UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNI�KA FAKULTETA

�IVILSKA TEHNOLOGIJA BIOTEHNOLO�KA PROIZVODNJA: SAKE Barbara MAČEK, Simona MATE, Irena MAJCEN, Nata�a MAJCEN

(�tudentje tretjega letnika �ivilske tehnologije) prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Pa� (mentorja)

Ljubljana, 2002 *Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 2

POVZETEK Sake je znamenito japonsko ri�evo vino, je �itna fermentirana pijača, ki sestoji iz ri�a, koji riža ter vode. U�ivajo ga predvsem na Japonskem, vendar ga zadnje čase vse več tudi izva�ajo. Njegova vsebnost alkohola je 14 � 20 %. Vsa proizvodnja sake-ja temelji na tradicionalnih tehnikah, ki se prena�ajo iz generacije v generacijo in se sprotno tudi izpopolnjujejo. Prav napredek na področju celične in molekularne biologije prina�a nove mo�nosti za nadaljni razvoj priprave sake-ja. Med procesom je prisotnih veliko mikroorganizmov, ki povzročajo kvar, zato ima posebno vlogo tudi pasterizacija. Proizvodnja sake-ja temelji na plesni Aspergillus oryzae, ki spro�ča encime za pretvorbo �kroba v sladkor, ki je hrana za sake kvasovke v procesu fermentacije. Biokemijsko sake sestoji iz n-propanola, izobutanola in izoamilnega alkohola ter iz njihovih etilnih estrov, skupaj z etilnimi estri maslene in kapronske kisline. Lastnost sake-ja je visoka vsebnost mlečne in jantarne kisline glede na skupne kisline. Večina kislin se proizvede med fermentacijo moromi-ja, izjema je le mlečna kislina, ki v glavnem izvira iz moto-ja. Sake-ju dajejo aromo vi�ji alkoholi in estri. Glede na različne arome ločimo več vrst sake-ja, najbolj raz�irjena vrsta pa je narejena s pomočjo novih tehnik, ki temeljijo na dodatku alkohola, sladkorja, organskih kislin in amino kislin med pripravo. Nekaj vrst: honjozo-shu, ginjo-shu, junmai-shu, taru-zake...

SUMMARY Sake is Japanese famous rice wine. It is fermented cereal beverage, consisting of rice, rice koji, and water. The product is consumed mainly in Japan, but recently the export is increasing. It contains 14 � 20 % alcohol. Sake brewing has been carried out largely on the basis of traditional techniques handed down from generation to generation, while beeing continually improved. Recent advances in both cell and molecular biology bring new chances for further progress in sake brewing. There are a lot of harmful microorganisms present during process of brewing, and pasteurization is of vital importance. Sake brewing is based on koji mould (Aspergillus oryzae), which is the source of amylolytic enzymes. Those enzymes break down the starch molecules to glucose, that is used as a nutrient for sake yeasts in the process of fermentation. Biochemically, sake contains n-propanol, isobutanol and isoamyl alcohol and their acetic acid esters, together with ethyl esters of butyric and caproic acids. A characteristic of sake is its high content of succinic and lactic acids in relation to total acids. Most of the many acids identified are produced during the moromi fermentation; the exception is lactic acid, which is mainly derived from moto. Higher alcohols and esters contribute to the flavour of sake. According to different flavours, there are many types of sake. The most popular type of sake is produced by the new techniques of adding alcohol, sugar, organic acids and amino acids during the production process. Some known types of sake are: honjozo-shu, ginjo-shu, junmai-shu, taru-zake...

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 3 KAZALO POVZETEK .......................................................................................................................... 1 SUMMARY .......................................................................................................................... 2 KAZALO............................................................................................................................... 3 1. UVOD................................................................................................................................ 4 2. ZGODOVINA BIOPROCESA ......................................................................................... 6

2.1. Opis proizvodnje sake-ja (v letu 1192) ...................................................................... 6 2.2 Pomembni dogodki v zgodovini kuhanja sake-ja........................................................ 7

3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA............................................................. 10 3.1 Koji ............................................................................................................................ 10

3.1.1 Primer običajne koji priprave ............................................................................. 10 3.1.2 Vrste koji-ja ........................................................................................................ 10

3.2 Fermentacija sake-ja .................................................................................................. 11 3.3 Moto (inokulum)........................................................................................................ 11 3.4 Drugi mikroorganizmi ............................................................................................... 12 3.5 Taksonomija sake kvasovk ........................................................................................ 12 3.6 Faktorji, ki vplivajo na donos in kakovost sake-ja .................................................... 13

3.6.1 Zahteve po vitaminih.......................................................................................... 13 3.6.2 Toleranca sake kvasovk na visoke koncentracije alkohola................................. 13

4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA.................................................................... 14 4.1 Komponente arome.................................................................................................... 14 4.2 Komponente okusa .................................................................................................... 14

5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA............................................................ 17 5.1 Pripravljalni postopki ................................................................................................ 17

5.1.1 Surovine:............................................................................................................. 17 5.1.2 Obdelava ri�a pred nadaljnim postopanjem ....................................................... 18 5.1.3 Priprava koji-ja ................................................................................................... 18

5.2 Potek bioprocesa........................................................................................................ 22 5.2.1 Priprava moto-ja ................................................................................................. 22 5.2.2 Fermentacija moromi-ja...................................................................................... 25

5.3 Zaključni postopki ..................................................................................................... 26 6. EKOLO�KI ASPEKT BIOPROCESA ........................................................................... 27 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI ........................................................... 28

7.1 Vrste sake-ja .............................................................................................................. 28 7.2 Sestavine.................................................................................................................... 29

8. IMPLIKACIJE DRUGIH TEHNOLOGIJ IN IMPLIKACIJE NA DRUGE TEHNOLOGIJE .................................................................................................................. 31 9. REFERENCE: ................................................................................................................. 32

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 4 1. UVOD ! Kaj je sake? Ali je pivo ali vino? Sake je �itna, natančneje ri�eva, fermentirana pijača. Na osnovi tega bi lahko prisodili, da je sake pivo in ne vino. Toda sake ne vsebuje ogljikove kisline, okus pa je bli�je vinu kot pivu, kljub temu da je le-ta specifičen in drugačen od okusa vina. ! Kak�na je njegova vsebnost alkohola? Sake vsebuje okoli 14 � 20 % alkohola. ! Koliko časa poteka priprava sake-ja? Običajno okoli mesec dni, lahko pa tudi dlje (npr. ginjo-shu), odvisno od vrste sake-ja. Sem pa ne pri�tevamo tudi časa potrebnega za staranje sake-ja, ki običajno traja okoli �est mesecev. ! Se sake lahko stara kot vino oz. ali sploh obstaja �staran� sake? Načeloma sake-ja ne staramo, razen zgoraj omenjenih �estih mesecev. Zelo pomembno je, da ga zau�ijemo kmalu po nakupu. ! Kako mora biti sake skladi�čen? Pomembno je, da sake skladi�čimo na hladnem in v temi, saj le v tak�nih pogojih ne spreminja in izgublja svojih prvotnih lastnosti. ! Kak�na je primerna barva sake-ja? Sake je skoraj povsem prozoren. Kot posledica nepravilnega skladi�čenja pa pogosto zasledimo tudi zlato-rumeni lesk, zelo star sake pa je lahko celo intenzivno rjav. ! Ali je sake bolj zdrav od drugih alkoholnih pijač? Da, vendar le v zmernih količinah. Kar nekaj raziskav se nana�a na večji zdravilni učinek sake-ja v primerjavi z drugimi alkoholnimi pijačami. Sake namreč ne vsebuje sulfitov in je zato idealen nadomestek za ljudi, ki imajo radi belo vino, a so občutljivi na sulfite. Ravno tako sake ne vsebuje ma�čob, kofeina, nitratov, ki pa jih lahko najdemo v prenekaterih pijačah. ! Kaj je koji? Koji je kultura koji plesni (Aspergillus oryzae) kultivirane v/na ri�u, kuhanem v pari. Uporablja se v proizvodnji sake-ja, in sicer za pretvorbo �krobnih molekul (v ri�u) v sladkor, ki je hrana za kvasovke v procesu fermentacije. ! Kak�na je idealna temperatura za serviranje sake-ja? Dober sake se ponudi mrzel. Topel sake ponavadi postre�ejo z namenom, da prekrijejo nepravilnosti okusa, ki se pojavijo s starostjo. Po starem kulturnem običaju pa prav tako postre�ejo topel sake. (http://www.sake-world.com/FAQ_Other_Topics/Making_Sake/faqs.html) Sake se proizvaja na Japonskem v okoli 2000-ih tovarnah s pijačami in se prodaja po celi Japonski. Ker priprava sake-ja zahteva nizke temperature pozimi, dober ri� in vodo, je

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 5 največji dele� proizvodnje name�čen na lokacijah, ki ustrezajo vsem trem pogojem, npr. Nada (Hyogo), Fushimi (Kyoto), Saijo (Hiroshima), Nigata (Nigata), Akita (Akita)� Sake u�ivajo predvsem na Japonskem, vendar ga zadnje čase vse več izva�ajo. V Ameriki, kjer ga zau�ijejo v manj�ih količinah, obstaja sedem tak�nih tovarn in tudi te so ustanovile japonske dru�be. (Enciklopedia of food science, food technology and nutrition. 1993. ACADEMIC PRESS LIMITED: 3958 str.)

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 6 2. ZGODOVINA BIOPROCESA Sake, popularno japonsko ri�evo vino, v primerjavi z drugimi sadnimi in �itnimi fermentiranimi pijačami ni tako raz�irjen po svetu, je pa zelo raziskan proizvod. Dolgo nazaj, v tretjem stoletju so ga imenovali kuchikami, kar naj bi pomenilo �sake pre�večen v ustih�. Tako imenovanemu proizvodu bi prisodili tudi povsem drugačen postopek pridelave kot ga poznamo danes. K sreči se sake danes ne proizvaja več tako kot se je v tretjem stoletju, ko so pri pridelavi sodelovali vsi va�čani. Ri�, kostanj in proso so namreč kar sami pre�vekovali v ustih, pre�večeno vsebino pa izpljunili v čeber za kuhanje. Pridelava sake-ja je bila pomemben del verskega praznika Shinitov. Takrat so u�ivali le topel sake. Nekoliko kasneje pa so �e ugotovili lastnosti koji riža oziroma lastnosti kvasovk. Dogodilo se je povsem slučajno. Ri� so namreč pustili zunaj v posodi, bil je nepokrit in tako izpostavljen umazaniji, vlagi in dejavnikom, ki so povzročili razvoj plesni. Le te so nato spro�čale encime, ki so sodelovali pri fermentaciji (�krob se pretvori v sladkor), in nastala je me�anica ki je vsebovala zelo majhen dele� alkohola. Vendar kljub skromnemu alkoholnemu dele�u so ljudje ugotovili, da so po zau�itju tega proizvoda bolj vedri, dobre volje, da je njihovo razpolo�enje prijetno in predvsem drugačno. In le to je bil zadosten vzrok, da so si prizadevali izbolj�ati kontrolo procesa in pričeli z natančnej�imi raziskavami. Dotlej pa so se zadovoljili kar z manj�o količino tak�ne me�anice �e oku�ene z plesnijo, ki so jo pome�ali z ri�em in pustili da plesni opravijo svoje delo. Dobili so zvarek, ýdozdevni sakeý, ki je bil precej gost. Zanj bi lahko prej trdili, da je hrana kot pa pijača, vseboval pa je tudi zelo malo alkohola, Temu so sledile različne recepture za različne tipe sakejev. Leta 1192 so se veselili povr�no izpopolnjene verzije nekako juhi podobnega sake-ja, kasneje pa so dajali poudarek na razvoju različnih kvalitet sake-ja. V tistem letu so razvili petnajst vrst sake-ja. Nekateri so bili kuhani do visoke stopnje alkohola spet drugi so bili obarvani, aromatizirani in di�eči. (http://www.sake.com/) (http://www.sake-world.com/Sake_Newsletter/Archives/Jan00/jan00.html)

