Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA
PENGHASILAN DAN PENCIRIAN ENZIM LIPASE DARI RHIZOPUS ORYZAE YANG DIPENCILKAN DARI
PERSEKITARAN TEMPATAN
ROSIAH BT MUSANI
FSAS 1992 2
PENGHASI LAN DAN PENCIRIAN ENZIM LIPASE DARI RHIZOPUS ORYZAE YANG DIPENCILKAN DARI
PERSEKITARAN TEMPATAN
Oleh
ROSIAH BT MUSANI
Tes i s Ini Dikemukakan kepada Universiti Pertanian Malaysia Sebagai Memenuhi Syarat untuk
Mendapat Ijazah Master Sa ins di Fakulti Sains dan Penga j ian Alam Sekitar ,
Univers iti Pertanian Malays ia .
Ogos
1992
PENGHARGAAN
Segala puji-puj ian bagi Al lah s.w.t. yang telah memberikan
kekuatan untuk menyempurnakan penyel idikan dan tesis ini .
Ribuan ter ima kas i h kepada Prof. Madya Dr Che Nyonya
Abdul Razak dan Prof. Madya Dr Abu Bakar Salleh di atas segala
bimbingan dan tunjuk a jar yang telah diberikan .
Ucapan terima kas ih Juga kepada Dr Kamaruzaman Ampon , Dr
Wan Mohd . Z i n Wan Yunus dan Puan Mahi ran Bas r i yang t elah
ba n y a k memb e r i p a n d a n g a n dan n a s i h a t y a n g b e r guna
untuk penyel idikan 1n1 .
Sepenuh penghargaan untuk Puan Normayati dan Cik Ruhaidah
yang telah banyak memberi ker jasama disepanjang penyel idikan
ini di j a lankan . Buat ayah , mak dan ke luarga yang dikas ihi,
terima kas i h di atas s egal a doa dan s okongan moral yang
diberikan . Tidak di lupakan Juga rakan-rakan seperjuangan , Siti ,
Yan , Puan Zainoha , Yusof , Puan Ra ja Noor Zaleha , Puan Rosl ina ,
Abdul Hadi dan Kak Nab yang turut membantu .
1 1
lSI KANDUNGAN
PENGHARGAAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SENARAI JADUAL · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SENARAI RAJAH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SENARAI GAMBAR · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SENARAI SINGKATAN PERKATAAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ABSTRAK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
BAB
1
2
PENGENALAN · . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
SOROTAN BAHAN BERTULIS
Lipase
Sumber Lipase
Penyaringan dan Pemenci lan Mikroorganisma Lipolisis
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Penghasilan Enzim o l eh Mikroorganisma
Swnber Karbon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Swnber Nitrogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kesan Faktor-faktor Fizikal . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mikroorganisma Sebagai Sumber Lipase
Kepentingan Enzim Termostabil dalam Industri . . . . . . . . . . . . . . .
Enz im Ekstrasel dan Intrasel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Penul enan Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iii
Muka Surat
11
vi
viii
x
X1
xii
1
5
5
8
12
15
16
22
25
29
35
37
41
Ciri-ciri Lipase Tulen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kesan pH dan Suhu . . . . . . . . . . • . . • . . . . . • . • • . . • .
Kespesifikan Substrat dan Mod Tindakbalas Lipase
Kepentingan Lipase . . . • . . . . . . . . . . . . • . . . • . • . . . . . . .
Hidrolisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Esterifikasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Interesterifikas i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kegunaan Lain Lipase . • . • . . . . . . . . . • . • • . • . • • • •
3 BAHAN DAN KAEDAH
Bahan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kaedah
Penyediaan Media Penyaringan dan Pemenci lan Kulat . . . . . . . •
Penyaringan Kulat Termofilik Lipoli s i s
Persampelan
Penyaringan dan Pemenci lan
Penentuan Kulat Pengha s i l Lipase di dalam Media Kaldu . . . . . . . . • • . • . • • • • • • •
Penentuan Aktiviti Lipase
Pengasaian Aktiviti Lipase Ekstrasel . . . . • • . • . .
