelene koncentracije.

Predhodno smo v brezprašni komori pripravili sterilne 2 ml epice in jih označili z

številkami analogov. Nato smo v vsako epico dodali 1,2 µL pripadajočega analoga in

1200 µL hranilnega medija s pipeto. Osnovno raztopino (c=40*10-3

M) smo redčili

tisočkrat, kar je ustrezalo preskušani koncentraciji 40*10-6

M. Morali smo preračunati,

kakšen volumen XN moramo dodati v 1200 µl hranilnega medija. Za izdelavo

preskusnih raztopin STA s koncentracijo 100*10-6

M, smo v vsako epico dodali 3 µl

osnovne raztopine STA in redčili z 1200 µl hranilnega medija. Po redčenju smo epice

zaprli, homogenizirali in premešali vsebino na vorteksu.


27

Nasajene celice smo pregledali pod svetlobnim mikroskopom in nato zamenjali

uporabljen medij s novo pripravljenim medijem, ki je vseboval tudi izbrane spojine. Pri

kontrolnih celicah smo le zamenjali medij s sveţim.

Po končanem delu smo mikrotitrsko ploščo prenesli v inkubator, kjer smo jo pustili

21 ur.

Dodajanje MTT in meritev

Po 21 urah smo v vsako vdolbinico s celicami dodali 20 µl (oziroma 10 %) MTT in

ponovno prenesli v inkubator za naslednje 3 ure.

Po treh urah smo iz vdolbinic odstranili medij in MTT. Delo nato ni več potekalo v

brezprašni komori ampak v digestoriju. Kristalom formazana, ki so ostali na dnu, smo

dodali 200 µl DMSO s pipeto in jih z mešanjem raztopili.

Nazadnje smo izmerili absorbanco pri valovni dolţini 570 nm (z referenčnim filtrom

690 nm).

Preglednica VIII: Gostota nasajanja posamezne celične linije za eno vdolbinico na mirkrotitrski plošči.

Celična linija Gostota nasajanja

celičnih linij

Volumen hranilnega

medija

U87 7000/vdolbinico 200 µl

HepG2 8000/vdolbinico 200 µl

HUVEC 7000/vdolbinico 200 µl

MiaPaCa2 7000/vdolbinico 200 µl

SNB19 7000/vdolbinico 200 µl

NCI H1299 9000/vdolbinico 200 µl

NHA 30000/vdolbinico 200 µl

3.5. Statistična analiza podatkov

Pridobljene rezultate meritev smo statistično obdelali z računalniškim programom

Microsoft Excel. Rezultate smo prikazali kot povprečno vrednost meritev paralelk iz več

neodvisnih preskusov. S Studentovim t-testom (dvodelno porazdelitvijo in dvovzorčno

neenako varianco) smo primerjali rezultate vzorčnih skupin in kontrole, ki so jo


28

predstavljale celice, izpostavljene zgolj mediju. Odstopanja od kontrole smo imeli za

statistično značilna, kadar je bila verjetnost, da sta dva vzorca enaka, manjša od 0,05

(p<0,05).

Vse pridobljene rezultate meritev smo najprej normalizirali. Povprečni vrednosti kontrole

smo določili vrednost 1. Povprečne vrednosti absorbanc celic, tretiranih z XN in STA smo

nato delili s povprečno vrednostjo kontrole in dobili odstotek preţivelih celic pri

posamezni celični liniji. Za vsako celično linijo smo izvedli več neodvisnih preskusov (od

tri do pet preskusov na posamezni celični liniji). Za grafični prikaz delovanja XN in STA

na posamezni celični liniji smo primerjali normalizirane vrednosti posameznih preskusov.

Normaliziranim vrednostim neodvisnih preskusov smo določili povprečno vrednost,

standardno napako in s Studentovim t-testom primerjali normalizirane vzorčne vrednosti s

kontrolo. Odstopanja od kontrole smo obravnavali kot statistično značilna, kadar je bila

verjetnost, da sta dva vzorca enaka, manjša od 0,05 (p<0,05). Za grafični prikaz smo

normalizirane vrednosti mnoţili s 100 in tako pridobili odstotke (%). Kontrola je tako

imela vrednost 100 %.


29

4. Rezultati in razprava

Namen naše raziskave je bil preučiti delovanje XN in njegovih strukturnih analogov na

preţivelost celic in vitro. Strukturne analoge XN smo pridobili z računalniškim programom

Ftress iz brezplačne banke spojin NCI. Za ugotavljanje citotoksičnosti preiskovanih spojin

smo izbrali pet humanih rakavih celičnih linij (U87, HepG2, MiaPaCa-2, SNB19, NCI

H1299) ter dve humani nerakavi celični liniji (NHA, HUVEC). Spojine smo preskušali na

vseh celičnih linijah pri koncentraciji 40 µmol/l. Pri celičnih linijah U87, MiaPaCa-2,

SNB19 in HUVEC smo spojine preskušali še pri koncentraciji 100 µmol/l in s tem

raziskali ali je jakost delovanja sorazmerna s koncentracijo. Celične linije smo za 24 ur

izpostavili XN in STA. Za ugotavljanje citotoksičnosti smo uporabili preskus MTT, pri

čemer so presnovno aktivne (ţive) celice po encimski poti spreminjale tetrazolijevo sol

MTT v netopne kristale formazana. Tega smo raztopili v DMSO in ga določali

spektrofotometrično. Vrednosti nastalega formazana so linearno korelirale s številom ţivih

celic. Pridobljene rezultate meritev smo statistično obdelali s programom Microsoft Excel.

Izračunali smo povprečno vrednost, standardni odklon in s Studentovim t-testom določili

statistično značilno odstopanje od kontrolnih vrednosti (p<0,05).

4.1. Citotoksično delovanje XN na vseh celičnih linijah

0

20

40

60

80

100

120

140

Pre

živ

elo

st ce

lic

v o

dst

otk

ih

Celične linije

Citotoksičnost XN na vseh celičnih linijah pri koncentracijah 40 in

100 µM

Graf 1: Rezultati posameznega MTT preskusa in prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD)

posameznih celičnih linij po 24-urni izpostavljenosti XN s koncentracijo 40 µmol/l ali 100 µmol/l in

primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami). Stolpci, ki so obarvani z rdečo barvo, prikazujejo posamezne

celične linije, katerih rezultati statistično značilno odstopajo od kontrole.


30

Poleg strukturnih analogov ksantohumola (STA XN) smo preučili tudi vpliv XN na vseh

celičnih linijah v koncentracijah 40 µmol/l in 100 µmol/l. Pri koncentraciji 100 µmol/l je

XN deloval toksično na vse celične linije in je statistično značilno zniţal preţivelost vseh

celičnih linij: U87 16,0% (p=0,007), HepG2 15,6% (p=0,003), HUVEC 17,7% (p=0,022),

MiaPaCa-2 7,7% (p=3*10-4

), SNB19 45,2% (p=0,004), NCI H1299 11,3% (p=4*10-5

) in

NHA 27,6%(p=6*10-4

).

XN je pri koncentraciji 40 µmol/l statistično značilno zniţal preţivelost celičnih linij U87

(57,9 %; p=0,003), MiaPaCa-2 (64,6%; p=0,034), NCI H1299 (37,2%; p=0,049) in NHA

(70,6%; p=0,028). Pri tej koncentraciji je imela najmanjšo preţivelost celična linija NCI

H1299 (37%; p=0,049), v primerjavi s kontrolo (100 % preţivelost celic). Na nerakavih

celičnih linijah NHA in HUVEC je bila preţivelost celic 70,6 % (p=0,028) in 56 %

(p=0,074). Preţivelost celic NHA je sicer nekoliko večja v primerjavi z rakavimi celičnimi

linijami, vendar iz rezultatov ne moremo sklepati na selektivno citotoksično delovanje XN

na rakave celice. Preţivelost celične linije SNB19 po izpostavitvi XN s koncentracijo

40 µmol/l in je bila najvišja (96 %; p=0,151) in ni bila statistično značilno različna od

kontrole. Pri 100 µmol/l koncentraciji XN, je bila preţivelost SNB19 prav tako višja v

primerjavi z drugimi celičnimi linijami (45 %; p=0,004) (Graf 1).

