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Université de Sherbrooke
Essais de purification et séquençage de la gSrcoproteme GP39.
Département d'anatomie a biologie celiulaue
Mémoire présenté à la Faculté de médecine
en vue de i'obtention du grade de
maître ès sciences (M. Sc.) en
Biologie cehaire
17 décembre 1996
National Library 1+1 ,,mada Bibliothèque nationale du Canada
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TABLE DES MATIÈRES
PAGE lTïRL-- -i
LETE DES ILLUSTRATIONS . ------ . p i
L INTRODUCTION -mmupp------.---- 1
A. STRUCTURE DE L9EPlTHELIUM ................................................................................................................... I
7 ................................................................................................................................................... 2 . Les vilfositis B . ROUS DE L'ÉPITH~KM ...................................................................... ..... ...4
J . Digestion terminale et absorption ...................... ,., ...,.., ............................................................................ 4 .. 2 . Bamere conire I 'environnement extétieur ...................................................................................................... 7 a) Flore imdmie ................................................................................................................................................. ...........7 b) Le système immunitaire .............tairetaire.......................................................................................................... ...................... 8
.............................................................................. c) Auas facteias anti'bactbi~1~ tmtlv& dans la muqunwuqunw 1 0 -- ................................................................................................................................................................ 12 -CeCropines ................................................................................................................................................................ 12 .A..tigiw GP39 ................................................................................................................................................ 1 3
.............. C . H Y P O ~ S E ET OBJECTES : ....... .. ......................................................................................... 14
.................................... 1 . PRÉPARATION DES TISSUS POUR LES DIFFERENTS PROTOCOLES UIILISÉS 16 a) Pmcré as. duodénum et d o n de souris. pannéas de chat et de porc ............................................................ 16 6) Jus pancréatique de souris ......................... ,., ............................................................................................ 17 . 2- IMMUNOPRÉCIP~~ATION SUR BILLES D AGAROSE ........... .. ......................o.............. 17 a) Préparation des billes ................................................................................................................................... 17 b) Préparation drc tint ..................................................................................................................................... 1 8 c) ImmunoprPcipitation ............................... .. .................................................................................................... 18
3 . IMMUNOPRECIPIT'ATION SUR BILLES DE SÉPHAROSE AVEC L'ANTICORPS MM-113 9 MONOCLONAL ............................................................................................ 19
a) Dialyse ......................................................................................................................................................... 19 ......... .......................................................................................... b) Couplage ............................................ 1 9
c) Désacinration ................................................................................................................................................ 20 4 Preparah'on rhr tissu ...................................................................................................................................... 20 e) Zmmunoprécipitation ............................................................................................................................ 2 0
4 . ~~MUNO&CPITATION AVEC ANTICORPS SOLUBLE ( P R o T ~ E A) .... ....................................... 22 7 7 0) Préparation àù tissu ................ ,.., ............................................................................................................... -- 7 9 6) Préparation des billes ...................... ,., ...................................................................................................... , ,
C) ImmunoprPc@itation ........................................................................... ................................ ....................... 22
5 . IMMUNOPRECPITATION A L'AIDE DE LA PANSORBINE .............. ...,... .............................................. 23 a} Lavage des celIuZesparisorbine ............................................................................................................... 2 3 b) Mpw-ution dir tissu ...................................................................................................................................... 24
4 ~ p u r a f z o n &s échantillons ......................................................................................................................... 24 e} Immunoprécipilalion ............................................................................................................................... 2 4
6 . ELECïRO-ELUTION ...................................................................................................................................... 25 a) Prépiration chr tissu .................................................................................................................................... 2 5 b) Préporatratron des gels ................. ..., .............................................................................................................. 25 cl Montage de l ' ~ e c ~ E / u t e t r r modèle 422 (Bio-Ra@ ..................................................................................... 25 t$ Spençuge ................................................................................................................................................. 2 6
7 . DEGLYCOSYLATION CHIMIQUE ..................................................... ., a) Préparation àk tissll ...................................................................................................................................... 27 6) DPg@osyIution ...................,..,.............................................. ................................................................ 27
........................................................................................................ 8 . DEGLYCOSYLATION ENZYMATIQUE 28 9 . CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE ....................................................................................................... 2 8
a) Réparation du tissu ............................................................................................................................... 28 b) PrPparation des colonnes ...........,......... ................................................................................................. 2 8 c) Chromatographie (Cwnmings. 1994) ..................................................................................................... 2 9 . . . . . . . 4 Precrprtatton des proternes ............ ,., ..................................... ......,,.. ..,... .............................................. 2 9 el Concan~vuiine-Asporose + Lentil-~ectin-ugmse ....................................................................................... 7 9
.................... .............................................................................. 10 . CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION ., 30 ............-. .........*...................................--...................................................................... a) Préparation du tissu .. 3 0
6) Prépuration des colonnes .................................................................................................................... 3 0
................................................................................ a) PtPplrration du tissa .....................,.........................- 31 6) Gradient glycérol . ou sucrose ..................................................................................................................... 3 1
12 . ESSAIS DE DIFFERENTS DETERGENTS ................... ,... . .., ........................................................... 32 ............. 0) Prépcaoiion rfrc tissu ,., ...,.......... ............................................................................................... 3 2
b) Pr&pation des desergen fs ................................... ... ............................................................................ 3 2 c) Détergent SDS ....................................,........................................................ ............................................. 32
13- GRAINS DE ZYMOGENE ........................ ., ................................................................................................... 33 a . Pdprat ion des grains ........................................................................................................................... 3 3
................................................................................................... -b) Priép~~ution de tampon ...................... ,., 33 ...................................................................................... .............................. cl Grains de qmogène ... ......... 3 4
................................................................. 14 . FRAûMENïATiON DE L'ANTIGÈNE y39 ................... .. 3 4 ............................................................................ I . Proteinme K et Tmsine ................................... .,...,., 34
.................................................................................................................................................... a) Préptrraticm du tissu 34 ....................................................................................................................................... ............... b) Dlgestim ..,..... 34
.. 2 Ch'Br @esmaud et a2 1993) ...................................................................................................................... 35 .................................................................................................................................................... a) Priparation du tissu 35
b) Lwphylisation ................... ,..,...,,,..,,. ................................................................................................................ 35 .......................................................................................................................................... ....... c) Fmgnentation ......,,., 36
.............................................................................. 3 . Endoprotéinase G1u-C Vû ........................... .... 36 ............ ....... 4- HyhxyIamhe .. ..... ....................................................................................................... 3 7
a) &tantillm ................................................................................................................................................................. 37 ....................................................................................................................................................................... b) Clivage 37
15 . ÉLE~OPHORÈSES BDDIMENSIONNELLES ..................................................................................... 38 . . 1 . Pmvn~em dimension ...................................................................................................................................... 38
.................................................................................................................................................... a) PrQxfration du tissu 38 ...... .................................................................... .............................. b) prép9iation des t u b d'&arcmhoriX .. ,. 38
............................................................ ......................................................... ................................. cl ElCCtropharése ., ,. 39 ................................................................................................................................................ d) Dépot des &hantillons 39
................................................................................... .... 2 . D-errnème dimension ................... ....... ,.. 40 ...................................................................................... 16 . ESSAIS A N W A ~ S @HRER ET AL. 1983) 40
10. FRAGMENTATIONS ENZYMATIQUES ET (3HIMIQUES DE L' ANTIGÈNE MIM-1/3 9. ...................GENE .-.. 103 A) Dip i ion erqmuth*que de fa GP39 ti parîir d'un homogPnuî de p&as de souns pm la pmtéinase K et la aypsine. ................................... ii.iiiiiii ...........-.-.....-..- - ........................................................................... 103 B) Digestion chimique de la GP39 à porh-r d'un homogénat de pandus de souris par fe CNBr. ..........-......... 1 O6 C) Digestion enzputique de ia GP39 à pprir'r de t 'homqgPnat d'un punçréus de souris par 1 'endopmt&inase Glu€ m.. -.-....*...,,.. .,,..* .......*..............--..--.-.........-...-...-...-....-.............-......-. ..............C.C ......-.......-...*...... . I I2 D) Digesiion chimique ri 1 'ai& d ' h y ~ i a m i n e àk GP39 puniiée pm é l e ~ l u t i o n . ......................... .,-...., 1 IS
11. PURIFICAnoN DE 8 3 9 PAR & E C T R O P H O ~ BIDIMENSIONNELLE A PARTIR DU PANCXÉAS Er DUNS PANCREATIQUE DE SOURIS. ......................URISURIS.URIS..URISURIS.URIS........URIS............ .. ....... - ........... . 118 12. ESSAIS ANTIBACTÉRIENS AVEC -9. ......................... ............................................................. . . 121 13. BIOLûGiE MOECULAIRE. ......-........-...-...--.-....a ..................................................... . ......... . 122 14. LIBRAIRIE D'INTESTIN GR& DE L'HOMME 5'-STRETCX ADNC ........................ ,.., ...... ..... 123 U, LOCALISATION DE ûP39 CHEZ LWOMMME ,....,...............MMME..MMME...........-... - ................................... . . 126
VL PERSPECTIVES ,- m m 139
LISTE DES ILLUSTRATIONS
FIGURE 1. Détection par transfert Western de la GP39 immunoprécipitée sur billes
d' agarose.
- - FIGURE 2. Détection par transfiert Westem de la GP39 immunoprécipitée sur billes de
Sépharose 4B-CNBr activées avec le MIM-1/39 monocIona1 à partir d'un
grattage de colon de souris.
FIGURE 3. Détection par transfert Western de la GP39 immunoprécipitée sur des biiies
Protéine A-Sépharose à partir du Nmageant d'un homogémt de pancréas de
souris.
FIGURE 4. Détection par traTlSfért Western a bleu de Coomassie de la GP39
bunoprécipitée par la pansorbine à partir du suniageant d'un homogénat de
pancréas de souris.
FIGURE 5. Détection par tratlsfert Western de la GP39 éiectro-élu& à partir d'un
homogénat de pancréas de souris. 66
FIGURE 6. Détection par transfert Western de la GP39 deglycosyIée chimiquement ( ï FMS) a
emymaîiquernent (N-Glycosidase F) à partir du surnageant d'un homogénat de
pancréas de sowis et de la GP39 p d é e par electroilution 70
FIGURE 7. Détection par transfert Western de la GP39 purifiée par chromatographie d ' f i t é
avec la Lentil lectine-agarose à partir du surnageant d'un homogénat de pancréas de
FIGURE 8. Détection par aansfert Westem de la GP39 purifiée par chromatographie d'afnnité
avec la Concanavalin A-agarose B partir du surnageant d'un homogénat de pancréas
de souris. 76
Détection par transfert Western de la GP39 purifiée par chromatographie d'afnaité
avec Jacahe lectine-agarose a partir du surnageant d'un homogénat de pancréas de
souns (PS). - 79
FIGURE 10. Détection par transfert Western de la GP39 purifiée par deux chromatographies
d'&té consécutives sur Concanavalin A et Lentii lectine-agarose à partir du
surnageant d'un homogénat de pancréas de souris. 82
FIGURE 1 1. Détection de la GP39 par immunocytochllnie à partir du d o t d'un homogénat de
pancréas de souris avec le MIM-1/39 poiyclonaL 85
FIGURE 12. Détection par transfert Western de la GP39 purinée par gradient de glycéroI à partir
d'un culot d'un homoginat de pancrées de souris. 88
FIGURE 13. Diteaion par transfert Western de la GP39 purifiée par gradient de sucrose à partir
d'un d o t d'un homoginat de pancréas de souris. 90
FIGURE 14. Détection par trandert Western de la GP39 solubilisée par trois détergents a 5 et
10 % (Triton X-100, SDS et guanidine) à partir du culot d'un homogénat de
pancréas de souris.
FïGURE 15. Détection par transfert Western de la GP39 solubitisée par utilisation successive de
- SDS 10 % sur le culot d'un homogénat de pancréas de souris. 96
RGURE 16. Détection par ~ansfaWestem de la GP39 dans le pmcréas de souris, de chat et de
porc. 99
FIGURE 17. Détection par transfert Western de la GP39 suite à la purification des grains de
sécrétion d'un homogenat de pancréas de souris. 102
FIGURE 18. Détection par traclsfert Western de la GP39 digérée par la p r o t h e K et la
trypsine.
RGURE 19. Détection de la GP39 d e à une digestion chimique au CNBr a partir d'un
homogénat de pancréas de souris. 109
FIGURE 20. Détection de la GP39 par M e r t Western suite à une digestion -que avec
la protéase V8. 114
FIGURE 21. Détection de la GP39 par spectrophotomiene à 280 nm suite a un traitement a
I'hydroqlamine. 117
FIGURE 22. Détection par W e r t Western de la GP39 suite à une électrophorèse
bidimensiomelie a partir d'un homogénat de pancréas ou de jus pancréatique de
souris. 120
RGURE 23. Détection des produits d'ampEcation PCR des clones positifs obtenus de la
brairie d'intestin humain. 125
FIGURE 24. Localisation par immunofluorescence indirecte de la GP39 au niveau des @des
sudoripares, des parotides et du duodénum l'homme. 128
FXGURE 25. Détection de la GP39 au niveau de la parotide, de la salive et des lames
de I'homme par hunobuvardage.
a LISTE DES ABRÉVLATIONS
ROI: Réactif oxygène intermédiaire
RMN:Résonaace magnétique nucléaire
RPM: Révolutions par mimite
SDS: Sodium dodecyi sulfate
EDTA: Ethylène diamine-tétraacétique acide
EGTA: EthyléneglymI-bis<13-AminoéthyI Ether) N , N , N ' , N ' , acide
PBS: Tampon phosphate
BSA: S b albumine bovin
BPB: Bleu de Bromophénol
PMSF: Phénylmethylsulfonyl Ruonire
fg PVDF: Pollvinylid& difluowe
CAPS: 3-[cydohexylaminol] I -propane-sulfonic acid
TSB: Trypticase soy broth
THB: Todd-Hewitt broth
T S k Trypticase soy agar
CA: Chocolat agar
BA: Blood agar (agar de sang)
Cm: Colony forming unit (unité de formation de colonie)
TFMS: Acide trifluorornithane suifionique
DDSA: Dodeceny1 succinic anhydride
'9 DMPJO: Tri (Diméthyl Amino Méthyl) Phenol
-L
Q HPLC: Chromatographie liquide haute paformance
M-PCR: Transcription réverse réaction de polymérase en chaine
OFA: One for aii
APS: P d e d'ammonium
TCA: Acide trichioroacCtique
AIIN: Acide désoxyribonucléique
ARN: Acide nionucléique
ESSAIS DE PUlUFICATION ET SÉQUENÇAGE DE LA GLYCOPROTÉINE GP39.
Julie Bisson
Mémoire présenté a la Facuité de Médecine en vue de l'obtention du dîplome de maître ès science (M-Sc.) en Biologie cellulaire, Université de Sherbrooke, Quibec.
La glycoprotéine GP39 est localisée dans les grandes de sécrétion des cellules indifférenciées des glandes gastriques, des cryptes intestinales et coliques, et des cellules épithéliales des glandes associées au tractus digestif: @des salivairesT vésicule biliaire et pmcréas. De plus, on la trouve dans plusieurs glandes exocrines, dont les sécrétions viennent en contact avec le milieu extérieu: glandes lacrymaies, glandes sudoripares. A cause de cette disüiiution, nous avons émis I'hypothise que la GP39 pourrait joua un rôle dans la protection
.. 6 contre les bacréria: L'objectif de ce travail était de p d a cette glycoprotéine afin d'en faire le -r séquençage. Plusieurs approches de purification ont été effectuées: immunoprécipitation,
chromatographie d'atnnité, divers gradients, électro-éhtion, et cnbage d'une lirairie d'expression La séquence des douze premiers acides aminés de la parti W& t&e a été déterminée. Cette séquence, QELEELNVPGEI, est homologue à 10W avec les premiers acides aminés de la béta-caséine bovine. Par contre nous savons que la GP39 n'est pas une caséine puisqu'elle a un poids molénilaire de 350 kDa tandis que la béta-caséine a un poids de 25 kDa Cinq clône positifs ont ensuite été obtenus suite au criblage d'une lirairie d'expression d'ADNc d'intestin grêle humain 5 ' STRETCH PLUS. Les ADNc intestinaux de trois de ces cinq clônes ont été amplifiés par PCR Ces trois ADNc serom éventueiiement clônés dans le vecteur pBIuescript@ II KS pour en faire le séquençage. Les séquences obtenues seront comparés à l'aide d'une banque de génes pour déterminer s'ils correspondent à des gènes nouveaux ou à des gènes déjà connus.
INTRODUCTION
A STRUCTURE DE L'EPITHELIUM
1. La crypte
La crypte mtesti.de, appelée aussi glande de LieberkW est une glande tubulaire simple
située à la base des villosités. On y dénmt trois zones: la zone des ceildes souches, la zone de
proiifération a la zone de différenciation. La zone de cellules souches est située à la base de la
crypte (Bjerhes et Cheng, 198 1 ; Potten et Henciry, 1983). Cette zone wmprend les cellules de la
position 1 à 5, et ne contient pas plus de 72 celluies par crypte (Ponen et al., 1987). Ces cellules
sont caractérisées par leur capacité à se diviser et par un cycle cellulaire constant d'environ 36
heures (Bjerknes et Cheng, 1981). On y retrouve égaiement des cehies de Paneth. La zone de
* ( w- proWération s'étend entre lès positions 5 à 18. Cs cellules possèdent un haut degré de
prolifération, un cycle cellulaire riduit ainsi qu'un indice mitotique élevé (Cheng et Leblond, 1974;
Trier et Madara, 198 1). Puis la zone de différenciation est située au niveau des positions 19 à 30.
Elle est constituk de plusieurs types ceiidaires en voie de diff5renciation telles les ceilules
absorbantes, les ceilules caiicifonnes et les cehles entéroendocrines. Toutes ces cellules perdent
gradueilement leur capacité de prolifération-
Les cellules de Paneth sont impliquées dans la défense ùitestinaIe (Jones et Bevim, 1993).
Plusieurs espèces de mammiFeres possèdent des cellules de Paneth. Ce sont des cellules
pyramidales qui résident à la base des cryptes de Liebakunh (Madara n Trier, 1987) partout dans
I'intestin Me et eues sont plus abondantes dans I'iiéon (Hertzog, 1937).
6: Ces cellules produisent du lysozyme ce qui suggère qu'eiies participent à la défense
diiactérienne (Jones a Bevins, 1992). Elles ont beaucoup de rétidum mdoplasmique
rugueux, un appareil de Golgi élaboré a de nombreuses vésicules de sécrétion (Behnke, 1964).
Elles dérivent des mêmes celluies souches que les autres entkocytes (Cheng et al., l969).
Toutefois, contrairement aux autres ent&ocytes qui migrent vers l'apex des villosités a s'y
dolient dans la lumière, les du le s de Paneth deviennent matures ai descendant vers le fond des
cryptes et eues ont une durée de vie d'environ vingt jours (Troughton a Trier, 1969). Eues
synthétisent des protéines sembIables à celles des leucocytes incluaat le hcteur de nécrose des
tumeurs (TNF) (Keshav et al, 1990) et les lysozymes (Speece, 1964; Hammer a al., 1987).
L'épithélium des villosités est simple cylindrique et on y distingue trois types cellulaires :
les cehies absorbantes, les &iules calicSormes et les ceildes entéroendomhes. Les ceiIuIes
absorbantes ont un noyau ovoïde situé dans la partie infëriewe de la ceUuIe. La suface Iuminale
possède une membrane en bordure en brosse sous laquelie il y a une zone dépourvue d'organelies,
le terminai web. Le cytoplasme est riche en mitochondries et possède un appareil de Golgi
supranucléaire bien développé. Le réticulum endoplasmique lisse est abondant cians la région
située sous le temunal web. Il joue un rôle important dans l'absorption des lipides. Le réticulum
endoplasmique rugueux est retrouvé aussi dans le cytoplasme supmucIéaire mais il est plus
abondant à la base de la cellule. Les IliicroMUosités qui forment k bordure en brosse, amplifiait la
surfâce exposée a la lumière intestinale d'environ 30 fois. Les microvilIosités sont recouvertes
d'un manteau de surface constitué de glycoprotéines et qui est extfèmernent résistant aw agents
protéolytiques et mucotytiques: ü a un rôle de protection La membrane de la bordure en brosse
a son manteau de surfâce sont aussi très importants dans Ies fonctions de digestion et
d'absorption. La présence de jonctions sarées entourant complètement chaque d u i e près de la
lumière assure que le mgtCne1 à être absorbé a partir de la lumière, traverse la membrane
plasmique de la bordure en brosse, le cytoplasme apical et les membranes latérales pour atteindre
l'espace interduiaire de l'épithélium. Puis il traverse la lame basale pour atteindre les capiliaires
et les chyfiFeres (Bloom et Fawcett, 1986).
Les cellules caliciformes sont dispersées irrégulièrement parmi les cellules absorbantes.
Lair région apicale nommé theca est distendue par des gouttelettes de mucine alors que la base de
la cellule est relativement libre d'inclusions et fome une mince tige. Le noyau tend à être aplati.
Les citemes du réticulum endoplasmique rugueux sont plus ou moins parallèles et concentrées à la
base des cellules. Un appareil de Golgi bien développé est situe entre le noyau et les grains de
mucines. Le produit de sécrétion des ceiiules caliciformes forme un matériel visqueux qui sert à
lubrifier a protéger la sunEice de l'épithélium (Bloom et Fawcett, 1986).
Les cellules entéroendocrines ont une IOcaIisation basale dans l'épithélium des cryptes a
des villosités. Ces cellules ont des grains de sécrétion concentrés entre le noyau et la lame basale.
Elle libèrent leur sécrétion dans la lamina propria plutôt que dans la lumière intestinale. Plus de 16
types différents de cellules entéroendocrines ont été décrites dans le tractus gastrointestinal. Ces
cellules Som la source des hormones gastrointestiaales (Bloom et Fawcctf 1986).
L'épithélium intestinal est impliqué dans la digestion taminale a I'absorption des
nutriments. Un autre rôle moins bien cornni mais qui féit l'objet d'intenses recherches
actueIiement est la protection de l'organisme contre i'environnernent.
1. Digestion terminale et absorption
Les deux tiers de I'apport alimentaire en giucides se trouvent sous forme de
polysaccharides d'amidon; Ie reste est constitué principalement de disaccharides, de saccharose et
de lactose. De petites quamités seuiement de monosaccfiarides sont nonnaîement présentes.
L'amidon est partieliement digéré par I'amylase sahaire, et cette digestion se poursuit dans
l'intestin grêle sous l'effet de l'amylase pancréatique- Les produits de digestion sont les :% -- disaccharides, le maltose, et de courtes chaînes composées d'environ huit moléniles de glucose.
