UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ BIOLOGIA DE AGENTES ... · universidade federal do parÁ instituto de ciÊncias biolÓgicas programa de pÓs – graduaÇÃo em biologia de agentes infecciosos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

ALTERAÇÕES NO PERFIL PROTEICO DE CÉLULAS DE CARCINOMA

HEPATOCELULAR HUMANO HEPG2 EXPERIMENTALMENTE INFECTADAS

COM O VÍRUS DA FEBRE AMARELA, CEPA H111 (FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

EDUARDO LANA

BELÉM – PARÁ

2014

EDUARDO LANA


HEPATOCELULAR HUMANO HEPG2 EXPERIMENTALMENTE INFECTADAS

COM O VÍRUS DA FEBRE AMARELA, CEPA H111 (FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito para a

obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira

Nunes.

BELÉM – PARÁ

2014

EDUARDO LANA


HEPATOCELULAR HUMANO HEPG2 EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

COM VÍRUS DA FEBRE AMARELA, CEPA H111 (FLAVIVIRIDAE: FLAVIVIRUS)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos

e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes

Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas IEC/SVS/MS

Banca examinadora: Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves

Instituto de Ciências Biólogicas, UFPA

Dra. Hivana Patrícia Melo Barbosa Dall’Agnol

Instituto Tecnológico Vale – Desenvolvimento Sustentável

Dra. Valéria Lima Carvalho


Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos


Belém, 18 de julho de 2014

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

___________________________________________________________________________

Lana, Eduardo, 1989-

Alterações no perfil proteico de células de carcinoma hepatocelular humano

HepG2 experimentalmente infectadas com o vírus da febre amarela, cepa H111

(flaviviridae:flavivirus) / Eduardo Lana. - 2014.

Orientador: Márcio Roberto Teixeira Nunes.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências

Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários, Belém, 2014.

1. Febre amarela. 2. Proteômica. I. Título.

CDD 22. ed. 616.91854

___________________________________________________________________________

EPÍGRAFE

“Somos uma pequena e trêmula

chama que a cada instante ameaça

apagar-se.”

José Saramago

“Deve haver alguma espécie de

sentido, ou o que virá depois?”

Caio Fernando Abreu

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu avô, Jorge

Lana, e ao meu opa, Werner Radünz, em

respeito a última despedida que nunca

aconteceu.

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo amparo, força e por ser tão bondoso comigo.

À CAPES pelo financiamento da bolsa de estudos mensal a nível de mestrado.

À todo o corpo docente e a turma de mestrado do biênio de 2012-2014 do Programa de

Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, pelos aprendizados e

discussões enriquecedoras trazidas as salas de aula e por me recepcionarem tão bem.

Aos membros da secretaria da Pós-Graduação BAIP, Raimundo Hosana e Mirna

Tavares, pela presteza e agilidade para resolver problemas e auxiliar nas questões

burocráticas.

À minha família, que no início da possibilidade de sair de casa para ir tão longe foi um

pouco relutante, mas que logo entenderam as minhas causas, sonhos e propósitos me dando

apoio e ajudando incondicionalmente. Eu amo vocês!

À Família Rachid, Eleonora (uma guerreira incrível!), Luiz (um pai exemplar), Thiago

(um irmão atencioso) e Thaís (a irmã mais nova que não tive), por terem me recepcionado de

maneira tão amável e cuidadosa, me ensinando tudo sobre Belém e a gastronomia local.

Ao meu orientador, Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes, por ter aberto um mundo de

possibilidades ao me aceitar como seu aluno. Não sei quem foi mais corajoso de nós dois, mas

obrigado pela confiança depositada e pela força estimulada. Cresci e aprendi muito como

você disse que esperaria de mim em nossa primeira conversa.

Às meninas do Mestrado, que sempre foram grandes mulheres que estiveram ao meu

lado sendo mães, irmãs, tias, avós, professoras e AMIGAS INCRÍVEIS. Que Deus lhes

abençoe como tem me abençoado pela oportunidade em conhecer todas vocês, Andrea, Edina,

Jannyce e Larissa.

Ao Professor Dr. Evonnildo Costa Gonçalves, por ter extrapolado as barreirras

profissionais e se tornado um grande amigo. Obrigado pelos ensinamentos, apoio, audição e

as broncas também, te devo várias.

Ao Jefferson Pereira e Silva, por estes quase dois anos de convivência que me

amadureceram muito pessoalmente e profissionalmente.

À toda a equipe da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto

Evandro Chagas, em especial: ao Laboratório de isolamento viral em cultura de células, meu

berço na seção (Creuza Lima, Drª Valéria Lima, Ercília (pela manipulação inicial do H111),

Jamilla (minha irmã que me entende tanto), Maissa (por me emprestar o cupcake amado dela

nos finais de semana), ao Maxwell e a agora Dra Eliana Pinto, por ter me iniciado e ensinado

todas as atividades e rotina do laboratório), ao Laboratório de biologia molecular (Bruno

Tardelli e Alice Queiroz, por todos os empréstimos temporários, Samir Casseb, pelo

tratamento das culturas de células e Natália Vale, por me ensinar a usar o Qubit, não teria sido

tão divertido se não fosse com você), Esterilização (Mari, pela presteza e por estar sempre

alegre e contagiante) e Secretaria (principalmente a Rose, por me ajudar com os problemas

burocráticos e entender a situação final do período das experimentações).

Ao Núcleo de proteômica do Centro de Inovações Tecnológicas – Novamente ao

professor Dr. Evo pelas orientações no laboratório. A Laise por compartilhar experiência e

macetes e ao Sanclayver (San san) por se arriscar junto comigo neste mundo eletrizante do

2D-SDS-PAGE.

A toda a galera da Genômica e Bioinformática do Centro de Inovações Tecnológicas,

pelas experiências, besteiróis e risadas compartilhados na bancada, copa, e sala da Microlins:

Clayton (volta pra terra!), Jedson (não se assustem ele já nasceu assim feio), Poliana (Miss

Haemagogus), Patroca (o guardião oficial do túnel do tempo), Jana (linda linda *-*), Lay

(LayEnne boladona), Daisy (amor em forma de gente) e Rodri (sei que me amas).

À Professora Dra Edina (Seção de Arbovirologia - IEC), por ter acolhido minhas

dúvidas com o teste de viabilidade celular e ajuda com as escalas microscópicas.

À Professora Dra Sílvia Marques (Seção de Bacteriologia/Micologia - IEC), por ter

me acolhido em seu laboratório como a um filho em um momento de desespero e ter me

mostrado com maestria, paciência e carinho os caminhos azuis e tortuosos de Bradford.

Ao Antônio Gregório Dias Júnior, pelos ensinamentos e questionamentos científicos

levantados ao meu projeto. Muito obrigado e muito sucesso na sua caminhada.

Ao Humberto Jácome, pelo apoio, incentivo e por nunca fugir das nossas discussões

científicas valiosas e engraçadas, mesclando nossos conhecimentos com diversão, sempre

instigando ao fortalecimento do pensamento científico e arguidor.

Aos “ICs” Thiago e Mayque, pela oportunidade de ensinar o pouco que aprendi,

ensinar é sempre um caminho de mão dupla.

Aos amigos que ficaram em outros estados, pelo apoio, por ouvirem meus desabafos,

medos e angústias e também pelas visitas.

Aos amigos que por acaso fui conhecendo em Belém e conquistando. Raimundo

Junior, Vinícius Matos e Natacha Malu, obrigado pelo apoio e momentos de descontração.

MUITO OBRIGADO!

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 15

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A FEBRE AMARELA ...................................... 15

1.2 ETIOLOGIA DA FEBRE AMARELA .......................................................................... 17

1.3 EPIDEMIOLOGIA DA FEBRE AMARELA ................................................................. 19

1.4 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA FEBRE AMARELA ............................................. 21

1.5 TRATAMENTO, PREVENÇÃO E DIAGNÓSTICO DA FEBRE AMARELA ............. 21

1.6 PROTEÔMICA VIRAL ................................................................................................. 22

2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 25

2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 25

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 25

3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 26

3.1 ASPECTOS ÉTICOS E DE BIOSSEGURANÇA .......................................................... 26

3.2 CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO, HEPG2 ............................................ 27

3.2.1 Descongelamento das Células HepG2 ......................................................................... 27

3.2.2 Subcultura das Células HepG2 .................................................................................... 28

3.3 CEPA VIRAL ................................................................................................................ 29

3.4 ESTOQUE VIRAL ........................................................................................................ 29

3.4.1 Estoque Viral em Cultivo de Células de Mosquito Aedes albopictus Clone C6/36 ....... 29

3.5 CONTAGEM DE CÉLULAS E VIABILIDADE CELULAR ........................................ 30

3.6 MULTIPLICIDADE DE INFECÇÃO ............................................................................ 31

3.7 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA ....................................................................... 32

3.8 TITULAÇÃO VIRAL .................................................................................................... 32

3.8.1 Titulação Viral em Células VERO ............................................................................... 33

3.9 INFECÇÃO DAS CÉLULAS HEPG2 PELO VFA ........................................................ 34

3.10 CINÉTICA VIRAL ...................................................................................................... 35

3.11 ANÁLISE PROTEÔMICA .......................................................................................... 35

3.11.1 Extração de Proteínas das Células Cultivadas ............................................................ 35

3.11.2 Clarificação do lisado celular..................................................................................... 35

3.11.3 Quantificação de Proteínas Totais .............................................................................. 36

3.11.4 Eletroforese Bidimensional........................................................................................ 36

3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 37

4 RESULTADOS ................................................................................................................ 38

4.1 Título viral, efeito citopático e teste de viabilidade celular .............................................. 38

4.2 Análise proteômica......................................................................................................... 41

5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 49

5.1 Título viral, efeito citopático e teste de viabilidade celular .............................................. 49

5.2 Análise proteômica......................................................................................................... 49

6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 55

REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 56

ANEXO ............................................................................................................................... 63

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Vírion infeccioso imaturo e maturo da Febre Amarela ......................................... 18

Figura 2 - Organização do genoma e tradução das proteínas virais de flavivírus ................... 19

Figura 3 – Fluxograma de trabalho ....................................................................................... 26

Figura 4 - Curva de cinética da infecção pelo VFA em células HepG2 ................................. 38

Figura 5 - Comportamento da infecção pelo VFA, cepa selvagem Be H111, em cultivo celular

HepG2 ................................................................................................................................. 39

Figura 6 – Resultados de viabilidade celular obtidos para infecção de células HepG2 pelo

VFA ..................................................................................................................................... 40

Figura 7 - Gel bidimensional de proteínas totais de células HepG2 infectadas com o vírus da

Febre Amarela, cepa selvagem Be H111, e corado com solução coloidal de Coomassie. ...... 43

Figura 8 - Gel bidimensional de proteínas totais de células HepG2 do grupo controle corado

com solução coloidal de Coomassie.. ................................................................................... 44

Figura 9 - Representação tridimensional do spot número 1, match ID 244 ............................ 45

Figura 10 - Representação tridimensional do spot número 2, match ID 318 .......................... 46



LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Características dos géis em relação ao número spots detectados e pareados. ........ 41

Tabela 2 – Spots proteicos diferencialmente expressos. ........................................................ 42

Tabela 3 – Síntese dos resultados encontrados em trabalhos utilizando o método 2-DE

comparativo em infecções experimentais com diferentes vírus. ............................................ 51