Naše rezultate lahko primerjamo tudi z rezultati podobnih raziskav citotoksičnosti XN.

Maherjeva je v svojem diplomskem delu določila koncentracijsko območje selektivne

citotoksičnosti, in sicer od 10 µmol/l do 40 µmol/l (36). Pri tej koncentraciji se je

preţivelost rakavih in nerakavih celic ţe začela zmanjševati. V primerjavi s preţivelostjo

nerakave celične linije NHA iz naše raziskave, se je preţivelost enake celične linije v

raziskavi Maherjeve zniţala pri nekoliko višjih koncentracijah XN (60 µmol/l). To razliko

lahko pripišemo uporabi vzorca XN z drugačno aktivnostjo oziroma čistoto spojine.

Na podlagi rezultatov lahko sklepamo na različno občutljivost celičnih linij na XN.

Podobne ugotovitve so v svoji študiji objavili tudi Miranda in sodelavci. Raziskovali so

antiproliferacijske in citotoksične vplive preniliranih flavonoidov na človeške rakave

celične linije MCF-7 (rak dojke), HT-29 (rak debelega črevesa) in A-2780 (rak jajčnikov).

Celice raka jajčnikov so bile bolj občutljive na XN v primerjavi s celicami raka debelega

črevesa in raka dojk (5). Po drugi strani je bil XN izrazito citotoksičen za celično linijo

raka debelega črevesa z IC50 (polovična maksimalna zaviralna koncentracija, ang. half-

maximal inhibitory concentration) z 4,1 µmol/l (37), za celice bolnikov s kronično


31

levkemijo pa XN zavira rast s povprečnim IC50 24 µmol/l (38). Celične linije, ki smo jih

uporabili v naši raziskavi, so si različne. Izolirane so bile iz različnih tkiv in imajo

posledično tudi različne lastnosti, kot so lahko npr. presnovne značilnost, hitrost rasti in

razmnoţevanja, vrsta celic (rakave oziroma nerakave), itd. Iz prej omenjenih raziskav je

razvidno, da se vsaka celična linija različno odzove na izpostavitev XN, saj na nekatere

deluje bolj citotoksično kot na druge. To je razvidno tudi iz naše raziskave. Moţno je, da

so nekatere celične linije zaradi naštetih lastnosti bolj občutljive na XN. Podobne zaključke

je moţno posplošiti na preučevane STA XN, kar je pokazala tudi naša raziskava.

4.2. Preskus MTT na celični liniji U87

0

20

40

60

80

100

120

140

Pre

živ

elo

st c

elic

v o

dst

otk

ih

Strukturni analogi XN

MTT U87 40 µM

Graf 2: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije U87, po 24-urni izpostavljenosti

preskušanim spojinam s koncentracijo 40 µmol/l in primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami). Graf

prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih vzporednih ponovitvah. Stolpci, ki so

obarvani z rdečo barvo, prikazujejo posamezne STA, katerih rezultati statistično značilno odstopajo od

kontrole.

Pri preskušani koncentraciji 40 µmol/l je zgolj STA 5 statistično značilno zavrl rast celične

linije U87 (p=0,012). Odstotek preţivelih celic pri obravnavi s tem analogom je bila 69% v

primerjavi s kontrolo (100 % preţivelost). Drugi preiskovani STA niso statistično značilno

vplivali na preţivelost celic pri isti koncentraciji, zato jih ne moremo obravnavati kot

biološko pomembne. STA 6 (103%; p=0,56) in 7 (116%; p=0,022) sta v primerjavi s

kontrolo, povečala število celic. Pri STA 7 je bilo to zvišanje statistično značilno.


32

0

20

40

60

80

100

120

140P

reži

vel

ost

cel

ic v

od

sto

tkih

Struktuturni analogi XN

MTT U87 (100 µM)

Graf 3: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije U87, po 24-urni izpostavljenosti




kontrole.

Pri koncentraciji 100 µmol/l so statistično značilno zniţali preţivelost celic STA 1

(79,4 %; p=0,014), 4 (53,9 %; p=0,016), 5 (49,6 %; p=0,003), 6 (87,3 %; p=0,044) in 8

(45,9; p=0,043) (Graf 3). Iz primerjave rezultatov preţivelosti z uporabo preskušanih

koncentracij je razvidno, da je biološki učinek STA pri tej celični liniji odvisen od

koncentracije, saj je preţivelost celic pri višji koncentraciji STA, manjša. Nobeden izmed

analogov s koncentracijo 100 µmol/l nima enakovrednega delovanja kot XN. Odstotek

preţivelih celic je po izpostavitvi XN 16 % (p=0,007), medtem ko je bila najniţja

preţivelost celic po izpostavitvi STA 8, in sicer 45,9 % (p=0,043) (Graf 4).


33

0

20

40

60

80

100

120

140

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih


Preživelosti celic (U87) po izpostavitvi obema

koncentracijama

U87 40 uM

U87 100uM

Graf 4: Prikaz odstotkov preţivelih celic celične linije U87 po 24-urni izpostavljenosti preskušanim spojinam

s koncentracijo 40 µmol/l ali 100 µmol/l.

4.3. Preskus MTT na celični linije HepG2

0

20

40

60

80

100

120

Pre

živ

elo

st c

eliv

v o

dst

oti

h


MTT HepG2 40 µM

Graf 5: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HepG2 po 24-urni izpostavljenosti




kontrole.

Na tej celični liniji smo opravili preskus MTT le z uporabo preskušanih spojin s

koncentracijo 40 µmol/l. Celice so rasle v skupkih, ki smo jih pred nasaditvijo razbili z

brizgo. Zaradi tega procesa je bilo delo z njimi zamudno. Poleg tega pa so bili rezultati


34

med posameznimi preskusi teţko primerljivi, kar je razvidno iz večjih standardnih

odklonov. Preţivelost celične linije HepG2 so statistično značilno zniţali naslednji analogi:

4 (50,5 %; p=0,029), 5 (70,7 %; p=0,001), 6 (50,0 %; p=0,004), 8 (80,7 %; p=0,012), 9

(79,4 %; p=0,033). Preţivelost celic po izpostavitvi STA 4 (50,5 %,p=0,029) in 6 (50,0 %,

p=0,004) je bila niţja od preţivelosti celic po izpostavitvi XN (57,3 %; p=0,179). Iz teh

rezultatov lahko sklepamo, da imata omenjena strukturna analoga izrazitejši citotoksični

učinek kot pa XN. Preţivelost celic po izpostavitvi preostalim analogom ni bila statistično

značilno spremenjena.

4.4. Preskus MTT na celični liniji HUVEC

0

20

40

60

80

100

120

140

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih


MTT HUVEC (40 µM)

Graf 6: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HUVEC, po 24-urni izpostavljenosti




kontrole.

STA s koncentracijo 40 µmol/l, ki so po obravnavi celične linije HUVEC statistično

značilno zniţali njeno preţivelost, so: 4 (62,9 %; p=0,016), 6 (59,5 %; p=0,003), 8

(57,9 %; p=0,003) in 9 (59,8 %; p=0,008). Preţivelost celic po izpostavitvi XN pri isti

koncentraciji (56,2 %) je bila niţja v primerjavi z rezultati preţivelosti celic po izpostavitvi

STA (Graf 6).


35

0

20

40

60

80

100

120

140P

reživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih

Strukturni anlogi XN

MTT HUVEC (100 µM)

Graf 7: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HUVEC po 24-urni izpostavljenosti

preskušanim spojinam s koncentracijo 100 µmol/l in primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami Graf



kontrole.

STA s koncentracijo 100 µmol/l, ki so statistično značilno zniţali preţivelost celic, so: 1

(55,2 %; p=0,005), 4 (75,4 %; p=0,015), 6 (39,2 %; p=0,004) in 8 (44,9 %; p=0,0002).