Pengasaian Aktiviti Lipase Intrasel . . . . . . . . . . . . . . . .
Pengenalpastian Ku1at
Penyediaan Media Faktor-faktor yang Penghasi lan Lipase
Untuk Kaj ian Mempengaruhi
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Penu1enan Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
iv
47
47
50
58
59
61
63
65
67
72
72
73
73
74
75
75
75
76
77
78
80
Pemendakan dengan Aseton . . . . . . • . . • . . . •• . • 8 1
Penurasan dengan Gel Sephadex G-100 . . ••• . 82
Penentuan Protein Menggunakan Kaedah Folin-Lowry . . . . . . . . . . . . . . . . • • • • . . • • • • 82
Elektrofores is dengan Rod Gel Pol iakri lamida . . . . . . . . . . . . . . . • . • . . . ••• . . 83
Penci rian Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 6
Kesan p H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . • • • • . . 87
Kesan Suhu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Penentuan Kespesifikan Substrat 88
Kespesi fikan Tindakbalas Lipase 90
4 KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN . . . . . . • . . • . . . . • . • . • • • . . 92
Penyaringan dan Pemenci lan Kulat Termofi lik Lipo l i tik • . . . . . . . . • . . . . ••• . . . . ••••••• 92
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Tahap Penghasi lan Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . • . . 98
Kesan Sumber Pemakanan 98
Kesan Lipid ke atas Penghasilan Lipase . . . • . . . • . . •••• . . . . . . •• . • . • 107
Faktor-faktor F i z ikal yang Mempengaruhi Penghasi lan Lipase
Penulenan Lipase
113
120
Ciri-ciri Lipase dari Rhi zopus oryzae • . ••• . •• . •• 126
Kespesifikan Substrat dan Mod Tindakbalas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
5 RINGKASAN DAN KES IMPULAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . 153
RUJUKAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 58
APENDIK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 1
VITA . . . '" . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
v
SENARAI JADUAL
Jadual
1 Senarai Mikroorganisma Lipolitik • . . . . • • • • • • . . .
Muka Surat
30
2 Ciri-ciri Lipase Tulen dari
3
4
Mikroorganistna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Aktiviti Lipase daripada Kulat yang Dipenci 1kan dalam Kaldu Pertumbuhan . . • • • • • . • . •
Ha8il Penulenan Lipase Ekstrasel . • • • • • • • • • • • • .
93
122
5 Tindakbalas Lipase Terhadap Monoasid Trigl iserida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
6 Tindakbalas Lipase ke atas Polioksi sorbi tan (Tween ) dan
7
Sorbitan ( Span ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
Tindakbalas Enz im ke atas Met i l Ester . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
8 Kesan Sumber Karbon ke atas Penghasilan Lipase . . . . . . . . . . . • . • • . • • • • • . • • . . . 171
9 Kesan Sumber Nitrogen ke atas
10
Penghasi lan Lipase • . . . . • • • . . . • . • • • • • • • • • • • • • • 172
Kesan Kehadiran NaN03 di dalam Media ke atas Penghasilan Lipase 173
11 Kesan Lipid ke atas Penghasilan
12
Lipase . . . It • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 174
Kesan Fraksi Minyak Kelapa Sawi t ke atas Penghasilan Lipase • • . . • . • • • . • • . • • • • • • 175
13 Kesan Suhu Pengeraman ke atas Penghasilan Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7 5
14 Kesan pH Media ke atas Penghasilan
1 5
1 6
Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
Kesan Kadar Goncangan ke atas Penghasiian Lipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