La digestion terminale est assurée par des enzymes situés dans les membranes plasmiques des
microvillosités des ceiluies absorbantes tapissant-l'intestin grêle.
Les monosaccharides, le glucose et le galactose, libérés par cette dégradation des
polysaccharides et des disaccharides sont activement transportés à travers l'épithélium intestinal
vers le sang.
Un apport de protéines égai à 50 g par jour est nécessaire c h u l'adulte normal pour
foumir les acides aminés essentiels et pour remplacer l'azote des acides aminés converti en urée.
En plus des protéines du régime alimentsire, une grande quantité de protéines sont h i é e s dans le
tube digestif par les divmes glandes ou par la désintégration des ceiiuies épithéliales. Les
t : protéines sont dégradées en fhgments peptidiques dans l'estomac par la pepsine et dans l'intestin
grêle par la trypsine a la chymotrypsine qui som sécrétées par le pancréas. Les fbgments
peptidiques produits sont ensuite digérés en acides aminés l i res par la carb~xypeptidase du
pancréas a I'amin~peptidase~ laquelle est située dans les mernbmes apicales des @des
absorbantes. Les acides aminés Iiires sont transportés activement à travers la paroi de I'im&
puis diffusent dans les capillaires des villosités intesthdes. PluSans systémes de transport
différents sont disponibles pour assura l'absorption des différentes classes d'acides aminés. Ce
sont des systhes de transport secondaires dépendants du sodium qui fonctioment selon les
mêmes principes que ceux utilisés pour absorber les glucides. Des chaînes courtes de deux ou
trois acides aminés sont aussi absorbées activement.
Les lipides contemis dans le régime alimentaire se trouvent surtout sous forme de
triacylgiycérols. La lipase pancréatique catalyse la rupture des liaisons unissant les acides gras aw
premier et troisième atome de carbone du glycérol libérant ainsi des acides gras libres et des
monoglycérides. Les triacylgiycérols qui pénètrent dans l'intestin grêle sont insolubles dans I'eau
et forment des agrégats dans de grosses gouttelettes lipidiques. Seuls les lipides siniés a la sudce
sont accessibles à la lipase. Les sels biliaires, foumis par le foie, réduisent les grosses gouttelettes
lipidiques en de nombreuses gouttelettes plus petites, par &nuisification. Les sels biliaires se
combinent aussi avec les produits de la lipase pour former des partides hydrosolubles appellés
M d e s . Les miceiles sont constituées de sels biliairrs, d'acides gras, de phosphoglycéqdes et de
monoglycéndes. Bien que les acides gras iiires a les monoglycérides aient une solubilité
extrêment faMe dans I'eau, quelques molécules isolées se trouvent en solution, et c'est sous cette
forme qu'elles sont absorbées par diffusion a travers la membrane plasmique. Les acides gras et
Cf les monoglycérides des miceIIes sont en équilibre avec ceux qui sont en solution, les molécules
étant continuellement échangées entre ces deux états. Les produits de digestion des lipides sont
nsynthétisés en triacylgiycéroIs dans le réticdm endoplasmique lisse dans les cellules
absorbantes et s'agrègent en gouttektes recouvertes par une protéine amphipatique qui joue un
rôie d'émulsiûm semblable à cehi des sels biliaires. Ces gouttelettes sont ensuite prises en
charge par I'appad de Golgi et fisionnent Mement avec la membrane plasmique, h i la
gounelate lipidique dans le liquide imerstitieI. Ces gouttelettes sont appelés chylomicrons et enes
contiennent des tryacylglycérols, des phosphoglycérides, du cholestérol et des vitamines
liposolubles qui ont été absorbées. Les chylomicrons passent ensuite daas les chyWeres.
Environ 9000 ml de liquide ingéré n sécrété pénètrent daas l'intestin grêle chaque jour.
Les membranes des.cellules épithéliales sont perméables a t'eau. Une dinusion d'eau se produit à
travers I'épithélium chaque fois qu'un gradient de concentration est établi à la suite de dinérences
dans les concentrations de soluté entre les deux compartiments. L'absorption active du soluté
errtraine indirectement l'absorption passive de l'eau. Outre les ions sodium et chlore, d ' m e s
minéraux présents à des concentrations plus faibles, comme le potassium, le magnésium et le
calcium, sont aussi absorbés; et il en est de même pour les éléments que l'on trouve à l'état de
traces comme le fer, le zinc et l'iode (Vander et al., 1989).
2. Bamère contre l'enviromement extérieur
a) Flore intestinale
Il y a une évoluîion dans la flore intestinaie depuis la naissance jusqu'au stade adulte. La
flore bactérienne du nowea~~-ne noumi au laa meme1 consiste principalement de bifidobactéries
de la classe gram-positives. La flore des enfants nourris à la bouteille est constituée en
prédominance de lactobactérîes qui sont égaiement gram-positives. Avec la substitution par la
nourriture solide a la diète aduite, une fiore gram-négative s'implante au niveau de l'intestin et
celle-ci est constituée principalement des espèces de la fannue Bactémides ( Pelaar et al., 1986).
L'estomac reçoit par la voie orale plusieurs bactéries. Le contenu gastrique contient
normalement moins de 10 bactéries par ml dû a l'effét bactéricide de l'acide chlorydrique des
sécrétions gastriques. Les organismes qui y sont m>wes sont principalement des hctobacilles et !% -
des levures, teiie la C d & albicam. Suivant l'ingestion de noumhire, le nombre de bactéries
augmente à environ id a 106 par gramme de contem, mais ce nombre diminue rapidement avec
la sécrétion de jus gastrique qui abaisse le pH. Le duodénum contient quelques bactéries mais
habituellement moins de 103 par ml de fluide. La majorité des bactéries sont grampositives de
type cocci et bac*. Au niveau du jéjunum on trouve des espèces d'entérocoques, de lanobacilles
et de diphthéroides ainsi que la levure CQltCjlcia ai'biccats. La flore de l'iléon commence à
ressembler à celle du colon. Des bactéries anaérobiques et des membres de la famille
Enterobucferiaceue y apparaissent en grandes quantités. Le colon contient la plus grande
population bactérienne. Le nombre de micro-organismes y est estimé à 101 1 par gramme de poids
humide. De 50 à 60% du poids sec de la matière f a e consiste en bactéries et autres micro-
organismes. Plus de 300 espèces Mére~lfes de bactéries ont été isolées des feces humaines.
Quotidiennement, un aduhe excrète m moyenne 3x1013 bactéries dans les f- (Pelczar et al.,
1986).
Ii doit donc exister plusieurs hm régulant la présence de ces organismes au niveau
intestinal. Au niveau du colon, les microorganismes sont efiminés par le mouvement continue1 du
contenu intestinai par péristaitisme et aussi par desquamation des cellules épithéliales de la surfàce
a laquelle les bactéries sont attachées. Le mouvement du contenu intestinal provoque l'adhérence
des rm'cro-organisrnes au mucus qui s'enroule ensuite en petites masses qui sont éliminées dans les
feces (Pelcaîr a ai., 1986).
1 ~ 4 Il existe a d d'autres facteurs qui aEectent la flore normale dont le stress émotionnei, les
changements de pression de l'air dus à I'altmide, le jeûne, la diarrhée, le traitement aux
antiibiotiques a la diète (Pelczar a al. 1986 ). Également les sécrétions acides et alcalines, la
motilité intestinale, le potentiel redox, les sels biiiaires, les anticorps, les drogues, les
xénobiotiques, les métabolites bactériens, la compétition bactérienne et le pH (Row~aud, 1988)
constituent des éléments réguiateurs.
b) Le système immunitaire
Un autre coastiniant tris important du - système de d é f i est le système immUMtaife
produisant une classe spéciale d'anticorps qui restreignent la proiifëration bactérienne, neutraiisent
les virus et préviement la pénétration des entéroxines à travers I'épithélium. La synthèse de ces
--
a. anticorps a leur sécrétion à la suditce de la muqueuse impIiquent la coopération des lymphocytes,
des plasmocytes et des macrophages prisan dans la lamina propria.
Les plaques de Peyer's sont formées de groupes de nodules lymphoides. mes sont
présentes dans l'iléon. De 30 à 40 plaques peuvent être habïtuelîement trouvées éparpaées le
long de l'iléon. Elles sont toujours localisées du côte ami-mesentérique (Blwrn a Fawcett,
1986). Ce sont les cellules contenues plaques de Peyer's qui produisent des immunoglobulines A
(IgA) spécifiques aux antigènes qui viennent de la lumière intestinale.
Les antigènes qui traversent la barrière de la muqueuse interagissent avec les cellules des
nodules lymphoïdes (plaque de Peyer's) de la lamina propria, lesquelles sont prédisposées à la
production d'IgA. Les ceiiuies M associées aux plaques de Peyer's seraient spécialisées dans la
capture et dans le mouvement transcellufaire de l'antigène. Quand les lymphoblastes sous-jacents
/S ont interagi avec I'antigéne, ils migrent vers les nodules lymphoïdes mésentériques a après -
maturation., ils entrent dans la circulation systémique. De la circulation, ils raiement à l'intestin
et deviennent largement distribués en tant que cellules iibres dans la lamina propria. Dans celle-ci,
ils se différencient en plasmocytes et produisent des IgA spécifiques à l'antigène absorbé. Les IgA
produits sont transportés a travers l'épithélium liés à une glycoprotéine spéciale de transport
appelée composante sécrétoire. Ceiie-ci le tramporte à la surface hire de I'épithelium tout en le
protégeant du système lysosomal. Les anticorps de sécrétion sont relâchés à la d a c e apicale a
sunt retenus dans le glycocaiyx où ils sont situés stratégiquement pour interagir avec les antigènes,
les mtérotoxines et les bactéries pour prévenir leur attachement à la membrane cellulaire. Ce
mécanisme est appelé exclusion immulutaife (Bloom et Fawcett, 1986).
c) Autres b e u r s mtï'bactériens trouvés daas la muqueuse.
-T-H~tsfhIi
Dans les séaétions externes, te1 17Unne, une molécule, la protéine Taimn-Horsfall (THP)
de 85 KDa (Tamm a Horsfàü, 1952), est capable de l ia la bactérie khen'chia coli ( O W e y d
ai, 1985), permettant possiblement une protection de la voie uxkaire contre la colonisation des
bactéries. La TW a été localisée par immunofluorescence dans la portion cytoplasmique apicale
des ceildes de l'anse de Henlé, dans les p u l e s de sécrétion apicaux des celules acineuses
pancréatiques, dans le cytoplasme des ceNdes séreuses des glandes saiivaifes, et dans le
cytoplasme apical des ceildes cyiindriques de l'épithélium viliositaire dans le jéjunum (Budi
Santoso et al., 1987).
Les dansines forment une fâmiIle de petits peptides cationiques isolés des macrophages
de poumons de lapin (Selsted et al., 1983; Patterson et al., 1980; Patterson et al., 1981; Lehrer et
al., 1981) et des neutrophiles (Zeha et al., 1966; Z e b et al., 1966; Zeha et ai., 1968). Six
défeasines, NP-1,2, 3% 3b, 4 et 5, ont été purifiées à partir de granulocytes de lapin (Seked et
al., 1983) et chacune exerce une activité antibactérienne sélective in vitro (Selsteû et ai., 1985).
Quatre défaines ont été isolées et caractérisées à partir de cellules dérivées des myéloïdes
humains (Ganz n ai., 1985; Selsted et al., 1985; Siugh et al., 1988; Gabay et al., 1989; Wdde et
al., 1989). La famille des défasines humaines est diverse et eue n'est pas restreinte a une
expression dans les seuls leuc~cyfes. Un g h e (HM), défiensine-5 humaine, est hautement
exprime dans les cellules de Paneth de l'intestin grêie. C'est le premier exemple de gène de
bg peptide antimicrobien exprimé dans les cellules épithéliales humaines (Jones et ai., 1992). Cette d
obswation suppmte l'hypothèse que les peptides antibactériens comnbuent à la défense des
nuqueuses chez l'homme et que les cellules de Paneth sont impüquées dans ce processus de
dinme antimicrobim de i'imestin grêle ( Jones et al., 1992). Deux rôles physiologiques des
d b i n e s intesthales sont suggérés. Premièrement, les d8eflSitles pourraient réguler le niveau de
la hre microbienne lurni.de. La grande densité des ceiiuies de Panah près de l'iléon distal
pc<irrait c o n f i e r une barrière rédukant l'abondance de la flore microbienne du colon.
Deuxièmement, les défensines pourraient être importantes dans la daiw de la muqueuse contre
les kwasions microbiennes.
-Cryptdiaes
Cinq autres défênsines matures, les Cryptdines 1-5, ont été isolées à partir de I'épithéhm
de l'intestin grêle des rongeurs (Ouellette et al., 1992). La présence de grandes -tés
d'ARNm de cryptdine dans les ceNdes de Paneth et la démonsîration d'une activité
mtikténenne du peptide le plus abondant, cryptdine-1, amène à l'hypothèse que les défensines
syathétisées dans l'épithélium intestinal peuvent constituer une banière mtimicrobienne dans
l'imestin grêle (Oueuette et al., 1989; Selsted et al., 1992). Les cellules de Paneth sécrètent les
Mansines dans la lumière intestide où elles contribuent à l'établissement d'un milieu
anu'bactérien local (Selsted et al., 1992). La structure primaire des cinq défensines entériques
contien les traits s t ~ c t u r a w distinctifs des défensines des neutrophiles de l'homme, du lapin, du
ria a du porc (Lehrer a al., 1991).
Parmi les plus abondants peptides emmpshés dans les glandes de Xenopus. il y a la
nimille des maphines, lesquelies exercent un grand spectre d'activité antimicrobieme (Govannini
et ai., 1987; Zasloe 1987). Ces peptides naturels i n h t i la croissance de bactéries gram-
positives a gram-négatives et des champignons. Ii a été suggéré qu'elles joueraient ua rôle dans
la défense contre I'invasion microbienne durant la guérison des blessures (Sonvia et al., 1988;
Wolff et ai., 1990). Plus d'une douzaine de peptides 8nfimicrobiens ont été identifiés chez
Xmopus luevis, ((Zaslo~ 1987; Andreu et al., 1985; Sures et Cnppa, 1984; Wakabayashi et ai.,
1984; Wakabayashi a al., 1985; Richter et ai., 1986; Poulta et ai., 1988). Des analogues de
plusieurs peptides biologiquement aaifs trouvés dans la peau d'amphiiiens ont également été
trouvés dans les tissus des xmmmifiéres (Erspaner et ai., 1980). Les glandes salivaires mineures et
majeures de I'homme et de diverses espèces de manmifteres ont été examinées par (3 fl
imrnunohistochimie, utilisant un anticorps polyclonal de lapin a&-magainine (Woilf et ai., 1990).
Un marquage spécifique à été obsené dans la portion apicale des ceildes épithéliales du canal
excréteur des glandes salivaires sublinguales et sous-maxiiiaires. La nature exacte de ia substance
n'est pas connue mais sa similarité à la magainine ou à son précurseur est probable (Wolff et al.,
1990).
cécropiws
Les peptides &opines ont été identifiées dans i'hémoiymphe immun du papillon de nuit
cecrupia. Toutes les cicropines ont de 31-39 résidus d'acides aminés, et dies sont dépourvues de
cysteme (Holak et ai., 1988). Les cécropines forment une famiUe de peptides amphipatiques
c héaires, qui présentent un système de défense amimicrobien majeur chez les insectes (Steiner et -
al., 1981; Bornan et Hultmark, 1987). Alon que l'on pensait que les cécropines étaient uniques
aux msectes, une b p i n e a été trouvée dans I'intestin de porc (Lee a aL, 1989): la cécropine
P 1. Bien que I'homologie de structure entre la cCaopine P 1 de mnmmiFee et les &opines des
insectes soit de seulement 33%, la plupart des caractéristiques de structure des &opines sont
conservées (Lee a al., 1989). L'activité antimicrobienne des &opines des insectes est induite
par des iafections bacténenues (Boman, 1991). ou par blessures. Le taux de cécropines s'élévmt
alors à des niveaux supcrieurs à ceux déîectés en I'abmce d'elhents activateun (Samakoviis et
al., 1990). Les cécropims sont hautement actives contre plusieurs bactéries gram-positÎves a
gram-néptives ; la forme porcine montre une forte activité seulement contre les gram-négatives.
Les cécropiaes Iysent les bactéries sans &&ter les cellules eukqotiques.
Le MM-1/39 est un anticorps monocIona1 préparé contre un homogenat de la muqueuse
duodénale de souris de quatre jours (Beaulieu et al., 1992). Cet anticorps est dirigé
spécifiquement contre une glycoprotéine nommé GP39. Par immmofluorescence indirecte
I'antigène GP39 a été IocaIisé dans les ceildes épithéliales de la s u r f e imedeuse de l'intestin
grêle a 17 et 18 jours de gestation Ensuite, l'antigène est exprimé uniquement dans les grandes
de sécrétion des cellules indifférenciées des cryptes depuis la naissance jusqu'à I'âge adulte. Dans
la littérature, le seul changement abrupt dans la morphologie subcellulaire dans les ceIIdes migrant
de la base des cryptes vers les villosités est la perte des grandes de sécrétion (Trier, 1963, 64)
exactement à la jonction crypte-dosité.
L'antigène GP39 a aussi été localisé dans différentes glandes associées au tube digestif.
Par immunofluorescence indirecte, l'antigène à été localisé chez la souris, dans les grains de 4 - -
sécrétion des ceUuies séreuses dans les @des liaguaIes, sublinguales, sous-maxillaires, dans les
glandes parotides, dans le pancréas, dans les ceilula épieliales de la vésicule biliaire a dans les
grains de sécrétions des cellules hdiffërenciées des *des gastriques. Le foie, le rein et les
glandes de Bnmner ne renferment pas l'antigène ( C M a al., 1993).
Par traasfi Western, (technique de Scparation des p r o t é i i jouant sur le rapport de leur
charge B leur masse pendant qu'on appiique un champ électrique, lesquelles sont ensinte
t r a n s f e sur une membrane de nitrocelhioses et peuvent être déteaées par un anticorps qui leur
est spécifique), dwr bandes, a 330 KDa a 350 KDa, sont détectées à partir de la muqueuse du
duodénum de souris adulte, dans la vésicule biliaire et dans l'estomac. Une seule bande à 330 KDa
est détectée à partir du jus pancréatique a i'aide de l'anticorps monoclonal alors que les deux
bandes sont détectées avec l'anticorps polyclod (Calvert a aL, 1993).
La distribution de GP39 est dinéreme de celie des IgA, de la cryptdine a de la protéine
T m - H o r W . Toutefois son rôle n'est pas connu. GP39 montre quelques sites de distribution
en commun avec plusieurs molécules possédant des activités antiiactériemes et antivirales
(Calvert et al., 1993). C'est la première molécule ayant une aussi large distribution dans le tracrus
gastro-intestinal et les glandes associées.
C. HYPoTHÈsE ET OBJECTIFS
A cause de sa distribution dans des glandes dont le produit de sécrétion vient ai contact
avec le milieu extérieur, nous avons formulé I'hypothése que l'antigène GP39 pourrait avoir un
rôle de protection pour la muqueuse digestive.
Notre premier objectifest de poursuhm ia localisation de I'dgène chez d'autres espèces
de manmiifers dont le rat et I'homme. De plus nous avons sussi poursuivi la caractérisation
biochimique de ['antigène a avons entrepris le séquençage de la molécule afin de pouvoir déduire
un rôle possible en anaiysmt ses homologies de séquence avec d'autres molécules cornues.
1. PRÉPARATION DES TISSUS POUR LES D-S PROTOCOLES UTILISÉS.
a) Pancréas, duodénum et colon de souris7 pancréas de chat et de porc.
Les souris ont été anesthési& a l'éther et le pancréas, le duodénum et le colon ont été
prélevés et pl& sur de la glace. Les tissus ont été rincés dans un tampon phosphate à pH 7.4
(39.5 ml Na2HP04 10 mM pH 8, 5 mi 1% Triton X-100, une pastille d'inhibiteurs de protéases
(Complete) (Boebringer Mannheim) et 500 pl de PMSF). Dans le cas du duodénum a du colon,
la muqueuse a été grattée avec une lame de verre et récupérée. Les différents tissus ont été
transférés dans le tampon phosphate pour obtenir une dilution 1/10, puis homogénéisés au
Polytron (Brinkmann Instruments) durant 3 x 30 sec. a intensité 7. Les diffierents homogénats ont
r j - été redilués 115 dans le même tampon puis Ys& 90 minutes à 4OC. Du NaCl a e<= ajouté aux
homogénats pour obtenir une concentration finaie de 200 mM. Aprh agitation vigoureuse, les
homogénats ont été centrifugés a 15000 rpm (Sorvall Super Speed RC2-13) durant 30 minutes a -
4°C. Les suniagûuits et les d o t s ont été récupérés séparément puis consenrés sur la glace d o u
à -20°C jusqu'à leur utilisation dans les dinérents protocoles.
b) Jus pancréatique de souris
Les souris ont été endormies a I'aide de Pentobarbital de sodium (50 mgld dans propylène
glycol 40 %, éthanol 10 %, Ha, injdon de 75 pl pour une souris de 35 g). Puis elles ont été
injectées avec 50 pl de cédéïrte 104 M dans la veine de la quew tifin d'obtenir une concentration
finale de 10'" M de céniiéine dans le sang de la souris. Un cathéter a été inséré dam le canal
pancréatique relie5 au duodénum et y a été fixé à I'aide d'un m. Une autre ligature a été faite au
niveau du canal cholédoque afin d'éliminer la sécrétion de bile. Le jus pancréatique a été récolté
dans des Eppendorfs jusqu'à épuisement de la souris a celui-ci a été consemé à -20°C.
2- IMMUNOPRECIPXTATION SUR BILLES D'AGAROSE
a) Préparation des bines
Quatre échantillons de 300 pi de billes d'agarose recouvertes d'IgG anti-lapin produites
chez le mouton (1 mi de résine a une capacité de liaison minimale de 0.6 mg IgG de lapin a partir
de s é m de lapin) (Sigma St-Louis, Mo) ont été prélevés et placés dans quatre Eppendorfs
distincts. Ces Eppendorfs ont été cenuifugés (IEC CLINICAL CENTRIRJGE) à 2800 rpm à
4OC pendant 3 minutes. Les surnageams ont été jetés et les d o t s ont été lavés trois fois avec 1
mi de tampon phosphate (5ml Na2HPOd 1M pH 7.4, 5d Triton X-100 1û%, 2d NaCl SM,
42Sd H20 à 4T). Une centrifigation a &é e&auée entre chacun des lavages a 2800 rpm
pendant une minute. Les surnageants ont été jetés a les d o t s de billes ont été récupérés.