Preţivelost celic po izpostavitvi XN z enako koncentracijo (17,7 %, p=0,022) je bila niţja

v primerjavi s STA (Graf 7). Iz primerjave rezultatov preţivelosti celic po izpostavitvi

obema koncentracijama, je razvidno, da je odziv po izpostavitvi STA 2, 4, 5, 7 in 9,

obratno sorazmeren. Po izpostavitvi celic omenjenim STA s koncentracijo 100 µmol/l, se

je število celic, v primerjavi s kontrolo, povečalo (Graf 8).

Celična linija HUVEC je nerakava celična linija in izpostavitev XN z obema

koncentracijama je, v primerjavi s kontrolo (100 % preţivelost), močno zniţala preţivelost

celične linije. Iz primerjave je razvidno, da imajo vsi STA, v primerjavi s XN, manjši

biološki učinek. Ker gre za nerakavo celično linijo, bi to lastnost STA lahko upoštevali pri

nadaljnjem rešetanju spojin, saj bi s tem pridobili skupino spojin z višjo stopnjo selektivne

citotoksičnosti za rakave celice. Izpostavitev celične linije koncentraciji 100 µmol/l, je pri

nekaterih STA celo povečalo število celic. To povečanje bi lahko povezali z morebitnim


36

estrogenim delovanjem nekaterih STA na celice, kar bi posledično lahko tudi ugodno

vplivalo na rast in razmnoţevanje nerakavih celic.

0

20

40

60

80

100

120

140

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih


Preživelosti celic (HUVEC) po izpostavitvi obema

koncentracijama

HUVEC 40 uM

HUVEC 100 uM

Graf 8: Prikaz odstotkov preţivelih celic celične linije HUVEC po 24-urni izpostavljenosti strukturnim

analogom XN s koncentracijo 40 µmol/l ali 100 µmol/l.

4.5. Preskus MTT na celični liniji MiaPaCa2

0

20

40

60

80

100

120

140

Pre

živ

elo

st c

elic

v o

dst

otk

ih


MTT MiaPaCa-2 (40 µM)

Graf 9: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije MiaPaCa-2 po 24-urni izpostavljenosti




kontrole.


37

STA s koncentracijo 40 µmol/l, ki so po tretiranju celične linije MiaPaCa-2 statistično

značilno zniţali njeno preţivelost, so: 1 (77,2 %; p=0,016), 2 (86,8 %; p=0,005), 4

(59,8 %; p=0,039), 5 (45,3 %; p=0,003), 6 (77,5 %; p=0,031), 8 (60,9 %; p=0,016) in 9

(59,3 %; p=0,012). Preţivelost celic je bila po izpostavitvi STA 4 , 5, 8 in 9 niţja v

primerjavi z rezultati preţivelosti celic po izpostavitvi XN z enako koncentracijo (64,6 %,

p=0,034) (Graf 9).

0

20

40

60

80

100

120

140

Pre

živ

elo

st c

elic

v o

dst

otk

ih

Strukturni analogi

MTT MiaPaCa-2 (100 µM)

Graf 10: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije MiaPaCa-2 po 24-urni

izpostavljenosti preskušanim spojinam s koncentracijo 100 µmol/l in primerjava s kontrolo (netretiranimi

celicami Graf prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih vzporednih ponovitvah.

Stolpci, ki so obarvani z rdečo barvo, prikazujejo posamezne STA, katerih rezultati statistično značilno

odstopajo od kontrole.

Pri koncentraciji 100 µmol/l so preţivelost celic statistično značilno zniţali STA: 1

(55,4 %; p=0,01), 4 (41,6 %; p=0,001), 5 (46,2 %; p=0,021), 6 (60,0 %; p=0,001), 8

(48,6 %; p=0,0008) in 9 (50,9 %; p=0,012). Preţivelost celic po izpostavitvi XN pri isti

koncentraciji (7,8 %, p=0,0003) je bila niţja v primerjavi z rezultati preţivelosti celic po

izpostavitvi STA, ki so jo prav tako statistično značilno zniţali (Graf 10). Razlog je lahko

drugačen mehanizem delovanja STA v primerjavi s XN, saj je citotoksično delovanje STA

manjša. Iz primerjave rezultatov preţivelosti celic je razvidna manjša preţivelost celic po

izpostavitvi preskušanim spojinam z višjo koncentracijo, kar nakazuje, da je biološka

aktivnost STA premosorazmerna s koncentracijo (Graf 11).


38

0

20

40

60

80

100

120

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih


Preživelosti celic (MiaPaCa-2) po izpostavitvi obema

koncentracijama

MiaPaCa2 40 uM

MiaPaCa2 100 uM

Graf 11: Prikaz odstotkov preţivelih celic celične linije MiaPaCa-2 po 24-urni izpostavljenosti preskušanim

spojinam s koncentracijo 40 µmol/l ali 100 µmol/l.

4.6. Preskus MTT na celični liniji NCI H1299

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih

Strukturni analogi

MTT NCI H1299 (40 µM)

Graf 12: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije NCI H1299 po 24-urni

izpostavljenosti preskušanim spojinam s koncentracijo 40 µmol/l) in primerjava s kontrolo (netretiranimi

celicami). Graf prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih vzporednih ponovitvah.

Stolpci, ki so obarvani z rdečo barvo, prikazujejo posamezne STA, katerih rezultati statistično značilno

odstopajo od kontrole.

Na tej celični liniji smo opravili preskus MTT le z uporabo preskušanih spojin s

koncentracijo 40 µmol/l. Preţivelost celic so statistično značilno zniţali naslednji analogi:

3 (89,8 %; p=0,006), 4 (72,4 %; p=0,011), 5 (50,4 %; p=0,009), 6 (70,8 %; p=0,027), 7

(82,7 %; p=0,014), 8 (65,9 %; p=0,002) in 9 (61,1 %; p=0,013). Preţivelost celic po


39

izpostavitvi XN (37,2%, p=0,049), je bila niţja v primerjavi z rezultati preţivelosti celic po

izpostavitvi STA. Rezultati nakazujejo, da XN deluje bolj citotoksično na to celično linijo,

kot pa STA (Graf 12).

4.7. Preskus MTT na celični liniji SNB19

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Pre

živ

elo

st c

elic

v o

dst

otk

ih


MTT SNB19 (40 µM)

Graf 13: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije SNB19 po 24-urni izpostavljenosti

preskušanim spojinam s koncentracija 40 µmol/l in primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami). Graf



kontrole.

STA s koncentracijo 40 µmol/l, ki so po izpostavitvi celični liniji SNB19 statistično

značilno zniţali njeno preţivelost, so: 5 (36,8 %; p=3*10-5

), 8 (85,3 %; p=0,029) in 9

(78,6 %; p=0,046). Vsi STA, ki so statistično značilno zniţali preţivelost celic, so v

primerjavi z rezultati preţivelosti celic po izpostavitvi XN z enako koncentracijo, delovali

bolj citotoksično. Najniţja preţivelost celic je bila po izpostavitvi STA 5 (36,8 %), medtem

ko je bila preţivelost pri XN 95,8 % (p=0,151). STA 1, 2, 4 so pri tej koncentraciji ugodno

vplivali na rast celic in v primerjavi s kontrolo, se je njihovo število povečalo. Vzrok tega

povečanja so lahko ţe manjše strukturne razlike STA v primerjavi s strukturo XN. XN ima

antiestrogeno delovanje (11). Na podlagi rezultatov preţivelosti celic po izpostavitvi STA,

je moţno sklepati na šibke estrogene lastnosti STA, kar ima lahko pozitiven vpliv na rast in

razmnoţevanje celic (Graf 13).


40

0

20

40

60

80

100

120

Kontrola XN 100 3 6 8 9

Pre

živ

elo

st c

elic

v o

dst

otk

ih


MTT SNB19 (100 µM)

Graf 14: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije SNB19 po 24-urni izpostavljenosti

preskušanim spojinam s koncentracijo 100 µmol/l) in primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami). Graf



kontrole.

Preučevali smo citotoksičnost naslednjih STA s koncentracijo 100 µmol/l: 3, 6, 8 in 9.

Izbrali smo analoge, ki so pri preskusu z uporabo koncentracije 40 µmol/l zavrli rast celic.

