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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO
NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE
BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA
MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ESTREPTOZOTOCINA”
RENATA SOUZA E SILVA
Natal-RN
2019
“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA
MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ESTREPTOZOTOCINA”
RENATA SOUZA E SILVA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Estrutural e
Funcional, do Departamento de Morfologia
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Morfologia.
Orientadora: Naisandra Bezerra da Silva Farias
Co-orientadora: Danielle Barbosa Morais
Natal-RN
2019
RENATA SOUZA E SILVA
“EFEITOS DO EXTRATO ALLIUM CEPA L. (CEBOLA) E S-METILCISTEÍNA NA
MORFOLOGIA TESTICULAR DE RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ESTREPTOZOTOCINA”
Comissão Examinadora
Fernanda Carolina Ribeiro Dias
Tirzah Braz Petta Lajus
Natal-RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Silva, Renata Souza e.
Efeitos do estrato de Allium cepa L. (cebola) e S-
metilcisteína na morfologia testicular de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina / Renata Souza e Silva. - Natal,
2019.
79 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional.
Orientadora: Profa. Dra. Naisandra Bezerra da Silva Farias.
Coorientadora: Profa. Dra. Danielle Barbosa Morais.
1. Diabetes mellitus - Dissertação. 2. Morfofisiologia
testicular - Dissertação. 3. Extrato de cebola - Dissertação. 4.
S-metilcisteína - Dissertação. I. Farias, Naisandra Bezerra da Silva. II. Morais, Danielle Barbosa. III. Universidade Federal
do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.379-008.64
Dedico à
meu avô Kerginaldo Vieira de Souza,
que sempre foi um exemplo de
determinação e sabedoria.
Minha família, que sempre me apoiou e
me disse que com determinação eu
poderia alcançar meus sonhos.
AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN), onde pude fazer minha graduação e amadurecer bastante. Agradeço também ao
Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PPGBioEF), onde pude
aprender que ser professora é muito mais do que estar na frente de uma sala e falar o
conteúdo, mas sim tentar fazer o aluno se envolver com a aula, participar e entender que
todo conteúdo é aplicável vida.
Agradeço a minha orientadora Naisandra Bezerra da Silva Farias, um exemplo de
pessoa e de profissional. Mesmo estando envolvida em diversos projetos, sendo
coordenadora de um curso de graduação, professora de várias turmas de histologia,
orientadora de vários alunos de mestrado e ainda lida com uma família diariamente, ela
consegue balancear tudo com bom-humor e sabedoria. Se eu for metade do profissional
que ela é, já me darei mais do que satisfeita.
Agradeço a minha co-orientadora Danielle Barbosa Morais por ter me ensinado a
trabalhar com o testículo e me dado a oportunidade de visitar a Universidade Federal de
Viçosa (UFV), onde tive uma das melhores experiências para este trabalho. Agradeço aos
professores Fernando Vagner Lobo Ladd por sempre estar disponível para tirar dúvidas e
explicar como as coisas do programa funcionam. Agradeço também ao professor Pedro
Paulo de Andrade Santos, que me ajudou na leitura das minhas lâminas, assim como de
disponibilizou sua aula preferida de histologia...o que me deixou muito nervosa, porque
não sabia se poderia conseguir dar uma aula que chegasse aos pés da aula ministrada por
ele.
Agradeço ao professor Gustavo Cunha Lima Freire, que sempre foi mais do que
apenas um professor, mas um amigo que me ajudou a aprender que aulas podem ser
ministradas de tantas formas diferentes e que não basta apenas estar presente na sala de
aula, mas se faz necessário mostrar pro aluno que aquele conteúdo não existe apenas para
dificultar a vida e ser cobrado em prova, mas sim como um modo que compreender o
mundo em que vivemos. Com ele eu pude assistir aula, dar aula, aprender a dar aula (ao
ponto de ter um estilo de aula muito parecido com o dele), desenvolver modelos de prova
diferentes...foram diversas experiências as quais eu tenho apenas agradecer e esperar que
essa parceria continue por vários anos.
Agradeço a Fernanda Carolina Ribeiro Dias, uma pessoa maravilhosa que entrou
na minha vida graças a professora Danielle que me apresentou como “a pessoa que me
acompanharia na UFV”. Não sabia eu que na realidade eu ganharia muito mais com
isso...uma co-orientadora, uma orientadora, uma amiga. Ela esteve presente na minha
vida desde o dia em que nos conhecemos e não apenas para me ajudar com o meu trabalho,
mesmo estando a tantos quilômetros de distância. Ela sempre me perguntou como eu
estava, sempre me ofereceu ajuda, sempre me ajudou quando eu estava desesperada e
agora eu tenho o prazer de tê-la na minha banca avaliatória. Agradeço por tudo, pelas
ajudas, por se importar comigo e por ser sempre presente. Espero que nossa amizade
continue pra sempre e que você goste desse trabalho que eu sinto que tem um pedaço de
você nele.
Agradeço ao professor Sergio Luís Pinto da Matta, que além de ter me ensinado
que a terra realiza mais de 13 movimentos (e não apenas dois como sempre ouvimos
falar), também se mostrou um modelo de pessoa e de profissional (basicamente o sonho
do que eu quero ser da minha vida: biomédico e professor de histologia). Ele sempre
esteve descontraído, aberto pra conversa, disposto a ajudar e fazendo brincadeira com o
meu sotaque. Quando disse que o laboratório estaria sempre aberto para mim, o que me
fez sentir bem-vinda e a vontade para trabalhar. Acredito que o tempo que eu passei lá eu
pude enriquecer muito mais o meu trabalho e amadurecer muito mais como ser humano.
Agradeço a todos os alunos de pós-graduação e de iniciação científica do
laboratório de biologia celular e estrutural. Vocês são pessoas maravilhosas, que me
acolheram durante a semana que pude conviver com vocês e me ajudaram a desenvolver
meu trabalho. Todos os almoços, momentos de descontração e piadas tonaram o trabalho
e a saudade de casa muito mais fáceis de aguentar. Sem falar do quanto vocês me
ensinaram sobre como realizar este trabalho. Só tenho a agradecer a todos vocês e esperar
que vocês tenham um futuro brilhante pela frente. Além de desejar “Bom dia”!
Agradeço a minha família, um conjunto de pessoas maravilhosas e exemplos de
vida. Minha mãe Lizélia Maria de Souza, uma mulher que criou três filhos sozinha,
trabalhando dois empregos e fazendo projetos fora parte pra colocar comida na mesa
todos os dias. Hoje em dia, com duas graduações, um mestrado quase finalizado, diversas
especializações e cursos profissionalizantes, um exemplo de vida a ser seguido. Além
dela, o meu pai Edson Alves da Silva, um homem com diversas experiências de vida,
terminando a terceira graduação, um professor, padeiro, pizzaiolo, motorista de
caminhão, pescador, aquacultor, tantos empregos e histórias que a gente não sabe quais
são verdade. Mas mesmo assim, ele é um exemplo de pessoa e de pai. Só tenho a
agradecer por ele estar na minha vida. Amo muito vocês dois!
Agradeço aos meus irmãos por estarem sempre presentes, rirem do meu trabalho
e fazerem piadas com tudo que eu faço na vida. Mas ao mesmo tempo, me dando apoio e
dizendo que eu consigo sim fazer todas as coisas que eu listei pro meu dia. Também
agradeço aos meus amigos, não tenho nem palavras para agradecer o apoio que vocês me
dão. O grupo 9, Os + lindos, Corais, Mestrado BIOEF, DMORte Origem, monitoria de
histologia...se eu fosse citar nome a nome, esses agradecimentos não acabariam nunca,
mas vocês sabem que são especiais pra mim e que sem vocês eu não sairiam do lugar com
esse trabalho.
Mas eu não poderia deixar de agradecer a algumas pessoas em especial.
Primeiramente eu gostaria de agradecer a Daniella Santos, minha sis, minha cheerleader,
a pessoa que comentava comigo sobre cultura coreana, que me apoia a todo momento e
que me mata de orgulho todos os dias. Você é uma pessoa muito especial pra mim e
merece muito amor e apoio. Só tenho a agradecer por esta amizade e espero que o seu
futuro seja tão brilhante quanto a sua pessoa.
Rhudson Cruz, a pessoa que chegou perdido no departamento, mas viramos
amigos instantaneamente. Debatemos sobre projetos, admirei os seus desenhos, tocamos
e cantamos juntos, comemos todas as tardes às 16 horas, você virou professor doutor e eu
fiquei pra trás (por enquanto). Você corrigiu o meu trabalho, realmente corrigiu o meu
trabalho e eu fiquei tão feliz em saber que eu tinha o seu apoio e a sua atenção. Muito
obrigada por tudo, o seu futuro só pode melhorar, porque eu nunca conheci alguém mais
determinado e preparado para alcançar o que almeja. Torço por você e espero que daqui
pra frente eu só escute mais notícias boas sobre você.
Agora eu quero agradecer a pessoa mais maravilhosa da minha vida. Minha amiga,
minha irmã, minha estrela Patrícia Dias Ribeiro. Que pessoa incrível. Você entrou na
minha vida a 14 anos e nunca mais saiu (graças a Deus). Sem você, eu não seria quem eu
sou. Você esteve comigo nos momentos ótimos, bons, ruins e péssimos. É minha amiga,
minha confidente, minha bússola, minha advogada e muito mais. Você me faz sorrir todos
os dias e me acalma quando eu choro. Me ajudou a passar por momentos difíceis que
foram trazidos pelo mestrado e pela vida, seja pessoalmente, por ligação, por mensagem
ou por memes. Você é mais importante pra mim do que os meus cachorros e você sabe
que eles valem mais do que meus órgãos. Muito obrigada por se fazer presente e nunca
me abandonar mesmo eu sendo estranha. Eu te amo!
Fazer mestrado não é uma experiência fácil. Sempre se está cansado, com sono,
preocupado com experimentos, ratos, artigos, bases de pesquisa, reuniões, qualificações,
prazos, futuro, defesa...tanta coisa que as vezes é difícil de respirar. Mas ao mesmo tempo
é extremante gratificante. A experiência de ministrar uma aula, de ter uma turma
chamando você de professora, de escrever um projeto e se orgulhar dele, de ter resultados
positivos e relevantes e de conseguir alcançar as próprias expectativas. Não existem
palavras para agradecer por tudo isso, porém é tudo que eu posso oferecer em troca. Muito
obrigada por tudo, espero ser uma profissional e pessoa melhor daqui pra frente.
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 14
2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 15
2.1. Geral ............................................................................................................................... 15
2.2. Específicos ...................................................................................................................... 15
3. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 16
3.1. Diabetes melitos ............................................................................................................. 16
3.2. Morfologia testicular ..................................................................................................... 18
3.3. Danos testiculares causados pelo DM .......................................................................... 19
3.4. Allium cepa L. ................................................................................................................ 20
3.5. S-Metilcisteína ............................................................................................................... 22
4. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 24
Effects of extract Allium cepa L. (onion) and s-metilcystein in testicular morphology of
diabetic rats induced by estreptozotocin ................................................................................. 33
ABSTRACT ............................................................................................................................... 33
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 34
MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................... 36
Modelo experimental................................................................................................................. 36
Desenho experimental ............................................................................................................... 37
Protocolo experimental ............................................................................................................. 37
Avaliação de consumo de água e ração ................................................................................... 38
Análises de glicemia .................................................................................................................. 39
Biometria corporal e testicular ................................................................................................ 39
Técnicas Histológicas ................................................................................................................ 39
Análise de dano tecidual ........................................................................................................... 40
Análise Morfométrica ............................................................................................................... 42
• Proporção volumétrica de túbulos seminíferos ............................................................... 42
• Índices tubulossomático e epiteliossomático .................................................................. 42
• Diâmetro tubular médio e comprimento total dos túbulos seminiferos .......................... 42
• Proporção volumétrica do intertúbulo ............................................................................. 43
• Parâmetros relacionados as células de Leydig ................................................................ 43
Técnicas de Imunohistoquímica ............................................................................................... 44
Análise estatística ...................................................................................................................... 45
RESULTADOS .......................................................................................................................... 45
Glicemia e consumo de insumos ............................................................................................... 45
Parâmetros biométricos ............................................................................................................ 46
Escore tecidual ........................................................................................................................... 47
Morfometria testicular .............................................................................................................. 48
Análise qualitativa ..................................................................................................................... 57
6.4. Imunohistoquímica........................................................................................................ 60
DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 63
CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 70
CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................................................... 80
RESUMO
Diabetes Melitos (DM) é uma doença complexa, endócrina e difusa caracterizada pela
elevação da glicemia. Uma das complicações recentemente apontada é a infertilidade,
sendo esta caracteriza pela redução dos níveis de testosterona e alterações no epitélio
germinativo dos túbulos seminíferos. O extrato de Allium cepa L. (cebola) já vem sendo
apontado como hipoglicemiante e antilipêmico. O aminoácido extraído deste extrato,
denominado S-metilcisteína, apresenta resultados ainda mais positivos em estudos
diversos. A aquisição de novas terapias que possam auxiliar no tratamento da diabetes é
de extrema importância, pois representa um impacto direto no bem-estar da sociedade.
Assim, este trabalho visou investigar os aspectos bioquímicos, morfofuncionais e
morfométricos do tecido testicular de ratos diabéticos, induzidos por estreptozotocina,
tratados com extrato de A. cepa L. e com o aminoácido S-metilcisteína. Foram utilizados
ratos Wistar, machos (45 dias), pesando de 200-250g, divididos em quatro grupos:
controle normoglicêmico, diabético sem tratamento, diabético tratados com o extrato de
A. cepa L. (400 mg/kg) e diabético tratado com o aminoácido S-metilcisteína (200
mg/kg). O DM foi induzido por estreptozotocina (40 mg/kg via intraperitoneal) e o
tratamento foi realizado por gavagem diariamente por um período de 4 semanas. Após a
eutanásia, os testículos foram coletados para análise histológica da integridade do tecido
(Hematoxilina e Eosina), morfometria (azul de toluidina) e imunohistoquímica para
receptores de testosterona. Ambos os tratamentos foram capazes de reduzir a glicemia
dos animais, porém não foram capazes de interferir em parâmetros biométricos.