2.1. Opis proizvodnje sake-ja (v letu 1192) Proizvodnja je potekala v dveh stopnjah: prva stopnja je bila priprava začetne me�anice, druga stopnja pa je bila fermentacija. Opis 1. stopnje: Sestavine: ri�, koji ri� in vodo, so pome�ali skupaj. Čez čas je nastala me�anica, ki so jo poimenovali moto. Nato so jo razdelili na več manj�ih delov in jih premestili v lesene kadi imenovane hangiri. Te ločene dele me�anice so več kot dve uri stiskali, me�ali in pasirali z rokami, da se je izoblikovala gostej�a gmota. Naslednji dan so nastalo gmoto preme�ali z lesenimi lopatami, kai in ko se je moto nekoliko razredčil, so hangiri izpraznili in vsebino prestavili v večje čebre imenovane moto-oroshi, ter jih pokrili. Čez nekaj dni so moto segrevali. To so izvedli s pomočjo sto�ičaste, zaprte posode daki, ki je bila napolnjena z vrelo vodo, ki so jo vlivali v moto-oroshi. Po treh dneh kuhanja so moto ponovno premestili v manj�e čebre, z namenom da ga ohladijo �e pred pričetkom glavnega procesa.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 7 Opis 2.stopnje: Glavni proces se je delil na kar tri stopnje in sicer soye, naka in shimai. �1.stopnja (sove): ohlajeni moto so imeli shranjen v velikih čebrih sanjaku-oke, kjer so ga me�ali vsaki dve uri, to so ponavljali dva do tri dni. Moto so potem ločili na polovico in ga prestavili v ločene čebre sanjaku-oke. �2.stopnja (naka): Vanje so nato dodajali sve�e sestavine (ri�, ri� koji in vodo). Zatem so me�anico ponovno me�ali dva do tri dni. Nato so moto pustili stati dva dni in proces zaključili s tretjo stopnjo. �3.stopnja (shimai): Ravno tako kot v drugi stopnji so me�anici ponovno dodajali sve�e sestavine, nato pa so vse skupaj premestili v ogromno kad roku-shaku-oke, ki je bila pribli�no trikrat večja od prej�nje posode (sanjaku-oke) ter jo pustili stati ter vreti tri dni. V tem časovnem obdobju je potekla fermentacija in nastal je fermentirani moto, ki so ga imenovali moromi. Kasneje so sake tudi filtrirali ter ga shranili v sode. Filtracijo so izvedli tako, da so fermentirani moto predevali v platneno vrečo name�čeno na ogromno leseno stiskalnico in jo pustili pod pritiskom pribli�no dvanajst ur. Sake je pritekal iz stiskalnice v podstavljeno posodo. In ob koncu je sledil �e postopek skladi�čenja. Pred pretakanjem v sode so sake segreli. Toplega so potem pretočili v sode ki so jih zama�ili z papirjem in lepilom. Tak pasteriziran sake so nato skladi�čili ter transportirali, običajno z ladjami. Temu so nato med transportom podalj�evali rok uporabnosti tako, da so ga ponovno segrevali saj so bili mnenja, da so se s tem znebili vseh bakterij, ki bi lahko prispevale k pokvarljivosti sake-ja. Ta proces so od trenutka ko so pasteriziran sake pretočili v osnovne nesterilizirane sode, večkrat ponovili, dokler ni bil sake pretransportiran. Tak�no postopanje ni bilo idealno, �e zlasti ne med poletnimi meseci, vendar pa je bilo bolj�e kot v samih začetkih proizvodnje sake-ja, ko toplotne obdelave sploh �e niso uporabljali. Tak�ne toplotne obdelave so se poslu�evali do konca devetnajstega stoletja. Danes se japonska proizvodnja sake-ja precej razlikuje od zgoraj opisane. Od konca prve svetovne vojne je bilo prepovedano brez licence fermentirati pijače, ki so vsebovale več kot 1% alkohola. Posledica tega je bil propad manj�ih proizvajalcev. Prav tako je vplivala na izdelavo sake-ja druga svetovna vojna. Namreč pomanjkanje ri�a je prisililo proizvajalce, da so razvili nove poti do povečanja proizvodnje. Po vladnem odloku se je lahko majhnim količinam moto-ja dodajal čisti alkohol in glukoza. Tako se je proizvodnja povečala tudi do �tirikrat. Zelo zanimivo pa je dejstvo, da skoraj 95% vse dana�nje proizvodnje sake-ja �e vedno poteka na tak�en način. (http://www.geocities.com/shamusan/sake.html)

2.2 Pomembni dogodki v zgodovini kuhanja sake-ja Kot smo lahko �e ugotovili, ima sake dolgo in zanimivo zgodovino, ki sega stoletja in stoletja v zgodovino.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 8 Poglejmo si nekaj prispevkov zadnjega stoletja v katerem je sake postajal vse bolj podoben dana�njemu proizvodu. l.1895: Prvič izolirane sake kvasovke.

Končno so ugotovili kako kvasne celice izgledajo in proučili njihov �ivljenjski cikel.

Do tega dogodka so kvasne celice naključno pri�le v me�anico ri�a in opravljale funkcijo, katera ljudem takrat �e ni bila poznana. l.1904: Ministrstvo za finance je ustanovilo Mednarodni center za raziskave proizvodnje sake-ja. V centru so si predvsem prizadevali pri raziskavah naprav, ki bi pripomogle k bolj�i in enostavnej�i proizvodnji sake-ja. l.1910: Odkrit je bil ýsokujo motoý (starterska kultura kvasovk).

Do tedaj je bila priprava moto-ja zelo dolga. l.1933: Uvedba modernega (pokončnega) mlina-lo�čilca za ri�. S tem velikim napredkom je bil ri� olu�čen hitreje, bolj previdno, učinkovito in enostavno. l.1936: Ministrstvo za finance je uvedlo sistem klasifikacije: - izreden razred

- 1. razred - 2. razred

Ves sake je bil uvr�čen v enega izmed razredov. Za izreden in prvi razred, je vlada zahtevala poku�anje in overitev sake-ja ter seveda tudi vi�ji davek. (V drugem razredu je bil sake, ki ga niso upredelili v nobenega od prvih dveh razredov). Ta sistem so kasneje ukinili (l.1989) iz razloga, da proizvajalci enostavno niso dali overiti svojih proizvodov, saj so le tako ohranili vi�jo ceno svojega sake-ja.

l.1943: So legalizirali dodajanje destiliranega alkohola v sake ob koncu procesa kuhanja. To je stopnjevalo okus in vonj, stopnjo alkohola in ustavilo proces

kuhanja.

l.1946: Odkrita in izolirana kvasovka �t. 7 v proizvodnji Masumi v Naganu. To kvasovko tam uporabljajo �e danes in tistega leta je Masumi sake pobral vse nagrade v svoji kategoriji. l.1948: Pomanjkanje ri�a je prisililo legalizacijo Sanzo-Shu, količina sake-ja

se je med proizvodnjo potrojila z dodatkom ogromnih količin destiliranega alkohola.

l.1953: Odkrita kvasovka �t. 9 (proizvajalec Koro-sakeja). Ta kvasovka proizvaja prijetne di�ave, daje aromatičen sake. l.1968: Narejen je bil prvi povojni Jinmai-shu (to je sake narejen brez dodatka

destiliranega alkohola in tudi brez vsakr�nih drugih aditivov). To je �e bil znak začetka prizadevanja za izbolj�anje sake-ja.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 9 l.1974: Proizvodnja sake-ja je vse bolj nara�čala, vendar pa je zaradi prizadevanj za bolj�o kvaliteto, količina proizvoda padala iz leta v leto. l.1975: Nenaden napredek Jizake (sake malih proizvajalcev iz de�el, kmetij). Le-ta je pridobival na priljubljenosti in priznanju. l.1989-2000: Odkritih ogromno novih rodov kvasovk in novih sort ri�a, za pridelavo sake-ja. Mnogo od njih je zakonsko za�čitenih, mnogo pa jih �e čaka na izvoropredstojnika. Vsi ti dogodki temeljijo eden na drugem in si prizadevajo narediti sake, kakr�nega imamo danes. Vendar moderna oprema in mikrobiologija ne vodita do ambrozije, kakr�no imamo dandanes, potrebno je tudi kanček zaupanja proizvajalcu, dolgoletne ve�čine in uglajena pamet. (http://www.sake-world.com/Sake_Newsletter/Archives/Nov00/nov00.html)

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 10 3. MIKROBIOLO�KE OSNOVE BIOPROCESA

3.1 Koji Koji je vir encimov za razgradnjo �kroba. Koji je kultura koji-plesni, Aspergillus oryzae, ki raste na in v vla�nem ri�evem zrnju (kuhanem v pari). Za njegovo pripravo v vseh japonskih pivovarnah uporabljajo tane koji (spore koji plesni). Tane-koji pripravljajo iz suhega, zrelega koji-ja. Plesni Aspergillus oryzae so kultivirane na ri�u, kuhanem v pari, pri 34 � 36°C, 5 � 6 dni. Tako dobimo obilno količino spor. Med pripravo koji-ja, micelij koji plesni prekrije povr�ino zrna in vdre v notranjost. Pomembno je zagotoviti pravilno ravnote�je med izhlapevanjem vlage in rastjo, kar dose�emo s kontroliranjem temperature in vlage. 3.1.1 Primer običajne koji priprave Ko ohladijo vla�en ri� na okoli 35°C, s pomočjo hladilnih aparatur, ga prenesejo v koji-muro, veliko inkubacijsko sobo, kjer kontrolirajo temperaturo (26 � 28 °C) in vlago (80 � 90 %). Tako zagotovijo primerne pogoje za rast plesni (hikikomi). Ri� dajo nato na kup, na izoliran podstavek in pokrijejo s cunjami za dve do tri ure, da se uravnata temperatura in vlaga. Temperatura prostora je okoli 35 � 38 °C. Zrnje nato izravnajo ter razkropijo tane- koji po surovini, v razmerju 20 � 100 g na 100 kg originalno poliranega ri�a. Nato zme�ajo in oblikujejo kup in pustijo, pri 31 � 32 °C, 10 � 12 ur pokrito s cunjami. Po tem času je na povr�ini zrnja �e viden micelij plesni. Pri tem se razvije nekaj toplote. Snov zopet zme�ajo in po nadaljnjih 10 � 20 urah opazijo bele, plesnive pike, ki so jasno vidne. Snov nato ločijo na 1,5 � 2,5. kg dele�e, ki jih dajo na plitve koji pladnje (mori) in 6 � 8 ur kasneje vsakega posebej preme�ajo. Temperaturo vzdr�ujejo na okoli 35 °C. Okoli 8 � 10 ur kasneje me�anje ponovijo, da pre�enejo ogljikov dioksid in ohladijo zrnje, ki ga nato razgrnejo v tanke plasti, 4 � 5 cm globoke. Temperatura je okoli 35 °C. Po 10 urah, ko temperatura koji-ja dose�e 40 � 42 °C, micelij prekrije zrnje in prodre v njegovo notranjost. Koji riž vzamejo iz inkubacijske sobe, nato čaka na cunjah dokler ga ne potrebujemo (de- koji). 3.1.2 Vrste koji-ja Razdeljeni so v tri skupine, glede na zunanjo obliko micelija, razvitega na ri�evem zrnju. 1. Tsukihaze-koji Njegova značilnost je,da ima več belih pik, gobastih kolonij, na povr�ini zrnja. Ima obilo micelija, ki prodre v notranjost zrnja, ne prekrije pa vrhnje plasti (ta vsebuje večje količine du�ikovih spojin kot v notranjosti). Tako da ta vrsta nima neza�eljenega priokusa, ki je posledica du�ikovih spojin, zato ga uporabljajo za varjenje sake-ja odlične kakovosti 2. Nurihaze-koji V primeru, ko je povr�ina ri�a, kuhanega v pari, pretirano mokra, notranjost pa je trda ali je odstotek poliranega koji riža visok (okoli 70 %), ali zaradi pretirane ventilacije naprave za izdelavo koji-ja, micelij popolnoma prekrije povr�ino zrnja, kot da bi bila pobarvana z barvo; na te načine se oblikuje nurihaze-koji. V tem tipu koji-ja so v povr�inski plasti

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 11 večje količine du�ikovih komponent. Le-te razgradijo koji proteaze do peptidov in aminokislin, ki se kopičijo in tvorijo temno barvo ter dajejo priokus sake-ju. 3. Sohaze-koji Je kombiniran tip tsukihaze- in nurihaze- koji-ja, ki ga lahko pripravijo po enostavnem postopku ter uporabijo za masovno proizvodnjo. Za zadovoljivo kvaliteto ri�a uporabljajo močno poliran ri�. Pri proizvodnji sake-ja ločimo seve sake kvasovk, ki jih uporabljamo od ostalih po encimski aktivnosti. Glavne mikolo�ke karakteristike, ki so empirično osnovane, za Aspergillus oryzae so:

a) hitra rast na in v zrnju ri�a, kuhanega v pari b) ogromna proizvodnja amilaze (α-amilaze in amiloglukozidaza), malo

karboksipeptidaz in tirozina c) majhna proizvodnja barvastih komponent, kot so flavini, deferiferihromi.