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

2-DE Eletroforese bidimensional

2D-DIGE Gel de eletroforese bidimensional diferencial

% Percentagem

°C Graus centígrados

μg Microgramas

μL Microlitros

ANOVA Análise de variância

AP61 Cultivo celular do invertebrado Aedes pseudoscutellaris

ATCC American type cell collection

BCRJ Banco de células do Rio de Janeiro

BHK-21 Cultivo celular de rim de hamster (Mesocricetus auratus) bebê

BSL2 Nível de biossegurança 2

C Proteína de Capsídeo

C6/36 Cultivo celular do invertebrado Aedes albupictus

Ca2+

Íon de cálcio

CHAPS 3-(cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propane sulfonate

cm² Centímetros quadrados

CMC Carboximetilcelulose

CO2 Gás Carbônico

DMEM Meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco

D-PBS Solução salina tamponada fofatada incompleta de Dulbecco

dpi Dias pós infecção

DTT Ditiotreitol

E Proteína de Envelope

EM Espectrometria de massas

ECP Efeito citopático

FA Febre amarela

g Gramas

HBsAg Antígeno da Hepatite B

IEC Instituto Evandro Chagas

IFI Imunofluorescência Indireta

IgG Imunoglobulina do tipo G

IgM Imunoglobulina do tipo M

KDa Quilodáltons

Kb Quilobases

KCl Cloreto de potássio

KH2PO4 Fosfato de potássio

KVh Quilovolts hora

L Litro

M Proteína de Membrana

M Molar

MEL Extensão Melanie de arquivo de imagem

Mg2+

Íon de magnésio

mL Mililitros

mm Milímetros

mM Milimolar

mm³ Milimetros cúbicos

MOI Multiplicidade de Infecção

MS Ministério da Saúde

ng Nanograma

NL Não linear

Na2HPO4 Fosfato de sódio

NaCl Cloreto de Sódio

nm Nanômetros

NS Proteína não estrutural

OMS Organização mundial de saúde

pH Potencial hidrogeniônico

PM Peso molecular

PCR Reação em cadeia da polimerase

PFU Unidade formadora de placas

pI Ponto isoelétrico

PrM Proteína Pré-membrana

RPM Rotações por minuto

RT-PCR Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase

SAARB Seção de arbovirologia e febres hemorrágicas

SBF Soro bovino fetal

SDS Dodecil-sulfato de sódio

SVS Secretaria de Vigilância em Saúde

SW13 Cultivo celular de adenocarcinoma humano

TIFF Extensão de arquivo de imagem

UI Unidade internacional

V Volts

VDEN Vírus da Dengue

VERO Cultivo celular de rim de macaco verde africano Cercopithecus aethiops

VFA Vírus da febre amarela

Vh Volts hora

VJE Vírus da Encefalite Japonesa

VNO Vírus do Nilo Ocidental

VROC Vírus Rocio

VSLE Vírus da encefalite de Saint Louis

Vv Volume de estoque viral a ser utilizado para infecção

x Vezes

xg Unidade para força centrífuga relativa

RESUMO

A febre amarela (FA) é uma doença viral endêmica de regiões tropicais da África e das

Américas que afeta principalmente humanos e primatas não humanos, sendo transmitida pela

picada de um mosquito vetor infectado. O agente etiológico, o Vírus da Febre Amarela

(VFA), é capaz de produzir grandes epidemias com alta taxa de mortalidade causada pela

febre hemorrágica pós-infecção. Apesar do controle epidemiológico sobre esta doença e do

estabelecimento de uma vacina eficaz, não existe medicação para tratamento e

frequentemente a FA não é diagnosticada até que o paciente tenha se recuperado ou

sucumbido, isto, se é que o diagnóstico é feito. A falta de informação proteômica sobre o

VFA, amplia a possibilidade da descoberta de biomarcadores proteicos para diagnósticos mais

eficazes e/ou alvos de tratamento, que podem, junto com as ferramentas atuais de controle de

surtos, aumentar a velocidade de resposta sobre possíveis epidemias. Neste trabalho, usamos

técnicas proteômicas para investigar o perfil das proteínas diferenciais de células HepG2

infectadas com o VFA, cepa Be H111. Para isso, cultivos de células HepG2 foram infectadas

com multiplicidade de infecção de 0,01 e avaliados a presença de efeito citopático, título viral

em unidades formadoras de placas (PFU), progressão da infecção através da detecção de

antígenos virais pela imunofluorescência indireta (IFI) e viabilidade celular para determinar o

melhor dia da avaliação da expressão proteica. A cada 24 horas durante 5 dias pós infecção

(dpi) as proteínas foram extraídas com tampão de extração (7M ureia, 2M tioureia e 4% de

CHAPS). As amostras foram analisadas por 2-DE usando fitas IPG pH 3-11 NL para a

focalização isoelétrica seguida de SDS-PAGE vertical para separação da segunda dimensão.

Os mapas 2D das células infectadas e não infectadas (controle) foram visualizados pelo

corante Coomassie G-250. O 4º dpi foi determinado para melhor avaliação das alterações

proteicas, detectando 4 spots de proteínas diferenciais. Estes resultados trazem novas

perspectivas para o aprofundamento nos estudos de biomarcadores celulares para diagnóstico

da FA.

Palavras-chave: Febre Amarela, Vírus da Febre Amarela, Proteômica.

ABSTRACT

Yellow fever (YF) is a viral disease endemic in the tropical parts of Africa and the

Americas that affects mainly human and non-human primates. It is transmitted by the bite of

an infected mosquito vector. The etiologic agent of Yellow Fever Virus (YFV), is the cause of

large epidemics with high mortality caused by post-infection hemorrhagic fever. Despite the

epidemiological control and the establishment of an effective vaccine against this disease,

there is no medication for treatment and YF is often not diagnosed until the patient has

recovered or succumbed, that, if the diagnosis is made. The lack of proteomic information

about YFV increases the possibility of the discovery of protein biomarkers for more effective

targets for diagnostic and/or treatment, which may, with the current tools for outbreak control,

increase the speed of response in possible epidemics. In this work, we used proteomic

approaches to investigate the profile of differentials proteins in infected HepG2 cells with the

YFV, strain Be H111. To do this, cultured HepG2 cells were infected at multiplicity of

infection of 0.01 and it was assessed for the presence of cytopathic effect, virus titers were

calculated by plaque forming units (PFU), the progression of infection by detection of viral

antigens by indirect immunofluorescence (IFI) and cell viability to determine the best day to

assess the protein expression. Every 24 hours for 5 days post infection (dpi) proteins were

extracted with extraction buffer (7M urea, 2M thiourea and 4% CHAPS). The samples were

then analyzed by 2-DE using IPG 3-11 NL pH strips for vertical isoelectric focusing followed

by SDS-PAGE separation in the second dimension. The 2D maps of infected and uninfected

(control) cells were visualized by Coomassie G-250 dye. The 4 dpi was determined to better

elucidate the protein changes, detecting 4 differential protein spots. These results open new

perspectives for the further studies of cellular biomarkers for diagnosis of YF.

Palavras-chave: Yellow Fever, Yellow Fever Virus, Proteomics.

15

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A FEBRE AMARELA

Durante as expansões das rotas marítimas com finalidade comercial e o tráfico

negreiro, ocorreu a disseminação de vários patógenos e doenças, dentre estes, a do Vírus da

Febre Amarela (VFA). Acredita-se que o VFA emergiu inicialmente na África, sendo

posteriormente levado para o continente Europeu e Americano (Barrett & Higgs, 2007;

Gardner & Ryman, 2010).

O início da história da febre amarela (FA) é pobremente documentado, no entanto

acredita-se que o termo “febre amarela” foi provavelmente usado pela primeira vez por

Griffin Hughes em seu livro “Natural History of Barbados” de 1750 (Gardner & Ryman,

2010). A primeira descrição de uma provável epidemia de FA foi encontrada em um

manuscrito Maia em Yucatan, no México, em 1648, usando o termo xekik (vômito de sangue

negro ou hematêmese) (Pulendran, 2009; Gardner & Ryman, 2010).

Ao longo do tempo, nos séculos XVIII e XIX, surtos de FA devastaram as Américas

Sul e Central, assim como, cidades portuárias na costa leste da América do Norte, causando

devastação aos colonos americanos, atingindo também, repetidamente várias cidades

européias envolvidas no comércio com o Novo Mundo (Monath, 1994; Staples & Monath,

2008; Gardner & Ryman, 2010).

Ainda por volta do século XIX, reconheceu-se que o contágio da FA não ocorria a

partir do contato inter-humano. No entanto, teorias cientificamente não fundamentadas

atribuíram erroneamente a doença aos miasmas ambientais (Staples & Monath, 2008; Gardner

& Ryman, 2010).

Em 1881, Carlos Finlay, um eminente médico e cientista cubano, avançou de forma

expressiva no campo de estudo da FA quando sugeriu o Culex cubensis (atualmente

conhecido como Aedes aegypti) como o mosquito responsável pela transmissão da doença

(Pulendran, 2009; Gardner & Ryman, 2010). Apesar de várias tentativas, Finlay não foi capaz

de provar sua teoria, que serviria de base para a pesquisa de Walter Reed (Staples & Monath,

2008).

Durante a Guerra Hispano-Americana de 1898, uma grave epidemia de FA eclodiu

entre os camponeses cubanos e os soldados americanos que se encontravam em Havana. Para

cada soldado que morria em batalha, 13 eram acometidos pela FA e evoluíam a óbito. Um

cirurgião geral dos EUA, George Sternberg, enviou Walter Reed e sua equipe para Cuba para

investigar a causa da FA. O trabalho de Reed provou que os mosquitos Ae. aegypti eram o

16

principal modo de transmissão da doença e que a FA era causada por um agente filtrável

encontrado no sangue de pacientes infectados (Staples & Monath, 2008; Pulendran, 2009;

Gardner & Ryman, 2010).

No ano de 1908, programas de controle do mosquito vetor erradicaram a FA dos

principais centros urbanos (Monath, 1994). Embora essas atividades iniciais tenham sido

bem-sucedidas contra FA urbana (transmitida por Ae. aegypti), a meta de erradicação foi

dissipada com a descoberta de que a FA era uma zoonose, mantida por espécies de mosquitos

silvestres e primatas não-humanos na selva amazônica (Staples & Monath, 2008).

Em 1927, mais de um quarto de século após a observação de Reed, Adrian Stokes

isolou o vírus de um homem doente em Gana, África, chamado Asibi (Staples & Monath,

2008; Pulendran, 2009). Max Theiler, em busca de um modelo animal mais barato, mostrou a

viabilidade da infecção em camundongos (Mus musculus). Seguindo os passos de Louis

Pasteur, que tinha atenuado o vírus da raiva por passagem em cérebro de coelho, Theiler

observou que a passagem em série neurotrópica em camundongos resultou em uma perda

progressiva da virulência em macacos rhesus (Macaca mulatta). Isto sugeriu a possibilidade

de desenvolver um vírus atenuado como vacina e, portanto, Theiler escolheu realizar a

passagem do vírus por vários tecidos animais para atenuar sua virulência em humanos. A

maioria das cepas resultou em vírus extremamente letais ou pouco imunogênicos em macacos.