Comme témoin de la réaction, 3 ml de tampon phosphate ont été ajoutés à dew des culots de
billes. Aux deux autres culots, 2.85 ml de tampon phosphate contenant 150 pi d'anticorps MIM-
g 1/39 P (polyclonal) ( B d e u et al. 1992) ont été ajoutés. Le contenu de ces quatre Eppendorfs a
été tratlsfëré dans des tubes de 15 ml fermés avec un bouchon- Ces tubes om ensuite été incubés
durant une nuit a 4°C nir un rotateur à plateau basculant (Canlab). Ensuite les tubes ont été
centrifiigés a 2800 rpm durant 3 minutes à 4OC. Les culots ont ité lavés 3 fois avec 1 ml de
tampon phosphate en mtxifûgeant entre chaque lava& durant une minute à 2800 rpm à 4OC.
b) Préparation du tissu
Le Surnageant de I'homogénat du pancréas de souris ainsi que celui de ia muqueuse
duodénaie ont été utilisés comme source de GP39. Le volume du swnageant de pancréas ainsi
que celui de la muqueuse duodénaie ont été portés à 10 ml avec le tampon A (500 jd Nam04 1
M, 2 mi NaCl 5 M, 5 ml Triton X-100 10 %, une pastiUe d'inhibiteurs de protéases Complete
(Boehringer Mannheim), 5 ml PMSF, et le volume complété à 50 ml). Cinquante p1 de chacun a
été conservé pour analyse m imrnunobuvardage. Le reste a été conservé sur glace pour la
technique d'immun~précipitation
Un échantillon de 10 ml du nunageant pancréatique ainn qu'un échantiiion du sumageant
de la muqueuse duodénale ont été ajoutés aux tubes contenant seulement les billes d'agarose-IgG
anti-lapin (témoins négatifs). Un autre échantillon de 10 ml de chacun de ces mêmes échanflons
a été ajouté aux tubes contenant des billes inabks avec l'anticorps polyclonal MIM-1/39. Ces
tubes ont été incubés pendant 4 heures a 4OC sur le rotateur à plateau basculant. Les tubes ont été
centrifiigés à 2800 rprn a 4OC. Ensuite les culots de billes ont été lavés trois fois avec 1 ml de
tampon A en centrifugeant entre chaque lavage 1 minute à 2800 rpm à 4°C . Les sumageants de
la première et dernière centrifbgation ont été conservés pour analyse en immunobwardage. Avant
le dernier lavagey le contenu des tubes a ite divisé en deux dans des Eppendorfj (soit 500
pYEppaidorf) puis a été centrifugés pendant 1 miaute à 2800 rpm a la température de la pièce.
Une des deux séries de tubes a été traitées avec 25 pl de B-mercaptoéthanot + 50 pl de tampon de
soiubition 1X par chdlkge pendant 5 minutes à 1 0 ° C puis umirifùgée à la température de la
pièce pendant une minute à 2ûûûg. Les sumageaats a les d o t s ont éîé réCupénis pour analyse
en immunobuvardage.
3. IMMUNOPRECIPITATION SUR BILLES DE sÉPHARosE
AVEC L'ANTICORPS M M 4 3 9 MONOCLONAL
a) Dialyse
Vmgt-cinq ml de milieu de culture contenant I'anticorps monoclonal MIM-1/39 ont été
dialysés contre 4 litres de tampon de couplage (NaHCa 0.1M pH 8.3, NaCl 0.5 M) a 4OC durant
sa mit (- 18 h).
b) Couplage
La solution d'anticorps monoclonal MIM-1/39 dialysée a été transférée dans un tube en
plastique de 50 ml. Des billes de Sepharose 4B CNBr-activée, 1 g (Pharmacia) ont été godés
dans 50 ml de HCI 1 mM. Les biies ont été lavées par filtration suus vide avec un papier
Whatman 50 avec 1 mM HCI (200mVg gel). Les billes gonflées ont été ajoutées doucement à
partir du papier filtre au tube contenant la solution d'anticorps. Le tube a été incubé sur un
rotateur à plateau basculant duram la nuit à 4°C.
c) Désactivafion
Le mâteriel non lié a été lavé avec 500 ml de tampon de couplage et nIné sous vide avec
un papier Whatrnan 50. Les billes om été transférées daw un tube en piasîiqlie à bouchon de 15
ml auquel 6.7 ml d'ithanolmine 1M à pH 8 ont été ajoutés. Le tube a été incubé sur le rotateur à
plateau basculant pendant 3 heures à 4OC. Par nItrabon sous vide avec aspimiion légère, le gel a
été lavé 3 fois avec 0.1 M Na acétate + I M NaCl a pH 4 puis 0.1 M Na Borate + 1 M NaCI à pH
8 par 100 d g de billes. Le gel a ensuite été lavé avec 100 d g billes d'une solution 0.2 M
&cine-HC! pH 2.8 + 0.5 M NaCl. Puis le gel a été iavé avec 100 d g biiles de PBS 1X (NaCl
0.137 mM. KCI 3 mM, KW2P0, 1.5 mM, Na2HP04 anhydre 8 mM). Le gel est consexve dans du
PBS 1X avec 0.05% N8N3 a 4°C.
d) Préparation du tissu
Le niniageant d'un épihéiium de colon de souris a été utilisé comme source de GP39.
Deux échantillons de 300 pl de billes de ~é~harose'4~-~1~-1/39 d é s a d k s et deux
échantillons de 300 de billes de Sépharose 4B CNBr désactivées ont été déposés dans 4 tubes
en plastique (avec bouchon) de 15 ml. Ces tubes ont été ceritrifugés pendant une minute à 2800
rpm (IEC CLINCAL CENTRIFUGE) à à°C. Les culots ont été récupérés et lavés 3 fois avec 1
ml de tampon A (5 ml Na2Hp01 1M, 5 ml Triton X-100 10 %, 2 ml NaCl SM, et compléter à 50
ml avec &O) à 4OC. Une centrifhgation d'une minute à 2800 rpm a 4'C a été effectuée entre
chaque lavage. Les d o t s ont été consrnés sur la glace a préparés comme suit pour
Tube A: Sépharose 4B CNBr-MIM-1/39 + 5 ml de surnageant de colon de souris + 5 mi
de tampon B (5 ml Na2HP04 1 M, 2ml NaCI 5M, 5 mi Triton X-100 10 %, um pastilie intriibiteun
de protéases Complete (Boehringer Mannheim), 500 pl PMSF, et compléta à 50 ml avec &O).
Tube B: Sépharose 4B-CNBr-MIM-1/39 + 10 ml tampon B
Tube C: Sépharose 4B-CNBr désactivé + 5 ml de !nunageant de colon de souris + 5 ml de
tampon B.
Tube D: Sépharose 4B-CNBr désactivd + 10 ml de tampon B.
Tous ces tubes ont été incubés pendant 4 h m w le rotateur à plateau basculant à 4°C. Les
billes ont été lavées 3 fois avec 1 ml de tampon B en centrifugeant entre chaque lavage durant 1
minute à 2800 rpm à 4OC. Les surnageam de la première a demière centrifugation sont
conservés pour être d y s é s par immunobuvardage. Avant le dernier lavage, le contenu des tubes
.dg a été séparé ai deuxa raison de 500 plEppendod Cinquante pl de tampon de solubiiidon 1 X- 4-
~mercaptoéthan01 on été ajoutés à chaque échantillon puis ces derniers ont été chauffés 5 min à
100°C. Les EppendorfS ont été centrifugés à la température de la pièce durant 1 minute à 2800
rpm Les sumageants a les culots ont été récupérés et d y s é s par immunobwardage.
4. IMMUNOPRECIPI'rAnON AVEC ANTICORPS SOLUBLE (PROTEINE A).
a) Préparation du tissu
Le surnageant d'un homogénat de pancréas de souris (PS) te1 que préparé à la section La.
a été utilisé comme source de GP39-
b) Prépamtion des büles
Lavages150 mg de biues Protéine A sépharose (Sigma) ont été lavées 3 fois dans 0.5 ml
de tampon phosphate pH 7.4 (1 XTriton X-100 196, NaCl 15Chh4, Tris-HC1 10 mM, EDTA 1
mM, EGTA 1 mM, Na Vanadate 0.2 mM, PMSF 0.2 mM, Nonidet P40 0.5%). Les billes ont été
réparties dans des EppmdonS de façon a cowrir le fond des tubes égalemeat (-50 pi biiles).
Pré-absorption: 15 mg de p r o t h A sépharose lavée (Sigma) a été ajouté à deux
{Q échantillons de 450 pl de PS. Le contenu d'un des deux tubes a été dénaturé en chauffht 5 min à
4
100°C. Les deux tubes ont ité agités durant 30 minutes sur le rotateur à plateau basculant a 4OC
puis cenagés à 2000 g durant 30 secondes. Les aunageants d'homogénat de pancréas pré-
absorbés (PS) ont été récupérés puis conserves sur glace jusqu'à l'immunoprécipitation.
Les solutions suivantes ont été préparées dans 6 Eppendorfs:
A et DA: 100 pi MM-1/39 P, 400 pl &O, 500 pi tampon phosphate pH 7.4 2x 100 jd PS;
B et DB: 100 pi MIM-1/39 P, 400 pl H20,500 pi tampon phosphate pH 7.4 2x 100 PS;
C et DC: 500 pl H20, 500 pi tampon phosphate pH 7.4 2x 100 pl PS.
Les échantüions DA DB et DC ont été préparés avec le surnageant d'homogénat de pancréas
-5 dénaturé et A, B et C avec ceIui nondénaturé. Les solutions ont été incubées 1 heure à 4°C.
Bi Ensuite 50 pi de protéine A sépharose ont dé ajoutés aux 6 Eppendorfb puis ces derniers ont hé
incubés 30 minutes à 4OC w rotateur à plateau basculant. Les six EppendorfS ont été cennifugés
à 2000 g durant 30 secondes, a le culot lave 3 fois avec 1 ml de tampon phosphate pH 7.4 1X.
Le produit du premier lavage a été conserve pour anaiyse en immunobuvardage. Trente @ de
tampon de solub01Iisation 2X ont été ajoutes aux 6 cuiots (bides) qui ont ensuite été chsuffés
durant 5 minutes à 100°C. Les 6 Eppendorfk ont été centrifii&s à 2000 g durant 5 minutes. Les
sufflz~geants a les cuiots ont été d y s é s par imrn~~~obuvardage-
5. IMMUNOPRECIPITATION A L'AIDE DE LA PANSORBINE
Nous avons utilisé la méthode décrite par Kessler (1975).
a) Lavage de la pansorbine
Un mi de pansorbice ( Capacité de liaison standardisée 2.16 mghi) (Calbiochem) a été
centrifùgé dans un Eppendorf à 4000 g durant 5 minutes ( C e n a g e Mode1 59, Fisher). Le
surnageant a été jeté puis le culot de cellules a été lavé 2 fois avec 1 ml de Nonidet P-40 0.5%
dans un tampon Net (Tampon Net à pH 7.4: NaCl 150 mM, EDTA 5 mhd, Tris 50 mM, Azide de
sodium 0.05%). Le culot de pansorbine a été remis en suspensÏon, incubé IS minutes à la
température de la pièce sur rotateur à plateau basailant puis centrifugé à 4000 g dutant 5 minutes
Ion de ces deux lavages. La pansorbine a été resuspendue avec 1 ml de Nonidet P-40 0.05% et
gardée à 4T.
b) Préparation du tissu
Le surnageant d'un homogénat de pancréas de souris (PS) a été utilisé comme source de
Gf39,
Deux échantillons de PS de 475 pi ont été pré-absorbés avec 100 pI de pansorbine.
Cinquante pi de PS ont i té gardés pour être d y s é s par immunobuvardage. Les deux
&hamillors ont été incubés durant 30 minutes à 4OC sur le rotateur à plateau basculant, puis
centrifitgb à 4000 g durant 5 minutes. Les sumageants (PS) ont été conservés pour
l'imunoprécipitation Cinquante pi de PS pré-absorbés avec la pansorbine ont été gardés pour
amlyse en immunobuvardage.
.g d) Préparation des échantillons -
A deux échantillons de 460 fl de PS, 10 pi ou 20 pi de MIM439 P ont été ajoutés. Ces
deux échantillons ont été agités vigoureusement puis incubés pour la nuit à 4°C.
Cent pl de la pansorbine ayant été lavée om été ajoutés aw échantillons PS. Ces derniers
ont été incubés durant 1 h à température de la pièce sur le rotateur à plateau basculant puis
centfigés durant 5 min à 4000 g. Les sumgeants ont été jetés. Les d o t s ont été lavés avec 1
ml de Nonidet 0.05% en les remettant en suspension, suivi d'une centrifugation durant 5 min à
4000 g (2 fois). Puis les d o t s ont été lavés une fois avec 1 ml de PBS:BSA 1 % de la même
manière. Les culots ont été remis en suspension avec 150 pi tampon de solubilisation 2x43-
mercaptoéthanol. Ceux-ci om éti chauffés duram 5 min a 100°C puis Çentrifiigés à 4000 g durant .& I
-
1 minute. Les Sufnageants ont été récupérés et anafysés par imaiunobuvardage.
a) Préparation du tissu
Le surnageant d'un homogénat de pancréas de souris (PS) a été utilisé comme source de
GP39,
b) Préparation des gels
Des gels minces du type Laernmli ont été utilisés. Un gel séparateur de 8% et un gel
d'entassement de 4% ont été préparés. Un maximum de 700 pl de PS (350p.i PS + 350 pl tampon
de sclubiiisation 2X) ont été appliqués aux gels. Les protéines ont migrées à 70 volts dans le gel - d'entassement et a 170 volts dans le gel séparateur. Une bande de gel contenant GP39 a été
coupée à l'endroit de sa Mgdon. Cette bande a été coupée en petits morceaux lesquels ont été -
conservés à 4°C dans un tube de verre contenant du tampon d'élution (25 m . Trisbase, 192 m M
Glycine et 0.01% SDS).
c) Montage de I7Electro-EIuteur modèle 422 (Bio-Rad)
Les capniles a membrane om été trempées à 60°C dans le tampon d'élution durant 1 heure
puis ont été conservées dans le tampon d'élution jusqu'à leur utilisation. Les coussinets ont été
dégazés sous vide durant 15 minutes dans un petit volume de tampon d'élution. Les coussinets
ont été placés sous les 4 tubes de verre du côté poli, le tout daas le tampon d'élution Les
ameaux d'insertion du module ont été mouillés avec le tampon d'élution afin d'y insérer les tubes.
Les capdes a membranes ont été insérées endessous des adaptateurs de silicone. Les
adaptateurs om été remplis de tampon d'élution. Ceux-ci ont été glissés au bas des tubes tout en
les retirant et repoussant légèrement pour fàire sortir iles bulles. Les tubes ont été remplis de
tampon d'élution auxquels les morceaux de gel ont été ajoutés. La chambre du bas a été remplie
avec 600 ml de tampon d'elution a la chambre du haut avec 100 ml. La 8 3 9 a été due des
morceaux de gel avec 10 di-Amperdtube avec agitation vigoureuse à l'aide d'un agitateur
magnétique dans la chambre du bas. Les tubes ont été retirés du module et, à I'aide d'une pipette,
le tampon d'éfution a été jeté. Les adaptateurs de silicone ont été retirés des tubes sans y enlever
les capsules a membranes. Le tampon contenu dans les capsules a été récupéré dans un
EppmdorE Les capsules ont été rindes avec 200 pl de tampon d'élution qui ont été ajoutés à
I'Eppendorf Les proteines GP39 éluées (PE) ont été consmées a -20°C pour utilisation
ultérieure dans dinërents protocoles.
d) Séquençage
- - Les protéines éluées (30 ml) (PE) ont été concentfées sur des concentrateurs Centricon 10
(Amicon) afin d'être séquencées. Deux ml de PE ont été ajoutés au Centricon et centrifugés à
6500 rpm (Sorvaii super speed RC2-13) durant 1 heure. Le support de base contenant le filtrat a
été enlevé. L'échantillon a été inversé et cemrifugé à 3000 rpm durant 2 minutes. Les
échantillons concentres de PE ont été récupérés, conservés a -20°C et anaiysés par
immunobwardage n par séquencage (Service de séquence des protéines de I'est du Québec).
tl
7. DEGLYCOSYLATiON CHIMIQUE
a) Préparation du tissu
Le surnageant d'un homogénat de pancréas de souris (PS) ainsi que les protéines GP39
ilectro-éIuées PE) ont été utilisés comme source de GP39.
Deux échantillons de 200 pi de PS a deux de PE ont été ajoutés dans des Eppendorfs dans
lesquels 10 pg d'ovalbumine ont été ajoutés. Les protéines ont été précipitées dans trois volumes
d'acétone (600 pl) durant 6 heuns à -20°C sur l'agitateur à plateau basculant ( N a h a al., 1988).
Les échantillons ont été centriftgés à 13000 rpm (Centrfige Model59, Fisher) durant 20 min a la
température de la pièce. Les d o t s ont été asséchés à 37OC, puis refkoidi nir la glace. Trente pl
. .g d'eau bidistillée ont .été ajoutés à un échantillon PS a a un échantillon PE (contrôles négafls). -
Trente pi d'un mélange pré-rrfroidis de TFMS (Fiuka) et d'anisole muka) (2:1, v/v) ont été
ajoutés aux deux m e s échantillons. De I'azote a été barbote à travers chaque échantillon puis les -
EppendorÎs ont été refennés et incubés à O°C durant 150 min. Les réactions ont été terminées par
l'addition de 125 jd de -dine (Baker d y s e d reagent)/eau (2:1, vh) par volume de 10 j.d
aux échantiuons ayant subi la déglycosylation, et 125 pl d'eau aux contrôles négatifs. Les
échantdlons ont été précipités dans trois volumes d'acétone a -20°C puis centrifugés à 13000 rpm
durant 15 minutes. Les d o t s ont ensuite été séchés sous vide durant 10 minutes puis
rrsuspendus dans 100 pi de tampon de solubilisation 1X pour être. d y s é s par
hunobwardage.
8. DEGLYCOSYLATION ENZYMATIQUE
Les prothes GP39 éluées (PE) ont été preparées tel que décrit dans la section 6. La
dégiycosyiation a été effectuée selon Servant et al. (1996). Douze pl de PE (-100 pg protemes)
ont été ajoutés a un Eppendorf contenant 10 pl de PNGase F (N-GIycosidase F) @oemger
Mannaham) a 28 jd de tampon de déglywsyiation (100 rnM Na2HP01 pH 7.4,25 rnM EDTA 5
mM N a 3 , 0.2 mglm1 d'inhibiteur de trypsine de soya, 0.2 mg/ml iacitracin, 2 m . PMSF). Dans
le contrôle négatif, la PNGase F a été remplacée par 10 pi de tampon de dégiycosyiation Les
Eppendorfi ont éîé incubés durant 4 h à 37°C. La réaction a été arrêtée par l'addition de 50 pi de
tampon de solubilisation 2X (lx: 1-25 ml Tris-HCI 1 M pH 6.8, 4.6 ml SDS 10 %, 2 ml giycérol
lm%, 40 @ BPB 0.1%. 12.11 mi HzO). Les échantillons ont été adysés par immunobwardage.
a) Préparation du tissu
Le suniageant d'un hornogénat de pancréas ile sÔwis (PS) a été utilisé comme source de
b) Préparation des colonnes
Une s e ~ g u e de 1 mi ayant un volume de 0.72 cm3 a éte utilisée en tant que colonne pour
le Lentil-iectin-agarose (Sigma) a une Seringue de 3 ml ayant un volume de 2.5 1 cm3 a été utilisée
pour la Concana&-A-agarose (Sigma) et la Jacalin-agarom (Sigma). Une petite quantité de
laine de verre a été glissée dans le fond des seringues et celles+ ont été remplies de TBS (10 mM
g Tris, 150 m M NaCL l m . MgCl*. 1 mh4 CaC12, 0.02% Na3) . A l'aide d'une Serinpe, les
a: colonnes ont été remplies avec les lectines. Les colonnes ont été lavées avec 10 fois leur volume
de TBS.
c) Chromatographie (CiimmMgs, 1994)
Cinq ml de PS ont été déposés à l'aide d'une seringue sur les différentes colonnes. Des
fiactions de 1 ml (vitesse d'écoulement entre 0.5 et 1 ml par nM) ont été récoltées pendant le
passage de 10 volumes de TBS sur la colonne. Les solutions d'élution suivantes ont éîé
appliquées: 100 mM a-Méthyhmnoside (Sigma), 100 mM a-Méthyirnmoside (Sigma) + 10
mM a-Méthylglucoside (Sigma) a 100 rnM a-MéthyIgalactoside (Sigma) respectivement aux
colonnes Lentil-tectin, ConA et Jacaline-lectine- Puis des fiactions de 1 ml ont été récoltées dans
des Eppendorfs suite au passage de TBS avec 10 fois le volume de la colonne.
d) Précipitation des protéines
Les fiactions protéiques ont été précipitées avec du TCA 100% à 4OC durant 60 min. avec
une concentration finale de 25% de TCA. Les échtiilons ont été centrifiigés à 13000 rpm durant
20 minutes. Les d o t s ont été lavés deux fois avec 500 pi d'acétone a -20°C, agités
vigoureusement et centrifugés a 13000 rpm durant 10 minutes. Les protemes ont été séchées sous
vide et resuspendues dans 40 pl de tampon de solubiiisation 1X Toutes les fiactions ont été
anaiysées par immunobuvardage.
La fiaaions éluées de la coIome Concanavalin-A-agarose avec la solution d'élution ont
été déposées sur la colonne Lentil-lectin-agarose. Le protocoIe mentionné plus haut a été suivi.
1 0. CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION
a) Préparation du tissu
Le surnageant d'un homogénat de pancréas de souris de 500 pl (PS) a été utüisé comme
souce de GP39.
b) Préparation des colonnes
Une seringue de 10 ml a été u tilisée en tant que colonne car son volume est de 14.4 mi et
que l'échantillon doit être égal a 5 % du volume de la colonne. Un petit morceau de laine de vene
a été placé au fond de la seringue. Une colonne de Bio-gel P-200, 50-100 mesh (wet) (Bio-Rad)
ayant une Limite d'exclusion 200000 daitons et 34 ml / g poids sec et une de Biogel P-100, 50-100
me& (wet) (Bio-Rad) ayant une limite d'exclusion de 100000 dalton, 12 d g poids sec ont été
préparées. Le Biogel P-200 (0.3 5 g) et 1 g de Biogel P-100 ont été dissous dans 24 ml d'acide
fonnique 9 % et dégazés. Les colonnes ont été remplies avec les Biogds avec les robinets d'am&
ouverts.
c) Chromatographie
Les échantiuons PS (500 pi) ont été déposés sur les colonnes. Les colonnes ont été éluées
avec de l'acide formique 9 % avec le robinet ouvert pour ne laisser tomber qu'une goutte a ia
seconde. Des hctiom de 500 pi ont été récupérées dans des Eppendorfs. Les fiactions ont été
lues .au spectrophotomètre à 280 nm (Beclÿnan DU 640) et les 20 p r d è r e s fiactions ont été
analysées par immunobuvardage.