3.2 Fermentacija sake-ja Japonska dru�ba za varjenje (Nihon Jozo Kyokai) priskrbuje seve sake kvasovk (Saccharomyces cerevisiae), ki se uporabljajo za pripravo sake-ja. Imenujejo se Kyokai �t. 6, �t. 7, �t. 9, �t.10 itd. Kyokai �t. 6 in 7 uporabljajo za pripravo običajnega tipa sake-ja. Kyokai �t. 9 in 10 uporabljajo za pripravo tipa sake-ja ginjo-shu, zaradi njune lastnosti, ker razvijata močno aromo. Zadnje čase uporabljajo tovarne za pripravo sake-ja njihove lastne seve kvasovk. Značilnosti, ki se rabita oz. sta za�eljeni sta visoka fermentacijska aktivnost pri nizki temperaturi (5 � 15 °C) in odpornost na visoke koncentracije alkohola (okoli 20 %).

3.3 Moto (inokulum) Inokulum je koncentrirana kultura čistih in zdravih, �ivih celic sake kvasovk. Njegova vloga je vstavitev kvasovk v varjenje. Poznamo več metod za izdelavo le-tega. Klasična oblika, ki-moto-ja, ki zahteva veliko truda, precej�no spretnost ter traja 25 � 30 dni.To obliko je izpodrinila yamahai-moto, zaradi enostavnej�ega sistema. Ta dva tipa uvr�čamo med tradicionalne metode, kjer pomaga veliko bakterij. To so nitrat-redukcijske bakterije (Pseudomonas spp., Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus spp.) in mlečno kislinske bakterije (Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sake). Te mlečno kislinske bakterije igrajo pomembno vlogo v kisanju moto-ja, ki je nujen za čisto kulturo sake kvasovk. Nastanek mlečne kisline s prej omenjenimi bakterijami traja okoli dva tedna, pri tradicionalnem moto-ju traja �e dlje (okoli 4 tedne). Kisanje z mlečnokislinskimi bakterijami je zelo pomembno, zaradi zagotavljanja čiste kulture sake kvasovk, navkljub odprti fermentaciji. Najbolj popularen moto, ki ga uporabljajo v modernem varjenju je sokujo-moto, ki ga lahko pripravijo v relativno kratkem času (12 � 15dni) pri maksimalni me�alni temperaturi 18 � 22 °C (Eda, 1909). Čeprav vzamemo čisto kulturo kvasovk, jo je potrebno čimprej inokulirati, da ne pride do oku�be z neza�eljenimi mikroorganizmi (Tsuhahara, 1954; Akiyama in Sugano, 1967).

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 12 3.4 Drugi mikroorganizmi Obstaja nekaj mikroorganizmov, ki so kvarni za pripravo sake-ja. Nekatere mlečno kislinske bakterije (Leuconostoc casei, Leuconostoc lichmannii) in �divje� kvasovke kvarijo moromi brozgo. Ti s svojo rastjo onemogočajo rast kultiviranim sake kvasovkam. Končani sake vsebuje okoli 20 % alkohola, tako da lahko tukaj raste samo hiochi bakterija (Lactobacilus heterohiochi, Lactobacillus homohiochi). Spremenjen sake, zaradi delovanja bakterij, ki je shranjen v posebnih tankih in steklenicah, postane moten, kisel in trpkega okusa. S pasterizacijo preprečimo kvar, zato je v zgodovini sake-ja pasterizacija znana �e v 16. stoletju, veliko prej kot Pasteurjeva iznajdba, leta 1868.

3.5 Taksonomija sake kvasovk

Na začetku so moto brozgo delali z dodatkom moto-ja, ki je bil shranjen od prej�nje serije, kot starter kulturo kvasovk. V 2. polovici 19. stoletja je Yabe (1895, 1897) izoliral kvasovke iz moto brozge, ki so bile odgovorne za fermentacijo sake-ja in jih poimenoval Saccharomyces sake Yabe. Od takrat japonski raziskovalci obse�no proučujejo morfologijo, fiziologijo in biokemijo sake kvasovk. Zaposleni pri Japonski dru�bi za varjenje in na Japonskem dr�avnem in�titutu za varjenje so izolirali veliko novih sevov. Najbolj uspe�ni so sevi skupine Kyokai, npr. �t.6, 7, 9 - 11 in 13. �t. 13 je primerna za proizvodnjo zelo kvalitetnega sake-ja (ginjo-shu). Ta sev kvasovke so naredili s hibridizacijo haploidov Kyokai �t. 9 in 10 (Hara s sod., 1983). Razlike med S. sake in S. cerevisiae so majhne. Na primer, asimilacijski vzorci za 29 ogljikovih komponent v Wickerhamovem tekočem testu za Kyokai �t. 6 in 7 in tip kulture S. cerevisiae so precej podobni. Da bi preprečili to dilemo sta Tsukahara in Takeda (1966) predlagala ime za sake kvasovke, S. cerevisiae var. sake. Njuno sklepanje temelji na karakteristikah, ki so v sledeči tabeli. Tabela 1: Značilne razlike med sake kvasovkami in drugimi sevi Sacharomyces cerevisiae ZNAČILNOSTI ODZIV Sake kvasovke Sacharomyces

cerevisiae RAST V MEDIJU BREZ VITAMINOVa + - RAST V MEDIJU Z NEZADOSTNO KOLIČINO BIOTINAa

+

-

ODPORNOST NA YEASTCIDINb + - AGREGACIJA Z Lactobacillus casei - + ELEKTRIČNA OBREMENITEV POVR�INE CELICE PRI pH = 3

+

-

REAKCIJA NA ANTIGEN �T. 5 - + (REDKO) TALIČNOST HETEROTALIČEN HOMOTALIČEN ALKOHOLNA TOLERANCA (%)c 20 � 23 16 � 19 NARAVNO OKOLJE STROGO OMEJEN

NA SAKE DROZGO POVSOD, NI OMEJITEV

Viri: Tsukahara in Takeda (1966)

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 13 a Kvasna osnova brez vitaminov (Difco) vsebuje za vir du�ika amonijev sulfat b Yeastcidin pridobivajo s kultivacijo Aspergillus oryzae na koji ekstraktu (specifične gostote 1.0259) 15 - 20 dni pri temperaturi 30 ºC. Osnovna priprava temelji na ultrafiltraciji filtrata kulture. Letalna koncentracija za seve Sacharomyces cerevisiae zna�a 100 - 1000 µg /ml, v primerjavi s sake kvasovkami, ki imajo vi�jo toleranco na yeastcidin. c Toleranco na alkohol merijo z najvi�jo koncentracijo alkohola, ki jo kvasovke �e tolerirajo, ne da bi pri tem izgubile aktivnost.

3.6 Faktorji, ki vplivajo na donos in kakovost sake-ja 3.6.1 Zahteve po vitaminih Takahashi (1954, 1956) je prvi omenjal, da sake kvasovke potrebujejo pantotensko kislino za rast, v primeru, da je vir du�ika aminokislinska me�anica. V primeru, da so vir du�ika amonijeve soli, pa ne. Fukui s sod. (1955) je to potrdil. Vzel je sev kvasovke Kyokai �t. 7, na kateri je dokazal, da lahko v mediju z amonijevim ionom, stimuliramo rast z dodatkom pantotenata, tiamina, biotina in inositola. Nekatere kvasovke, ki so jih izolirali iz moto in moromi me�anice, so dokazali, da zahtevajo pirodoksin v povezavi s pantotenatom (Ito s sod., 1955). Sugama s sod. (1965) je poročal, da jih od določenega �tevila proučevanih sake kvasovk, 98 % potrebuje pantotenat in le 2 % pantotenat in piridoksin. Zadnje najdemo le v zgodnjih fazah priprave moto in moromi drozge (Takeda in Tsukahara, 1965). Sake kvasovke se glede na potrebo po vitaminih, močno razlikujejo od pekovskih, destilacijskih in vinskih kvasovk. Zadnje za svojo rast nujno potrebujejo biotin ne pa nujno pantotenat (Takahashi 1954; Nukanashi in Tsukahara,1954; Takeda in Tsukahara, 1965). Fukui s sod.(1956) so aminokisline ločili v dve skupini. V skupino, ki podpira rast sake kvasovk. Sem spadajo glukonska kislina, asparaginska kislina, arginin, prolin in alanin. V drugo skupino, ki pa inhibirajo rast pa sodijo histidin, treonin, metionin, leucin in cistin. Če te dve skupini zme�amo, se lahko učinki izničijo. Pantotenska kislina pospe�uje rast kvasovk, inhibira pa nastanek alkohola. Posledica aktivnega presnavljanja rasti kvasovk v zgodnji fazi, je nizka koncentracija aminokislin (Fukui s sod., 1955). Prav tako je dokazano, da tiamin dodan v brozgo v zgodnji fazi in pantotenat kasneje, prav tako ugodno vpliva na rast (Fukui s sod., 1958). 3.6.2 Toleranca sake kvasovk na visoke koncentracije alkohola Sake kvasovke v drozgi �e tolerirajo 20 � 22 % alkohola.Veliko raziskav je bilo izvedenih o tej pomembni značilnosti, tukaj je nekaj pomembnih dognanj: 1.) Z me�anjem moromi-ja v treh ravneh dose�emo koncentracijo kvasnih celih povsod enakomerno. 2.) Istočasna saharifikacija s koji encimi in fermentacijske reakcije sake kvasovk pri nizkih temperaturah omogočita, da fermentacija teče počasneje dlje časa. 3.) Sake drozga vsebuje visoke koncentracije trdnih delcev, ki tvorijo matriks, kateri obdr�i kup kvasovk v suspenziji okrog 108 celic/g od začetka do konca fermentacijske preiode (Yamasaki,1958; Muto s sod., 1962). 4.) Prisotni proteolipid v koji plesni micelija in ri�evih proteinih pospe�i rast kvasovk pod neza�eljenimi pogoji, kot so nizke temperature in visoke koncentracije mlečne kisline, sladkorjev in etanola. 5.) Ugotovili so, da je regulacija oksidacijsko-redukcijskega potenciala ugodna (Hongo s sod.,1967; Kawaharada s sod., 1967) 6.) Povi�ana koncentracija alkohola je pomembna prilagoditev sake kvasovk (Yamashiro s sod., 1966, 1967)

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 14 4. BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA

4.1 Komponente arome Sake sestoji iz n-propanola, izobutanola in izoamilnega alkohola ter iz njihovih etilnih estrov, skupaj z etilnimi estri maslene in kapronske kisline (Yoshizawa, 1966a; Koizumi,1968). Količina teh sestavin, ki izvirajo iz glukoze in aminokislin, je odvisna od koncentracije in vrste aminokisline v drozgi, temperature fermentacije in vrste kvasovk (Yoshizawa, 1966b). Ehrlichova pot je pomembna v ureditvi sintez vi�jih alkoholov v mediju, ki vsebuje du�ikov kompleks (Ouchi s sod., 1981). Vi�ji alkoholi in estri, sake-ju dajejo aromo. Najbolj rafiniran sake, ginjo-shu, vsebuje večje koncentracije estrov, kot so npr. etil acetat, izoamil acetat, etil kaproate ter etil kaprilat (Komoda s sod., 1966; Yoshizawa, 1966c). Pridelujejo ga z izčrpno tehniko, ki zahteva uporabo ri�a z 40 � 50 % polirnim razmerjem ter nizko vsebnostjo proteinov, pri nizki temperaturi drozge (9 � 11 ºC), kar povzroči počasno fermentacijo (25 - 30 dni). Ginjo-shu vsebuje majhne količine du�ika, organskih kislin, aminokislin in sladkorjev, ki dajejo specifičen okus in aromo. Sinteza arome, ki jo dajejo estri, je povezana z mikrosomalnimi frakcijami v kvasnih celicah. Prisotnih je nekaj encimov, med katerimi je najpomembnej�i alkohol acetiltransferaza (AATF-aza). Nedavno so iz mikrosomalnih membran sake kvasovk Kyokai �t. 7 izolirali in očistili AATF-azo (molekulska masa 50 000) (Akita s sod., 1990). Pri temperaturah vi�jih od 10 °C in kislem pH-ju (ni�ji od 5,5) ta encim ni obstojen, v rahlo alkalnem pH-ju (okoli 6,0 � 7,5) pa je stabilen. Pri temperaturi 30°C in pH-ju okoli 7,0 pa je njegova aktivnost povečana. Z dodatkom lecitina ali palmitinske kisline aktiviramo nedelujoč encim, medtem ko linolna kislina ne vpliva na njegovo delovanje. Inhibicija encima, vezanega na celične membrane z nenasičenimi ma�čobnimi kislinami, vpliva na tvorbo etilnih estrov. Z nara�čanjem �tevila dvojnih vezi v verigi ma�čobne kisline se omenjena inhibicija veča. Te kisline so nepo�kodovane vključene v lipide kvasne celice, tako da se njihova sestava precej razlikuje od sestave ma�čobne kisline v mediju (Ishikawa in Yoshizawa, 1978). Za tvorbo ma�čobno-kislinskih etilnih estrov, kot je etil kaproat, sta poznani dve poti: prek esteraze ali prek acil-CoA:alkohol acetiltransferaze. Lokacije teh encimov v celici pa so različne. V citosolni frakciji sta odkriti obe esterazni aktivnosti. Optimalen pH za esterazo, odgovorno za sintezo etil kaproata, je 5,0, za hidrolizo etil kaproilata 8,0; optimalen pH za acetiltransferazo pa 8,0 (Kuriyama s sod., 1986).