Morfometricamente, ambos os tratamentos foram capazes de melhorar o tecido testicular,
elevando a altura do epitélio e diâmetro dos túbulos seminíferos. Porém, os tratamentos
não foram capazes de interferir nos componentes intertubulares. As analises morfológicas
do tecido demonstraram uma melhora visível para ambos os tratamentos e, a
imunohistoquímica apresentou uma melhora na apresentação de receptores para
testosterona para ambos os tratamentos, principalmente para o extrato. O extrato da
cebola apresentou resultados positivos como forma de terapia, principalmente na
disponibilidade de receptores para testosterona. O aminoácido isolado foi capaz de
apresentar resultados ainda melhores de forma generalizada na melhora da integridade do
tecido testicular.
Palavras-chave: Diabetes mellitus, Extrato de cebola, Morfofisiologia testicular,
Imunohistoquímica
ABSTRACT
Diabetes Melitos (DM) is a complex, endocrine and diffuse disease characterized by
elevated glycemia. One of the recently reported complications is infertility, which is
characterized by reduced testosterone levels and changes in the germinal epithelium of
the seminiferous tubules. The extract of Allium cepa L. (onion) has already been reported
as hypoglycemic and antilipemic. The amino acid extracted from this extract, called S-
methylcysteine, presents even more positive results in several studies. The acquisition of
new therapies that may aid in the treatment of diabetes is extremely important, since it
has a direct impact on the well-being of society. This work aimed to investigate the
biochemical, morphofunctional and morphometric aspects of the testicular tissue of
diabetic rats, induced by streptozotocin, treated with extract of A. cepa L. and with the
amino acid S-methylcysteine. Male Wistar rats (45 days) weighing 200-250 g were
divided into four groups: normoglycemic control, diabetic without treatment, diabetic
treated with the extract of A. cepa L. (400 mg / kg) and diabetic treated with the amino
acid S-methylcysteine (200 mg / kg). DM was induced by streptozotocin (40 mg / kg
intraperitoneally) and the treatment was performed by gavage daily for a period of 4
weeks. After euthanasia, the testes were collected for histological analysis of tissue
integrity (Hematoxylin and Eosin), morphometry (toluidine blue) and
immunohistochemistry for testosterone receptors. Both treatments were able to reduce
the glycemia of the animals, but were not able to interfere in biometric parameters.
Morphometrically, both treatments were able to improve the testicular tissue, raising the
height of the epithelium and diameter of the seminiferous tubules. However, the
treatments were not able to interfere with the intertubular components. The morphological
analyzes of the tissue showed a visible improvement for both treatments, and the
immunohistochemistry presented an improvement in the presentation of receptors for
testosterone for both treatments, mainly for the extract. The onion extract presented
positive results as a form of therapy, mainly on the availability of receptors for
testosterone. The isolated amino acid was able to present even better results in a
generalized way in the improvement of the integrity of the testicular tissue.
Key words: Diabetes mellitus, Onion extract, Testicular morphophysiology,
Immunohistochemistry
14
1. INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença crônica associada a problemas com a
produção, secreção ou utilização de insulina e, sendo este o hormônio responsável por
regular a glicemia, o indivíduo apresenta altas concentrações de glicose circulante
(BURUL-BOZKURT et al., 2010). Indivíduos que vivem com esta doença tendem a
apresentar maiores riscos de morbidade e mortalidade quando comparados com a
população saudável em geral, apresentando uma menor expectativa de vida quando
comparado a indivíduos saudáveis (OGURTSOVA et al., 2017).
A estimativa de pessoas convivendo com a diabetes tem aumentado
drasticamente, elevando-se de 30 milhões em 1964 para mais de 422 milhões em 2014 e,
acompanhando esta progressão, acredita-se que em 2040 este número seja de
aproximadamente 642 milhões (OGURTSOVA et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2017;
WHO, 2016). O Brasil atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior
prevalência de indivíduos com diabetes, apresentando cerca de 14,3 milhões de pessoas
afetadas, com idades variando entre 20 e 79 anos (OLIVEIRA et al., 2017).
A elevação da glicemia, característica marcante do DM, pode levar ao
desenvolvimento de complicações sistêmicas que incluem cetoacidose, nefropatia,
retinopatia, neuropatia, problemas circulatórios e infertilidade (SCHOELLER et al.,
2012; VAN BELLE et al., 2011). Em portadores do sexo masculino, o DM está envolvida
na redução dos níveis de testosterona, alterações na espermatogênese, alterações na
contagem e mobilidade de espermatozoides e destruição de células de Leydig
(BACCETTI et al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018; KOH, 2007).
Como forma de atenuar os sinais e sintomas de diversas doenças, a população
mundial sempre fez uso de diversos artifícios mais acessíveis como forma de terapia e
tratamento. A utilização de fitoterápicos é algo que já vem sendo utilizado a vários anos
como modo alternativo de tratamento para diversas doenças. Já se sabe que o extrato
obtido da cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia, assim como atenuar o estresse
oxidativo em distúrbio metabólicos relacionados a diabetes (SEETUR R. PRADEEP e
SRINIVASAN 2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017). A aplicação de recursos
para descoberta de novas terapias para tratar a diabetes de modo mais acessível e barato
15
pode auxiliar na redução dos danos causados por esta doença ou até mesmo impedi-los
de acometer os órgãos e sistemas.
Além da utilização dos fitoterápicos, a extração e purificação de componentes
presentes em plantas são necessárias para se entender como os fitoterápicos funcionam
ou se há modos de potencializar o seu funcionamento. S-metilcisteína (SMC) é um
aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do gênero Allium, como alho e
cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram que o SMC apresenta uma
atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011), assim como antidiabéticas
(KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI e AUGUSTI 2002). Porém, não
existem estudos voltados para avaliação da aplicação da S-metilcisteína como tratamento
para os danos causados pelo DM no tecido testicular.
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Verificar a ação do extrato da cebola Allium cepa L. e do aminoácido isolado S-
metilcisteína na prevenção às alterações morfológicas testiculares de ratos diabéticos
induzidos por estreptozotocina.
2.2. Específicos
• Avaliar se houve controle glicêmico relacionado aos tratamentos;
• Avaliar o consumo de insumos pelos animais dos grupos;
• Avaliar parâmetros biométricos como peso corporal, testicular, túnica
albugínea e parênquima testicular;
• Determinar a proporção dos componentes dos túbulos seminíferos e
intertúbulo;
• Obter os índices gonadossomático (IGS), parenquimossomático (IPS),
tubulossomático (ITS), Leydigossomático (ILS);
• Avaliar alterações no comprimento dos túbulos seminíferos por testículo e por
grama de testículo;
16
• Avaliar alterações na altura do epitélio seminífero e o diâmetro dos túbulos
seminíferos;
• Realizar a morfometria das células de Leydig;
• Realizar avaliação histopatológica da integridade do tecido testicular dos
grupos;
• Avaliar por imunohistoquímica a disponibilidade de receptores para
testosterona presentes no tecido testicular entre os grupos.
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. Diabetes melitos
O Diabetes mellitus (DM) é um distúrbio metabólico associado a diversas
complicações funcionais e estruturais severas em vários órgãos e sistemas (SADIK, El-
SEWEIDY e SHAKER 2011). Acometendo 8,8% da população mundial (GOBBO et al.,
2015; OGURTSOVA et al., 2017), este distúrbio é caracterizado pela elevação da
concentração de glicose presente na circulação sanguínea (MALANDRINO e SMITH,
2011), um efeito que pode estar associado tanto as alterações na secreção e produção,
assim como na sensibilidade de receptores celulares à insulina (AMERICAN DIABETES
ASSOCIATION, 2010; FALLAH et al., 2017).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) destacou em 2015 que o DM é uma
doença crônica, séria e complexa. Ela pode ocorrer quando o pâncreas não produz insulina
suficiente ou quando o corpo não consegue utilizar a insulina produzida de modo
adequado (WHO, 2016). Nos últimos anos, o número de pessoas com diabetes, assim
como a prevalência dessa síndrome têm aumentado significativamente. Dados de 1980
indicavam que 108 milhões de pessoas viviam com o DM, e esse número subiu para 422
milhões no ano de 2014 (WHO, 2016).
O Brasil atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior prevalência
de indivíduos que sofrem com algum tipo de DM, apresentando, em 2015 cerca de 14,3
milhões de pessoas, com idades variando entre 20 e 79 anos convivendo com esta doença,
perdendo apenas para os Estados Unidos da América (29,3 milhões), Índia (69,2 milhões)
e China (109,6 milhões) (OLIVEIRA et al., 2017). Estes números podem subir
drasticamente até 2040, chegando a 23,3 milhões de indivíduos no Brasil (MILECH et
17
al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017). Essa elevação nos casos de DM está diretamente
relacionada ao aumento da expectativa de vida e do crescimento populacional
(OLIVEIRA et al., 2017). O DM pode ser separado de acordo com sua causa em diversos
tipos, sendo os dois principais o Tipo 1 e o Tipo 2 (OLIVEIRA et al., 2017).
O DM Tipo 1 (DM1) é caracterizado pela destruição das células beta-pancreáticas
que leva à uma deficiência na secreção de insulina para o organismo. Um indivíduo com
DM-1 necessita da utilização de insulina exógena, já que o seu corpo é incapaz de
produzi-la; ou a insulina produzida é insuficiente ou incapaz de realizar sua função
(OLIVEIRA et al., 2017). Essa forma está comumente associada a doenças autoimunes,
alterações em diversos genes ou causas idiopáticas, com sinais e sintomas se
apresentando-se usualmente nos estágios iniciais da vida (OLIVEIRA et al., 2017). O
DM-1 representa 5-10% dos casos de DM no mundo (MILECH et al., 2016).
O DM Tipo 2 (DM2) é caracterizado por defeitos na ação e/ou secreção da insulina
e na regulação da produção hepática de glicose (MILECH et al., 2016). Trata-se de uma
doença poligênica, com forte herança familiar, ainda não completamente esclarecida,
porém comumente associada a outras doenças e estilo de vida como obesidade e
sedentarismo (OLIVEIRA et al., 2017). Com isso, seus sinais e sintomas tendem a
aparecer após os 40 anos de idade, mas não se limitam apenas a este período. Pacientes
com DM-2 não necessitam de insulina como terapia, comumente fazem uso de
hipoglicemiantes orais, porém, com o agravamento da doença, pode-se chegar a
necessidade de uma terapia com insulina. Este tipo de DM pode representar mais de 90%
dos casos totais da doença no mundo (MILECH et al., 2016; SACHDEVA e STOFFERS,
2009).
Estudos realizados em animais indicam que as altas concentrações de glicose por
um tempo prolongado podem resultar em danos intra e extracelulares devido ao
desbalanço entre fatores pro e anti-oxidantes (HRUDA et al., 2010). O processo de
oxidação e produção de radicais livres são comuns dentro do metabolismo de um
organismo normal. Porém, altas concentrações de radicais livres podem iniciar um
processo de peroxidação lipídica, assim como danos a moléculas importantes como
proteínas, carboidratos e o próprio DNA (KUMARI e AUGUSTI, 2002).
Estudos demonstram que existe uma correlação entre a elevação da glicemia,
concentração de insulina circulante e o estresse oxidativo em indivíduos diabéticos
(GOBBO et al., 2015; KUMARI e AUGUSTI, 2002; WANG et al., 2013). Já foi
18
demonstrado que a glicose pode sofrer oxidação na corrente sanguínea quando catalisada
por metais, gerando radicais livres, peróxido de hidrogênio e cetoaldeída reativos (HUNT
et al., 1988).
Este estresse oxidativo desencadeia uma série de alterações em diversas vias de
sinalização celular, levando a modificações intracelulares, que acabam por causar
manifestações de cunho micro e macrovascular (BODEN, 2011; EVANS et al., 2002;
MUNUSAMY e MACMILLAN-CROW, 2009). Em decorrência destes aspectos, o DM
acaba por estar associada a diversas complicações sistêmicas como retinopatia,
nefropatia, neuropatia, doenças coronárias, doenças associadas ao sistema nervoso e até
mesmo infertilidade (ABD El-TWAB et al., 2016; VAN BELLE et al., 2011).
Devido ao surgimento progressivo de tais complicações, o DM promove a
redução na qualidade de vida, assim como maiores riscos de morbidade e mortalidade
quando comparados com a população em geral (OGURTSOVA et al., 2017). De modo
crescente, até mesmo um DM com bom acompanhamento demonstra danos nos órgãos
periféricos (SCHOELLER et al., 2012). Por estes motivos, o DM necessita de um
diagnóstico precoce, associado a um tratamento adequado e modificações no estilo de
vida (AMORIM et al., 2011; FALLAH et al., 2017).
3.2. Morfologia testicular
O testículo é a gônada masculina responsável pela produção dos espermatozoides
(gameta masculino) (DOHLE et al., 2012). São encontrados em pares, protegidos por uma
bolsa composta de diversas camadas de tecido conjuntivo e epitelial, denominada de
escroto (BART, 1831). Além de apresentar uma função reprodutiva, o testículo também
é considerado uma glândula endócrina responsável pela produção e liberação de
testosterona (CORONA et al., 2011; PITTELOUD et al., 2005). Este hormônio é
responsável por estimular a produção dos espermatozoides, assim como o
desenvolvimento de características sexuais secundárias (CORONA et al., 2011;
DHINDSA et al., 2004; PITTELOUD et al., 2005; RATO et al., 2012, 2014).
A regulação da produção deste hormônio está diretamente ligada à secreção do
hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo-estimulante (FSH) pela adenohipófise
(SCHOELLER et al., 2012) que, por sua vez, é regulada pela secreção de GnRH pelo
hipotálamo, formando um eixo denominado de eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Em um
19
organismo funcionalmente normal, o hipotálamo libera GnRH , estimulando a secreção
de LH e FSH pela adenohipofise. O LH irá agir nas células de Sertoli e o FSH irá agir nas
células de Leydig, respectivamente, estimulando a espermatogênese. Em um indivíduo
diabético, este eixo se encontra desbalanceado, resultando em alterações na
espermatogênese e infertilidade ou subfertilidade (SCHOELLER et al., 2012). Este pode
ser um dos caminhos por onde a diabetes pode afetar a atividade do tecido testicular, além
do dano testicular direto associado ao estresse oxidativo.