61 11. GRADIENT DE GLYCÉROL ET DE SUCROSE
a) Prkpztion du tissu
Le d o t d'un homogénat de pancréas de souris a été utilisé comme source de GP39.
b) Gradient de glycéro1 ou de sucrose
Des solutions de glycérol ou sucrose de 300/0 et une de 1% ont été préparées dans le
tampon sUivant:Sml Na2HP04 1 h4, 2 ml NaCl 5 M, 5 ml Triton X-100 Lû%, une panille
d'inhibiteurs de protéases (Complete, Boehringer Mannheim), 5 ml PMSF. et le volume est
complété à 50 mi avec H20. Les culots ont été resuspmdus avec 300 pi de ce tampon a ont été
conservés sur glace. Deux gradients de 30% à 1% de glycérol ou de sucrose ont été codés dans
des tubes pour dtracentrifirgeuse de 12 ml (Sonvall03699, Polyallomer). Les deux culots ont été
d ajoutés délicatement à la d a c e des gradients. Les tubes menant les gradiems ont été
équilibrés avec la solution de 1% puis ont été uitracentrifbgés a 35000 rpm (L-70 Ultracentnfiige
Bechan, sw 41 Ti), durant 24 heures à 4OC. Les tubes ont été sortis délicatement du rotor et ont
été placés dam la glace pour être ensuite fixés a un support à l'aide a'une phce. Un bout de
papier adhésifa été collé au bas des tubes et I'ouvernire des tubes a été recouvene d'un parafilm-
A I'aide d'une aiguille, les tubes o a été percés à la base et des fiactions de 12 gouttes par
Eppendorf(Glycéro1) et 8 gouttes (Sucrose) ainsi que le culot ont été récoltés. Les échantillons
ont été consemés à -20°C et anaiysés par imrnunobuvardage.
12. ESSAIS DE DIFFERENTS DÉTERGENTS
a) Préparation du tissu
Le d o t d'un homogénat de pancréas de souris a éîé utilisé comme source de GP39.
b) Préparation des détergents
Des solutions de 5% et 10% de Triton X-100, de SDS et de guanidine ont été préparées
dans 1 ml de tampon A (voir section La.). Chacune de ces solutions a été ajoutée i un échantillon
de culot d'homogénat de souris. LAS échantillons ont été agités vigoureusement, solubiiisés et
laissés 10 min à la température de la pièce puis centnfiigés durant 30 min a 15000 rpm ( S o W
Super Speed RC2-13) à 4OC. Les niniageants et les dots ont été récupérés. Les culots ont été
sdubilisés avec 1000 pl de tampon A Tous les échantillons ont été d y s é s par
15 immunobuvardage. .
C) Détergent SDS
Deux ml d'une solution de SDS 10 % ont été ajoutés a deux culots d'homogénat de
pancréas de souris. Les culots ont été bien solubiIisés par agitation vigoureuse et laissés durant 10
min. a la température de la pièce. Puis ils ont été centrifugés durant 30 min à l5OOO rprn a 4°C.
Les sumageants et les culots ont été récupérés et 2 ml de SDS 10 % ont été ajoutés aux culots
trois fois de suite. Les échantillons ont été analysés par irnmunobuvardage.
a) Préparation des grains (Pelé, 1976)
Les pancréas de 2 souris anesthésiées % I'ither ont été prélevés et rincés, I'un dans une
salution de sucrose avec inhibiteurs de protéases (1 1.12 g suaose mur, 0.01 68 I g de a s , le
pH est ajusté à 5.8 avec N-ethyhorpboline 2 %, une p d e d'inhibiteurs de protéases, 500 pI de
PMSF, et le volume est complété à 50 ml avec &û bidistiiiée) et l'autre daas une solution de
suaose sans inhibiteurs de protkses. Les deux pancréas ont été homogénéisés daas 35 ml de
solution de sucrose avec ou sans iniiliiteus dans un tube de Dounce de 50 ml avec environ 20
coups de piston lâche et 15 coups de piston semé¶ le tout dans la glace. Cinquante pi de chaque
échantillon ont été conservés pour analyse par immunobuvardage. Les homogénats ont été
cenaifugés à 700 x g durant 15 min. a 4OC pour enlwer les noyaux, les cellules entiers et les
fJ débrk eeiiulaires. Les deux surnageam ont &é récupérés et centrifùgér à 4000 x g durant 15 min
a 4OC. Les deux sunageants et les deux culots ont été réaipérés. Cinquante pl de sunageant ont
été conservés pour analyse par immunobwardage. Les culots renferment les gains de zymogène.
b) Préparation des tampons
Tampon A: 500 pl Na2HPOd 1 M, 2 ml NaCl SM, 5 ml Triton X-100 10%, une pastille
d'inhibiteurs de protéases Complete, 500 pl PMSF, le pH est ajusté à 7.4 avec HCl concentré: le
volume est complété à 50 ml avec Hz0 bidistillée.
Tampon B: 500 CI Na2HP04 1 M, 2 ml NaCl S M, 5 ml Triton X-100 IO%, le pH est
ajusté a 7.4 avec HCI concentré et le volume est wmplèté à 50 r d avec Hz0 bidistillée.
Tampon C: 25 ml de tampon A + 0.008 g EDTA 1 PM.
Tampon D: 25 ml de tampon B + 0.008 g EDTA 10-%4
c) Grains de zymogene
Les d o t s de gains de zymogène ont été rrsuspendus dans 1 mi de tampon A dans le cas
du culot avec inhiiiteurs de protéases a dans 1 ml de tampon B pour ceux sans inhibiteurs.
Cinquante pl de chaque culot ont été conservés pour analyse par mimunobuvardage. Deux ml de
tampon C et D ont été ajoutés aux grains de qmogènes avec et sans inhibiteurs respectivement.
Ces échantillons ont été agités vigoureusement et laissés pendant 60 min à 4OC. Tous les
échantillons ont été analysés par immunobuvardage et le reste a été conservé à -20°C.
14. FRAGMENTATION DE L'MG- l/3 9
1. Protéinase K et trypsine
a) Préparation du tissu
Les pancréas de quatre s o k s anesthésiées à l'éther ont été prélevés et rincés dans du PBS
iX pH 7.4 (NaCl 1.137 mM, KCI 3 mM, NatHP04 anhydre 8 mh4, -PO( 1.5 mM. Le volume
total de chaque pancréas a été dilué 1/10 avec PBS 1X pour ensuite être homogénéisé au Polytron
(Brinlonann Instruments) 3 X 30 sec. à intensité 7.
b) Digestion
La protéinase K a été diluée (Sigma)à une concentration de 20 mglml. La trypsine a été
diluée 11250 (Boehringer Mannheim). Une digestion en duplicata a été fhïte sur les homogénats
de pancréas de souris avec diffërrntes concentrations de p r o t ë i K pendant une heure:
C d
K1: 25 pl d'homogénat + 25 pi pmtéinase K (0.5 mg)
K.2: 25 p1 d'homogénat + 12.5 pi protéiaase K + 12.5 pl HzO (0.24 mg)
K3: 25 pl d'homogénat + 8.3 p1 protéinase K + 16.6 PI H20 (0.166 mg)
K4: 25 pl d'homogénat + 6.25 pi Proteinase K + 18.75 pi H20 (0.125 mg)
Tl : 25 pi d'homogénat + 25 pi trypsine (1/250): 11500
T2: 25 pl d'homogénat + 12.5 pl trypsine (1/250) + 12.5 pl Ha: 1/1000
T3: 25 pi d'homogénat + 8.3 pi trypsine (1/250) + 16.6 pl H20: 1llSOO
T4: 25 pl d'homogénat + 6.25 pi trypsine (lB50) + 18.75 pl Ha: 1/2000
Les réactions ont été arrêtées par l'addition de 50 pI de tampon de solubiiisation 2X et
elles ont été analysées par immunobuvardage.
2. CNBr (Desamaud et al., 1993)
a) Préparation du tissu
Le pancréas de souris a été prélevé et ~ c é dans un tampon 100 mM Tris/HCI pH 8.5 1
SDS 0.1%. Le volume total du pancréas a été dilué 115 dans ce tampon et a ensuite été
homogénéisé au Polytron 3 X 30 sec à intensité 7. L'homogénat a ensuite été dilué '/z dans ce
même tampon. La fhgmentation a également été effectuée sur les GP39 électru-éluées (PE).
b) Lyophylisation
L'homogénat a été sépare en 4 échantillons de 1 ml dans des Eppendorfs ainsi que 2 ml de
PE. Les échantillons ont été iyophylises durant la nuit et ensuite soiubiiisés dans 500 pi d'acide
formique 70%.
c) Fragmentation
Deux g de CNBr (Sigma) ont été dissouts dans 2 ml d'acide formique 70%. Cmq cents pl
d'acide formique 70% ont été ajoutés a un échantillon d'homoginat de pancréas et a LUI
échantillon de PE qui ont semi de wntrôIes négatifs. Cinq cmts pl de CNBr (500 mg) ou 3-00 pl
CNBr + 200 acide formique 70% (300 mg) ou 100 pl CNBr + 400 pl acide formique 70% (100
mg) ont été ajoutés rrspectivernent aux trois autres échantillons d'homogénat. Trois c m t s p l
CNBr + 200 pi acide formique 70% (300 mg) ont été ajoutés I l'autre échantillon PE. Toutes ces
préparations ont été inaibées à la noirceur durant 24 h à température de la pièce. Les réactions
ont été arrêtées par l'addition de 1 ml d'eau bidistillée suivie d'une lyophyiisation à trois reprises.
Les échantillons ont été s01ubiIisés avec 1 ml de PBS 1X (NaCI 0.137 mM, KC13 mM, Na2HP04
anhydre 8 mM, -PO4 1.5 mM) puis anaiysés par immunobuvardage.
3. Endoproteme Glu-C V8
Le pancréas d'une souris anesthésiée a l'éther a été prélevé puis rincé dans un tampon
phosphate 10 m . pH 8/SDS 0.1%. Le volume total du pancréas a été dilué 1/10 dans ce tampon
et a ensuite ké homogénéisé au Polycron 3 X 30 sec. à intensité 7. L'homogénat a été dilué H
dans du PBS 1X (NaCl 0.137 mM, KC1 3 mM, Na2KP04 anhydre 8 mM, -O4 1.5 mM).
L'endoprotéinase Glu4 V8 (376.6 unités) (souche V8 de S ~ ~ ~ Z U C O C C U S meus, Sigma) a été
prépare dans 100 pl du tampon phosphate pH 8. Un pi de PMSF (8.7 mg/1000 ml isopropanol) +
49 pi PBS 1X (contrôle négatif), 188.3 unités, 94.15 unités, 37.66 unités de V8 ont
respectivement été ajoutés a quatre échantiiions d'homogénat (Desaniaud et al., 1993). Ces
Q échantïiions ont été incubés 1 heure à 37OC sur I'agitateur à plateau basculant. Les réactions ont -'
&: été d é e s par I'addition de 1 pi de PMSF et les échtillons om été analysés par
inmunobuvardage-
a) Échantillon
Les GP39 électro-éluées (PE) ont été utilisees. La réaction a été fkite sur une t
coxmentration protéique de 1-5 mg/mt. A 210 pl de PE (6 m g h i de protéines), ont été ajoutés 10
pl de $-mercaptoéthanol pour riduire les ponts &sulfures. Cet échantillon a été chauffé à 100°C
dumi 5 minutes.
b) Clivage
Une solution 6 M de guanidine-HCl (Sigma), 2 M hydroxylamine-HCI (Eastnm Organic
- Chcmicais) a kt6 dans du LiOH 4.5 M (Sigma) @omstein et B a b , 1977). La solution
de LiOH 4 . m (filtrée) a été ajoutée lentement avec agitation vigoureuse à 4OC à la solution de
guanidine-HCl et d'hydroxylarnine-HC1. Le pH de la solution a été maintenu à 7-8 jusqu'ii ce que
tout le soluté soit dissout et qu'un volume de 8 ml soit atteint. Le pH a ensuite été ajusté à 9 avec
du LiOH jusqu'à I'obtention d'un volume de 10 mi. La solution a été transfirée dans un bain
d'eau a 45°C.
Cette solution (210 pl) a été ajoutée à I'échantillon PE qui a ensuite été incubé dunim 4
hains à 45OC. La réaction a été arrêtée par l'addition d'acide fonnique jusqu'à l'atteinte d'un pH
2-3 (3 gouttes).
L'échantillon a alors été passé sur une coionne de Biogel P-100 et les fi-actions ont été
Q adysées au spectrophotomètre à 280 nm (Beckman DU 640). -
15. ÉLECTROPHORÈSES BIDIMENSIONNELLES 6)
1. Première dimension
a) Préparation du tissu
Pancréas de souris: Le pancréas d'une souris anesthésiée à Séther a été prélevé et celui-ci a
été dilué 1/10 dans du tampon de Dxyer modifié (0.01 M Tris, p H 7.40.1 % Triton X-100, 150
pdp1 PMSF, 0.1 % O-macaptoéthanoI). Ii a été homogénéisé au PoIytron 3 X 30 sec à intensité
7 a centfigé durant 30 min à 15000 rpm a 4°C. Le sumageant a été récupéré et la solution
suivante représentant 1/10 du voiume a été ajoutée: DNase/RNase 10X (0.5 m g h l de DNase I
(Sigma), 0.25 mgM de RN- A (Sigma), 50 mM de MgC12.6&û, 20 mM de CaC12 dans tris 0.5
M a pH 7.4 &é sur mülipore 0.22 p). L'homogénat a été agité vigoureusement à la température
.$ de la pièce durant 2 minutes. La solution DNase/RNase iOX a été de nouveau ajouté a raison de
- 1/10 du volume. L'homogénat a été agité a la tempérawe de la pièce durant 5 min puis chauffé à
100°C durant 1 min et refroidi à 4OC. L'homogénat a été réparti en échantillons de 100 pl, qui ont
été congelés et lyophylisés au Speed Vac SC100 (Savant) durant 2 heures et Mernent conserves
Jus pancréariaue de souris: 2 ml de tampon de Dxyer ont été ajoutés à 20 pi de jus
pancréatique. Un traitement DNase/RNase 10X a été efféaué. Le jus a été aliquoté en
échantillons de 100 pUEppendonet masené à -20°C.
b) Préparation des tubes d'électrophorèse
Les tubes ont été traités au Sigrnacote (Sigma), fennés par deux épaisseurs de parafilm
$ d'un côté et marqués à I I cm de l'autre &té. Quinze ml de gel ont été préparés comme suit: 8.25
g d'urée, 2.96 ml d'eau bidistillic, 1.995 ml de solution ~cryIamide 30% (28.38 % (wh)
acqdamide (Boehringer 1.62 % (w/v) de Bis N7N' -MéthyIene-bis-acrylamide (Bio-
Rad), 3 ml de solution 10 % (wlv) NP40 dans H20, 0.6 ml d'ampholine pH 5-7, et 0.15 ml
d'arnphoiine pH 3-10. La solution a été filtrée su. millipore 0.22 pm a dégazée. Quinze pi
à'APS 10 % et 10.5 p1 de Terned y ont i té ajoutés. Chaque tube a été rempli jusqu'a 11 cm a
l'aide d'une seringue de 5 ml et d'un d i t e r . Vingt jd d'une solution d'urée 8 M y ont éti
déposés durant 90 min, puis remplacés par 20 pl de tampon de lyse (9.5 M d'urée, 2 % (w:v)
Nonidet P40, 2 % d'ampholine @io-Rad) (1.6 % pH 5-7, 0.4 % pH 3-10), 5 % B
mercaptoéthanoI), le tout recouvert d'eau.
Les parafilms ont été remplacés par une membrane à dialyse a le tampon de lyse par 20 pl
(4 de tampon de lyse fiaiche. Le reste du tube a été rempli de NaOH 0.02 M La tubes ont été -
montés dans la m e cylindrique (Tube CeU Model 175, Bio-Rad). Le réservoir inférieur a été
rempli avec la solution d'anode (H3POd 0.01 M) et le résewoir du haut, avec de la solution de
cathode (NaOH 0.02 M).
d) Dépot des échantillons
Le tampon de lyse et le NaOH 0.02M ont éte enlevés e!t remplads par 40 pl (100pg de
protéines) des échantillons d'homogénats, de pancréas ou de jus pancréatique de souris. Les
échantillons ont été recowerts avec 20 pi d'une solution d'urée 9 M, ampholine 1 % (0.8% pH 5-
afin d'y mesurer le
puis avec du NaOH 0.02 M L'un des tubes
pH dans le gel. Les échantillons ont migré à
a reçu 40 pl de tampon de lyse
200 volts durant 15 min, à 300
volts durant 15 min, et 8 400 vohs durant 18 heures. Dans le cas ou il y a eu me pré- ci electophortse, les gels ont migré duraat 15 min a 2 0 volts, 30 min à 300 volts et 30 min a 400
volts. Puis les échantillons ont migre à 650 volts pendant 15 heures a à 1000 volts durant 1
haire. Les gels ont été démoulés a Cquiliirés dans 5 ml de tampon d'@&ration (10 % (wh)
de gIycéroI, 5 % (vlv) de Bmercaptoéthanol, 2.3 % (w/v) de SDS, 0.0625 M de Tris -HCl pH
6.8) durant deux heures avec agitation puis conservés à -20°C. Le gel semant a la détermination
du pH a été coupé à tous les 0.5 cm Les morceaux ont été ajoutes à 2 ml d'eau a le pH de
chacun a été mesuré.
2. Deuxième dimension
Un gel séparateur à 8 % et un gel d'entassement à 5 % ont été coulés saos peigne. Un gel
cyhdrique a été déposé sur le dessus du gel d'entassemmt et couvert d'agarose 1 %. Les
protéines ont migr= à 1 W volts dam le gd d'entassement et à 185 volts dans le gel séparateur puis -. elles ont été transférées sur une membrane PVDF pré-traitée dans du méthanol 100% à 100 volts
durant 90 min dans le tampon CAPS 100 mM pH 11 (Sigma).
16. ESSAIS ANTIBACTÉRIENS (Lebrer et al., 1983).
1. Culture des bactéries
Les bactéries ont été mises en culture dans leur bouillon durant la nuit à 37OC.
Bactéries Bouillons de culture Agar
StqhyZococcus areus TSB TSA
S~qhyiococctls eepidermidis TSB TSA
S ~ ~ ~ O C O C C ~ ~ S pnezmonionicre
1 Streptococ~ agahctiae
meria monocytogenes
Pdomoonar îzerugrnosa
kherichiu coli
Mebsekz pnetrmoni.
&mafia mmarcescem
Heamophilus i f l u e m e
Bordeella bronchiseptiea
THB
TWB
TSB
TSB
TSB
TSB
TSB
TSB
TSB
TSA
TSA
TSA
Cent pl ont été remises en culture dans 4.9 ml de leur bouillon de culture respeaifà 37OC
durant 3h30 mie Les bactéries ont été iavées 2 fois par centrifiigation (2900 x g, 10 min) avec un
tampon 10 mM KHtPO4- K&U?04.. Chaque d o t bactérien a été amené à uw concentration de ' 10' CRiiml par l'addition de tampon IO mM KHrW)i- K i m < i une concentration de 10'
cFU/ml.
2. Essais antibactériens
Les cultures concentrées à 10' CFU/d ont été exposées a 5 pg de PE dans un volume de
100 pl de tampon 10 mM m 2 P 0 4 - & H P 0 4 dans des EppendorfS et incubées 20 minutes à la
température de la pièce. Dans les contrôles négatïfis les 5 pg de protéines 1/39 n'ont pas été
ajoutées. Les réactions ont été mêtées par l'addition de 900 pl de tampon 10 m M -04-
K2KP04 et elles ont été diluées 3 fois 1/10 en duplicata dans ce tampon Cent pl de ces séries de
dilutions om été mis en culture sur I'agar approprié a incubés a 37OC durant 24 à 72 heures. Les
colonies ont été comptées.
s d
1. Préparation des solutions
Z'kattw: g i d d é h y d e 1%- padormaldéhyde 2Y~tampon phosphate 0.2 M: '1 ml
giutaraldéhyde 1%, 2 mi pdormaldéhyde lû??, 5 ml tampon phosphate 0.2 M, le pH a été ajusté
a 7.2-7.4'2 ml d'eau.
2. Fixation
Le culot d'un homogénat de pancréas de souris a été laissé durant 2 heures dans le fkateur
à la température de la pièce puis lavé 2 fois durant 10 min à la température de la pi&. Il a été
ensuite laissé durant la nuit a 4OC dans un tampon phosphate 0.2 M-NaCI 0.15 M. Le blocage a
été effectue ii la température de la pi& duranî 45 min dans du PBS-glycine 100 m . suivi de
deux lavages a la température de la pièce de 10 min avec le tampon phosphate 0.2 M-NaCI 0.15
M. L'échantillon a ensuite été déshydraté dans du méthanol 50% a 4OC durant 20 min, à 700/0 à - 20°C durant 20 min, à 90% à -20°C durant 20 minet 3 fois à 10W à -20°C durant 20 min. Le
culot a éîé enrobé dans du Lowicry1:méthanol 1: 1 (500 pl: 500 pl) à -20°C 1 heure, 3 2 (600 pl:
400 pl) à -20°C 1 heure et dans du Lowicryi pur à -20°C 2 fois durant 1 heure, et durant la nuit.
Le bloc a été stabilisé à -20°C 1 heure avec les U.V.. Les coupes ont été fixées sur des lames qui
oa été trempées 5 min dans du PBS 1X L'anticorps MIM-1/39 dilué 1/50 dans du PBSBSA
20% a été appliqué sur les coupes durant 1 heure (avec wntrôle négatif). Les lames ont été lavées
3 fois 5 min avec du PBS 1X pH 7.4 (NaCl 0.137 mM, KCI 3 mM, Na2HPQ anhydre 8 mM,
m2PO4 1.5 mM).. L'amicorps secondaire de mouton anti lapin IgG-RTC (Boehringer
Mannheim) dilué 1/25 dans du PBS/BSA 20% a été applique aux coupes dunint 30 min. Les t l -
lames ont été Iavées 3 fois 5 min avec du PBS 1X
I S. DETECTION SUR HPLC EN PHASE INVERS&
Les protéines GP39 électrOIéIuées a fbgmntées au CNBr ont été analysées par HPLC en
phase réverse sur une colorne Delta pack C4, 1.5 mi /min. Temps O = 100% Tampon A: 80%
(0.05% TFA/eau) et 200/0 acétonitrife/O.OS% TFA et temps 50 = 1W/o Tampon B: 4% (0.05%
TFAhu) et 60% acétonitriie/O.05% TFA
Le pancréas d'une souris anesthésiée a l'éther a été prélwé très rapidement et a été mis
immédiatement dans une solution LiCl3MKJrée 6M sur dace carbonique (10.4 d 0 . 5 g de tissu).