4.2 Komponente okusa a) Ogljikovi hidrati Vsebnost ogljikovih hidratov v sake-ju je: 1,6 � 3,7 % glukoze; 0,07 � 0,14 % maltoze; 0,08 � 0,09 % sakebioze (nigeroza,3-O-α-D-glukozil-D-glukoza); (2-O-α-D-glukozil-D-glukoza), 0,08 � 0,19 % kojibioze; 0,03 � 0,61 % izomaltoze; 0,08 � 0,14 % panoze; 0,08 � 0,19 % izomaltotrioze; 0,15 % izomaltotetraoze; 0,12 � 0,20 % drugih oligosaharidov; 0.005 % pentoze; 0,64 % polisaharidov (dekstrini).

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 15 b) Organske kisline Lastnost sake-ja je visoka vsebnost mlečne kisline in jantarne glede na celotno kislino. Večina kisline se proizvede med fermentacijo moromi-ja, izjema je mlečna kislina, ki v glavnem izvira iz moto-ja (Kodama, 1970). Analize od Otake in Yamanouchi (1955), Ueda s sod.(1960), Matsui in Sato (1963,1966), Muto s sod. (1964), uporabljajo nekaj različnih kromatografskih tehnik, ki dajejo sledeče rezultate (µg ml-1) za organske kisline: ocetna, 35 � 249; n-butirna, 14; citronska, do 480; fumarna, 10 � 337; glikolna, 47 � 137; α-hidroksiglutarna, do 15; izobutilna, 10; α-ketoglutarna, 0 do 175; mlečna 135 � 550; jabolčna, 94 do 442; malonska, 0 do 73; oksalna, 0 do 27; propionska, 5 do 10; piroglutaminska, 129 do 232; piruvična, 0 � 62; jantarna, 283 do 732. Dolga vrsta omenjenih rezultatov je brez dvoma zasluga spreminjajočih rastnih pogojev med procesom. Celotna vsebnost organske kisline dose�e 1000 µgml-1, to je 0,1% (Toyozawa s sod., 1960; Hayashida s sod., 1968). c) Aminokisline Količina aminokislin v sake-ju je zelo raznolika, giblje se nekje med 0,3 - 0,5%, v glavnem so to glutamiske kisline, glicin, leucin, alanin, serin, valin, aspartinska kislina in proline (Takahashi, 1965; Kodama, 1970). Večina se jih sprosti iz proteinov v ri�u, med pripravo koji-ja in fermentacijo moromi-ja in sicer med delovanjem proteolitičnih encimov iz koji plesni. Domnevajo, da aminokislinska prisotnost ni zgolj rezultat mrtvih kvasnih celic, temveč tudi pravočasna aktivacija intercelularnih karboksipeptidov (Hara s sod. 1977). Kakovost sake-ja je obratnosorazmerna vsebnosti aminokislin (Takahashi s sod., 1983). Toda kljub temu, aminokisline in baze nista glavna dejavnika slab�e kakovosti. d) Baze Količina baze ki jo sake vsebuje je 50 do 150 µg ml-1; v glavnem so te uridin, hipoksantin in citidin. Okoli 30 % jih izvira iz kvasovk, preostali dele� pa iz koji ri�a. Ravno tako, kot pri aminokislinah je tudi tu vsebnost baz obratnosorazmerna kakovosti. Okus sake-ja je blag, lahek, sladek in rahlo kisel, vendar kljub temu bogat in mamljiv. Tabela 2 nam prikazuje povprečne vrednosti kvalitet najbolj poznanih vrst sake-ja. Da bi lahko objektivno razvrstili različne sake-je na osnovi okusa, so uvedli teste, s katerimi so ocenili njegove posamezne karakteristike. Z uporabo razčlenitvenega faktorja so v 16.-ih testih ocenili lastnosti sake-ja, in za sake, ki naj bi �el v prodajo, sta morala biti dose�ena faktorja za popolnost in čistost. Nadalje so uvedli �e faktor za sladkost. Metoda, s katero so ocenjevali sladkost, je temeljila na ocenjevanju 6.-ih vzorcev sake-ja z različnimi koncentracijami sladkorja, organskih kislin, aminokislin in mineralov. Tabela 2: Povprečne ocene analiz posameznih sake-jev razreda stopnjaa etanol

(vol%) gostotab DRSc

(%,w/v) kislina (100 ml-1)

aminokisline(%/w/v)

OD43010

minimum 15.8 -6.7 2.21 1.3 0.10 0.007 poseben povprečje 16.5 -1.5 2.78 1.5 0.15 0.012 maksimum 17.1 +3.3 3.47 1.9 0.20 0.020 minimum 15.6 -3.7 2.53 1.2 0.10 0.003 prvi Povprečje 15.8 -1.1 2.94 1.4 0.14 0.010 maksimum 16.1 +4.3 3.24 1.7 0.21 0.023

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 16 minimum 14.4 -10.2 1.99 0.8 0.07 0.001 drugi optimum 15.3 -0.9 3.13 1.3 0.14 0.013 maksimum 16.1 +5.8 4.48 2.7 0.28 0.052 Vir: Letno poročilo japonske nacionalne davčne uprave a Ta klasifikacija je bila uradno ocenjena 1. aprila 1990 in autorizirana od Japonskega centralnega in regionalnega svetovalnega komiteja za alkoholne pijače. b Gostota je merjena s sake metrom, čigar merjenje temelji na principih Baume-ovega hidrometra za merjenje gostot ni�jih od vode. Gostota vode je umerjena na 0. Pozitivne vrednosti predstavljajo ni�jo gostoto od vode, medtem ko negativne predstavljajo vi�jo: +10, predstavlja zelo suh sake; +5, suh sake; +3, rahlo suh; 0, niti suh, niti sladek; -3, rahlo sladek; -5, sladek; -10, zelo sladek. c DRS je analiza za reducirajoče sladkorje kot je npr. glukoza.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 17 5. BIOIN�ENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA V V

DivoVi

5.1 5.1 1. ZasaknavZrnv nko 2. VoVobarmivseMivople

ri� poliran ri� kuhanje v pari

poliranje

agram 1: Blokovni diagram prda; K ~ sake kvasovka r: Kodama (1970)

Pripravljalni postopki

.1 Surovine:

ri�

pripravo sake-ja so najbolj pre-ja, se imenuje �yamadanishadnem jedilnem ri�u tehta le 2a morajo imeti mehko jedro zjihovo notranjost in zaradi hit

ličnik� (Toyozawa in Yonezak

voda

da predstavlja kar 80 vol. % kda za pripravo sake-ja mora ive, vonja in okusa ter ne smneralov. Biti mora srednje trdbnost klora. neralna sestava vode vpliva nda vsebuje veliko mineralov ksni (Tokuoka, 1941; Ito, 1952

otrobi

spore koji plesn

sve�i sake

S

T

pranje

iprave sake-ja; M ~

imerne sorte ri�a z iki�. (1000 ri�evih 1 � 22 g.) aradi la�jega predrej�ega sprejemanji, 1959; Kodama, 1

ončnega produkta, meti nevtralen ali e vsebovati �kodl

a (nem�ka lestvica

a kakovost končneot so kalij, fosfor i; Wakabayashi s s

kuhan ri�

moto

moromi

koji riž i

sake

V

K

M

fermentacija

mlečna kislina, T ~

velikimi zrni. Sortazrn te sorte tehta 2

iranja micelijev plea vode ter nizek �n970).