Profi l pH Aktiviti Lipase Kasar . . . . . . . . . • . . . . 177
vi
17 Profil pH daripada Aktiviti Lipase Tulen . . • • .
18 Profil pH Aktiviti Lipase Intrasel
19 Kesan pH ke atas Kestabilan
178
179
Lipase Kasar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
20 Kesan pH ke atas Kestabilln Lipase Tulen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
21 Kesan pH Penimbal ke atas Kestabilan Lipase Intrasel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
22 Suhu Optimum Aktiviti Lipase . . . . • • • . . • • . . • • • . 183
23 Kestabi lan Lipase Terhadap Suhu • • • • • • • • • • • • • • 183
24 Kes tabilan Lipase Terhadap Suhu 500 C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
2 5 Tindakbalas Lipase Terhadap Monoas id Trigl iserida . • • • • . . . . • • • • • • • • • • . • • • • 185
26 Tindakbalas Lipase Terhadap Polioksisorbitan (1ween) dan Sorbitan (Span) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . • . 185
27 Tindakbalas Lipase ke atas Metil Ester
vii
186
SBNARAI RAJAH
Ra jah
1 Tindakba1as Lipase (Macrae dan H8IIIDOnd , 1 98 5 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Hipotes i s Tindakan Lipase pada Antara Permukaan Minyak dan Air ( Brockerhoff , 1983) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Tindakba1as Lipase Mengikut Kespes ifikan Tempat ( a ) Tindakbalas Pemangkinan Lipase yang Tidak Spesifik dan (b) Tindakbalas Pemangkinan yang Spesifik pada Kedudukan Karbon 1 dan ke 3 (Macrae dan Hammond ,
Muka Surat
6
7
198 5 ) . . . . . . . . I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3
4 Kesan Sumber Karbon ( 1 . 0% ) Terhadap Penghas i1an Lipase Ekstrasel (a ) dan Intrase1 (b ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . 100
5 Kesan Sumber Nitrogen ( 5 . 0% ) Terhadap Penghasilan Lipase Ekstrasel ( a ) dan Intrase1 ( b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
(, Kesan NaNOS (0 . 01%) ke atas Penghasi lan Lipase Ekstrasel (a ) dan Intrase1 (b ) . . . . . . . . . . . . . . . 104
7 Kesan Lipid ( 1 . 0% ) Terhadap Penghasilan Lipase Ekstrasel ( a ) dan Intrasel(b) . . . . . . . . . . . 108
8 Kesan Fraks i Minyak Ke 1apa Sawit ( 1 . 0% ) Terhadap Penghasilan Lipase Ekstrasel(a) dan Intrasel ( b) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 12
9 Kesan Suhu Pengeraman Terhadap Penghasi 1an Lipase Ekstrase 1 ( a ) dan Intrasel ( b ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . • 114
10 Kesan pH Media Terhadap Penghasi lan Lipase Ekstrasel ( a ) dan Intrasel(b) . . . . . . . . . . . 1 16
1 1 Kesan Kadar Goncangan Terhadap Penghas ilan Lipase Ekstrasel ( a )
1 2
dan Intrasel (b ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 9
Lengkuk Penurasan Gel Sephadex G-IOO • • . • • . • • . • 123
viii
13 Profil Aktiviti Lipase Ekstrasel Kasar Terhadap pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . • . • • . 129
14 Profi1 Aktiviti Lipase Ekstrasel Tulen Terhadap pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
15 Profil Akt iviti Lipase Intrasel Terhadap pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
16 Kesan pH Terhadap Kestabi lan Lipase Ekstrasel Kasar . • . . . . . • . . . • . • • • • • • • • • • 132