A única exceção foi a cepa YF-17D (do inglês YF, yellow fever), que foi desenvolvida por

176 passagens do vírus primeiramente em cérebro e cultura de tecidos de embrião de

camundongo e posteriormente em embrião e cultura de tecidos de embrião de galinha (Theiler

& Smith, 1937a; 1937b).

Esse trabalho induziu a realização de experimentos em humanos, no qual a cepa YF-

17D foi inoculada pela primeira vez em voluntários humanos, incluindo os autores

desenvolvedores da cepa vacinal, resultando na indução de anticorpos neutralizantes (Theiler

& Smith, 1937b). Em 1945, a Organização Mundial de Saúde permitiu o uso de dois lotes de

sub cepas descendentes da cepa 17D, a cepa 17DD, que tem sido usada na América do Sul, e

17D-204, que tem sido usada no resto do Mundo. Ambas as sub cepas da vacina são

produzidas em ovos de galinha embrionados. Theiler recebeu o Prêmio Nobel em 1951 por

esse trabalho, e este ainda é o único Prêmio Nobel concedido para o desenvolvimento de uma

vacina viral (Pulendran, 2009).

Essas descobertas iniciais serviram como a base para as investigações posteriores

acerca da FA, por conseguinte, gerando avanços nos conhecimentos da epidemiologia,

ecologia, diagnóstico, etiologia e prevenção da febre amarela (Staples & Monath, 2008).

17

1.2 ETIOLOGIA DA FEBRE AMARELA

O VFA é o membro protótipo da família Flaviviridae e gênero Flavivirus, que tem o

seu nome originado da palavra em latim flavus que significa amarelo. O gênero Flavivirus

contém aproximadamente 70 vírus (Monath, 2001; Barrett & Higgs, 2007; Fernandez-Garcia

et al., 2009; Smit et al., 2011), cujo os principais agentes virais associados a doença em

humanos são os Vírus da Febre Amarela, Vírus Dengue (VDEN), Vírus do Nilo Ocidental

(VNO), Vírus da Encefalite Japonesa (VJE), Vírus Rocio (VROC) e o Vírus da Encefalite de

Saint Louis (VSLE) (Vasconcelos, 2002; 2003; Fernandez-Garcia et al., 2009; Smit et al.,

2011).

Em termos ecológicos, os flavivírus são denominados arbovírus, termo derivado da

expressão em inglês Artrophod-borne virus, devido à maioria destes vírus serem transmitidos

por vetores artrópodes (Monath, 2001; Barrett & Higgs, 2007).

O vírion do VFA apresenta morfologia icosaédrica (Smit et al., 2011), nucleocapsídeo

formado por subunidades de proteínas de capsídeo (C), cerca de 25-30 nm de diâmetro,

envoltório bilaminar de natureza lipoprotéica, também conhecido como envelope, que é

originário da célula hospedeira (Vasconcelos, 2003; Gardner & Ryman, 2010) (Figura 1). A

partícula íntegra (vírion mais envelope) mede cerca de 40 nm (Vasconcelos, 2002; King et al.,

2012). O envelope viral é composto por dímeros de glicoproteína do envelope (E) e proteína

de membrana (M) (Monath, 2001; King et al., 2012).

O genoma empacotado no interior do nucleocapsídeo do vírion VFA é constituído de

RNA de fita simples, de polaridade positiva, de aproximadamente 11 kilobases (Kb) de

comprimento (Gardner & Ryman, 2010; King et al., 2012). O genoma completo possui

10.862 nucleotídeos (Vasconcelos, 2003; King et al., 2012) que codifica uma poliproteína de

aproximadamente 3.400 aminoácidos (Fernandez-Garcia et al., 2009), que é posteriormente

processada por clivagem proteolítica (Gardner & Ryman, 2010). Mecanismos de clivagem co-

e pós-traducionais realizadas no polipeptídeo precursor pela ação de enzimas derivadas da

célula hospedeira e viral (enzimas de clivagem) originam três proteínas estruturais (Capsídeo

[C], membrana [M] e envelope [E]) e sete não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,

NS4B e NS5) (Fernandez-Garcia et al., 2009; King et al., 2012) (Figura 2).

18

As três proteínas estruturais (C, M e E) que formam o vírion são codificadas a partir

da extremidade 5’ do genoma viral, enquanto as sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A,

NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5) são codificadas nos três quartos restantes do genoma

(Gardner & Ryman, 2010). As proteínas estruturais e não estruturais estão envolvidas em

mecanismos de replicação do RNA viral, montagem do vírus, e modulação das respostas da

célula hospedeira (Fernandez-Garcia et al., 2009).

Figura 1 - Vírion infeccioso imaturo (intracelular) e maturo

(extracelular) da Febre Amarela. O genoma infeccioso de fita

simples de RNA está guardado por um nucleocapsídeo icosaédrico

dentro do envelope com suas proteínas associadas, prM/M e E. A

proteína prM é processada para M por clivagem mediada por

furina logo após a sua egressão da célula hospedeira. Figura

adaptada de Gardner & Ryman (2010).

19

Figura 2 - Organização do genoma e tradução das proteínas virais de flavivírus. A única

região codificante é traduzida em uma poliproteína precursora que é clivada co- e pós-

traducionalmente em três proteínas estruturais (em verde) e sete proteínas não estruturais (em

vermelho). Legenda: UTRs, Regiões não traduzidas 5’ e 3’; nt, nucleotídeos; Kb, quilobases;

aa, aminoácidos; C, proteína do capsídeo; E, proteína de envelope; M, proteína de membrana.

Fonte: Figura adaptada de Fernandez-Garcia et al. (2009).

1.3 EPIDEMIOLOGIA DA FEBRE AMARELA

Notavelmente, a epidemiologia do VFA reflete a distribuição do mosquito vetor

(Barrett & Higgs, 2007), e mesmo depois de uma vacina segura e eficaz (17D) (Vasconcelos

et al.,2004) a doença ainda ocorre em regiões tropicais da África subsariana e das Américas

Central e do Sul (Monath, 2001; Barnett, 2007; Monath, 2008).

A epidemiologia natural da FA em ambos os continentes consiste no ciclo do vírus

entre mosquitos e primatas não humanos (Gardner & Ryman, 2010), sendo que a infecção em

humanos pode ocorrer em duas modalidades epidemiológicas: silvestre e urbana

(Vasconcelos, 2002).

A principal causa de preocupação em nível de saúde pública tanto na África quanto

nas Américas provém do ciclo de transmissão urbana da FA, o qual resulta em uma epidemia

explosiva de alta escala (Vasconcelos, 2002; Gardner & Ryman, 2010) que é iniciada com a

introdução do vírus em áreas com alta densidade populacional, onde o mosquito Ae. aegypti é

o vetor responsável pela disseminação da doença.

20

O ciclo de transmissão silvestre da FA ocorre na mata de áreas endêmicas onde o vírus

é transmitido entre várias espécies de primatas e mosquitos que habitam o dossel da floresta,

sendo que o vírus é “acidentalmente” transmitido para humanos que entram nestas áreas

(Gardner & Ryman, 2010). O ciclo silvestre, além de complexo, não é ainda de inteira

compreensão e varia de acordo com a região onde ocorre (Vasconcelos, 2002). Na África, este

ciclo foi descrito como tendo o Ae. africanus como o principal vetor (Barrett & Higgs, 2007).

Já nas Américas, o ciclo silvestre têm como responsáveis pela transmissão os mosquitos dos

gêneros Haemagogus (Hg. janthinomys, Hg. albomaculatus, etc.) e Sabethes (Sa.

chloropterus, Sa. soperi, etc.), sendo que o Hg. janthinomys é o principal responsável

(Vasconcelos, 2002).

Nas áreas de savana africana há também a transmissão intermediária da FA, que

resulta em epidemias de pequena escala em vilarejos rurais, onde espécies de mosquitos semi-

domésticas (Ae. luteocephalus, Ae. furcifer, Ae. metallicus, Ae. opok, Ae. taylori, Ae. vittatus,

e membros do complexo Ae. simpsoni) (Barrett & Higgs, 2007) infectadas se alimentam de

ambos os hospedeiros, tanto do homem quanto de primatas. Este tipo de surto tem sido

comum na África nas últimas décadas (Gardner & Ryman, 2010).

Segundo estimativa realizada pela Organização Mundial da Saúde (OMS), o VFA

acomete cerca de 200.000 pessoas anualmente (Monath, 2001), incluindo 30.000 mortes

anuais (Barrett & Higgs, 2007). Mais de 90% destes casos ocorrem na África, onde a

transmissão é mantida pela alta densidade de populações do mosquito vetor que estão

próximos a grandes populações humanas não vacinadas em conjunção com um processo de

rápida urbanização, visto que a taxa de aumento da população urbana de 4% ao ano. Já na

América do Sul, a menor taxa de transmissão é em parte devido à alta cobertura vacinal que

ocorre em campanhas de imunização em massa. Contudo, é preocupante a re-infestação de

mosquitos Ae. aegypti nos mais importantes centros urbanos das Américas Central e do Sul,

incluindo cidades onde historicamente ocorreram epidemias de FA urbana e agora estão

habitadas por grandes populações não imunizadas (Gardner & Ryman, 2010).

Com o advento da biologia molecular, mais especificamente de sequenciamento

genômico, caracterização genética e filogenia empregando sequências dos genes de Envelope,

NS5 e regiões não traduzidas 5’ e 3’, sete genótipos do VFA foram descritos, sendo cinco de

ocorrência geográfica na África (Mutebi et al., 2001) e dois nas Américas (Vasconcelos et al.,

2004; Bryant et al., 2005). Nunes et al. (2012) por meio do estudo do genoma completo de

diferentes cepas brasileiras em comparação com cepas Africanas e de Trinidad, bem como,

pela análise filogeográfica, confirmaram dados previamente descritos sobre a heterogeneidade

21

das regiões 3’ não traduzidas (Mutebi et al., 2001; Bryant et al., 2005), bem como, lançaram

as bases para a análise filogeográfica e de dispersão espaço-temporal do VFA nas Américas,

em particular no Brasil.

1.4 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA FEBRE AMARELA

Descrito como ''a original febre hemorrágica viral'' a FA é uma sepse viral

pansistêmica que pode apresentar-se clinicamente por febre, prostração, lesão hepática, renal

e miocárdica, hemorragia, choque, e têm 20% a 50% de letalidade (Monath, 2008; Gardner &

Ryman, 2010). A doença clínica varia de não-específica leve, doença abortiva até a febre

hemorrágica fatal (Monath, 2001). Diferenças nas cepas de vírus, bem como fatores imunes

incompletamente compreendidos do hospedeiro, são provavelmente responsáveis pela gama

de sintomas clínicos (Barnett, 2007). Apesar disto, o fígado é o alvo principal da infecção e

pigmentos biliares amarelos são liberados a partir do fígado danificado resultando em

icterícia, por isso o termo "febre amarela" (Pulendran, 2009).

Três fases de FA são descritas. A primeira é durante a viremia que é caracterizada por

febre, mal-estar, mialgia generalizada, náuseas, vômitos, irritabilidade, tontura, e geralmente

uma aparência tóxica. A segunda fase é caracterizada por melhora dos sintomas, incluindo

uma redução de febre, o que pode durar até 48 horas, mas não é observado em todos os casos.

A terceira fase ocorre em aproximadamente 15% dos casos e caracteriza-se pelo retorno da

febre, náuseas, vômitos, icterícia e diátese hemorrágica (Barnett, 2007).