A estrutura testicular é relativamente conservada dentre as espécies e pode ser
dividida em dois compartimentos: germinativo (tubular) e intersticial (DE SIQUEIRA-
SILVA et al., 2018). Estes compartimentos são separados por uma membrana basal e
conjuntos destes dois componentes são separados em lóbulos por uma capa de tecido
conjuntivo denso que circunda todo o testículo e adentra o mesmo, chamada de túnica
albugínea (DE SIQUEIRA-SILVA et al., 2018). No compartimento germinativo é onde
estão localizados os túbulos seminíferos, estruturas responsáveis por produzir os
espermatozoides (BROWN-PETERSON et al., 2002; DE SIQUEIRA-SILVA et al.,
2018; GRIER et al., 2016).
As células da linhagem espermatogênica ficam alojadas dentro destes túbulos,
sendo protegidas, agrupadas, organizadas e estimuladas por células de sustentação
denominadas de células de Sertoli (SCHULZ et al., 2010). No compartimento intersticial
podemos encontrar células de Leydig (responsáveis pela produção de testosterona),
células mióides peritubulares (responsáveis pela contração dos túbulos seminíferos para
auxiliar na expulsão e liberação dos espermatozoides), vasos sanguíneos, nervos, células
do tecido conjuntivo e espaço linfático (CHAVES-POZO et al., 2018; Lo NOSTRO et
al., 2004; NÓBREGA et al., 2009; SCHULZ et al., 2010).
3.3. Danos testiculares causados pelo DM
Diversos modelos de animais diabéticos, assim como em pacientes humanos
demonstram distúrbios relacionados a espermatogênese e/ou fertilidade associados ao
desenvolvimento do DM (SCHOELLER et al., 2012). O DM induz alterações intra e
extracelulares no testículo, causando apoptose das células germinativas, alterações na
produção e liberação da testosterona, o que acaba resultando em subfertilidade ou
infertilidade (KILARKAJE et al., 2014).
20
Os efeitos mais comuns da diabetes ao sistema reprodutor masculino incluem
redução dos níveis de testosterona, redução do peso testicular, alterações na
espermatogênese, alterações na contagem e mobilidade de espermatozoides, destruição
de células de Leydig e alterações teciduais dos componentes testiculares (BACCETTI et
al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018; KOH, 2007). Mesmo conhecendo todos estes
efeitos, ainda não se sabe se estes danos estão diretamente relacionados a hiperglicemia
local ou a alterações hormonais que afetam o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal
(SCHOELLER et al., 2012). Porém, atualmente já é conhecido o fato de que tanto os
testículos quanto os espermatozoides produzem insulina e que a sua expressão encontra-
se reduzida em modelos diabéticos induzidos por estreptozotocina (GÓMEZ et al., 2009;
SCHOELLER et al., 2012).
O avançar do tempo faz com que indivíduos portadores do DM tendam a
desenvolver infertilidade causada por danos testiculares associados a esta síndrome. Isso
pode ocorrer devido ao aumento de radicais livres que são produzidos normalmente
dentro das células, gerando o estresse oxidativo (KILARKAJE et al., 2014). Associado a
isso, a membrana das células germinativas, rica em ácidos graxos poli-insaturados pode
reagir com esses radicais livres que se encontram em concentrações elevadas, causando
o dano no epitélio germinativo (HENKEL R., 2005; SANOCKA e KURPISZ, 2004).
Ademais, no espermatozoide de um indivíduo diabético, a hiperglicemia estimula genes
relacionados à sinalização intracelular, estrutura e movimentação de espermatozoides,
funções de citocinas, estresse oxidativo e pro-oncogenes (KILARKAJE et al., 2014).
Levando-se em consideração, todos os danos que o DM desencadeia, não apenas
no tecido testicular como também no organismo de modo sistêmico, torna-se importante
a aquisição de novas terapias ou terapias combinadas com a insulina. Isto porque a
obtenção de novas formas de tratamento de baixo custo e alta acessibilidade para estas
alterações pode auxiliar na redução dos danos gerados pelo DM, sejam eles gerados
diretamente pela hiperglicemia causada pelo DM ou por danos secundários a órgãos e
sistemas corporais.
3.4. Allium cepa L.
Plantas medicinais vem sendo utilizada como uma forma de tratamento alternativo
e seguro para diversos tipos de doenças. Plantas sempre foram bons exemplares de fontes
medicamentosas e funciona como fonte de diversos medicamentos, seja de forma direta
21
ou indireta (PATIL et al., 2011). A cebola (Allium cepa L.) é um membro da família
Liliaceae, que contempla mais de 250 gêneros e 3700 espécies. Esta vem sendo utilizada
durante muito tempo na medicina tradicional, assim como amplamente utilizada na dieta
(FALLAH et al., 2017). O extrato desta planta tem demonstrado efeitos antidiabético,
antioxidante, anti-hipertensivo, hipoglicêmico, dentre outros (SHENOY et al., 2009).
Foi demonstrada que a cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia associada a
distúrbios metabólicos e estresse oxidativo no tecido hepático e cardíaco de ratos
diabéticos induzidos por estreptozotocina (SEETUR R. PRADEEP e SRINIVASAN
2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017). Ela é rica em dois compostos, onde um
deles já foi apontado como benéfico para a saúde humana: sulfóxidos alquil cisteína
(ACSOs) e flavonoides (PARK, KIM, e KIM 2007). ACSOs estão associados ao sabor e
odor característico apresentado pelas cebolas (GRIFFITHS et al. 2002), porém eles não
são conhecidos por apresentarem nenhum efeito, seja ele benéfico ou maléfico, à saúde.
Os flavonoides são responsáveis pela coloração amarelada do interior, e o exterior
amarronzado, de diversos tipos de cebola (FOSSEN, PEDERSEN, e ANDERSEN 1998).
Dentro do Reino Vegetal, os flavonoides são compostos polifenóis amplamente
distribuídos, composto de aproximadamente 600 membros diferindo entre si em quesitos
como características e estruturas (COOK e SAMMAN, 1996; WANG et al., 2014). Estes
compostos são metabólitos não-energéticos e não-nutritivos presentes em plantas como a
cebola, mirtilo, salsa e banana, e não podem ser produzidos por seres humanos (BRAVO,
1998). Seu efeito antioxidante está associado a redução da concentrações de radicais
livres excedentes responsáveis por causar desbalanço no equilíbrio anti e pro-oxidante,
gerando o estresse oxidativo em tecidos vivos (SULERIA et al. 2015).
De modo geral, os flavonoides exibem diversos efeitos biológicos, como
antibacteriano, antiviral, anti-inflamatório, antialérgico e ação vasodilatadora (E Jr and
KANDASWAMI, 1994; HANASAKI et al., 1994; HOPE et al., 1983). Estes também
inibem a peroxidação lipídica, agressão plaquetária, permeabilidade e fragilidade capilar,
assim como a atividade de enzimas como ciclo-oxigenase e lipoxigenase, que são enzimas
associadas ao processo inflamatório (E Jr e KANDASWAMI, 1994; HODNICK et al.,
1988; HOPE et al., 1983; ROBAK et al., 1988; WINDHOLZ and BROWN, 1978).
Um dos principais exemplos de flavonoides presentes na cebola é a quercetina,
que já é bem conhecida por apresentar efeito antioxidante, reduzindo assim os efeitos
22
causados pela hiperglicemia (KANTER, AKTAS, e ERBOGA 2012). Esta também é
conhecida por reduzir a atividade carcinogênica de diversos alimentos mutagênicos
cozidos, inibir a atividade enzimática associada a vários tipos de células tumorais
(FOSSEN et al., 1998). A quercetina consegue remover espécies extremamente reativas,
como peroxinitrito e o radical hidroxil, que são de extrema importância para iniciar o
processo de estresse oxidativo (D’ANDREA, 2015). Seus efeitos benéficos são
apreciados mundialmente, sendo o seu isolado disponibilizada como suplemento diário
em doses que variam de 200 a 1200 mg diárias em alguns países (D’ANDREA, 2015).
Produtos naturais com efeitos antidiabéticos já vêm sendo apontados como
tratamentos em potencial por serem capazes de mimetizar as propriedades da insulina,
inibir a absorção intestinal de glicose ou processos metabólicos dependentes de insulina,
sendo até mesmo apontados como possíveis curas para o DM (ZAREI et al. 2015). A
cebola já é conhecida por apresentar efeitos que podem auxiliar na redução da glicemia,
agindo também na proteção contra danos causados pela diabetes, assim como podendo
auxiliar na regeneração tecidual de diversos tecidos e órgãos. Com isso, a aplicação de
fitoterápicos como alternativas mais simples e acessível para a sociedade como forma de
controlar e reduzir os danos gerados pela diabetes pode ser uma boa alternativa para
auxiliar na melhora da saúde do paciente.
3.5. S-Metilcisteína
Os estudos relacionados o DM buscam controlar a concentração de glicose
plasmática, lidar com o estresse oxidativo causado nos tecidos e normalizar alterações no
metabolismo de lipídeos (KILARKAJE et al., 2014). S-metilcisteína (SMC) é um
aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do gênero Allium, como alho e
cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram que o SMC já apresenta
uma atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011), assim como
antidiabéticas (KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI and AUGUSTI
2002) bem conhecida de modo sistêmico. Um estudo realizado por Hsu e colaboradores
(2004) demonstrou que uma dose diária de SMC na água por 4 semanas poderia reduzir
a hiperglicemia, hiperlipidemia, dano oxidativo e melhorar o balanço homeostático em
ratos diabéticos.
Uma dieta suplementada com SMC pode retardar a depleção da glutationa
reduzida (GSH), manter a atividade da glutationa peroxidase (GPx) e diminuir o dano
23
gerado por oxidação no sistema nervoso de ratos (CHEN et al. 2007). Isso demonstra que
já é conhecida a capacidade do SMC de reduzir o estresse oxidativo no sistema nervoso,
mas não limitado apenas a esse sistema. Assim como, a pré-ingestão de SMC retardou a
diminuição de dopamina e glutationa, mantendo a atividade de GPx e diminuindo a
concentração de citocinas proinflamatórias no sistema nervoso de camundongos (CHEN
et al., 2007).
O SMC consegue suprimir a ativação de MAPK e NF-κB, assim como aumenta a
taxa de sobrevivência de células PC12 tratadas com fator de crescimento de nervo
submetidas a condições de hipóxia (LIU, HSIA, e YIU 2014), demonstrando que o SMC
pode ter um papel importante na redução do estresse oxidativo tecidual, assim como
auxilia na proteção das células que constituem diversos tecidos. A utilização de SMC
pode ser positiva para diversos órgãos e sistemas, porém pouco se sabe os efeitos deste
aminoácido como forma de terapia para o dano que o DM causa em vários órgãos e
sistemas. Porém, não há trabalhos na literatura aplicando todos estes efeitos benéficos
que a SMC apresenta como uma forma de terapia para os danos que o DM causa no tecido
testicular.
Com isso, este trabalho está em busca de demonstrar a capacidade que o Allium
cepa L e o aminoácido isolado S-metilcisteína pode apresentar como uma forma de
impedir, reduzir ou melhorar as alterações morfológicas que o DM gera, sejam elas
gerados diretamente pela hiperglicemia causada pelo DM ou por danos secundários a
órgãos e sistemas corporais. Os resultados poderão sugerir a efetividade da utilização
deste aminoácido como uma terapia viável ao DM.
24
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33
CAPÍTULO 1
Effects of extract Allium cepa L. (onion) and s-metilcystein in testicular morphology
of diabetic rats induced by estreptozotocin
ABSTRACT
Diabetes Melitos (DM) is a complex, endocrine and diffuse disease characterized by
elevated glycemia. One of the recently reported complications is infertility, which is
characterized by reduced testosterone levels and changes in the germinal epithelium of
the seminiferous tubules. The extract of Allium cepa L. (onion) has already been reported
as hypoglycemic and antilipemic. The amino acid extracted from this extract, called S-
methylcysteine, presents even more positive results in several studies. The acquisition of
new therapies that may aid in the treatment of diabetes is extremely important, since it
has a direct impact on the well-being of society. This work aimed to investigate the
biochemical, morphofunctional and morphometric aspects of the testicular tissue of
diabetic rats, induced by streptozotocin, treated with extract of A. cepa L. and with the
amino acid S-methylcysteine. Male Wistar rats (45 days) weighing 200-250 g were
divided into four groups: normoglycemic control, diabetic without treatment, diabetic
treated with the extract of A. cepa L. (400 mg / kg) and diabetic treated with the amino
acid S-methylcysteine (200 mg / kg). DM was induced by streptozotocin (40 mg / kg
intraperitoneally) and the treatment was performed by gavage daily for a period of 4
weeks. After euthanasia, the testes were collected for histological analysis of tissue
integrity (Hematoxylin and Eosin), morphometry (toluidine blue) and
immunohistochemistry for testosterone receptors. Both treatments were able to reduce
the glycemia of the animals, but were not able to interfere in biometric parameters.
Morphometrically, both treatments were able to improve the testicular tissue, raising the
height of the epithelium and diameter of the seminiferous tubules. However, the
treatments were not able to interfere with the intertubular components. The morphological
analyzes of the tissue showed a visible improvement for both treatments, and the
immunohistochemistry presented an improvement in the presentation of receptors for
testosterone for both treatments, mainly for the extract. The onion extract presented
positive results as a form of therapy, mainly on the availability of receptors for
testosterone. The isolated amino acid was able to present even better results in a
generalized way in the improvement of the integrity of the testicular tissue.