17 Kesan pH Terhadap Kestabilan
18
19
20
21
22
Lipase Ekstrasel Tulen • • . . . • • • . • • • • • • • • • • • • • • 133
Kesan pH Terhadap Kestabilan Lipase Intrasel . . . . . " " " "" ,, " """""" " " " " " ,, . . . . . . 134
Profil Suhu Aktiviti Lipase • • . • • • • • • • • • • • • • • 137
Kes tabi lan Lipase Terhadap Suhu 138
Kestabi lan Lipase Terhadap Suhu 500 C " . ,,"""""" 139
Lekuk Piawai Penentuan Protein . . . . . . . . . . • • . . . 187
ix
Gambar
1
2
3
4
SENARAI GAMBAR
Rhizopus oryzae di at as Plat Agar Kentang Dekstrosa ( selepas 48 jam pengeraman) • • • • • • • • •
Rhi zopus oryzae di atas Plat Agar Triolein ( pandangan dari atas ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Rhi zopus oryzae di atas Plat Agar Triolein ( pandangan dar i bawah ) • • . . . . • . • . . • • . • • • • • • • • •
Rod Gel Elektroforesis
Mub Surat
95
96
97
127
5 Kespesifikan Tindakbalas Lipase Ekstrasel . . . . . . .. .. . . .. .. . .. . . . . .. .. . . . .. .. .. . . . . .. .. .. .. . . 145
6 Kespesifikan Tindakbalas Lipase Intrasel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
7 Alatradas untuk Penulenan Lipase dan Kolum Sephadex G-100.......... . .. . . . . . . . . . . . . . 188
x
psm
PORIM
TEMED
TRIS
U
umol
eks
int
bms
CPO
CPOo
CPKO
CPKOo
SENARAI S INGKATAN PERKATAAN
Pusingan Seminit
Palm Oil Research Institute of Malaysia
N, N, N, N - tetramethylenediamine
Tris (hydroxymethyl ) aminomethane
Uni t
Mikromol
Lipase Ekstrasel
Lipase Intrasel
Berat Kering Miselia
Minyak Kelapa Sawit Kasar
Minyak Olein Kelapa Sawit Kasar
Minyak Isirong Kelapa Sawit Kasar
Minyak Olein Isirong Kelapa Sawit Kasar
xi
Abstrak tesis Pertanian Mal aysia I jazah Master Sains .
yang dikemukakan kepada Senat Univers iti s e bagai memenuhi syarat untuk mendapat
Pensyarah
Fakulti
PBNGHASILAN DAN PBNCIRIAN BNZIM LIPASE DARI RHIZOPUS ORYZAE YANG DIPENCILKAN DARI
PERSEKITARAN TEMPATAN
Oleh
ROSIAH HT MOSANI
Ogos , 1992
Prof . Madya Dr Che Nyonya Abdul Razak .
Sains dan Penga j ian Alam Sekitar .
Penyaringan dan pemenci lan kulat termof i l ik l ipolitik
telah di lakukan dari dua tempat iaitu kolam buangan s i sa kelapa
s awit dan tempat pembuangan sampah dengan menggunakan plat agar
triolein . Enam s train kulat l ipo l it ik telah dikenalpasti dengan
adanya pembentukan zon keamatan di seke l i l i ng mi s e l i a kul a t
ters ebut . Wa lau baga imanapun hanya dua s t rain saha j a yang
men gha s i l ka n 1 i p a s e da l am med i a k a ldu . Kul at - ku l a t i n i
di k e n a l p a s t i s e b a g a i R h izopus o r yzae d a n R h i z o p us
rhizopodiformis.
Rhizopus oryzae didapati menghasilkan l ipase ekstrasel
pada aras yang maks imum s e l epas 72 j am penge raman pad a s uhu
4S"C di da1am media yang mengandungi pepton , pada pH 5 dan
digoncang pada 100 psm . Penghasi lan lipase intrase l maksimum di
dalam media pada pH 5 yang mengandungi kaldu soya tripton ,
xii
pol i pepton atau corn steep liquor ' sebagai sumber nitrogen .
Pengeraman d i lakukan pada suhu 37·C dan digoncang pada 150 psm .
Sorbi tol dan glukosa merupakan perangsang yang berkesan untuk
penghasi lan lipase intrasel .
