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UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA – UNIR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL – PGBIOEXP
RAFAELA DINIZ SOUSA
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FUNCIONAL DE UMA FOSFOLIPASE A2
HOMÓLOGA E PEPTÍDEOS SINTÉTICOS DO VENENO DE Lachesis muta muta
COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
Porto Velho, RO
2018
RAFAELA DINIZ SOUSA
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E FUNCIONAL DE UMA FOSFOLIPASE A2
HOMÓLOGA E PEPTÍDEOS SINTÉTICOS DO VENENO DE Lachesis muta muta
COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental da Universidade Federal de
Rondônia - UNIR, para obtenção do título de Doutora.
Orientador: Dr. Andreimar Martins Soares
Porto Velho, RO
2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Fundação Universidade Federal de Rondônia
Gerada automaticamente mediante informações fornecidas pelo(a) autor(a)
Sousa, Rafaela Diniz.
Caracterização bioquímica e funcional de uma fosfolipase A2 homóloga epeptídeos sintéticos do veneno de Lachesis muta muta com atividadeantibacteriana / Rafaela Diniz Sousa. -- Porto Velho, RO, 2017.
91 f. : il.
1. Serpentes - Veneno. 2. Lachesis muta muta. 3. Fosfolipase A2homóloga. 4. Peptídeos sintéticos. 5. Atividade antibacteriana. I. Soares,Andreimar Martins. II. Título.
Orientador(a): Prof. Dr. Andreimar Martins Soares
Tese (Doutorado em Biologia Experimental) - Fundação UniversidadeFederal de Rondônia
S725c
CDU 577.1
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Caracterização Bioquímica e Funcional de uma Fosfolipase A2 Homóloga e
Peptídeos Sintéticos do Veneno de Lachesis muta muta com Atividade
Antibacteriana
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental da
Universidade Federal de Rondônia – UNIR, para obtenção do título de Doutora.
Defesa Pública realizada em 24 de fevereiro de 2017
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. Dr. ANDREIMAR MARTINS SOARES
(Presidente – Orientador – Fiocruz Rondônia)
____________________________________________
Prof. Dr. CÉSAR LUIZ GUIMARÃES
Membro Titular Externo – IBAMA
____________________________________________
Prof. Dr. JOSÉ LUIS LÓPEZ LOZANO
Membro Titular Externo – Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
_____________________________________________
Prof. Dr. GABRIEL EDUARDO MELIM FERREIRA
Membro Titular Interno – UNIR/ FIOCRUZ-RO
_____________________________________________
Profª. Dra. JULIANA PAVAN ZULIANI
Membro Titular Interno – UNIR/ FIOCRUZ-RO
À minha mãe, Maria Luele, a quem amo infinitamente.
Agradecimentos
Ao meu orientador Dr. Andreimar Martins Soares por estar sempre presente, mesmo
quando ausente. Sua superação, persistência e conhecimento é um exemplo para
todos nós. Obrigada pela confiança depositada em mim.
Ao Dr. Leonardo de Azevedo Calderon por me conceder a oportunidade de fazer
parte do grupo CEBio. Obrigada pelos esforços em submeter projetos, correr atrás
de verbas, se preocupar em manter o laboratório e a nós. Somos frutos de tudo
isso.
Ao Kayano. Existem pessoas que simplesmente amamos, que nos ensinam a olhar o
mundo de diferentes ângulos; a buscar novos horizontes; a querer ser melhores.
E você é uma delas. Obrigada por tudo, pela amizade, conversas, conselhos.
#amokayano
A Cleópatra pela amizade de cada dia. Não temos os mesmos sonhos, nem
compartilhamos as mesmas vontades de explorar o mundo, mas fomos unidas pela
vida. Ainda bem. Obrigada pelo companheirismo, pelas conversas, pelo amor que
não cresce (risos). Te amo!
A Cláudia, por ser boa demais (risos). Sua maneira única de ajudar a todos, nos
ensina o quanto precisamos aprender a estar mais perto do outro. Obrigada por
ouvir meus desabafos “realistas demais”; você é maravilhosa. Te amo!
A Tainara, nossa pupila, que está sempre disposta a ajudar e a aprender. Você é
uma companheira e tanto. Obrigada pelos abraços espontâneos, pelos sorrisos
exagerados e verdadeiros, pelas conversas demoradas, pelos gestos de amar sem
medidas. Te amo, princesa.
Aos demais colegas de laboratório, meu muito obrigada!
A Dra. Najla por estar sempre de braços abertos para nos acolher no laboratório
de Microbiologia. Ao seu lado, nos sentimos acolhidos. Obrigada!
A todos os integrantes do laboratório de Microbiologia, meu muito obrigada!
A Amália pela disposição em ajudar a todos. Obrigada pela contagem de células,
pipetagens, C2C12.
A Dra. Carolina pelo carisma, acolhimento e sugestões. A simplicidade com que
nos trata faz a gente voltar mais vezes (risos). Obrigada!
Aos meus pais Maria Luele e José Raimundo. Vocês são meus tesouros mais
preciosos, meu aconchego, meu porto seguro. Sem o apoio de vocês não teria
chegado tão longe. Essa vitória é nossa. Te amo, mãe; Te amo, pai.
Ao meu irmão Rodrigo pelas conversas, apoio e amizade. Obrigada pelo amor, pela
confiança, pela vontade de crescer juntos. Te amo.
Ao Dênis por acreditar em mim, mesmo quando eu não acreditava. Crescemos juntos,
amadurecemos. Fizemos planos; desistimos deles. Corremos atrás do que era
possível; conquistamos. Fim? Só o começo. Te amo.(Agora casados 😊)
A todos aqueles que passaram por minha vida e deixaram um pouco do que eram em
mim.
Aquele que conheci menina, mas que me conhecia bem antes de eu pronunciar as
primeiras palavras. Você me chamou e eu ouvi seu chamado. “A alegria do Senhor
é minha força, a alegria do Senhor é minha força, a alegria do Senhor me
alcançou” (Colo de Deus). #serdeDEUS
Ao CNPq, FIOCRUZ-RO, CAPES e FINEP por financiarem esta pesquisa e proporcionarem
minha formação profissional.
“Nenhum problema pode ser
resolvido pelo mesmo grau de
consciência que o gerou”.
Albert Einstein
i
RESUMO
Sousa, Rafaela Diniz. Caracterização bioquímica e funcional de uma Fosfolipase A2 homóloga e peptídeos sintéticos do veneno de Lachesis muta muta com atividade antibacteriana.
A luta pela sobrevivência em ambientes hostis selecionou, ao longo da evolução,
organismos ou populações inteiras que conseguiram desenvolver ferramentas úteis de
adaptação, como venenos, toxinas ou repelentes. Dentre estes, os venenos de serpentes
se destacaram por suas atividades biológicas frente a vários patógenos, como bactérias,
fungos e protozoários, mostrando-se fontes inestimáveis de novos agentes
antimicrobianos. O objetivo desse estudo foi isolar e caracterizar bioquímica e
funcionalmente fosfolipases A2 (PLA2) e peptídeos sintéticos do veneno da serpente
Lachesis muta muta (VLmm) com possíveis atividades antimicrobianas. O VLmm foi
fracionado em duas etapas cromatográficas. Na primeira, realizada em resina de
exclusão molecular (Sephacryl S200), foram obtidas 4 frações, denominadas LmS-1 a
LmS-4. Após eletroforese e avaliação da atividade fosfolipásica, observou-se que LmS-3
e LmS-4 apresentavam massas moleculares compatíveis com PLA2s, contudo
mostraram-se desprovidas de atividades enzimáticas sobre o substrato ácido 4-nitro-3-
octanoiloxi benzoico. Na segunda etapa, a fração LmS-3 foi cromatografada em coluna
de fase reversa (C18), com a obtenção de 6 frações (P1 a P6), onde P6 continha uma
proteína com características compatíveis com as de interesse. A determinação da massa
molecular de P6 foi realizada por Espectrometria de Massa, onde se observou uma
molécula com 13889 Da. A estrutura primária, determinada por Degradação de Edman e
complementada por espectrometria de massa, evidenciou elevada identidade com PLA2s
homólogas dos venenos de serpentes do gênero Bothrops. A proteína foi então nomeada
LmutTX. Peptídeos sintéticos desenhados a partir da sequência primária de LmutTX
(regiões N-terminal, segmento 41-52 e C-terminal) foram avaliados quanto às suas
atividades citotóxicas e antimicrobianas, juntamente com a proteína íntegra. Na
citotoxicidade sobre células musculares C2C12 diferenciadas em miotubos, o VLmm e
LmutTX diminuíram a viabilidade celular em mais de 50% nas concentrações de 5 e 40
µg/poço, respectivamente, enquanto os peptídeos apresentaram baixo efeito citotóxico,
não atingindo mais de 30% de dano na maior concentração testada (125 µg/poço).
Nenhum dos peptídeos foram hemolíticos quando incubados em suspensões de
eritrócitos. A avaliação do potencial antimicrobiano de LmutTX foi realizada em diferentes
parasitas, como Trypanosoma cruzi clone CL-B5, Leishmania infantum
MCAN/ES/92/BCN83 e Plasmodium falciparum cloroquina-resistente (W2), e bactérias,
como Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus resistente a meticilina (MRSA),
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e
Escherichia coli ATCC 25922. A toxina não mostrou atividade sobre T. cruzi e L. infantum
na concentração testada de 100 µg/mL, mas apresentou um IC50 de 105 µg/mL sobre P.
ii
falciparum. No ensaio de antibiofilme, LmutTX inibiu mais de 50% da formação de biofilme
das cepas de S. aureus ATCC 25904 e S. epidermidis ATCC 35984 (100 µg/mL). A
atividade de LmutTX sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas na concentração
de 12,5 µg/mL foi suficiente para inibir ~60% do crescimento bacteriano nos períodos de
24 e 48 horas, exceto para E. coli que não foi inibida pela toxina. Peptídeos sintéticos de
LmutTX foram avaliados sobre cepas de S. aureus, MRSA e P. aeruginosa, onde
mostraram atividades relevantes para as duas últimas cepas. Um dos peptídeos
derivados da região C-terminal foi capaz de inibir completamente o crescimento de MRSA
na concentração de 15,6 µg/mL, demonstrando o grande potencial de peptídeos
sintéticos derivados de proteínas. Este trabalho descreve pela primeira vez, o isolamento
e a caracterização de uma PLA2 homóloga do veneno de L. m. muta com potencial
antibacteriano sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas, bem como a
identificação da região da molécula responsável por tal atividade.
PALAVRAS-CHAVE: Veneno de serpentes, Lachesis muta muta, Fosfolipase A2 homóloga, Peptídeos sintéticos, Atividade antimicrobiana.
iii
ABSTRACT
Sousa, Rafaela Diniz. Biochemical and functional characterization of a homologue Phospholipase A2 and synthetic peptides of the Lachesis muta muta venom with antibacterial activity.
The struggle for survival in hostile environments has, throughout evolution, selected
organisms or entire populations that have been able to develop useful tools for adaptation,
such as venoms, toxins, or repellents. Among these, snake venoms stand out for their
biological activities against several pathogens, such as bacteria, fungi and protozoa,
proving to be invaluable sources of new antimicrobial agents. This study aimed to isolate
and to characterize biochemically and functionally phospholipases A2 (PLA2) and
synthetic peptides of the Lachesis muta muta venom (VLmm) searching for antimicrobial
activities. The VLmm was fractionated through two chromatographic steps. The first,
carried out in molecular exclusion resin (Sephacryl S200), were obtained 4 fractions,
named LmS-1 to LmS-4, respectively. After electrophoresis and phospholipase activity
evaluation, it was observed that LmS-3 and LmS-4 showed molecular weights compatible
with snake venom phospholipase A2, however, was lacking enzymatic activities on the
substrate 4-nitro-3-octanoyloxy benzoic acid. In the second chromatographic step, the
LmS-3 fraction was applied on a reverse phase column (C18), obtaining 6 fractions (P1
to P6), in which P6 contained a protein with compatible characteristics with those of
interest. Molecular weight evaluation of P6 was performed by MALDI-TOF Mass
Spectrometry, where a 13889 Da molecule was observed. The primary structure,
determined applying the Edman Degradation method associated with spectrometric
methods, showed high identity with PLA2 of Bothrops snake venoms. The protein was
then named LmutTX. Synthetic peptides designed from LmutTX amino acid sequence (N-
terminal, segment 41-52 and C-terminal regions) as well native protein were evaluated for
their cytotoxic and antimicrobial activities. Cytotoxicity on C2C12 muscle cells
differentiated in myotubes, VLmm and LmutTX decreased the cell viability by above than
50% at concentrations of 5 and 40 μg/well, respectively, whereas the peptides showed
low cytotoxic effect, reaching no more than 30% of damage at the highest concentration
tested (125 μg/well). None of the peptides were hemolytic when incubated in erythrocyte
suspensions. The evaluation of the antimicrobial potential of LmutTX was performed in
different parasites such as Trypanosoma cruzi clone CL-B5, Leishmania infantum MCAN
/ ES / 92 / BCN83 and chloroquine-resistant Plasmodium falciparum (W2), and bacteria
such as Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 and Escherichia coli ATCC 25922. The toxin
showed no activity on T. cruzi and L. infantum at the tested concentration of 100 μg / mL,
but had an IC50 105 μg/mL on P. falciparum. In the antibiofilm assay, LmutTX inhibited
more than 50% of the biofilm formation of the strains of S. aureus ATCC 25904 and S.
epidermidis ATCC 35984 (100 μg/mL). The activity of LmutTX on gram-positive and gram-
iv
negative bacteria at the concentration of 12.5 μg/mL was sufficient to inhibit ~60% of
bacterial growth in the periods of 24 and 48 hours, except for E. coli that was not inhibited
by toxin. The synthetic peptides of LmutTX were tested against S. aureus, MRSA and P.
aeruginosa, where they showed relevant activities against the two last tested strains. One
of these peptides designed based on the C-terminal region could entirely inhibit the growth
of MRSA at concentration of 15.6 μg/mL, demonstrating the great potential of synthetic
peptides derived from proteins. This work describes, for the first time, the isolation and
characterization of a PLA2 homologous to the L. m. muta with antibacterial potential on
gram-positive and gram-negative bacteria, as well as the identification of the region of the
molecule responsible for such activity.
Key Words: Snake venoms, Lachesis muta muta, Phospholipase A2 homologue,
Synthetic peptides, Antimicrobial activity.