1.5 TRATAMENTO, PREVENÇÃO E DIAGNÓSTICO DA FEBRE AMARELA

Não há medicamento específico para o tratamento da doença (Staples & Monath,

2008). Embora não haja drogas antivirais específicas disponíveis, alguns compostos com

atividade antiviral in vitro foram descritos, incluindo ribavirina e interferon-α (Gardner &

Ryman, 2010), além destes, Monath (2008) revisou trabalhos que relatam o uso de diferentes

dosagens destes compostos e também o uso de anticorpos passivos, interferons,

imunomodulatórios e outras drogas contra a FA. Desta forma, o tratamento medicamentoso

deve se voltar para o combate aos sintomas e os sinais manifestos da doença, como a

medicação a ser prescrita depende das manifestações clínicas, é comum o uso de analgésicos e

antitérmicos, entretanto, se contra-indica o uso de medicamentos que contenham em sua

fórmula o ácido acetil-salicílico ou seus derivados pois eles podem agravar os fenômenos

hemorrágicos (Vasconcelos, 2002; 2003).

22

A vigilância da FA é fundamental para o monitoramento da incidência da doença e

para permitir a detecção precoce de surtos ou sua prevenção, além do acompanhamento de

medidas de controle, a comunicação dos casos é exigida pelo Regulamento Sanitário

Internacional (International Health Regulations) (Gardner & Ryman, 2010). Outra forma

preventiva é o uso da vacina YF17D, como citado anteriormente.

Exames de diagnóstico laboratoriais se baseiam na detecção do vírus ou antígeno viral

no sangue durante a fase pré-ictérica ou por sorologia. Nenhum teste comercial está

disponível e as capacidades de diagnóstico residem unicamente em laboratórios

especializados e de referência (Monath, 2001), pois infelizmente requerem um pessoal de

laboratório altamente treinado, e com acesso a equipamentos e materiais especializados

(Gardner & Ryman, 2010).

O vírus pode ser isolado por inoculação intracerebral em camundongos recém

nascidos ou em cultivos celulares (células VERO, SW13, BHK-21, AP61 e clone C6/36),

particularmente se combinadas com técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), testes

de imunofluorescência indireta usando anticorpos monoclonais ou mediante testes de fixação

do complemento (Monath, 2001; Vasconcelos, 2002; 2003). O diagnóstico sorológico pode

ser feito através da presença de IgM específica para o VFA ou um aumento quatro vezes

maior nos níveis de IgG entre o soro de fase aguda e convalescente na ausência de uma

vacinação recente (Gardner & Ryman, 2010). A reação cruzada entre o VFA e outros

Flavivirus pode dificultar o diagnóstico sorológico, particularmente em indivíduos que vivem

em regiões onde vários Flavivirus são endêmicos (Monath, 2001). Nos casos fatais procura-se

antígenos específicos pela técnica de imunohistoquímica em tecidos hepáticos ou é

evidenciado o genoma viral por RT-PCR do sangue (células e soro) e fígado (Vasconcelos,

2002; 2003). Frequentemente a FA não é diagnosticada até que o paciente tenha se recuperado

ou sucumbido, isto, se é que o diagnóstico é feito (Gardner & Ryman, 2010).

1.6 PROTEÔMICA VIRAL

A proteômica clínica, um subconjunto de atividades da proteômica dentro do campo

da medicina, surgiu com a promessa de acelerar a descoberta de novos alvos de drogas e

proteínas marcadoras de doenças que são úteis para diagnóstico in vitro (Vitzhum et al.,

2005). O recente desenvolvimento das técnicas proteômicas tem estimulado um grande

interesse em aplicar as tecnologias em estudos clínicos translacionais, em particular, pesquisa

por proteínas biomarcadoras (Pan et al., 2011). Um biomarcador é uma substância encontrada

23

em amostras biológicas (Issaq & Veenstra, 2007) que serve como uma característica para o

estado fisiológico da célula em um determinado tempo e pode mudar durante o processo

patológico (Wulfkuhle et al., 2003). Além disso, os biomarcadores são medidas biométricas

que transmitem informações sobre a condição biológica da questão a ser testada, obtendo o

seu valor a partir de sua capacidade de diferenciar entre dois ou mais estados biológicos

(LaBaer, 2005).

Na virologia, a pesquisa proteômica ainda é considerada como um enorme desafio

trazido principalmente por três aspectos; o estudo sobre o proteoma complexo do vírus com

variações inesperadas, o desenvolvimento de técnicas de análise mais precisas, bem como a

compreensão da patogênese viral e dinâmica de interação vírus-hospedeiro. Avanços nessas

áreas serão úteis para o desenvolvimento de vacinas e de descoberta de drogas antivirais

(Zheng et al., 2011). Até agora, um pequeno número de estudos têm utilizado abordagens

proteômicas para mostrar os efeitos de uma infecção viral no proteoma celular e as crescentes

evidências enfatizam a proteômica comparativa como alternativa para o conhecimento das

proteínas diferencialmente expressas em células do hospedeiro que estejam associadas aos

processos fisiopatológicos da infecção por vírus (Maxwell & Frappier, 2007). Além disso,

esta abordagem permite identificar o repertório de fatores do hospedeiro que estão envolvidos

ativamente no ciclo viral infeccioso e caracterizar as respostas hospedeiras, qualitativa e

quantitativamente durante a patogênese viral (Zheng et al., 2012).

De forma geral, as infecções virais podem resultar em modificações pós-traducionais,

tais como a ubiquitinação, fosforilação e glicosilação sem afetar as taxas de transcrição.

Portanto, a análise proteômica das respostas celulares do hospedeiro à infecção por vírus é

mais provável para a avaliação de potenciais fatores celulares envolvidos direta ou

indiretamente na infecção viral e para identificar potenciais alvos de drogas antivirais (Zheng

et al., 2008).

Zheng et al. (2011) relatam que vários vírus de importância clínica e suas infecções no

interior de células hospedeiras foram estudados utilizando diferentes abordagens proteômicas

em conjunção com análise de espectrometria de massas. Somente são relatados em sua

revisão cinco vírus da Família Flaviviridae, o Vírus da Hepatite C, o VDEN, o Vírus da Peste

Suína, o VNO e o Vírus da Diarréia Viral Bovina.

Apesar de ter uma vacina eficaz e a imunização ser o método mais importante de

prevenção contra a FA (Barnett, 2007), esta continua a ser classificada como uma doença

emergente ou re-emergente (Vasconcelos, 2003; Barrett & Higgs, 2007; Gardner & Ryman,

2010) com grande potencial de reurbanização nas Américas. Isto é devido ao atual nível de

24

infestação de Ae. aegypti nos grandes centros urbanos próximos às áreas endêmicas, à

frequente migração de populações entre as áreas endêmicas e não endêmicas, e a baixa

cobertura vacinal contra FA em muitos países (Vasconcelos, 2003; Gardner & Ryman, 2010).

Com a falta de informação proteômica sobre o VFA, estudos como este, podem

ampliar o entendimento da fisiopatologia da doença e também possibilitam a descoberta de

biomarcadores protéicos para diagnósticos mais eficazes e/ou alvos de tratamento, que

podem, junto com as ferramentas atuais de controle de surtos, aumentar a velocidade de

resposta sobre possíveis epidemias. Embora muito se tenha aprendido nos últimos 100 anos,

claramente ainda há muito mais a ser descoberto sobre a FA (Staples & Monath, 2008).

25

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Verificar alterações no proteoma de células de carcinoma hepatocelular humano,

HepG2, experimentalmente infectadas pelo Vírus da Febre Amarela, Cepa Be H111

(Flaviviridae: Flavivirus).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Observar o provável efeito citopático induzido pelo VFA, a cinética viral

adquirida com MOI de 0,01 e estabelecer o melhor período para análise das

alterações no proteoma celular;

Comparar os padrões dos perfis proteicos de células HepG2 infectadas com

VFA ao grupo controle;

26

3 MATERIAL E MÉTODOS

O material e métodos utilizados estão descritos a seguir, enquanto que a ordem dos

principais experimentos realizados para alcançar os objetivos propostos encontra-se resumida

no fluxograma de trabalho (Figura 3).

3.1 ASPECTOS ÉTICOS E DE BIOSSEGURANÇA

Este projeto para desenvolvimento da dissertação de mestrado não visou a utilização

de humanos, outros animais ou meio ambiente como objetos de pesquisa, sendo utilizada a

Figura 3 – Fluxograma de trabalho. Fluxograma dos principais passos realizados. Caixas

em tons de cinza; representam os experimentos iniciais com cultivos celulares e manuseio

viral. Caixas vermelhas; testes realizados para estabelecer o melhor dia para a análise

diferencial. Caixas verdes; diferenciam os materiais biológicos coletados utilizados. Caixa

roxa; período de análise dos dados gerados a partir dos testes realizados para estabelecer o

melhor dia para a análise diferencial. Caixas azuis; indicam as análises finais partindo da

extração de proteínas até a análise diferencial final. Setas pretas; indicam a ordem do trabalho

realizado. Setas azuis; indicam a ordem do trabalho realizado com as células cultivadas em

placas de seis poços. Setas e conectores laranja; indicam a ordem do trabalho realizado com as

células cultivadas em garrafas.

27

cepa viral já previamente isolada e pertencente ao acervo do Instituto Evandro

Chagas/SVS/MS, Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (SAARB/IEC).

Para a realização dos procedimentos descritos a seguir, foram aplicadas as normas e

critérios pré-estabelecidos e exigidos pelo Comitê Internacional de Biossegurança. Todos os

procedimentos envolvendo a manipulação da cepa viral foram realizados em cabines de

biossegurança e os que envolvam substâncias tóxicas, em capelas de exaustão.

3.2 CARCINOMA HEPATOCELULAR HUMANO, HEPG2

O cultivo epitelial HepG2 (ATCC: HB8065; BCRJ:0103) é considerado nível de

biossegurança 1 e como descrito na patente de criação (Knowles & Aden, 1983), estas células

foram criadas primeiramente com objetivos de produzir uma linhagem de célula hepática

estável aplicáveis à estudos de metabolismo de drogas, em particular, na procura de potencial

carcinógenos e mutagênicos e na produção de componentes vacinais para o Vírus da Hepatite

B, não descartando a cultura de vírus.

A linhagem HepG2 foi derivada de uma biópsia retirada de um adolescente argentino

caucasiano de 15 anos de idade em 1975. Foram caracterizados 55 cromossomos (variando de

50 à 56), tendo como cromossomo marcador o cromossomo 1 rearranjado. Foram testados a

produção de 17 proteínas normais do plasma humano, e dentre elas, apenas a Gc-globulina

estava ausente, e também foi relatado a satisfatória produção do antígeno da hepatite B

(HBsAg) durante a replicação viral do Vírus da Hepatite B (Knowles & Aden, 1983).

3.2.1 Descongelamento das Células HepG2

Para o descongelamento das células HepG2 foi utilizado meio de cultura consistindo

de meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM – Sigma, EUA), acrescido de

1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 10 mM de Hepes (Sigma), 2 mM de L-glutamina (Sigma), e

10% de soro bovino fetal (SBF), sem a adição de antibióticos.