Enz im l ipase ekstras e l t e lah d i tul enkan menggunakan
pemendakan dengan asiton dan di turas melalui gel Sephadex G-
100. Enzim ini telah ditulenkan sebanyak 1 5 8 kal i ganda dengan
pulangan aktiviti sebanyak 64% dan spes ifik aktivitinya adalah
189 U/mg . Melalui proses elektroforesis dengan gel pol iakr i l
amida , 1 ipa s e tulen menunjukkan hanya satu j a lur protein
sahaja .
Pencirian lipase te lah dilakukan terhadap l ipase ekstrasel
kasar dan tul en dan juga l i pase intras e l . L i pase eks trase l
kasar dan tulen didapati stabi l pada pH 6 . 0 . Lipase ekstrase l
kasar mengekalkan aktivit inya lebih dari 90% selepas tiga jam
didedahkan pada suhu 50 · C manakala lipase ekstrasel tulen pula
hanya mengekalkan 83.0% aktivitinya selepas satu jam pendedahan
pada suhu yang sama . L i pase intra s e l pul a l eb i h sensi t i f
terhadap haba dan hanya mengekalkan 79 . 3% akti vi tinya selepas
satu jam didedahkan pada suhu 50·C. Lipase i n i juga s t abi l
pad a pH 6 .
L i pa s e eks t ra s e l menun jukkan k e a f inan yang t i nggi
terhadap t r i g l i s e r i da yang mempunya i ran t a i a s i d l emak
sederhana pan j ang . Manak a l a 1 i pa s e i n t ra s e l pul a t i dak
xiii
menun jukkan keaf inan terhadap j en i s subs trat yang spe s i f i k .
Kedua-dua enzim ini bert indakba1as terhadap ika tan ester pada
kedudukan 1 , 3 pada trig1 iserida .
Abs tract of thesis submitted to the Senate of Universi t i Pertanian Malaysia in fulfilment o f the requirements for the degree of Master of Sc i ence .
Chairman
Facul ty
PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF LIPASE
SECRETED BY RHIZOPUS ORYZAE ISOLATED FROM LOCAL ENVIRONMENT
By
ROSIAH BT MUSANI
August • 1992
Prof . Madya Dr Che Nyonya Abdul Razak .
Science and Environmental Studies .
Screening and i solation of thermophi l i c l ipolyt i c fungi
was taken from two different s ites ; palm oil mi l l effluent and
waste dumping area . Lipolyti c fungi were identi f i ed through the
format ion of intens i f i ca t ion zone a round the myc e l i a on the
trlolein agar plate . Only two out of the six strains i solated
produced l ipase 1n the culture broth . They were identified as
Rhizopus oryzae and Rhizopus rhizopodiformis .
R h i zOpUS o ryza e w a s f ound t o p r odu c e ma x i mum
extrac e l lular l ipas e a f t e r 72 hr i ncuba t ion at 4 S · C in t he
medium containing peptone and shaken at 100 rpm . The maximum
product i on of intrace l lular l ipas e was f ound i n the medium
containing tryptone soy broth , polypeptone or corn s teep l iquor
as nitrogen source . The cul ture was incubat ed a t 37 · C and
xv
shaken at 100 rpm in the medium of pH 5. Sorbitol and glucose
were effective inducers for intracellular lipase production.
The extracellular enzyme was purified by means of acetone
precipitation and through Sephadex G-IOO. It was purified about
158 fold with a yield of 64% and the specific activity was 189
U/mg. Purified lipase displayed only one protein band through
native polyacrylamide gel electrophoresis.
Three types of lipases; crude extracellular lipase, pure
extracellular lipase and intracellular lipase were
characterized. All the three lipases were found to be stable at
pH 6.0. At 50°C, crude and purified extracellular lipase
maintained more than 90% and 83.0% of their activity after
three hour and one hour incubation, respectively. In contrast
intracellular lipase was found to be more sensitive to heat
whereby only 79.3% of the activity was retained after one hour
incubation at the same temperature.