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Potencial microbicida dos venenos animais....................................................17
Figura 2 – Potencial microbicidas das PLA2s dos venenos de serpentes.......................19
Figura 3 – Espécime de Lachesis muta em seu ambiente natural...................................20
Figura 4 – Estrutura terciária das PLA2s Asp49..............................................................27
Figura 5 – Fluxograma da metodologia utilizada nas etapas de isolamento e
caracterização..................................................................................................................33
Figura 6 – Fracionamento do VLmm e atividade fosfolipásica das frações obtidas na
cromatografia de exclusão molecular...............................................................................40
Figura 7 – Isolamento e caracterização de uma proteína do VLmm desprovida de
atividade catalítica............................................................................................................50
Figura 8 – Alinhamento múltiplo da sequência de LmutTX com toxinas de venenos
botrópicos.........................................................................................................................51
Figura 9 – Modelagem molecular por homologia de LmutTX.........................................54
Figura 10 – Citotoxicidade em células C2C12 diferenciadas em miotubos....................56
Figura 11 – Atividade de hemólise dos peptídeos derivados de LmutTX.......................58
Figura 12 – Atividade antibacteriana de LmutTX sobre diferentes bactérias nos períodos
de 24 e 48 horas..............................................................................................................59
Figura 13 – Atividade antibacteriana dos peptídeos derivados de LmutTX sobre cepas
gram-positivas e gram-negativas.....................................................................................60
Figura 14 – Avaliação da atividade antibiofilme de VLmm, frações e LmutTX ...............62
Figura 15 – Atividade antibacteriana de LmutTX sobre diferentes bactérias nos períodos
de 24 e 48 horas ..............................................................................................................63
Figura 16 – Atividade antimicrobiana dos peptídeos derivados de LmutTX sobre cepas
Gram-positivas e Gram-negativas nos períodos de 24 e 48 horas .................................65
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais componentes caracterizados nos venenos do gênero Lachesis ......23
Tabela 2 – Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos obtidos no sequenciamento de
LmutTX ..............................................................................................................................53
Tabela 3 – Resultados do IC50 do VLmm, frações e LmutTX contra cepa de P. falciparum
W2 .....................................................................................................................................61
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
VLmm – Veneno de Lachesis muta muta
LmutTX – Toxina isolada do veneno de Lachesis muta muta
PLA2 – Fosfolipase A2
PLA2 Lys49 – Fosfolipase A2 Lys49 ou homóloga
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de Poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
ANOVA – Análise de Variância
Tyr→Trp – Substituição do resíduo tirosina por triptofano
→ – Substituição de um resíduo de aminoácido por outro
MDoS – Sítio de docking na membrana
MDiS – Sítio hidrofóbico de desestabilização da membrana
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................................................i ABSTRACT ................................................................................................................iii LISTA DE FIGURAS....................................................................................................v LISTA DE TABELAS...................................................................................................vi LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................vii 1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................17
1.1. SERPENTES DO GÊNERO LACHESIS: DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA, ENVENENAMENTOS E BIOMOLÉCULAS ..................................................19
1.2. FOSFOLIPASES A2 (PLA2s) DE SERPENTES: PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, ESTRUTURAS E MECANISMO CATALÍTICO..........................26
1.3. PLA2s HOMÓLOGAS: ESTRUTURA, MECANISMO E IMPLICAÇÕES TERAPÊUTICAS...........................................................................................29
1.4. PEPTÍDEOS DERIVADOS DE PLA2s HOMÓLOGAS COMO POTENTES AGENTES ANTIMICROBIANOS...................................................................35
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................39 2.1. GERAL...........................................................................................................39 2.2. ESPECÍFICOS...............................................................................................39
3. METODOLOGIA .................................................................................................. 40 3.1. VENENO DE LACHESIS MUTA MUTA (VLmm)...........................................40 3.2. MAPA METODOLÓGICO........................................................................... ..40 3.3. ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS....................................................................41 3.4. DOSAGEM DE PROTEÍNAS.........................................................................41 3.5. ELETROFORESE MONODIMENSIONAL.....................................................41 3.6. ATIVIDADE FOSFOLIPÁSICA SOBRE 4N3OBA..........................................42 3.7. SEQUENCIAMENTO DA TOXINA DO VLmm...............................................42 3.8. PEPTÍDEOS SINTÉTICOS............................................................................43 3.9. MODELAGEM MOLECULAR........................................................................43 3.10. CITOTOXICIDADE SOBRE CÉLULAS MUSCULARES C2C12
DIFERENCIADAS EM MIOTUBOS.............................................................43 3.11. ATIVIDADE DE HEMÓLISE........................................................................44 3.12. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA EM DIFERENTES MICRORGANISMOS
PATOGÊNICOS..........................................................................................45 3.12.1. Parasitas.................................................................................................45 3.12.1.1. Ensaio sobre Trypanosoma cruzi........................................................ 45 3.12.1.2. Ensaio sobre Leishmania infantum.......................................................45 3.12.1.3. Ensaio sobre Plasmodium falciparum...................................................46 3.12.1.3.1. Cultivo contínuo de fase eritrocítica do parasita...............................46 3.12.1.3.2. Sincronização dos parasitas para utilização nos testes in vitro........46 3.12.1.3.3. Preparo das placas para os ensaios de quimioterapia......................47 3.12.1.3.4. Avaliação da at. antimalárica pelo método de Syber Green..............47 3.12.1.3.5. Determinação da concentração inibitória de 50% do crescimento do
parasita (IC50)................................................................................... 48 3.12.2. Ensaio de antibiofilme.............................................................................48 3.12.3. Ensaio sobre bactérias........................................................................... 49
4. RESULTADOS ......................................................................................................50 4.1. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE UMA PLA2
HOMÓLOGA DO VENENO DE LACHESIS MUTA MUTA (VLmm)..............50 4.1.1. Sequenciamento de LmutTX......................................................................52
4.1.2. Desenho e síntese de peptídeos oriundos da sequência de LmutTX.........55 4.1.3. Modelagem molecular de LmutTX .............................................................55 4.2. CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE LmutTX.............................................56 4.2.1. Citotoxicidade do VLmm, LmutTX e peptídeos sintéticos sobre células
C2C12 diferenciadas em miotubos.............................................................56 4.2.2. Atividade hemolítica dos peptídeos sintéticos de LmutTX..........................59 4.2.3. Atividade antiparasitária sobre diferentes protozoários de importância
médica........................................................................................................59 4.2.4. Atividade antibiofilme do VLmm, frações e LmutTX...................................61 4.2.5. Atividade antibacteriana de LmutTX e peptídeos sintéticos sobre diferentes
bactérias gram-positivas e gram-negativas................................................62 5. DISCUSSÃO .........................................................................................................68 6. CONCLUSÃO .......................................................................................................77 REFERÊNCIAS .........................................................................................................78
INTRODUÇÃO
17
1. INTRODUÇÃO
Diversos organismos desenvolveram ao longo da evolução ferramentas úteis de
defesa, alimentação e/ou reprodução, que os permitiram sobreviver nos ambientes mais
hostis. Com o conhecimento tradicional acerca de seu uso medicinal, suas
potencialidades tornaram-se objetos de muitas pesquisas científicas. Nos últimos anos,
intensificou-se a busca por novos agentes terapêuticos a partir de fontes naturais, como
microrganismos (ABBAS; SENTHILKUMAR; ARJUNAN, 2014), algas
(MOGHADAMTOUSI et al., 2014), plantas (VU et al., 2016), venenos de anuros
(LAMADRID-FERIS et al., 2015), escorpiões (BEA; PETRAGLIA; JOHNSON, 2015),
aranhas (BENLI; YIGIT, 2008), vespas (JALAEI et al., 2014), abelhas (LEANDRO et al.,
2015) e serpentes (ADADE et al., 2014; DOUMANOV et al., 2015), que constituíssem
uma importante alternativa de tratamento contra as inúmeras doenças infecciosas,
emergentes ou não, que afligem a sociedade. Dentre estas, os venenos de animais vêm
mostrando promissoras atividades microbicidas sobre diferentes patógenos, como
bactérias, fungos e protozoários (Figura 1).
Figura 1: Potencial dos venenos animais
A cor marrom representa as atividades biológicas descritas para venenos animais. Cada cor representa um tipo de veneno animal. Linhas completamente preenchidas: todas as atividades biológicas descritas em dado veneno; linhas inexistentes numa dada atividade: ainda não descrita para o animal em questão.
Antifúngico
Le
ishm
anic
ida
Tripanocida
Insetic
ida
Atividade
biológica
VENENOS:
ABELHAS
VESPAS
ARANHAS
ESCORPIÕES
ANUROS
SERPENTES
INTRODUÇÃO
18
Na figura 1, observa-se que todos os venenos animais listados apresentam
atividades antibacteriana, antifúngica, inseticida e antimalárica, porém diferem na
ausência de atividades sobre vírus e parasitos, como T. cruzi, Leishmania e Toxoplasma
e vírus da dengue, respectivamente. Os venenos de serpentes foram os que
apresentaram mais registros de atividades biológicas. A maioria das atividades descritas
para aranhas (AYROZA et al., 2012; CHOI et al., 2004; WINDLEY et al., 2012), abelhas
(ADADE et al., 2013; PARK et al., 2014), vespas (DAS NEVES et al., 2016; PRAJAPATI;
UPADHYAY, 2016; QUISTAD et al., 1994), escorpiões (HMED; SERRIA; MOUNIR, 2013;
MOERMAN et al., 2002; TARAZI, 2015) e anuros (BERGAOUI et al., 2013; BRAND et al.,
2013) deve-se principalmente à ação de peptídeos, encontrados em grandes quantidades
nesses venenos. Ao contrário das serpentes, que apresentam uma constituição proteica
de aproximadamente 80 a 90%, representadas por fosfolipases A2 (PLA2s), L-aminoácido
oxidases (LAAO), serino-proteases, metaloproteases, lectinas e desintegrinas
(CALVETE, 2013).
Dos componentes encontrados nos venenos de serpentes, as PLA2s
representam uma das principais classes de proteínas responsáveis por atividades
antiparasitárias, antibacterianas, antifúngicas e antivirais. A figura 2 mostra a variedade
de atividades descritas para as PLA2s numa diversidade de patógenos (ALMEIDA et al.,
2016; BORGES et al., 2016; CASTILLO et al., 2012; CECILIO et al., 2013; MULLER et
al., 2012; PERUMAL SAMY et al., 2007; SAMY et al., 2015). Por isso, estas proteínas
são intensamente estudadas em relação as suas implicações terapêuticas.
INTRODUÇÃO
19
Figura 2: Potencial microbicida das PLA2s dos venenos de serpentes
As PLA2s com atividades microbicidas estão representadas por diferentes cores, em relação ao tipo de atividade exposta. Toxinas: BnuTX-I (Bothrops neuwiedi urutu); NN-XIb-PLA2 (Naja naja); CB-PLA2 (Crotalus adamateus); CoaTx-II (Crotalus oreganus abyssus); MTX-I/ II (B. brazili); VipTx-II (Daboia russelli russelli); BlK-PLA2/ BlD-PLA2 (B. leucurus); CB-PLA2 (C. d. terrificus); Fração V-Asp49/ Fração VI-Lys49 (B. asper); BnSP-7 (B. pauloensis) (BORGES et al., 2016); PLA2-Cdt (C. d. terrificus); MjTX-II (B. moojeni). Patógenos: Vírus Dengue: DENV (sorotipos 1, 2 e 3); Vírus da febre amarela: YFV; Leishmania: L.; Staphylococcus aureus: S. aureus; Escherichia coli: E. coli; Klebsiella pneumoniae: K. pneumoniae; Salmonella paratyphi: S. paratyphi; Enterobacter aerogenes: E. aerogenes; Pseudomonas aeruginosa: P. aeruginosa. Autoria: Rafaela Diniz Sousa
A utilização de fontes naturais de biomoléculas pouco exploradas (como os
venenos de serpentes do gênero Lachesis) é propícia à caracterização de agentes
bioativos até o momento não descritos na literatura.
1.1. Serpentes do gênero Lachesis: distribuição geográfica, envenenamento e
biomoléculas
As serpentes pertencentes ao gênero Lachesis são amplamente distribuídas em
áreas florestais tropicais da América Central e do Sul. Esse gênero está dividido em
quatro espécies e duas subespécies: L. stenophrys (Costa Rica e Panamá), L.
melanocephala (Costa Rica), L. acrochorda (Panamá, Colômbia e Equador), L. muta
muta (Florestas Equatoriais da Venezuela, Colômbia, Trindade, Guiana, Suriname,
PLA2s AntiparasitárioAntibacteriano
Antifúngico
Antiviral
MTX-I/ MTX-II
Candida albicans
CB-PLA2
DENV-1DENV-3
DENV-2
YFVBlK-PLA2/ BlD-PLA2
E. coli
S. aureus
E. coli
E. aerogenes
Burkholderia
pseudomallei
Proteus vulgaris
Bacillus subtilis
K. pneunomiae
S. paratyphi
CoaTx-II
VipTx-II
MTX-I/ MTX-II
CB-PLA2
NN-Xib-PLA2
BnuTX-I
S. aureus
S. aureusP. aeruginosa
P. aeruginosa BnSP-7
MjTX-II
Toxoplasma gondii
Plasmodium falciparum
Schistosoma mansoni
Fração V/ VI
L. amazonensis
L. braziliensis L. major
L. donovani
L. Infantum chagasiPLA2-Cdt
INTRODUÇÃO
20
Guiana Francesa, Brasil, Equador, Peru e Bolívia) e L. m. rhombeata (Mata Atlântica,
Brasil). L. muta, também conhecida como surucucu pico-de-jaca, é a maior serpente
venenosa das Américas, podendo atingir 2-3 metros de comprimento quando adultas, por
habitarem áreas remotas de florestas, essas serpentes são difíceis de serem encontradas
e/ou mantidas em cativeiro, tendo poucos trabalhos descritos devido à dificuldade em
obtenção de seu veneno (Figura 3) (SANZ et al., 2008; TANUS JORGE et al., 1997;
ZAMUDIO; GREENE, 1997).
Essa serpente apresenta comportamento pouco agressivo, sendo relatados
escassos casos de envenenamento; indígenas que caçam em seu habitat raramente são
mordidos por estas serpentes. Seu veneno apresenta baixa toxicidade em relação a
outros venenos de viperídeos, contudo a quantidade de veneno inoculado durante a
picada (168-552 mg), torna esses acidentes graves e com altos índices de sequelas
permanentes e mortalidade (OLIVEIRA et al., 2002; SÁNCHEZ et al., 1992; TANUS-
JORGE et al., 1997).
Figura 3: Espécime de Lachesis muta em seu ambiente natural
Foto: Paulo Bernarde
O sintoma do envenenamento causado por Lachesis é similar ao observado
naqueles associados ao gênero Bothrops, caracterizado por dor local, edema,
hemorragia e mionecrose, porém efeitos neurotóxicos (comuns ao gênero Crotalus)
também são relatados (DAMICO et al., 2005a). Há manifestações sistêmicas
INTRODUÇÃO
21
consideradas próprias de envenenamentos laquéticos, como a síndrome vagal
caracterizada por sudorese profusa, cólica abdominal, náusea, vômito, diarreia aquosa,
bradicardia, sonolência e lapsos de consciência, que pode persistir por dias, mesmo após
a administração de antivenenos (DE LIMA; JUNIOR, 2015; PLA et al., 2013; TANUS
JORGE et al., 1997).
O arsenal bioquímico desses venenos é constituído por proteínas e peptídeos,
com proporções diversas, dependendo da idade do animal e das condições ambientais
que se encontram, incluindo serino-proteases, metaloproteases, lectinas tipo C, L-
aminoácido oxidases (LAAO), fosfolipases A2 (PLA2) e B (PLB), hialuronidases, peptídeos
potenciadores de bradicinina (BPP) e peptídeos natriuréticos tipo C (CNP) (BREGGE-
SILVA et al., 2012; DAMICO et al., 2005b; DE ASSIS et al., 2008; MAGALHAES et al.,
2003; SÁNCHEZ et al., 1991; SOARES et al., 2005; WIEZEL et al., 2015). Análises
proteômicas do veneno de L. muta e L. stenophrys, evidenciaram que estas serpentes
apresentam concentrações significativas de peptídeos vasoativos (BPP/ CNP – 15% do
peso seco) e compartilham similaridades entre suas proteínas, porém diferem
drasticamente na expressão de PLA2 (SANZ et al., 2008). Ao comparar os venenos de 5
espécimes de L. muta da Bolívia e do Peru e 1 veneno comprado da Sigma Chem. Co.
(USA), os autores evidenciaram uma grande variabilidade intraespecífica na expressão
de PLA2s, sugerindo uma evolução rápida dessas toxinas em processo de adaptação aos
novos nichos. A análise proteômica da peçonha de outras espécies (L. melanocephala,
L. acrochorda e L. m. rhombeata) também mostraram uma alta semelhança entre si,
contudo divergem na expressão de determinadas proteínas, como serino-proteases e
metaloproteases (MADRIGAL et al., 2012; PLA et al., 2013).
A tabela 1 mostra as principais moléculas caracterizadas nos venenos de
Lachesis. Nota-se que a maioria das proteínas purificadas pertencem à classe das PLA2s,
com atividades miotóxicas, neurotóxicas, anticoagulantes e antitrombóticas, e serino-
proteases, similares à trombina, giroxina e calicreína. Somente duas metaloproteases,
denominadas fatores hemorrágicos (LHF-I e II) foram isolados de L. m. muta, com
isoformas de LHF-II descritas posteriormente. As outras proteínas apresentam apenas
uma única isoforma relatada, como são os casos da LAAO e desintegrina de L. muta, da
lectina de L. stenophrys e da hialuronidase e PLB de L. m. rhombeata. Contudo, nenhuma
INTRODUÇÃO
22
PLA2 homóloga ou PLA2 Lys49 foi descrita até o momento. Observa-se também que
poucos trabalhos relataram o potencial terapêutico dessas toxinas, demonstrando a
necessidade de mais estudos na área.
INTRODUÇÃO
23
Tabela 1. Principais componentes caracterizados nos venenos do gênero Lachesis
NOME ESPÉCIE PROTEÍNA MASSA MOLECULAR
(kDa)
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS
POTENCIAL TERAPÊUTICO
REFERÊNCIAS
LmLAAO L. muta LAAO 60 Sem atividades miotóxica, hemorrágica e edematogênica
Atividade citotóxica sobre células AGS e MCF-7;
Atividade sobre L. braziliensis
(BREGGE-SILVA et al., 2012)
Stenoxobin L. stenophyrs Serino-protease
(trombina-símile)
37 α e β-fibrinogenolítica - (ARAGON-ORTIZ; GUBENSEK,
1993)
LsPA-1 L. stenophyrs PLA2 Asp49 13,87 - (DE ASSIS et al., 2008)
LmTX-I L. m. muta PLA2 Asp49 básica
14,24 Atividade fosfolipásica sobre substratos
sintéticos; edema; miotoxicidade;
neurotoxicidade
- (DAMICO et al., 2005b, 2006,
2008)
LmTX-II L. m. muta PLA2 Asp49 básica
14,18 Atividade fosfolipásica sobre substratos sintéticos
- (DAMICO et al., 2005b)
LmrTX L. m. rhombeata
PLA2 Asp49 básica
14,27 Atividades anticoagulante e antitrombótica
- (DAMICO et al., 2012)
Lmr-PLA2 L. m. rhombeata
PLA2 Asp49 ácida
13,97 Inibição da agregação plaquetária
- (CORDEIRO et al., 2015)
LV-Ka L. m. muta Serino-protease
(calicreína-símile)
33 Ativação de plasminogênio - (FELICORI et al., 2003)
LM-PLA2-I L. muta PLA2 Asp49 ácida
Miotoxicidade - (FULY et al., 2000)
LM-PLA2-II L. muta PLA2 Asp49 ácida
18 Miotoxicidade; inibição da agregação plaquetária;
atividade edematogênica
- (FULY et al., 2002, 2003)
TLE-B L. m. muta Serino-protease
44 α e β-fibrinogenolítica - (MAGALHAES et al., 2003)
Continua...
INTRODUÇÃO
24
NOME ESPÉCIE PROTEÍNA MASSA MOLECULAR
(kDa)
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS
POTENCIAL TERAPÊUTICO
REFERÊNCIAS
TLB-P L. m. muta Serino-protease
43 α e β-fibrinogenolítica - (MAGALHAES et al., 2003)
Mutalisina I (LHF-I)
L. m. muta Metaloprotease 100 α e β-fibrino(geno)lítica; alta atividade hemorrágica;
atividade caseinolítica
- (SANCHEZ; COSTA;
ASSAKURA, 1995; SANCHEZ;
MAGALHAES; DINIZ, 1987)
Mutalisina II (LHF-II)
L. m. muta Metaloprotease 22 Degradação de laminina, fibronectina e colágeno tipo IV; edematogênica;
baixa atividade hemorrágica
Efeito trombolítico (AGERO et al., 2007; RUCAVADO
et al., 1999; SÁNCHEZ et al.,
1991)
Mut IIa L. m. muta Isoforma da Mutalisina II
≈ 23
α e β-fibrinogenolítica; atividade proteolítica sobre
dimetilcaseína
- (SÁNCHEZ et al., 2003)
Mut IIb L. m. muta Isoforma da Mutalisina II
≈ 23
α e β-fibrinogenolítica; atividade proteolítica sobre
dimetilcaseína
- (SÁNCHEZ et al., 2003)
Hialuronidase L. m. rhombeata
Hialuronidase 60 - - (WIEZEL et al., 2015)
PLB L. m. rhombeata
Fosfolipase B - - - (WIEZEL et al., 2015)
LMR-47 L. m. rhombeata
Serino-protease (giroxina)
47 α-fibrinogenolítica - (AGUIAR et al., 1996)
Proteína similar a lectina
L. stenophyrs Lectina 16,2 Hemaglutinação - (ARAGÓN-ORTÍZ; BRENES-BRENES; GUBENSEK, 1989; ARAGÓN-ORTIZ;
MENTELE; AUERSWALD,
1996)
Continua...