Le tissu a été homogénéisé dans cette solution au Polytron 3 x 30 sec à intensité 7 puis incubé
pour la nuit dans un bain de glace sèche/éthanol. L'homogénat a été centrifiigé durant 30 min à
4OC a 2000 x g. Le culot d7ARN a été resuspendu dans une solution 10 mM Tris pH 7.4, 0.5%
SDS, 1 mM EDTA (autoclave) (2.1 m110.5 g tissu) puis a subi deux extractions
phinoVchlorofonne/imamyl saturé 2X Du sulfate d'ammonium a été ajoute à 0.4 M a 1'AR.N a
été précipité dans 2.5 volumes d'éthanol 100% par une inaibation de 30 min à -80°C.
L'échantillon a été camifiige duram 15 mia à 4°C à 13000 x g. et le d o t d'ARN a été lavé avec
400 pl d'éthanol TV!, suivi d'une nouvelle centrifûgation. Les échantillons CARN ont été
c o r n é s à -80°C.
20. RT-PCR
Des RT-PCR ont été e f F i i é s sur 7 pg d'ARN pancréatique de souris avec les
oligonucléotides dégénérés JB- 1 (%CGGCCYTNGARGARYTN~') a h3-2
( 5 ' G C ~ ~ ~ ~ ~ ~ ' T Y T C N ~ C N ~ ~ ~ * ) (Gibco) qui correspondent aux parties 5' et 3' des 12 acides
aminés déteminés par séquençage de la partie_NH2 temllnale de la GP39. La tmwrîption réverse
a éte effectuée à 37OC avec la Super Script II RNase H-Réverse Transcriptase (Gi BR.) et les
oligonucléotides complémentaires JB-2. Des smpIifications de l'ADN complémentaire par PCR
de type touchdown ont été faites avec 1'AmpiiTaq DNA polymérase (Roche), du [ a 3 2 ~ ] d ~ ~ ~
(Amenham) et avec les oligo JB-1 et JB-2 sur un DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer). Les
programmes de PCR en touchdown avaient une tempirature de dénaturation de 94OC et une
14 L température d'élon&on de 72OC ci- une m h t e à chacun d a cycles. Un programme avait
une température d'hybridation des oligonucléotides passant de 71°C à 50°C, un autre de 65°C à
50°C et l'autre de 50°C à 35°C. Chacune de ces températures avait une durée de 1 minute. Puis
25 cycles avec une température d'hybridation a 50°C ont suivi chanin des cycles en touchdown.
Les produits d'amplification PCR ont été vérifiés sur gel d'acrylamide-Bis 38:Z. Nous
avons mélangé 10 mi acrylamide-Bis 38:2 et 5 ml TBE 10X (0.2 M Tris-base, 0.03 M acide
borique, 0.02 M NarEDTA), puis avons complété à 50 mi avec de I'H20 bidistillée; nous avons
ajouté 500 pl dYAPS 10 %, et 30 pi de TEMED. Un marqueur moléculaire a été préparé par la
digestion de 3 cig pBluescript@ II KS avec 1 pi de Mspl ( P h a d ) . Les échantilions ont misé
C! à 200 volts durant une heure puis le gel a été coloré au bromure d'érhidium durant 15 mimites. Le
gel a dors été observé aux U.V. a les bandes d'ADN d'intérêt ont été récupérées directement à
partir du gel.
22. ÉLUTION DES BANDES D'ADN ET CLONAGE
Les morceaux de gel contenant une bande d'ADN ont été coupés en petits morceaux et
éluécs avec 450 pi de tampon d'eiution (10 mM tris / 1 mM EDTA 1 100 rnM NaCl). durant 2 h
sur agitateur à plateau basculant à la température de la pièce. Les bandes d'ADN éluées ont
ensuite tté consemées à 4OC. Ces bandes ont été extraites au phénollchiorofome a elles ont ité
insérées dans un site EcoRV du vecteur pBluescriptC9 II KS (250 ng), qui avait subi un traitement
3 à la Taq ppolymérase (Marchuk & ai., 1990). La ligatioa a été eEectuée durant la nuit dans un bain
d'eau fioide a 1 SOC avec la T4 ADN iigare (Phannacia).
23. TRANSFORMATION
Une transformation a été effectuée avec 15 pl des différents produits de ligation dans 200
pl de cellules compétentes E-wii (INVaF') (DH 5 ) par une incubation de 30 min. sur glace suivi
d'un choc termique à 42°C durant 2 min. Certt pi de milieu de culture LB (10 g Bacto-triptone, 5
g Bacto-Yeast, 5 g NaCl dans 1 L d'eau bidistiilée, pH ajusté à 7 avec NaOH) ont éte ajoutés,
puis les celiuies transformées ont été incubées dunint 1 h à 37OC. Cent pl des différentes
transformations ont été étalés sur agar contenant du LB, 50 mg/ml ampicdine, de I'IPTG et du X-
Q GAL a incubés durant la nuit a 37°C. Dix domes bianches de chaque transformation ont été
piquées, ensemendes dans 3 mi de LB et incubées durant la mît à 37°C. Une digestion avec des
enzymes de restriction a permis de vérifier la présence de fkgments insérés. L'ADN
correspondant aux bandes obtenues par PCR inséré dans les vecteurs a été purifie par le système
de purification d'ADN minipreps WIZARD (Promega).
24. SYSTÈME DE PURIFICATION D'Am MIMPREPS WIZARD
1- Production d'un lysat clair
Trois ml de culture bactérienne ont été centrifirgés à 13000 x g durant 2 min dans un
Eppendorf. Le culot a été resuspendu dans 200 pl de solution de resuspension (50 mM Tris-HC1
- 4 pH 7.5, 10 mM EDTA 100 &ml Rnase A), et 200 pl de solution de lyse (O.2M NaOH, 1% -
SDS) ont été ajoutés et mélangés. Puis 200 pi de solution de neutralisation (2.55 M KOAc pH
4.8) ont été ajoutés et mélangés. Les Eppendorfs ont été centrifilgés à 13000 x g durant 5
minutes.
2- Purification du plasmide
Un mi de résine de purification d'ADN minipreps Wuard Promega) a été ajouté aux
surnageants et mélangé par inversion. Des minicolomes ont été préparées avec des seringues de 3
ml auxquelles les mélanges ADNfrésine ont été ajoutés. Les mélanges ont été poussés dans la
colonne puis lavés avec 2 ml de solution de lavage. Les minicolornes ont été transférées a des
Eppendorfs puis Centriftgées a 13000 x g durant 20 sec. pour sécher la colonne. Les
mlliicolonnes ont été transferées a de nouveaux Eppendorfs. Cinquante fl HzO stérile ont été
-4
a, appliqués aux rismes durant 1 minute' puis les minicolonnes ont été centrifùgées 20 sec a 13000 x
g. L'ADN récupéré a été gardé à 4OC.
25. SEQUENÇAGE (Sequenase Version 2.0 DNA sequencing Ka Amersham)
Les échaatiI1ons d'ADN purifiés ont été dénaturés et ont été dilués dans un volume total de
54 pi. Six pi d'une solution 2 M de NaOH naichement préparée ont &é ajoutés et les échantillons
ont été incubés durant 5 min à h tempirature de la pièce. Quarante-huit pl de MtOacétare 2.5
m M pH 7.5 et 300 pi d'éthanol 100 % fkoid ont été ajoutés et les é c h d o n s ont été incubés 10
min dans la glace sèche. Ils ont été centrifùges durant 15 min a 13000 x g et les culots ont été
lavés avec 200 fl éthanol 70%. Les d o t s ont été dissous cians 7 pl H20, 2 pi de tampon de
sequenase, 1 pi d'amorce T3. L'ADN a été chauffé à 65°C durant 2 min, afm de permettre
l'hybridation de l y ~ o r c e et refroidi I la température de la pièce jusqu'à V°C. Cet ADN a été
marque au [a035 S] dATP (Amersham). Puis les réactions de séquençage ont été &éctuées avec
la sequenase à 37PC durant 10 minutes pour chaque didéoxynucléotide (ddNïP). Elles ont été
séparées sur un gel de séquençage (6% urée 7 M). Le gel a &é exposé durant 24 heures sur
automdiogramne de 35 X 43 cm (Kodak).
26. LiBRAIRIE D'ADNc D'INTESTIN GRÊLE HUMAIN 5'-STRETCH PLUS
Une librairie d'expression d'ADNc d'intestin grêe humain 5'-STRECH PLUS clone dans
le vecteur Xgtl 1 a été criblée avec l'anticorps MIM-1/39 polyclonai. Le titre de la librairie de
21 O' pfiumi a d'abord été vérifié de la manière suivame.
Une panie de la hirairie a été diluée 10~' dans l'eau bidistillée. Cette dilution a seni de
solution de dépmt pour les dilutions subséquentes. La librairie a été copservée à -80°C. La
solution de départ 10-' a été diluée 1/10 a six reprises pour obtenir des dilutions 10-', W3, 104,
1 O", 1 od, 10.'. Des bactéries Y 10%- ont été infectées comme suit:
A) 1 pi de la dilution 1 o4 dam 200 pi Y IOgOr- + 1 o4
B) 1 pl de la dilution IO-' daas 200 pl Y lO9Or- + IO-'
C) 1 pl de la dilution l ~ ~ d a n s 200 pi YY1090r-+ 106
D) 1 pl de la dilution 1 O-' dans 200 pi Y lO9Or- +
Préparation des bactéries Y109W: 10 des bactaies Y1090r- ont été ajoutés à 45 ml de milieu
LB contenant 10 rnM de MgS04 du d t o s e 0.2% a 100 @ml d'ampicüline d incubés durant la
nuit à 37'C avec agitation. Les bactériophages ont été mis en présence des bactéries rapidement
et incubés dunuit 20 min à 37OC. Quatre ml d'agar de surfâce (0.7% Agarose type I I . (S ip )
dans du milieu LB) ont été ajoutés aux bactéries infectées. Cet agar de d a c e a été étendu sur
pétri contenant une couche d'agar de fond (1.5 % Agar @ifbu) dans du milieu LB avec 500 mg/L
d'arnpiciline). Les pétris ont été incubés à 42OC jusqu'à I'apparition des plages. Le nombre de
plages a été compté et titré avec la formule suivante: p W d = # plaquedpi utilisés X f-r de
dilution X ~d pVd. La dilution 104 a été utilisée pour fàke le criblage. Afin d'obtenir 300000
plages sur un Pétri de 22.5 X 22.5, 2 ml de bactéries Y1090 ont été infectées par une quantité de
la dilution lo4 de la librairie d'expression. Par la suite 50 ml d'agar de Jurface ont été ajoutés et le
tout a été étendu sur grands Pétris qui ont été incubés à 4Z0C jusqu'a l'apparition des plages. Une
membrane de nitroceUulose (Hybond-C, Arnersham) préalablement saturée dans une solution de
10 mM I'IPTG et séchée, a été appliquée sur les Pétris puis incubée à 37OC durant 5 heures. Les
Q membranes ont été retirées déiicstememt puis r i n h dans du PBSlfween 0.05%. Elles ont été
bloquées toute la nuit dans du Blotto 5%/ PBS/ Tween 0.05% puis lavées 2 fois au PBSRween
0.05%. Elles ont été incubées pendant 90 min avec le MIM-1/39 P IROOOO dans du Blotto
5%1PBS/cTween 0.05% puis lavées 2 fois 10 min avec du PBS 1X Eks ont été incubées avec
l'anticorps secondaire de chévred-iapin IgG-ALP lnOûû dans du Blotîo 5 W B S durant 1
hane puis lavées au PBS 1X 2 fois 10 min, au PBSITween 0.05% 3X 15 min, au PBS 1X 5 min,
et au Tampon ALP 5 min. Elles ont été révélées avec 300 pl de réactif A (600 mg
Ninobluetetrazoliun/20 ml N,N-Dinictyiformamide 70 %(Fisher D131.1)) et 300 pi de réactifB
(300 mg 5-Brorno4Chloro-3-Indoiylphosphatd20 ml N.N- DimétyIformamide 100 %) dans 30
mi de tampon ALP (0.1 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCh.6H20). Les colonies positives ont été
conservées à 4OC dans 1 ml de tampon SM (50 mg gélatine, 1 g MgSOc 2.9 g NaCl, 12.5 ml Tris
2 M pH 7.5. dans a 500 ml) auquel a été ajoute une goutte de chloroforme. Les colonies positives a ont été titrées comme decrit plus haut. Chaque colonie positive a W ensemencée par infection
des Y109ûr- à confiuence sur des grands Pétris. Chacune des wuches d'agar de d a c e
contenant les dones a été réculté avec 15 ml de tampon S M Ces agars ont été incubés à 37OC
durant 2 heures puis centrifugés à 5000 x g afin de récupérer dans les sumageants les phages
lambda contenant les clones. L'ADN des virus lambda contenu dens les surnageants a été purifié
par un Kit Lambda (Qiagen). L'ADN des phages launbda de chacun des clones a été rempendu
d. 30 pl d'eau stérile. Les ADNc intestinaux ont éte ampiifiés par PCR avec les
oligonucléotides sens adsens du phage Âgt 1 l situes de part a d'autre du site d'insertion de ces
ADNc-
27. IMhiUNOBUVARDAGE WESTERN
Tous les échantillons liquides qui ont été analysés par mimunobwardage ont été solubüisés
dans un volume de tampon de solubüisation 2X (1.25 ml Tris-HCl pH 6.8 1M, 4.6 ml SDS 10 %,
2 ml giycéro1 100 %, 40 pl BPB 0.5 %, 12.1 1 ml Ha) tandis que les culots I'ont été avec le 1X
(2.5 ml Tris-HCI pH 6.8 1 M, 9.2 d SDS 10 ?%O, 4 mi gIycér01 100 %, 80 pl BPB 0.5 %, 2.5 ml
Réparation des gels :
Gels de t v w aLaemmllu
AcrylBis
30:00.8 Tris 8.8
1
Tris 6.8
I Agiter delicatament et transvider entre les plaques de verre I
1
Persulf.
TEMED
Vol fin. 1 5 ml 1 20 ml 11 40 ml 1 BO ml 1 40 ml 1 80 ml ( 40 ml 1 80 ml
Overlay
-
O. 75 -
Tous les gels oa migré avec le tampon d'électrode suivant: 0.1% SDS, 0.192 M glycine et
H20 4.4 14.74
SDS 0.05 0.20
0.025 -
0.025 M Tris. Et k ont tous été transférés sur une nitroceHulose (Amedam) durant 90 min à
Entassement 4%
2.66
- 2.50
100 volts dans un tampon de tr811Sfert (3 M giycine et 0.4 M Tris). Les membranes ont été rincées
- Dérsaérer 10 min sous vide - Ajouter lentement et dans l'ordre les solutions suivantes
dans du PBS/Tween 0.05% puis bloquées toute la nuit dans du Blottol Ph/ PBSI Tween 0.05%.
gel sdparateur
0.10
0.10
16.10
0.40
21.40
0.40
32.20 3
0.80
18.70
0.40
42.80
0.80
1~10%
13.30
10.00 -
37.40
0.80
1 ~ 6 %
8.00
10.00 -
0.10
0.02
2 ~ 1 0 %
26.60
20.00 I - 1
1 ~ 8 % 10.70
10.00 -
2 ~ 6 % j6.W
20.00 -
2x8016 21-40
20-00 -
0.20
0.04
0.20
0.04
0.20
0.04
0.10
0-02
0.10
0.02
9. Elles ont et6 i a v k 2 fois avec du PBSRween 0.05% puis incubées avec le MM-1/39
monoclonal 1/10 ou polyclonai I/300ûû dans du Blotto 100?/PBS/Tween 0.05% duraat lh30.
Elles om été lavées 2 fois 10 min avec du PBS 1X puis incubées avec l'anticorps secondaire de
ch&re-anti-lapin IgG-ALP 1/3000, dans du Blotto lû?/o/PBS durant Iheure. Eues ont été lavées
avec du PBS 1X 2 fois 10 min, du PBS/Tween 0.05% 3X 15 min, du PBS 1X 5 min, et du
tampon ALP 5 min mes ont été révélées avec 300 @ de réacnfA a 300 pi de réactifB dans 30
ml de tampon ALP.
A) Immuno~réci~itation de la GP39 à ~artir de sunumeants d'homo~énats de
pancréas et de duodénum de souris nar des billes d'aparose.
Le but était d'immunoprécipiter spécifiquement la GP39 en quantité sufnsamment
importante pour en effecnier le séquençage. Le principe de cette technique repose sur la
formation d'un complexe billes d'agarose-anticorps primaire-anticorps secondaire-antigène. Nous
avons utilisé I'anticorps MIM-1/39 polyclonal produit chez le lapin en tant qu'anticorps
,-g 9
secondaire et les surnageants d'homogénats de pancréas et de duodénum de souris comme source
d'antigèm. Cette approche a été effectuée à cinq reprises.
L'imunoprécipitation de la GP39 a été verSée par transfert Western (fig. 1 a et b). On
observe une bande de 350 kDa correspondant à la protéine GP39 dans I'homogénat, dans le d o t
et dans le surnageant (pistes 1-3) de I'homogém de pancréas (a) et de duodénum @). il s'est
avéré que l'antigène se retrouve également dans un contrôle négatif(fig. 1 a et b piae 6) où il a
été immunoprécipité par les billes sans qu'a n'y ait eu complexe avec Santicorps MIM439. De
plus, il n'y a pas d'immunoprécipitation spécifique de la protéine par le complexe
d'immunoprécipitation (fig 1 a et b piae 7) puisque l'on observe un fort bruit de fond.
Figure 1. Détection oar transfert Western de la GP39 imrnunoprécipitée sur billes
d' Agarose.
A) A partir du surnageant d'un homogénat de pancréas et B) de duodémun de souris
comme source de GP39,
L'anticorps MIM439 pobclod recounaît une bande de 350 kDa dans Ies pistes i , 2 ,3 ,
6, 7, 8, IO et 11 en A) et dans les pistes 1, 2'3, 6 et 7 m B). Marqueurs : Myosine 199 kDa, P-
galactosidase 120 ma, albumine du sérim Bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Homogénat de pancréas (A) ou de duodénum (E3) de souris (-1 %).
Piste 2: Culot d'homogénat de pancréas (A) ou de duodénum (B) de souris (-2 %).
Piste 3: Sumageant d'homogénat de pancréas (A) ou de duodénum (B) de souris (-1 %).
Piste 4: Bues d'agarose (contrôle négatif) (A et B) (-2.5 %).
Piste 5: Billes d'agarose + M M 4 3 9 pobcional (controle négatif) (A et B) (-2.5 %).
Piste 6: Billes d'agarose + Surnageant d'homogénat (controle négatif) (A et B) (-2.5 %).
Piste 7: Biîies d'agarose + MIM- 1/39 + Surnageant d'homogénat (A et B) (-2.5 %).
Piste 8: Surnageant (piste 6) traité au D-mercaptoéthanol (A et B) (-2.5 %).
Piste 9: Culot (piste 6) traité au Bmercaptoéthanol (A et B) (-2.5 %).
Piste 10: Surnageant (piste 7) traité au Bmercaptoéthanol (A et B) (-2.5 %).
Piste 1 1: Culot (piste 7) traité au &mercaptoéthanoL (A et B) (-2.5 %).
La ~ro~ortion. en oourcentaae. du matériel total anaivsé sur gel DOW chaque oiste est indiouée
&n-oi~se.
B) hmuno~réci~itation de la W 3 9 a ~ a d r d'un homogénat d'un grattap:e de la
activées avec le MIM-1/39 monoclonal,
Nous avons immunoprécipité la GP39 à l'aide des billes de Sépharose 4B-r activées
et de I'anticorps monoclonal MIM-1/39 plutôt que l'anticorps polyclonal de la technique
précédente. Le surnageant d'un homogénat d'un grattage de la muqueuse de colon de souris a été
utilisé corne source d'antigène. Cette approche a été effemiée une seule fois.
L'immunoprécipitation de la GP39 a été vérifiée par transfert Western (fig. 2 a et b). On
observe une bande de 350 kDa correspondant à la protéine dans l'homogé~t, le surnageant et
'3 dans le dot (pistes 1-3) à partir d9un grattage de I i rnuqueaxw de d o n de souris (fig.2 b) r é d k
par I'anticorps polyclonal. L'anticorps monoclonal (fig. 2 a) ne détecte pas l'antigène dans ce
tissu. Donc, I'antiforps monoclonal lié aux billes de Sépharose n'a pas reconnu et
immunoprécipité la GP39.
Figure 2. Détection Dar transfiert Western de ia GP39 immuno~réci~itée sur billes de
Sépharose 4B-CNBr activées avec le MIM-1/39 monoclonai à ~artir d'un
grattage de colon de souris.
A) L'anticorps monodonal MIM-1/39, B) l'anticorps polydonal MIM-1/39. Billes de Sepharose
4B-CNBr-MIM-1/39 monocionai (B-M) a billes désactivées (B). Marquau~ : Myosine 199 kDa,
P-galactosidase 120 kDa, albumine du sérum bovin 87 kDa a Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
- . . -
Pine 1 : Homogémit d'un grattage de la muqueuse de colon de souris (-1 %).
Piste 2: Sumageant de l'homogénat (-1 %)).
Piste 3: Culot de l'homoginat (-2 %).
Piste 4: B-M + Surnageant. Surnageam du dernier
Piste 5: B-M. lavage après I'immuno-
Piste 6: B + Surnageant. contrôle négatif. précipitation (-2.5 %).
Piste 7: B.
Piste 8: B-M + Surnageant. Surnageant après chauf-
Piste 9: B-M. fage a 100°C avec B-
Piste 10: B + Sumageam. contrôle négatif. mrcaptoéthanol(-2.5 %).
Piste 1 1 : B.
Piste 12: B-M + Surnageant. Culot (billes) après
Piste 13: B-M. chauffage à 100°C
Piste 14: B + Surnageant. contrôle négatif. avec B-mercapto-
Piste 15: B. éthanol (-2.5 %).
C) Immuno~récipitation de la GP39 a oartir du surnageant d'un homonénat de
pancréas de souris sur des billes ~rotéine A-Sépharose.