34
Key words: Diabetes mellitus, Onion extract, Testicular morphophysiology,
Immunohistochemistry
INTRODUÇÃO
O Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica associada a problemas com a
produção, secreção ou utilização de insulina e, sendo este o hormônio responsável por
regular a glicemia, o indivíduo apresenta altas concentrações de glicose circulante,
sintoma marcante em indivíduos diabéticos (BURUL-BOZKURT et al., 2010). Esta
elevação da glicemia pode levar ao desenvolvimento de complicações sistêmicas que
incluem cetoacidose, nefropatia, retinopatia, neuropatia, problemas circulatórios e
infertilidade (SCHOELLER et al., 2012; VAN BELLE et al., 2011).
Indivíduos que vivem com esta doença tendem a apresentar maiores riscos de
morbidade e mortalidade quando comparados com a população em geral (OGURTSOVA
et al., 2017). A estimativa de pessoas convivendo com a diabetes tem aumentado
drasticamente, elevando de 30 milhões em 1964 para mais de 422 milhões em 2014 e,
acompanhando esta progressão, acredita-se que em 2040 este número chegue a 642
milhões (OGURTSOVA et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2017; WHO, 2016). O Brasil
atualmente ocupa o quarto lugar dentre os países com maior prevalência de indivíduos
com diabetes, apresentando cerca de 14,3 milhões de pessoas afetadas, com idades
variando entre 20 e 79 anos (OLIVEIRA et al., 2017).
O sistema reprodutor masculino é um dos sistema acometidos pelos danos
causados pelo DM, chegando a 90% o número de indivíduos acometidos por algum
distúrbio na função sexual (ALVES et al., 2013). Os testículo são gônadas presentes em
mamíferos do sexo masculino, sendo responsáveis pela produção de espermatozoides,
assim como a produção e liberação de testosterona, o que faz desse órgão extremamente
importante para reprodução e aquisição das características sexuais secundárias
(CORONA et al., 2011; DOHLE et al., 2012; PITTELOUD et al., 2005).
Este órgão pode ser dividido histologicamente em dois compartimentos, sendo um
(germinativo) onde se alojam as células germinativas e células de Sertoli (células
somáticas responsáveis por sustentação) e outro (intersticial) onde se encontra o tecido
de sustentação responsável por diversas funções, como produção de testosterona e céulas
responsáveis por auxiliar na expulsão dos espermatozoides dos túbulos seminíferos
35
(CHAVES-POZO et al., 2018; Lo NOSTRO et al., 2004; NÓBREGA et al., 2009;
SCHULZ et al., 2010, 2010). O DM está envolvida na redução dos níveis de testosterona,
destruição das células de Leydig, alterações na espermatogênese e alterações na contagem
e mobilidade de espermatozoides (BACCETTI et al., 2002; ERSOY and KIZILAY, 2018;
KOH, 2007).
A utilização de fitoterápicos é algo que já vem sendo aplicada a vários anos como
modo alternativo baratas e mais acessíveis de tratamento para diversas doenças. Já se sabe
que o extrato obtido da cebola é capaz de reduzir a hiperglicemia, assim como atenuar o
estresse oxidativo em distúrbio metabólicos em estudos relacionados a diabetes
(SEETUR R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017; S.R. PRADEEP e SRINIVASAN 2017).
A aplicação de recursos para descoberta de novas terapias para tratar a diabetes de modo
mais acessível e barato pode auxiliar na redução dos danos causados por esta doença ou
até mesmo impedi-los de acometer os sistemas.
Assim como o uso de fitoterápicos, a extração de componentes destes fitoterápicos
presentes em plantas e saber sua capacidade pode ser uma chave para entender como os
fitoterápicos funcionam ou se há modos de potencializar o seu funcionamento. S-
metilcisteína (SMC) é um aminoácido sulfatado hidrofílico encontrado em plantas do
gênero Allium, como alho e cebola (JONES et al. 2004). Estudos anteriores demonstraram
que o SMC apresenta uma atividade antilipêmica (HASIMUN e SUKANDAR, 2011),
assim como antidiabéticas (KUMARI, MATHEW, e AUGUST 1995; KUMARI e
AUGUSTI 2002). Porém, não existem estudos voltados para compreender a aplicação da
S-metilcisteína como tratamento para os danos causados pelo DM no tecido testicular.
Este trabalho teve como objetivo avaliar os danos gerados pelo DM no tecido
testicular de ratos diabéticos. De mesmo modo, também avaliar a capacidade do extrato
de Allium cepa L. (cebola) e o aminoácido isolado S-metilcisteína em auxiliar na redução
destes danos e/ou prevenir que a diabetes venha a causar alterações no tecido testicular.
Além disso, comparar a efetividade de ambos estes tratamentos com o intuito de
determinar qual seria a terapia mais indicada para auxiliar na redução destes danos
gerados pelo DM.
36
MATERIAIS E MÉTODOS
Modelo experimental
Para avaliação dos efeitos do extrato da cebola Allium cepa L., assim como do
aminoácido isolado, foi utilizado um modelo experimental de ratos da linhagem Wistar
(Rattus norvegicus albinus) com o DM-1 induzido pela utilização de estreptozotocina
(STZ). A STZ é um componente extraído de uma bactéria gram-negativa Streptomyces
achromogenes, capaz de causar uma destruição parcial ou total das ilhotas pancreáticas,
o que causa alteração na produção da insulina (HERR et al., 1959) e leva ao
desenvolvimento de um quadro hiperglicêmico característico do DM-1.
Este conhecido modelo experimental é capaz de mimetizar os efeitos da diabetes
de modo sistêmico em animais (TAKADA et al., 2007). Partindo desse modelo, a partir
da obtenção dos ratos diabéticos, estes foram dividos em grupos e direcionados para seus
respectivos tratamentos com o extrato da cebola Allium cepa L. e um aminoácido isolado
presente na cebola (S-metilcisteína), para verificar seus efeitos nas alterações
morfológicas do tecido testicular dos ratos portadores de diabetes.
Obtenção e preparo extrato metanólico de Allium cepa L. e sulfóxido de s-
metil-cisteína
O preparo do extrato metanólico de Allium cepa L. foi realizado no Laboratório
de Pesquisa em Matéria Médica (LAPEMM) do Departamento de Medicamentos da
Faculdade de Farmácia da UFBA. As cebolas foram descascadas, cortadas e maceradas a
frio em 3 balões de 1000ml, permanecendo com álcool metílico 99,8% (CH3OH) por 7
dias. Após a filtragem, o extrato foi concentrado sob pressão reduzida em evaporador
rotatório. O processo foi repetido três vezes, chegando a exaustão. O extrato metanólico
após secagem na estufa, teve rendimento de 4,8% e foi mantido em -20°C até a utilização.
O SMCS, com 99% de pureza ( (R)-2-Amino-3-(methylmercapto) propionic acid,
SMLC) foi obtida comercialmente da Sigma-Aldrich®. O extrato de Allium cepa L. e o
SMCS utilizados nos tratamentos in vivo foram solubilizadas em solução salina estéril,
nas concentrações definidas para o experimento.
37
Desenho experimental
Foram utilizados 28 ratos machos da linhagem Wistar, com 45 dias de idade,
pesando cerca de 200-250g. Estes animais foram provenientes do estudo “Avaliação dos
efeitos do extrato Allium cepa L. e S-metilcisteína em ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina” aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais (CEUA), com
protocolo de número 012.018/2017. Os animais foram adquiridos do Biotério do Centro
de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN),
sendo divididos em 4 (quatro) grupos:
• C (animais normoglicêmicos), com tamanho amostra de n = 7;
• DM (animais diabéticos não tratados), com tamanho amostral de n = 7;
• DAC (animais diabéticos tratados com 400 mg/kg o extrato Allium cepa L.), com
tamanho amostral de n = 7;
• DSM (animais diabéticos tratados com 200 mg/kg o aminoácido S-metilcisteína),
com tamanho amostral de n = 7.
Os animais permaneceram alojados em caixas de polipropileno providas de
bebedouro e comedouro disponível ad libitum durante o período de ambientação de uma
semana. Após esse período de adaptação, os animais foram separados em grupos de 3
(três) animais e alocados em caixas (41 x 34 x 16 cm) já determinando quais seriam os
animais que passariam pelo processo de indução da diabetes e mantidos em condições
controladas de temperatura (24±2°C) e de iluminação (ciclo de 12/12 claro e escuro).
Protocolo experimental
Após um período de 14 horas de jejum, os animais dos grupos separados para
indução da diabetes receberam uma dose única de STZ (40 mg/kg) por via intraperitoneal,
dissolvida em 10 mmol/L de solução citrato de sódio (pH 4,5) (CHANDIRASEGARAN
et al., 2018). Após cinco dias da indução, a glicemia de todos os animais que passaram
pelo procedimento foi mensurada por meio de glicosímetro portátil (ONETOUCH,
Ultra®). Animais que apresentaram uma glicemia ≥250 mg/dl foram considerados aptos
a participarem da pesquisa por apresentarem perfil diabético e foram alocados nos grupos
DM, DAC e DSM, recebendo seus tratamentos respectivos.
38
Uma semana após a indução, foi iniciado o tratamento, que teve como duração 30
dias consecutivos, com o extrato Allium cepa L. na dose de 400 mg/kg (FALLAH et al.,
2017) para os animais do grupo DAC e s-metilcisteína na dose de 200 mg/kg (KUMARI
and AUGUSTI, 2002) para os animais do grupo DSM, diluídos em água destilada. Nos
animais dos grupos CT e DM solução salina foi administrados por gavagem. Após a
finalização dos 30 dias de tratamento, 24 horas depois do último tratamento, foi realizada
a eutanásia dos animais (Figura 1). Os animais foram anestesiados e eutanasiados com
isoflurano inalatório e posteriormente foi realizada a coleta de sangue por punção cardíaca
e remoção de ambos os testículos para posterior processamento histoquímico e de
imunomarcações.
Figura 1. Protocolo experimental da indução do DM-1, tratamentos realizados, e
eutanásia para remoção das amostras de órgãos em Ratos Wistar. Os valores entre
parênteses representam a dosagem administrada (i.p. = via intraperitoneal; v.o. = via oral).
Avaliação de consumo de água e ração
Foi realizada a medição do consumo de água e ração diários durante o período
experimental de 30 dias para cada caixa. A ração foi pesada em balança (Marte – Marte
Científica e industrial Ltda - Brasil) a quantidade de ração restante na grade de
alimentação subtraído da quantidade que foi adicionada no dia anterior (250 g de ração
diárias). O consumo de água foi avaliado em proveta plástica a partir da medição do
volume restante de água nos recipientes subtraído do volume total de água que foi
adicionado nos recipientes no dia anterior (1000 mL de água diárias). A partir de uma
média de consumo dentro dos 30 dias do experimento, foi comparado o consumo destes
39
insumos para cada grupo experimental, com o intuito de averiguar se haveria ou não
alteração em seu consumo.
Análises de glicemia
Amostras de sangue de cada animal foram coletadas por punção cardíaca após a
eutanásia dos animais em frascos devidamente etiquetados e sem anticoagulante. Após a
formação do coágulo primário, o sangue foi centrifugado para aquisição do soro, material
utilizado para determinação da glicemia neste estudo. A partir do soro, foi realizada
análise da glicemia dos animais de todos os grupos utilizando-se kits LABTEST (Lagoa
Santa, Minas Gerais, Brasil), de acordo com a metodologia descrita pelo fabricante e
fazendo uso de um analisador bioquímico LABMAX PLENNO (Labtest, Lagoa Santa,
Minas Gerais, Brasil).
Biometria corporal e testicular
Antes da eutanásia dos animais, eles foram pesados individualmente em balança
de precisão (BEL Photonics do Brasil E. C. Ltda – Brasil). Este peso foi utilizado para
posterior comparação entre os grupos experimentais. Os testículos coletados após a
eutanásia foram pesados em balança de precisão (BEL Photonics do Brasil E. C. Ltda –
Brasil). Para determinar o peso do parênquima testicular, a membrana conjuntiva que
recobre o testículo (denominada albugínea), foi retirada e pesada. O valor correspondente
ao seu peso foi subtraído do peso total do testículo, que foi obtido anteriormente. Baseado
nos pesos corporal e testicular foi calculado o índice gonadossomático (IGS, em
porcentagem) a partir da divisão do peso testicular total pelo peso corporal, e multiplicado
por 100 (FLORES et al., 2015). O índice parenquimossomático (IPS, em porcentagem)
foi determinado pela divisão do peso do parênquima testicular pelo peso corporal, e
multiplicado por 100 (SILVA, 1965).
Técnicas Histológicas
Para realização das análises histológicas foram utilizados os 28 animais dos quatro
grupos experimentais. Os tecidos testiculares foram dissecados e fixados em solução de
paraformaldeído 4% por 24 horas. Após a fixação, foi coletado um fragmento do ápice
de um testículo, direito, de cada animal, que em seguida foi desidratado em seis banhos
de 30 minutos de álcool gradativamente mais concentrados (álcool 70%, 80%, 90%, 95%
40
e dois banhos em álcool absoluto). Após a desidratação, o material foi impregnado em
dois banhos de resina, sendo um overnight e um por duas horas. Após a impregnação, o
material foi incluído em historesina (Historesin, Leica Microsystems, Nussloch,
Germany) para posterior secção e alocação em lâminas de vidro para microscopia.
A historesina (monômero de glicolmetacrilato) foi preparada seguindo o protocolo
disponibilizado pelo fabricante, onde foi misturado 50 mL de resina básica a um ativador
(peróxido de benzoila) (sachê de 0,5g), agitando por 5 minutos ou até diluição completa.
Após a diluição, adicionou-se um endurecedor (derivado de ácido barbitúrico), na
proporção de 1 mL de endurecedor para cada 15 mL de resina. Com a resina pronta, pôde-
se realizar o emblocamento em placa de acrílico com o molde para o bloco, da seguinte
maneira: foi adicionado uma camada de resina no molde, e o material foi posicionado,
completando o resto do molde com a resina, e cobrindo o molde com Parafilm
(PARAFILM®, Chicago, EUA), isolando-o do contato com o ar. Ao final do processo, o
material foi armazenado em estufa overnight, sendo posteriormente removido do molde.