INTRODUÇÃO
25
NOME ESPÉCIE PROTEÍNA MASSA MOLECULAR
(kDa)
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS
POTENCIAL TERAPÊUTICO
REFERÊNCIAS
Lachesin L. muta Desintegrina Inibição da agregação plaquetária; ligação a integrina GPIIb-IIIa
- (SCARBOROUGH et al., 1993)
LSF L. stenophyrs Metaloprotease 24 - - (LEONARDI et al., 1999)
Serino-protease
L. m. muta Serino-protease
45 - - (MAGALHÃES et al., 1997)
Kininogenin L. muta Serino-protease
29,7 Efeito hipotensivo - (DINIZ; OLIVEIRA, 1992)
Giroxina L. m. muta Serino-protease
≈ 60 Alta letalidade - (DA SILVA et al., 1989)
Trombina-símile
L. m. muta Serino-protease
≈ 41-47 Fibrinogenolítica - (SILVEIRA et al., 1989)
Serino-protease
L. m. muta Serino-protease
40 α e β-fibrinogenolítica - (YARLEQUE et al., 1989)
Arginina esterase
L. muta - ≈ 30 Atividade arginil esterase; - (SILVA; DINIZ; MAGALHÃES,
1985) BIP L. muta Inibidor de
bradicinina 1,06 Atividade inibitória sobre
bradicinina via receptores B2
- (GRAHAM et al., 2005)
βPLIs L. muta Inibidor de PLA2s do tipo β
36,5 - - (LIMA et al., 2011)
LNF1 e LNF2 L. m. muta Inibidores de PLA2s do tipo γ
≈ 20 - - (FORTES-DIAS; BARCELLOS;
ESTEVÃO-COSTA, 2003)
Trombina-símile/ análoga
a giroxina
L. m. muta Serino-protease
25,6 - - (MAGALHAES et al., 1993)
LV-PA L. m. muta Serino-protease
33 Ativação de plasminogênio - (SANCHEZ et al., 2000, 2006)
Lm-BPP 1 a 5 e Lm-CNP
L. muta BPPs e Peptídeos
natriuréticos tipo C
1 a 2,2 - - (SOARES et al., 2005)
Conclusão
INTRODUÇÃO
26
1.2. Fosfolipases A2 (PLA2s) de serpentes: Propriedades físico-químicas, estrutura
e mecanismo catalítico
As PLA2s dos venenos de serpentes da família Viperidae pertencem ao grupo IIA
das PLA2s secretadas, na qual também se encontram as PLA2s de fluidos sinoviais de
mamíferos (DENNIS et al., 2011). Diferem do grupo IA (família Elapidae) pela distribuição
de pontes dissulfeto, a inexistência do “loop elapídico” entre os resíduos 52-65 e a
extensão de 5-7 resíduos na região C-terminal da molécula (ARNI; WARD, 1996a).
Apresentam de 13-15 kDa, 7 pontes dissulfeto, dependência de íons Ca2+ para atividade
enzimática e a díade His48 e Asp99 [segundo o sistema de numeração de Renetseder e
colaboradores (1985)] no sítio catalítico. Caracterizam-se por sua habilidade em hidrolisar
especificamente a ligação éster na posição sn-2 dos fosfolipídios, formando como
produtos da reação ácidos graxos e lisofosfolipídios (BALSINDE; WINSTEAD; DENNIS,
2002; BURKE; DENNIS, 2009; VERNON; BELL, 1992).
O ácido araquidônico quando liberado a partir dessa reação pode ser
metabolizado para formar os eicosanoides, que incluem as prostaglandinas, os
leucotrienos e os tromboxanos (ARGIOLAS; PISANO, 1983; BALSINDE; WINSTEAD;
DENNIS, 2002), enquanto que, o lisofosfolipídio pode gerar o fator de ativação
plaquetária (PAF), todos estes mediadores lipídicos (GIJÓN; LESLIE, 1999). As PLA2s
mostram-se mais ativas quando os fosfolipídios estão agregados em micelas,
monocamadas ou membranas, que formas monoméricas, possivelmente, por facilitar
interações eletrostáticas e hidrofóbicas entre a enzima e o substrato (SCOTT et al., 1990).
As PLA2s secretadas do grupo IIA compartilham uma estrutura secundária
padrão, formada por: (i) uma α-hélice N-terminal longa (α1) (1-13); (ii) uma hélice curta
(18-23); (iii) um loop de ligação ao Ca2+ (25-33); (iv) duas α-hélices antiparalelas longas
(α2 e α3) (37-54 e 90-109); (v) duas β-folhas antiparalelas curtas (β-wing) (74-84); e (vi)
uma região C-terminal (ARNI; WARD, 1996b; FERNANDES et al., 2013; HOLLAND et
al., 1990; SCOTT; SIGLER, 1994). O grupo amino N-terminal encontra-se no centro de
uma extensa rede de ligações de hidrogênio, que interconecta a hélice α1, um segmento
adjacente a β-wing e o Asp99 do sítio ativo. Alguns resíduos hidrofóbicos (Leu/Val2, Phe5
e Ile9) da hélice N-terminal, altamente conservados, contribuem para a formação do canal
hidrofóbico que fornece acesso ao sítio catalítico da enzima (SCOTT; SIGLER, 1994);
INTRODUÇÃO
27
outros resíduos como Met19, Lys69 e a ponte dissulfeto Cys29-Cys45 também podem
contornar essa cavidade (ZHAO et al., 1998). As hélices α2 e α3 constituem o cerne da
proteína, sendo interligadas por duas pontes dissulfeto (C44-C105 e C51-C98). É nesse
arcabouço que se localizam os resíduos envolvidos na rede catalítica, como o Asp49
(coordenação ao Ca2+) e His48, Asp99, Tyr52 e Tyr73 (sítio ativo), e os que revestem
internamente o canal hidrofóbico (Cys45, Ala102, Ala103 e Phe106) (SCOTT; SIGLER,
1994).
Figura 4: Estrutura terciária das PLA2s Asp49
Modelo tridimensional de BthTX-II (PDB: 3JR8) (DOS SANTOS et al., 2011) evidenciando as hélices α1 (N-terminal), α2 e α3, a hélice curta, as duas folhas-betas antiparalelas (β-wings), a região C-terminal, o loop de ligação ao Cálcio e os resíduos que formam o sítio catalítico (His48, Asp99, Tyr52 e Tyr73). As
pontes dissulfeto aparecem em amarelo.
A β-wing é uma subestrutura projetada para fora da molécula em direção ao
solvente e apesar de apresentar uma baixa conservação na sequência de aminoácidos,
a conformação estrutural terciária se mantém preservada (SCOTT; SIGLER, 1994). É
também uma das regiões mais flexíveis da molécula e está relacionada a estabilização
do dímero (resíduos 78-80), quando existentes (CORRÊA et al., 2008).
His 48
Tyr 52
Asp 99
Leu 5
Região C-terminal
Hélice α1
Hélice curta
Hélice α2
β-wing
Hélice α3
Tyr 73
Região N-terminalLoop de ligação
ao Cálcio Asp 49
Ca2+
INTRODUÇÃO
28
A região C-terminal está localizada na face mais externa da molécula e comunica-
se ao loop de Ca2+ pela ponte dissulfeto Cys50-Cys132, por conter um considerável
número de resíduos carregados positivamente, dispostos favoravelmente ao solvente,
mostra-se um interessante sítio de ligação a substratos aniônicos (GEORGIEVA et al.,
2004; RIGDEN et al., 2002). Em dímeros alternativos, esta unidade encontra-se na
interface entre os monômeros, juntamente com o loop de Ca2+ (CORRÊA et al., 2008;
RIGDEN et al., 2002), devido, possivelmente, à reorientações conformacionais após a
entrada do substrato no sítio ativo (MAGRO et al., 2009).
O cálcio é um cofator essencial para a catálise de PLA2s secretadas. Este íon
está envolvido na ligação ao substrato e na estabilização do intermediário tetraédrico
(estado de transição) durante a etapa química. Este íon é coordenado por dois oxigênios
do carboxilato de Asp49, três oxigênios da carbonila de Tyr28, Gly30, Gly32 e duas
moléculas de água (W5 e W12) (SCOTT et al., 1992). Ao lado do loop de coordenação
ao Ca2+, encontra-se o sítio catalítico estruturado da seguinte maneira: os átomos Nδ e
Nε da His48 estão ligados por pontes de hidrogênio com uma molécula de água (W6) e
Asp99, respectivamente, e o carboxilato do Asp99 forma pontes de hidrogênio com as
hidroxilas de Tyr52 e Tyr73. Para o início da hidrólise, o complexo enzima-substrato
requer a presença de uma molécula de água catalítica (W5) coordenada pelo Ca2+ e
interligada a His48 por meio de W6. Durante a catálise, a His48 ativa W5 que ataca a
posição sn-2 do fosfolipídio; a protonação da His48, segue a formação do intermediário
tetraédrico, estabilizado por pontes de hidrogênio com Ca2+ e Gly30. A substituição de
W12 pelo fosfato sn-3 do substrato, favorece a formação dos produtos (BAHNSON, 2005;
BERG et al., 2001; EDWARDS et al., 2002; SCOTT et al., 1990; YU et al., 1998).
Outros cátions também mostram afinidade pelo sítio de ligação (Zn2+, Cu2+ e
Cd2+), contudo, mesmo suportando a ligação do substrato, não alcançam a catálise.
Outros ainda, como Co2+ e Ni2+, mostram valores cinéticos próximos ao Ca2+ em
substratos aniônicos, porém diferem em substratos zwiteriônicos (fosfatidilcolina),
provavelmente por diferenças na coordenação geométrica dos íons no complexo [enzima
+ interface + cátion + substrato], pois somente cátions catalíticos favorecem a
conformação “próxima ao ataque” (YU et al., 1998).
INTRODUÇÃO
29
As PLA2s são consideradas enzimas interfaciais, por agirem na interface lipídio-
água, de modo a alcançarem um estado completamente ativado. A interação precede a
ligação do substrato ao sítio ativo, referindo-se ao primeiro contato entre enzima e
membrana; nesta etapa, o Ca2+ não tem influência sobre a ligação da enzima a interface.
A região de reconhecimento interfacial nessas proteínas está próxima a abertura do canal
hidrofóbico, e resíduos como Lys7 e Lys10, a partir de estudos com uma PLA2 Asp49 de
Agkistrodon piscivorus piscivorus, têm sido propostos por favorecerem a interação com
substratos aniônicos agregados, contudo não sobre substratos zwiteriônicos (HAN et al.,
1997). Segundo Ray, Scott e Tatulian (2007), a interação com a membrana em si não é
suficiente para a ativação da enzima, esta pode permanecer por um período de latência
antes de ser ativada, necessitando de condições favoráveis como carga, temperatura e
produtos de reação na superfície. Uma das principais características que facilita a
ativação é a perturbação da membrana, qualquer alteração desestabilizadora dessa base
estrutural fluida, aumenta consideravelmente a atividade dessas proteínas sobre
agregados lipídicos.
1.3. PLA2s homólogas: estrutura, mecanismo e implicações terapêuticas
Por interferirem nos processos fisiológicos normais do organismo, as PLA2s de
serpentes exibem uma variedade de efeitos toxicológicos e farmacológicos, tais como:
miotoxicidade, neurotoxicidade e edema, e efeitos sobre a agregação plaquetária e
atividade anticoagulante, respectivamente (ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2002; CORRÊA
et al., 2016; KINI, 2003). Segundo Kini e colaboradores (2003), as PLA2s induzem tais
efeitos por meio de mecanismos dependente ou não de atividade catalítica. Quando
dependentes de catálise, os fosfolipídios e seus derivados são responsáveis pelos efeitos
farmacológicos, contudo, se independentes, a interação com proteínas alvo pode gerar
ações agonistas ou antagonistas no metabolismo da célula (KINI et al., 2003).
Um subgrupo de PLA2s dentro da família Viperidae podem induzir dano tecidual
por mecanismos independentes de catálise. Essas proteínas, denominadas PLA2s
homólogas ou PLA2s Lys49, apresentam uma substituição do resíduo aspartato na
posição 49 por um resíduo de lisina, que impede a coordenação de íons Ca2+ no loop de
ligação, acarretando na perda da atividade enzimática, pois o grupo amino-ε da cadeia
INTRODUÇÃO
30
lateral da lisina ocupa essa região. Outras substituições também são relatadas por alterar
a conformação do loop de ligação, como Tyr28→Asn e Gly32→Leu (ARNI et al., 1995;
MARAGANORE et al., 1984). Estudos mais recentes vêm demonstrando que o grupo
amino-ε pode alternar ligações de hidrogênio com os resíduos de Asn28, Gly30 e His33
e uma molécula de água (AMBROSIO et al., 2005), o que confirma a impossibilidade da
permanência do Ca2+ no local. Apesar dessas diferenças, essas proteínas conservam
todos os resíduos que compõem a rede catalítica: His48, Asp99, Tyr52 e Tyr73, indicando
que a interação com fosfolipídios de membrana é provável, contudo sem ciclo catalítico
(DELATORRE et al., 2011).
As PLA2s homólogas são proteínas básicas, contendo 120-122 resíduos de
aminoácidos e preservando a estrutura padrão do grupo IIA. Apresentam ~14 kDa, 7
pontes dissulfeto e formam dímeros em solução, o qual é confirmado a partir de estruturas
cristalográficas de algumas miotoxinas botrópicas (AMBROSIO et al., 2005; ARNI et al.,
1995). Estudos com a miotoxina II de Bothrops asper revelaram que os dímeros
interagem por meio das regiões β-wing e hélice N-terminal (Gln12, Trp77 e Lys80), sendo
estabilizados por pontes salinas e ligações de hidrogênio entre os monômeros (ARNI et
al., 1995). Análises preliminares, com dímeros de BthTX-I, uma miotoxina Lys49 isolada
do veneno de B. jararacussu, obtidos em dois estados conformacionais distintos,
sugeriram que a interface entre os monômeros poderia servir como uma “dobradiça” entre
conformações “aberta” e “fechada”, o que favoreceria o deslocamento de moléculas de
fosfolipídios em contato com a proteína associada a membrana, causando uma
desorganização no pacote lipídico e, consequentemente, dano celular (DA SILVA
GIOTTO et al., 1998).
Atividades citotóxicas sobre células C2C12 mioblásticas de quatro PLA2s
homólogas isoladas de B. asper, Atropoides nummifer, B. jararacussu e Agkistrodon p.
piscivorus, mostraram que suas atividades foram reduzidas em pH 5,0 (dissociação dos
dímeros), em relação ao pH fisiológico, contudo não abolidas, demonstrando que o
estado dimérico não era unicamente responsável pela perturbação na membrana, mas
outras regiões poderiam estar envolvidas (ANGULO et al., 2005).
Apesar de não apresentarem atividade catalítica sobre substratos artificiais não
agregados, essas proteínas provocam mionecrose local e edema (SOARES et al., 2000a,
INTRODUÇÃO
31
2000b) e exercem ações antimicrobianas sobre uma variedade de patógenos (PÁRAMO
et al., 1998; STÁBELI et al., 2006). O primeiro relato da possível região envolvida na
interação com a membrana e, consequentemente, nos efeitos tóxicos descritos para essa
toxina, ocorreu em 1994, dez anos após a descoberta das PLA2s Lys49 nos venenos de
serpentes, por Lomonte e colaboradores (1994). No estudo, o peptídeo compreendendo
os resíduos 115-129 (o qual inclui uma combinação variável de resíduos hidrofóbicos e
carregados positivamente), localizados na região C-terminal da miotoxina II de B. asper,
foi identificado por interagir com heparina (poliânion inibidor de PLA2s miotóxicas) e
neutralizar parte da atividade citotóxica em células endoteliais da proteína nativa.
Posteriormente, essa mesma região apresentou atividade antimicrobiana sobre cepas de
S. aureus e E. coli (PÁRAMO et al., 1998).
Núnez, Ângulo e Lomonte (2001) avaliaram a atividade citotóxica em células
C2C12 indiferenciadas e a miotoxicidade in vivo de quatro peptídeos derivados da região
115-129 de PLA2s Lys49 e Asp49 dos venenos de A. p. piscivorus e B. asper, e
verificaram que somente os peptídeos correspondentes à sequência de PLA2s Lys49
induziram citotoxicidade e miotoxicidade, sendo essas atividades abolidas
completamente quando incubados com heparina. Esses resultados foram concludentes
quanto a participação dessa região nos efeitos citotóxicos descritos para essas toxinas.
A partir dessas evidências, vários trabalhos vêm tentando esclarecer o mecanismo de
ação, pelo qual as PLA2s homólogas interagem e desestabilizam membranas biológicas
independente de íons Ca2+. Com algumas hipóteses a serem testadas: I. Essas
moléculas se ligam a receptores de membrana? II. Possuem alta afinidade por domínios
específicos na bicamada? III. Ou preferem fosfolipídios carregados negativamente?
(LOMONTE; ANGULO; SANTAMARÍA, 2003).
Estudos de Ambrósio e colaboradores (2005) propuseram, com base em
estruturas cristalográficas da miotoxina Lys49 ACL de Agkistrodon contortrix laticinctus e
nos estudos de PrTX-II proposto por Lee e colaboradores (2001), uma relação estrutural
direta entre o sítio ativo e a região C-terminal. Segundo estes autores, a densidade
eletrônica não proteica observada dentro do canal hidrofóbico, em uma das estruturas
(interpretada como uma molécula de ácido graxo), é estabilizada por ligações de
hidrogênio com uma molécula de água e a ligação peptídica entre Cys29 e Gly30,
INTRODUÇÃO
32
hiperpolarizada pela Lys122 (conservada entre as PLA2s homólogas). A interação com o
ligante estabiliza a região C-terminal, devido às ligações de hidrogênio entre essa região
e os resíduos do loop de ligação ao Ca2+, favorecendo a exposição de um “nó hidrofóbico”
formado pelos resíduos de Phe121 e Phe124, que adentram na bicamada lipídica. Sem
ligantes, este nó está internalizado em direção ao sítio ativo, a região C-terminal com
maior flexibilidade conformacional e a Lys122 exposta ao solvente.
Dos Santos, Soares e Fontes (2009) verificaram, a partir da análise estrutural
entre PrTX-I (miotoxina Lys49 isolada do veneno de B. pirajai) e BthTX-I (miotoxina Lys49
isolada do veneno de B. jararacussu), dois padrões distintos de conformações
oligoméricas, relacionados à presença ou ausência de ligantes no canal hidrofóbico: i)
um estabilizado por interações entre as regiões β-wings e os resíduos da hélice N-
terminal, denominado “dímero convencional”, onde a maioria das estruturas
cristalográficas das PLA2s homólogas são refinadas; e ii) outro estabilizado pelo contato
entre o loop de ligação ao Ca2+ e a região C-terminal, formando uma conexão entre os
sítios ativos dos dois monômeros, denominado “dímero alternativo”, neste caso o canal
hidrofóbico estaria na interface dimérica (MURAKAMI et al., 2005).