Extracellular lipase showed higher affinity towards
triglycerides which have moderate length of fatty acid chain,
whereas, intracellular lipase did not show affinity towards any
specific substrate. Both enzymes showed 1,3 regiospecificity.
xvi
BAH 1
PENGENALAN
Enzim l ipolitik (l ipase) b ertanggungjawab dalam
biopenukaran lipid di perseki tarall. Melalui proses ini lipid
dapat dipindahkan dari suatu organisma kepada organisma lain.
Dalam sesuatu organisma i tu sendiri, lipase memainkan peranan
penting untuk proses metabolisme lipid (Brockerhoff dan Jensen,
1974). Lipase adalah gliserol-ester-hidrolase ( E . C . 3 . 1 . 1 . 3 . )
yang bertindak dengan menghidrolisiskan ikatan ester pada
asilgliserol. Hidrolisis lengkap lipid menghasilkan asid lemak
bebas dan gliserol manakala hidrolisis separa akan menghasilkan
digliserida, monogliserida, asid lemak dan gliserol (Macrae dan
Hammond, 1985).
Walaupun lipase tersebar luas di persekitaran dan boleh
ditemui dalam haiwan, tumbuhan dan mikroorganisma namun kajian
masa kini tertumpu kepada lipase dari mikroorganisma
berbanaing dengan sumber-sumber lain. Ini disebabkan beberapa
faktor, antaranya a) mikroorganisma mempunyai kitaran hidup
yang pendek oleh itu penghasilan lipase dalam kuantiti yang
besar boleh dilakukan dalam masa yang singkat, b) penghasilan
lipase dari mikroorganisma boleh dikawal melalui faktor
taktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan penghasilan lipasenya
seperti faktor-faktor pemakanan (sumber nitrogen dan sumber
karbon) dan faktor-faktor fizikal (pH media, suhu pengeraman
1
2
dan kadar goncangan) dan c ) mikroorgani sma bo1eh dimanipu1asi
bahan g e n e t i knya un tuk menghas i 1 kan mikroorgani sma yang
mempunyai ciri -ciri yang ist imewa seperti mempunyai kemampuan
untuk menghasi 1kan lipase pada aras yang lebih tinggi ('super
producer' ) ( Frost dan Moss , 1 987 ) .
Berbagai s train mikroorganisma termasuk bakteria, kulat
dan y i s t e 1 ah dikena 1 pa s t i s ebagai mikroorganisma lipol i t i k
antaranya ia1ah Staphylococcus sp ( Vadehra dan Harmon, 1969) ,
Ps eudomonas fragi ( Ni shio et al . , 1 98 7 ) , Chromobacterium
( Yamaguchi et a1 . , 1973 ) , Alcal igene ( Kokusho et a1 ., 1 982),
Rhizopus delemar ( Iwai et al . , 1966), Aspergillus niger ( Pal et
al . , 1978 ) , Humicola 1anuginosa (Arima et al . , 1972 ; Morinaga
et a1 . , 1986 : Ibrahim et al ., 1 987a), Rhizopus rhizopodiformis
( Samad et a1 . , 199 1 ) , Geotricum candidum (lwai et a1 . , 1973)
da n Ca n d i d a c y 1 i n d r a c e a ( 0 t a e t a 1 . , 1 9 6 8 ) . Wa 1 a u
bagaimanapunapun dari sudut ekonomi dan industri, kulat lebih
banyak digunakan s ebagai sumber lipase kerana ia s e lalunya
menghas ilkan lipase ekst ras e 1. Bnz im ekstrasel ini mudah
di a s i n g k a n d a r i mi s e l i a melalui p r o s e s p e nu r a s an a t au
pengemparan ( Iwa i dan Tsu j i saka, 1 984 ) . Miselia yang telah
diasingkan juga mungkin mengandungi lipase intrasel yang boleh
digunakan di dalam industri . Lipase intrasel itu telah tersedia
dalam bentuk s ekatgerak dan t idak perlu ditulenkan (Lilly,
1979 ) .