Após a remoção do material dos moldes de historesina, os blocos formados foram
microtomizados (RM 2255, Leica Biosystems, Nussloch, Germany) em secções
semisseriadas com espessura de 3 μm, respeitando uma espessura de 40 μm entre os
cortes. Foram feitas 2 lâminas por bloco, cada uma contendo 10 cortes. Uma das lâminas
foi corada em coloração de rotina de Hematoxilina e Eosina (HE) e outra corada em Azul
de toluidina. A preparação destas lâminas foi realizada em colaboração com o laboratório
de Biologia Celular e Estrutural da Universidade Federal de Viçosa (UFV) – MG.
Análise de dano tecidual
A coloração de HE foi utilizada para avaliar alterações teciduais, como
degeneração dos túbulos seminíferos, padrões inflamatórios, entre outras características
de lesão tecidual de modo qualitativo. Para a realização destas análises, foram utilizadas
imagens digitais obtidas em fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200)
equipado com câmera digital (Moticam 58D 5.0 MP).
A análise foi realizada de modo cego e semiquantitativo, identificando-se
alterações teciduais comuns no tecido, assim como a aquisição do Score de Johnsen
(JOHNSEN, 1970) e o Score de Johnsen alterado (DIAS et al., 2019). Segundo esta
classificação, quanto maior o escore entre os túbulos analisados, melhor e mais
41
organizado se encontra o tecido enquanto que, quanto menor o escore, mais alterado e
desorganizado se encontra o tecido. No escore alterado, se considera que no nível 1 os
túbulos estão normais, níveis 2 e 3 correspondem a alterações leves, níveis 4 e 5
apresentam alterações moderadas e, por fim, níveis 6, 7 e 8 correspondem a alterações
severas. Para a realização destes escores, foram necessárias a análise de 200 túbulos em
campos aleatórios (JOHNSEN, 1970) para cada animal dentro dos diferentes grupos.
Quadro 1 – Escore de Johnsen, para padrão histológico testicular (JOHNSEN, 1970).
Escore Nível de espermatogênese
1 Ausência de epitélio seminífero, esclerose tubular
2 Ausência de células germinativas, apenas células de Sertoli
3 Apenas espermatogônias
4 Alguns espermatócitos, espermatogênese estagnada no estágio de
espermatócitos primários
5 Vários espermatócitos
6 Algumas espermátides precoces, espermatogênese estagnada no estágio de
espermátide
7 Nenhuma espermátide tardia, várias espermátides precoces
8 Menos de cinco espermatozoides por túbulo
9 Espermatogênese levemente afetada
10 Espermatogênese completa
Quadro 2 – Escore de Johnsen alterado, para padrão histológico testicular (DIAS,
2018).
Escore Nível de espermatogênese
1 Túbulos íntegros, com células germinativas dispostas no seu sítio de
localização normal e poucos vacúolos
2 Espaços vacuolares na base do epitélio
3 Espaços vacuolares no ápice do epitélio
4 Espaços vacuolares na base e no ápice do epitélio
5 Células espermatogênicas no interior do lúmen e presença de células em
processo de degeneração visível
6 Túbulos contendo apenas células basais (espermatogônias e espermatócitos
primários)
42
7 Túbulos contendo apenas células de Sertoli
8 Túbulos seminíferos desprovidos de células de Sertoli ou germinativas
Análise Morfométrica
A coloração de azul de toluidina foi utilizada para realização da morfometria do
tecido testicular. Nessa análise foi avaliada a densidade percentual e total dos índices
tubulossomático e epiteliossomático, morfometria do túbulo seminífero, concentração
percentual e total de componentes do intertúbulo e parâmetros morfométricos das células
de Leydig. Para as análises morfométricas foram utilizadas imagens digitais obtidas em
fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200) equipado com câmera digital
(Moticam 58D 5.0 MP). Todas as imagens foram analisadas utilizando os softwares
Image J® (National Institute of Health, USA) e Image-Pro plus 5® (Media Cybernetics,
USA).
• Proporção volumétrica de túbulos seminíferos
Para a realização da proporção volumétrica de túbulos seminíferos foi realizada a
contagem de 266 pontos em 20 campos aleatórios, totalizando 5.320 pontos por animal.
O volume dos componentes testiculares (mL) foi estimado considerando o percentual
ocupado por cada constituinte multiplicado pelo peso do parênquima testicular. Levando
em consideração que a densidade do testículo de mamíferos é em torno de 1 g/cm3, a
massa do testículo foi considerada igual ao seu volume (COSTA et al., 2011; JOHNSON
et al., 1981).
• Índices tubulossomático e epiteliossomático
O índice tubulossomático (ITS) foi calculado a partir da divisão do volume de
túbulo seminífero pelo peso corporal x 100. O índice epiteliossomático (IES) foi obtido
pela divisão do volume do epitélio seminífero dividido pelo peso corporal multiplicado
por 100. Foram calculadas as áreas tubulares (ART), luminal (ARL) e epitelial (ARE), de
acordo com as fórmulas: ART= π*RT2, onde RT= raio tubular; ARL= π*RT2, onde RL=
raio luminal; ARE = ART – ARL e a Relação T/E= ART-ARE (DIAS et al., 2019).
• Diâmetro tubular médio e comprimento total dos túbulos seminiferos
O diâmetro tubular médio por animal foi obtido a partir da mensuração de 20
secções transversais de túbulos seminíferos que apresentavam contorno o mais circular
43
possível, sem considerar a fase do ciclo do epitélio seminífero, nem sua posição na
lâmina. Nestas mesmas secções, foi mensurada a altura do epitélio seminífero (média de
duas medidas diametralmente opostas). O comprimento total dos túbulos seminíferos
(CTS/t), em metros, foi estimado a partir do conhecimento do volume ocupado pelos
mesmos nos testículos e do diâmetro tubular médio obtido para cada animal a partir da
divisão do volume do túbulo seminífero (mL) pela área do túbulo seminífero (μm2)
(DIAS, 2018; DORST VJ, 1974). O comprimento total de túbulo por grama de testículo
foi calculado a partir da fórmula: CTS/g = Comprimento total de túbulos /Peso bruto dos
testículos (g).
• Proporção volumétrica do intertúbulo
Para realização da proporção volumétrica do intertúbulo foi realizada a contagem
de 266 pontos em 20 campos aleatórios, o que totalizou 5.320 pontos para cada animal.
O volume (mL) deste componente foi estimado a partir do percentual ocupado pelo
intertúbulo multiplicado pelo volume do parênquima testicular total. Para a aquisição das
proporções volumétricas (%) dos componentes do intertúbulo, foram contados 1.000
pontos projetados no espaço intertubular. Foram quantificados células de Leydig (núcleo
e citoplasma), macrófagos, vasos sanguíneos, espaço linfático e tecido conjuntivo. O
volume (mL) destes componentes foi calculado a partir da porcentagem de cada um
desses componentes/100, multiplicado pelo peso do parênquima de ambos os testículos.
• Parâmetros relacionados as células de Leydig
Para calcular parâmetros relacionados as células de Leydig, foram medidos 30
núcleos de contorno circular, cromatina perinuclear e nucléolo evidente destas células em
cada animal. Para calcular os volumes nuclear (VN), citoplasmático (VC) e das células
de Leydig (VL) foram utilizado as seguintes formulas expressas em μm3: VN = 4/3 πR3,
onde R = raio nuclear; VC=% de citoplasma*VN/% de núcleo; VL=VN+VC. O número
de células de Leydig por testículo (NLT) e por grama de testículo (NLGT) foram
utilizadas as seguintes fórmulas expressas em μm3: NLT=volume que as células de
Leydig ocupam por testículo/volume de uma célula de Leydig, NLGT=volume que a
célula de Leydig ocupa por grama de testículo/volume de uma célula de Leydig. Onde:
Volume que a células de Leydig ocupa por testículo = proporção da célula de Leydig no
testículo*peso do parênquima de um testículo/100, Volume que a célula de Leydig ocupa
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por grama de testículo = volume que a célula de Leydig ocupa por testículo/peso bruto de
um testículo. Para a realização do índice Leydigossomático (ILS) foi calculado utilizando
fórmula: ILS=volume que a célula de Leydig ocupa nos testículos / PC x 100, onde
PC=peso corporal.
Técnicas de Imunohistoquímica
Para realização das análises imunohistoquímicas foram utilizados os animais que
apresentaram alterações significativas após análise das lâminas coradas em HE. Os
tecidos testiculares foram fixados em solução de paraformaldeído 4% por 24 horas. Após
a fixação, o material foi seccionado e alocado em cassetes, que em seguida foi desidratado
em seis banhos de 60 minutos de álcool gradativamente mais concentrados (álcool 70%,
80%, 90%, e três banhos em álcool absoluto).
Após a desidratação, o material foi impregnado em três banhos de 60 minutos em
xilol e mais três banhos de 60 minutos em parafina. Após a impregnação, o material foi
incluído em parafina (Parafina histológica, Dinâmica química contemporânea Ltda,
Brasil). Após a aquisição dos blocos, cortes foram realizados e colocados em lâminas
silanizadas para realização do processo de imunohistoquímica. As lâminas foram
desparafinizadas por um período de 24 horas em estufa, e em seguida foram direcionadas
para a marcação.
O procedimento foi iniciado a partir de dois banhos de xilol, durante 10 minutos,
para remoção da parafina restante. Em seguida as lâminas passaram por um processo de
reidratação em concentrações decrescentes de álcool (dois álcoois absolutos, 95%, 90%
e 80%), com duração de 3 minutos, cada. Em seguida, foi realizada uma lavagem com
água destilada e as lâminas foram colocadas em banho maria por 30 minutos. Após um
descanso de 20 minutos à temperatura ambiente, as lâminas passaram por dois processos
de inativação de peroxidase com peróxido de hidrogênio por 10 minutos cada, com uma
lavagem com água destilada após cada adição de peroxido de hidrogênio.
Posterior a esta inativação, foi realizado o bloqueio de background por 5 minutos,
seguida por quatro lavagens, sendo a primeira com água destilada e as três subsequentes
com tampão fosfato-salino (PBS). Em seguida, foram adicionados os anticorpos
primários específicos para cada marcação de receptor de testosterona. As lâminas foram
armazenadas em geladeira por 18 horas para que os anticorpos pudessem se ligar aos seus
45
epítopos específicos. Após este período, as lâminas foram lavadas com PBS para remoção
do excesso de anticorpos, sendo em seguida adicionado o anticorpo secundário por 15
minutos.
Em seguida, foi adicionado o conjugado com strept avidina HRP por 30 minutos
para amplificar o resultado da reação. Foram realizadas, posteriormente, duas lavagens
com PBS, sendo seguidas pela adição de diaminobenzidina 3,3’ (DAB) por 10 minutos.
Após uma lavagem com água destilada, foi realizada a contracoloração com hematoxilina
de Harris por 10 minutos. Finalizando a contracoloração, as lâminas foram lavadas,
desidratadas com álcool 95% (um banho) e absoluto (três banhos), três banhos de xilol e,
por fim foram montadas com lamínula e Entelan (Merck).
Para a realização desta análise, foram utilizadas imagens digitais obtidas em
fotomicroscópio de campo claro (Nikon ECLIPSE E200) equipado com câmera digital
(Moticam 58D 5.0 MP). As análises foram realizadas de modo cego e qualitativo,
comparando as marcações de cada grupo, avaliando a presença de células marcadas na
região intertubular e comparando a presença de células marcadas no epitélio dos túbulos
seminíferos.
Análise estatística
Para realização da determinação da normalidade da distribuição dos dados, foi
realizado o teste de Kolmogorov-smirnov no software Bioestat® 5.0 (Instituto Mamirauá,
Brasil). Após a determinação da normalidade dos dados, as análises estatísticas foram
realizadas pelo software GraphPad Prim 6® (GraphPad Software Inc., EUA), sendo
realizado o teste ANOVA one-way para comparar as diferenças entres os grupos. Na
presença de diferenças entre os grupos, comparações múltiplas post hoc foram conduzidas
através do teste de Sidak. Valores de P ≤ 0.05 foram considerados como estatisticamente
significativos, e os resultados foram expressos como a média ± o desvio padrão.
RESULTADOS
Glicemia e consumo de insumos
A partir da comparação da concentração de glicose circulante, foi possível notar
que os grupos diabéticos apresentavam uma glicemia superior, quando comparados com
o grupo controle (Tabela 1). Ambos os grupos tratados com o extrato da Allium cepa L e
46
S-metilcisteína apresentaram uma glicemia inferior ao grupo diabético sem tratamento.
O grupo tratado com a aminoácido S-metilcisteína apresentou uma glicemia inferior
quando comparado ao grupo tratado com A. cepa L. Com isso, é possível inferir que
ambos os tratamentos atuam reduzindo a glicemia dos ratos diabéticos, sendo o
tratamento com o aminoácido isolado mais eficiente (Tabela 1).
Acerca da comparação da média de consumo de água e ração pelos grupos, não
foram vistas diferenças estatísticas relevantes. O consumo de água foi semelhante entre
todos os grupos diabéticos, sendo quatro vezes mais elevado quando comparado ao grupo
controle. Já o consumo de ração foi elevado nos grupos diabéticos (sem e com
tratamento), quando comparado com o grupo controle não diabético (Tabela 1). O que
significa que ambos os tratamentos não foram capazes de conter tanto o consumo de água
e ração de animais diabéticos.
Tabela 1 – Valores de glicemia, consumo de água e consumo de ração dos grupos
experimentais.
CT DM DAC DSM
Glicemia (mg/dL) 121 ± 6.34 700 ± 36.95* 566 ± 35.27*# 513 ± 19.83*#+
Água (mL) 140 ± 5.00 557 ± 31.11* 500 ± 47.9* 559 ± 9.13*
Ração (g) 87 ± 3.9 111 ± 18* 94 ± 10.13* 110 ± 2.86*
Dados expressos como média ± DP.
*Diferença com o grupo controle.
#Diferença com o grupo DM.
+Diferença com o grupo DAC.