La protéine A-Séphasox fotme un cornplate avec Pantiwrps polyclonaI MlM439. .Le
surnageant d'un homogénat de pancréas de souris a été utilisé comme source d'antigène. Cette
approche a été &ectuée à deux reprises. H
L'immunoprécipitation de la GP39 a été vérifiée par transfert Western (fig.3). On observe
une bande de 350 kDa correspondant à la protéine dans I'homogénat (piste l), et dans
I'homogénat dénaturé ou non après pré-absorption sur les bines (pistes 2 a 3). On observe
également cette bande dans les contrôles négatifs (pistes 7-9) et dans le tampon de lavage des
4 bilies (pistes 4 et IO), ce qui indique qu'a y a une perte de protéines lors des lavages et que la
4 P
GP39 adhère aux billes sans qu'il n'y ait eu d'abord formation d'un complexe avec I'aritiwrps. Le
surnageant et Ie culot des billes après immunoprécipitation montrent une bande à 350 kDa ainsi
qu'une longue train& (pistes 5,6, 1 1 et 12) suggérant une imrmuioprécipitation non spédique.
Figure 3. Détection par transfert Wesrtm de la GP39 Unmuno~réci~itée sur des
billes ~rotéine A-SéDharose à ~ar t i r du sumwearrt d'un homonéaat de
pancréas de souris.
L'anticorps polyclonal MM- 1/39 reconnait une bande de 3 50 kDa dans les pistes 1 à 12.
A= Homogénat non-dénature et B= Homogéaat dénaturé. Marqueurs : Myosine 1 9 9 kDa, B-
gaiactosidase 120 kDa, Aibumine du sérum bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Homogénat de pancréas de souris (-0.25 %).
Piste 2: Homogénat non dénaturé suite au pré-clear, A (-0.25 %).
Piste 3: Homogénat dénaturé suite au pré-clear, B (-0.25 %).
Piste 4: ler lavage après immunoprécipitation, A (-0.3 %).
Piste 5: Surnageant des billes, A (-1 1.1 %).
Piste 6: Culot des billes, A (-1 1.1 %).
Piste 7: 1 er lavage après imrminoprécipitation; contrôle négatif(4.3 %).
Piste 8: Surnageant des billes; contrôle négatif(4 1. l %).
Piste 9: Culot des billes; conaôle négatif (-1 1.1 %).
Piste 10: 1 er lavage après immunoprécipitation, B ( 4 . 3 %).
Piste 1 I : Surnageant des büles. B (-1 1.1 %).
Piste 12: Culot des bues, B (-1 1.1 %).
D) Iminuno~récipitation de la GP39 Dar la anso orbi ne à partir du sumaneant d'un
homonénat de ancréa as de souris.
La pansorbine forme un complexe avec IT8nticorps poîyclonal MM-1/39. Le surnageant
d'homogénat de pancréas de souris a été utilisé comme source d'antigène. Cette approche a été
idilisée à trois reprises.
L'inimunoprécipitation de la GP39 a été vérifiée par transfi Western et au bleu de
Coomassie (fig. 4 A et B). On observe une bande à 350 D a comespondant B la protéine dans le
surnageant d'homogénat avant et après pré-absorption avec la pansorbine (pistes 1-3, fig.4 A).
On obsente également cette bande dans les produits d'bnmmoprécipitation avec 10 et 20 pi de
MIM-1/39 polydonal (pistes 4-5, fig.4 A). L'immunoprécipitation n'est pas spécifique a la GP39
car on note la présence de plusieurs bandes correspondant a d'autres protéines immunoprécipitées
@istes 4-5, fig.4 A et B).
Figure 4. Déteaion par transfért Western et bleu de Coomassie de la GP39
immnuno~récipitée Dar la anso orbi ne à partir du surnageant
d'un homopht de ancréa as de souris.
A: Tramfkrt Western B: Bleu de coomassie
L'anticorps poiyclonal MIM-1/39 recolmait m e bande à 350 kDa daas les pistes 1 à 5 en
A Marqueurs : Myosine 199 kDa, P-gaiactosidase 120 Da, AIbumjne de sénim bovin 87 D a et
Ovaibiunine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Surnageant d'homogénat de Pancrias de souris (PS) (-O. 1%).
Piste 2: PS suite a la pré-absorption avec la Pansorbine (4.3%).
Piste 3: PS suite à la pré-absorption avec la Pansorbine (4.3%).
Piste 4: Produits d'immunoprécipitation avec 10 pi de M M 4 3 9 polycIonal(4.4%).
Piste 5: Produits d'immuaoprécipitation avec 20 pi de MIM-1/39 polyclonal(4.4%)).
La GP39 a été purifiée par élecaOIé1ution a partir d'un ensemble de 13 bandes de gel SDS-
PAGE coupées i la hauteur de migration de 350 kDa de la -39 a partir d'un homogénat de
pancréas de souris. Cette approche a été effectuée à une dizaine de reprise afin de purifier un
maximum de la GP39 pour différentes annalyses ultérieurs de séquençage a de deglycosylation
La purification de la GP39 a été vérifiée par transfert Western (fig. 5). On obsewe une
bande de 350 D a dans l'homogénat , dans le sumageant a dans les protéines éluées (pistes 1-3).
Ii y a deux bandes à 330 et 350 kDa présentes dans l'homogénat et le surnageant tandis que seule
la bande à 350 kDa est présente dans les protéines éiuées.
Figure 5. Détection Dar fransfert Western de la GP39 éiectro-éIuée a aartir d'un
homo~énat de pancréas de souris.
L'anticorps polyclonal reconnaît une bande a 350 kDa correspondant à la GP39 dans les
pistes 1-3. Marqueurs : Myosine 199 kDa, p-galactosidase 120 kDa, Albumine de sérum bovin 87
kDa a Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Pute 1: Homogénat de pancréas de souris (-0.05%).
Piste 2: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (4.025%)
Piste 3: Proté'l~~e~ éluées, GP39 (-0.035%)-
A) vcosvlation chimiaue de la GP39 par TFMS à partir du surnapreant
d'un homoaénat de ancréa as de souris et de motéines GP39 électro-éluées.
Le TFMS est un acide organique. Ce réa= introduit par Edge et al. (1981) est efficace
pour cliver les liens O-glycosylés. L'utiGdon de ce réactif avait pour but de vérifier s i le GP39
est une giycoprotéine avec des liens O-giycosylés. L'essai a été efféctué sur la GP39 contenue
dans le surnageant de I'homogénat de pancréas de souris et nu la protéine purifiée par électro-
dution Cette approche a été effectuée à deux reprises.
La dégiycosylation chimique de la GP39 a été vérifiée par transfert Western (fig.6 A). On
observe une bande de forte intensité à 350 kDa correspondant a la GP39 dans le surnageant de
l'homogénat de pancréas ainsi que dans les protéhes GP39 éluées (piste 1 et 3) qui ont seM de
cuntrôle négatif de la réaction. On observe une autre bande de plus h%Ie intensité à environ 245
kDa correspondant à la GP39 dans ces mêmes pistes. On observe la bande de 350 D a
beaucoup plus faiblement dans le surnageant d'homogénat et dans les protéines éluees ayant subi
la d6gIycosylation (pistes 2 et 4). La bande de 245 kDa n'est pas présente suite à la
dégiywsylation ; par contre, une nouvelle bande à 225 kDa est présente dans ces deux pistes.
L'enzyme N-Gtycosydase F dégiycosyle tous les oiigosacc~des des deux classes liés a N
soit les mannoses prédominants a les complexes. Cette enzyme a été utilisée afin de vérifier le
taw de glycosylation de type N de la GP39. L'essai a été effectué sur la GP39 purifiée par
électro-élution. Cette approche a été effectuée à deux reprises.
La dégiycosylation enzymatique de la GP39 par la PNGase F a été vtkifiée par transfert
Western (fig. 6 B). On observe une bande à 350 kDa correspondant à la GP39 dans les protéines
'5 éhées (piste 1). ob-e une bande I environ 260 kDa correspondant à la GP39 dégiycosylée
(piste 2). Les oligosaccharides de type N fiés représentent 70 kDa du poids de la protéine.
Figure 6. Détection par transfert Western de la GE39 dM~cosvIée chhiquement (TFMS]
et v a t i a u e m e n t M-Glvcosidase E7 à ~ a r t i r du sumapeant d'un homonénat - de h ancré as de f souris et de GP39 purifiée par électro-éIution.
A) L'anticorps polyclonal MIM-1/39 r e c o d t une bande à 350 kDa dans les pistes 1 à 4,
une bande a 245 kDa dans les pistes 1 et 3 et une bande à 225 kDa correspondant à la GP39 dans
les pistes 2 et 4. Marqueurs : ~Myosine 199 kDa, p-gdactoSdase 120 kDa, Albumine de sénim
bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa @fie O).
Piste 1 : Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (PS).
Piste 2: PS dégiycosyié.
Piste 3: Protéines GP39 élecso-eluées (PE).
Piste 4: PE déglycosylées.
B) L'anticorps polyclonal MIM439 reconnaît une bande à 350 kDa correspondant à la
protéine intacte dans la piste 1. II reconnaît me bande à 260 kDa correspondant à la GP39
dégiycosylée dans la piste 2.
Piste 1: Protéines GP39 électro-éIuées (PE).
Piste 2: PE déglycosylées.
4. CHROMATOGRAPHIE D'AFFDK&.
A) Purification de la GP39 à partir du surnageant d'un homo~énat de ~anaéas de
souris Dar cbromatopraphie d'aninite sur h t i l leçtine-marose.
La source de Lentil lectine est Lens mlimsS Seuiement certaines glycoprotéines de type
N-glycosyiées avec des oligosaccharides wmplexes bi a t r i - d e s et possédant un résidu hcose
a 1-6 sur le N-aCétyIglucosamine, peuvent être liées a cette lectine (Cummings, 1994). Le
surnageant d'homogenat de pancréas de souris a été utilisé comme source de GP39. Cette
approche a été effectuée a trois reprise.
La purification par chromatographie d'-té sur Lentil lectine-agarose a été vérifiée par
transfert Western (fig. 7). On obsewe une bande à 350 kDa correspondant à la GP39 dans
I'homogénat, le culot et le surnageant de I'homogénat de pancréas de souris (pistes 1 a 3) ahsi
que dans les 16 premières fiactions de 1 mi récoltées après I'appiication du tampon d'élution
(piste 4 à 12). Une autre bande à 170 kDa est égaiement observée dans Les haions d'iilution
(piste 4 à 12).
Figure 7. Détection Dar transfert Western de GP39 ~urifiée ~ a t chmatoszra~hie
d'affinité avec Lena lectine-anarose à partir d'un homogénat de
pancréas de souris.
L'anticorps polyclonal MIM-1/39 reconnaÎt une bande à 350 kDa dam les pistes 1 à 12
correspondant a la GP39 et une bande à 170 kUa dans les pistes 4 à 12. Marqueurs : Myosine
199 kDa, P-galactosidase 120 kDa, Albumine du sérum bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa
(Piste O).
Piste 1: Homogénat de pancréas de souris (-0.2%).
Piste 2: Culot d'homogénat de pancréas de souris (-0.5%).
Piste 3: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (-0.2%) .
Piste 4: Fractions 1 et 2 suite a l'elution de la colonne (-2.2%).
Piste 5: Fractions 3 et 4 suite à I'élution de la colonne (-2.2%).
Piste 6: Fractions 5 et 6 suite à i'élution de la colonne (-2.2%)).
Piste 7: Fractions 7 et 8 suite a I'éhition de la colonne (-2.2%).
Piste 8: Fractions 9 et 10 suite à I'élution de la colonne (-2.2%)).
Piste 9: Fractions 11 et 12 suite à l'élution de la colonne (-2.2%).
Piste 10: Fractions 13 et 14 suite à I'élution de la colonne (-2.2%).
Piste 1 1 : Fractions 15 et 16 suite B l'élution de la colorne (-2.2%).
Piste 12: Fractions 17 et 18 suite à I'élution de la colorme (-2.2%).
B) Ruincation de la GP39 à Dsrtir du a~aaeant d'un homo~énat de ancréa as de
La source de Concanavalin A (Con A) est Cbma&z mftomis. Les Blycoprotéines de
type N-glycosylées aveç oligosaccharides complexes b i - 4 6 s ainsi que les oligosacchandes a
mannose prédominantmybndes sont liés a la ConA (Cummings, 1994). Le surnageant
d'homogénat de pancréas de souris a été utiiisé comme source de GP39. Cene approche a été
effecttlée une seule fois.
La purification par chromatographie d'atnnité sur ConA agarose a été vérifiée par transfert
Western (fig. 8). On observe w bande a 350 kDa correspondant à la GP39 dans l'homogénat, le
5 culot a le sumageani d'homogénat de pancréas de m u i s (piste 1 à 3). Cme bande n'est pas -
obsenée dans les 60 premières fractions de 1 ml suivant I'élution de la colonne (pistes 4 à 15).
On observe une bande à 170 kDa dans ces fiactions (pistes 4 a IS), bande égaiement présente lors
de la chromatographie d'afsnité avec Lentil lectine agarose.
Figure 8. Détection par transfert Western de la GP39 purifiée Dar chrornatopra~hie
d7atFNté avec la ConcanavalUi A anarose 8 partir du m e a n t d'un
homoaénat de ancréa as de souris.
L'anticorps polyclonal M M 4 3 9 reconnaît une bande à 3 50 kDa correspondant à la GP39
dans les pistes 1 à 3 et une bande à 170 kDa dans les pistes 4 à 15. Marqueurs : Myosine 199
ma, P-gaiactosidase 120 kDa, Albumine du sém bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Homogénat de pancréas de wuris (4.2%).
Piste 2: Culot d'hornogénat de pancréas de souris (-0.5%).
Piste 3: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (-0.2%).
Piste 4: Fractions 1 à 5 suite a I'éI~itioo de la c o l o ~ e (-1.7%).
Piste 5: Fractions 6 à 10 suite a l'élution de la colorne (-1.7%)).
Piste 6: Fractions 1 1 à 1 5 suite a I'élution de la colonne (-1 -7%).
Piste 7: Fractions 16 à 20 suite à I'élution de la cofome (-1 -7%)-
Piste 8: Fractions 2 1 à 25 suite à I'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 9: Fractions 26 a 30 suite à l'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 10: Fractions 3 1 ii 35 suite à I'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 1 1 : Fractions 36 i 40 suite à I'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 12: Fractions 4 1 a 45 suite a l'élution de la colonne (-1 -7%).
Piste 13: Fractions 46 à 50 suite à I'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 14: Fractions 51 à 55 suite à l'élution de la colonne (-1.7%).
Piste 15: Fractions 56 à 60 suite à l'élution de la coIome (-1. PA).
C) Purincation de la GP39 à odr du ~urna~lte8nt d'un homopénat de pancréas de
La source de Jacalin lectine est Artocaipus htegnfIia leaine. Cette lectine se Iie aw
structures Gal~l3GaINAc des ~Iigosaccharides k a O a aux résidus =-lié galactosyl terminaux
des autres oligosaccharides (Cummings, 1994). Le surnageant d'homoginat de pancréas de souris
(PS) a été utilisé comme source de GP39. Ceîte approche a été &&tuée à deux reprises.
La purification par chromatographie d'aninité sur Jacalui lectine-agarose a été vérifiée par
transfert Western (fig. 9). On observe une bande à 350 kDa et une bande à 330 kDa
correspondant à la GP39 dans l'homogénat, le culot et le sumaguuit de l'homogénat de pancréas
de souris (pistes 1 à3). Ca deux bander som observées dans Ie tampon TBS récolté après --
l'application de PS à la colonne et daas les hctioas 1 à 9 récoltées après élution de la colonne
(pistes 4 à 7). Seule la banàe à 350 kDa est présente dans les hctions 10 a 33 (pistes 8-15). On
observe une bande à 170 kDa dans les M o n s i à 33 (pistes 1 à 15) comme pour les
chromatographies avec Lentil lectine et ConA
Figure 9. Détection oar traasfert Western de la -39 purifiée mr chromatogra~hie
d'affinité avec Jacalin lectine-astarose a oartir du surnageant
d'un homonénat de ancréa as de souris PSI.
L'anticorps polycIonal M M 1/39 remnaait une bande à 350 kDa (pistes 1 à IS), une à
330 kDa (pistes 1 à 9) correspondant à la GP39, et une à 170 kDa (pistes 1 à 15). Marqueurs :
Myosine 199 kDa, P-galactosidase 120 kDa, Aibumine du Sénirn bovin 87 kDa et Ovalbumine 48
kDa (Piste O).
Piste 1 : Homogénat de pancréas de souris (-0.2%).
Piste 2: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (4.5%).
Piste 3: Culot d'homogénat de pancréas de souris (-0.2%).
Piste 4: Tampon TBS récolté mite à i'application de PS a la colonne.
Piste 5: Fractions 1-3 suite a l'ehtion de la colonne (4.3%).
Piste 6: Fractions 4-6 mite à l'élution de la donne (-0.3%)).
Piste 7: Fractions 7 - 9 d e à I'élution de la colonne (4.3%).
Piste 8: Fractions 10- 12 suite B l'elution de ta coionne (-0.3%).
Piste 9: Fractions 13-15 suite à I'élution de la colonne (-0.3%).
Piste 10: Fractions 16-1 8 d e à Mution de la colonne (4.3%).
Piste 1 1 : Fractions 19-21 suite à l'élution de la c o l o ~ e (4.3%).
Pistel2: Fractions 22-24 suite a l'élution de la colonw (4.3%).
Piste 13: Fractions 25-27 suite a I'élution de la colonne (-0.3%).
Piste 14: Fractions 28-30 suite à I'élution de la colonne (-0.3%)).
Piste 15: Fractions 31-33 suite à I'élution de la coloune (-0.3%)).
D) Purification de La GP39 à ~ a r t i r du surnageant d'un homoaénat de ancréa as de
souris P S I ~ a r deux chromate-graphies d'affinité CO-es sur
on ose.
La double chromatographie sur ConA puis sur Lentil lectine avait pour but d'éiiminer la
bande de 170 I(Da Cette bande est retenue par ces deux lectines tandis que la bande de 350 kDa
correspondant a la 8 3 9 n'est pas retenue par la C o d - Cette approche a été effectuée à trois
reprises.
La purification de la GP39 par ces chromatographies a été vérifiée par traflsfert Western
(fig 10). On observe une bande a 350 kDa et à 330 kDa correspondant à la GP39 daas
I'hornogt5naf le culot et le airnageant de I'homogénat de pancréas de souris (pistes 1-31. On 4-
observe aussi la bande a 350 kDa, à faible intensité après elution de la coIonne ConA (piste 4) et
suite au passage du produit d'élution de ConA sur Lentil leaine (piste 5). La bande à 3 50 kDa
cornespondant à la GP39 est a peine perceptiile dans les fiactions 1 à 10 de la deuxième
chromatographie sur Lentil lectine (pistes 6 à 10).
Figure 10. Détection par transfert Western de la GP39 ~ d é e par deux chromatopra~hies
d'affinité c o ~ e s sur Concanavalin A et Lentil lectine-anarose à D& du
sumaaeant d'homogénat de pancréas de souris.
L'anticorps polyclonai MïM-1/39 recomaÎt une bande a 350 kDa (pistes 1-5) et une bande
a 330 kDa (piste 1-3) correspondant a la GP39. Mirqueurs : Myosïne 199 kDa, P-gaiactosidase
120 kDa, Albumine du sérum bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Homogénat de pancréas de souris (-0.05%).
Piste 2: Culot d'homogénat de pancréas de souris (4.1%).
Piste 3: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (-O. 1%).
Piste 4: Matériel élué de C o d
Piste 5: Tampon TBS récolté suite au passage sur Lemil lectine agarose.
Piste 6: Fractions 1-2 suite à I'élution de Lentil Iecthaagamse (-0.15%).
Piste 7: Fractions 3-4 suite a l'élution de Lentif lectine-agarose (-0.15%).
Piste 8: Fractions 5-6 suite à I'élution de Lentil lectine-agarose (-0.15%).
Piste 9: Fractions 7-8 suite a I'élution de Lentïl lectine-agarose (4.15%).
Piste 10: Fractions 9-10 suite à l'élution de Lentil leaine-agarose (-0.15%).
Piste 1 1 : Fractions 1 1- 12 suite a I'éIution de Lentil lectine-agarose (4.15%).
Piste 12: Fractions 13-14 suite à I'élution de Lentil lectineagarose (-0.15%).
Piste 13 : Fractions 15-16 suite à i'élution de Lentil lectineagarose (4.15%).
Piste 14: Fractions 17-18 suite a I'élution de Lentil lectine-agarose (4.15%).
Piste 1 5 : Fractions 19-20 suite à i' élution de Leritil lectine-agarose (-0.1 5%).
PANCRËAS DE SOURIS AVEC LE MM-1/39 POLYCLONAL.
La préparation de grains de zymogène est relativement pure. Les grains renferment
l'amigène (Fig 1 1).
Figure I I . Détection de la GP39 Dar i m m u n o c y t o c ~ e a ~ a r t i r du culot d'un
homogénat de oancréas de souris avec le MIM-1/39 ~olvclonalr
L'anticorps utilisé & Ie M M 4 3 9 polyclond. Les grandes intacts sont bien marqués.
6. PURIFICATION DE LA GP39 PAR GRADIENTS DE GLYCÉROL ET DE
SUCROSE A PARTIR DU CULOT D'HOMOGÉNAT DE PANCRÉAS
DE SOURIS,
L'utilisation d'un gradient de 1 % à 30 % de BlycéroI et de sucrose avait pour but de
purifier ta GP39 à partir d'un d o t de I'homogbt de pancréas de souris. L'approche avec le
glycérol a été eEectllée à trois reprises et cele avec le sucrose a été effetuée une seule fois.
La pdcat ion de la GP39 a été vérifiée par transfert Western pour le gradient de glycérol
(fig. 12) et pour le gradient de sucrose (fig. 13). On observe une bande à 3 50 kDa correspondant
à ia GP39 seulement dans le d o t de chacun des gradients (fig. 12, piste 12 et fig. 13, piste 19).
5 Aucune der fkactio& der gradients ne contient cette bande (fig. 12, pista 1 à 11 et fig. 13, pistes - 2 à 18).
Figure 12. Déteaion par W e r t Western de la GP39 ~ t d i é e par -gradient de
glycerol a ~artir d'un d o t d'un horno~énat de pancréas de souris.
L'anticorps polyclond MIM-1/39 reconnaît une bande a 350 kDa correspondant a la GP39
dans la piste 15. Marqueurs : Myosine 199 ma, $-galanosidase 120 kDa, Albumine du sénim
bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1 : Fraaion 1 du gradient.
Piste 2: Fraction 2 du gradient.
Piste 3 : Fraction 3 du gradient.
Piste 4: Fraction 4 du gradient.
Piste 5: Fraction 5 du pdient-
Piste 6: Fraction 6 du gradient.
Piste 7: Fraction 7 du gradient.
Piste 8: Fraction 8 du gradient.
Piste 9: Fraction 9 du gradient.