zato je njena kakovrahlo alkalen pH, jivih mikroorganiz 3-7), priporočljiva

ga produkta, saken magnezij, saj so od., 1957; Shimizu

V

ohlajanje

filtracija

namakanje

usedanje

filtracija pasterizacija skladi�čenj me�anje redčenje ustekleničenje

t

, t8

snera

osbitmo p

-jale-, 1

pasterizacija

rdni delci, V ~

ipična za pripravo g, medtem ko pri

i rodu Aspergillus zpolo�ljiv polirni

t zelo pomembna. i mora čista, brez v in neprimernih

a je precej visoka

. Za�eljeno je, da ti potrebni za rast 960; Ichikawa in

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 18 Maeda, 1963), pospe�ujejo pa tudi rast kvasovk in alkoholno fermentacijo. Minerali kot so kalcij in klor pa naj bi pospe�evali elucijo nekaterih encimov iz koji riža. Kalij je pomemben tudi za nadome�čanje izgub med pranjem in namakanjem ri�a (Nojiro in Aoki, 1957; Kanoh, 1962). Ne�eljeni minerali v vodi pa so �elezo, mangan in baker. �elezo je najbolj ne�eljeno, saj reagira s cikličnim polipeptidom (deferiferikrom), ki ga proizvaja koji plesen (Aspergillus oryzae) in povzroča rdečkasto rjavo barvo sake-ja in mu daje neprijeten okus. Voda za pripravo sake-ja lahko vsebuje največ 0,02 ppm �eleza. Znana voda za pripravo sake-ja je �Miyamizu� iz pokrajine Nada, vsebuje pa visoko koncentracijo kalija in fosforja. 5.1.2 Obdelava ri�a pred nadaljnim postopanjem 1. Poliranje in namakanje Zrna ri�a sprva mehansko obdelajo (poliranje ali rezkanje), da odstranijo otrobe. To povzroči zmanj�anje te�e za 25 � 35 %. Potem poliranje nadaljujejo, dokler ne dose�ejo ugodnega polirnega razmerja, ki predstavlja odstotek končne te�e glede na prvotno. Za�eleno je nizko polirno razmerje, saj zunanji sloji zrn vsebujejo relativno visoke količine proteinov, ma�čob, vitaminov in mineralov, kateri pogubno vplivajo na kakovost sake-ja. Na splo�no za pripravo sake-ja uporabljajo ri� s 60 � 70 % polirnim razmerjem, za pripravo sake-ja vi�je kakovosti (�ginjo-shu�) pa uporabljajo ri� s 35 � 50 % polirnim razmerjem. Po poliranju sledi pranje ri�a, z namenom da odstranijo ostanke otrobov; nato pa ga namočijo v vodo za eno do �est ur, glede na spremenljivo hitrost absorpcije vode. Odvečno vodo odvedejo, zrnom pa se poveča te�a za 25 � 30 %. 2. Kuhanje v pari Namočen ri� kuhajo v pari z namenom, da �elatinizirajo �krob in denaturirajo proteine ter s tem omogočijo koji plesni (Aspergillus oryzae) la�je prodiranje v notranjost zrna. Encimi, ki izhajajo iz koji plesni, tako lahko temeljito prebavijo ri�. Po tradicionalni metodi namočen ri� prenesejo v plitve odprte posode, imenovane koshiki, ki imajo v sredini odprtino skozi katero vstopa para. Koshiki postavijo na vrh velikega kotla, napolnjenega z vrelo vodo. Tako se ri� kuha v pari pri atmosferskem pritisku pribli�no pol do ene ure. Zrnom se v tem času poveča te�a za 8 � 12 %. Dandanes pa so razvili kontinuirne sisteme, ki vodijo zrna, v plitvem sloju nalo�ena na tekočem traku, skozi tunel s kontroliranim pritiskom, v katerega prihaja para. Na ta način je ri� kuhan v 20 � 30 minutah. 5.1.3 Priprava koji-ja Koji je kultura koji plesni, Aspergillus oryzae, ki raste na in znotraj kuhanih ri�evih zrn. Za pripravo koji-ja na Japonskem uporabljajo tane-koji, spore koji plesni, ter 20 % vsega ri�a, preostanek rabijo za pripravo sake-ja. Tane-koji pripravijo s su�enjem starega koji-ja, plesni A. oryzae, kultivirane na kuhanem ri�u pri 34 � 36 ºC pet do �est dni. Po tem času sledi obilna tvorba spor.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 19 V koji rižu (kuhan ri� inokulairan s koji plesnijo) so poleg amilaz in proteaz odkrili okrog 50 vrst encimov, posebno pomembni sta α-amilaza, ki utekočinja ri�, in S-amilaza (amiloglukozidaza), ki osladi ri� (Tokuoka, 1941; Shimada s sod., 1953; Kitahara in Murata, 1953). α-amilaza (amilo-1,4-dekstrinaza) razcepi �krobne molekule v ri�u na manj�e fragmente in tako zni�a viskoznost �krobne suspenzije v sake ka�i. Nato S-amilaza (amiloglukozidaza) odceplja glukozne enote od konca omenjenih fragmentov. Koji riž vsebuje tako kisle kot tudi alkalne proteaze, prve so pomebnej�e, saj pri pH 3-4 odcepljajo amino kisline in peptide od proteinskih molekul (Kageyama in Sugita, 1955). Med procesom priprave koji-ja se znotraj ri�evih zrn kopičijo �e prej omenjeni hidrolitični encimi, sladkorji, aminokisline, peptidi in vitamini B-kompleksa ter se tvorijo prekurzorji aromatskih spojin. Med pripravo koji-ja, miceliji koji plesni prekrijejo povr�ino zrna ter vdrejo v njegovo notranje tkivo. Zato je cel čas potrebno vzdr�evati pravilno ravnote�je med izhlapevanjem vlage in hitrostjo rasti plesni z uravnavanjem temperature in vla�nosti. Pri konvencionalni pripravi koji-ja kuhan ri� na tekočem traku prehaja skozi hladilnik, kjer ga sprva ohladijo na pribli�no 35 ºC, nato ga prenesejo v koji-muro, to je velika kultivacijska komora, kjer lahko nadzorujejo temperaturo (26 � 28 ºC) in vlago (80 � 90 %) na primernem nivoju za rast plesni (hikikomi). (Hikikomi je prva stopnja pri pripravi koji riža.) Tam ga nakopičijo na podstavek (toko) in ga za dve do tri ure pokrijejo s cunjo, da se izenači temperatura in vlaga. Okoli�ka temperatura je naravnana na 35 � 38 ºC. Potem zrna enakomerno razprostrejo po podstavku in po njih raztresejo tane-koji v razmerju 20 � 100 g na 100 kg poliranega ri�a. Nastalo maso zme�ajo in oblikujejo kup pri 31 � 32 ºC ter ga pokrijejo s cunjo. Po 10 � 12 urah, ko na povr�ini ri�evih zrn �e lahko opazimo micelije plesni, maso razpustimo in ponovno zme�amo (kirikaeshi), da iz�enemo toploto in ogljikov dioksid, ki nastajata zaradi dihanja koji-plesni. Po nadaljnjih 10 � 12 urah, ko so bele lise plesni vidne �e s prostim očesom, maso razdelimo na dele po 1,5 do 2,5 kg na plitve lesene koji pladnje s perforiranim dnom (mori). Koji plesen začne burno in �ivahno rasti, kar se odra�a v hitrem nara�čanju temperature in ogljikovega dioksida. �est do osem ur kasneje vsak pladenj preme�amo (nakashigoto). Temperaturo koji-ja dr�imo na pribli�no 35 ºC. Kakih 8 � 10 ur pozneje me�enje ponovimo (shimaishigoto) da iz�enemo nastali ogljikov dioksid in ohladimo zrna, katera potem razprostremo v 4 � 5 cm debel sloj. Pribli�no 10 ur kasneje, ko temperatura koji-ja dose�e 40 � 42 ºC in miceliji plesni �e popolnoma prepredejo povr�ino zrn in njihovo notranjost, se razvije tipična aroma koji riža, ki ima vonj po pečenem kostanju. Po tej stopnji koji riž odvedejo ven iz kultivacijske komore (koji-muro), z namenom da nizka temperatura (prib. 5 ºC) ustavi rast plesni, in ga razprostrejo po cunjah, dokler ga ne potrebujejo (de-koji). 1. Vrste koji-ja Koji lahko razvrstimo v tri vrste glede na posamezne značilnosti razvoja micelijev koji plesni na ri�evih zrnih. Kvaliteta nastalega sake-ja je brez dvoma odvisna od značilnosti razvoja micelijev na in znotraj ri�evih zrn.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 20

Slika 1: Mikrografije prečnih prerezov ri�evih zrn, prepredenih s koji plesnijo.

(a) tsukihaze-koji, (b) nurihaze-koji, (c) sohaze-koji. Vir: Kodama (1989)

a. Tsukihaze-koji Tsukihaze-koji ima nekaj belih lis (od kolonij plesni) na povr�ini zrn, ki so polna micelijev, kateri prodirajo globoko v njihovo notranjost. Za pripravo tsukihaze-koji-ja naj bi bil kuhan ri� trd in suh na povr�ini ter mehek in vla�en v notranjosti zrn. Ker miceliji ne prekrijejo vrhnje plasti zrn (katera vsebuje veliko količino du�ikovih spojin), ampak prodirajo globoko v notranje kanale in pore zrn, je vsebnost naza�eljenih priokusov, kateri izhajajo iz zgoraj omenjenih du�ikovih spojin, relativno nizka v moromi-ju. Primeren je za pripravo sake-ja bolj�e kakovosti � manj kisel, ule�an, mil, saden in s telesom � kot je ginjo-shu. V nasprotju s spodaj omenjenim sohaze-koji-jem zahteva priprava te vrste koji-ja posebno spretnost in različne previdnosti oz. varnostne ukrepe. b. Nurihaze-koji Nurihaze-koji nastane, če je povr�ina kuhanega ri�a pretirano mokra in notranjost trda ali pa ima ri� visoko polirno razmerje (nad 70 %) ali pa če je bil izpostavljen prekomerni

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 21 ventilaciji. V teh primerih namreč miceliji popolnoma prekrijejo povr�ino zrn, tako da izgledajo tako, kot bi jih pokapali z barvo. Ta vrsta koji-ja vsebuje na povr�ini večje količine du�ikovih spojin, katere razgradi koji proteaza na peptide in aminokisline, katerih akumulacija povzroči nastanek temne barve in priokusa sake-ja. c. Sohaze-koji Sohaze-koji je vrsta, sestavljena iz tsukihaze- in nurihaze-koji-ja; pripravimo ga po relativno lahki metodi in ga zato lahko uporabljamo v serijski proizvodnji. Da bi bil nastali sake konstantno dobre kvalitete, se priporoča uporaba precej visoko poliranega ri�a (Oana, 1954). 2. Serijska (mno�ična) proizvodnja Za serijsko proizvodnjo koji-ja so razvili več različnih naprav (Kawamura s sod., 1959, 1960; Sakai s sod., 1960; Terui in Shibasaki, 1960; Terui s sod., 1960; Ogawa in Wakayama, 1961; Ito, 1962; Kato, 1984). Za pripravo tsukihaze-koji-ja z uporabo avtomatske naprave naj bi upo�tevali naslednje pogoje kultivacije:

i. Ravna, pravokotna in zaprta kultivacijska komora, ki je po zunanjosti podobna koji pladnju

ii. Globina plasti na koji pladnju: 4 � 5 cm iii. Polirno razmerje: manj kot 70 %; inokulum tane-koji manj kot 20 g na 100 kg

poliranega ri�a iv. prezračevanje: �ibko in pretrgano (v presledkih)

Tipična avtomatska naprava za proizvodnjo koji-ja je prikazana na sliki 2 (Kato, 1984). Sestavljena je iz posamičnih klimatiziranih, ravnih, pravokotnih in zaprtih kultivacijskih komor, opremljenih s tekočim trakom iz nerjaveče �ične mre�e. Ohlajen kuhan ri� nakopičijo na kultivacijski podstavek v prvi komori. Potem ga s pomočjo premičnega razpr�ilca razprostrejo po podstavku in inokulirajo s tane-koji. Po pribli�no 10. urah maso pome�ajo in premestijo na koji pladenj v drugi komori. Tam jo zopet enakomerno razprostrejo v 4 � 5 cm debel sloj. Kakih 10 ur pozneje postopek ponovijo, na koncu pa koji riž odvedejo ven iz zadnje kultivacijske komore.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 22

Slika 2: Avtomatska naprava za proizvodnjo koji-ja. Vir: Kato (1984)

5.2 Potek bioprocesa 5.2.1 Priprava moto-ja Moto dobesedno imenujemo �mati sake-ja�. Je kvasna starter kultura za sake moromi fermentacijo. Za pripravo moto-ja porabijo 7 % vsega ri�a. Njegova vloga se sklada z vlogo ječmenovke (v katero dodamo kulturo kvasovk) pri varjenju piva. Za pripravo moto-ja obstajajo tri tipične metode, opisane spodaj. Klasična oblika moto-ja � ki-moto � zahteva zelo intenziven postopek, ki traja 25 � 30 dni, in precej izku�enj. Zato jo dandanes izpodrinja enostavnej�a modifikacija stare metode, ki nam daje yamahai-moto (Kagi s sod., 1909). 1. Yamahai-moto Postopek drozganja vključuje energično mehansko me�anje (Kawakami s sod., 1964; Kodama, 1989). Na primer, kuhan ri� (120 kg), koji riž (60 kg) in vodo (200 l) pri 13 � 14 ºC zme�ajo in hranijo tri do �tiri dni, občasno preme�ajo. V tem času temperatura postopno pade na 7 � 8 ºC, ri�eva zrna pa se delno razgradijo in osladijo. Ka�o nato pogrevajo, in sicer za 0,5 ºC na dan, nadaljnjih 10 � 15 dni, dokler ne dose�e temperature 14 � 15 ºC. V prvih nekaj dneh, ko je pH vrednost �e nevtralna, se namno�ijo divji mikroorganizmi, ki potrebujejo le nekaj hranil. Na začetku se pojavijo nitrat-reducirajoče bakterije, kot npr. Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium in Micrococcus spp., ki izvirajo iz vode ali koji riža. Sledijo jim mlečnokislinske bakterije, vključno z Leuconostoc mesenteroides var. sake in Lactobacillus sake, ki izvirajo iz koji riža. Ti organizmi se namno�ijo do �tevila 107

� 108 celic g-1, kasneje pa zaradi visoke koncentracije sladkorja in mlečnokislinskega zakisanja zaporedoma izginejo (Saito in Oda, 1932; Katagiri in Kitahara; 1934; Oda, 1935; Saito, 1950; Kodama, 1959a,b; Kitahara, 1960; Kodama s sod., 1960; Ashizawa, 1961; Ashizawa in Saito, 1965). Glej graf 1(a).