Parâmetros biométricos
A partir da comparação das médias de peso dos animais, foi visto que os animais
diabéticos apresentavam um peso inferior quando comparados ao grupo controle não
diabético. Ambos os grupos tratados também apresentavam um peso inferior ao grupo
diabético sem tratamento (Tabela 2). Quanto ao peso testicular, foi visto que os grupos
diabéticos apresentavam um peso inferior, quando comparados ao grupo controle não
diabético. Isso pode indicar nenhum dos tratamentos foi capaz de interferir na perda de
massa testicular. Porém, os grupos tratados não apresentavam diferença estatística entre
eles e nem quando comparados ao grupo diabético sem tratamento (Tabela 2).
47
Avaliando as médias dos pesos da túnica albugínea dos grupos experimentais, foi
possível observar que não havia diferença estatística entre os grupos. O que demonstrou
que a diabetes não interferiu relevantemente no peso desta membrana conjuntiva, assim
como ambos os tratamentos não foram capazes de modificar o peso desta túnica (Tabela
2). Quanto ao peso do parênquima testicular, foi possível observar que os grupos DM e
DAC apresentaram um peso inferior quando comparados ao grupo controle. Porém, o
grupo DSM não apresentou diferença estatística quando comparado a todos os grupos
experimentais, o que demonstra que o tratamento foi capaz de melhorar o peso do
parênquima, mas não de modo eficaz (Tabela 2).
O índice gonadossomático (IGS) dos grupos foi semelhante para todos, o que pode
estar ligado a perda de peso corporal e testicular equivalente entre os grupos. Como os
animais dos grupos diabéticos perderam peso, porém o testículo aumentou o peso, isso
leva a uma elevação no IGS. Nestes mesmos grupos não foi possível observar diferença
com relevância estatística entre os grupos controle e diabéticos (Tabela 2). Assim como
o IGS, o índice parenquimossomático (IPS) também demonstrou semelhança entre os
grupos experimentais, por motivos semelhantes aos observados no IGS (Tabela 2).
Tabela 2 – Parâmetros biométricos, corporal e testicular dos grupos experimentais.
CT DM DAC DSM
Peso corporal (g) 283 ± 39.84 226 ± 21.31* 184 ± 18*# 189 ± 2.65*#
Peso testicular (g) 1.63 ± 0.14 1.35 ± 0.20* 1.21 ± 0.13* 1.25 ± 0.19*
Peso albugínea (g) 0.33 ± 0.12 0.21 ± 0.14 0.23 ± 0.7 0.23 ± 0.9
Peso parênquima (g) 1.3 ± 0.17 1.14 ± 0.23 * 0.98 ± 0.16 * 1.02 ± 0.23
IGS (%) 1,15 ± 0.19 1,19 ± 0.13 1,31 ± 0.09 1,32 ± 0.20
IPS (%) 0.93 ± 0.21 0.96 ± 0.20 1.06 ± 0.14 1.04 ± 0.26
IGS - Índice gonadossomático; IPS – Índice parenquimossomático. Dados expressos como média ± DP.
*Diferença com o grupo controle.
#Diferença com o grupo DM.
Escore tecidual
A partir da realização do escore de Johnsen, que demonstra alterações na
organização tubular, assim como na espermatogênese, foi possível identificar que todos
os grupos diabéticos apresentavam um escore inferior quando comparados ao grupo
controle não diabético. Isso comprova que o DM pode estar interferindo no
48
desenvolvimento adequado da espermatogênese. Por outro lado, ambos os grupos tratados
apresentaram um escore superior ao grupo diabético não tratado, o que demonstra que os
tratamentos podem atenuar os danos morfológicos ou auxiliar no reparo do dano causado
pelo DM. Porém, não houve diferença estatisticamente relevante entre os tratamentos
(Tabela 3).
Assim como o escore de Johnsen, o escore modificado também apresentou
resultados que demonstraram que os túbulos de ratos diabéticos apresentam um escore
superior, quando comparados ao grupo controle não diabético. Isso demonstra, mais uma
vez, que a diabetes está causando alterações nos túbulos seminíferos. Da mesma forma,
os grupos tratados apresentaram um escore inferior, quando comparados com o grupo
diabético não tratado. Demonstrando, novamente, que os tratamentos podem estar
auxiliando na proteção ou reparo dos túbulos seminíferos. Porém, não houve diferença
estatisticamente relevante entre os tratamentos (Tabela 3).
Tabela 3 – Valores dos escore de Johnsen e escore de Johnsen modificado nos grupos
experimentais
CT DM DAC DSM
Escore de Johnsen 9.85 ± 0.1 6.36 ± 0.67* 8.49 ± 0.49*# 9.04 ± 0.43*#
Escore de Johnsen
modificado
1.15 ± 0.1 3.79 ± 0.4* 2.48 ± 0.41*# 2.10 ± 0.39*#
Dados expressos como média ± DP.
*Diferença com o grupo controle.
#Diferença com o grupo DM.
Morfometria testicular
A partir da análise qualitativa da densidade volumétrica percentual e total de
componentes tubulossomático e epiteliossomático, foi possível observar que o grupo
DAC apresentou um percentual tubular (T) superior, quando comparado ao grupo
controle. Quanto aos grupos DM e DSM, não houve diferença estatística entre estes
grupos e o grupo controle (Tabela 4). Porém, quando avaliado o volume tubular total
(VT), não foi possível observar esta elevação (Tabela 4). O que demonstra que os
tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.
Quanto ao volume percentual de epitélio (E), foi possível observar que o grupo
DM apresentou uma menor média, quando comparado ao grupo controle (Tabela 4). Os
grupos DAC e DSM apresentaram um volume percentual de epitélio seminífero superior
ao grupo DM, também não apresentando diferença estatística entre os mesmos e o grupo
49
controle (Tabela 4). Por outro lado, quando avaliado o volume epitelial total (VE), não
houve diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 4). O que demonstra
que os tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.
Comparando a densidade volumétrica percentual de túnica própria (TP), foi
possível observar que os grupo DM apresentou um espessamento desta túnica, por outro
lado, os grupos tratados DAC e DSM não apresentaram resultados estatisticamente
relevantes quando comparados ao grupo controle e DM (Tabela 4). Porém, quando
avaliado a densidade de volume da túnica própria total (VTP), não foi possível observar
diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 4). O que demonstra que os
tratamentos não foram capazes de interferir neste parâmetro.
Quando comparada as médias da densidade volumétrica percentual (L) e total
(VL) do lúmen dos grupos experimentais, não foi possível observar diferença estatística
relevante entre os grupos (Tabela 4). Avaliando os índices tubulossomático (ITS) e
epiteliossomático (IES), não foi possível observar diferença estatística entre os grupos
experimentais em ambos os índices (tabela 4). O que demonstra que os tratamentos não
foram capazes de interferir neste parâmetro.
Tabela 4 - Densidade volumétrica (%), volume (mL) dos componentes tubulares e
índices tubulossomático e epiteliossomático dos grupos experimentais.
CT DM DAC DSM
T (%) 92.68 ± 0.83 93.36 ± 1.42 94.50 ± 1.20* 94.42 ± 0.68
E (%) 59.11 ± 3.78 54.50 ± 0.89* 59.76 ± 2.33# 58.91 ± 2.59#
TP (%) 9.40 ± 0.46 10.03 ± 0.25* 9.93 ± 0.27 9.69 ± 0.24
L (%) 24.18 ± 3.71 28.83 ± 1.96 24.82 ± 1.99 27.49 ± 4.02
VT (mL) 2.41 ± 0.32 1.96 ± 0.43 1.85 ± 0.29 1.91 ± 0.44
VE (mL) 1.54 ± 0.20 1.15 ± 0.26 1.17 ± 0.18 1.20 ± 0.31
VTP (mL) 0.24 ± 0.03 0.21 ± 0.05 0.19 ± 0.03 0.20 ± 0.04
VL (mL) 0.63 ± 0.14 0.61 ± 0.14 0.49 ± 0.09 0.56 ± 0.17
ITS (%) 0.86 ± 0.20 0.90 ± 0.19 1.00 ± 0.13 0.98 ± 0.24
IES (%) 0.55 ± 0.12 0.52 ± 0.11 0.63 ± 0.08 0.62 ± 0.17
T– percentual de Túbulo seminífero; E - percentual de epitélio seminífero; TP – Percentual de Túnica Própria; L-
Percentual de Lúmen; VT – Volume de túbulo seminífero; VE – Volume de Epitélio; VTP – Volume de Túnica
Própria; VL – Volume de Lúmen; ITS – Índice Tubulossomático; IES – Índice Epiteliossomático. Dados expressos
como média ± DP. *Diferença com o grupo controle.
50
#Diferença com o grupo DM.
Analisando o diâmetro do túbulo seminífero (DT), foi possível observar que o
grupo DM apresenta um diâmetro inferior, quando comparado ao grupo controle (Tabela
5). O grupo DAC não apresentou diferença estatística relevante quando comparado aos
grupos experimentais (tabela 5). Por outro lado, o grupo DSM apresentou um diâmetro
superior, quando comparado aos grupos DM e DAC, porém não apresentou diferença
estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). Isso pode demonstrar uma
capacidade de prevenir a degradação do túbulo seminífero pelo aminoácido isolado.
Quando avaliada a altura do epitélio (AE), podemos observar que o grupo DM
apresentou uma altura inferior quando comparado a todos os grupos experimentais
(Tabela 5). Os grupos DAC e DSM apresentaram um epitélio mais alto quando
comparado ao grupo DM e não apresentaram diferença estatística quando comparado ao
grupo controle (Tabela 5). Resultado semelhante ao observado no diâmetro do lúmen
tubular (DL), onde o grupo DM apresentou um diâmetro superior aos outros grupos
experimentais e os grupos DAC e DSM não apresentaram diferença estatística com o
grupo controle (Tabela 5). O que demonstra que ambos os tratamentos são capazes de
conservar ou melhorar o epitélio do túbulo seminífero.
Avaliando o comprimento total do túbulo seminífero (CTS/s), este apresenta um
comprimento menor no grupo DSM, quando comparado ao grupo DM, porém não
apresenta diferença estatística quando comparado aos grupos experimentais (Tabela 5).
Os grupos controle, DM e DAC não apresentam diferença estatística relevante (Tabela
5). Também quando avaliado o comprimento total do túbulo seminífero por grama de
testículo, não é observada diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 5).
Calculando a área do túbulo seminífero, foi possível observar que o grupo DM
apresenta uma menor área, quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). O grupo
DSM apresenta uma área maior quando comparado ao grupo DM e DAC, também não
apresentando diferença estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela 5). O
grupo DAC não apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo controle e
DM (Tabela 5). Quanto a área do lúmen, foi possível observar que o grupo DM apresentou
uma área maior do que os grupos controle, DAC e DSM (Tabela 5).
Quando avaliada a área do epitélio, pode ser observado que o grupo DM
apresentou uma área menor, quando comparado aos grupos controle, DAC e DSM
51
(Tabela 5). O grupo DSM apresentou uma área maior, quando comparado ao grupo DAC,
porém não apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo controle (Tabela
5). Realizando uma relação túbulo/epitélio é possível observar que o grupo DM apresenta
uma relação maior, quando comparado aos grupos experimentais (Tabela 5). Isso é
possível, pois o grupo DM apresenta um diâmetro tubular menor e uma altura epitelial
também menor em relação aos outros grupos experimentais, o que leva a uma elevação
desta relação.
Tabela 5: Morfometria de túbulo seminífero dos grupos experimentais.
CT DM DAC DSM
DT (μm) 379.96±17.00 335.86±12.28* 362.12±19.33 394.25±20.05#+
AE (μm) 104.03±3.37 61.46±4.17* 109.70±5.33# 110.98±5.27#
DL (μm) 171.91±22.22 212.95±14.76* 142.73±20.83# 172.29±15.31#
CTS/t (m) 21.54±4.55 22.26±5.17 18.04±2.97 15.74±4.08#
CTS/g (m/g) 6.57±0.92 8.24±1.18 7.45±1.22 6.24±1.00
Área do túbulo
(μm2x104)
11.35±1.02 8.86±0.65* 10.31±1.09 12.22±1.26#+
Área do lúmen
(μm2x104)
2.35±0.6 3.57±0.48* 1.62±0.47# 2.34±0.43#
Área do epitélio
(μm2x104)
8.99±0.44 5.29±0.36* 8.69±0.73# 9.88±0.91#+
RTE 1.26±0.05 1.68±0.10* 1.19±0.05# 1.24±0.03#
DT – Diâmetro de túbulo; AE- altura do Epitélio; DL- Diâmetro de Lume; CTS/t- Comprimento total de túbulo
seminífero; CTS/g- Comprimento total de túbulo seminífero por grama de testículo e RET – Relação túbulo/Epitélio.
Dados expressos como média ± DP *Diferença com o grupo controle.
#Diferença com o grupo DM.
+ Diferença com o grupo DAC.
A partir da análise do volume percentual do intertúbulo, foi possível observar que
o grupo DAC apresentou um volume inferior, quando comparado ao grupo controle
(Tabela 6). Os outros grupos experimentais não apresentaram diferença estatística entre
eles (Tabela 6). Por outro lado, quando avaliado o volume total, ambos o grupo DAC e
DSM apresentaram um volume inferior, quando comparados ao grupo controle (Tabela
6). Porém, não apresentaram diferença estatística quando comparados ao grupo DM.
52
Avaliando o volume percentual e total de vasos sanguíneos no intertúbulo, não foi
observada diferença estatística relevante entre os grupos experimentais (Tabela 6) apesar
de haver um leve aumento da presença dos vasos nos grupos diabéticos. Quanto ao
volume do espaço linfático, foi visto que percentualmente os grupos DAC e DSM
apresentam um volume inferior, quando comparados ao grupo DM, porém o volume total
foi inferior para todos os grupos diabéticos, quando comparados ao grupo controle
(Tabela 6).
O volume percentual do citoplasma e núcleo das células de Leydig, assim como o
volume total nuclear e volume percentual e total da concentração destas células no
intertúbulo, não foi estatisticamente diferente entre os grupos experimentais (Tabela 6).