Segundo o mecanismo proposto, o ácido graxo, liberado pelas PLA2s Asp49,
interage com o canal hidrofóbico das PLA2 Lys49, induzindo mudanças conformacionais
na toxina e alinhando os resíduos Lys20 (hélice curta), Lys115 e Arg118 (C-terminal), de
ambos os monômeros, para o mesmo plano. Esse conjunto de resíduos carregados
positivamente poderia ancorar a toxina à membrana, e desta maneira, haveria uma
interdependência dos sítios ativos e as regiões C-terminal.
Fernandes e colaboradores (2013), com base nas estruturas de BbTX-II e MTX-
II, miotoxinas Lys49 isoladas do veneno de B. brazili (COSTA et al., 2008;
HUANCAHUIRE-VEGA et al., 2009), refinadas no modelo de dímero alternativo,
identificou dois potenciais sítios de interação com a membrana: (i) sítio de Docking na
membrana (MDoS), formado por resíduos catiônicos da região C-terminal (Lys115 e
Arg118, que podem ser complementados por Lys20, Lys80, Lys122 e Lys127) e (ii) sítio
hidrofóbico de desestabilização da membrana (MDiS), constituído por resíduos
hidrofóbicos (Leu121 e Phe125) também localizados no C-terminal. A proposta do
mecanismo tóxico baseia-se em três etapas: i) entrada de uma molécula hidrofóbica
INTRODUÇÃO
33
(ácido graxo) no canal hidrofóbico, levando à reorientação de um monômero, à exposição
dos resíduos MDoS e MDiS ao solvente e o alinhamento de ambos para o mesmo plano;
ii) estabilização da toxina na membrana pela interação dos MDoS e os fosfolipídios; e iii)
desestabilização da membrana pela penetração/inserção dos MDiS na membrana,
podendo acarretar num influxo descontrolado de íons e, eventualmente, alterações
intracelulares irreversíveis e morte celular (Fig. 5) (LOMONTE; ANGULO; CALDERÓN,
2003). Sendo este, o modelo atual proposto para o possível mecanismo citotóxico das
PLA2s homólogas.
Figura 5: Possível mecanismo de ação das PLA2s Lys49
Esquema do mecanismo de ação das PLA2s Lys49 proposto por Fernandes e colaboradores (2013)
Segundo Lomonte, Angulo e Calderón (2003), as evidências sugerem que a ação
dessas proteínas pode não estar relacionada à presença de receptores na membrana,
mas à ligação de fosfolipídios, podendo ser os carregados negativamente os seus
principais aceptores, pois i) essas toxinas rompem lipossomas preparados
exclusivamente de fosfolipídios, com preferência por tipos aniônicos (DÍAZ et al., 1991);
INTRODUÇÃO
34
ii) lisam uma variedade de tipos celulares em cultura, mostrando baixa seletividade em
atividades citotóxicas (LOMONTE et al., 1994); iii) lisam células procarióticas (PÁRAMO
et al., 1998); e iv) aumentam sua ação quando membranas de eritrócitos são enriquecidos
com fosfolipídios aniônicos (DÍAZ et al., 2001).
Contudo, outros alvos moleculares não podem ser descartados. Estudos
anteriores descreveram a alta afinidade de PLA2s de venenos de serpentes (proteínas
OS1 e OS2 de Oxyuranus scutellatus scutellatus) com receptores de membranas
identificados em células neurais (receptores tipo N) e células musculares (receptores tipo
M), mostrando o loop de ligação ao Ca2+ (resíduos Gly30 e Asp49) como a principal região
de interação, com preferência pela forma molecular livre de íons (LAMBEAU et al., 1995).
O receptor tipo M, provável sítio de ligação para PLA2s endógenas, apresenta um longo
domínio extracelular composto por um domínio rico em cisteína, um domínio tipo II similar
a fibronectina e oito domínios de reconhecimento a carboidratos (CRD), sendo este último
(CDR5) envolvido na ligação com PLA2s de serpentes (OS1) (NICOLAS; LAMBEAU;
LAZDUNSKI, 1995). Uma PLA2 homóloga isolada de Agkistrodon piscivorus piscivorus
teve ação antagonista sobre o receptor KDR do fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF) (expresso em células musculares esqueléticas), bloqueando a
proliferação celular de células endoteliais induzidas por VEGF (YAMAZAKI et al., 2005).
Esta ação antagonista mostra que não apenas as membranas celulares são alvos das
PLA2s, como também outras moléculas extracelulares podem ser potenciais alvos destas
toxinas.
Além de serem amplamente estudadas por seus efeitos tóxicos durante
envenenamentos, as PLA2s de serpentes (Asp49 e Lys49) apresentam-se como
promissores agentes antimicrobianos. Sua ação direta sobre membranas celulares é uma
ferramenta útil no combate à microrganismos patogênicos, por isso diversos trabalhos
vêm relatando seu potencial. Como elencado na figura 2 (pág. 7), as PLA2s exibem
atividades sobre diferentes espécies de Leishmania, como L. infantum chagasi, L. major,
L. braziliensis, L. amazonensis e L. donovani (BARROS et al., 2015; STÁBELI et al.,
2006); sobre P. falciparum (CASTILLO et al., 2012), S. mansoni (STÁBELI et al., 2006) e
T. gondii (BORGES et al., 2016); sobre fungos, como Candida albicans (COSTA et al.,
2008); e sobre uma variedade de bactérias gram-negativas, como P. aeruginosa, E. coli
INTRODUÇÃO
35
(ALMEIDA et al., 2016), S. paratyphi (SUDARSHAN; DHANANJAYA, 2016), E.
aerogenes (PERUMAL SAMY et al., 2007), B. pseudomallei e P. vulgaris (SAMY et al.,
2015); e gram-positivas, como S. aureus e B. subtilis (SUDARSHAN; DHANANJAYA,
2016; SUDHARSHAN; DHANANJAYA, 2015; VARGAS et al., 2012).
Toda essa diversidade de patógenos suscetíveis a ação lítica das PLA2s mostra
o quanto estas toxinas são versáteis e propícias a aplicações biotecnológicas.
1.4. Peptídeos derivados de PLA2s homólogas como possíveis agentes
antimicrobianos
As condições precárias de saúde a que grande parte da população de países em
desenvolvimento são expostas favorecem o surgimento de doenças negligenciadas, tais
como leishmaniose, doença de chagas, hanseníase e esquistossomose. Estas
contribuem para o quadro de desigualdade por representarem um entrave no
desenvolvimento do país (BRASIL et al., 2010). Apesar do investimento em pesquisas
com doenças negligenciadas, seus resultados são pouco refletidos na população.
Além do mais, novos casos de resistência aos fármacos convencionais vêm
sendo registrados, agravando a situação. Por exemplo, L. infantum (leishmaniose
visceral), mostrou resistência em tratamentos com a combinação de anfotericina B
lipossomal e miltefosina em regiões endêmicas da Índia. Mutações pontuais no
transportador transmembrana de miltefosina e alterações em fosfolipídios específicos na
bicamada, foram apontados como mecanismos de resistência à droga (FERNANDEZ-
PRADA et al., 2016). A doença de chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi,
é outro problema de saúde, pois 70% dos casos são assintomáticos (fase crônica), no
qual os pacientes eventualmente desenvolvem a patologia décadas depois. Poucos
tratamentos são efetivos para esta fase, pela dificuldade de identificação dos parasitas,
presentes em quantidades extremamente baixas em órgãos ou tecidos. Estudos recentes
mostram que fármacos nitro heterocíclicos (benzonidazol e nifurtimox), comumente
usados para o tratamento da doença na fase aguda, apresentam uma resposta mais
específica na fase crônica (FRANCISCO et al., 2016), porém muitos desses
medicamentos exibem uma série de efeitos colaterais tóxicos, dificultando a adesão do
paciente.
INTRODUÇÃO
36
Em doenças como hanseníase (Mycobacterium leprae), esquistossomose
(Schistosoma mansoni) e malária (gênero Plasmodium – não considerada mais uma
doença negligenciada), também são causas de resistência os tratamentos prolongados
e os mecanismos de escape desenvolvidos pelo patógeno dentro de compartimentos
intracelulares das células hospedeiras (BHAT; PRAKASH, 2012; DE KONING-WARD et
al., 2016; DE MORAES et al., 2012), o que mostra a necessidade de mais estudos
voltados para a caracterização de novas moléculas antimicrobianas a partir de diversas
fontes naturais.
Um outro agravo à saúde da população é o crescente número de cepas
bacterianas resistentes aos fármacos convencionais, pois este crescimento é
inversamente proporcional à quantidade de novos antimicrobianos lançados no mercado,
tornando a resistência bacteriana um dos principais problemas e saúde pública (LOWY,
2003).
A resistência bacteriana pode ocorrer em todos os tipos de bactérias encontradas
em UTI (Unidade de terapia intensiva), embora as bactérias gram-negativas, como E.
coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e espécies de Proteus e Acinetobacter, sejam mais
susceptíveis a adquirirem resistência a múltiplas classes de antibióticos (KARAM et al.,
2016). Os principais mecanismos utilizados por bactérias gram-negativas são destruição
de antibióticos pela produção de enzimas β-lactamases (β-lactâmicos), impermeabilidade
celular pela diminuição de porinas na membrana externa e presença de bombas de efluxo
(KARAM et al., 2016). A P. aeruginosa por exemplo, apresenta uma resistência natural a
antibióticos, com uma notável habilidade em adquirir mecanismos de escape a múltiplos
grupos de agentes antimicrobianos, demonstrando praticamente todos os mecanismos
enzimáticos e mutacionais de resistência já conhecidos. Apresenta uma membrana
externa pouco permeável, bombas de efluxo e formação de biofilmes, dificultando o
tratamento de infecções causadas pela bactéria (STRATEVA; YORDANOV, 2009). Este
patógeno pode provocar uma variedade de doenças em indivíduos predispostos à
infecção, como resultado de queimaduras, feridas e lesões no trato urinário, sendo uma
das principais causas de mortalidade em pacientes com fibrose cística (BENAMARA et
al., 2014).
INTRODUÇÃO
37
Relatos recentes apontam um aumento significativo na resistência de isolados de
Acinetobacter baumannii (coletados nos períodos de 2004 a 2014 – América do Norte e
Europa) em ensaios in vitro com o antibiótico tigeciclina (44%), aprovado por estes países
para o tratamento de infecções na pele e de pneumonia causada por bactéria
(GIAMMANCO et al., 2017).
As infecções causadas por bactérias gram-positivas, como Staphylococcus
aureus resistente a meticilina (MRSA), Enterococcus resistente à vancomicina e
Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina, vêm dificultando as escolhas
terapêuticas (OHLSEN; LORENZ, 2007). Estes patógenos são responsáveis pelos
inúmeros casos de infecções adquiridas nos hospitais ou na comunidade, como
bacteremia, pneumonia, endocardite e meningite, assim como aumentando o risco de
infecções associadas à imunossupressão (transplantes e quimioterapia anticâncer),
intubação e cateterismo (MARTINEZ et al., 2009; SHOPSIN; KREISWIRTH, 2001;
STACEVIČIENĖ et al., 2016).
A resistência de cepas MRSA está associada à expressão de proteínas 2a
ligadoras de Penicilina (PBP2a) com baixa afinidade para antibióticos resistentes à
penicilinases/β-lactamases (meticilina, oxacilina). Esta proteína, de aproximadamente 78
kDa, está ligada à membrana e é responsável pela reação de transpeptidação entre
cadeias de peptideoglicanos da parede celular bacteriana, conferindo resistência a todas
as classes de antibióticos β-lactâmicos (LOWY, 2003; PEACOCK; PATERSON, 2015).
Por sua vez, o mecanismo de resistência de espécies de Enterococcus está associada à
modificação dos precursores de peptideoglicanos. A vancomicina se liga a porção
terminal (D-Alanina – D-Alanina) dos precursores de peptideoglicanos, inibindo a ligação
cruzada e a síntese da parede celular. As cepas resistentes apresentam uma
modificação: D-Alanina-D-Alanina-Serina ou D-Alanina-D-Alanina-Lactato, que diminui a
ligação do antibiótico ao precursor (MILLER; MUNITA; ARIAS, 2014). Estas bactérias
também apresentam resistência a penicilina e cefalosporina.
Patógenos, como protozoários ou bactérias, são responsáveis por grande parte
das doenças que afligem a população, e o desenvolvimento de estratégias para minimizar
seus efeitos são necessários.
INTRODUÇÃO
38
Os peptídeos antimicrobianos, denominados AMPs, são pequenas moléculas
distribuídas numa variedade de espécies de invertebrados, plantas e animais, onde
diferem na composição de aminoácidos, anfipaticidade, carga, hidrofobicidade e
tamanho. Essas características permitem a eles atacarem e se inserirem em membranas
biológicas (pela formação de poros), bem como desencadear a morte celular por
mecanismos intracelulares (BROGDEN, 2005). Devido a isso, os AMPs encontram-se
em posições elevadas na busca por novos agentes farmacológicos para o tratamento de
infecções causadas por microrganismos patogênicos.
Muitos peptídeos derivados de proteínas apresentam propriedades semelhantes
aos AMPs, por isso foram incluídos num subgrupo dessa grande família. Peptídeos
sintetizados a partir da região C-terminal de PLA2 homólogas vêm sendo testados em
células musculares C2C2 indiferenciadas ou diferenciadas em miotubos (ANGULO et al.,
2001; ARAYA; LOMONTE, 2007), células Jukart (COSTA et al., 2008), bactérias (COSTA
et al., 2008; PÁRAMO et al., 1998; SANTAMARÍA et al., 2005) e fungos (MURILLO et al.,
2007), todos com atividades citotóxicas promissoras. Estas pequenas moléculas podem
constituir, portanto, boas alternativas para a prospecção de novos agentes
antimicrobianos.
OBJETIVOS
39
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar bioquímica e funcionalmente fosfolipases A2 e peptídeos sintéticos do
veneno de Lachesis muta muta com possíveis atividades antimicrobianas.
2.2. Objetivos Específicos
▪ Purificar os componentes bioativos do veneno de L. m. muta por cromatografias
de exclusão molecular e fase reversa;
▪ Determinar a massa molecular relativa dos componentes por eletroforese
monodimensional, assim como o grau de pureza das proteínas;
▪ Caracterizar enzimaticamente as proteínas isoladas;
▪ Sequenciar as proteínas purificadas;
▪ Sintetizar peptídeos a partir da sequência da proteína isolada;
▪ Avaliar o efeito citotóxico da proteína isolada e dos peptídeos sintéticos sobre
células C2C12 e eritrócitos humanos;
▪ Avaliar o potencial antimicrobiano da proteína e peptídeos sintéticos.
MATERIAIS E MÉTODOS
40
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Veneno de Lachesis muta muta (VLmm)
O VLmm foi fornecido pelo serpentário BioAgents (Batatais-SP). O estudo tem
autorização do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
(número de licença 27131-1) e do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN)
(número 010627/2011-1).
3.2. Mapa Metodológico
A metodologia empregada para obtenção dos resultados obedeceu ao seguinte
fluxograma (Figura 6):
Figura 6: Fluxograma da metodologia utilizada nas etapas de isolamento e caracterização
Cada cor representa as etapas e suas subdivisões nos processos de purificação e caracterização das proteínas de interesse.
Veneno de
L. m. muta
FracionamentoCromatografia de
Exclusão Molecular
Cromatografia de
Fase Reversa
Caracterização bioquímica
Eletroforese
Atividade
fosfolipásica
Espectrometria de
Massa
Sequenciamento
Degradação de
Edman
Espectrometria
de massa
Síntese de peptídeos
Caracterização biológica
Citotoxicidade
At. antimicrobiana
T. cruzi
L. infantum
P. falciparum
BactériasAt. hemólise
MATERIAIS E MÉTODOS
41
3.3. Isolamento da toxina de VLmm
O VLmm foi solubilizado no tampão bicarbonato de amônio 0,5 M pH 8,0 e
aplicado a cromatografia de exclusão molecular em coluna Sephacryl S200 (GE
Lifescience Health Care, 10 x 30 cm), acoplada a um sistema FPLC Akta Purifier (GE
Lifescience Health Care). A fração de interesse foi recromatografada numa coluna de
fase reversa C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 μm – Discovery Supelco) utilizando como soluções
ácido trifluoroacético (TFA – Sigma Aldrich, EUA) 0,1% (Eluente A) e acetonitrila (ACN –
Sigma Aldrich, EUA) 99,9% + TFA 0,1% (Eluente B), sob o fluxo de 1 mL/min e gradiente
linear de 0-70%. A absorbância foi mensurada em 280 nm.
3.4. Dosagem de proteínas
A quantificação de proteínas do VLmm, frações e toxina foi realizada de acordo
com o kit DC Protein (Bio-Rad, EUA) (LOWRY et al., 1951), utilizando a albumina sérica
bovina (BSA) como padrão.
3.5. Eletroforese monodimensional
O procedimento para eletroforese monodimensional foi realizado conforme
Laemmli (1970). A determinação da massa relativa das proteínas foi avaliada por SDS-
PAGE usando géis em formatos descontínuos, com um gel concentrador (Acrilamida 4%
em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8) (Sigma Aldrich, EUA) e um gel separador (acrilamida
12,5% em tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8). A solução do tampão de corrida empregada
no preenchimento dos reservatórios da cuba foi formada por Tris-Base 0,06 M, Glicina
0,5 M e SDS 10% (Sigma Aldrich, EUA). As amostras foram pré-aquecidas em 95°C por
5 min e aplicadas nos poços do gel concentrador, juntamente com o padrão de peso
molecular (7 a 175 kDa – BioLabs P7709S, EUA). Na corrida eletroforética foi fixada uma
corrente de 15 mA por gel e voltagem livre por 1h e 40 minutos.
Após a corrida, o gel foi lavado por 15 minutos com uma solução fixadora (álcool
etílico 50% e ácido acético 12%) e, em seguida, corado com solução de azul de
Coomassie G-250 (Sigma Aldrich, EUA) por 10-30 minutos. Depois desse período, o gel
foi descorado em solução descorante (álcool etílico 20% e ácido acético 3%). As imagens
dos géis foram escaneadas num ImageScanner III (GE Lifescience Health Care).