Preţivelost celic so statistično značilno zniţali STA 6 (30,4 %; p=0,001), 8 (52,5 %;

p=0,0006) in 9 (52,6 %; p=0,004). Preţivelost celic po izpostavitvi STA 6 (30,4 %,

p=0,001) je bila niţja v primerjavi z rezultati preţivelosti po izpostavitvi XN z enako

koncentracijo (50,0 %, p=0,0003) (Graf 14). Iz primerjave rezultatov preţivelosti celic po

izpostavitvi obema koncentracijama je razvidno, da je preţivelost celic po izpostavitvi

preskušanim spojinam z višjo koncentracijo, manjša. (Graf 15).


41

0

20

40

60

80

100

120

140

Pre

žive

lost

ce

lic v

od

sto

tkih


Preživelosti celic (SNB19) po izpostavitvi obema

koncentracijama

SNB19 40 uM

SNB 19 100 uM

Graf 15: Prikaz odstotkov preţivelih celic celične linije SNB19 po 24-urni izpostavljenosti strukturnim

analogom XN s koncentracijo 40 µmol/l ali 100 µmol/l.

4.8. Preskus MTT na celični liniji NHA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Preživ

elo

st c

eli

c v

od

sto

tkih


MTT NHA (40 µM)

Graf 16: Prikaz odstotkov preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije NHA po 24-urni izpostavljenosti




kontrole.


42

Na nerakavi celični liniji NHA smo opravili preskus MTT le z uporabo preskušanih spojin

s koncentracijo 40 µmol/l. Preţivelost sta statistično značilno zniţali spojini 5 (57,8 %;

p=0,003) in 6 (80,3 %; p=0,045). STA 1 (130 %; p=0,127) in 2 (128 %; p=0,081) sta pri tej

koncentraciji povečala število celic, vendar to povišanje ni bilo statistično značilno.

Preţivelost po izpostavitvi XN je bila pri tej koncentraciji 70,6 % (p=0,028) in v primerjavi

z ostalimi STA, niţja (Graf 16). Vzrok večje preţivelosti bi lahko bilo šibko estrogeno

delovanje omenjenih STA. Lahko sklepamo, da imajo STA ugoden vpliv na rast in

razmnoţevanje celic na nerakavi celični liniji in morebiten regenerativen učinek na zdrave

celice (Graf 17).

4.9. Strnjen pregled rezultatov

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Kontrola XN 40 XN 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Preživ

elo

st celi

c v

od

sto

tkih


Primerjava rezultatov vseh celičnih linij

U87

HepG2

HUVEC

MiaPaCa2

SNB19

NCI H1299

NHA

Graf 17: Prikaz odstotkov preţivelih celic vseh celičnih linij po izpostavitvi preskušanim spojinam s

koncentracijo 40 µmol/l.

Primerjava rezultatov citotoksičnega delovanja vseh STA na izbranih celičnih linijah

prikazuje raznolikost delovanja STA (Graf 17). V primerjavi z rezultati delovanja XN na

izbrane celične linije pri enaki koncentraciji, lahko izpostavimo STA, ki so najpogosteje

zniţali preţivelost celic. To so STA 4, 5, 6, 8 in 9. Vsak od naštetih STA je uspešno zniţal

preţivelost različnih celičnih linij, kar nakazuje na morebitno drugačno občutljivost celične

linije za določen STA. Tako STA 4 statistično značilno zniţa preţivelost celic pri celičnih

linijah HepG2, HUVEC, MiaPaCa-2 in NCI H1299. STA 5 lahko označimo kot najbolj


43

učinkovitega, saj je na vsaki celični liniji, razen nerakavi celični liniji HUVEC, statistično

značilno zniţal preţivelost celic. Tako je pri celičnih linijah SNB19 in MiaPaCa-2 bila, v

primerjavi s preţivelostjo celic po izpostavitvi XN, preţivelost celic celo niţja. STA 6 je

statistično značilno zniţal preţivelost celic na celičnih linijah HepG2, HUVEC,

MiaPaCa-2, NCI H1299 in NHA. Na celični liniji MiaPaCa-2 pa je bila preţivelost celic, v

primerjavi s XN, niţja. STA 8 je statistično značilno zniţal preţivelost celičnih linij

HepG2, HUVEC, MiaPaCa-2 in NCI H1299. Prav tako pa je na enakih celičnih linijah

statistično značilno zniţal preţivelost celic STA 9.

Razlika v delovanju med XN in STA je lahko posledica strukturne narave in razporeditve

funkcionalnih skupin v molekuli halkona. XN ima dva fenilna obroča povezana z verigo

treh ogljikovih atomov, in sicer α, β nenasičenega karbonilnega sistema. Fenilni obroč B

ima hidroksilno skupino na mestu 4, fenilni obroč A pa ima hidroksilni skupini na mestih

2' in 4', na mestu 3' prenilno skupino in na mestu 6' metoksi skupino. Plochmann in

sodelavci so v svoji raziskavi preiskovali od strukture odvisno delovanje flavonoidov, med

drugim tudi XN. Njihova študija razkriva, da flavonoidi laţje prehajajo celične membrane

zaradi večje lipofilnosti s tem dosegajo višje znotrajcelične koncentracije. XN ima na

obroču A, na mestu 3', prenilno skupino za katero je znano, da ima večjo afiniteto za

celične membrane (39). Vsi omenjeni STA so si med seboj zelo podobni: imajo fenilna

obroča, povezana z verigo treh ogljikovih atomov α, β nenasičenega karbonilnega sistema,

prav tako kot XN.

STA 4 je v primerjavi s XN, povzročil manjšo preţivelost celičnih linij HepG2 in

MiaPaCa-2. Na mestu 3' na fenilnem obroču A ima metoksi skupino namesto prenilne

STA 4 STA 5

STA 8

STA 6

STA 9

Slika 8: Izbrani STA ki so največkrat zniţali preţivelost celic.


44

skupine, na mestu 2' ima hidroksilno skupino in na mestu 5' metilno skupino. Fenilni obroč

B nima hidroksilne skupine, kakor jo ima XN.

STA 5 je v primerjavi s XN, povzročil manjšo preţivelost celičnih linij MiaPaCa-2 in

SNB19. Na fenilnem obroču A ima na mestu 3' brom, na mestu 4' in 6' metoksi skupino, na

mestu 2' pa hidroksilno skupino. Na fenilnem obroču B ima na mestu 4 metoksi skupino.

STA 6 je v primerjavi s XN, povzročil manjšo preţivelost celične linije MiaPaCa-2. Na

fenilnem obroču A ima na mestih 2' in 4' hidroksilno skupino. Na fenilnem obroču B pa

ima hidroksilno skupino na mestu 2.

STA 8 je v primerjavi s XN, povzročil manjšo preţivelost celične linije MiaPaCa-2.

Statistično značilno je zmanjšal tudi preţivelost celičnih linij HUVEC in NCI H1299. Na

fenilnem obroču A ima na mestu 4' in 6' metoksi skupino, na mestu 3' nima funkcionalne

skupine, na mestu 2' pa je hidroksilna skupina. fenilni obroč B ni substituiran.

STA 9 je v primerjavi s XN, povzročil manjšo preţivelost celične linije MiaPaCa-2.

Statistično značilno je zmanjšal tudi preţivelost celičnih linij HUVEC in NCI H1299,

vendar je bila pri slednjih, v primerjavi s podatki po izpostavitvi XN, preţivelost večja. Na

fenilnem obroču A ima na mestu 4' metoksi skupino, na mestu 2' pa hidroksilno skupino.

Fenilni obroč B ni substituiran.

Na podlagi primerjav struktur XN in STA (4, 5, 8, 9), lahko sklepamo da je za citotoksično

delovanje nujno potrebna osnovna struktura:

dva fenilna obroča,

povezana z verigo treh ogljikovih atomov α, β nenasičenega karbonilnega sistema.

Prenilna skupina na mestu 3' fenilnega obroča A je verjetno pripomogla k boljšemu

citotoksičnemu delovanju XN na vse celične linije, in sicer zaradi vpliva na lipofilnost.