Porém, comparando as médias do volume total do citoplasma das células de Leydig, foi
possível observar que o grupo DSM apresentou um volume inferior, quando comparado
ao grupo controle (Tabela 6). Enquanto que os grupos DM e DAC não apresentaram
diferença estatística entre eles e também com o grupo controle. O que demonstra que a
utilização do aminoácido isolado não foi capaz de impedir o dano da hiperglicemia nas
células de Leydig.
O volume percentual de tecido conjuntivo, nos grupos DAC e DSM apresentaram
um volume inferior, quando comparado ao grupo controle, porém não apresenta diferença
estatística relevante em relação ao grupo DM (Tabela 6). Entretanto, quando avaliado o
volume total de tecido conjuntivo, foi evidenciado que todos os grupos diabéticos (DM,
DAC e DSM) apresentaram um volume inferior quando comparado ao grupo controle
(Tabela 6). Por fim, o volume percentual e total de macrófagos no tecido intertubular não
foi estatisticamente diferente entre os grupos experimentais (Tabela 6).
53
54
Tabela 6: Volume percentual e total dos componentes do intertúbulo dos grupos experimentais.
CT DM DAC DSM
Intertúbulo (%) 7.32 ± 0.83 6.64 ± 1.42 5.50 ± 1.20* 5.58 ± 0.68
Vaso sanguíneo (%) 0.43 ± 0.15 0.60 ±0.37 0.59 ±0.17 0.79 ± 0.54
Espaço linfático (%) 1.63 ± 0.31 1.24 ±0.32 0.80 ± 0.29* 0.91 ± 0.25*
Núcleo de Leydig (%) 1.32 ± 0.25 1.58 ±0.44 1.35 ± 0.23 1.34 ± 0.26
Citoplasma de Leydig (%) 0.56 ± 0.12 0.45 ±0.09 0.49 ± 0.17 0.39 ± 0.05
Leydig (%) 1.89 ± 0.33 2.02 ±0.48 1.84 ± 0.39 1.73 ± 0.29
Tecido conjuntivo (%) 3.32 ± 0.45 2.71 ±0.57 2.21 ± 0.62* 2.10 ± 0.38*
Macrófago (%) 0.10 ± 0.12 0.07 ±0.03 0.06 ± 0.03 0.05 ± 0.01
Intertúbulo (mL) 0.19 ± 0.03 0.14 ± 0.04 0.12 ± 0.02* 0.12 ± 0.03*
Vaso sanguíneo (mL) 0.011 ± 0.003 0.013 ± 0.009 0.013 ± 0.004 0.018 ± 0.015
Espaço linfático (mL) 0.042 ± 0.009 0.026 ± 0.008* 0.017 ± 0.005* 0.019 ± 0.008*
Núcleo de Leydig (mL) 0.034 ± 0.008 0.034 ± 0.013 0.029 ± 0.007 0.027 ± 0.006
Citoplasma de Leydig (mL) 0.014 ± 0.003 0.009 ± 0.002 0.01 ± 0.003 0.008 ± 0.002*
Leydig (mL) 0.049 ± 0.012 0.044 ± 0.015 0.04 ± 0.009 0.036 ± 0.008
Tecido conjuntivo (mL) 0.087 ± 0.01 0.058 ± 0.016* 0.048 ± 0.014* 0.044 ± 0.013*
Macrófago (mL) 0.002 ± 0.002 0.001 ± 0.0008 0.001 ± 0.0007 0.0009 ± 0.0002
Dados expressos como média ± DP *Diferença com o grupo controle
55
Avaliando parâmetros morfométricos relacionados a célula de Leydig, pode ser
observado que os grupos diabéticos apresentam um diâmetro nuclear inferior, quando
comparado ao grupo controle (Tabela 7). O grupo DSM apresentou um diâmetro menor,
quando comparado ao grupo DM (Tabela 7). O mesmo padrão foi observado no volume
nuclear desta mesma célula (Tabela 7). Quanto ao volume do citoplasma, foi visto que os
grupos diabéticos apresentaram um volume menor, quando comparados ao grupo
controle, assim como o volume total de células de Leydig (Tabela 7).
No volume total de células de Leydig por testículo e por grama de testículo, foi
observado que não havia diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 7).
O número de células de Leydig por testículo foi superior no grupo DSM, quando
comparado com o grupo controle (Tabela 7), enquanto que os outros grupos
experimentais não apresentaram diferença estatística entre si. Quanto ao número de
células de Leydig por grama de testículo, ambos os grupos tratados (DAC e DSM)
apresentaram um número maior, quando comparados ao grupo controle (Tabela 7). Porém
não houve diferença estatística quando comparados ao grupo DM. Por fim, foi visto que
o índice Leydigossomático foi estatisticamente semelhante entre os grupos experimentais.
56
Tabela 7: Parâmetros morfométricos das células de Leydig dos grupos experimentais.
CT DM DAC DSM
Diâmetro nuclear de
Leydig (μm³)
6.63 ± 0.12 5.77 ± 0.54* 5.39 ± 0.39* 5.10 ± 0.16*#
Volume do núcleo de
Leydig (μm³)
152.88 ± 8.46 102.83 ± 25.55* 82.89 ± 18.94* 69.39 ± 6.43*#
Volume do citoplasma de
Leydig (μm³)
66.06 ± 14.98 29.66 ± 8.71* 30.69 ± 13.43* 20.90 ± 4.88*
Volume de célula de
Leydig (μm³)
218.94 ± 21.66 132.48 ± 30.74* 113.58 ± 31.63* 90.29 ± 10.85*
Volume de Leydig/T
(x106) (μm³)
49710.4 ± 12062.72 44240.55 ± 15320.04 40489.73 ± 9455.07 36349.91 ± 8782.62
Volume de leydig/gT
(x106) (μm³)
15197.33 ± 2955.24 17160.65 ± 7912.57 16699.72 ± 3680.8 14330.01 ± 1764.77
Número de células de
Leydig/T (x106) (μm³)
228.17 ± 54.78 334.02 ± 89.17 368.24 ± 96.21 403.65 ± 93.89*
Número de células de
Leydig/gT (x106) (μm³)
69.72 ± 13.66 129.56 ± 52.81 154.89 ± 52.93* 160.44 ± 27.49*
Índice Leydigossomático
(%)
0.018 ±0.005 0.021 ± 0.008 0.022 ± 0.004 0.019 ±0.005
Dados expressos como média ± DP. *Diferença com o grupo controle.
#Diferença com o grupo DM.
57
Análise qualitativa
Análises qualitativas das lâminas coradas em Hematoxilina-Eosina permitiram
identificar que o grupo controle apresentava um epitélio seminífero integro, com ausência
de alterações morfológicas (Figura 2).
Figura 2 – Secção histologica de túbulos seminíferos de ratos do grupo controle. A e B
aumento de 100x, C e D aumento de 400x.
O grupo diabético sem tratamento apresentou vários túbulos com epitélio
degenerado, possivelmente associado à uma esfoliação epitelial, acumulando células no
lúmen. As células germinativas apresentavam hipertrofia, algumas em processo de
apoptose e com presença de exsudato intertubular. Entre as células dos túbulos
seminíferos, foi possível visualizar a formação de vacúolos e perda de adesão celular,
resultando possivelmente na presença de células do epitélio no espaço intertubular,
culminando em túbulos apresentando alterações em sua linhagem espermatogênica, e
alguns em estágio de degeneração (Figura 3).
A B
C D
58
Figura 3 – Secção histológica de túbulos seminíferos de ratos do grupo diabético sem
tratamento. A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Asterisco vermelho –
Túbulos em degeneração. Seta amarela – Esfoliação do epitélio do túbulo seminífero.
Seta verde – Células em processo de necrose. Seta preta – vacúolos. Seta vermelha –
Células de Leydig.
O grupo tratado com o extrato de Allium cepa L apresentou túbulos em processos
de degeneração, porém poucos túbulos apresentavam esfoliação epitelial. Os túbulos
apresentaram poucas alterações, com reduzido número de células em apoptose. Alguns
túbulos apresentaram perda de adesão celular, resultando em algumas células do túbulo
seminífero soltas no espaço intertubular. As células germinativas apresentaram
hipertrofia e presença de algumas áreas intertubulares apresentando exsudato. Em
comparação com os animais do grupo diabético não tratado, o grupo tratado com A. cepa
L apresentou um tecido mais organizado, com uma menor quantidade de túbulos com
espermatogênese alterada e com poucas alterações intertubulares (Figura 4).
59
Figura 4 – Imagens de túbulos seminíferos de ratos do grupo tratado com Allium cepa L.
A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Asterisco vermelho – Túbulo seminífero
em degeneração. Seta azul – Hipertrofias de células do túbulo seminífero. Seta preta –
Vacúolos no tecido intertubular.
O grupo tratado com o aminoácido S-metilcisteína apresentou poucos túbulos em
processos de degeneração, com pouca esfoliação celular. Alguns animais apresentaram
células germinativas hipertrofiadas, com a presença de alguns vacúolos entre as células
do túbulo seminífero. Não foram identificadas células em apoptose, com poucas
alterações na espermatogênese. De modo geral, o grupo tratado com S-metilcisteína
apresentava um parênquima mais organizado e integro, com poucas alterações quando
comparado ao grupo diabético não tratado e tratado com A. cepa L (Figura 5).
60
Figura 5 – Imagens de túbulos seminíferos de ratos do grupo tratado com S-metilcisteína.
A e B aumento de 100x, C e D aumento de 400x. Seta amarela – Esfoliação do epitélio
do túbulo seminífero. Seta preta – Vacúolos no tecido intersticial.
Imunohistoquímica
Avaliando qualitativamente as lâminas marcadas por imunohistoquímica para o
receptor de testosterona, foi possível identificar que o grupo DM apresenta uma menor
marcação para estes receptores, quando comparado ao grupo controle não diabético. Os
grupos diabéticos tratados apresentam uma marcação mais evidente, quando comparados
ao grupo diabético não tratado. O grupo tratado com o extrato apresenta uma marcação
mais evidente, quando comparado ao grupo tratado com o aminoácido isolado.
Comparando o grupo controle não diabético e o grupo diabético tratado com o extrato,
ambos apresentavam marcações semelhantes entre ambos os grupos (Figura 6).
61
Figura 6 – Imagens contendo marcação de imunohistoquímica para receptor de
testosterona nos grupos controle (A e B), diabético não tratado (C e D), diabético tratado
com Allium cepa L. (E e F) e diabético tratado com S-metilcisteína (G e H). (A) Presença
de células marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (B) Presença de
células de diversos estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como
células do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (C) Presença de poucas células
marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (D) Presença de algumas
poucas células de estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como
células do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (E) Presença de diversas células
marcadas em castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (F) Presença de várias
células de estágios de desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como células
do intertúbulo marcadas em castanho (400x). (G) Presença de células marcadas em
castanho dentro dos túbulos seminíferos (100x). (H) Presença de células de estágios de
desenvolvimento dentro do túbulo seminífero, assim como células do intertúbulo
marcadas em castanho (400x).
62
A B
C D
E F
G H
A B
C D
E F
G H
63
DISCUSSÃO
Como pode ser visto nos resultados, a diabetes foi induzida com sucesso, onde os
grupos DM, DAC e DSM apresentaram elevação na sua glicemia, o que divergia do que
era visto no grupo CT. Isso comprova o quadro hiperglicêmico característico da diabetes,
demonstrando a efetividade da indução por STZ. Parâmetros como consumo de água e
ração não se alteraram entre os grupos diabéticos, por outro lado a glicemia foi reduzida
em ambos os grupos tratados. Avaliando o tecido, foi visto que os grupos tratados
apresentaram melhora em diversos parâmetros, dentre eles pode ser apontado: morfologia
tecidual, disponibilidade de receptores para testosterona, parâmetros tubulares e também
demostrou alterações em componentes intertubulares.
A utilização de terapias alternativas como uma forma de auxiliar na redução dos
danos sistêmicos causados pelo DM1 é uma boa forma de prevenir e tratar os sintomas
gerados pela doença e que podem ser visualizados nos pacientes, como por exemplo:
problemas de cicatrização periférica, perda de visão, problemas renais, problemas
cardíacos, alterações no consumo de água/alimentos e infertilidade. Disfunção testicular
em diabéticos pode ser temporária ou permanente dependendo do quão controlada e a
quantos anos se convive com a doença.
O tratamento com o extrato de Allium cepa L. e com S-metilcisteína reduziram a
glicemia dos animais diabéticos, no entanto o aminoácido S-metilcisteína reduziu de
forma mais eficiente a glicemia, sendo significativa a redução entre os grupos tratados.
Estes dados são consistentes com os resultados encontrados por El-Demerdash e
colaboradores (2005) em ratos Sprague–Dawely diabéticos induzidos por aloxan bem
como Yin e colaboradores (2007) em estudo realizado com camundongos Balb/cA e S-
metilcisteína.
Quanto ao consumo de água e ração foi visto que não há diferença entre os grupos
experimentais, o que também é visto em estudos realizados por Yin e colaboradores
(2007), Kumari e colaboradores (2002) e Nishikawa-Ogawa e colaboradores (2006), pois
mesmo com a redução da glicose pelo tratamento os animais continuam diabéticos e a
necessidade de reposição de líquidos permanece, visto que estes animais apresentam alto
nível de diurese. Essa característica de polifagia e polidipsia é bastante comum em
animais e indivíduos diabéticos, assim como não são facilmente alterados em estudos
voltados para tratamento da diabetes.
64
Comumente, a diabetes tende a gerar perda de massa corporal de modo simultâneo
em diversos tecidos e órgãos. Analisando parâmetros biométricos, o peso corporal do
grupo tratado com o estrato de A. cepa L. foi inferior aos grupos controle e diabético sem
tratamento, essa redução de peso foi visualizada por Fallah e colaboradores (2017), porém
a redução não foi significativamente inferior ao grupo diabético sem tratamento. O grupo
tratado com S-metilcisteína também apresentou redução no peso quando comparado com
os grupos controle e diabético sem tratamento, porém em um estudo realizado por Yin e
colaboradores (2007) os animais tratados com diferentes concentrações deste aminoácido
foram capazes de impedir a perda excessiva de peso. Este resultado pode ser explicado
pela diferença em metodologia de utilização do aminoácido, onde neste estudo foi
utilizado o procedimento de gavagem e no estudo realizado por Yin e colaboradores
(2007) o aminoácido foi adicionado a água dos animais.