MATERIAIS E MÉTODOS
42
3.6. Atividade fosfolipásica sobre 4N3OBA
O procedimento foi realizado conforme descrito por Petrovic e colaboradores
(2001) com modificações. O substrato ácido 4-nitro-3-octanoiloxi-benzoico (4N3OBA)
(Enzo Lifescience, EUA) (5 mg) foi diluído em 5,4 mL de acetonitrila. Alíquotas de 0,2 mL
foram secas e mantidas a -20°C. Cada tubo contendo 4N3OBA foi diluído em 2 mL de
tampão de amostra (Tris-HCl 0,01 M em pH 8,0, CaCl2 0,01 M e NaCl 0,1 M) (Sigma
Aldrich, EUA) e mantido no gelo. Para determinação da atividade fosfolipásica foi
aplicado 190 μL de reagente 4N3OBA combinados com 10 μL de amostra (veneno bruto
e/ou frações) pré-diluídas em água e, imediatamente, incubados a 37°C; a absorbância
foi mensurada em 425 nm por 30 minutos. A atividade fosfolipásica foi tida como
diretamente proporcional ao aumento dos valores da absorbância e expressa como
média ± desvio padrão, e submetida a análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-
teste de Tukey para p<0,05.
3.7. Sequenciamento da toxina de VLmm
A toxina isolada foi sequenciada por duas técnicas: i) sequenciamento N-terminal
por degradação de Edman, na qual a sequência foi determinada por um sequenciador
automático PPSQ-33A (Shimadzu, Kyoto, Japão), e submetida posteriormente à busca
por similaridade utilizando o software BLAST, com subsequente alinhamento múltiplo
através do CLUSTALW2; e ii) Espectrometria de Massa, no qual a proteína foi digerida
com tripsina, de acordo com as instruções do fabricante, e os fragmentos obtidos da
digestão foram analisados em espectrômetro ESI-IT-TOF (Electrospray-Ion Trap-Time of
Flight) (Shimadzu Co., Japão) equipado com o UFLC (Ultra-Fast Liquid Chromatography)
(20A Prominence, Shimadzu). Os espectros MS/MS gerados foram analisados pelo
software Peaks Mass Spectrometry (Bioinformatics Solutions Inc., Canadá). As análises
por espectrometria de massa foram realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biofísica
do Instituto Butantan, em colaboração com o pesquisador Dr. Daniel Carvalho Pimenta.
A acurácia dos fragmentos gerados da digestão enzimática foi obtido segundo
metodologia de Coutinho-Neto e colaboradores (2013), onde:
Acurácia = 1.000,000 x (massa teórica - massa mensurada) / massa teórica
MATERIAIS E MÉTODOS
43
3.8. Peptídeos sintéticos
Os peptídeos sintetizados a partir dos resíduos 1-12 (região N-terminal), 41-52 e
105-116 (região C-terminal) foram obtidos da Aminotech Pesquisa e Desenvolvimento,
Diadema, SP.
Os peptídeos modificados foram desenhados com base na carga residual e no
grau de hidrofobicidade, utilizando os softwares PEPTIDE 2.0 Online
www.peptide2.com/N_peptide_hydrophobicity_hydrophobicity.php e THE ANTIMICROBIAL
PEPTIDE DATABASE http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php.
3.9. Modelagem molecular
Para investigar as características estruturais dos aminoácidos foi realizada a
modelagem molecular por homologia da sequência de LmutTX usando a estrutura
cristalográfica de MTX-II de Bothrops brazili (PDB: 4DCF) como modelo, com uma
resolução de 2,7 Å (ULLAH et al., 2012), e a estrutura de uma PLA2 ácida de
Deinagkistrodon acutus (PDB: 1IJL) (GU et al., 2002). A fim de pesquisar e recuperar a
estrutura modelo foram usados Protein Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (ALTSCHUL
et al., 1990) e Protein Data Bank (PDB) (http://www.pdb.org). Os alinhamentos das
sequências foram realizados com os softwares MODELLER v9.16 (SALI; BLUNDELL,
1993) e CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994). O modelo de construção
foi realizado no MODELLER v9.16. Um total de 1000 modelos foram gerados e o modelo
final foi selecionado baseado score DOPE mais baixo calculado pelo software
MODELLER. A qualidade estereoquímica do modelo final para LmutTX foi avaliado
usando o programa PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1993). A visualização interativa e
análise comparativa das estruturas moleculares foram realizadas em UCSF Chimera
(PETTERSEN et al., 2004).
3.10. Citotoxicidade sobre Células musculares C2C12 diferenciadas em miotubos
O procedimento foi realizado de acordo com Lomonte e colaboradores (1999). As
células C2C12 (linhagem de mioblastos murinos) foram cultivadas em meio de
crescimento DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Sigma Aldrich, EUA)
suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, ácido pirúvico 1 mM,
MATERIAIS E MÉTODOS
44
penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0,1 mg/mL) e anfotericina B (0,25 mg/mL) (Sigma
Aldrich, EUA), em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Uma suspensão inicial
de células de 2 x 104 foi aplicada em placas de 96 poços e incubados por 4 dias. Após
esse período, o meio de crescimento foi substituído por meio de diferenciação,
constituído por DMEM + 1% de soro fetal, por 4-6 dias. Para o ensaio de citotoxicidade,
a proteína e os peptídeos foram diluídos em PBS e acrescentados na cultura de célula,
num volume total de 200 µL/poço. Controles de 0% e 100% de toxicidade consistiu em
meio celular e Triton X-100 (Sigma Aldrich, EUA), respectivamente. Após 3 horas de
incubação, alíquotas de 150 µL do sobrenadante foram coletados para determinação da
atividade de Desidrogenase láctica (LDH), liberada a partir de danos celulares utilizando
kit comercial (LDH Bioclin, Brasil). Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão, e submetidos a análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste de Tukey
com nível de significância para p<0,05. Os experimentos foram realizados em triplicata
de poços (n=3).
3.11. Atividade de hemólise
A atividade de hemólise foi realizada de acordo com Stark, Liu e Deber (2002).
O sangue humano colhido em citrato 3,2% foi centrifugado a 3500 rpm por 15 minutos
para remoção do plasma. Os eritrócitos obtidos foram lavados três vezes com soro
fisiológico, centrifugados por 10 minutos e ressuspendidos em tampão fosfato salino
(PBS) a 4%. Para a atividade, 100 µL da amostra e 100 µL da suspensão de eritrócitos
foram incubados a 37 ºC por 1 hora. Após este período, as alíquotas foram centrifugadas
a 1000 x g por 5 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para poços de uma
microplaca de 96 poços e a liberação de hemoglobina mensurada em 540 nm. PBS e
Triton X-100 0,1% foram usados como 0 e 100% de hemólise, respectivamente. Os
resultados foram expressos como média ± desvio padrão e submetidos a análise de
variância (ANOVA), seguido pelo pós-teste de Tukey com nível de significância para
p<0,05. Os experimentos foram realizados em triplicata de poços de 2 experimentos
individuais. Autorização do Comitê de Ética e Pesquisa sob o número de 1.233.171.
MATERIAIS E MÉTODOS
45
3.12. Atividade antimicrobiana em diferentes microrganismos patogênicos
3.12.1. Parasitas
Para os estudos tripanocidas das amostras de venenos e proteínas purificadas
foi usado o clone CL-B5 de T. cruzi. Os parasitas, transfectados estavelmente com o
gene β-galactosidase (lacZ) de Escherichia coli, foram fornecidos gentilmente pelo Dr. F.
Buckner do Instituto Conmemorativo Gorgas (Panamá). Epimastigotas foram cultivados
a 28 °C em caldo de triptose de infusão hepática (LIT) com penicilina e estreptomicina
em soro fetal bovino (FBS) 10%, e colhidos durante a fase de crescimento exponencial.
Para a atividade leishmanicida foi usada Leishmania infantum (MCAN/ES/92/BCN83).
Promastigotas foram cultivados a 28 °C em meio Schneider suplementado com FBS 10%.
3.12.1.1. Ensaio sobre Trypanosoma cruzi
A atividade foi realizada em microplacas de 96 poços de fundo chato com culturas
que não tinham atingido a fase estacionária (VEGA et al., 2005). Os epimastigotas foram
semeados a 2,5 x 105 mL-1 em 200 µL de meio LIT. As placas foram incubados com
diferentes concentrações de amostras de veneno (1,62-100 µg/mL) e frações ou toxinas
isoladas (3,25-50 µg/mL) a 28 °C por 72 horas; 50 µL da solução de CPRG (Chlorophenol
Red-β-D-galactopyranoside) foram acrescentados aos poços para alcançar a
concentração final de 200 µM. As placas foram incubadas a 37 °C por 6 horas e a
absorbância mensurada a 595 nm. Cada concentração foi testada em triplicata. Controles
contendo apenas parasitas foram incluídos. Como droga controle foi utilizada
Pentamidina na concentração de 100 µg/mL. A eficiência dos componentes foi estimada
calculando a percentagem de atividade anti-epimastigota. Os resultados foram expressos
como média ± desvio padrão, e submetidos a análise de variância (ANOVA) seguido pelo
pós-teste de Tukey com nível de significância para p<0,05.
3.12.1.2. Ensaio sobre Leishmania infantum
O experimento foi realizado conforme Rolón e colaboradores (2006) com
modificações para L. infantum (Leishmaniose visceral). Promastigotas em fase log de
crescimento (1 x 106 de parasitas) foram cultivados em microplacas de 96 poços. As
MATERIAIS E MÉTODOS
46
amostras foram acrescentadas aos parasitas em diferentes concentrações (1,62-100
µg/mL) para um volume final de 200 µg/mL. Cada concentração foi realizada em triplicata.
Controles contendo apenas parasitas foram incubados por 72 horas a 26 °C, após este
período foram adicionados 20 µL da solução de resazurina 2,5 Mm e a reação de
oxidorredução quantificada a 570 e 595 nm para calcular a inibição do crescimento de
promastigotas. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, e
submetidos a análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste de Tukey com nível
de significância para p<0,05. Como droga controle foi utilizada Benzonidazol na
concentração de 100 µg/mL.
3.12.1.3. Ensaio sobre Plasmodium falciparum
Este experimento foi realizado em colaboração com a profª. Dra. Carolina Bioni
do Laboratório de Malária e Leishmaniose, Fiocruz Rondônia.
3.12.1.3.1. Cultivo contínuo da fase eritrocitária do parasito
Nos ensaios de atividade antimalárica foram utilizadas formas sanguíneas de um
clone de P. falciparum Cloroquina-resistente (W2). Os parasitos foram cultivados em
hemácias humanas em condições estabelecidas por Trager e Jensen (1976) em placas
de cultura, com hematócrito a 5%, diluídos em meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-
Aldrich) suplementado com 25 mM de Hepes (Sigma-Aldrich), 21 mM de bicarbonato de
sódio (Sigma-Aldrich), 11 mM de glicose (Sigma-Aldrich), 40 μg/mL de gentamicina e
10% (v/v) de albumax. As placas foram mantidas em dessecadores a 37 °C ou em mistura
gasogênica contendo 5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2. Diariamente, foram realizadas
trocas do meio de cultura e a parasitemia monitorada em esfregaços sanguíneos, fixados
com metanol, corados com Giemsa e visualizados em microscópio óptico com objetiva
de imersão (1.000x).
3.12.1.3.2. Sincronização dos parasitos para utilização nos testes in vitro
Os cultivos com predomínio de anéis utilizados nos ensaios de quimioterapia
foram obtidos por meio da sincronização com sorbitol conforme descrito na literatura
(LAMBROS; VANDERBERG, 1979). O hematócrito e a parasitemia, pré-determinados
MATERIAIS E MÉTODOS
47
para cada teste, foram ajustados com a adição de hemácias e meio RPMI completo em
quantidades adequadas.
3.12.1.3.3. Preparo das placas para os ensaios de quimioterapia
As culturas de parasitos sincronizadas com predomínio de anéis de P. falciparum
foram distribuídas em microplacas de 96 poços, utilizando-se apenas 60 poços desta, os
demais poços das bordas não foram utilizados para evitar o efeito de borda, adicionando-
se 180 μL/poço de meio de cultura RPMI contendo: 0,5% de parasitemia e 2% de
hematócrito para o teste de Sybr Green. Anterior a adição da suspensão dos parasitos,
20 µL de amostra foram adicionados à placa teste, em duplicata, nas concentrações
testes. Os poços controles (seis por teste) continham hemácias infectadas sem adição
dos compostos-testes (controle negativo). O antimalárico padrão Artemisinina (Art) foi
testado em paralelo em todos os experimentos realizados, nas diluições seriadas de 500
a 7,8 ng/mL (controle positivo). Os compostos testes foram inicialmente testados nas
concentrações de 1200 a 37,5 ng/mL, posteriormente titulados, utilizando concentrações
seriadas até atingir a concentração inibitória para 50% do crescimento dos parasitos
(IC50).
3.12.1.3.4. Avaliação da atividade antimalárica pelo método de Sybr Green
No ensaio com o intercalante fluorescente de DNA Sybr Green (SMILKSTEIN et
al., 2004), duas placas de 96 poços foram preparadas para cada experimento, uma placa-
teste, contendo os parasitos e as amostras a serem testadas, e outra pré-preparada com
PBS 1x para leitura fluorimétrica. As placas-testes foram incubadas por 48 horas à 37 ºC
nas condições ideais para o crescimento do parasito. Após 48 horas de incubação, o
sobrenadante das placas-testes foi descartado cuidadosamente sem suspender a papa
de hemácias e, em seguida, foram adicionados 100 μL de PBS 1x em cada poço das
placas contendo o cultivo de P. falciparum, os quais foram centrifugadas a 1.500 rpm por
10 minutos. Paralelamente, foram adicionados 100 μL de PBS 1x em cada poço em outra
placa de cultura de 96 poços de fundo chato, onde foi realizada a leitura fluorimétrica.
Após centrifugação das placas, o sobrenadante foi novamente descartado de forma
cuidadosa sem suspender a papa de hemácias e 100 μL/poço de tampão de lise com
MATERIAIS E MÉTODOS
48
Sybr Green I (Invitrogen) (2 μL de Sybr Green para cada 10mL de tampão de lise – para
uma placa) foi adicionado na placa contendo a cultura de P. falciparum. Em seguida foi
homogeneizado e transferido o conteúdo de 100 μL dos poços da placa-teste para a placa
de leitura previamente preparada com 100 μL/poço de PBS 1x. A placa de leitura foi
recoberta por papel laminado e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Após
o período de incubação, as bolhas de ar que surgiram nos poços foram eliminadas para
não influenciarem na leitura. A leitura das absorbâncias foi realizada em fluorímetro
(Synergy HT – BioTek) com excitação de 485nm e emissão de 535nm, em ganho de 30,
para então analisar a inibição do crescimento dos parasitas.
3.12.1.3.5. Determinação da concentração inibitória de 50% do crescimento do
parasito (IC50)
A inibição de 50% do crescimento dos parasitos foi determinada utilizando curvas
dose-resposta, em função de regressão linear. O programa Origin (OriginLab
Corporation, Northampton, MA, EUA) foi utilizado para determinar o valor de IC50. As
amostras que apresentaram IC50 < 10 μg/mL foram consideradas ativas; IC50 entre 10 a
50 μg/mL parcialmente ativas; e IC50 > 50 μg/mL inativas.
3.12.2. Ensaio de antibiofilme
As cepas de bactérias gram-positivas Staphylococcus epidermidis ATCC 35984
e Staphylococcus aureus ATCC 25904 foram cultivadas em meio por 24 horas em ágar
Mueller Hinton (Oxoid Ltd. England) a 37 ºC. As suspensões bacterianas foram
preparadas em NaCl 0,9% correspondentes a 1 na escala de McFarland (3×108 CFU/mL).
As frações e toxina foram testadas na concentração de 100 µg/mL. O antibiótico
Vancomicina (8 mg/mL) (Sigma–Aldrich Co., USA) foi utilizado como controle positivo e
a água como controle negativo. Para avaliar a atividade de antibiofilme, 40 µL de caldo
triptona de soja (TSB), 80 µL de amostra e 80 µL de suspensão bacteriana foram
incubadas em microplacas de 96 poços a 37 ºC por 24 horas. A atividade da formação
de antibiofilme avaliou a camada de biofilme aderente formada que foi corada com cristal
violeta 0,4% (STEPANOVIC et al., 2007). A atividade de erradicação foi obtida pela
incubação de diferentes soluções de cepas bacterianas nas placas por 24 horas, para
MATERIAIS E MÉTODOS
49
pré-formação de biofilme, seguido pelas células plantônicas removidas e inoculadas por
mais de 24 horas com amostras. Após este período, a biomassa de biofilme foi corada
com cristal violeta 0,4%. Este experimento foi realizado em colaboração com o Prof. Dr.
Alexandre José Macedo da UFRGS.
3.12.3. Ensaio sobre bactérias
A atividade antimicrobiana foi estabelecida conforme o Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2012) com adaptações. A concentração mínima inibitória (CIM)
foi determinada por teste de suscetibilidade de microdiluição, as bactérias utilizadas
foram Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus aureus resistente à
meticilina (MRSA), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883). Todas as cepas bacterianas foram cultivadas em caldo Luria Bertani (LB
- BD DifcoTM) durante 24 horas (fase exponencial) e ajustado a uma absorbância de
turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland, que corresponde a 1,5 x 106
unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. As amostras foram diluidas e ajustadas para
12,5 µg/mL (VLmm) e para 125-7,6 µg/mL (peptídeos sintéticos) com o volume final de
200 µL e analisadas em microplacas de 96 poços por 24 horas a 37°C. Para o controle
negativo foi utilizado 20 µL de suspensão bacteriana + 180 µL do caldo LB, enquanto que
o controle positivo foi composto de 20 µL de suspensão bacteriana + 50 µL do antibiótico
Imipenem (Sigma Aldrich, EUA) (20 µg/mL) + 130 µL LB. Como branco foi utilizado
somente o caldo LB (200 µL). A inibição do crescimento bacteriano foi determinada por
espectrofotometria no comprimento de onda de 630 nm (TC 96 Elisa Microplate Reader).