Piste 10: Fraction 10 du gradient.
Piste 1 1 : Fraction 1 1 du gradient.
Pistel2: CuIot du gradient (-20%).
Figure 13. Détection ~ a r transfert Western de la GP39 ourinée Dar gradient de
sucrose ii ~artir d'un culot d'un homooénat de ancréa as de souris.
L'anticorps polyclod MIM-1/39 reconnaît une bande à 3 50 kDa correspondant à la GP39
dans la piste 19. Marqueur : Myosine 199 kDa, P-galactosidase 120 kDa, Albumine du sérum
bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa
Piste 1: Marqyxs
Piste 2: Fraction 1 du gradient.
Piste 3 : Fraction 2 du gradient.
Piste 4: Fraction 3 du gradient.
Piste 5: Fraction 4 du gradient.
Piste 6: Fraction 5 du gradient.
Piste 7: Fraction 6 du gradient.
Piste 8: F d o n 7 du gradient.
Piste 9: Fraction 8 du gradient.
Piste 10: Fraction 9 du gradient.
Piste il : Fraction 10 du gradient.
Piste 12: Fraction 1 1 du gradient.
Piste 13: Fraction 12 du gradient.
Piste 14: Fraction 13 du gradient-
Piste 15: Fraction 14 du gradient.
Piste 16: Fraction 15 du gradient.
Piste 17: Fraction 16 du gradient.
Piste 18: Fraction 17 du gradient.
Piste 19:. Fraction 18 du gradient.
Piste 20: Culot du gradient (-20%).
7. PURIFlCATION DE LA GP39 PAR DIVERS DETERGENTS À PARTIR
D'UN CULOT D'HOMOGÉNAT DE PANCRÉAS DE SOURIS.
A) Purifiication de la GP39 à ~artir d'un culot d'homoaht de oancréas de souris Dar
diverses concentrations de Triton X-100, de SDS et de manidine. -
L'unlisation des détergents Triton, SDS et gusnidine avait pour but de purifier la GP39 qui
demeure dans le d o t de I'homogénat de pancréas de souris. Cette approche a éîé effectuée une
seule fois-
La purification de la GP39 a été vérifiée par transfert Western (fig. 14). On observe une
bande à 350 kDa a une autre à 330 kDa conespondant à la GP39 dans les sumageants
d'homogénat de pancréas de souris (pistes 1 1 6-7)' dans les sumageants récoltés suite aux essais
des détergents (pistes 8-13) a dans les culots récoltés suite aux essais (pistes 5 et 14-18). Le
SDS à 5 et 10 % possède le meilleur pouvoir de purification comparativement au Triton X-100 et
à la guanidine puisqu'on observe des bandes plus larges a plus intenses (pistes 10-1 1). Plusieurs
essais consécutifs avec le SDS sur un même culot pourraient être utilisés car il reste beaucoup de
GP39 dans les culot après un d essai (pistes 14-1 8).
Figure 14. Détection par transfert Western de la GP39 solubilisée Dar trois
détergents à 5 et 10% CTriton X-100. SDS et manidine) i oartir du
culot d'un homoaénat de ancréa as de souris.
L'anticorps polyclonal MM-1/39 reco-t une bande à 350 kDa et une a 330 kDa dans
les pistes 1 B 18. Marqueurs : Myosine 199 kDa, p-galactosidase 120 ma, Albumine du sérum
bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1,2, 3'4, 6 et 7: Surnageant d' homogénat de pancréas de souris (-0.1%).
Piste 5: Culot suite à l'essai Triton X-IO0 1% (4.25%).
Piste 8: Surnageant Triton X-100 5% (-0.250/0.
Piste 9: Surnageant Triton X-100 10 % (-0.25%)).
Piste 10: Surnageant SDS 5 % (-0.25%).
Piste 11: Surnageant SDS 10% (4.25%).
Piste 12: Surnageant guanidine 5% (-0.25%).
Piste 13: Surnageant guaoidine IO% (4.25%).
Piste 14: Culot suite à i'essai Tnton X-100 5% (4.25%).
Piste 15: Culot suite a l'essai SDS 5% (-0.25%).
Piste 16: Culot suite a L'essai SDS 10% (4.25%).
Piste 17: Cuiot suite a l'essai Guanidine 5% (-0.25%).
Piste 18: Culot suite à I'essai Guanidine 10% (4.25%)).
B) Sohbilisation de la GP39 à mrtir du cuiot d'un homoaénat de ancréa as de
souris Dar Ie déteraent SDS 1û%.
L'utilisation sucassive du détergent SDS 10% sur le cuiot d'un hornogénat de pancréas de
souris avait pour but de solubiliser un maximum de GP39 retenu dans le d o t . Cette approche a
été effectuée une seule fois,
La purification de la 8 3 9 a été vérifiée par transfert Western (fig. 15). On obsente une
bande a 350 kDa et une à 330 kDa correspondant à la GP39 dans le sumagean. d'homogénat de
pancréas de souris (pistes 1-2). On observe la bande a 350 kDa dans les trois suniageants récoltés
consécutivement suite aux traitements avec le SDS 100/o sur le d o t de I'homogénat de pancréas
(pistes 3-81. La de GP39 solubilisée d'un traitement i I'autre va en diminuant.
Figure 15. Détection par transfert Western de la GP39 solubilisée par utilisation
sucessive de SDS 10% sur le culot d'un hornogkat de pancréas de
souris-
L'anticorps polyclonai MiM-1/39 reco~ait une bande à 330 kDa dans les pistes 1-2 et une
bande à 350 kDa daas les pistes 1-8. Ibhrqueurs : Myosine 199 k h , f3-gaiactosidase 120 kDa,
A l b e e du sénun bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (-0.1%).
Piste 2: Surnageant d'homogénat de pancréas de souris (4.1%).
Piste 3 : Surnageant suite au l er traitement au SDS 10% (-0.125%).
Piste 4: Sunageant suite au ler traitement au SDS 10% (4.125%)).
Piste 5: Surnageant suite au 2 ieme traitement au SDS 10% (-0.06%)).
Piste 6: Surnageant suite au 2 ième traitement au SDS 10Y0 (-0.06%).
Piste 7: Surnageant suite au 3 ième traitement au SDS 10% (-0.03%).
Piste 8: Suniagem suite au 3 ième traitement au SDS 10% (-0.03%)).
8. COMPARAISON LES GP39 OBTENUES DU PANCRÉAS DE SOURIS, DE
CHAT ET DE PORC.
La présence de la GP39 a été vérifiée dans le pancréas de chat a de porc avec l'anticorps
polyclonal MIM-1/39 par transfert Western (fig. 16). On observe une bande a 3 50 kDa
correspondant à la GP39 dans le surnageant d'un homogaiat d'un pancréas de souris (piste 1).
On observe une bande à 270 kDa et une à 190 kDa daas I'homogénat de p a a c r h de chat (piste
2). Et deux bandes a 280 mû et 270 kDa dans l'homogénat de pancréas de porc. La protéine est
donc présente dans le p811c~éas chez ces espèces mais avec des poids moléculaires moins élevés.
Egure 16. Détection Dar transfert Western de la GP39 dans le ancréa as de souris de
chat et de porc.
L'anticorps polycloaai MIM-1/39 recoml une bande à 350 kDa dans la piste 1, une
bande a 270 kDa a une autre à 190 kDa dans la piste 2, une bande a 280 kDa et une à 270 kDa
dans la piste 3. Marqueurs : Myosine 199 Da, f3-plactosidase 120 kDa, Albumine du sérum
bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1 : Surnageant d'homogénat de pancréas de souris-
Piste 2: Homogéoat de pancréas de chat.
Piste 3: Homogénat de pancréas de porc.
9. PURIFICATION DE LA GP39 A PARTIR DES GRAINS DE ZYMOGÈNES D'UN
HOMOGÉNAT DE PANCXÉAS DE SOURIS.
Dans le pancréas de souris, Ia GP39 est iocalisée dans les grains de sécrétion Lors de
l'homogénéisation du pmcréas, une hction de cette GP39 est solubilisép dans le surnageant a
l'autre partie demeure dans les grains du culot de I'homogénat. En pinifiant les grains de
zymogène nous voulions concentrer la GP39. Les grains de zymogàes ont d e été lysés avec
EDTA Cette approche a été effectuée une d e fois.
La purification de la GP39 a été vérifiée par transfert Westem (fig. 17). On observe une
bande à 330 kDa a une a 350 kDa correspondant à la GP39 dans I'homogénat de pancréas de
souris @iaes 1 et 5); daas le surnageant des grains (pistes 2 et 6), dans les grains (pistes 3 n 7) et
dans les lysats des grains (pistes 4 et 8). On note qu'une quantité importante de la GP39 est
contenue dans les grains suite à I'homogéne~tion.
Figure 17. Détection Dar transfert Western de la GP39 suite a la purincation des
grains de sécrétion-d'un homoeénat de uancréas de souris.
L'anticorps polyclonal MIM-1/39 reconnaît une bande à 330 kDa et une a 350 kDa
correspondant à la GP39 dans les pistes 1 a 8. Marqueurs : Myosine 199 ma, $-galactosidase
120 kDa, Albumine du sérum bovin 87 kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
k sans inhibiteurs de protéases.
B: avec iabiibiteurs de protéases.
Piste 1 : Homogénat de pancréas de souris, B (-O. I 5%)).
Piste 2: Surnageant des grains, B (-0.01%)).
Piste 3: Grains, B (4.125%).
Piste 4: Grains lysés, B (-0.8%).
Piste 5: Homogénat de pancréas de souris, A (4.15%).
Piste 6: Surnageant des g r a k , A (4.0 1%).
Piste 7: Grains, A (-0.125%).
Piste 8: Grains lysés, A (4.8%).
10. FRAGMENTATIONS ENZYMATIQUES ET CHIMIQUES DE L'ANTIGÈNE
MIM-1/39,
A) Diaestion enzymatique de la GP39 à ~artir d'un hornoszmat de an créas de souris
- par la protexnase K et la si ne.
La source de prote- K est T~tirachiunz album limber- La prote- K est de type
endo et exolytique sérine. Sa spépitité de clivage est -x-?- Y- ou X est non-spécifique
mais les acides aminés aiiphatiques, aromatiques et les autres hydrophobiques sont préférés et Y
est non-spécifique. Cet enzyme effectue une digestion totale des protéines. La trypsine est de
* Q
type endolytiquesérine. Sa spécificité de site de clivage est -x-?-Y-où X est une lysine ou --
une arginine a Y est non-spécifique. Cet enzyrne n'effectue pas une digestion totale. Cette
approche a été effectuée a deux reprises.
La digestion de la GP39 a été vérifiée par m e r t Western (fig. 18). On observe une
bande à 350 kDa correspondam à la GP39 dans I'homogénat de pancréas de souris (piste 1.8 et
15) et dans les quatres dinérentes digestions e f f i é e s par ta trypsine (pistes 3-6). L'intensité de
la bande de GP39 à 350 kDa va en augmentant avec la diminution de concentration de trypsine.
Les hgments de GP39 produits par la digestion avec la trypsine ne sont pas détectés.
L'anticorps ne détecte pas la protéine intacte à 350 D a ni ses hgments dans les quatre essais ou
différentes concemations de prote- K ont été ajoutées, puisque cette enzyme effectue une
digestion totale (pistes 1 0- 13). -
Figure 18. Détection Dar transfert Western de la GP39 digérée par la orotéinase K et
la trynsine.
L'anticorps polyclonal M M 4 3 9 reconnaît une bande a 350 kDa dans les pistes 1,3-6, 8
et 15. Marqueurs : Myosine 199 kDa, $-galactosidase 120 kDa, Albumine du sérum bovin 87
kDa et Ovalbumine 48 kDa (Piste O).
Piste I : Homogénat de pancréas de souris (-1%)).
Piste 2: non utilisée
Piste 3: Digestion de i'homogénat à la trypsine 11500 (-0.15%).
Piste 4: Digestion de l'homogénat à la trypsine 1/1000 (4.15%).
Piste 5 : Digestion de I'homogé~t à la trypsine 111 500 (-0.1 5%).
Piste 6: Digestion de l'homogénat à la trypsine 112000 (-0.15%).
Piste 7: non utilisée
Piste 8: Homogénat de pancréas de souris (-1%).
Piste 9: non utilisée
Piste 10: Digestion de Shomogénat a la protel~lil~e K (0.5 mg) (4.15%).
Piste I 1 : Digestion de I'homogénat à la protéinase K (0.24 mg) (-0.15%).
Piste 12: Digestion de l'homogénat à la protéinase K (0.166 mg) (4.15%)).
Piste 13: Digestion de I'homogénat à la protéinase K (0.125 mg) (-0.15%)).
Piste 14: non utilisée
Piste 15: Hornogénat de pancréas de souris (-1%).
B) Di~estion chimiaue de la GP39 à partir d'un homo~énat de ~mcréas de souris
par le C m .
Le CNBr coupe spicifiquement les Iiaisoas Met-peptide et, dans la plupart des cas,
quantitativemeni, du coté COOH de la Met. La méthionine étant rare dans les polypeptides, ceci
engendre des âagmenîs de taiUes assez importantes (Granner a al., 1989). L'homogénat de
pancréas de souris a été utilisé comme source de -39. Cette approche a été effixtuée a huit
reprises.
La hgmentation de la GP3 9 par le CNBr a été vérifiée par transfert Western (fig. 19 A).
On obsenre une bande à 350 kDa correspondant à la GP39 dans I'homogénat de pancréas de
;j souris (scntr6Ie nég&f) (piste 1). Cme bande n S a par observée dans I'homagér~at digére avec
trois concentrations différentes de CNBr (pistes 29). Par contre trois bandes à 108.80, 57 kDa y
sont observées.
La fragmentation a égaiement été fXte sur la GP39 purifiée par électrWlution à partir de
l'homogénat de pancréas de souris. La protéine entière ainsi que l'échantillon de GP39 traités au
W r ont été purifiés par HPLC en phase riverse puis les fiactions ont été analysées directement
au spectrophotomètre à 230 nm (fig. 19 B, C et D). On observe la formation de deux pics lors du
passage de la GP39 non-traitée au CNBr. Un petit pic apparat à 19.7 minutes a un pic plus
important à 28.9 minutes (fig. 19 B). Le premier wmspondrat à la GP39 de 330 kDa, qui est la
forme présente en plus petite quantité dans I'homogénat de pancréas de souris. Le plus grand pic
correspondrait à la GP39 de 350 ma, forme la plus abonda.uk On observe trois petits pics dans
le contrôle nigatifde la réaaion (fig. 19 C). Le plus petit apparaît a 7.3 minutes, le deuxième
apparaît a 17.2 minutes et le troWème apparaît après à 29 minutes.Ces trois pics s'expliqueraient
par le fiut que le contrôle négatifest dans l'acide formique à 70.h Ce dernier cause un clivage
partiel au niveau des Asp-Pro. Les deuxihe a troisième pics du contrôle négatif sortent aw
mêrnes moments que les fomes de 330 et 350 kDa de la GP39 maÛ en quantité moindre dûe au
clivage par I'acide formique. ûn obsewe deux petits pics à 16.8 et 28.8 minutes correspondant
aux deux formes de la GP39 non-traitée suite au clivage par le CNBr (fig. 19 D). II y a eu clivage
par le CNBr mais les hgments formés ne som pas détectables par HPLC en phase réverse.
Figure 19. Détection de la GP39 suite à une di~estïon chimiaue au CNBr à ~artir
d'un homoaénat de ancréa as de souris.
A) Détection par transfert Western
L'anticorps polyclonai MIM-ln9 reconnalt une bande à 350 kDa dans la piste 1 et trois
bandes à 108, 80,57 kDa dans les pistes 2 à 4. Marqueurs : Myosine 199 kDa, j3-gaiactosidase
120 kDa, Atbtunine du sénun bovin 87 kDa et ûvaibuniine 48 kDa
Piste 1 : Homogénat de pancréas de souris (contrôle négatit) (4.3%)).
Piste 2: Homogénat traité au CNBr (500 mg) (4.3%).
Piste 3: Homogénat traité au CNBr (300 mg) (4.3%).
Piste 4: Homogénat traité au CNBr (100 mg) (4.3%).
B) Détection de la GP39 purifiée par électro-éIution par HPLC en phase réverse.
On observe un pic à 19.7 minutes et un à 28.9 minutes.
C) Détection de la GP39 dans le contr6le négatif de la réaction au (SNBr par HPLC en
phase réverse.
On observe trois pics: à 7.3, 173 et 29 minutes.
D) Détection de la GP39 suite a une réaction au CNBr par HPU: en phase réverse.
On observe un pic à 16.8 minutes et un autre à 28.8 minutes.
Les échantiilons GP39, GP39 en contrôle négatif et GP39 ayant subi une hgmentation au
CNBr, ont &é appliqués a une c o l o ~ e D e h Pack C4 et ont été analysés par un système
SHMADZU EZCHROM DATA, à 230 nm.
C) Diaestionemwmati e de la GP39 a partir d'un homo~énat de ancréa as de
La protéase V8 de S~hyIoicoicc~cs aurm coupe les résidus Glu-X de préf&ence lorsque
X est hydrophobe (Gramer et al., 1989). L'homogénat de pancréas de souris a été utilisé comme
source de GP39 pour la digestion enzymatique. Cette approche a été effectuée à deux reprises.
La digestion a été véri6ée par trandert Western (fig. 20). On observe une bande à 350
kDa correspondant à la GP39 daas i'homogénaî de pancréas de souris (contrôle négatif) (piste 1).
Cme bande n'est pas observée dans l'homogénat digéré par trois wncentrations daferentes de
I'enqme protéase V8 (pisres 24). Plusieurs bandes de plus petit poids moléculaires sont
$ observées dans le m&le oegatif Ces banda r~nuhnit d'une degradation par les protéases
contenues dans I'homogénat puisqu'aucun inhibiteur n'a &é ajouté au tampon de préparation de
I'homogénat- Quatres bandes à 199, 165, 145, 125 kDa sont observées dans I'h~mogénat digéré
avec la moins forte concentration d'enzyme (piste 4). A plus forte concentration enzymatique, il
n'y a que les deux plus petites bandes qui sont observées (pistes 2-3).
Figure 20. Détection de la GP39 Dar transfert Westem suite à wie di~estion
enqmtique avec la rrrotéase V8.
L'anticorps poiyclonal M M 4 3 9 reconnaît une bande à 3 50 kDa dans la pistes 1, deux
bandes à 199 et 165 kDa dans la piste 4 et deux bandes à 145 et 125 kDa daiis les pistes 2 à 4.
Marqueurs : Myosine 199 kDa, Pgdactosidase 120 Ba, Albumine du sérum b o a 87 kDa et
Ovalbumine 48 kDa,
Piste 1 : Homogénat de pancréas de souris, contrôle négatif (-0.15%).
Piste 2: Homogénat traité a la protéinase V8 (188.33 unités) (4.15%).
Piste 3: Homogénat traité à Ia protéinase V8 (94.15 mités) (-0.15%).
Piste 4: Homogénat traité a la protéhase V8 (37.66 d é s ) (4.15%).
D) Diaestion - chimiuue B l'aide d'hydroxvlamim de la GP39 ~urifiée ~ a r électro-élution.
L'hydroxylamiue coupe les liaisons Asn-C2y (Gramer a al., 1989). L'essai de digestion
chimique a été effectue sur la GP39 electrpéluée. Les produits de la réaction ont été purifiés par
chromatographie d'exclusion sur Biogel P-100. Les fiactions recueillies ont été analysées au
spectrophotomètre à 280 nm (fig. 21). Cette approche a été effectuée une seule fois.
Un seul pic est observe dans les fractions de la chromatographie. Ce pic correspond a la
GP39 imacte dans sa forme entière. L7hydroxyIamine ne semble donc pas avoir d'effet wu la
GP39; les liaisons Asn-Gly étant très rarement retrouvées dans h structure des protéines.
Figure 21. Détection de (a GP39 par mectro~hotornétne à 280 MI suite a UR
traitement à i'hvdrowhnine,
L'échantillon de GP39 ayant été traité a 17hydroxyIarnine a été purifié par chromatographie
d'exclusion sur Biogel P-100. Les fiactons de 0.5 ml ont éîé anaiysées a 280 nm au
spectrophotornètre. Un seul pic d'absorption correspondant à la forme intacte de la GP39 est
observé.
miIlili tre
Q : 1 1. PUUFICA'T'IQN DE LA GP39 PAR ÉLECTROPHORÈSE BIDIMENSIONNELLE A
PARTIR DU PANCRÉAS ET DU JUS PANCR~ATIQUE DE SOURIS.
Le but de cette technique était de purifier la GP39 pour ensuite en faire le séquençage. La
purincation de la GP39 par électrophorèse bidimensiomeue (BD) a éîe vérifiée par transfert
Western (fig. 22 A a B). LA forme de 350 kDa de gp39, n'est pas détectée suite a
I'électrophor&se BD a parti. d'un homogénat de pancréas de souris (A). Par conne une bande à
350 kDa correspondant à la GP39 est obsenée lors de I'électrophorèse BD avec le jus
pancréatique de souris @). Cette bande e n située entre les pH 5.76 et 6.77. La quantité de
protéine n'est cependant pas suflisante pour la purifier en électro-élution et la Kquencer. Cette
approche a été effectué a sept reprises.
Figure 22. Détectio~ par transfert Western de la GP39 suite à une electro~horése
bidimensionneiIe B ~artir d'un homo~énat de vancréas ou de ius oancréatime 3 de souris.
A) Hornogénat de pancréas de souris (150 pg de protéines).
L'anticorps polyclonal MIM-1/39 ne détecte pas de bande de 350 KDa correspondant à la
GP39,
B) Jus pancréatique de souris (150 pg de protéines).
L'anticorps polyclonal MIM-1/39 reconnait une bande à 350 kDa correspondant a la
GP39.
Marqueurs : Myosine 199 kDa, 8-galactosidase 120 ma, Albumine du sérum bovin 87 D a et
Ovaibumine 48 kDa
& 12. ESSAIS ANTIBACTÉRIENS AVEC LA GP39.
La GP39 possède une très large distribution chez la souris. Eue est détectée au niveau des
cellules indifférmciées des cryptes intestides et au niveau des glandes associées au tractus
gesao-imestinaIestinaI A cause de sa distribution au niveau des cellules en contact avec le milieu
extérieur, on peut supposer que cette glycoprotiint pourrait avoir un rôle antcbactérien, Nous
avons donc utilisé la GP39 purifiée par éleardlution à partir d'un surnageant d'homogenat de
pancréas de souris pour effectuer des essais sur douze types différents de bactéries.