3
L i pase yang t e r has i l t e l ah dapat d i tu l e nkan d engan
berbagai teknik kromatografi dan dengan adanya teknik-teknik
ini , ciri-ciri dan mekanisme tindakbalas l ipolisis dapat dikaji
dan dije1askan ( Bogstrom dan Brockman , 1984 ) . Antara ciri-ciri
yang dikaji terhadap enzim ini adalah suhu dan pH yang sesuai
bagi akt i vi t i dan kes tabi l annya untuk tujuan penyimpanan .
Ke tahanan te rhadap suhu merupakan c i r i yang pent ing dal am
industri masa kini kerana beberapa keperluan , antaranya proses
tindakbalas pada suhu tinggi akan mengurangkan ke1ikatan sistem
tindakbalas bagi l emak . Pada suhu b i lik , l emak da1am bentuk
pepe jal dan pad a keadaan ini t indakbalas lipase terhadap
substrat adalah rendah ( Brockerhoff dan Jensen , 1974 ; Sugiura
dan Isobe , 1975 ) . Pada suhu lebih dad 50 ·C , 1emak akan cal.r
dan t i ndakbalas l ipase adalah cekap . Antara sebab lain pul a
ada1ah untuk mengurangkan kontaminasi pada sistem tindakba1as
kerana kebanyakan mikroorganisma dipersekitaran adalah da1am
kumpulan mesofil ik ( Doig , 1973 ) . Penggunaan enzim termofilik
juga mengurangkan kos penggunaan enzim kerana setiap penambahan
suhu sebanyak 10·C , kadar tindakbalas bertambah dua kal i ganda .
01eh itu jum1ah enzim yang di gunakan dan masa tindakba1as bo1eh
dikurangkan ( Wasserman , 1984 ) . Ciri kespesi fikan substrat dan
mod tindakbalas juga turut dikaji untuk tujuan analitikal dan
juga perindustrian (Macrae dan Hammond, 1985 ) .
Lipase amat penting dalam industri yang berasaskan lemak
dan minyak kerana ia didapat i boleh menja1ankan proses-proses
4
hidrolisis , esterif ikasi dan interesterifikasi terhadap minyak
dan lemak , penghasilan bahan-bahan pencuc i dan juga untuk
tujuan analitikal dalam klinikal ( Macrae dan Hal1l'OOnd , 1985) .
Malays i a s end i r i t elah mula meneroka i b idang ini dengan
tertubuhnya s ebuah institut penyelidikan minyak ke1apa sawit
iaitu PORIM ( Palm Oil Research Institute of Malaysia) . Melalui
penyelidikan yang di j alankan minyak kelapa s awit yang murah
harganya boleh di tukarkan kepada bahan-bahan t e rpros e s yang
bermutu dan t i nggi harganya. Indus tri berasaskan lemak dan
minyak amat b e rpot e n s i untuk di t ingkatkan memandangkan
banyaknya bahan mentah yang tersedia. Keperiuan kepada enzim
lipolitik untuk industri ini juga perlu diberi perhatian kerana
tindakbalas beren z im adalah lebih spes i f ik dar i t indakbalas
kimia dan untuk memenuhi keperluan ini sumber lipase tempatan
perlu dicari. Atas sebab-sebab inilah kaj ian ini di jalankan.
Antara obj ektif-objekti f untuk kaj i an ini adalah
1 ) untuk memencilkan mikroorganisma termofilik lipolitik .
2) untuk menentukan komposisi media yang sesuai bagi
pertumbuhan dan penghas ilan lipase ekstrasel dan
intrasel dari mikrcorgani sma yang dipencilkan.
3 ) untuk menentukan persekitaran yang sesuai bagi
pertumbuhan dan penghasilan kedua-dua jenis lipase ( pH
media, suhu pengeraman dan kadar goncangan) .