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, e submetidos a análise de
variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste de Tukey com nível de significância para
p<0,05. Os experimentos foram realizados em triplicata (n=3) de três ensaios individuais.
A percentagem de inibição do crescimento foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula:
% inibição do crescimento = 100 – Absorbância da amostra x 100
Absorbância do meio com bactérias
Atividade realizada em colaboração com a profª. Dra. Najla Benevides Matos,
Laboratório de Microbiologia, FIOCRUZ-RO.
RESULTADOS
50
4. RESULTADOS
4.1. Purificação e caracterização físico-química de uma PLA2 homóloga do veneno
de Lachesis muta muta (VLmm)
O VLmm foi fracionado em duas etapas cromatográficas: Exclusão Molecular e
fase reversa. Na primeira etapa foram eluídas 4 frações, denominadas LmS-1 a LmS-4,
respectivamente (Figura 6). Ao serem analisadas em eletroforese monodimensional em
condições desnaturantes e redutoras (SDS-PAGE 12,5%), observou-se que as frações
LmS-3 e LmS-4 apresentavam proteínas com massas moleculares de aproximadamente
13 kDa (Figura 7A) (compatíveis com PLA2s do veneno de serpentes) e quando
submetidas à avaliação da atividade fosfolipásica sobre substrato artificial, ambas não
apresentaram atividades significativas (Figura 7B). Devido à baixa quantidade de
proteína na fração LmS-4, o estudo foi direcionado para a fração LmS-3.
Figura 7: Fracionamento do VLmm e atividade fosfolipásica das frações obtidas na cromatografia de exclusão molecular
(A) Cromatografia de Exclusão Molecular (EM) do Veneno de Lachesis muta muta (VLmm) em coluna Sephacryl S-200 (1,0 x 30 cm) pré-equilibrada com tampão de Bicarbonato de amônio (AMBIC) 50 mM, pH 8,0, sob fluxo de 1 mL/min em gradiente isocrático. Desta cromatografia foram eluídas 4 frações, denominadas LmS-1 a LmS-4, respectivamente. Á direita superior, encontra-se o perfil eletroforético das frações sob condições redutoras (SDS-PAGE a 12,5%), onde são observadas uma predominância de proteínas com alta massa molecular (LmS-1 e 2) e de baixa massa molecular (LmS-3 e 4). (B) Atividade fosfolipásica das frações obtidas na cromatografia de EM com o substrato 4N3OBA. 10 µg de amostra foi incubada com 190 µL (298 µM) de substrato por 30 minutos a 37°C, e a absorbância mensurada em 425 nm. Os géis foram corados com Coomassie Blue G250 e os resultados expressos como média ± desvio padrão (n=3) e submetidos à análise de variância (ANOVA) seguidos pelo pós-teste de Tukey. (*) Valores significativos para p<0.05; (#) Estatisticamente diferente do controle negativo.
Tempo
Ab
so
rbâ
nc
ia 2
80
nm
Lmuta VB S200 1 04022014:10_UV1_280nm
0
500
1000
1500
mAU
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 min
41.71
Lmuta VB S200 1 04022014:10_UV1_280nm@01,PEAK1
No Ret Area Height
min mAU*min mAU
1 41.71 3290.9869 407.150
Total number of detected peaks = 50
Total area = 11543.4797 mAU*min
Area in evaluated peaks = 3290.9869 mAU*min
Ratio peak area / total area = 0.285095
Total peak width = 8.63 min
Column height = 30.00 cm
Calculated from : Lmuta VB S200 1 04022014:10_UV1_280nm
Baseline : Lmuta VB S200 1 04022014:10_UV1_280nm@01,BASEM1
Peak rejection on:
Maximum number of peaks: 20
LmS-1
LmS-2
LmS-3 LmS-4
12
17
24
333852
72
kDa PM 1 2 3 4
(A) (B)
Atividade fosfolipásica
C+ C- LmS-1 LmS-2 LmS-3 LmS-40.0
0.1
0.2
0.3
***
**
*** ***
***#
#
#
Absorb
ância
425 n
m
RESULTADOS
51
Na segunda etapa, a fração LmS-3 foi cromatografada em coluna de fase
reversa, onde foram eluídas 6 frações (P1 a P6) (Figura 8A).
Figura 8: Isolamento e caracterização de uma proteína do VLmm desprovida de atividade catalítica
(A) Cromatografia de Fase Reversa (RP) da fração LmS-3 em coluna C18 (Discovery 0,45 x 25 cm 5 µm) utilizando soluções de TFA 0.1% (Eluente A) e ACN 99,9% + TFA 0.1% (Eluente B), sob o fluxo de 1 mL/min e gradiente linear de 0-70% em 10 volumes de coluna, com eluição de 6 frações (P1 a P6). À direita, encontra-se o perfil eletroforético das frações obtidas, onde observa-se apenas uma banda proteica em P6, enquanto as demais frações não possuem bandas visíveis. (B) Recromatografia da fração P6 em RP com obtenção de uma única fração. Ao lado, SDS-PAGE a 15% da proteína isolada. Os géis foram corados com Coomassie Blue G250. (C) Atividade fosfolipásica da proteína isolada com o substrato 4N3OBA, utilizando BthTX-II e água como controles positivo e negativo, respectivamente. Os resultados foram expressos como Média ± Desvio padrão, seguido pela análise de variância por ANOVA e pós-teste de Tukey. (***) Estatisticamente significativo em relação ao controle positivo (p<0,05); (#) Estatisticamente diferente do controle negativo. (D) Determinação da massa molecular da fração P6 por MALDI-TOF, utilizando como matriz de ionização ácido sinapínico. Observa-se um único pico no espectro de massa de 13.889 Da, correspondente a proteína isolada.
Atividade fosfolipásica
C+ C- P60.0
0.2
0.4
0.6
*** ***
#
Ab
so
rbân
cia
425 n
m
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
TOF2 Data: <Untitled>.L17[c] 2 Jul 2014 16:02 Cal: 29 Jun 2007 9:23 Shimadzu Biotech Axima ToF² 2.9.3.20110624: Mode Linear, Power: 94
13890.38
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000
m/z
TOF2 Data: <Untitled>.L17[c] 2 Jul 2014 16:02 Cal: 29 Jun 2007 9:23 Shimadzu Biotech Axima ToF² 2.9.3.20110624: Mode Linear, Power: 94
13890.38
m/z
(C) (D)
Ab
s.
280 n
m
Tempo
%A
CN
Lmuta F2 G75 IN C18 05122013:10_UV1_280nm Lmuta F2 G75 IN C18 05122013:10_Conc
0
500
1000
1500
mAU
0
20
40
60
80
%B
10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 min
P6
P5P4
P3
P2
P1
Lmuta F2 G75 IN C18 05122013:10_UV1_280nm@01,PEAK2
No Ret Area Height
Total number of detected peaks = 298 Total area = 2236.3520 mAU*min Area in evaluated peaks = 0.0000 mAU*min Ratio peak area / total area = 0.000000 Total peak width = 0.00 min Column height = 25.00 cm Calculated from : Lmuta F2 G75 IN C18 05122013:10_UV1_280nm Baseline : Lmuta F2 G75 IN C18 05122013:10_UV1_280nm@01,BASEM Peak rejection on: Maximum number of peaks: 20
19
26
38
46
62
91
120
kDa PM P6 P5 P4 P3 P2 P1
12
17
24
3338
52
72
Lmuta PLA2 ISOLADA IN C18 03042014:10_UV1_280nm Lmuta PLA2 ISOLADA IN C18 03042014:10_Conc
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mAU
0
20
40
60
80
%B
10.0 20.0 30.0 40.0 min
Ab
s.
280 n
mTempo
%A
CN
(A) (B)
13890
RESULTADOS
52
A SDS-PAGE 12,5% em condições redutoras das frações mostrou que a fração
P6 era constituída por uma única banda proteica (~13 kDa) e considerável grau de
pureza, enquanto as demais frações não apresentaram bandas visíveis (Figura 8A). A
avaliação da atividade fosfolipásica da fração P6 mostrou que esta era destituída de
atividade enzimática, pois não houve diferença estatisticamente significativa entre
controle negativo e P6 (Figura 8C), tratando-se, possivelmente, de uma PLA2 homóloga.
A proteína foi recromatografada em fase reversa para averiguar sua pureza, o que foi
confirmada com a eluição de apenas uma fração (Figura 8B) em 36% de Eluente B. A
determinação precisa da massa molecular de P6 foi realizada por espectrometria de
massa, onde a proteína apresentou 13.889 Da e apenas um pico no espectro de massa
(Figura 8D), sendo denominada LmutTX.
4.1.1. Sequenciamento de LmutTX
A estrutura primária de LmutTX foi determinada por duas técnicas: i)
Sequenciamento por degradação de Edman, com a obtenção dos primeiros 57 resíduos
de aminoácidos da região N-terminal da molécula, e ii) Espectrometria de massa,
mediante análise dos espectros de fragmentação dos peptídeos gerados da digestão
enzimática, com a elucidação de 63 resíduos de aminoácidos. Um total de 120 resíduos
foram determinados, completando 98,36% da sequência, com apenas 2 resíduos
localizados na região C-terminal não sequenciados. Os fragmentos obtidos da digestão
enzimática, com suas respectivas regiões na estrutura primária e massas moleculares
teóricas e mensuradas, bem como a acurácia de cada fragmento, estão elencados na
Tabela 2.
A busca por similaridade e alinhamento múltiplo da sequência completa em
banco de dados, mostrou que a proteína apresentava alta identidade com PLA2s
homólogas dos venenos de serpentes do gênero Bothrops, como B. brazili (95,1%), B.
moojeni (92,6%), B. pauloensis (92,4%), B. pirajai, B. leucurus (90,9%) e B. alternatus
(86,8%) (Figura 9). Esta é a primeira descrição de uma PLA2 Lys49 para venenos de
serpentes do gênero Lachesis.
RESULTADOS
53
Tabela 2. Razão massa/carga (m/z) dos fragmentos obtidos no sequenciamento de LmutTX
Número Fragmento
sequenciado
Região Massa
mensurada
Massa
teórica
Acurácia
(ppm) 1 KLTDCDPKKDR 53-63 1374.6925 1374.69 -1.81
2 YSYSWK 64-69 832.3755 832.38 5.40
3 DKTIVCGENNSCLK 70-83 1636.7549 1636.75 -2.99
4 ELCECDK 84-90 952.3630 952.36 -3.15
5 AVAICLR 91-97 801.4531 801.45 -3.86
6 ENLDTYNKK 98-106 1123.5509 1123.55 -0.80
7 YNYLKPFCK 109-117 1231.6060 1231.60 -4.87
8 KADPC 118-122 532.2315 532.23 -2.81
ppm: partes por milhão
RESULTADOS
54
Figura 9: Alinhamento múltiplo da sequência de LmutTX com toxinas de venenos botrópicos
A sequência foi analisada no banco de dados UNIPROT, onde teve alta identidade com PLA2s Lys49 dos venenos de serpentes do gênero Bothrops, como B. brazili (MTX-II: I6L8L6), B. moojeni (MjTX-II: Q9I834), B. pauloensis (BnSP-7: Q9IAT9), B. pirajai (PrTX-II: P82287), B. leucurus (BlK-PLA2: P86975) e B. alternatus (BaTX: P86453), respectivamente. Resíduos destacados em amarelo: resíduos que compõem o sítio de ligação ao cálcio; em azul: resíduo do sítio catalítico (*) alta identidade entre as sequências; (.) um resíduo alterado; (:) dois resíduos alterados. O alinhamento está de acordo Renetseder e colaboradores (1985), utilizando a PLA2 pancreática bovina como padrão.
LmutTX SLVELGKMILQETG-KNPVTSYGAYGCNCGVLGSGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--D-C-----DPKKDRYSYSWKDK
MTX-II SLVELGKMILQETG-KNPAKSYGAYGCNCGVLGRGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--D-C-----DPKKDRYSYSWKDK
MjTX-II SLFELGKMILQETG-KNPAKSYGVYGCNCGVGGRGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--G-C-----DPKKDRYSYSWKDK
BnSP-7 -SFELGKMILQETG-KNPAKSYGAYGCNCGVLGRGQPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--G-C-----DPKKDRYSYSWKDK
PrTX-II SLFELGKMILQETG-KNPAKSYGAYGCNCGVLGRGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--G-C-----NPKKDRYSYSWKDK
Blk-PLA2 SLFELGKMILQETG-KNSVKSYGVYGCNCGVGGRGKPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--G-C-----DPKKDRYSYSWKDK
BaTX SLFELGKMILQETG-KNPAKSYGAYYCYCGWGGQGQPKDATDRCCYVHKCCYKKLT--G-C-----NPKKDRYSYSWKDK
.*********** ** ..***.* * ** * *:******************** . * :*************
% Identity
LmutTX TIVC-GENNSCLKELCECDKAVAICLRENLDTYNKK--YNYL-KPFCKKADPC
MTX-II TIVC-GENNSCLKELCECDKAVAICLRENLDTYNKKYRNNHL-KPFCKKADPC 95.1
MjTX-II TIVC-GENNSCLKELCECDKAVAICLRENLDTYNKKYRYNYL-KPFCKKADPC 92.6
BnSP-7 TIVC-GENNPCLKELCECDKAVAICLRENLGTYNKKYR-YHL-KPFCKKADPC 92.4
PrTX-II TIVC-GENNPCLKELCECDKAVAICLRENLGTYNKKYR-YHL-KPFCKKADDC 90.9
Blk-PLA2 TIVC-GENNPCLKELCECDKAVAICLRENLGTYNKKYR-YHL-KPFCKKADPC 90.9
BaTX TIVC-GENNSCLKELCECDKAVAICLRENLNTYNKKYR-YYL-KPLCKKADAC 86.8
**** **** ********************.****** :* **:***** *
15 28
85
52
99 123
57-5832 48-49 62-66 73
RESULTADOS
55
4.1.2. Desenho e síntese de peptídeos oriundos da sequência de LmutTX
Como muitos trabalhos com PLA2s homólogas vêm sugerindo o envolvimento de
regiões específicas da proteína na perturbação de membranas biológicas, foram
desenhados e sintetizados 6 peptídeos, 3 idênticos (PEP 1C – região C-terminal; PEP
3N – região N-terminal; PEP 5 – região compreendendo os resíduos 41-52) e 3
modificados da sequência original do peptídeo (PEP 2Cm, PEP 4Nm e PEP 6), com base
no número de cargas e no grau de hidrofobicidade.
4.1.3. Modelagem molecular de LmutTX
A modelagem por homologia produz resultados razoáveis com base no
pressuposto de que as estruturas terciárias de duas proteínas serão semelhantes se suas
sequências estiverem relacionadas (KROEMER et al., 1996). Para avaliar a validade de
4DCF como um modelo estrutural para modelagem de LmutTX foi examinado a
homologia das sequências. O alinhamento de LmutTX forneceu 95% de identidade com
4DCF. O percentual de resíduos encontrados em regiões favoráveis do gráfico de
Ramachandran (RAMACHANDRAN; RAMAKRISHNAN; SASISEKHARAN, 1963) é um
dos melhores guias para verificar a qualidade estereoquímica de um modelo de proteína
baseado no pressuposto que um bom modelo deve ter mais de 90% dos resíduos em
regiões permitidas (LASKOWSKI et al., 1993). A análise do gráfico de Ramachandran ou
a estrutura de ambos os modelos de LmutTX mostraram que mais de 90,4% dos
aminoácidos estão em regiões favoráveis. A qualidade do modelo foi também avaliada
pela comparação da estrutura predita com o modelo estrutural via sobreposição e desvios
RMS de posições atômicas (RMSD). O traço RMSD do Cα entre LmutTX e o modelo é
de 0,52 Å. Para construir o modelo dimérico foi utilizado o modelo 1IJL. A estrutura
monomérica de LmutTX foi sobreposta nos monômeros A e B do molde. Duas
minimizações foram realizadas. Primeiro com 100 etapas com o método “descida mais
acentuada”, seguido pelas 100 etapas do método “gradiente conjugado”. O traço RMSD
do Cα entre LmutTX dimérica e o modelo dimérico de 1IJL é 0,94 Å. Assim, os modelos
são razoavelmente bons e bastante semelhantes ao molde.
RESULTADOS
56
Figura 10: Modelagem molecular por homologia de LmutTX
A conformação dimérica de LmutTX foi construída a partir das estruturas cristalográficas de MTX-II de B. brazili (PDB: 4DCF) e uma PLA2 ácida de D. acutus (PDB: 1IJL). Observa-se a conservação das estruturas secundárias da toxina dentro do Grupo IIA das PLA2s secretadas. Monômero A: azul; monômero B: rosa. Em destaque, resíduos de ambos os monômeros localizados na interfase dimérica.
O modelo estrutural de LmutTX apresentou todas as estruturas secundárias
conservadas para as PLA2s do Grupo IIA, como a hélice N-terminal (α1), as duas hélices
longas antiparalelas (α2 e α3), a hélice curta, as duas folhas-β antiparalelas (β-wing) e a
região C-terminal (Figura 10), bem como evidencia alguns resíduos de aminoácidos
localizados na interfase dimérica envolvidos, possivelmente, nas interações não-
covalentes para estabilização do dímero, como Asn16, Tyr109, Leu110 e Lys111 (que
correspondem aos Asn17, Tyr121, Leu122 e Lys123 segundo o sistema de numeração
proposto por Renetseder e colaboradores (1985)).
β-wingHélice curta
Hélice α1
Hélice α3
Hélice α2
Loop de ligação ao Ca2+
RESULTADOS
57
4.2. Caracterização funcional de LmutTX
4.2.1. Citotoxicidade do VLmm, LmutTX e peptídeos sintéticos sobre células C2C12
diferenciadas em miotubos
Para avaliar o efeito citotóxico do VLmm, LmutTX e peptídeos sintéticos, utilizou-
se uma linhagem de mioblastos murinos (C2C12) diferenciadas em miotubos e diferentes
concentrações de amostra. O VLmm foi citotóxico em todas as concentrações testadas,
tendo ação máxima a partir de 10 µg/poço (Figura 11A), enquanto LmutTX somente a
partir de 40 µg/poço (Figura 11B). Os peptídeos apresentaram baixa citotoxicidade sobre
as células, atingindo aproximadamente 30% de dano celular máximo em 120 µg/poço
com o peptídeo PEP 2Cm (Figura 11D). Os demais tiveram porcentagens abaixo de 20%
para as outras concentrações (Figura 11C, E, F, G e H).