O descongelamento da suspensão celular criopreservada em nitrogênio líquido foi

realizado rapidamente em banho Maria 37°C, porém, antes do total descongelamento a

suspensão celular foi conduzida à cabine de segurança biológica de classe II (B2) para ser

feita uma diluição final de 1:10 em meio de cultura DMEM. A transferência da suspensão

celular para o meio de cultura foi realizada de forma lenta (gota a gota) e seguida por uma

centrifugação de 5 minutos a 800 rotações por minuto (RPM). Após a centrifugação foi

retirado o sobrenadante e o precipitado de células resuspendido em 5 mL de meio e

28

transferido para uma garrafa de 25 cm² de área de crescimento celular a qual foi incubada em

sistema semi aberto em estufa com 5% de CO2 a 37°C.

3.2.2 Subcultura das Células HepG2

Após a formação da monocamada celular foi feito o processo de passagem celular, ou

subcultura para manutenção da linhagem manipulada. De forma geral, existe um padrão

metodológico descrito para culturas celulares de vertebrados (Freshney, 2010; American type

culture collection, 2013) o qual pode ser alterado de forma livre ao manipulador das células,

porém, as mudanças devem ser bem analisadas para não comprometer o cultivo celular. Desta

forma, após a observação da formação da monocamada o meio de cultura foi retirado, e a

monocamada de células lavada três vezes com uma solução salina fosfatada tamponada de

Dulbecco (Dulbecco & Vogt, 1953) incompleta (D-PBS), sem a adição de íons de Ca2+

e

Mg2+

(Knowles & Aden, 1983). A composição do D-PBS é de NaCl (8,0 g), KCl (0,2 g),

Na2HPO4 (1,15 g) e KH2PO4 (0,2 g) diluídos em 1000 mL de água deionizada ultra pura

(Mili-Q) (Milipore, EUA) autoclavada.

Para desprender as células aderidas à parede da garrafa, foi adicionado uma solução

contendo 0,25% de tripsina e 0,02% EDTA em um volume de 0,5 mL/25 cm². Após cobrir

toda a monocamada de células, essas permaneceram em repouso por 30 segundos, quando

logo após, a tripsina foi removida parcialmente, e as células incubadas em estufa 37°C por 2 a

5 minutos, de modo a permitir o desprendimento mais rápido possível das células.

Para inativar a tripsina, logo após o processo descrito acima foi acrescentado meio de

cultura DMEM de crescimento (10% de SBF) com 0,1% de uma formulação de dois

antibióticos (Sigma, EUA) sendo penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 μg/mL),

utilizando-se um volume de pelo menos duas vezes ao de tripsina adicionado. A suspensão de

células foi submetida a centrifugação de 1000 RPM por 4 minutos. O sobrenadante foi então

desprezado, e o precipitado de células resuspendido em 3 mL de meio DMEM de

crescimento.

Novas garrafas de cultivo celular foram mantidas em uma divisão split ratio de 1:3

(American type culture collection, 2013) para manutenção da linhagem celular ou para o

experimento de infecção com o VFA.

29

3.3 CEPA VIRAL

Para o presente estudo foi utilizado o isolado Be H111 do VFA pertencente a coleção

de isolamentos da SAARB/IEC com autorização da direção do IEC (Anexo). A cepa em

questão corresponde ao vírus selvagem mantido inoculado em camundongos recém-nascidos

(Mus muscullus).

3.4 ESTOQUE VIRAL

Para alcançar os objetivos deste estudo, foi necessário a síntese de um estoque viral a

partir da recuperação in vitro do isolado do VFA. Esta recuperação foi realizada em duas

passagens em cultivo de células de Aedes albopictus clone C6/36, sendo a segunda passagem

viral utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01.

3.4.1 Estoque Viral em Cultivo de Células de Mosquito Aedes albopictus Clone C6/36

O cultivo de células de mosquito Aedes albopictus, clone C6/36, foi mantido em meio

Leibowitz (L-15 – Sigma) com adição de triptose fosfato (Sigma) a 10%, solução de

aminoácidos não essenciais (fórmula do Dr. Moacir Rebello – Baktron microbiologia, Brasil)

a 1%, bem como uma formulação de dois antibióticos (Gibco, EUA) sendo penicilina e

estreptomicina adicionados ao volume final de 0,1%. O meio de crescimento contém 5% de

SBF, e o de manutenção 2%. A subcultura foi realizada como indicado no sítio eletrônico da

ATCC (American type culture collection, 2013).

Inicialmente, para recuperação do VFA e produção do estoque semente, foi utilizada

uma garrafa grande (175 cm²) com monocamada confluente. O meio de crescimento foi

desprezado e a monocamada lavada delicadamente uma vez com meio de cultivo de

manutenção para retirar células não aderidas à parede da garrafa. Foi realizada a maceração

do cérebro de camundongo recém-nascido infectado em 1,8 mL de uma solução salina

contendo albumina bovina (0,75%), penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 µg/mL), o

macerado foi centrifugado por 5 minutos a 5000 RPM, onde o sobrenadante foi utilizado

como inóculo. Logo após, foi inoculado 1 mL do isolado viral em suspensão filtrado em filtro

de seringa sobre a monocamada celular e incubada para adsorção viral por uma hora em

temperatura de 28 a 30°C, com eventuais agitações suaves neste período de tempo. Após a

adsorção, a monocamada foi novamente lavada, e acrescido 50 mL de meio de manutenção

para posterior incubação por 6 a 10 dias em 28 a 30°C.

30

Diariamente foi realizado o acompanhamento em microscópio ótico invertido para

verificar a presença de ECP, ou desagregação das células da parede da garrafa. Quando

notada a presença de um dos dois, foi acrescentado 5 mL (10%) de SBF, com posterior

homogeneização e coleta do líquido do interior da garrafa para centrifugação. Após

centrifugar por 3000 RPM durante 5 minutos, o sobrenadante foi aliquotado em tubos

específicos para congelamento e estes foram armazenados em freezers a -70°C para posterior

titulação viral, enquanto que as células precipitadas foram coletadas em lâminas especiais

para imunofluorescência (Perfecta, Brasil) e testadas por imunofluorescência indireta (IFI)

(subsecção 3.7).

Após a realização do teste de IFI, e com resultado positivo para VFA, foi realizada a

titulação viral (Subsecção 3.8).

Com o título viral do estoque semente já definido, foi realizada uma segunda

passagem do vírus nas células da linhagem C6/36, gerando desta forma o estoque trabalho, só

que desta vez a monocamada foi infectada com diferente MOI, apresentado na subsecção 3.6.

Para realização da segunda passagem foram necessárias duas garrafas grandes com

monocamada confluente. Uma delas foi utilizada para contagem celular (como visto na

subsecção 3.5), e a outra foi inoculada com MOI de 0,01, conforme descrito para a

recuperação viral. Ao final da incubação por 6 a 10 dias pós-infecção (dpi) foi realizado o

mesmo protocolo da primeira inoculação, com acréscimo de SBF, centrifugação e

aliquotamento e armazenagem do sobrenadante, teste de IFI para o precipitado celular e

posterior titulação viral, gerando o estoque viral de trabalho.

3.5 CONTAGEM DE CÉLULAS E VIABILIDADE CELULAR

A contagem de células em câmara de Neubauer foi uma prática frequente no

plaqueamento de células para titulação, teste de viabilidade celular e na infecção utilizando

MOI. Esta prática foi efetuada com o corante vital azul de tripan 0,4% (Sigma), para

diferenciação de células viáveis das não viáveis (Louis & Siegel, 2011).

Após o preparo e homogeneização da suspensão celular foi retirada uma alíquota para

a contagem das células, e a partir desta foi feita uma diluição final de 40 μL de suspensão

celular adicionados a 360 μL de meio de crescimento (1:10), sendo o meio de cultivo

específico para a célula a ser contada. Foram transferidos 300 μL desta diluição celular para

outro microtubo contendo 300 μL de solução de azul de tripan (1:1), onde, após

homogeneização foram transferidos um total de 20 μL, sendo 10 μL em cada borda da câmara

31

de Neubauer, por capilariedade, entre a lamínula e as canaletas em forma de V, então em

seguida foram contadas todas as células.

A contagem foi feita em microscópio ótico, em um aumento de 100 x (aumento de 10

x nas lentes objetivas e 10 x nas lentes oculares), e foram contadas as células presentes nas 8

zonas de canto da câmara. A câmara tem profundidade de 0,1 mm e estas zonas de canto são

de 1 mm x 1 mm de diâmetro e cada zona está dividida em 16 quadrados pequenos, formando

uma matriz de quatro por quatro. Cada zona de canto tem um volume de 0,1 mm³ ou 1 x 10-4

mL (Louis & Siegel, 2011). Gerando desta forma a seguinte fórmula para cálculo, onde Z é a

zona de canto:

Suspensão celular = Média de células x fatores de diluição x volume da zona de canto

Suspensão celular = (Z1+Z2+ Z3+Z4+Z5+Z6+Z7+Z8) x 2 x 10 x 104 células/mL

8

Para calcular o total de células dentro de uma garrafa, parâmetro utilizado para

estabelecer a MOI, foi multiplicada a quantidade de células/mL pela quantidade total de mL

de suspensão celular.

Para determinação do percentual de viabilidade de cada grupo, dividiu-se o número de

células viáveis contadas pelo total de células contadas (viáveis e não viáveis) de ambos os

grupos experimentais. Ou seja:

% de células viáveis = número de células viáveis contadas x 100

total de células contadas

3.6 MULTIPLICIDADE DE INFECÇÃO

A MOI é uma medida quantitativa utilizada para controlar as condições de infecção,

sendo simplesmente a razão do número médio de unidades formadoras de placas (PFU) por

célula utilizada na infecção. Como exemplo, em um ensaio onde a MOI utilizada será de 1,

significa que a inoculação será feita baseada em uma PFU por célula (Wagner et al., 2008).

Para utilização desta medida quantitativa de controle de infecção são necessários dois

parâmetros que são, a concentração de vírus no estoque original (PFU/mL), e a quantidade

total de células a serem infectadas.

Para o cálculo do volume do estoque viral (Vv) titulado necessário para se obter a

MOI desejada, será utilizada a seguinte fórmula:

32

Vv (mL) = MOI x o número total de células a serem infectadas

Título viral (PFU/mL)

3.7 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A IFI foi utilizada para confirmar a infecção pelo VFA nas culturas inoculadas. Todos

os testes de IFI foram realizados com o protocolo utilizado na rotina do Laboratório de

Isolamento Viral em Cultura de Células do SAARB/IEC, que segue o protocolo descrito por

Gubler et al. (1984), com adaptações. Os testes, sempre realizados em duplicata, utilizaram

como anticorpos primários os anticorpos, policlonal para o Grupo B e, monoclonal para o

VFA, este último adquirido da Fundação Oswaldo Cruz (Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro) e

preparados em uma diluição de 1:20 e 1:900, respectivamente, e como anticorpo secundário o

anticamundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Cappel, EUA) na

diluição de 1:800.

A leitura das lâminas foi realizada em microscópio de fluorescência (Zeiss) com epi-

iluminação.

3.8 TITULAÇÃO VIRAL

O ECP em células hospedeiras pode ser observado após infecção por muitos vírus que

causam dano ou alterações celulares em decorrência de sua replicação. Mesmo se as células

não são mortas ou lisadas, modificações célulares de uma área devido a uma infecção por

vírus pode ser prontamente observada como uma placa ou foco de infecção (Wagner et al.,

2008).