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 23 Med to fazo se spremeni tudi dele� �divjih� kvasovk. Te se klasificirajo kot metanojski TTC (2,3,5-trifeniltetrazol klorid)-ro�nate ali -bele kolonije. Ro�nate predstavljajo zlasti kvasovke, ki tvorijo mreno, posebno Hansenula anomala; bele pa kvasovke Candida guilliermondii in Pichia, Debaryomyces in Torulopsis ssp. Večina ima izvor v koji rižu (Saito in Oda, 1934; Kodama s sod., 1957; Kodama in Kyono, 1963; Kodama, 1966; Akiyama in Sugano, 1967). V kakih desetih dneh TTC-ro�nate kvasovke dose�ejo �tevilo 103 celic g-1, zatem pa le-te naglo upadejo zaradi toksičnega učinka nitrita (koncentracija 5 � 7 mg l-1), katerega so iz nitrata, vsebovanega ali dodanega v vodo, proizvedle nitrat-reducirajoče bakterije (Hanaoka, 1918; Zenda, 1920; Kanai in Iida, 1932; Ashizawa, 1961, 1962, 1963). TTC-rdeče kvasovke, ki so podobne Kyokai Št. 7 (to je določenemu sevu sake kvasovk), lahko najdemo v začetnih fazah. Ko �divje� kvasovke skoraj popolnoma izginejo in se temperatura ka�e dvigne na pribli�no 15 ºC, dodamo čisto kulturo sake kvasovk (ekolo�ka skupina sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae), in sicer 105 � 106 celic g-1. Glej graf 1(b). V tej fazi je sestava filtrata naslednja: specifična te�a 1,124 � 1,128 (16,0 � 16,5 ºBaumé); vsebnost reducirajočih sladkorjev 26 � 28 %; vsebnost amino kislin (kot glicin) 0,5 � 0,8 %; vsebnost skupnih kislin (kot mlečna kislina) 0,30 � 0,40 %. Po dveh do treh dneh, ko se temperatura dvigne na 17 � 19 ºC in povi�ana kislost povzroči odstranitev nitrata, se inokulum kvasovk hitro razmno�i in prične se fermentacija. Ko kvasovke dose�ejo �tevilo 108 celic g-1, fermentacija poteka �ivahno in učinkovito, temperatura pa se dvigne na 20 �23 ºC. Nekaj dni kasneje ka�o postopno ohladimo, z namenom da preprečimo smrt ali oslabitev kvasovk, predvsem zaradi visokih koncentracij alkohola ali kislin. Po 5 do 7 dnevnem mirovanju moto uporabijo kot starter kulturo za glavno fermentacijo moromi kaše. Filtrat ka�e ima: specifično te�o 1,028 � 1,043 (4 � 6 ºBaumé); vsebnost alkohola 12 � 15 %; vsebnost amino kislin 0,45 � 0,65 %; vsebnost skupnih kislin 0,9 � 1,0 %. Omenjen klasičen postopek priprave nudi zdrav(ilen) moto, kateri vsebuje čiste kvasne celice z dolgotrajno fermentativno lastnostjo. Fermentacija moromi-ja, katerega pripravimo iz yamahai-moto-ja, teče počasi ter s konstantno aktivnostjo kvasovk.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 24

Graf 1: Spremembe v populaciji mikroorganizmov med pripravo moto-ja. (a) Bakterije: prazen krogec ~ Leuconostoc mesenteroides ver. sake; prazen trikotnik ~ Lactobacillus sake; poln krogec ~ nitrat-reducirajoče bakterije. (b) Kvasovke: poln trikotnik ~ Candida guilliermondii; prazen trikotnik ~ Hansenula anomala; poln krogec ~ �divje� kvasovke; prazen krogec ~ sake kvasovke; # ~ dodatek sake kvasovk. Vir: Kodama (1989) 2. Sokujo-moto Je dandanes najbolj raz�irjena in uporabna vrsta moto-ja. Sokujo-moto lahko pripravimo v relativno kratkem času (12 � 15 dni) pri maksimalni temperaturi drozganja 18 � 22 ºC (Eda, 1909). Za zni�anje pH vrednosti na 3,6 � 3,8, dodajo ka�i mlečno kislino (75 %, specifična te�a 1,21). Pomembno je, da ka�o čimprej inokulirajo s čisto kulturo kvasovk (105 � 106 celic g-1), z namenom da se izognejo oku�bi z ne�eljenimi mikroorganizmi (Tsukahara, 1954; Akiyama in Sugano, 1967). 3. Koontoka-moto Koontoka-moto je bil dolgo poznan pod imenom amazake-moto, kateri je bil njegova izvirna vrsta in je dobil ime po sladki pijači iz koji riža. Koontoka-moto je kasneje razvila tovarna za pripravo sake-ja v predstojni�tvu v Hiroshimi (Kodama, 1970). Drozganje poteka pet do sedem ur pri 56 � 58 ºC, s čimer dose�emo optimalne pogoje za utekočinjenje in saharifikacijo ri�evega �kroba ter učinkovito uničimo aktivnost vegetativnih celic �divjih� kvasovk in bakterij. Visoko razmerje med vodo (150 � 160 litrov) in ri�em (100 kg) ustvari redko in vodeno ka�o, katera prepreči visoko viskoznost in prekomerno kopičenje sladkorjev. Visoka viskoznost in visoka koncentracija sladkorja namreč inhibirata rast sake kvasovk. Omenjena ka�a je koristna tudi zaradi mo�nosti hitrej�ega zvi�anja temperature na nivo, ustrezen za encimsko razgradnjo, ter hitrej�ega hlajenja med pripravo moto-ja.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 25 4. Stisnjene kvasovke Leta 1907 je Takahashi posku�al uporabiti gojene kvasovke namesto moto-ja. Kasneje je Yamada s sod. (1939) pokazal, da lahko brez oklevanja izvedemo eksperimentalni test za pripravo sake-ja z uporabo sake kvasovk, kultiviranih na steriliziranem koji ekstraktu, kot primernega inokuluma za običajni moto. Ta princip je imel za osnovo nov postopek, ki ga lahko imenujemo �metoda stisnjenih kvasovk�, izumil pa ga je Shimoide s sod. (1964, 1965). Pri njem uporabimo stisnjene sake kvasovke, pridobljene z aerobnim razmno�evanjem, kot inokulum. 5.2.2 Fermentacija moromi-ja Moromi je glavna fermentacijska ka�a, katere fermentacija poteka v velikih odprtih posodah s kapacitetami od 6 do 18 kl. V eni tak�ni posodi je bilo dolgo časa 1,5 tone poliranega ri�a, zadnje čase pa v velikih tovarnah za pripravo sake-ja uporabljajo večje količine poliranega ri�a, to je od 3 do 5 ton. Moromi sestoji iz v pari kuhanega ri�a, koji riža in vode. V tabeli 3 je primer dele�ev navadno uporabljenih surovin. Tabela 3: Prikaz dele�ev surovin v moromi-ju med pripravo sake-ja

stopnja dan ri� [kg] kuhan ri� [kg] koji ri� [kg] voda [l]

moto kaša 0 180 120 60 270

1. dodajanje 1 510 360 150 500

2. dodajanje 3 1020 810 210 1230

3. dodajanje 4 1710 1350 360 2329

skupaj 3420 2640 780 4329

Vir: Kodama (1970)

V posodi pripravljeno kvasno starter kulturo (moto) s temperaturo 12 �13 ºC se doda sve�enj surovin. Po enem dnevu naraste �tevilo kvasnih celic na 108 g-1, to je isti red kot pri pripravi moto-ja. Drugi dan se fermentacija počasi prične, nadaljnji dodatki surovin pa sledijo tretji in četrti dan. Z reguliranjem temperature kuhanega ri�a in vode se zni�a temperatura ka�e in se četrti dan zadr�i na 7 � 8 ºC. Tak�en re�im je pomemben zaradi omejevanja mo�nosti oku�be z divjimi kontaminanti, ker �e visoka koncentracija kvasne populacije in mlečne kisline v moto-ju preprečuje prekomerno razredčitev v enem koraku. Po tretjem dodajanju se ka�a pome�a dvakrat dnevno, tri do �tiri dni kasneje pa sestava filtrata dose�e svoje maksimalne vrednosti: specifična te�a 1,051 � 1,058 (7 � 8 ºBaumé); vsebnost alkohola 3 � 4 %, vsebnost skupnih kislin (kot jantarna kislina) 0,06 � 0,07 %. Po celotni povr�ini fermentirajočega moromi-ja se postopno raz�iri pena in sve� vonj po sadju ka�e na ugodno fermentacijo. Z vi�anjem temperature fermentacijska aktivnost postopno raste, na povr�ini pa se ustvarja globok sloj pene (taka-awa), katerega razbija me�alnik. �tevilo kvasnih celic dose�e vrednost 2,5 · 108 g-1 (Nojiro, 1959). Ko koncentracija alkohola in kislin naraste, postane

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 26 pena manj gosta in začne izginjati, tako da jo brez te�av razpr�imo (Tsukahara s sod., 1964; Saito, 1965). V 6 do 9. dneh ka�a dose�e maksimalno temperaturo 13 � 18 ºC, katero nato vzdr�ujemo nadaljnjih 5 � 7 dni, ko koncentracija alkohola dose�e 17,5 � 19,5 %, pa temperatura upade in fermentacija se ustavi. Zatem ponavadi dodajo rafiniran 30 � 40 % alkohol, z namenom da prilagodijo končno alkoholno koncentracijo ka�e na 20 � 22 %. Da dobimo sake bolj enotne (soglasne) lastnosti, lahko v ka�o dodamo �e glukozo, mlečno kislino, jantarno kislino in natrijev glutamat. Za slajenje v zadnji stopnji fermentacije v ka�o dodamo 7 � 10 % celotne količine kuhanega ri�a. Na ta način encimi (α-amilaza in amiloglukozidaza) pri 15 % koncentraciji alkohola pretvorijo določen dele� �kroba v glukozo. Druga mo�nost pa je, da po koncu fermentacije dodamo manj alkohola, saj lahko sake tako pridobi bolj�e telo. Za izvoz v sake ponavadi ne dodajajo alkohola; taka vrsta sake-ja se imenuje junmai-shu. Primer sprememb v sestavi moromi kaše med fermentacijo je prikazan v tabeli 4. Tabela 4: Spremembe v sestavi moromi kaše med postopkom fermentacije

čas [dan]

gostota

[g/ml] [°Baumé]

reducirajoči sladkorji

[% kot glukoza]

etanol

[vol %]

kislina

[% kot jantarna]

4 1,059-1,051 8-7 8-7 3-4 0,06-0,07

6 1,043-1,036 6-5 7-6 6-7 0,08-0,09

9 1,036-1,029 5-4 7-6 9-10 0,09-0,10

12 1,028-1,021 4-3 6-5 11-12 0,10-0,11

15 1,018-1,014 2,5-2,0 5-4 15-16 0,11-0,15

18 1,011-1,007 1,5-1,0 4-3 17,5-18,5 0,14-0,16

21 1,004-1,000 0,5-0,0 3-2 18,5-19,5 0,14-0,16

Vir: Kodama (1970)

5.3 Zaključni postopki Po koncu fermentacije pustiijo moromi ka�o nekaj dni stati, da se ustali. Po klasičnem postopku jo nato natočijo v lanene vreče in pod pritiskom filtrirajo, zadnje čase pa za v trgovske namene uporabljajo avtomatske filtre. Po nadaljnjih 5 do 10 dneh usedanja postane filtrat sake-ja skoraj popolnoma bister. Če ga pustijo predolgo usedati, se lahko zgodi, da bodo dobili sake slab�e kvalitete. Omenjeni filtrat nato spustijo �e skozi filter, ki vsebuje aktivno oglje, in po 30 do 40. dneh ga pasterizirajo, nato pa hranijo pri 13 � 18 ºC, da dozori, preden ga ustekleničijo.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 27 6. EKOLO�KI ASPEKT BIOPROCESA Pri procesu izdelave sake-ja igra voda zelo pomembno vlogo. Le-ta mora biti neoporečna, da dobimo izvrsten, specifičen okus izdelka. Sake kot končni proizvod predstavlja kar 80% čiste vode. Preden dose�e končno oceno je v vsaki stopnji bioprocesa potrebna ogromna količina vode (ri� mora biti namreč izpran in opran, namočen in kuhan, povsod uporabljamo vodo, med fermentacijo se tudi brozgi dodaja voda in končno moramo očistiti tudi posodo v kateri skladi�čimo sake). Na koncu vse skupaj nanese kar tridesetkratno te�o ri�a, ki smo ga porabili v tem istem procesu. To pa seveda ne pomeni, da je poraba ri�a zanemarljiva. Ostanki ri�eve brozge, ki ostanejo po stiskanju, se uporabljajo za proizvodnjo dveh alkoholnih pijač, shochu in mirin. Pri proizvodnji prve pijače (shochu), ki je ri�ev alkohol oziroma �pirit, se odpadki, ki ostanejo po stiskanju sake-ja dodajajo lu�činam, ostankom procesa lu�čenja ri�a. (V procesu izdelave sakeja, proizvajalci običajno odstranijo le 55% teh ri�evih lupinic ali lu�čin. Vzrok tega je namreč, da te lu�čine vsebujejo tol�čno kislino, katera povzroča glavabole, kar ni ravno ugodno za porabnike, vendar po drugi strani pa le-te lu�čine dajejo prijeten okus sakeju). Nastala me�anica je nato podvr�ena procesu destilacije v japonskem kotlu za kuhanje �ganja. Tako nekako maksimalno izkori�čajo surovine, za pridelavo novih manj kvalitetnih pijač. Dejstvo pa je, da kljub vsej tej iznajdljivosti, na koncu vedno ostane nekaj organskih odpadkov, ki se jih lahko predela ter izkoristi. Aparatura za predelavo organskih odpadkov je dokaj komplicirana. Sestavlja jo naprava za vbrizgavanje (injektor), ki dozira organske odpadke in usedline v bioreaktor, me�alo za me�anje vsebine reaktorja, napravo za dovajanje zraka, razkrojevalec, ki razkraja organske odpadke v anorganske trdne delce, vodo ter plin ter odtočni kanal po katerem odvajajo organske substance in lug (ta je večinoma prisoten le na dnu reaktorja, v usedlinah). Aparatura se uporablja za obdelavo organskih odpadkov, ki ostanejo v proizvodnjah hrane in vsekakor tudi v pridelavi sake-ja. Obdelane odpadke pa nato porabijo za hranjenje �ivine in tudi kot kompost (gnojenje njiv).