RESULTADOS
58
Figura 11: Citotoxicidade em células C2C12 diferenciadas em miotubos
O VLmm (A), a toxina isolada (B) e os peptídeos sintéticos (C, D, E, F, G e H) foram incubados com células C2C12 diferenciadas em miotubos por 3 horas em diferentes concentrações de amostra, para um volume final de 200 µL/poço. Controles de 0% e 100% de toxicidade consistiu em meio celular e Triton X-100, respectivamente. Após 3 horas de incubação, alíquotas de 150 µL do sobrenadante foram coletados para determinação da atividade de Desidrogenase láctica (LDH), liberada a partir de danos celulares. A atividade foi realizada em triplicata de poços, para três experimentos individuais. (*) Estatisticamente significativo em relação ao controle positivo (Triton X-100 0,1%) para p<0,05. Controle negativo (C-): meio de cultura celular.
A B
C D
E F
G H
Células C2C12 - VLmm
C- 60 40 20 10 50
20
40
60
80
100
120
***
***
*** *** ***
concentração g/poço
% L
ibera
ção
deL
DH
Células C2C12 - LmutTX
C- 60 40 200
20
40
60
80
100
***
***
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP1C
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
concentração g/poço
*** **
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP2Cm
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
****** *
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP3N
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
*** *** ***
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP4Nm
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
**
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP5
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
***
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
Células C2C12 - PEP6
C- 120 60 30 15 7,50
20
40
60
80
100
* *
concentração g/poço
% L
ibera
ção
de L
DH
RESULTADOS
59
4.2.2. Atividade hemolítica dos peptídeos sintéticos de LmutTX
Para verificar se os peptídeos derivados de LmutTX poderiam causar hemólise,
estes foram testados na concentração de 600 µg/mL (120 µg/ poço) em suspensão de
hemácias. Observa-se na figura que nenhum dos peptídeos foram hemolíticos, pois não
houve diferença estatística entre o controle negativo e os peptídeos (Figura 12).
Figura 12: Atividade de hemólise dos peptídeos derivados de LmutTX
C-
C+
PEP
1C
PEP
2Cm
PEP
3N
PEP
4Nm
PEP
5
PEP
6
0
20
40
60
80
100***
# # # # # # #
% H
em
óli
se
Os peptídeos foram incubados numa suspensão de hemácias a 4% na concentração única de 600 µg/mL por 1 hora, com um volume final de 200 µL. Controles de 0 e 100% de hemólise consistiu de PBS e Triton X-100 0,1%, respectivamente. Após este período, as alíquotas foram centrifugadas e os sobrenadantes coletados para mensurar a liberação de hemoglobina em 540 nm. A atividade foi realizada em triplicata de poços a partir de dois experimentos individuais. ***Estatisticamente diferente do controle negativo. #Estatisticamente diferente do controle positivo para p<0,05. C-: controle negativo (PBS). C+: controle positivo (Triton X-100 0,1%).
4.2.3. Atividade antiparasitária sobre diferentes protozoários de importância médica
O VLmm, as frações da cromatografia de exclusão molecular (LmS-1 a LmS-4) e
a toxina LmutTX foram testados sobre cepas de Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum
e Plasmodium falciparum. O VLmm mostrou-se efetivo contra formas epimastigotas de
T. cruzi, inibindo completamente o crescimento destes parasitas na concentração de 12,5
µg/mL (Figura 13A), contudo esta mesma atividade não ocorreu com formas
promastigotas de L. infantum, onde o IC50 foi de 100 µg/mL (Figura 13B). Uma ação
RESULTADOS
60
significativa também foi observada para P. falciparum, onde o VLmm apresentou um IC50
de 0,11 µg/mL (Tabela 3).
Figura 13: Atividade leishmanicida e tripanocida do VLmm, frações e LmutTX
Diferentes concentrações de VLmm (1,6 a 100 µg/mL) e frações/ LmutTX (PLA2) (100 µg/mL) foram incubadas com formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (Clones CL-B5) (A, C) e promastigotas de Leishmania infantum (MCAN/ES/92/BCN83) (B, D). Após o período de incubação, as placas foram lidas em 595 nm e o percentual de inibição do crescimento dos parasitas determinado. O ensaio foi realizado em triplicata. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n=5) e submetidos à análise de variância (ANOVA) seguido pelo pós-teste de Tukey (*) Valores significativos quando comparados com o grupo controle (p<0,05).
As frações LmS-1, LmS-2 e LmS-4 inibiram aproximadamente 30% do
crescimento de T. cruzi na concentração teste de 100 µg/mL (Figura 13C); uma atividade
semelhante foi observada sobre L. infantum com as mesmas frações (Figura 13D), não
sendo possível desta maneira determinar o IC50. A cepa de P. falciparum, porém,
mostrou-se mais sensível a ação das frações (incluindo LmS-3), as quais apresentaram
Trypanosoma cruzi - VLmm
0
20
40
60
80
100
C+ 1,6 3,12 6,25 12,5 25 50 100
Concentração g/mL
*
*
*
Ativid
ad
e a
nti-e
pim
astig
ota
s (
%)
Leishmania infantum - VLmm
0
20
40
60
80
100
C+ 1,6 3,12 6,25 12,5 25 50 100
Concentração g/mL
* **
** *
*
Ativid
ad
e a
nti-p
rom
astig
ota
s (
%)
Trypanosoma cruzi - Frações
0
20
40
60
80
100
C+ LmS-1 LmS-2 PLA2 LmS-4
* * *
100 g/mL
Ativid
ad
e a
nti-e
pim
astig
ota
s (
%)
Leishmania infantum - Frações
0
20
40
60
80
100
C+ LmS-1 LmS-2 PLA2 LmS-4
* * *
100 g/mL
Ativid
ad
e a
nti-p
rom
astig
ota
s (
%)
A B
C D
RESULTADOS
61
IC50 entre 0,11 a 12,79 µg/mL (Tabela 4). LmutTX não teve atividade contra as formas
epimastigotas e promastigotas de T. cruzi e L. infantum, respectivamente (Figura 13C e
D), mas exibiu ação contra P. falciparum, obtendo um IC50 de 105 µg/mL (Tabela 3).
Tabela 3. Resultados de IC50 do VLmm, frações e LmutTX contra cepa de P. falciparum
W2
Amostra IC50
VLmm 0,11 µg/mL
LmS-1 0,36 µg/mL
LmS-2 0,25 µg/mL
LmS-3 0,42 µg/ mL
LmS-4 12,79 µg/mL
LmutTX 105 µg/mL
Artemisinina 0,0071 µg/mL
4.2.4. Atividade antibiofilme do VLmm, frações e LmutTX
Na avaliação da atividade antibiofilme, o VLmm reduziu em mais de 90% a
formação de biofilme de S. epidermidis (Figura 14A), enquanto que de S. aureus houve
inibição de 80% (Figura 14B). Das frações avaliadas, LmS-1 inibiu completamente a
formação de biofilme de S. epidermidis e ~80% de S. aureus. As demais frações (LmS-2
e LmS-4) inibiram ~50-70% em ambas as cepas. LmutTX também inibiu a formação de
biofilme na concentração teste de 100 µg/mL, com ~50% e ~70% para S. epidermidis e
S. aureus, respectivamente (Figura 14A e B).
RESULTADOS
62
Figura 14: Avaliação da atividade antibiofilme de VLmm, frações e LmutTX
O VLmm, as frações e a toxina LmutTX foram incubados com cepas de (A) S. epidermidis e (B) S. aureus na concentração de 100 µg/mL por 24 horas. A inibição da formação de biofilme foi avaliada pela camada de biofilme corada com cristal violeta 0,4%. O ensaio foi realizado em triplicata de dois experimentos individuais, e os resultados expressos como média ± desvio padrão, seguido pela análise de variância (ANOVA) e pós-teste de Tukey para p<0,05. ***Estatisticamente diferente do controle positivo (vancomicina).
4.2.5. Atividade antibacteriana de LmutTX e peptídeos sintéticos sobre diferentes
bactérias gram-positivas e gram-negativas
Para verificar a ação antibacteriana de LmutTX, esta foi testada sobre cepas
gram-positivas (S. aureus e MRSA) e gram-negativas (E. coli, P. aeruginosa e K.
pneumoniae) na concentração de 12,5 µg/mL nos períodos de 24 e 48 horas. A inibição
do crescimento bacteriano pela toxina alcançou aproximadamente 60% para S. aureus e
MRSA; ~35% para P. aeruginosa em 24 horas, atingindo 50% em 48 horas; e ~30% para
K. pneumoniae em ambos os períodos de incubação (Figura 15). LmutTX não foi capaz
de inibir o crescimento de E. coli na concentração testada.
Staphylococcus epidermidis
C+ VLmm LmS-1 LmS-2 LmutTX LmS-40
20
40
60
80
100
***
*** ***
***
100 g/mL
% F
orm
ação d
e B
iofil
me
Staphylococcus aureus
C+ VLmm LmS-1 LmS-2 LmutTX LmS-40
20
40
60
80
100
***
*** ******
100 g/mL
% F
orm
ação d
e B
iofil
me
A B
RESULTADOS
63
Figura 15: Atividade antibacteriana de LmutTX sobre diferentes bactérias nos períodos de 24 e 48 horas
SA
SA
MRSA P
AKP
EC
SA
MRSA P
AKP
EC
0
20
40
60
80
100
Imipenem
******
******
*** ***
***
***
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
O potencial antibacteriano de LmutTX foi testado sobre diferentes cepas de bactérias na concentração única de 12,5 µg/mL nos períodos de 24 e 48 horas, utilizando Imipenem como antibiótico controle. A absorbância foi mensurada em 630 nm e os resultados expressos como média ± Desvio padrão, seguido pela análise de variância por ANOVA e pós-teste de Tukey considerando o nível de significância para p<0,05. SA: Staphylococcus aureus ATCC 29213; MRSA: S. aureus resistente a meticilina; PA: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; KP: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; EC: Escherichia coli ATCC 25922.
Como as cepas mais sensíveis à ação de LmutTX foram S. aureus, MRSA e P.
aeruginosa, estas foram selecionadas para avaliação da atividade antimicrobiana com os
peptídeos sintéticos. Dos peptídeos N-terminal (PEP3N e PEP4Nm), somente PEP3N
inibiu o crescimento de S. aureus, com ~30% de inibição em 24 horas e ~45% em 48
horas (Fig. 16C), enquanto que o PEP4Nm (modificado) não apresentou atividade
significativa nas concentrações testadas (Fig. 16D). Resultados similares foram
observados para os demais peptídeos, como PEP1C e PEP2Cm (C-terminal) (Fig. 16A e
B) e PEP5 e PEP6 (segmento 41-52) (Fig. 16E e F) que inibiram de 20 a 40% em ambos
os períodos.
Sobre P. aeruginosa, somente os peptídeos PEP2Cm e PEP3N apresentaram
atividade inibitória significativa. PEP2Cm inibiu completamente o crescimento dessas
RESULTADOS
64
cepas na concentração de 125 µg/mL e ~90% em 62,5 µg/mL em 24 horas, mantendo
aproximadamente 80% desta atividade no período de 48 horas (Fig. 16H). PEP3N inibiu
~50% do crescimento de P. aeruginosa nas concentrações de 125 e 62,5 µg/mL em 24
horas, diminuindo em 10% esta ação em 48 horas (Figura 16I).
MRSA mostrou-se mais sensível à ação dos peptídeos PEP1C, PEP2Cm e
PEP4Nm, porém em proporções diferentes. PEP1C inibiu 60% destas cepas nas
concentrações de 125 e 62,5 µg/mL em 24 horas (Fig. 16N), enquanto PEP2Cm inibiu
completamente seu crescimento nas concentrações de 125 a 15,6 µg/mL e ~95% em 7,8
µg/mL no período de 24 horas, mantendo esta ação por 48 horas na concentração mínima
(15,6 µg/mL) (Figura 16O). O peptídeo PEP 4Nm inibiu aproximadamente 90% do
crescimento de MRSA em 125 e 62,5 µg/mL, conservando 80% desta atividade num
período mais prolongado.
RESULTADOS
65
Figura 16: Atividade antimicrobiana dos peptídeos derivados de LmutTX sobre cepas Gram-positiva e Gram-negativa nos períodos de 24 e 48 horas
A B
C D
E F
Os peptídeos foram diluídos nas concentrações de 125; 62,5; 31,2; 15,6 e 7,8 µg/mL e incubados com S. aureus ATCC 29213, MRSA e P. aeruginosa ATCC 27853 nos períodos de 24 e 48 horas e a absorbância mensurada em 630 nm. Como controle positivo foi utilizado cloranfenicol. O ensaio foi realizado em triplicata, de três experimentos individuais e os resultados expressos como Média ± Desvio padrão, seguido pela análise de variância por ANOVA e pós-teste de Tukey para p<0,05. (*) em relação ao controle de crescimento.
S. aureus - PEP1C
0
20
40
60
80
100
** *** *** *****
*** ******
******
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
S. aureus - PEP2Cm
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
** ** *****
******
****** ***
***
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
S. aureus - PEP3N
0
20
40
60
80
100
****** ***
******
***
******
***
***
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
S. aureus - PEP4Nm
0
20
40
60
80
100
* * *
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
S. aureus - PEP5
0
20
40
60
80
100
*** ** *
*
******
******
**
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
S. aureus - PEP6
0
20
40
60
80
100
*** **
*
***** ** **
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
24 horas 48 horas
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
RESULTADOS
66
G H
I J
L M
Os peptídeos foram diluídos nas concentrações de 125; 62,5; 31,2; 15,6 e 7,8 µg/mL e incubados com S. aureus ATCC 29213, MRSA e P. aeruginosa ATCC 27853 nos períodos de 24 e 48 horas e a absorbância mensurada em 630 nm. Como controle positivo foi utilizado cloranfenicol. O ensaio foi realizado em triplicata, de três experimentos individuais e os resultados expressos como Média ± Desvio padrão, seguido pela análise de variância por ANOVA e pós-teste de Tukey para p<0,05. (*) em relação ao controle de crescimento.
P. aeruginosa - PEP1C
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
P. aeruginosa - PEP2Cm
0
20
40
60
80
100
***
24 horas 48 horas
******
***125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
P. aeruginosa - PEP3N
0
20
40
60
80
100
****** *
**
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
P. aeruginosa_PEP4Nm
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
P. aeruginosa_PEP5
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
P. aeruginosa_PEP6
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
RESULTADOS
67
N O
P Q
R S
Os peptídeos foram diluídos nas concentrações de 125; 62,5; 31,2; 15,6 e 7,8 µg/mL e incubados com S. aureus ATCC 29213, MRSA e P. aeruginosa ATCC 27853 nos períodos de 24 e 48 horas e a absorbância mensurada em 630 nm. Como controle positivo foi utilizado cloranfenicol. O ensaio foi realizado em triplicata, de três experimentos individuais e os resultados expressos como Média ± Desvio padrão, seguido pela análise de variância por ANOVA e pós-teste de Tukey para p<0,05. (*) em relação ao controle de crescimento.
MRSA - PEP1C
0
20
40
60
80
100
24 horas 48 horas
***
***
*****
****
**
***
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
MRSA - PEP2Cm
0
20
40
60
80
100
120
*** *** *** ******
*** *** *** ***
***
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
MRSA - PEP3N
0
20
40
60
80
100
*
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
MRSA - PEP4Nm
0
20
40
60
80
100
***
***
*
***
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
*** ***
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
MRSA - PEP5
0
20
40
60
80
100
*
125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
MRSA - PEP6
0
20
40
60
80
100125 g
62,5 g
31,2 g
15,6 g
7,8 g
Cloranfenicol
24 horas 48 horas
% In
ibiç
ão
bacte
rian
a
DISCUSSÃO
68
5. DISCUSSÃO
A busca por moléculas farmacologicamente úteis para a população, evidenciou
a riqueza da flora e fauna como verdadeiras fontes naturais para o desenvolvimento de
novos medicamentos. Dentre os recursos da biodiversidade, os venenos de serpentes
mostram-se propícios a descoberta de compostos ou atividades biológicas com potencial
terapêutico, pela variedade de proteínas, enzimas e peptídeos. Apesar do alto custo
temporal e financeiro até o desenvolvimento de um protótipo-líder de biofármaco, a
caracterização desses venenos é a porta de entrada para possíveis aplicações
biotecnológicas. Poucas proteínas foram isoladas dos venenos de Lachesis muta muta,
o que permite a identificação de moléculas, comuns a outros gêneros, porém
desconhecidas para essas.
Este trabalho descreve pela primeira vez, o isolamento e a caracterização de uma
PLA2 homóloga a partir do veneno de L. m. muta, denominada LmutTX. A purificação da
proteína seguiu metodologias comumente utilizadas para obtenção de PLA2s Asp49 dos
venenos laquéticos, como LmTX-I, LmTX-II, LM-PLA2-I e LM-PLA2-II, que consistem de
uma cromatografia de exclusão molecular (1ª etapa) e uma cromatografia de fase reversa
(2ª etapa) (DAMICO et al., 2006; FULY et al., 2002). A grande variabilidade na expressão
dessas proteínas nos venenos do gênero Lachesis (SANZ et al., 2008) pode ter sido um
dos fatores que dificultou sua purificação prévia, bem como sua identificação por estudos
transcriptômicos (JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO et al., 2006). Análise proteômica realizada
por Sanz e colaboradores (2008) com diferentes espécimes de Lachesis muta, identificou
num dos venenos um fragmento peptídico com sequência similar a PLA2s Lys49,
demonstrando que estas proteínas não estão ausentes nesses venenos, mas que de
alguma maneira não são identificadas em todos os venenos de Lachesis, o que valida os
resultados obtidos com LmutTX.
Esta proteína de 13.889 Da e destituída de atividade fosfolipásica sobre substrato
artificial, apresentou alta identidade com PLA2s homólogas dos venenos botrópicos,
diferindo apenas em 5 resíduos (Val19, Thr20, Ser34, Tyr119 e Tyr121), além de 2 não
sequenciados (posições 117 e 118). Os resíduos que formam o sítio ativo (His48, Asp99,
Tyr52 e Tyr73) encontram-se conservados, bem como as substituições de Tyr28→Asn,
Gly32→Leu e Asp49→Lys que impossibilita a coordenação ao Ca2+. As estruturas
DISCUSSÃO
69
secundárias e terciárias mostram-se conservadas dentro do grupo IIA das PLA2s
secretadas (ARNI; WARD, 1996; FERNANDES et al., 2013). Alguns resíduos de
aminoácidos como Asn16, Tyr109, Leu110 e Lys111 foram evidenciados na modelagem
molecular de LmutTX como possíveis sítios de interação interfacial entre os dois
monômeros. Alguns desses resíduos (Asn16 e Tyr109) foram observados em outras
estruturas, como PrTX-I e BthTX-I complexadas com ligantes, onde Asn16-Tyr109 e
Tyr109-Tyr109 são mantidas por ligações de hidrogênio (SANTOS; SOARES; FONTES,
2009).