Trabalhando com diluições e condições apropriadas, uma tal infecção localizada pode

ser o resultado da infecção com um único vírus biologicamente ativo. Uma partícula de vírus

capaz de iniciar uma infecção produtiva é denominado como uma PFU (Wagner et al., 2008).

O processo de formação da placa é iniciado com uma primeira célula infectada que

libera muitos vírus. Se os vírus são mantidos em uma ampla difusão, ocorrerá a infecção na

vizinhança das células infectadas originais que irá infectar as células vizinhas. Este processo

repetido inúmeras vezes, contanto que a interação de células e de vírus é mantida localizada

sob o uso de um meio de cultura celular viscoso, fazem desta área de citopatologia o

resultado de uma única infecção de uma única PFU. As placas resultantes podem ser

facilmente observadas e contadas alguns dias após a infecção (Wagner et al., 2008).

33

3.8.1 Titulação Viral em Células VERO

O cultivo celular VERO (ATCC: CCL-81) é propagado em meio 199 (Gibco)

acrescido de 2,2 g/L de bicarbonato de sódio e 1 mL/L de antibiótico Gentamicina (Nova

Farma, Brasil) e 5% de SBF para o meio de crescimento.

De forma geral, a subcultura de células VERO é semelhante com a descrita para

HepG2 na subsecção 3.2.2, mudando apenas o meio de cultivo utilizado.

Para a titulação do VFA foram utilizadas monocamadas de células VERO preparadas

com concentração celular de 2 x 105 células/mL, confluindo em monocamadas em dois dias

após a sua passagem. A titulação foi realizada em placas de poliestireno (TPP, Suiça) de 6

poços, plaqueadas com 3 mL de meio de crescimento contendo a quantidade de células

citadas.

A técnica utilizada para titulação biológica da cepa em estudo é uma adaptação da

descrita por Malewicz & Jenkin (1979), os quais utilizaram um meio semi-sólido (overlay)

sem SBF.

As placas de poliestireno com monocamada celular confluente tiveram o seu meio de

crescimento retirado e a monocamada foi lavada uma vez com D-PBS. Foram preparadas

diluições em série de 10-1

até 10-8

dos sobrenadantes coletados a serem titulados, utilizando-se

como diluente o meio 199 incompleto com a mesma formulação descrita anteriormente e sem

a adição de SBF.

Foi realizada a inoculação em duplicata de 0,1 mL das diluições a partir de 10-4

em

seus respectivos poços, e no controle negativo foi adicionado apenas o meio de cultura sem

inóculo viral. Logo após, as placas foram incubadas em estufa a 37°C com 5% de CO2 por

uma hora, com agitação a cada 15 minutos para auxiliar na adsorção viral.

Após o período de adsorção viral, as monocamadas foram novamente lavadas com D-

PBS para posterior adição de 3 mL do meio overlay. O meio overlay consiste em meio 199

1X (2,2 g/L de bicarbonato de sódio) e carboximetilcelulose (CMC) de média viscosidade

(Sigma) na concentração final de 1,6%. Após isso, as placas foram incubadas em estufa a

37°C com 5% de CO2 por sete dias.

Após os setes dias de incubação, as monocamadas de células foram fixadas em formol

a 10% durante no mínimo 4 horas, lavadas e posteriormente coradas com cristal violeta a

0,1% durante no mínimo 4 horas. O título viral foi determinado em PFU/mL.

34

As placas formadas nas monocamadas de células foram contadas na primeira diluição

em que se observaram individualizadas. Por conseguinte, foi feita a média de placas e os

números de placas foram multiplicados pelos seus fatores de diluição, e divididos pelo

volume em mL utilizado como inóculo, como apresentado na fórmula a seguir:

Título viral (PFU/mL) = Média de placas x fator de diluição

Volume do inóculo (mL)

3.9 INFECÇÃO DAS CÉLULAS HEPG2 PELO VFA

Neste estudo foram utilizadas 30 garrafas com 25 cm² de área de crescimento celular

contendo monocamadas com confluência de aproximadamente 80% de células HepG2

divididas em dois grupos, grupo controle (sem inóculo viral) e o grupo infectado (inoculados

com VFA). Diariamente foram realizadas extrações de proteínas totais de seis garrafas, três de

cada grupo, durante o período de 1 a 5 dpi. Em paralelo a utilização das garrafas, foram

utilizadas 5 placas (uma pra cada dpi) de seis poços (9,6 cm² de área de crescimento, sendo,

desta forma, um poço equivalente a uma garrafa) mantidas nas mesmas condições que as

garrafas para fazer o teste de viabilidade celular e IFI. Também foram utilizadas garrafas e

uma placa extra, mantidos nas mesmas condições de crescimento celular, as quais foram

tripsinizadas para contagem total de células, e servindo de subsidio para em seguida realizar a

infecção como descrito a seguir.

O meio de crescimento foi removido, e as monocamadas foram lavadas duas vezes

com D-PBS, e inoculadas com MOI 0,01. Para isso, as amostras virais foram diluídas em

meio DMEM sem SBF, padronizando-se o volume final para 3 mL/garrafa e 1 mL/poço. Nos

controles negativos (cultivos não infectados) foram adicionados 3 mL de meio sem inóculo

em cada garrafa ou 1 mL por poço. As garrafas e placas foram incubadas por 1 hora em estufa

37°C a 5% de CO2 e homogeneizadas cuidadosamente a cada 15 minutos para o espalhamento

da suspensão viral na monocamada.

Após a adsorção viral, os inóculos virais foram removidos e as monocamadas lavadas

uma vez com D-PBS. Foi adicionado um volume de 10 mL (garrafa) e 3 mL (poço) de meio

DMEM de manutenção (3% de SBF). Seguindo-se, então, a incubação em estufa 37°C a 5%

CO2 por até 5 dias. As células foram observadas nesse intervalo de tempo objetivando a

pesquisa de provável ECP em microscópio ótico invertido (Zeiss).

35

3.10 CINÉTICA VIRAL

Para a curva da cinética viral, durante o preparo das garrafas para extração de

proteínas, foram coletados os sobrenadantes das garrafas do grupo infectado. Em sequência da

adição de 10% de SBF, e foram centrifugados a 2000 RPM, alíquotados e estocados em

freezers a -70°C, para posterior titulação viral pelo método descrito na subsecção 3.8. Os

sobrenadantes do grupo controle também foram coletados para posterior uso como controle

negativo no teste de titulação.

3.11 ANÁLISE PROTEÔMICA

3.11.1 Extração de Proteínas das Células Cultivadas

As extrações de proteínas foram realizadas em ambos os grupos, diariamente, entre os

dias 1 a 5 após a inoculação, sendo os sobrenadantes celulares coletados conforme descrito na

subsecção 3.10.

Posteriormente, as monocamadas de ambos os grupos foram lavadas duas vezes com

10 mL de D-PBS gelado. Foi, então, adicionado 1 mL de uma solução de tampão de extração

(7 M de Uréia, 2 M de Tiuréia e 4% de CHAPS (3-(cholamidopropyl)dimethylammonio-1-

propane sulfonate)) com 1 μL de inibidor de protease Protease Inhibitor Mix (GE Helthcare)

sobre as monocamadas, agitando levemente para que esta solução cubra totalmente a

monocamada celular, submetendo, então, as garrafas a um banho de gelo por 5 minutos.

Após o banho de gelo, as monocamadas foram rapidamente coletadas com pipeta

sorológica. O lisado celular foi transferido para microtubos do tipo eppendorf, e mantidos em

gelo/refrigeração durante a ultrassonicação, realizada por 30 segundos divididos em dois

períodos de 15 segundos cada, em uma frequência de onda de 60% do ultrassonicador. Após

isto, permanecendo em banho de gelo/refrigeração durante todo o período de clarificação e

quantificação.

3.11.2 Clarificação do lisado celular

Após a extração, os tubos com os lisados celulares permaneceram em banho de gelo, e

foram centrifugados a 8000 xg por 10 minutos a 4°C para a precipitação dos “debris”

celulares.

36

Os sobrenadantes foram cuidadosamente transferidos para tubos tipo eppendorf e

imediatamente quantificados. Durante esta etapa, os tubos permaneceram sob refrigeração

constante, isto é, em um recipiente com gelo.

3.11.3 Quantificação de Proteínas Totais

A quantificação de proteínas totais foi realizada com auxílio do 2-D Quant kit (GE

Healthcare), de acordo com as recomendações do fabricante. Após a quantificação, as

amostras foram aliquotadas e então armazenadas em freezers a -80°C até posterior uso.

3.11.4 Eletroforese Bidimensional

Os extratos proteicos foram aplicados em uma quantia de 125 µg de proteínas em

IPG-strip, 7 cm, pH 3-11NL (GE Healthcare) pelo método de re-hidratação em gel por no

mínimo 16 horas para a realização da primeira dimensão. A focalização isoelétrica foi

realizada na unidade IPGphor III (GE Healthcare) com o seguinte perfil: 100 V por 30

minutos, 300 V por 200 Vh, gradualmente até 1000 V por 300 Vh, gradualmente até 5000 V

por 4000 Vh, permanecendo em 5000 V por 1500 Vh, com uma focagem total de 6 kV. Antes

da segunda dimensão, as strips foram passadas por um processo de redução em tampão de

equilíbrio (6 M uréia, 0,075 M TrisHCl pH 8,8; glicerol 29%; SDS 2%; azul de bromofenol

0,02%) contendo 10 mg/mL de DTT (ditiotreitol) durante 15 minutos e em seguida,

alquilados por 15 minutos na mesma solução de equilíbrio mencionada anteriormente,

contendo iodacetamida (25 mg/mL). Na segunda dimensão os spots protéicos foram

separados em gel de SDS-poliacrilamida 12,5% com auxilio do sistema MiniVE (GE

Healthcare), em uma voltagem constante de 100V por aproximadamente 2 horas.

Os spots de proteínas foram visualizados após coloração em solução coloidal de

Comassie Blue G 250, overnight sob agitação, seguido da captura de imagem através do

ImageScanner III (GE Healthcare), software Labscan (GE Healthcare), no qual a imagem é

importada em formato TIFF e MEL. Após aquisição das imagens do gel estas foram

analisadas e os mapas diferenciais das proteínas gerados usando o programa ImageMaster 2D

Platinum 7.0 (GE Healthcare).

37

3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise estatística dos dados obtidos nos testes de viabilidade celular, foi

utilizado o programa BioEstat 5.0 (Instituto Mamirauá), os dados foram submetidos ao teste

de análise de variância (ANOVA) com um critério seguido do teste Tukey, ambos assumindo

valor de p < 0,05 para consideração de diferença estatística significante. Os resultados de

ANOVA obtidos para os valores dos spots diferenciais foram obtidos automaticamente pelo

programa ImageMaster 2D Platinum 7.

As tabelas e figuras com representações gráficas foram geradas no Microsoft Office

Excel 2007 (Microsoft).

38

4. RESULTADOS

4.1 TÍTULO VIRAL, EFEITO CITOPÁTICO E TESTE DE VIABILIDADE CELULAR

Com o intuito de fazer uma observação mais extensa do comportamento e progressão

da infecção viral da cepa selvagem Be H111 do VFA em células HepG2, optou-se por uma

inoculação contendo uma MOI de 0,01. Desta forma, foi obtida uma curva de cinética viral

(Figura 3), em que os maiores títulos virais observados foram a partir do 3º dpi. O ECP foi

caracterizado pela presença de células não aderidas/mortas na monocamada celular. No grupo

infectado, foram observados ECP bem caracterizados no quarto e quinto dpi em comparação

com o grupo controle, que apresentou leves características de morte celular no quinto dia,

semelhante ao terceiro dia do grupo infectado (Figura 4 A e B). Estes resultados de ECP

acompanham as características da curva viral, mostrando que a alta taxa de replicação viral

contribui para a formação do ECP em cultivo celular.