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 28 7. UPORABA BIOPROIZVODOV V PREHRANI

7.1 Vrste sake-ja Najbolj raz�irjena vrsta sake-ja je narejena s pomočjo novih tehnik z dodatkom alkohola, sladkorja, organskih kislin in aminokislin, med pripravo. Te nove tehnike so se razvile po 1945. letu, z namenom da zagotovijo stabilno produkcijo sake-ja zaradi pomanjkanja surovin. Zadnje čase se je količina rafiniranega alkohola in drugih sestavin, ki so dodane moromi kaši, manj�ala iz leta v leto. V letu 1990 pa so uvedli zakon, ki je določal sestavo določenih vrst sake-ja. Ta sistem je podoben francoskemu sistemu � French Appellation Contrôlèe. V letu 1989 je bila produkcija honjozo-shu 198,9, junmai-shu 54,6 in ginjo-shu sake-ja 32,4 milijonov litrov, kar ustreza 25. % celotne pridelave. Junmai-shu To je prvotna vrsta sake-ja, v katerem je samo ri�, z manj kot 70 % polirnim razmerjem, koji ri� in voda so uporabljene kot sestavine brez dodatkov drugih substanc, kot npr. alkohol ali sladkor. Po sestavi je junmai-shu najbli�eje tradicionalnemu sake-ju. V preteklosti so uporabljali vi�je polirno razmerje (več kot 90 %), kar je vplivalo na okus in aromo ri�a, ki je bila precej drugačna od sedanje. Čeprav se junmai-shu nagiba k izrazitej�emu okusu kot pa običajne vrste sake-ja, postaja popularnej�i. Honjozo-shu K belemu ri�u se doda manj kot 10 % (w/w) alkohola (95 %) ter nobene druge sestavine. Uporabiti moramo ri� z manj kot 70 % polirnim razmerjem, moromi ka�i pa moramo dodati rafiniran alkohol, ki vpliva na razvoj aromatskih spojin. Ginjo-shu To je sake najvi�je kvalitete, je poseben tip junmai-shu-ja ali honjozo-shu-ja in ima sadno aromo po jabolku. Ves ri�, ki ga uporabljamo za pripravo te vrste sake-ja, mora imeti najmanj 60 % polirno razmerje. Zadnje čase uporabljajo za pripravo te vrste sake-ja ri� z 35 � 40 % polirnim razmerjem. Druge vrste sake-ja Taru-zake ali cask sake je staran v lesenih sodih (18 � 72 litrov), tako da se barva, aroma in okus absorbirajo iz lesa v sake. Taru-zake dandanes prodajajo v sodih različnih velikosti ali pa v steklenicah. Koshu je �star sake� v pravem pomenu besede. Preden ga ustekleničijo, ga starajo 2 - 3 leti. Večino sake-jev pa ustekleničijo pred enim letom staranja, torej je zau�ito kot �mlado vino�. Nekateri vrhunski sake-ji, kot je ginjo-shu, se z leti izbolj�ajo in pridobijo značilno ule�ano aromo. Nigori-sake je �moten sake�ali �grobo filtriran sake� in vsebuje ostanke ri�a suspendirane v tekočini, ki dajo sake-ju bel moten videz. Kijo-shu je pripravljen tako, da nadomestijo polovico vode (ki naj bi jo uporabili za pripravo sake-ja) s sake-jem. Okus je izrazit in sladek in se ponavadi u�iva kot aperitiv.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 29 Akai-sake je �rdeč sake�. Za njegovo pridelavo poznamo dve metodi. Pri prvem načinu uporabljajo rdeče obarvan koji namesto običajnega, rumenega. Drugi način pa je uporaba adenin auksotrofičnega mutanta navadne sake kvasovke.

7.2 Sestavine Sake namenjen mno�ični proizvodnji vsebuje okoli 16 % alkohola, 3 % celotnega sladkorja (izra�eno kot glukoza) in ima titrabilno kislost 1.4 (volumen v mililitrih 0.1 M natrijevega hidroksida, potreben za titracijo 10 ml sake-ja) in aminsko kislost 1.5 (volumen v mililitrih 0.1 M natrijevega hidroksida, potreben za titracijo du�ikovega formola v 10 ml sakeja). Sake vsebuje poleg glukoze tudi druge sladkorje, npr. izomaltoza in etilglikozid; maltoze ni odkrili. Spisek organskih kisline in amino kislin je prikazan v tabeli ? in ?. Du�ikove spojine v sake-ju se v glavnem sestojijo iz aminokislin ali peptidov. Te komponente so pomembne za blag okus. Od aromatskih spojin so pomembni �e estri, vi�ji alkoholi; posebno �e izoamil acetat (3 � 5 ppm) in etil kaproat (1 � 2 ppm). Le-te so najpomembnej�e komponente v ginjo-shu-ju, ki ima sadno aromo. Tabela 5: Aminokislinska sestava junmai-shu aminokisline mg l-1 % Aspartatna kislina 99.8 3.1 Treonin 243.5 7.5 Serin 137.1 4.2 Glutaminska kislina 281.6 8.6 Glicin 179.0 5.5 Alanin 291.8 8.9 Cistein 73.4 2.3 Valin 177.7 5.4 Metionin 59.4 1.8 Izolevcin 112.7 3.5 Levcin 240.8 7.4 Tirozin 198.6 6.1 Fenilalanin 150.8 4.6 Ornitin 37.7 1.2 Lizin 147.6 4.5 Histidin 84.5 2.6 Triptofan 14.2 0.4 Arginin 407.9 12.5 Prolin 191.7 5.9 γ-aminobutirična kislina 36.1 1.1 Etanolamin 66.3 2.0 Amonijak 28.5 0.9 Skupaj 3261.0 100 Vir: Kitamoto (1991)

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 30 Tabela 6: Sestava organskih kislin v junmai-shu Kisline mg l-1 % mlečna kislina 475.0 29.2 ocetna kislina 40.8 2.5 piruvična kislina 17.4 1.1 jabolčna kislina 315.3 19.4 citronska kislina 78.0 4.8 jantarna kislina 698.8 43.0 skupaj 1625.3 100 Vir: Kitamoto (1991) Tabela 7: Prikaz 8. kategorij sake-ja v odvisnosti od surovin in priprave procesa Ime Potrebni