O peso testicular dos animais diabéticos foi reduzido para todos os grupos, onde
nenhum dos tratamentos foi capaz de elevar ou impedir essa redução. Em um estudo
realizado por Fallah e colaboradores (2017), o tratamento com 400 mg/kg de extrato de
A. cepa L. intraperitonealmente também não foi capaz de impedir a redução do peso
testicular, pelo contrário, a perda de peso foi superior ao grupo diabético não tratado. O
grupo tratado com o aminoácido isolado também não foi capaz de impedir a perda de
peso testicular, o que demonstra que ambos os tratamentos não são capazes de interferir
na perda de massa testicular em animais diabéticos.
Utilizando o peso testicular e corporal, pode-se obter o IGS e a partir da
comparação deste parâmetro entre os grupos, foi possível ver que não houve diferença
significativa entre os grupos. Isso pode acontecer devido a semelhança entre a perda de
peso corporal e testicular visualizada em animais diabéticos, assim como o ganho de peso
corporal e testicular dos animais do grupo controle. No estudo realizado por Ismail e
colaboradores (2018) foi visto um resultado semelhante, onde os animais do grupo
diabético não apresentaram diferença no IGS quando comparado a qualquer grupo
presente no experimento, sendo ele controle ou tratado. Semelhantemente, o IPS também
não apresentou diferença estatística entre os grupos devido a perda de peso uniforme
apresentada pelos animais dos grupos diabéticos e ganho de peso dos animais do grupo
controle.
A diabetes tende a gerar danos no tecido testicular que podem ser visualizados e
classificados dentro do Escore de Johnsen. O escore de Johnsen do grupo diabético sem
65
tratamento foi inferior quando comparado a todos os grupos experimentais. Em estudos
de Ersoy e Kizilay (2018) e Ghanbari e colaboradores (2015) o grupo diabético sem
tratamento apresenta redução do escore e o tratamento foi capaz de melhorar o aspecto
tecidual. Semelhantemente neste trabalho, ambos os tratamentos foram capazes de
melhorar o aspecto tecidual, elevando o escore. Do mesmo modo, o escore de Johnsen
modificado foi inferior no grupo diabético sem tratamento, porém ambos os grupos
tratados apresentaram um maior escore. Isso demonstra que, os tratamentos são capazes
de reduzir ou prevenir o dano causado pelo DM1.
Um estudo realizado por Keyhanmnesh e colaboradores (2018) demonstrou que o
DM é capaz de reduzir o volume dos componentes testiculares. O volume total tubular e
epitelial foram reduzidos e o volume da túnica própria e do lúmen foram aumentados.
Diferentemente deste estudo, os ratos do grupo diabético não apresentaram alterações no
volume total destes componentes. Isto pode ter acontecido, pois o tempo experimental
deste estudo foi de 4 (quatro) semanas enquanto que no estudo de Keyhanmnesh e
colaboradores (2018) a duração foi de 8 (oito) semanas, o que aumentaria a probabilidade
do desenvolvimento de danos mais profundos na integridade testicular gerada pelas
consequências sistêmicas do DM.
Avaliando o percentual de componentes teciduais, foi visto que o grupo DM
apresentou um espessamento na túnica própria dos túbulos seminíferos, porém quando
levado em consideração o volume total, não houve diferença estatística. Os tratamentos
não interferiram no volume total destes componentes testiculares, porém relativamente
foi visto que o tratamento com o extrato foi capaz de elevar a porcentagem de túbulo
seminífero no tecido testicular, assim como a porcentagem de epitélio germinativo. O
tratamento com o aminoácido isolado foi capaz de elevar a porcentagem de epitélio
germinativo, mas semelhantemente não foi capaz de interferir no volume de outros
componentes de modo relativo ou total.
O diâmetro tubular, assim como a altura do epitélio germinativo do grupo DM foi
inferior ao grupo controle, o que é condizente com os achados de Ersoy e Kizilay (2018)
e Shoorei e colaboradores (2018) e comprova que o DM causa danos ao tecido testicular,
causando degradação do epitélio germinativo e reduzindo o diâmetro tubular. O
tratamento com A. cepa L. não foi capaz de melhorar totalmente os danos causados pelo
DM, apenas a integridade epitelial foi mantida. Por outro lado, o tratamento com o
aminoácido isolado foi capaz de gerar um efeito protetor ao tecido tubular, mantendo o
66
diâmetro tubular e altura do epitélio semelhantes ao grupo controle. Assim, o tratamento
com o aminoácido foi capaz de apresentar melhor resultado quando comparado com o
grupo do extrato neste quesito.
Associada as alterações de diâmetro de túbulo seminífero e de altura de epitélio,
o lúmen dos animais do grupo diabético foi superior quando comparado aos grupos
experimentais. Isso ocorre, pois com a degradação o epitélio germinativo, o diâmetro do
lúmen é aumentado. Ambos os tratamentos foram capazes de reduzir este diâmetro de
modo estatisticamente semelhante, o que comprova que os tratamentos podem estar
associados a proteção e/ou auxílio na regeneração do tecido tubular. O DM também foi
capaz de interferir em parâmetros como a área dos componentes tubulares (área do túbulo,
epitélio e lúmen), reduzindo as áreas do túbulo e do epitélio e assim elevando a área do
lúmen.
De modo semelhante, os tratamentos foram capazes de melhorar estes parâmetros,
sendo o tratamento com o aminoácido isolado capaz de interferir, elevando ainda mais a
área do epitélio. A relação entre o volume tubular e o volume epitelial, revela que os
animais do grupo diabético apresentam uma maior relação. Isso ocorre pois, o grupo
diabético apresenta uma redução maior na área do epitélio em comparação a redução a
área do túbulo, o que eleva numericamente esta relação. Os tratamentos atuam reduzindo
essa relação, deixando-a mais próxima ao que é visualizado no grupo controle, o que
comprova que os tratamentos atuam melhorando a integridade tecidual.
A comparação do comprimento total do túbulo seminífero entre os grupos
experimentais demonstrou que os grupo DM e DAC não apresentaram diferença
estatística entre si e também quando comparados ao grupo controle. O grupo tratado com
o aminoácido isolado apresentou uma redução no comprimento total deste componente
testicular. No estudo de Keyhanmnesh e colaboradores (2018), o grupo diabético também
não apresentou diferença com os outros grupos experimentais. Isso pode determinar que
o DM pode estar relacionada a danos ao tecido de modo pontual, como ao epitélio ou ao
tecido intersticial, mas não reduziria o comprimento total dos túbulos seminíferos.
Quando avaliado o tecido intersticial, foi visto que os grupos diabéticos
apresentaram uma redução no volume relativo e total. Porém, quando comparado a
estudos como o realizado por Keyhanmnesh e colaboradores (2018) é visto que os grupos
diabéticos apresentam elevação no volume deste componente. O tecido intersticial em
67
grupos diabéticos estaria preenchendo o espaço deixado pelo tecido tubular degradado
devido ao DM. O estudo de Keyhanmnesh e colaboradores (2018) foi realizado em 8
(oito) semanas, enquanto nesse trabalho foram 4 (quatro), um maior período experimental
pode interferir na degradação do tecido tubular e cicatrização pelo tecido intersticial,
enquanto que em 4 (quatro) semanas isso não pode ser visualizado.
Além disso, a retração do tecido intersticial visualizada nas lâminas poderia ser
um fator interferente no volume relativo e total dos componentes intertubulares.
Componentes como tecido conjuntivo e espaço linfático se apresentaram em volume
reduzido em comparação entre os grupos diabéticos e controle. Essa redução pode estar
ligada diretamente ao DM ou a retração tecidual, o que levaria a diminuição na contagem
morfométrica destes componentes. Porém, poucos são os estudos voltados para
morfometria testicular em animais diabéticos, o que impede a determinação real destas
alterações.
Os animais diabéticos apresentaram redução no volume e diâmetro nuclear das
células de Leydig. Além disso, os animais do grupo tratado com o aminoácido isolado
apresentaram uma redução ainda maior, quando comparado aos grupos DM e DAC. No
estudo realizado por Ismail e colaboradores (2018), os animais do grupo diabético não
apresentaram alterações estatisticamente relevantes nestes parâmetros. Isso pode ocorrer
devido ao fato que o estudo realizado por Ismail e colaboradores (2018) tratava-se de
DM2. O DM2 é caracterizada por danos mais brandos ao tecido testicular por causar
alterações de cunho crônico aos sistemas, enquanto que o DM1 é caracterizada por danos
agudos devido à elevação rápida e baixo controle da glicemia.
Quanto ao número de células de Leydig por testículo, foi visto que não havia
alterações estatística entre os grupos controle, DM e DAC, porém o grupo tratado com o
aminoácido isolado apresentou um aumento na quantidade de células de Leydig presentes
no estroma testicular de forma compensatória a redução do volume destas células e assim
garantindo a manutenção da produção de testosterona. No estudo realizado por
Keyhanmnesh e colaboradores (2018), o grupo diabético sem tratamento apresentou uma
redução na contagem destas células. Isso pode estar relacionado ao tempo de duração do
experimento, o que poderia interferir nos danos ao tecido intersticial, sendo mais evidente
quanto maior o tempo de duração.
68
O testículo apresenta uma composição tecidual bastante característica e de alta
sensibilidade. A diabetes pode gerar diversos danos teciduais que gerarão consequências
vistas como redução do peso testicular, subfertilidade e infertilidade. A partir da análise
de lâminas histológicas é possível ver o motivo do desenvolvimento dessas
características. A análise qualitativa das lâminas histológicas demonstraram que o grupo
diabético apresentou degradação no tecido testicular. Foi possível visualizar que os
túbulos apresentavam atrofia, assim como degradação do epitélio germinativo e
vacuolização do interstício. Resultados semelhantes podem ser vistos em estudos como
os realizados por Ersoy e Kizilay (2018), Ghanbari e colaboradores (2015) e Yigitturk e
colaboradores (2017), onde o grupo diabético não tratado apresenta alterações tanto no
compartimento germinativo como no intersticial.
O grupo tratado com o extrato apresentou melhora significativa em relação ao
grupo diabético. Ao contrário do que foi visto no estudo realizado por Fallah e
colaboradores (2017), onde os animais tratados com o extrato não apresentou alterações
morfológicas em relação ao grupo diabético. O grupo tratado com o aminoácido isolado
apresentou alterações teciduais positivas, em relação ao grupo DM e DAC. O tecido
apresentou uma melhor integridade tecidual, uma aparência mais característica de um
tecido normal, o que pode apontar uma melhor capacidade protetora ou regenerativa desta
forma de tratamento.
A integridade tecidual é bastante importante para manter o funcionamento normal
do tecido e realização de suas funções. A marcação imunohistoquímica para o receptor
de testosterona demonstrou que os animais do grupo diabético apresentavam uma menor
marcação tanto no tecido tubular, como no tecido intersticial. O tratamento com o
aminoácido isolado foi capaz de elevar a marcação deste receptor, demonstrando sua
capacidade de melhor integridade tecidual. No entanto, o tratamento com o extrato da
cebola apresentou um resultado aparentemente ainda melhor, quando comparado com os
grupos DM e DSM. O que aponta para ao extrato sendo capaz de melhorar a
disponibilidade de receptores para testosterona em animais diabéticos.
69
CONCLUSÃO
Os danos testiculares causados pela diabetes foram atenuados ou regenerados pelo
tratamento melhorando o epitélio germinativo e aumentando o número de célula de
Leydig como forma compensatória a redução de volume destas. O principal efeito do
tratamento com o extrato de cebola foi o aumento da disponibilidade dos receptores de
testosterona. Por outro lado, o tratamento com o aminoácido isolado apresentou de modo
geral, resultados ainda melhores podendo ser apontado como uma melhor terapia para
tratar os danos testiculares causados pelo DM.
70
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CONCLUSÕES GERAIS
A aplicação de recursos em estudos voltados para a descoberta de novas terapias
alternativas, acessíveis e baratas para o tratamento do DM é de extrema importância.
Diversos estudos já demonstraram que os danos a longo prazo vistos em indivíduos que
convivem com a diabetes ocorrerão independentemente do quão controlada é a doença.
Com isso, tratar previamente as consequências sistêmicas desta doença pode ser um passo
chave para reduzir estas alterações e elevar a expectativa de vida destes indivíduos.
A diabetes é causadora de danos no tecido testicular de modo que está relacionado
diretamente ao desenvolvimento de subfertilidade e infertilidade. O tratamento com o
extrato da cebola apresentou diversos pontos positivos como forma de terapia para estes
danos, principalmente na disponibilidade para receptores de testosterona. Por outro lado,
o tratamento com o aminoácido isolado apresentou resultados ainda melhores, de modo
geral, podendo ser apontado como uma melhor terapia para tratar os danos testiculares
causados pelo DM.
Este estudo confirma que a diabetes tem um efeito adverso na função do sistema
reprodutor masculino, o que já foi visto em outros estudos como os realizados por
Ghanbari e colaboradores (2015), Shrilatha e Muralidhara (2007) e Sonmez e
colaboradores (2015). Do mesmo modo que este estudo demonstra um efeito protetor do
extrato de Allium cepa L. e de seu aminoácido isolado S-metilciteína. Este estudo é um
dos poucos que avalia este efeito protetor do extrato e o único a avaliar o efeito do
aminoácido isolado contra o dano testicular causado pela diabetes induzida por
estreptozotocina em ratos.
Infelizmente, a escassez de estudos voltados para aplicação da S-metilcisteína,
assim como estudos voltados para a morfometria testicular, torna difícil a comparação de
resultados e determinação da funcionalidade destas terapias alternativas como tratamento
para o DM. Com isso, se faz necessário a realização de mais estudos para determinação
de melhores resultados para terapias voltadas ao tecido testicular danificado pelo DM.