Figura 4 - Curva de cinética da infecção pelo VFA em células HepG2. Título viral de

acordo com os dias pós-infecção. Os títulos virais em PFU/mL estão indicados em escala

logarítmica de base 10 (log10).

Também foram observados com os resultados obtidos da IFI o aumento crescente da

progressão da infecção viral através da expressão de antígenos virais detectados tanto por

anticorpos policlonais (Figura 4 C) quanto por monoclonais (dados não mostrados).

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

6,50

7,00

0 1 2 3 4 5 6

Título viral (Log

10)

Dias pós-infecção

39

Figura 5 - Comportamento da infecção pelo VFA, cepa selvagem Be H111, em cultivo celular HepG2. A e B, acompanhamento do ECP durante o período de

cinco dias (aumento de 100x). C, resultado dos testes de IFI durante o período de cinco dias com anticorpo policlonal para o grupo B dos arbovírus (aumento de 100x).

40

Os resultados de ECP foram reproduzíveis em todos os experimentos realizados.

Para quantificar este achado foi realizado o experimento de viabilidade celular através da

contagem celular com Azul de Tripan 0,4%.

Nos ensaios para verificar a viabilidade celular relacionada à infecção viral, os

valores das médias das contagens de células viáveis foram comparados entre os dias por

grupo e também entre os grupos por dia. Os resultados obtidos nos testes de viabilidade

celular estão representados na Figura 5. Na comparação entre os dias por grupo, o grupo

controle não apresentou diferença estatística (p > 0,05), demonstrando que a condição de

cultivo em meio de manutenção (3% SBF) não afeta estatisticamente a viabilidade celular.

Já no grupo infectado os dias 1 e 2 tiveram diferenças significativas (p < 0,05 e p < 0,01)

quando comparados com os dias 4 e 5, enquanto no dia 3 apenas foi observada diferença

significativa (p < 0,05) quando comparado ao dia 5, demonstrando que a atividade de

replicação viral está envolvida na diminuição da viabilidade celular. Entre as comparações

dos grupos por dia, apenas os dias 4 e 5 obtiveram diferença estatística (p < 0,05) entre os

grupos, demonstrando quantitativamente o já notado ECP.

Figura 6 – Resultados de viabilidade celular obtidos para infecção de células HepG2

pelo VFA. Os sinais e letras estão incluídos para delimitar os grupos e dias que tiveram

diferenças estatísticas no teste de ANOVA um critério seguido de Tukey. Na comparação

entre grupos por dias, “*” representa p < 0,05. Na comparação entre os dias por grupo, “a”,

*

*

a;d b;e

c

a;b

c;d;e

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 2 3 4 5

Via

bil

idad

e c

elu

lar

(%)

Dias pós-infecção

Controle Infectado

41

“b” e “c” representam diferença onde p < 0,05 e “d” e “e” diferença onde o valor de p <

0,01.


Na tentativa de definir o melhor dpi para fazer a análise proteômica diferencial da

infecção viral, foram levados em consideração todos os dados descritos anteriormente.

Inicialmente optou-se por fazer a análise com o 3º dpi, devido ao alto título viral obtido, a

presença de expressão de antígenos virais detectados pela IFI, a ausência de ECP entre o

grupo controle e infectado, levando em consideração que a infecção viral pelo VFA induz o

mecanismo de morte celular por apoptose (Mariannaeu et al., 1998; Xiao et al., 2001), e

entre as características bioquímicas da apoptose há a ativação da cascata de proteases

(Elmore, 2007), o que evidentemente atrapalharia os objetivos do trabalho. Apesar dos

critérios adotados, a análise dos géis pelo programa ImageMaster 2D Platinum 7 não

identificou nenhum spot diferencial.

Em uma reavaliação dos dados obtidos, considerando principalmente o aumento de

células expressando os antígenos virais no teste de IFI e que nas comparações estatísticas de

viabilidade celular entre os dias por grupo não houve diferença entre os dias 3 e 4, optou-se

pela tentativa de avaliação do 4º dpi.

Para a detecção dos spots proteicos nos géis corados por Comassie foram utilizados

os parâmetros de Smooth 2, saliência 100 e área mínima 10. Desta forma, foram detectados

no mínimo 521 e no máximo 612 spots nos géis de ambos os grupos, e como resultado do

matching (pareamento dos géis), foram encontrados uma média de 85% de spots pareados.

Os dados resultantes da detecção e processo de matching dos géis estão apresentados na

tabela 1.

Tabela 1 – Características dos géis em relação ao número spots detectados e pareados.

Amostra Grupo Spots Matches Matches (%)

C1D4 Controle 521 450 86



H1D4 Infectado 545 453 83



Para a análise de seleção dos spots diferenciais foram levados em consideração a

presença do mesmo spot nos três géis do mesmo grupo, valor da análise estatística por

ANOVA com p < 0,05 e, quando presente nos dois grupos, tiver uma diferença de expressão

42

de pelo menos 1,5 vezes entre os grupos. Seguindo estas considerações foram obtidos 4

spots proteicos diferenciais (Figura 6 e 7), onde dois foram caracterizados como spots

diferenciais (por estarem presente em apenas um dos grupos) e dois como expressamente

diferenciais (por estarem presentes nos dois grupos e terem diferença de expressão > que 1,5

vezes) (Tabela 2) podendo serem visualizados em representação gráfica tridimensional nas

figuras 8, 9, 10 e 11.

Tabela 2 – Spots proteicos diferencialmente expressos.

Legenda: Match ID é o número de identificação do pareamento feito automaticamente pelo

software ImageMaster 2D Platinum 7. pI é o ponto isoelétrico, o pH encontrado da proteína

separada. PM, peso molecular da proteína encontrada. “+” representa a presença do spot

proteico no grupo, enquanto que “–” é a ausência e “++” é a maior expressão da proteína no

grupo.

Nº do spot Match

ID pI PM

Diferença em

Vezes Controle Infectado

ANOVA

(valor de p)

1 224 5,70 45738 2,86362 + ++ 0,00011383

2 318 6,97 67299 2,26962 + ++ 0,0113139

3 482 7,16 67299

– + 0,00067245

4 484 6,97 70341 – + 0,00423055

43

Figura 7 - Gel bidimensional de proteínas totais de células HepG2 infectadas com o

vírus da Febre Amarela, cepa selvagem Be H111, e corado com solução coloidal de

Coomassie. Os spots identificados com o número 1 e 2 foram expressamente diferenciais

e os spots 3 e 4 diferenciais. Os valores de pH e peso molecular dos spots estão na Tabela

2.

44

Figura 8 - Gel bidimensional de proteínas totais de células HepG2 do grupo controle

corado com solução coloidal de Coomassie. Os spots identificados com o número 1 e 2

foram os expressamente diferenciais. Os valores de pH e peso molecular dos spots estão na

Tabela 2.

45

Figura 9 - Representação tridimensional do spot número 1, match ID 224. Do lado

esquerdo estão os géis do grupo controle, na direita os infectados. A linha verde faz a

marcação do spot selecionado, a vermelha são outros spots detectados.

Grupo Controle Grupo Infectado

46



marcação do spot selecionado, a vermelha são outros spots detectados


47



marcação do spot selecionado apenas no grupo infectado devido à ausência deste spot no

grupo controle, e a vermelha são outros spots detectados.


48



marcação do spot selecionado apenas no grupo infectado devido à ausência deste spot no

grupo controle, e a vermelha são outros spots detectados.


49

5 DISCUSSÃO

5.1 TÍTULO VIRAL, EFEITO CITOPÁTICO E TESTE DE VIABILIDADE CELULAR

A caracterização da infecção viral realizada com MOI 0,01 para um

acompanhamento lento e progressivo da infecção viral mostrou resultados satisfatórios com

a progressão evidente e bem definida. Marianneau et al. (1998) demonstraram em apenas

algumas células HepG2 infectadas o aparecimento de ECP e apoptose no 3º dpi, o que é

visualizado também nos resultados deste trabalho, onde há pouco aparecimento de ECP que

é visualizado pelo teste de viabilidade celular (provável apoptose) com uma queda de 14%,

o que não foi significante estatisticamente, no 3º dpi. Esta semelhança foi encontrada apesar

dos MOIs diferentes utilizados, pois Marianneau et al.(1998) utilizaram MOIs de 1, 10 e 20,

e neste trabalho o único MOI utilizado foi o de 0,01, o que sugere um padrão

comportamental da replicação viral na indução de apoptose celular.

A técnica para titulação viral sem SBF de Malewicz & Jenkin (1979) utilizada para

titulação do Vírus da Dengue, foi adaptada para células VERO (CCL-81) e apresentou

formação nítida de placas, apesar de não produzirem resultados antes de 7 dias de incubação

como descrito pelos autores. Os títulos virais obtidos com o MOI de 0,01 se apresentaram

diferentes dos alcançados por Mariannaeu et al. (1998), devido as diferenças de MOIs e

talvez ao método de titulação. O maior título viral visto foi de 9 x 105 pfu/mL com MOI 20

após 2 dpi em um método utilizando células AP61 (Mariannaeu et al., 1998), enquanto que

neste trabalho no mesmo dpi o título foi de 1 x 105 pfu/mL (Figura 3) utilizando células

VERO.


Rachas et al. (2014) reafirmam a necessidade de métodos de diagnósticos precoces

para respostas de controle mais rápidas durante a ocorrência de possíveis surtos de FA. Já no

relato de Okamoto et al. (2010), a detecção e os esforços de diagnóstico de patógenos

tipicamente utilizam de métodos de identificação patógeno-específica que são baseados em

técnicas imunológicas ou de amplificação de genes, o que também é visualizado na grande

área da arbovirologia, tanto no campo da pesquisa científica quanto em vigilância (Lanciotti,

2003; Parida et al., 2004, 2005, 2006, 2007; Peyrefitte et al., 2008; Toriniwa & Komiya,

2006) incluindo estudos específicos com o VFA (Drosten et al., 2002; Bae et al., 2003;

Weidmann et al. 2010; Nunes et al., 2011; Dash et al., 2012; Domingo et al., 2012; Kwallah

et al., 2013; Escadafal et al., 2014).

50

Desta forma, as ferramentas proteômicas são uma nova metodologia para a detecção

de componentes das interações proteicas tanto quanto dos processos fisiopatológicos que

ocorrem durante a infecção viral (Maxwell & Frappier, 2007; Zheng et al., 2008). A

ausência de estudos proteômicos com o VFA aumenta a importância dos resultados deste

trabalho, e dificulta a comparação dos seus achados. No presente estudo foram visualizados

4 spots proteicos diferenciais, sendo que em outros estudos com diferentes vírus conseguiu-

se identificar através do mesmo método de separação por gel de eletroforese bidimensional

(2-DE) (O’Farrell, 1975) de 17 a 102 spots diferenciais (Tabela 3). Estas diferenças podem

ser explicadas devido aos vírus estudados, células utilizadas como hospedeiras, tipo de

extração das proteínas, tratamento e manipulação da amostra, tamanho e intervalo de pH das

strips e aos métodos de detecção de spots proteicos.