STA 5 ima namesto prenilne skupine brom (Br), vendar je ta zamenjava, v primerjavi s

XN, bolj izrazito zmanjšala preţivelost celičnih linij MiaPaCa-2 in SNB19. Zamenjava

prenilne skupine z metoksi skupino v STA 4 je verjetno povzročila zmanjšanje preţivelosti

celičnih linij HepG2 in MiaPaCa2. STA 6 ima mesto 3' nesubstituirano in je, v primerjavi s

XN, povzročil manjšo preţivelost celične linije HepG2. Tudi STA 8 in 9 nimata prenilne

skupine na mestu 3', a imata zaradi tega verjetno večjo jakost delovanja na celično linijo

MiaPaCa-2. STA 7, ki prav tako ni substituiran na mestu 3', je celo povečal število celic

rakavih celičnih linij (U87, SNB19 in MiaPaCa2). Na preostalih celičnih linijah pa je


45

zmanjšal preţivelost celic, a to zmanjšanje ni bilo statistično značilno. Na podlagi naštetih

dejstev je moţno sklepati, da je za citotoksično delovanje morda potrebna velika lipofilna

funkcionalna skupina na mestu 3' fenilnega obroča A.

Tako kot XN imajo vsi izbrani STA hidroksilno skupino na mestu 2' v fenilnem obroču A.

Edini STA, ki ni imel hidroksilne skupine na mestu 2', in sicer 1 pa je, primerjavi s XN,

imel manjšo jakost delovanja na vseh celičnih linijah. Lahko sklepamo, da je za

citotoksično delovanje morebiti potrebna hidroksilna skupina na mestu 2' fenilnega obroča

A.

Mesto 5' v strukturi XN ni substituirano. STA 4 pa ima na mestu 5' metilno skupino in, v

primerjavi s XN, morebiti posledično večjo jakost delovanja na celični liniji HepG2 in

MiaPaCa-2. Preostali analogi prav tako nimajo substituiranega mesta 5', kar najbrţ

pripomore k boljšemu citotoksičnemu delovanju.

XN ima v strukturi hidroksilno skupino na mestu 4' fenilnega obroča A. STA 5, 8 in 9

imajo na tem mestu metoksi spojino in, v primerjavi s XN, morebiti posledično večjo

jakost delovanja na celičnih linijah SNB19 in MiaPaCa-2.

Na mestu 6' fenilnega obroča A je v strukturi XN metoksi skupina. STA 4, 6, 9 ne tem

mestu niso substituirani. Odsotnost te funkcionalne skupine je lahko povezana z večjo

jakostjo delovanja na celične linije MiaPaCa-2 in HepG2. STA 5 ima na mestu 6' metoksi

skupino. Jakost delovanja tega analoga je med naštetimi tudi najmočnejša. Lahko

sklepamo, da je za večjo jakost citotoksičnega delovanja morebiti potrebna metoksi

skupina na mestu 6'.

Na mestu 4 fenilnega obroča B ima XN hidroksilno skupino. STA 4, 8 in 9 na tem mestu

niso substituirani. Razlika morebiti ponovno vpliva zgolj na določene celične linije. STA 5

ima na tem mestu metoksi spojino in je zaradi tega moţno učinkoviteje delovanje na

celični linji MiaPaCa-2 in SNB19. Ker STA 5 zmanjšuje preţivelost nekaterih celičnih

linij v večji meri kot XN, je morebiti za večjo jakost citotoksičnega delovanja ugodnejša

zamenjava hidroksilne skupine z metoksi skupino.

Če povzamemo lahko sklepamo, da k boljšemu citotoksičnemu delovanje STA pripomore

substitucija na mestu 3' fenilnega obroča A z veliko lipofilno funkcionalno skupino. Mesto

2' fenilnega obroča A je najbolje, da ostane substituirano z hidroksilno skupino, mesto 5'


46

ostane nesubstituirano, mesto 6' zaseda metoksi skupina, hidroksilno skupino na mestu 4

fenilnega obroča B pa bi lahko nadomestila metoksi skupina.


47

5. Sklep

Preučevali smo delovanje XN in njegovih strukturnih analogov na preţivelost celic in

vitro. Strukturne analoge XN smo pridobili z računalniškim programom Ftress iz banke

prosto dostopnih spojin NCI. Za ugotavljanje citotoksičnosti preiskovanih spojin smo

izbrali pet humanih rakavih celičnih linij (U87, HepG2, MiaPaCa-2, SNB19, NCI H1299)

ter dve humani nerakavi celični liniji (NHA, HUVEC). Spojine smo preskušali na vseh

celičnih linijah pri koncentraciji 40 µmol/l. Pri celičnih linijah U87, MiaPaCa-2, SNB19 in

HUVEC smo spojine preskušali še pri koncentraciji 100 µmol/l in s tem raziskali ali je

jakost delovanja sorazmerna s koncentracijo. Celične linije smo za 24 ur izpostavili XN in

STA. Za ugotavljanje citotoksičnosti smo uporabili preskus MTT. Pridobljene rezultate

meritev smo statistično obdelali s programom Microsoft Excel. Preučili smo odziv celic na

različne koncentracije XN in njegovih STA ter rezultate slednjih primerjali z rezultati za

XN. Na podlagi tako pridobljenih rezultatov smo ovrednotili citotoksičnost XN in njegovih

STA ter s tem preučili morebitno učinkovitost protitumorskega delovanja. V primerjavi z

rezultati delovanja XN na izbrane celične linije pri enaki koncentraciji, lahko izpostavimo

STA, ki so najpogosteje zniţali preţivelost celic. To so STA 4, 5, 6, 8 in 9. Vsak od

naštetih STA je uspešno zniţal preţivelost različnih celičnih linij, kar nakazuje na

morebitno drugačno občutljivost celične linije za določen STA.

Rezultati naše raziskave nakazujejo, da je za citotoksično delovanje potreben osnovni

skelet: dva fenilna obroča, povezana z verigo treh ogljikovih atomov α, β nenasičenega

karbonilnega sistema, mesto 3' fenilnega obrača A naj ima veliko lipofilno funkcionalno

skupino in mesto 5' naj ostane nesubstituirano. Fenilni obroč B bi z morebitno metoksi

skupino na mestu 4, izkazoval učinkovitejše citotoksično delovanje.

Na osnovi dobljenih rezultatov predlagamo nadaljnji razvoj spojin v smeri iskanja spojin z

učinkovitejšo citotoksičnostjo na vseh rakavih celičnih linijah in večjo selektivnostjo za

rakave celice. V procesu razvoja spojin bi bilo smiselno še naprej iskati spojine, ki so

strukturni analogi XN in ob tem upoštevati predlagane strukturne značilnosti, za katere

smo v naši študiji ugotovili povezanost s citotoksičnim delovanjem.


48

6. Literatura

1. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Flower RJ: Rang and Dale's Pharmacology, 6,

Churchill Linvingstone, 2007:718-730

2. Stevens JF, Page JE: Xanthohumol and related prenylfavonoids from hops and beer: to

your good health! Phytochemistry 2004; 65: 1317-30.

3. Middleton E Jr, Kandaswami C, Theoharides TC: The effects of plant flavonoids on

mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol

Rev. 2000; 52: 673-751.

4. Botta B, Vitali A, Menendez P, Misiti D, Delle Monache G: Prenylated flavonoids:

pharmacology and biotechnology. Curr Med Chem. 2005; 12(6): 717-39.

5. Miranda CL, Stevens JF, Helmrich A, Henderson MC, Rodriguez RJ, Yang

YH,Deinzer ML, Barnes DW, Buhler DR: Antiproliferative and cytotoxic effects of

prenylated flavonoids from hops (Humulus lupulus) in human cancer cell lines. Food

Chem Toxicol. 1999; 37: 271-85

6. Stevens JF, Taylor AW, Deinzer ML: Quantitative analysis of xanthohumol and related

prenylflavonoids in hops and beer by liquid chromatography-tandem mass

spectrometry. J Chromatogr A. 1999; 832(1-2): 97-107.