4) mencirikan enzim-enzim yang dihasilkan.
BAS 2
SOROTAN BAHAN BBRTULIS .
Lipase
Lipase adalah gliserol ester hidrolase ( E . C . 3 . 1 . 1 . 3 )
yang memangkinkan hidrolis is trias igliserol dan menghas ilkan
asid l emak bebas, diasigl iserol, monoasilgliserol dan gliserol .
Tindakbalas ini boleh berbalik iai tu enzim ini juga berupaya
memangkinkan t indakbalas e s t e r i f ikas i dimana ikatan ester
terbentuk antara gliserol dan asid lemak (Rajah 1 ) ( Macrae dan
Hanmond, 1985 ) .
Tindakbalas hidro l i s i s yang d imangkinkan o l eh l ipase
berlaku dalam s istem yang heterogen iaitu substrat berkeadaan
tidak larut air manakala enzimnya berkeadaan larut . Tindakan
pemangkinan ini berlaku pada antara permukaan minyak dan air
dimana substrat berada dalam bentuk emul s i , misel atau dalam
be ntuk f i l em monomo l ekul . Kebo l e han l i pas e memangki nkan
tindakbalas hidrol i s i s terhadap s ubs trat t idak l arut air
membezakannya dari e s te rase dimana e s te rase hanya berupaya
memangk inkan t indakbalas hidro l i s i s substrat yang larut air
(Macrae dan Hammond, 1985 ) .
Hipotesis tindakan lipase ditunjukkan seperti dalam rajah
2 ( Brockerhoff, 1983 ) .
5
6
trigliserol
diasilglisero1
+
asid l emak bebas
monoasilgliserol
+
asid l emak bebas
gliserol
+
asid l emak bebas
Rajah 1 : Tindakbal as Lipase (Macrae dan Hammond , 1985 ) .
minyak
SUBSTRAT
antara\ I I I
permukaan
SUPERSUBSTRAT
H IDROPOBIK
tapak aktif i ekor
H IDROP ILIK
Rajah 2 Hipotesis Tindakan Lipase pada antara Permukaan Minyak dan Air (Brockerhoff, 1983).
7
8
Sumber lipase
Lipase, seperti juga enzim-enzim lain boleh diperolehi
dari organ-organ dan tisu-tisu haiwan dan tumbuh-tumbuhan dan
juga dari mikroorganisma (Towalski dan Rothman, 1986). Lipase
memainkan peranan yang penting dalam pengaturan fungsi bahan
bahan berlipid dalam tubuh organisma tersebut.
Dal a m t u b u h haiwan terdapat beberapa organ yang
merembeskan lipase seperti pankreas (Verger, 1984), lidah
(Hamosh, 1984) dan tisu adipos (Belfrage et al., 1984). Lipase
dirembeskan oleh organ-organ tersebut mengikut keperluan pada
masa-masa tertentu. Contohnya lipase yang terlibat dalam
metabolisme lemak dalam makanan pada mamalia. Apabiia haiwan
tersebut makan makanan yang mengandungi Iemak, kelenjar serus
di bahagian dorsal lidah akan merembeskan lipase yang dipanggil
lipase lingual. Lipase ini akan menghidrolisiskan sebahagian
dari lemak dalam makanan dan menjadikannya separa hadam.
Setelah makanan ditelan ke dalam perut, lipase dari pankreas
akan bertindak ke atas Iemak tersebut dengan bantuan cecair
hempedu sebagai pengemulsi. Lipase ini dipanggil lipase
pankreatik. Sebahagian besar lipid dalam makanan
dihidrolisiskan oleh lipase ini. Lemak dihidrolisiskan kepada
asid lemak dan monogliserida yang kemudiannya dihantar ke
dinding usus bagi penyediaan metaboli t untuk penjanaan tenaga
(Verger, 1984) atau dihantar ke tisu adipos dan diproses semula