materiali dele� stopnje poliranosti

Proces,vonj,barva,itd. Dodatek alkohola

Ginjo-shu ri�, koji ri�, alkohol

Manj kot 60% Ginjo proces Naravni vonj in barva:dobra

Osnovan na Honjozo-shu

Daiginjo-shu ri�, koji ri�, alkohol

Manj kot 50% Ginjo proces Naravni vonj in okus:zelo dobra

Osnovan na Honjozo-shu

Junmai-shu ri�, koji ri� Manj kot 70% Ginjo proces Naravni vonj in barva:dobra

Brez

Junmaiginjo-shu

ri�, koji ri� Manj kot 60% Ginjo proces Naravni vonj in barva:dobra

Brez

Junmaidaiginjo-shu

ri�, koji ri� Manj kot 50% Ginjo proces Naravni vonj in barva:zelo dobra

Brez

Tokubetsu-junmai-shu

ri�, koji ri�, alkohol

Manj kot 60%,ali posebni proces

Naravni vonj in barva:zelo dobra

Brez

Honjozo-shu ri�, koji ri�, alkohol

Manj kot 70% Naravni vonj in barva:dobra

Brez

Tokubetsu-hon-jozo-shu

ri�, koji ri�, alkohol

Manj kot 60%,ali posebni proces

Naravni vonj in barva:zelo dobra

Brez

Vir: (http://www.sake-world.com/Sake_Newsletter/Archives/Jan00/jan00.html) Iz sake-ja pa lako pripravljamo tudi veliko orientalske hrane, kot sta npr. teriyaka in sukiyaki. Lahko ga pa pri kuhanju uporabljamo kot nadomestek kisa.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 31 8. IMPLIKACIJE DRUGIH TEHNOLOGIJ IN IMPLIKACIJE NA DRUGE TEHNOLOGIJE Med dr�avami zahoda in vzhoda se proces saharifikacije močno razlikuje. Na zahodu uporabljajo amilolitične encime, ki jih pridobijo iz slada, medtem ko na vzhodu kot vir amilolitičnih encimov uporabljajo plesni Aspergillus ali Rhizopus. Tako npr. pivo pripravljajo s saharifikacijo ječmenovega �kroba z uporabo amilolitičnih encimov iz slada, medtem ko saharifikacija pri pijačah iz Orienta poteka z uporabo amilolitičnih encimov iz prej omenjenih plesni. Tipične japonske fermentirane jedi so fermentirana sojina omaka ali shoyu, fermentirane sojine testenine ali miso, fermentirano ri�evo vino ali sake, ri�ev kis, amasake... Skupna lastnost vsem tem fermentiranim jedem je kultiviranje plesni na delu ali pa celotni količini surovine, npr. ri�a, soje. Te plesni spadajo k vrsti Aspergillus, npr.: A. oryzae, A. sojae, A. niger. Te proizvajajo encime kot so amilaze, proteaze, lipaze, celulaze, pektinaze in ostale. Snov, ki je obdelana s kulturami plesni, imenujejo na Japonskem koji. Koji se uporablja za razgradnjo surovine v vodi s soljo ali brez nje. Kot je razvidno koji pomeni ime za vse snovi obdelane s plesnijo Aspergillus, torej se ne uporablja samo kot specifičen izraz pri proizvodnji sake-ja. Za proizvodnjo shoyu in miso uporabljamo A. oryzae, prav tako kot za sake. Vendar se sev, ki ga uporabljamo za proizvodnjo ri�evega vina močno razlikuje od ostalih po encimski aktivnosti. Pomemben proces, ki preprečuje kvar je pasterizacija.V zgodovini sake-ja je pasterizacija znana �e v 16. stoletju, veliko pred Pasteurjem, leta 1868. Sve� sake vsebuje ogromno kvasnih celic, motnih delcev, kot so vlaknine, �krob in proteini. Po 5 � 10. dnevnem usedanju z aktivnim ogljem (200 � 500 g na 1000 l) filtrirajo supernatant skozi bomba�no vlakno s filtrsko stiskalnico. Po me�anju sve�i sake segrejejo na 60 � 65 ºC s pomočjo toplotnega izmenjalnika. Ta pasterizacija inaktivira encime (amilaze, proteaze...) in uniči hiochi bakterije, kvarne mikroorganizme, ki povzročajo kvar v času skladi�čenja. Takoj po pasterizaciji spravijo vroč sake v posode za skladi�čenje. Namesto pasterizacije zadnje čase uporabljajo membranske filtre z velikostjo por okoli 45 µm. Proizvodnja sake-ja �e vedno temelji na tradicionalnih tehnikah, ki se prena�ajo iz generacije v generacijo ter se sprotno izpopolnjujejo. Nova spoznanja fiziologije, biokemije in ekologije mikroorganizmov potrjujejo pravilnost teh tehnik. Znanstven pristop lahko prinese nove izbolj�ave v tehnologijii, in sicer z izločanjem nesmiselnih postopkov. Veliko je bilo zamenjanega, na primer uporaba pnevmatskih sistemov, tekočega traku namesto ročnega dela� V proizvodnjo si prizadevajo vpeljati on-line kontrolo procesa fermentacije in avtomatsko kontrolo temperature. Nov napredek na področju celične in molekularne biologije prav tako prina�a nove mo�nosti manipulacije s sevi sake kvasovk. Prihod genske manipulacije, vključno s fuzijo protoplastov, tehniko rekombinantne DNK in transformacijo bo v prihodnosti omogočil, da bomo sake kvasovki podelili različne koristne lastnosti, kot na primer visoka produktivnost alkohola pri visokih in nizkih temperaturah, povi�ana toleranca na alkohol in rezistenca na �killer� kvasovke ter tvorbo bolj�e in edinstvene arome.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 32 9. REFERENCE: Akita, O., Suzuki, S., Obata, T. In Hara, S. (1990). Agricultural and Biological Chemistry 54, 1485. Akiyama, H. in Sugamo, N. (1967). Journal of Fermentation Technology, Osaka 45, 1093. Akiyama, H. in Sugano, N. (1967). Journal of Fermentation Technology,Osaka 45, 1093. Ashizawa, H. (1961). Journal of the Brewing Society of Japan 56, 113. Ashizawa, H. (1962). Journal of the Brewing Society of Japan 57, 422. Ashizawa, H. (1963). Journal of the Brewing Society of Japan 58, 543. Ashizawa, H. in Saito, Y. (1965). Journal of the Brewing Society of Japan 60, 803. Aso,K.,Shibasaki, K. In Yamauchi, F. (1954). Journal of Fermentation Technology,Osaka 32, 47. Eda, K. (1909). Report of the Japanese Government Institute of Brewing 25, 22. Eda, K. (1909). Report of the Japanese Government Institute of Brewing 25, 22. Fukui, S., Tani, Y. In Kishibe, T. (1955a). Journal of Fermentation Technology,Osaka 33, 50. Fukui, S., Tani, Y. In Kishibe, T. (1956). Journal of Fermentation Technology,Osaka 34, 369. Fukui, S., Tani, Y. In Kishibe, T. (1958). Journal of Fermentation Technology,Osaka 36, 169. Hanaoka, M. (1918). Journal of the Brewing Society of Japan 13, 1. Hara, S., Wakai, Y., Shimazaki,T. in Kitano, K. (1983). Journal of the Brewing Society of Japan 78, 449. Hara,S., Obata, T. In Shimada, T. (1977). Journal of Fermentation Technology,Osaka 372, 596. Hongo, M., Hayashida, S. in Koizumi, R. (1967). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 41, 629. Ichikawa, K. in Maeda, Y. (1963). Journal of Fermentation Technology, Osaka 41, 530. Ishikawa, T. In Yoshizawa, K. (1978). Agricultural and Biological Chemistry 43, 45. Ishikawa, T., Momose, H. In Yoshizawa, K. (1984). Journal of the Brewing Society of Japan 79, 62. Ito, K. (1952). Journal of the Brewing Society of Japan 47, 137. Ito, K. (1962). Journal of the Brewing Society of Japan 57, 1172. Kageyama, K. in Sugita, O. (1955). Journal of Fermentation Technology, Osaka 33, 109. Kagi, K., Otake, I., Moriyama, Y., Ando, F., Eda, K. in Yamamoto, T. (1909). Report of the Japanese Government Institute of Brewing 29, 1. Kanai, H. in Iida, S. (1932). Report of the Japanese Government Institute of Brewing 114, 184. Kanoh, S. (1962). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 36, 379, 489. Katagiri, H. in Kitahara, K. (1934). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 10, 942. Kato, T. (1984). Journal of the Brewing Society of Japan 79, 8. Kawaharada, H., Hayashida, S. in Hongo, H. (1967a). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 41, 635. Kawaharada, H., Kuga, H. Hayashida, S. in Hongo, M. (1967b). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan Kawamura, M., Yamashita, M., Umemura, Y. in Shibata, M. (1959). Journal of the Brewing Society of Japan 54, 581. Kawamura, M., Yamashita, M., Umemura, Y. in Shibata, M. (1960). Journal of the Brewing Society of Japan 55, 780.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 33 Kitahara, K. (1960). In �Ecology of Micro-organisms�. Institute of Applied Microbiology Japan Symposium 11, 42. Kitahara, K. in Murata, U. (1953). Journal of Fermentation Technology, Osaka 31, 90. Kodama, K. (1959a). Journal of the Brewing Society of Japan 54, 138. Kodama, K. (1959b). Journal of the Brewing Society of Japan 54, 770. Kodama, K. (1966). Journal of the Brewing Society of Japan 61, 677. Kodama, K. (1966). Journal of the Brewing Society of Japan 61, 677. Kodama, K. (1989). Journal of the Brewing Society of Japan 84, 222. Kodama, K. in Kyono T. (1963). Journal of Fermentation Technology, Osaka 41, 113. Kodama, K.(1970). In �The Yeasts� (A.H. Rose in J.S. Harrison, eds), 1st edn, vol. 3, pp. 225-282. Academic Press, London. Kodama, K., Kyono, T. in Kodama, S. (1957). Report of the Synthetic Sake Corporation of Japan 14, 554. Kodama, K., Kyono, T. in Kodama, S. (1960). Report of the Synthetic Sake Corporation of Japan 20, 919. Koizumi, T.(1968). Journal of Fermentation Technology, Osaka 363, 446. Komoda, H., Mano, F. In Yamada, M. (1966). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 40, 127. Kuriyama, K., Ashida, S., Hata, Y., Suginami, K. In Imayasu, S. (1986). Journal of Fermentation Technology,Osaka 64, 175. Kurono., K., Katsume, S. In Kawashima, T. (1930). Report of the National Research Institute of Brewing of Japan 110, 18. Macrae, R., Robinson, R. K. in Sadler, M. J. (1993). Encyclopaedia of food science, food technology and nutrition. Vol 6. In K., Kitamoto. Sake (3958-3962). San Diego: Academic Press inc. Masuda, Y.,Yamashita, K., Sasaki, S., Hattori, K. In Ito, Y. (1965).Journal of the Brewing Society of Japan 60, 1114. Matsui, H. in Sato, S. (1963). Journal of the Brewing Society of Japan 58, 734. Matsui, H. in Sato, S. (1966). Journal of Fermentation Technology,Osaka 44, 14. Muto, H., Tadenuma, M. in Furuichi, A. (1964).Report of the Japanese Government Institute of Brewing 136, 1. Muto, H., Tadenuma, M. in Narumi, K. (1962). Journal of the Brewing Society of Japan 57, 819. Nakanishi, S. in Tsukahara, T. (1954). Journal of the Brewing Society of Japan 49, 475. Nojiro, K. (1959). Journal of the Brewing Society of Japan 54, 653. Nojiro, K. in Aoki, M. (1957). Journal of the Brewing Society of Japan 52, 1008. Oana, F. (1954). �Shuzoyohketsu�. Nikorjoyukai, Osaka. Oda, M. (1935). Journal of Fermentation Technology, Osaka 13, 629. Ogawa, C. in Wakayama, K. (1961). Journal of the Brewing Society of Japan 56, 161. Ouchi, K., Takagishi, M., Yamamoto, Y. In Akiyama, H. (1981). Journal of Fermentation Technology,Osaka 59,9. Rose, A.H., Harrison, J.S. (1993). The yeasts. Vol 5. Yeast technology. Sake-brewing yeasts (129-168). London: Academic Press Ltd. Saito, K. (1950). �The Mycology of Sake Brewing�. Osakajozoga kai, Osaka. Saito, K. in Oda, M. (1932). Journal of Fermentation Technology, Osaka 10, 787. Saito, K. in Oda, M. (1934). Journal of Fermentation Technology, Osaka 12, 159. Saito, T. (1965). Journal of the Brewing Society of Japan 60, 898. Sakai, S., Tsuzumi, H. in Nagayama, F. (1960). Journal of the Brewing Society of Japan 55, 525.

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 34 Sato, S., Kawashima, H. in Maruyama, Y. (1974b). Journal of the Brewing Society of Japan 69, 774. Sato, S., Tadenuma, M., Takahashi, K., Azuma, Y., Tanzawa, K. In Edamura, H. (1974a). Journal of the Brewing Society of Japan 69, 771. Sato, S.,Shimada, M. In Yabara, T. (1967). Journal of the Brewing Society of Japan 62, 506. Shimada, S., Sugita, O. in Mizumoto, K. (1953). Journal of Fermentation Technology, Osaka 31, 498. Shimizu, T. (1960). Annals of the Brewers' Association of Japan 15, 20. Shimoide, M., Tani, Y.,Sumino, K., Yamashiro in Fukui, S. (1965). Journal of the Brewing Society of Japan 60, 443. Shimoide, M., Tani, Y.in Fukui, S. (1964). Journal of the Brewing Society of Japan 59, 996. Sugama, S., Saheki, H. in Nojiro, K. (1965). Journal of the Brewing Society of Japan 60, 362. Takahashi, A. (1965). Doctoral Thesis. Takahashi, K., Shimoni, H., Akita, S., Suzuki, A., Ishikawa, T., Shiraishi, T.,Kobayashi, S. in Akimoto, I. (1983). Journal of the Brewing Society of Japan 78, 886. Takahashi, M. (1954). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 28, 395. Takahashi, M. (1956). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 30, 140. Takahashi, T. (1907). Journal of the Society of Brewing of Japan 1, 20. Takeda, M. in Tsukahara, T. (1965). Journal of Fermentation Technology, Osaka 43, 447. Terui, G. in Shibasaki, I. (1960). Journal of Fermentation Technology, Osaka 38, 40. Terui, G., Shibasaki, I., Mochizuki, T. in Takano, M. (1960). Journal of Fermentation Technology, Osaka 38, 29. Tokuoka, U. (1941). Journal of Fermentation Technology, Osaka 19, 791. Toyozawa, M. in Yonezaki, H. (1959). Journal of Fermentation Technology, Osaka 37, 64. Tsukahara, T. (1954). Journal of the Brewing Society of Japan 28, 405. Tsukahara, T. (1954). Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 28, 405. Tsukahara, T., Sakai, T., Maeda, K. in Miyasaka, T. (1964). Journal of the Brewing Society of Japan 59, 358. Ueda, R., Hayashida, M. in Kitagawa, E. (1960). Journal of Fermentation Technology, Osaka 38, 337. Wakabayashi, K., Uozumi, M. in Tsukahara, T. (1957). Journal of the Brewing Society of Japan 52, 721. Wood, I., Brian, J. B. (1985). Microbiology of fermented foods. Vol 2. In N., Lotong. Koji (248-251). London, New York: Elsevier Applied Science Publischers Ltd. Yamada, M., Ishimaru, K. in Masui, S. (1939). Report of the Japanese Government Institute of Brewing 128, 265. Yamasaki, I. (1958). Journal of Fermentation Association of Japan 116, 335. Yoshizawa, K. (1966a). Journal of the Brewing Society of Japan 61, 629. Yoshizawa, K. (1966b). Agricultural and Biological Chemistry, Tokyo 30, 634. Yoshizawa, K. (1966c). Journal of the Brewing Society of Japan 61, 952. Zenda, N. (1920). Journal of the Brewing Society of Japan 15,1. http://ns.media-akita.or.jp/akita-sake/varietyE.html http://www.geocities.com/shamusan/sake.html http://www.sake-world.com/FAQ_Other_Topics/Making_Sake/faqs.html

Biotehnolo�ka proizvodnja: sake, Seminar, Biotehni�ka fakulteta, �tudij �ivilske tehnologije, 2002 35 http://www.sake-world.com/FAQ_Other_Topics/Pubs_and_Restaurants/Top_Ten/top_ten.html http://www.sake-world.com/Sake_Label_Service/sake food.htm http://www.sake-world.com/Sake_Newsletter/Archives/Jan00/jan00.html http://www.sake-world.com/Sake_Newsletter/Archives/Nov00/nov00.html