7. Magalhães PJ, Carvalho DO, Cruz JM, Guido LF, Barros AA: Fundamentals and

health benefits of xanthohumol, a natural product derived from hops and beer. Nat Prod

Commun. 2009; 4(5): 591-610

8. Yilmazer M, Stevens JF, Deinzer ML, Buhler DR: In vitro biotransformation of

xanthohumol, a flavonoid from hops (Humulus lupulus), by rat liver microsomes. Drug

Metab Dispos. 2001; 29(3): 223-31

9. Yilmazer M, Stevens JF, Buhler DR: In vitro glucuronidation of xanthohumol, a

flavonoid in hop and beer, by rat and human liver microsomes. FEBS Lett. 2001;

491(3): 252-6

10. Nookandeh A, Frank N, Steiner F, Ellinger R, Schneider B, Gerhäuser C, Becker H:

Xanthohumol metabolites in faeces of rats. Phytochemistry 2004; 65(5): 561-70

11. Gerhäuser C: Beer constituents as potential cancer chemopreventive agents. Eur J

Cancer. 2005; 41(13): 1941-54

12. Avula B, Ganzera M, Warnick JE, Feltenstein MW, Sufka KJ, Khan IA. High-

performance liquid chromatographic determination of xanthohumol in rat plasma,

urine, and fecal samples. J Chromatogr Sci. 2004; 42(7): 378-82

13. Gerhauser C, Alt A, Heiss E, Gamal-Eldeen A, Klimo K, Knauft J, Neumann I, Scherf

HR, Frank N, Bartsch H, Becker H: Cancer chemopreventive activity of Xanthohumol,

a natural product derived from hop. Mol Cancer Ther. 2002; 1(11): 959-69

14. Miranda CL, Stevens JF, Ivanov V, McCall M, Frei B, Deinzer ML, Buhler DR:

Antioxidant and prooxidant actions of prenylated and nonprenylated chalcones and

flavanones in vitro. J Agric Food Chem. 2000; 48(9): 3876-84

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11121513

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11121513


49

15. Rodriguez RJ, Miranda CL, Stevens JF, Deinzer ML, Buhler DR: Influence of

prenylated and non-prenylated flavonoids on liver microsomal lipid peroxidation and

oxidative injury in rat hepatocytes. Food Chem Toxicol. 2001; 39(5): 437-45

16. Gerhäuser C: Broad spectrum anti-infective potential of xanthohumol from hop

(Humulus lupulus L.) in comparison with activities of other hop constituents and

xanthohumol metabolites. Mol Nutr Food Res. 2005; 49(9): 827-31

17. Henderson MC, Miranda CL, Stevens JF, Deinzer ML, Buhler DR: In vitro inhibition

of human P450 enzymes by prenylated flavonoids from hops, Humulus lupulus.

Xenobiotica. 2000; 30(3): 235-51

18. Zhao F, Nozawa H, Daikonnya A, Kondo K, Kitanaka S: Inhibitors of nitric oxide

production from hops (Humulus lupulus L.). Biol Pharm Bull. 2003; 26(1): 61-5

19. Dell'Eva R, Ambrosini C, Vannini N, Piaggio G, Albini A, Ferrari N: AKT/NF-kappaB

inhibitor xanthohumol targets cell growth and angiogenesis in hematologic

malignancies. Cancer. 2007; 110(9): 2007-11

20. Bajorath J: Integration of virtual and high-throughput screening. Nat Rev Drug Discov.

2002 ; 1(11): 882-94

21. Shoichet BK: Virtual screening of chemical libraries. Nature. 2004; 432 (7019): 862-5

22. Schneider G, Baringhaus KH: Molecular Design, Wiley-VCH, 2008, Weinheim: 149-

72

23. Rarey M, DIXNon JS: Feature trees: a new molecular similarity measure based on tree

matching. J Comput Aided Mol Des. 1998; 12(5): 471-90

24. Abou-Alfa GK, DeMatteo R: 100 Questions&Answers about Liver Cancer, Jason and

Bartlett Publishers, USA, 2006: 2-4

25. Knasmüller S, Parzefall W, Sanyal R, Ecker S, Schwab C, Uhl M, Mersch-Sundermann

V, Williamson G, Hietsch G, Langer T, Darroudi F, Natarajan AT: Use of

metabolically competent human hepatoma cells for the detection of mutagens and

antimutagens. Mutat Res. 1998; 402(1-2): 185-202

26. Aden DP, Fogel A, Plotkin S, Damjanov I, Knowles BB: Controlled synthesis of

HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line. Nature. 1979;

282(5739): 615-6

27. Cockerill GW, Meyer G, Noack L, Vadas MA, Gamble JR: Characterization of a

spontaneously transformed human endothelial cell line. Lab Invest. 1994; 71(4): 497-

509

28. Ko AH, Dollinger M, Rosenbaum EH: Everyone's Guide to Cancer Therapy, 5,

Andrewa McMeel Publishing, Kansas City, 2008: 467

29. Welch WC, Morrison RS, Gross JL, Gollin SM, Kitson RB, Goldfarb RH, Giuliano

KA, Bradley MK, Kornblith PL: Morphologic, immunologic, biochemical, and

cytogenetic characteristics of the human glioblastoma-derived cell line, SNB-19. In

Vitro Cell Dev Biol Anim. 1995; 31(8): 610-6

30. Yunis AA, Arimura GK, Russin DJ: Human pancreatic carcinoma (MIA PaCa-2) in

continuous culture: sensitivity to asparaginase. Int J Cancer. 1977; 19(1): 128-35


50

31. Su GH, Pancreatic Cancer Methods and protocols,Humana Press Inc, New Jersey,

2005: 1

32. Ponten J, Macintyre EH: Long term culture of normal and neoplastic human glia. Acta

Pathol Microbiol Scand. 1968; 74: 465- 486

33. Dostopno na naslovu:

http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.a

spx?ATCCNum=CRL-5803&Template=cellBiology

34. Eisel D, Fertig G, Fischer B, et al.: Apoptosis and cell proliferation. Booklet by

Boehringer Mannheim GmbH. Biochemica, 1998: 67-70

35. Amara FM, Junaid A, Clough RR, Liang B: TGF-β1, regulation of Alzheimer amyloid

precursor protein mRNA expression in a normal human astrocyte cell line: mRNA

stabilization. Molecular brain research. 1999; 71: 42-49

36. Maher K: Toksičnost ksantohumola za različne vrste normalnih in rakavih celic.

Diplomsko delo, Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Enota medodelčnega študija

mikrobiologije, 2008

37. Pan L, Becker H, Gerhäuser C: Xanthohumol induces apoptosis in cultured 40-16

human colon cancer cells by activation of the death receptor- and mitochondrial

pathway. Mol Nutr Food Res. 2005 Sep;49(9):837-43

38. Lust S, Vanhoecke B, Janssens A, Philippe J, Bracke M, Offner F: Xanthohumol kills

B-chronic lymphocytic leukemia cells by an apoptotic mechanism. Mol Nutr Food Res.

2005; 49(9): 844-50

39. Plochmann K, Korte G, Koutsilieri E, Richling E, Riederer P, Rethwilm A, Schreier P,

Scheller C: Structure-activity relationships of flavonoid-induced cytotoxicity on human

leukemia cells. Arch Biochem Biophys. 2007; 460(1): 1-9.

http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-5803&Template=cellBiology

http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-5803&Template=cellBiology


51

7. Priloge

7.1. Citotoksično delovanje XN na vseh celičnih linijah

Preglednica IX: Rezultati posameznega MTT preskusa in prikaz odstotkov (stolpec %) preţivelih celic

(odstotki ± SD) posameznih celičnih linij po 24-urni izpostavljenosti XN s koncentracijo 40 µmol/l ali

100 µmol/l in primerjava s kontrolo (netretiranimi celicami).