Les essais préliminaires ont permis de démontrer que la GP39 a un effet inhiiteur sur la
croissance de deux types de bactéries. Premièrement, la GP39 a complètement uihibé la
croissance de S ~ h y ~ l o c o c c u p epidennidis. Les essais sur une même qU8Iitite de bactéries au f
départ n'ont dormé aucune colonie en présence de 5 pg de GP39 pwr 30 colonies obtenues en
contrôle néga* Enfin, la GP39 a réduit de 99% la croissance de Listeria m o ~ u g e n e s
puisqu'une seule colonie a poussée comparativement à la confluence dans les mntrôles negatifj.
6 - 13. BIOLOGIE MOLÉCULAIRE.
La purification d'une quantité importante de GP39 par électro-élution à partir du
suniageant d'homogé~ts de pancréas de souris a permis d'obtenir la s6quence des d o m
premiers acides aminés par le Senrice de Séquence des Protemes de l'Est du Québec. Les doues
premiers acides aminés de la partie NH2 terminale sont les suivants: QELEELNVPGEI. Une
- recherche dans BLAST a dome 10û% d'homologie pour les acides aminés 3 à 12 avec la bêta-
caséine. Deux oiigonucléotides dégénérés7 S7GCGGCCYTNGARGARYïN3 ' et
SYGCTCTAGATYTCNCCNGGN3' ont été synthétisés à partir de cette séquence. Ces deux
oiigonucléotides ont été utilisés en RT-PCR sur I'ARN du pancréas de souris afin d'obtenir les
nudeotides exacts qui correspondent a la séquence d'acides aminés. Une bande de 43 nucléotides
était attendue suite au RT-PCR Environ cinq bandes d'ADN d'environ 43 nucléotides ont été
-5 amplinées RT-PCK Celes-ci om éte purinées et sécpmM. Malheureusement, aucune
d'entre elles ne correspondait parfiaitement à la séquence en acides aminés de la GP39.
14. LIBRAIRIE D'ADNc D'INTESTIN GRÊLE HUMAIN SSTRETCH.
Nous nous sommes tournés vers le criblage d'une librairie d'expression d'ADNc d'intestin
grêle humain S'STRETCH avec le MIM439 polyclonal car la GP39 est exprimée au niveau de
l'intestin humain Le vecteur de construction de la iiibrsine est le phage Xgt 11. Cinq clônes
positifs ont été obtenus a purifiés. Une ampMcation PCR avec les amorces sens et Blltisens
spécifiques au phage de part et d'autre du site d'insertion des ADNc intestinaux a permis
d'amplifier trois des cinq dones (fig. 23, pistes 3 à 5). Ces trois produits de PCR ont des tailles
différentes. Deux d'entre eux ont une taille d'environ 2000 paires de bases et l'autre d'environ
1300 paires de bases. Ces trois produits de PCR seront purifiés puis clônés dans le vecteur
pBluescript@II KS afin d'être ultérieurement siquencis. Les trois séquences obtenues seront
comparées par redierche dans la banques de données tel que Genbank a h d'identifier si ces -
séquences correspondent à des gènes déjà connus ou à des gènes nouveaux.
Figure 23. Détection des ~roduits d'amdification PCR des clônes ~ositifi obtenus
de la hirairie d'intestin bumain,
Les produits d'amplification PCR ont été appliqués sur un gel d'agarose 1% contenant du
bromure d'éthidium Les ~hant3Ion.s ont migré durant 30 minutes à 100 volts puis ils ont été
observés aux U.V.. Les clones 4,6 et 7 ont été ampNés par PCR Marqueurs Lambda digéré
par HUid DI: 23 130 bp, 9416 bp, 6557 bp, 436 1 bp, 2322 bp, 2027 bp, 507 bp.
Piste 1: Marqueur moléculaire Lambda 0.5 pg.
Piste 2: 15 pi de pro& PCR du clône positif numéro 2.
Piste 3: 15 pl de produit PCR du clône positif numéro 4.
Piste 4: 15 pi de produit PCR du cIône positif numéro 6.
Piste 5: 15 pl de produit PCR du clône positif numéro 7.
Piste 6: 15 pi de produit PCR du clône positifmméro 8.
15. LOCALISATION DE LA GP39 CHEZ L'HOMME.
L'amigène GP39 a été localisé dans divers tissus qui sont en contact avec le milieu
extérieur chez l'homme. La protéine a été localisée au niveau des glandes sudoripares (fig. 24 A),
au niveau des parotides (fig. 24 B) et au niveau du duodhum (fig. 24 C) par imrnunofiuorescence
indirecte. La salive Binsi que les lannes ont été adysées par imrnunobwardage Western (fig. 25 /
pistes 2 et 3). La proteme GP39 a été détectée dans ces deux produits de sécrétion- Elle a
également été détectée au niveau de la parotide par immunobuvardage Western (fig. 25 piste 1).
Les tissus humains ont été rendus disponibles grâce à la collaboration du Dr. André Riom Le
protocole avait reçu au préalable l'approbation du comité d'éthique a les fomiulaires de
consentement ont été signés par les patientes.
Figure 24. Localidon par ~ o f i u o r e s c e n c e indirecte de la GP39 au niveau des
plandes sudo~~ares, des parotides et du duodénum de l'homme.
A) Glandes sudoripares de l'homme.
L'anticorps poiycld MIM-1/39 détecte la GP39 au niveau des grains de sécrétion
apicaux dans la giande sudoripare. Il y a quefques inclusions plus volumineuses où la fluorescence
est très intense: la nature de ces organites est inconnue pour i'instant.
B) Parotides de I'homrne.
L'anticorps polyclooal W U 3 9 détecte la GP39 au niveau des granules de sécrétion
apicaux des cellules acinaires.
C) Duodénum foetal & i'homme.
L'anticorps polyclonal M M 4 3 9 détecte Ia GP39 au niveau des grains de sécrétion
apicaux des cellules des cryptes.
Figure 25. Détection de la GP39 au niveau de la narotide. de la dive et des lames
de l'homme par immunobuvardane.
L'anticorps polyclonal détecte une bande à 350 kDa wmespondm à la GP39 dans les
pistes 1 à 3. Marqueurs : Myosine 199 ma, j3-gahctosidase 120 kDa, AIbumine du sérum bovin
87 kDa et OvaIbumine 48 kDa (Piste O).
Piste 1: Parotide humaine.
Piste 2: Salive humaine,
Piste 3: Larmes humaines-
n! DISCUSSION
La glycoprotiiae GP39 possède une très grande distriion au niveau du tractus gastro-
intestinal. Chez la souris, cette protéine est exprimée dans des grandes de sécrétion apicaux des
cellules épithéliales de la s u f h imervüleuse de l'intestin grêle à 17 et 18 jours de gestation;
ensuite son expression est détectée seulement dans les granules de sécrétion des cellules
indifférenciées des cryptes intestinales et coliques depuis la naissance jusqu'à i'âge adulte
(Beaulieu et aL, 1992). La GP39 est également exprimée dans différentes glandes associées au
tube digestif: daas les ceIlda séreuses des glandes liriguaies, sublinguaies, sous-maxiliaires, et
parotides, dans le pancréas, dans les cellules épithélides de la vésicule biliaire ainsi que dans les
grains de sécrétion des cellules principales des a d e s gastriques (Caivert et al., 1993).
- La glycoprotéine GP39 est également retrouvée chez l'homme. Elle est exprimée dans les
cellules épithéliales du duodénum chez le foetus à 18-20 semaines, dans la parotide chez l'adulte,
dans les glandes sudoripares, dans les larmes et la salive. En fkit, tant chez la souris que chez
I'homme, la GP39 est localisée dans divers tissus qui sont en contact avec le milieu extérieur.
Les objeaifs du présent n a d étaient de purifier la GP39 afin d'en f&e le séquençage.
Pour y pawenir, diverses approches expérimentales incluant des techniques
d'immunoprécipitation, de chromatographies d'afnnité, de gradient de sucrose ou giycérol et
d'élecso-élution ont été utilisées.
g, Premièrement, quatre différentes techniques d'immunoprét5pitation ont éte utiiisées avec
les anticorps MZM-1/39 (monoclonal ou polyclonal). Nous avons vouiu immunoprécipiter la
GP39 avec l'anticorps polyclonal sur billes d'-se, sur billes protéine-A Sépharose et avec la
pansorbine, puis avec I'anticorps monoclonal avec des billes de Sépharose 4B-CNBr activées.
Dans chacun des cas d'immunoprécipitaton avec I'anticorps polyclonal, la GP39 n'a pas été
Unmunoprécipitée de manière spécifique. Différentes protéines ont été immunoprécipitées par les
billes même si I'aaticorps MIM439 y avait été fixé au préaiable. II y avait probablemenî des sites
non recouverts d'anticorps sur les biiies permettant à d'autres protéines de s'y fixer. Dans le cas
de I'immwioprécipitation avec I'anticorps monoclonal, le tissu qui a été utilisé comme source de
GP39 était la muqueuse du colon de souris. L'anticorps monoclonai fixé au billes de Sépharose
n'a pas reconnu la GP39 au n i v a du colon et donc n'a pu I'immunoprécipiter.
Ensuite nous avons déglycosylé chimiquement la Gf39 avec le TFMS. Ce réactif;
introduit par Edge et al., (198 l), clive les liens O-glycosylés ainsi que quelques types liés en N.
L ' d y s e en immunobuvardage suite au Mement de la GP39 avec le TFMS démontre
l'apparition d'une bande correspondant à la GP39 à 225 kDa et une diminution en intensité de la
bande correspondant à la protéine intacte à 350 D a . Une déglycosylation enymatique avec la N-
Giywsydase F a égaiement été effectuée sur la GP39. Cet enryme déglycolyse tous les
oiigosaccharides des deux classes liés en N soit les mannoses prédominants a les complexes
(Servant a al., 1996). L'analyse en irnm~~fobwardage suite au traitement de la GP39 par cet
enzyme démontre l'apparition d'une bande a 260 D a correspondant à la GP39 degiycosylée a la
disparition de la bande a 350 kDa correspondant à la protéine intacte. Ces résultats de
C! dégiycosylation ont permis de démontrer que la GP39 est une protéine très glyc0syIée tant dans le
type O que le type N-glycosyle. Donc le poids moléaiiaire du peptide sans oligosaccharides serait
Ces résultats nous ont poussés à utiliser la chromatographie d'afnnité avec trois dinéremes
lectines complexées à des Vies d'agarose comme technique de purification de la -39. La GP39
s'est liée a la Lentil-Iectine, a la Jacdblectine mais non à la Concanavalui-k Par contre, une
autre bande à 170 kDa ne comspondant pas à la -39 a égaiement été détectée par I'aaticorps
MIM439 par irnrnunobwardage suite aux trois chromatographies. Dew chromatographies
consécutives ont été e f f i é e s sur ConA puis sur Lentü-lectine afin d'éliminer-la bande a 170
kDa L'anaiyse en hunobwardage suite à ces deux chromatographies a démontrée la perte de
,.q deux bandes suggemt une dégradation protéique suite à la période de temps trop longue entre le
4
début de la première chromatographie et h fin de la seconde. Ces chromatographies d'&é ont
permis de démontrer que la GP39 est une glycoprotéiie de type N-glycosylée avec des
oligosaccharîdes bi et tri ramifiés qui possèdent un fucose al4 sur le N-acétyigluwsamine
puisque seuls ces ~Iigosaccharides sont retenus par la Lauil-lectine (Cummings, 1994). De plus
cette glycoprotéiw possèàe des oligosaccharides aux structures Galf31-3 Nac liés a O ainsi que
des résidus a-liés galactosyi terminam puisque seuls ces oligosaccharides sont retenus par la
lacalin-lech (Cummitlgs, 1994). La plupart des protéines des membranes qui sont produites dans
le riticulum endoplasmique, incluant celles destinées pour le transport à l'appareil de Golgi, aux
lysosomes, à la membrane plasmique ou à l'espace extraceiiulaire, sont des giycoprotéines. En
contraste, il n'y a que quelques protéines dans le cytosol qui sont glycosylées, et celles-ci portent
C? la fonne le plus simple de sucre soit un simple groupe N-acitylglucosamine qui est additionné à un
résidu sérïne ou thréonine de la protéine. Le type N-glycosylé est le plus retrouvé sur les
glycoprotëies. Moins aéquemment, les oligosacchandes sont liés au groupe hydroxyl sur la
chaûie latérale d'une sérine, d'une thréonine ou d'un acide aminé hydro>ryiisine. Ces types O-
glycosylés sont formés dans I ' a p p d de Golgi (Albert a ai., 1994).
Une immunocytochimie sur le culot d'un homogénat de pancréas de souris nous a permis
de constater que les grains de zymogène qui s'y trouvent sont relativement purs et qu'ils
renferment l'antigène GP3 9. Nous avons utiiisé uo gradient de 1 à 3 û% de glycérol et un gradient
de sucrose afin de purifier ces grains. Dans chacun des cas, les graios sont demeurés au niveau
des culots des gradients. Probablement que les grains de qmogènes sont bien retenus dans le
matériel cellulaire qui doit être sous une forme très visqueuse. Nous avons aisuite utilisé divers
- détergents a différentes concentrations afin de solubiliser ces grains. Le Triton X-100, la
guanidine et le SDS à 5 et 100h ont tous solubilisé une certaine quantité de ces grains mais c'est le
SDS qui a donné le meilleur rendement. L'application d'une solution de SDS a 1% a quatre
reprises a solubilisé un rmxhum de grains retenus dans le culot mais il y avait également présence
d'autres protaDes au niveau des sumageants qui ont égaiement été wlubiiisées par le détergent
SDS. Les grains de zymogène om été purifiés par la technique décrite par Pelé (1976) afin de
concentrer la GP39 suite a une lyse des grains avec I'EDTA La concentration de la GP39
obtenue n'était pas sutfisante pour en fkke le séquençage.
Nous avons voulu aiante purifier la GP39 par électrophorèse bidimensionnelle à partir
Q: d'un homogénat de pancréas a du jus pancréatique de souris. La bande à 350 kDa correspondant
à la GP39 n'a pas été détectée par immunobuvardage dans le cas du pancréas. Par contre elle I'a
été ciam le jus pancréatique mais il n'y en avait pas sufnsammerrt pour la purifier par éiectro-
élution Nous avons finalanent purifié la GP39 en quamité importante par le rassemblement d'une
dizaine de bandes de gel SDS-PACFE coupées à 350 kDa et qui avaient subi une éiearo-élution.
Les 12 premiers acides aminés de la partie M&temiinale ont i té sequencés par le SeMce de
Séquence des Protéines de l'Est du Québec et sont les suivants: QELEEL,NVPGEI. Une
recherche dans Blast a donné 100% d'homologie pour les acides aminés 3-12 avec la bêta-caséine
bovine. La bêta-casé'me est une protéine du lait et elle a un poids moléculaire de 25 kDa (Groves
a Gordon, 1969). La OP39 a un poids moléçulaire de 350 kDa et le peptide a un poids de 225
kDa Il s'agit donc de deux protéines différentes. Une certaine homologie de séquence peut être
possible entre ces deux protémes mais le reste de la séquence de la GP39 reste à être déterminée
et celle-ci présentera possiblement certaines homologies avec d'autres protéines connues à case
de sa taille énorme.
Nous avons également effectué des digestions chimiques (CNBr, hydroxylamine) et
enzymatiques (protéinase Y trypsine a prote- V8) de la GP39 afin de p d e r des fhgmems
permettant de wnnaintre des bouts de la séquence ti l'intérieur de la protéine. Des fragments ont
été générés par ces dinérentes techniques, sauf pour I'hydroxyiIunine, ~s ceux-ci n'ont pu être
purifiés car dans certain cas l'anticorps ne reconnaissait pas les fragments formés et dans d'autres
cas il y a ai perte des produits de digestion lors des essais de purification Les fragments générés
C! suite à la digestion -que avec la trypsine amsi qu'avec la protéinase K dom pas été
détectés avec l'anticorps. L'épitope permettant la liaison de l'anticorps a été détruit par ces deux
digestion Par contre des fhgments générés aute à la digestion avec la protéhase V8 ainsi
qu'avec le CNBr possédaient toujours l'épitope pour I'anticorps puisqu'ils ont été détectés par
immunobuvardage westem. Nous avons tenté de purifier les h g m e a t s ginais par digestion au
CNBr par HPLC en phase inversée. Les f h p e n t s ont été detedés mais iIs n'étaient pas présent
en quantité aifnsante pour permettre un séquençage. La digestion au CNBr a également été
effèctuée sur la GP39 obtenue par électrotlution. Cependant suite à la digestion I'échanîUon
&ait trop visqueux pour permettre son injection au HPLC afin de le purifier.
Daix oligonucléotides dégénérés, S'GCGGCCYTNGARGARYTN3' et
S'GCTCTAGATYTCNCCNGGN3' établis à partir des acides aminés cornus de la GP39 ont été
- utilisés en RT-PCR sur l ' A m de pancréas de souris. Cinq bands d'ADN de taille d'environ 43
nucléotides ont été ampiSées d séquencées. Aucune d'entre elles ne correspondait pasfkitement à
la séquence en acides aminés de la GP39.
Nous avons finaiement cnilé une librairie d'expression d'ADNc d'intestin grêle humain
5' STRECH avec I'anticorps polyclonal MIM 1439. Cinq clones positifk ont été obtenus et
purifiés. Uoe amplification PCR avec les amorces sens et antisens spécifiques au phage de part et
d'autre du site d'insertion des ADNc int estinaux a permis d'ampiifier trois des cinq clônes. Ces
trois ADNc ont respectivement environ 200q 2300 et 1300 paires de bases. XI existe une
possibilité d'obtenir des faux positifs puisque i'anticc,rps utilisé est un polyclonal. Sauf que les
- cinq clones p o s w obtenus sont demeurés positaj suite a quatre passage.
d: ces clones soient de fkm pomifs sont minces. Le séquençage de ces trois
Donc les chances que
ADNc nous permetna
de les identifier. Si ils s'avirem être des vrais positifS nous auront donc en min les outils pour
nous permettre d'obtenir la séquence complète du gène de la 8 3 9 a nous pounons donc
déterminer ces propriétés biochimiques et bactériostatiques.
A cause de la distniution de la ~ ~ 3 9 au niveau de cellules en contact avec le milieu
extérieur, on peut supposer que cette giycoprotéine pourrait avoir un rôle antibactérien. Des
,;sais antiiacténens sur 12 types différents de bactéries ont été effèctués avec la GP39 électro-
éluée. Ces essais préIiminaires ont permis de démontrer que la GP39 a un effet inhibiteur sur la
croissance de deux de ces douze types de bactéries. La GP39 a complètement inhibé la croissance
de St~IryIococcus epidennidis et a réduit ceUe de Listeria monocytogenes de 9%. Plusieurs .<g - peptides possédant une activité antibactériennes ont été localisés au niveau de Iq muqueuse
intestinal tels les défensines chez l'homme (Jones et al., 1992), les ciyptdines chez la souris
(Oueuette et ai., 1989; Ouenette et al., 1992; Selsted et al., 1992) et les cecropines chez le porc
(Lee et al., 1989).
V. CONCLUSION
La glycoprotéhe GP39 est largement distribuée chez la souris a chez I'homme dans divers
tissus qui sont en contact avec le milieu extériau. La protéine GP39 de poids molénilaire de
350kDa est fortement giywsylée taut ai O quand N. Le peptide sans oligosaccharides a un poi&
moléculaire de 225 kDa Puisque la plupart des protéines des membranes qui sont produites dans
le réticulum endoplesmique. incluant ceiles destinées pour le transport à l'appareil de Golgi, aux
lysosomes, à la membrane plasmique ou à l'espace extracelIdaire. sont des glywprotemes et
qu'en cornaste, il n'y a que quelques protéines dans le cytosoi qui sont glycosylées, et celles-ci
portent la forme le plus simple de sucre soit un simple groupe N-acétylgiucosamine qui est
additionné à un résidu sérine ou thréonine de la protéine, on peut donc conclure que la GP39 n'est
pas une protéine cytosolique. Les premiers acides aminés de la partie NH2terminale ont été
'$ ditermin&: QET,EF;IT,NVPGI. Cmc séquence a homologue à 1W% a . les r acides
aminés de la béta-caséine bovine. Par contre la GP39 n'est pas une caséine puisque sont poids
moléculaire de 350 kDa est différent de celui de 25 kDa de la béta-casine. Le criblage d'une
librairie d'ADNc d'intestin grêle humain a permis d'isoler a de purifier cinq clônes positifs dont
trois ont été ampiifiés par PCR. Les ADNc de ces trois clônes ont respectivement 2000,2300 et
1300 paires de bases. Le séquençage de ces trois ADNc nous pemiettra détabiir si il sagit
vraiment de positifs co~espondant à la GP39. Et s'ils s'avèrent positifs, ces ADNc sentiront à
obtenir la séquence complète du géne de la GP39 afin de diterminer les propntés biochimiques d
bactériostatiques de la protéine. Un essai antibactérien préliminaire a permis de démontrer que la
GP39 a un S e t inhibiteur sur deux types bactériens. il y a donc une forte possibilité que cette
fiI glycoprotéine jouent un rôle antiibacténen au niveau de la voie gastro-intestinale.
u-
VI. PERSPECTIVES
Ces trois ADNc seront éventuellement clonés dans le vecteur pBluescript @ II KS afin
d'être ultérieurement séquencés. Une recherche dans une banque de dom& tel Genbank avec les
trois séquences obtenues nous permettra d'identifier si ces demières correspondent à des gènes
déjà connus ou nouveaux. Également, I'authdcité de ces ADNc pour la -39 sera vérifiée à
I'aide du systéme de transcription in vitro eucaryotique de Lysat de Réticulocyre Couple TNT@.
Ce système permet la transcription et la traduction des ADNc qui sont clonés en aval des
promoteurs de I'ARN polymérase T3, TI ou SP6. Les protemes produites seront appliquées air
un gel SDS-PAGE et elles seront révélées par l'anticorps poiyclonal MZM-1/39.
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier le Dr. Raymond Calvert qui m'a accueilli dans son laboratoire ainsi que
le Dr. Jean-François BeauLeu qui a été mon CO-directeur. Je remercie également Anne VéPna
pour les deux b d e s années de coopération que nous avons partagées. Eue m'a apporté une aide
précieuse tout au long de ma maîtrise. Je ne voudrais pas oubliex le Dr. C h d e Asselin, François
Boucireau, le Dr. Benoît Chabot et Hélène Chabot pour leurs contniutions à mon travail en
biologie moléculaire. Merci à Moustapha El Amine qui m'a permis d'accomplir en un temps
record un travail qui aurait duré au moins 5 mois n'eut été de ses précieux conseils.
Enfin je voudrais remercier mes parents ainsi que ma soeur Judith pour lm nombreux
encouragements tout au long de ces années de maîtrise. Et un merci tout spéciale à Yves, mon
amour et meilleur ami qui m'a soutenue lors de la demière année de ma
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