De fato, diferentes vírus infectam diferentes tipos celulares devido as afinidades de

interações entre receptores celulares e proteínas virais, além de induzirem diferentes padrões

proteicos como resposta à infecção. Quanto ao processo de extração de proteínas celulares,

foi observado que diferentes tratamentos (uso de ultrassonicador ou congelamento rápido) e

tampões utilizados para lisar as células e solubilizar as proteínas, geram diferentes

quantidades de proteínas disponíveis na amostra, afetando também os padrões apresentados,

como visto durante as experimentações de padronização deste trabalho (dados não

mostrados). Sobre os tratamentos e manipulação da amostra, há diferentes protocolos

caseiros de precipitação (Englard & Seifter, 1990) e kits comerciais disponíveis para a

eliminação de impurezas e interferentes (excesso de sais, material genético e lipídeos) das

amostras, estes prometem melhorar a focalização isoelétrica das proteínas, mas podem

ocasionar perdas proteicas durante a sua aplicação.

O tamanho e intervalo de pH da strip trazem o melhoramento da resolução dos spots

proteicos separados na segunda dimensão, quanto maior o tamanho da strip e menor seu

intervalo de pH mais separados os spots ficarão entre si, evitando sobreposições de pontos

isoelétricos das proteínas devido a maior cobertura de faixa de pH alcançada. Na tabela 3 se

torna evidente que quanto maior o tamanho da strip maior a quantidade de spots detectados

maior o número de spots diferenciais detectados. Os estudos que utilizaram géis com

tamanho igual ou superior a 17 cm (Sun et al., 2008; Zheng et al., 2008; Zhang et al., 2009)

obtiveram detecção superior a 1300 spots por gel e os maiores números de spots diferenciais

detectados. Porém, os métodos de detecção tem grande importância para a revelação dos

spots proteicos, como visto na detecção de até 200 spots a mais (Pattanakitsakul et al., 2007)

em comparação com os resultados obtidos neste trabalho.

51

Tabela 3 – Síntese dos resultados encontrados em trabalhos utilizando o método 2-DE comparativo em infecções experimentais com diferentes vírus.

Referência Vírus

família:gênero

Célula

hospedeira

Tamanho

da strip

Faixa

de pH Método de detecção

Spots totais

detectados

Spots

diferenciais

Spots

identificados

Horas pós infecção

analisadas

Alfonso et al., 2004 Vírus da Peste Suína Africana

Asfarviridae

Vero

(CCL-81)

17 cm

3-10

Prata compatível com

EM

não relata

90

68 10 e 24

Pattanakitsakul et al., 2007

Vírus Dengue sorotipo2

Flaviviridae:Flavivirus

HepG2

7 cm

3-10

NL

SYPRO Ruby

até 800

17

17 24

Sun et al., 2008

Vírus Clássico da Peste Suína

Flaviviridae:Pestivirus

PK-15

17 cm

3-10

Prata/Coomassie G250

mais de 1300

35

21 48

Zheng et al., 2008

Vírus da Doença de Gumboro

Birnaviridae

Fibroblasto

de embrião

de galinha

24 cm

5-8

Prata compatível com

EM

1400-1650

102

81

12, 48 e

96

Zhang et al., 2009

Circovírus Suíno tipo 2 Circoviridae

PK-15

24 cm

5-8 L

Prata compatível com EM

1450-1600

61

37 12, 48 e 96

Presente estudo

Vírus da Febre Amarela

Flaviviridae:Flavivirus

HepG2

7 cm

3-11

NL

Coomassie G250

521-612

4

0 72 e 96

cm centímetros;

EM Espectrometria de massas;

NL Não linear;

L Linear;

52

O que se espera das técnicas de detecção de spots proteicos é que: sejam sensíveis

suficientes para poucas cópias de proteínas; permitam análises quantitativas; tenham grande

linearidade; tenham um grande alcance dinâmico; sejam compatíveis com EM; não sejam

tóxicos; que causem baixo impacto ambiental; e de custo acessível. Mas infelizmente

nenhuma das técnicas disponíveis possui todas estas características juntas (Westermeier &

Naven, 2002).

As colorações com Coomassie ganharam a popularidade devido a seu baixo custo,

praticidade de uso e ótima compatibilidade com os métodos de caracterização proteica como

através da EM, apesar das limitações de pouca sensibilidade e alcance dinâmico. Porém, a

sensibilidade varia para os diferentes tipos de coloração por Coomassie (Neuhoff et al.,1988).

O Coomassie coloidal tem uma sensibilidade de 8-10 ng de proteínas enquanto que nos outros

tipos desta coloração a sensibilidade é de 30-100 ng de proteínas (Patton, 2002).

A coloração por prata tem maior sensibilidade, chegando a 0,5 ng de proteínas

(Heukeshoven & Dernick, 1985), mas tem um alcance dinâmico inferior ao do Coomassie,

além de ser um tanto complexo, com vários passos e processos que devem ser parados em

tempo arbitrário para evitar o excesso de reações, e a modificação da técnica para utilização

compatível com a EM diminui a sua sensibilidade (Patton, 2002).

Existem alguns corantes fluorescentes disponíveis, eles possuem um grande alcance

dinâmico e por isso tem boa empregabilidade para quantificação de proteínas (Westermeier &

Naven, 2002). A literatura relata que o SYPRO Ruby apresenta melhor sensibilidade que as

colorações por prata (Lopez et al., 2000; Berggren et al., 2000). Além disto, o SYPRO Ruby é

um método de coloração de fácil aplicação (Patton, 2002) e tem melhor reprodutibilidade na

quantificação de proteínas de baixa intensidade nos géis de 2-DE e geram grande

convergência da sequência aminoacídica na identificação através do perfilamento de massas

dos pepitídeos destas proteínas (Lopez et al., 2000), demonstrando assim que este corante é

superior a coloração por prata para aplicações em proteômica (Patton, 2002).

Hoving et al. (2000) relataram as vantagens da utilização de géis com ultrazoom

(vários géis com diferentes faixas reduzidas de pH das strips para caracterização de uma

amostra) para o aumento da resolução dos padrões proteicos apresentados em géis 2-DE

ressaltando também as desvantagens no aumento da quantidade de géis e de amostras

utilizados, dando importância aos métodos de detecção e descrevendo o SYPRO Ruby como o

possível melhor corante para uso em estudos proteômicos.

A 2-DE é uma técnica poderosa que oferece, por uma perspectiva, alta eficiência para

separação de misturas proteicas complexas, mas, em contrapartida, é caracterizado por sua

53

baixa reprodutibilidade (Robotti et al., 2011) devido as variações de gel para gel, como a

localização dos spots e o baixo alcance dinâmico das técnicas de coloração normalmente

utilizadas (Ye et al., 2010). É provável que estas variações intrínsecas de gel para gel

mascaram as diferenças biológicas entre as amostras e comprometem as comparações

qualitativas em nível de expressão de proteínas. Estas variações parecem surgir da absorção

problemática das proteínas pelas strips de focalização isoelétrica, transferência incompleta de

proteínas da primeira para a segunda dimensão e locais não homogênios na composição do

gel, campo de força ou gradiente de pH (Bergh & Arckens, 2004). Estas limitações podem ser

superadas quando deixado de lado o clichê ‘um gel, uma amostra’, e for implementado uma

abordagem multiplex, utilizando um único gel para separação de múltiplas amostras de

proteínas, seguido pela visualização independente destas amostras, como acontece na técnica

de gel de eletroforese bidimensional diferencial (2D-DIGE) (Bergh & Arckens, 2004; Ye et

al., 2010).

No estudo de Ye et al. (2010), onde o foco era a identificação de proteínas virais do

Vírus Vaccinia, a técnica de 2D-DIGE mostrou ter maior sensibilidade, reprodutibilidade e

eficiência que o 2-DE comparativo, apresentando 5 proteínas virais por 2D-DIGE e apenas 1

proteína viral utilizando o 2-DE; observou-se também mais proteínas diferenciais, mas como

o estudo tinha foco específico as outras proteínas não foram relatadas.

Nos estudos com vírus da família Flaviviridae, empregando a técnica 2D-DIGE,

Pastorino et al. (2009) utilizaram strips de 18 cm em combinação com dois espectros de pH

diferentes e conseguiram fazer o match de 1950 spots proteicos na faixa de pH 4-7 e 1674 na

faixa de pH 6-11, alcançando a quantidade de 127 spots diferenciais, dos quais 93 foram

completamente identificados para elucidar a infecção do VNO em células VERO. Enquanto

que Li et al. (2010), utilizando strips de um única faixa de pH (3-10) com tamanho de 24 cm

conseguiu um total de aproximadamente 1400 spots proteicos, sendo 15 diferenciais e 8

proteínas completamente caracterizadas durante a infecção de cultura de células endoteliais

primárias de suíno infectadas experimentalmente pelo Vírus clássico da Peste Suína. Em

comparação com o estudo de Li et al., (2010) a diferença na quantidade de spots detectados é

de quase três vezes menor nos resultados obtidos no presente estudo, esta diferença

acompanha a mesma proporção em relação ao número de spots diferenciais, mostrando certa

linearidade dos achados. Comparando com as observações de Pastorino et al., (2009), a

diferença é muito maior devido a utilização de menores faixas de pH em géis de grandes

dimensões, demonstrando novamente que o emprego destes materiais amplia o número de

resultados para análises proteômicas mais profundas.

54

Os resultados adquiridos com a técnica utilizada mostraram novas informações quanto

às alterações no perfil proteico e biologia da célula hospedeira induzidas pela infecção do

VFA. Contudo o emprego de outras técnicas (tanto de detecção de spots como também a

utilização de géis de ultrazoom) podem aumentar a quantidade e relevância destas

informações. Desta forma, é importante enfatizar que diferentes técnicas utilizadas em estudos

proteômicos, detectam diferentemente as proteínas (Westermeier & Naven, 2002), como

exemplo, a coloração por prata que normalmente produz padrões diferentes dos padrões

adquiridos com Coomassie e outros procedimentos de coloração como com SYPRO Ruby

(Görg et al., 2000). Logo, os resultados obtidos no presente trabalho sugerem a necessidade

de maiores explorações nesta temática, ampliando os conhecimentos sobre o VFA e também

trazem novas perspectivas para o aprofundamento nos estudos de biomarcadores celulares

para diagnóstico e tratamento da FA.

55

6 CONCLUSÕES

Observou-se efeito citopático induzido pelo VFA no 4º dpi, identificado pela

microscopia óptica e quantificado através do teste de viabilidade celular.

A cinética viral adquirida com MOI de 0,01 apresentou o maior título no 5º dpi,

apresentando discreta variação de valores a partir do 3º dpi.

O melhor período para análise das alterações no proteoma celular foi o 3º dpi, no

entanto, em comparação ao grupo controle não foram observadas diferenças de expressão

proteica pela técnica de coloração com Coomassie coloidal.

O período do 4º dpi, apresentou 4 spots diferenciais pela técnica de coloração com

Coomassie coloidal;

56

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ANEXO

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ BIOLOGIA DE AGENTES ... · universidade federal do parÁ instituto de ciÊncias biolÓgicas programa de pÓs – graduaÇÃo em biologia de agentes infecciosos