Preskus 1 2 3 4 xpov SD T test Norm. % SD %

Kontrola 1 1 1 1 1 0,1656 1 100 16,5608

U87 40 0,582 0,577 0,5792 0,00324 0,00346 0,57922 57,92 0,32371

U87 100 0,108 0,089 0,0984 0,01318 0,00658 0,16037 16,04 1,31811

HepG2 40 0,954 0,229 0,538 0,5736 0,36372 0,17939 0,57358 57,36 36,3717

HepG2 100 0,223 0,068 0,178 0,1564 0,07949 0,00295 0,15643 15,64 7,94896

HUVEC 40 0,511 0,613 0,5622 0,07247 0,07419 0,56222 56,22 7,24732

HUVEC 100 0,148 0,206 0,177 0,04038 0,02208 0,17704 17,7 4,03821

MiaPaCa2 40 0,526 0,757 0,657 0,6464 0,11574 0,03391 0,64642 64,64 11,5743

MiaPaCa2 100 0,1 0,043 0,088 0,0773 0,02986 0,00035 0,07729 7,729 2,98587

SNB 19 40 0,968 0,948 0,9582 0,01432 0,15142 0,95824 95,82 1,43172

SNB 19 100 0,525 0,421 0,41 0,452 0,06363 0,00446 0,45198 45,2 6,36296

NCI H1299 40 0,63 0,13 0,35 0,372 0,2512 0,0494 0,3718 37,18 25,1176

NCI H1299 100 0,12 0,11 0,1 0,113 0,0095 4E-05 0,1126 11,26 0,94712

NHA 40 0,69 0,719 0,706 0,018 0,0276 0,7064 70,64 1,80038

NHA 100 0,2 0,25 0,42 0,242 0,277 0,096 0,0006 0,2766 27,66 9,60201

7.2. Preskus MTT na celični liniji U87

Preglednica X: Prikaz odstotkov (stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije U87, po 24-urni


celicami). Preglednica prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih vzporednih

ponovitvah. V stolpcu T test, so prikazani rezultati Studentovega t-testa, s katerim smo določili statistično

značilno odstopanje od kontrolnih vrednosti (p<0,05).

Preskus 1 2 3 xpov SD T test Norm. % SD %

Kontrola 1 1 1 1 0,042 1 100 4,2356

XN 40 0,582 0,577 0,5792 0,003 0,0035 0,579 57,92 0,3237

XN 100 0,108 0,089 0,0984 0,013 0,0066 0,16 16,04 1,3181

1 0,956 1,019 1,039 1,0046 0,043 0,8702 1,005 100,5 4,3389

2 0,889 1,007 1,02 0,9719 0,072 0,5706 0,972 97,19 7,2426

3 0,959 0,962 1,024 0,9818 0,036 0,4789 0,982 98,18 3,6477

4 0,962 1,044 0,963 0,9898 0,047 0,7421 0,99 98,98 4,7002

5 0,666 0,76 0,65 0,6919 0,059 0,0122 0,692 69,19 5,939

6 0,946 1,084 1,057 1,029 0,073 0,5645 1,029 102,9 7,3371

7 1,161 1,172 1,1662 0,008 0,0216 1,166 116,6 0,7988

8 1,022 0,957 0,9894 0,046 0,7985 0,989 98,94 4,579

9 0,863 0,893 0,8779 0,021 0,0787 0,878 87,79 2,1459


52

Preglednica XI: Prikaz odstotkov (stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije U87, po 24-urni


celicami). Preglednica prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih vzporednih

ponovitvah. V stolpcu T test so prikazani rezultati Studentovega t-testa, s katerim smo določili statistično

značilno odstopanje od kontrolnih vrednosti (p<0,05).

Preskus 1 2 3 xpov SD T test Norm % SD %

Kontrola 1 1 1 1 0,187 1 100 18,7

XN 40 0,582 0,577 0,5792 0,003 0,003 0,579 57,92 0,324

XN 100 0,108 0,089 0,0984 0,013 0,007 0,16 16,04 1,318

1 0,815 0,744 0,823 0,794 0,043 0,014 0,794 79,4 4,325

2 0,801 0,904 0,905 0,8701 0,06 0,063 0,87 87,01 5,951

3 0,767 0,805 0,7862 0,027 0,056 0,786 78,62 2,688

4 0,528 0,551 0,5393 0,016 0,016 0,539 53,93 1,634

5 0,55 0,449 0,49 0,4963 0,051 0,003 0,496 49,63 5,083

6 0,864 0,882 0,8728 0,013 0,044 0,873 87,28 1,256

7 0,955 1,096 1,14 1,0636 0,097 0,373 1,064 106,4 9,679

8 0,423 0,495 0,4591 0,051 0,043 0,459 45,91 5,129

9 0,746 0,831 0,7886 0,06 0,125 0,789 78,86 5,959

7.3. Preskus MTT na celični linije HepG2

Preglednica XII: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HepG2, po

24-urni izpostavljenosti preskušanim spojinam s koncentracijo 40 µmol/l in primerjava s kontrolo

(netretiranimi celicami). Preglednica prikazuje rezultate štirih neodvisnih preskusov, izvedenih v petih

vzporednih ponovitvah. V stolpcu T test so prikazani rezultati Studentovega t-testa, s katerim smo določili


Preskus 1 2 3 4 xpov SD T test Norm % SD %

Kontrola 1 1 1 1 1 0,085 1 100 8,4738

XN 40 0,954 0,229 0,538 0,574 0,364 0,179 0,5736 57,36 36,372

XN 100 0,223 0,068 0,178 0,156 0,079 0,003 0,1564 15,64 7,949

1 0,855 0,806 0,929 0,863 0,062 0,062 0,863 86,3 6,1774

2 0,927 0,959 0,874 0,92 0,043 0,083 0,92 92 4,2672

3 0,963 0,982 0,862 0,984 0,948 0,058 0,17 0,9479 94,79 5,7872

4 0,528 0,482 0,505 0,032 0,029 0,505 50,5 3,2151

5 0,685 0,719 0,719 0,707 0,02 0,001 0,7074 70,74 1,9629

6 0,462 0,473 0,565 0,5 0,056 0,004 0,4999 49,99 5,6366

7 0,728 1,003 0,884 0,91 0,881 0,114 0,13 0,8814 88,14 11,433

8 0,885 0,778 0,723 0,844 0,807 0,071 0,012 0,8075 80,75 7,1353

9 0,809 0,851 0,721 0,794 0,067 0,033 0,7936 79,36 6,654


53

7.4. Preskus MTT na celični liniji HUVEC

Preglednica XIII: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HUVEC,

po 24-urni izpostavljenosti preskušanim spojinam s koncentracijo 40 µmol/l in primerjava s kontrolo

(netretiranimi celicami). Preglednica prikazuje rezultate treh neodvisnih preskusov, izvedenih v petih



Preskus 1 2 3 xpov SD T test Norm % SD%

Kontrola 1 1 1 1 0,222 1 100 22,17

XN 40 0,511 0,613 0,562 0,072 0,074 0,562 56,22 7,247

XN 100 0,148 0,206 0,177 0,04 0,022 0,177 17,7 4,038

1 0,683 0,564 0,624 0,084 0,1 0,624 62,35 8,401

2 0,686 0,583 0,634 0,073 0,089 0,634 63,45 7,292

3 0,967 0,881 0,985 0,944 0,055 0,223 0,944 94,43 5,531

4 0,608 0,559 0,72 0,629 0,083 0,016 0,629 62,92 8,253

5 0,845 0,823 0,952 0,873 0,069 0,086 0,873 87,32 6,901

6 0,638 0,584 0,563 0,595 0,039 0,003 0,595 59,48 3,879

7 0,875 0,85 0,862 0,018 0,058 0,862 86,22 1,774

8 0,552 0,564 0,621 0,579 0,037 0,003 0,579 57,89 3,681

9 0,57 0,549 0,668 0,596 0,063 0,008 0,596 59,57 6,333

Preglednica XIV: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije HUVEC,



vzporednih ponovitvah. V stolpcu T test, so prikazani rezultati Studentovega t-testa, s katerim smo določili



Kontrola 1 1 1 1 0,039 1 100 3,8643

XH 40 0,511 0,613 0,562 0,072 0,074 0,562 56,22 7,2473

XN 100 0,148 0,206 0,177 0,04 0,022 0,177 17,7 4,0382

1 0,57 0,49 0,598 0,552 0,056 0,005 0,552 55,25 5,5964

2 0,816 0,73 0,773 0,06 0,119 0,773 77,32 6,0432

3 0,824 0,95 0,915 0,896 0,065 0,109 0,896 89,63 6,475

4 0,748 0,76 0,754 0,008 0,015 0,754 75,44 0,8315

5 1,151 1,139 1,145 0,008 0,025 1,145 114,5 0,8055

6 0,347 0,352 0,476 0,392 0,073 0,005 0,392 39,16 7,299

7 1,022 1,067 1,045 0,031 0,295 1,045 104,5 3,1393

8 0,449 0,45 0,449 3E-04 2E-04 0,449 44,94 0,0268

9 0,629 0,762 0,695 0,094 0,137 0,695 69,52 9,402


54

7.5. Preskus MTT na celični liniji MiaPaCa2

Preglednica XV: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije MiaPaCa-2,






Kontrola 1 1 1 1 1 0,037 1 100 3,7198

XN 40 0,526 0,757 0,657 0,646 0,116 0,0339 0,646 64,64 11,574

XN 100 0,1 0,043 0,088 0,077 0,03 0,0003 0,077 7,729 2,9859

1 0,806 0,798 0,714 0,773 0,051 0,0165 0,773 77,25 5,1204

2 0,882 0,871 0,85 0,868 0,017 0,0052 0,868 86,76 1,6599

3 0,863 0,921 0,987 0,923 0,062 0,1657 0,923 92,33 6,207

4 0,573 0,622 0,598 0,035 0,0389 0,598 59,79 3,4798

5 0,494 0,469 0,397 0,453 0,05 0,0028 0,453 45,32 4,9986

6 0,856 0,733 0,735 0,775 0,07 0,031 0,775 77,46 7,0404

7 0,882 1,225 1,027 1,045 0,172 0,6972 1,045 104,5 17,194

8 0,518 0,616 0,694 0,609 0,088 0,0165 0,609 60,94 8,7995

9 0,633 0,644 0,503 0,593 0,078 0,0121 0,593 59,34 7,8285

Preglednica XVI: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije MiaPaCa-2,






Kontrola 1 1 1 1 1 0,154 1 100 15,436

XN 40 0,526 0,757 0,657 0,646 0,116 0,0339 0,646 64,64 11,574

XN 100 0,1 0,043 0,088 0,077 0,03 0,0003 0,077 7,729 2,9859

1 0,642 0,51 0,509 0,554 0,077 0,0097 0,554 55,37 7,6858

2 0,918 0,739 0,745 0,801 0,102 0,077 0,801 80,08 10,172

3 0,922 0,81 0,78 0,837 0,075 0,0636 0,837 83,74 7,4624

4 0,391 0,458 0,398 0,416 0,037 0,0013 0,416 41,55 3,6515

5 0,444 0,48 0,462 0,025 0,021 0,462 46,2 2,5084

6 0,598 0,628 0,575 0,6 0,026 0,0014 0,6 60,03 2,6221

7 0,934 0,925 0,908 0,922 0,013 0,0098 0,922 92,23 1,3423

8 0,515 0,476 0,467 0,486 0,026 0,0008 0,486 48,6 2,5965

9 0,635 0,413 0,479 0,509 0,114 0,0175 0,509 50,9 11,385


55

7.6. Preskus MTT na celični liniji NCI H1299

Preglednica XVII: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije NCI

H1299, po 24-urni izpostavljenosti preskušanim spojinam s koncentracijo 40 µmol/l in primerjava s kontrolo





Kontrola 1 1 1 1 0,385 1 100 38,51

XH 40 0,633 0,133 0,349 0,372 0,251 0,0494 0,372 37,18 25,12

XN 100 0,122 0,112 0,103 0,113 0,009 4E-05 0,113 11,26 0,947

1 1,008 0,858 1,023 0,963 0,091 0,5544 0,963 96,28 9,147

2 0,988 0,807 1,019 0,938 0,115 0,4475 0,938 93,8 11,45

3 0,91 0,9 0,883 0,898 0,014 0,0059 0,898 89,78 1,369

4 0,781 0,692 0,698 0,724 0,05 0,0106 0,724 72,36 4,96

5 0,567 0,538 0,411 0,505 0,083 0,0092 0,505 50,54 8,268

6 0,707 0,793 0,624 0,708 0,084 0,0267 0,708 70,81 8,433

7 0,84 0,787 0,854 0,827 0,035 0,0137 0,827 82,73 3,532

8 0,686 0,647 0,645 0,659 0,023 0,0016 0,659 65,94 2,339

9 0,647 0,522 0,665 0,611 0,078 0,0131 0,611 61,13 7,78

7.7. Preskus MTT na celični liniji SNB 19

Preglednica XVIII: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije SNB19,






Kontrola 1 1 1 1 0,069 1 100 6,936

XN 40 0,968 0,948 0,958 0,014 0,151 0,958 95,82 1,432

XN 100 0,525 0,421 0,41 0,452 0,064 0,004 0,452 45,2 6,363

1 1,254 1,327 1,165 1,249 0,081 0,034 1,249 124,9 8,092

2 1,297 1,272 1,4 1,323 0,068 0,014 1,323 132,3 6,758

3 0,994 0,964 1,01 0,989 0,023 0,505 0,989 98,91 2,339

4 1,281 1,253 1,155 1,23 0,066 0,027 1,23 123 6,616

5 0,369 0,361 0,373 0,368 0,006 3E-05 0,368 36,8 0,608

6 0,908 0,882 0,774 0,855 0,071 0,07 0,855 85,45 7,069

7 1,213 1,053 1,239 1,168 0,101 0,102 1,168 116,8 10,1

8 0,865 0,804 0,89 0,853 0,044 0,029 0,853 85,3 4,431

9 0,805 0,857 0,695 0,786 0,083 0,046 0,786 78,57 8,256


56

Preglednica XIX: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije SNB19, po





Preskus 1 2 3 4 5 xpov SD T test Norm % SD %

Kontrola 1 1 1 1 1 1 0,104 1 100 10,35

XN 40 0,968 0,9481 0,958 0,014 0,151 0,958 95,82 1,432

XN 100 0,457 0,689 0,525 0,421 0,41 0,5 0,115 6E-04 0,5 50,03 11,46

3 0,914 0,896 0,7312 0,847 0,101 0,119 0,847 84,71 10,07

6 0,47 0,216 0,245 0,2848 0,304 0,114 0,001 0,304 30,41 11,39

8 0,511 0,549 0,5166 0,525 0,021 6E-04 0,525 52,54 2,052

9 0,557 0,557 0,4631 0,526 0,054 0,004 0,526 52,6 5,448

7.8. Preskus MTT na celični liniji NHA

Preglednica XX: Prikaz odstotkov (glej stolpec %) preţivelih celic (odstotki ± SD) celične linije NHA, po






Kontrola 1 1 1 1 1 0,0567 1 100 5,673

XN 40 0,694 0,719 0,706 0,018 0,028 0,706 70,64 1,8

XN 100 0,196 0,252 0,416 0,242 0,277 0,096 6E-04 0,277 27,66 9,602

1 1,242 1,365 1,303 0,0869 0,127 1,303 130,3 8,69

2 1,32 1,247 1,283 0,0515 0,081 1,283 128,3 5,148

3 0,951 0,814 0,882 0,0967 0,336 0,882 88,25 9,672

4 0,98 1,122 0,961 1,021 0,0881 0,721 1,021 102,1 8,805

5 0,561 0,547 0,626 0,578 0,0421 0,003 0,578 57,82 4,209

6 0,717 0,854 0,84 0,803 0,0751 0,045 0,803 80,34 7,507

7 0,956 0,942 1,052 0,983 0,0601 0,681 0,983 98,35 6,007

8 0,724 0,895 1,022 0,88 0,1494 0,3 0,88 88,05 14,94

9 0,91 1 0,946 0,952 0,0454 0,208 0,952 95,19 4,535

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO · Diplomsko nalogo sem opravljal na Intitutu za biologijo (NIB), pod mentorstvom izr. prof. dr. Stanislava Gobca in somentorstvom dr