Analisando a sequência de LmutTX e correlacionando-a com as características
estruturais das PLA2s homólogas discutidas anteriormente, observa-se que muitos
resíduos pertencentes ao canal hidrofóbico ou a região C-terminal dispostos na interface
dimérica, são pouco conservados, podendo variar de espécie para espécie. Por exemplo,
os resíduos Lys20 e Lys122 que poderiam complementar o “sítio de Docking na
membrana (MDoS)” (FERNANDES et al., 2013) não estão presentes em LmutTX (apenas
Lys123), assim como Phe121 e Phe124 responsáveis pela formação do nó hidrofóbico
na região C-terminal (AMBRÓSIO et al., 2005), somente Phe125. Essa variação na região
C-terminal é descrita por Fernandes e colaboradores (2013), onde a sobreposição das
estruturas de BbTX-II e MTX-II revelaram que as principais diferenças entre elas estão
localizadas no loop de ligação ao Ca2+ e na região C-terminal. Esses dois locais
juntamente com o sítio ativo e o canal hidrofóbico formam a superfície de contato, ligação
e perturbação das membranas celulares. Modificações nessa região pode distinguir
funcionalmente uma proteína da outra. A análise de estruturas cristalográficas também
mostra diferenças no sítio de ligação ao substrato (AMBROSIO et al., 2005; DELATORRE
et al., 2011; DOS SANTOS; SOARES; FONTES, 2009; HOLLAND et al., 1990; MARCHI-
SALVADOR et al., 2009), sugerindo que, apesar da alta identidade em suas sequências
e a conservação da estrutura secundária e terciária, alterações em resíduos chaves
podem fazer com que as PLA2s apresentem diferentes graus de toxicidade.
Kini e colaboradores (2003) relatam que a variação nos efeitos tóxicos das PLA2s
baseia-se nas diferenças de penetrabilidade da proteína em membranas. Este efeito
pode ser resultado de mutações em resíduos importantes para a interação com a
membrana ou com ligantes. Um exemplo é a toxina BthTX-II (uma PLA2 Asp49 isolada
DISCUSSÃO
70
do veneno de B. jararacussu) que apresenta baixa atividade enzimática, devido ao fato
da cadeia lateral da Tyr28 estar posicionada ao lado oposto em relação ao mesmo
resíduo em outras PLA2s Asp49, dificultando a coordenação do Ca2+ (CORRÊA et al.,
2008). Essa mesma característica pode ser expandida para as PLA2s Lys49 cuja região
C-terminal é bastante variável (FERNANDES et al., 2010), de modo que pequenas
alterações podem facilitar ou não a perturbação das bicamadas.
As PLA2s Lys49 induzem mionecrose por mecanismos independentes da
hidrólise de fosfolipídios (FERNÁNDEZ et al., 2013). A perturbação da bicamada pode
desencadear, como consequência, o influxo de Ca2+ e a liberação de K+ e ATP para o
meio extracelular (CINTRA-FRANCISCHINELLI et al., 2009, 2010), que pode envolver a
participação de receptores purinérgicos estimulados por moléculas de ATP liberadas,
aumentando a extensão do dano tecidual. Diversos mecanismos vêm sendo propostos
para explicar sua ação tóxica sobre membranas celulares (AMBRÓSIO et al., 2005;
SANTOS et al., 2009; FERNANDES et al., 2013), contudo compreender a relação
estrutura-função destas toxinas tão peculiares não é tarefa simples. Por isso, a utilização
de modelos celulares in vitro proporciona novas possibilidades para o estudo de seu
mecanismo miotóxico e citotóxico (ANGULO; LOMONTE, 2005; VILLALOBOS et al.,
2007).
Na avaliação da citotoxicidade in vitro sobre células C2C12 diferenciadas em
miotubos, LmutTX foi citotóxica a partir de 40 µg/poço, concentração acima da
encontrada para BthTX-I (PLA2 Lys49 de B. jararacussu), que em 20 µg/poço diminui
60% da viabilidade dessas células (dados não mostrados), contudo LmutTX foi similar a
algumas miotoxinas avaliadas por Lomonte e colaboradores (1999). Os autores
observaram que as 14 PLA2s avaliadas, incluindo representantes de Bothrops,
Trimeresurus, Agkistrodon e Crotalus, mostraram uma rápida atividade citotóxica sobre
miotubos C2C12 que em células endoteliais. As concentrações de 20 e 80 µg/poço
usadas nos experimentos foram suficientes para induzir citotoxicidade sobre miotubos,
porém nem todas as miotoxinas apresentaram o mesmo grau de toxicidade na
concentração de 20 µg/poço, como observado para LmutTX.
Diferenças também foram observadas para Mt-II (Lys49) de B. asper e LmTX-I
(Asp49) de L. m. muta, onde Mt-II foi citotóxica a partir de 10 µg/poço, enquanto LmTX-I
DISCUSSÃO
71
não afetou a viabilidade das células em nenhuma das concentrações testadas (10 a 40
µg/poço) (VILLALOBOS et al., 2007; DAMICO et al., 2007). Há um certo grau de diferença
nas atividades tóxicas induzidas por PLA2s Lys49, dependendo do tipo celular. O que
torna estas proteínas com sequências e estruturas tão semelhantes, serem distintas em
seu modo de ação dependendo da célula? Mudanças conformacionais? Sítios de
interação mais favoráveis as suas particularidades na célula alvo? Receptores? A
diferença de citotoxicidade observada para LmutTX pode ser devida a alterações de
resíduos presentes na rede catalítica, como os citados acima, que dificultaram sua
atividade em miotubos C2C12 na concentração mínima.
A ação citolítica das PLA2s Lys49 não se restringe a células musculares, mas se
expande a outros tipos celulares, como células endoteliais (LOMONTE et al., 1994),
macrófagos (TONELLO et al., 2012), linfócitos (MARCUSSI et al., 2013) e células de
linhagens tumorais (GEBRIM et al., 2009; SOBRINHO et al., 2016), sugerindo um
mecanismo pouco seletivo, mas inerente as suas características estruturais.
Os peptídeos sintéticos de LmutTX também foram avaliados em miotubos
C2C12, porém não apresentaram efeito citotóxico significativo quando comparados a
proteína inteira. Apenas PEP2Cm foi capaz de diminuir 30% da viabilidade celular na
maior concentração analisada (120 µg/poço). Lomonte e colaboradores (1999) relataram
o aumento nas atividades de dano a membrana em células endoteliais (tEnd) e
procarióticas (E. coli) e na miotoxicidade in vivo do peptídeo p115-W3 com 3 substituições
de Tyr→Trp. Segundo os autores, o dano na membrana provocado por peptídeos
desenhados a partir do segmento 115-129 de PLA2s homólogas depende de seu caráter
anfipático. Por isso, as modificações realizadas em p115-W3 aumentaram sua ação
citotóxica e mimetizaram os efeitos tóxicos da proteína nativa. Apesar das modificações,
p115-W3 não foi hemolítico, assim como os peptídeos descritos no presente trabalho.
Nenhum dos peptídeos C-terminais de PLA2s Lys49 estudados até o momento
apresentaram atividade hemolítica (LOMONTE; ÂNGULO; MORENO, 2010; SANTOS-
FILHO et al., 2015).
Alguns dos peptídeos 115-129 são mais ativos que outros, apresentando
diferenças na citotoxicidade in vitro e na miotoxicidade in vivo (NÚNEZ; ANGULO;
LOMONTE, 2001), contudo podem ter suas atividades abolidas quando suas sequências
DISCUSSÃO
72
de aminoácidos são randomicamente posicionados, demonstrando a importância de uma
distribuição espacial que favoreça a ligação e a perturbação das membranas biológicas
(LOMONTE; ANGULO; SANTAMARÍA, 2003). Estudos de mutagênese sítio dirigida de
alguns aminoácidos presentes nas PLA2s homólogas de serpentes (como por exemplo,
Lys, Phe, His, Tyr, Leu, Arg e Asp, em diversas partes da molécula, por Alanina) mostram
que os determinantes estruturais dos efeitos biológicos (miotoxicidade, citotoxicidade,
atividade antimicrobiana e danos na membrana de lipossomas) induzidos pelas toxinas
estão localizados majoritariamente na região C-terminal (CHIOATO et al., 2007),
confirmando os resultados obtidos com peptídeos sintetizados a partir desse segmento.
Peptídeos C-terminais derivados de PLA2s Lys49 também apresentam
citotoxicidade sobre diferentes linhagens de células tumorais oriundas de leucemia
linfoide (Jurkat), adenocarcinoma (SKBR3), melanoma (B16F10), sarcoma (S180)
(GEBRIM et al., 2009), mieloma (P3X) e de mama (EMT6) (ARAYA; LOMONTE, 2007),
além de uma ampla atividade sobre células bacterianas. Essa mesma região em
BpirPLA2-I, uma PLA2 Asp49 ácida de B. pirajai, é responsável pela atividade
antiplaquetária apresentada pela proteína inteira, contudo esse segmento é rico em
aminoácidos aniônicos e hidrofílicos, ao contrário dos encontrados em PLA2 Lys49
(TEIXEIRA et al., 2011). Muitas atividades biológicas de determinadas proteínas estão
relacionadas a pequenas porções da molécula, por isso a identificação e a caracterização
dessas regiões são etapas fundamentais para a prospecção de novos agentes com
potencial terapêutico.
A região C-terminal de PLA2s Lys49 compreende uma combinação variável de
resíduos catiônicos e hidrofóbicos, próprios de muitas classes de AMPs (BROGDEN,
2005). As propriedades estruturais e físico-químicas dos AMPs desempenham um papel
essencial na determinação da especificidade por células alvo. Esses peptídeos podem
ter estruturas secundárias de α-hélice, folha-β com uma ou várias pontes dissulfeto, alças
ou formas estendidas; apresentam carga superficial de 2+ a 9+, formada por resíduos de
lisina ou arginina, e porções substanciais de resíduos hidrofóbicos. Peptídeos aniônicos
ou constituídos por aminoácidos incomuns são descritos (PUSHPANATHAN;
GUNASEKARAN; RAJENDHRAN, 2013). Essa diversidade de formas, tamanhos, cargas
DISCUSSÃO
73
e hidrofobicidade possibilita um amplo espectro de atividades sobre microrganismos
patogênicos.
Na avaliação antimicrobiana de LmutTX, a proteína não apresentou atividade
significante sobre os protozoários testados. Resultados similares foram obtidos por Costa
Torres e colaboradores (2010), onde a toxina BmarPLA2 (PLA2 Lys49 de B. marajoensis)
não teve ação contra cepas de Leishmania amazonensis e L. chagasi. Ao contrário das
PLA2s Asp49 que por agirem diretamente sobre os fosfolipídios de membranas
biológicas, podem induzir a morte numa variedade de parasitas, as PLA2s Lys49
necessitam, com base em dados experimentais e mecanismos de ação propostos (DÍAZ
et al., 2001; FERNANDES et al., 2013), de domínios favoráveis na bicamada (fosfolipídios
aniônicos) para sua atividade. Nisso, as bactérias mostram-se propícias, pois apresentam
pelo menos 15% de lipídios aniônicos (fosfatidilglicerol e cardiolipina), juntamente com
lipopolissacarídeos (LPS) e ácidos lipoteicoicos (LTA) ou peptideoglicanos, que
proporcionam a seletividade de muitos agentes antimicrobianos catiônicos (EPAND;
EPAND, 2009).
Na atividade de antibiofilme, tanto as frações quanto LmutTX inibiram
significativamente a formação do biofilme de S. epidermidis e S. aureus, mostrando uma
maior ação por este tipo de patógeno. Estudos recentes publicaram o isolamento de uma
Lectina tipo C de B. jararacussu com atividade antibiofilme. A proteína foi capaz de
promover o rompimento e prevenir a formação dos biofilmes de S. epidermidis e S.
aureus, sem afetar o crescimento das bactérias, possivelmente pela interação com
domínios de reconhecimento a carboidratos presentes no biofilme de ambas as cepas
(KLEIN et al., 2015).
LmutTX mostrou atividade contra cepas bacterianas gram-negativas e gram-
positivas. A ação antibacteriana de PLA2s homólogas é bem descrita, como para BnuTX-
I (B. n. urutu) com atividade sobre P. aeruginosa (CORRÊA et al., 2016); MTX-II (B.
brazili) sobre E. coli (COSTA et al., 2008); CoaTX-II (C. o. abyssus) sobre P. aeruginosa,
E. coli e S. aureus (ALMEIDA et al., 2016); e MjTX-II sobre E. coli (STÁBELI et al., 2006).
Estas toxinas afetam a integridade da membrana celular por mecanismos independentes
da hidrólise de fosfolipídios, causando efeitos tóxicos irreparáveis pela célula (SAMY;
SETHI; LIM, 2016).
DISCUSSÃO
74
Dentre os peptídeos sintéticos de LmutTX testados neste trabalho, o PEP2Cm
inibiu 100% do crescimento bacteriano das cepas de P. aeruginosa (125 µg/mL) e MRSA
(15,6-125 µg/mL). O peptídeo PEP1C também teve ação sobre MRSA, porém menor que
o peptídeo modificado. Essa diferença de atividade pode estar associada ao nível de
hidrofobicidade entre os dois peptídeos C-terminais (PEP1C→25% e PEP2Cm→41,67%)
ou mesmo por alterações conformacionais favoráveis originadas após modificação dos
resíduos de Tyr→Trp em PEP2Cm, uma vez que o número de cargas positivas é
igualmente disposto entre eles. O peptídeo PEP4Nm, derivado da região N-terminal,
também teve atividade sobre MRSA, inibindo 90% do crescimento desta cepa nas
concentrações de 125 e 62,5 µg/mL.
Os peptídeos derivados da região C-terminal de PLA2s homólogas vêm sendo o
foco de muitas pesquisas, com o intuito de elucidar sua contribuição no mecanismo da
ação miotóxica destas proteínas e/ou no uso como possíveis agentes antimicrobianos
(PÁRAMO et al., 1998; COSTA et al., 2008) e antitumorais (ARAYA; LOMONTE, 2007;
GEBRIM et al., 2009; LOMONTE; ANGULO; MORENO, 2010; SOBRINHO et al., 2016).
O peptídeo p115-129 da miotoxina II (B. asper) mostrou potente atividade contra cepas
de E. coli e S. aureus, mas não em cepas de Brucella abortus, via interação inicial com
moléculas de LPS e LTA, respectivamente, seguida por alterações morfológicas
irreversíveis na membrana e morte celular (PÁRAMO et al., 1998). Peptídeos variantes a
partir de p115-129 mostraram diferenças na toxicidade in vitro e nas atividades
antibacterianas sobre Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus e B. abortus. Um
deles, denominado pEM-2 teve relevante ação contra S. typhimurium e baixa
citotoxicidade sobre mioblastos C2C12, interagindo também com LPS (SANTAMARÍA et
al., 2005).
A relevância de LPS na superfície de bactérias gram-negativas para a atividade
desses peptídeos foi evidente, quando moléculas de LPS de S. typhimurium foram
inseridas na membrana externa de B. abortus (na qual apresenta um tipo de LPS distinto
do expresso em E. coli), aumentando sua suscetibilidade pelo peptídeo. Isto sugere uma
atração eletrostática inicial de pEM-2 por LPS, uma vez que estes componentes,
juntamente com lipoproteínas e fosfolipídios, concede as membranas externas de
bactérias gram-negativas, uma forte carga negativa (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012),
DISCUSSÃO
75
facilitando a interação com peptídeos catiônicos. Além da atividade antibacteriana, pEM-
2 apresentou atividade antifúngica sobre uma variedade de espécies de Candida, sendo
capaz de inibir 100% do crescimento desses fungos em ~10 µg/mL (MURILLO et al.,
2007).
Um peptídeo C-terminal derivado de BthTX-I (B. jararacussu), denominado p-
BthTX-I, foi mais ativo sobre cepas de E. coli do que S. aureus, porém não inibiu o
crescimento de Candida albicans. No trabalho, os autores demonstraram que p-BthTX-I
forma dímeros em solução devido a presença de resíduos de Cys na sequência, esta
estrutura dimérica ((p-BthTX-I)2) quando sintetizada mostrou mais atividade
antibacteriana que a estrutura monomérica (SANTOS-FILHO et al., 2015). Ao contrário
do observado com peptídeos C-terminais derivados de PLA2s homólogas, (p-BthTX-I)2
não promoveu lise celular, nem foi capaz de interagir com a membrana.
Dentre os peptídeos avaliados no presente trabalho, o PEP2Cm apresentou
maior seletividade para MRSA quando comparado a S. aureus e P. aeruginosa, pois não
apenas inibiu completamente o crescimento desta bactéria em baixas concentrações,
como também manteve sua atividade por 48 horas.
O mecanismo de ação deste peptídeo é desconhecido, mas suas características
catiônicas e hidrofóbicas podem favorecer interações eletrostáticas entre componentes
da membrana externa e da parede celular de bactérias Gram-positivas, como os ácidos
teicoicos (carregados negativamente pela presença de grupos fosfatos) (TORTORA;
FUNKE; CASE, 2012), e auxiliar na inserção de resíduos hidrofóbicos na bicamada. Por
outro lado, uma ação mais específica não pode ser descartada, ao pensar que S. aureus
e MRSA devem compartilhar propriedades físico-químicas e estruturais de suas
membranas e paredes celulares, propícias à atividade de PEP2Cm, contudo cepas S.
aureus foram menos sensíveis ao peptídeo, sugerindo que outros fatores (ou alvos
moleculares) podem estar envolvidos na atividade sobre MRSA.
O conhecimento acerca dos mecanismos pelos quais bactérias se adaptam ao
ambiente contendo antimicrobianos não acompanha o ritmo de crescimento do número
de cepas resistentes. A busca por novos agentes antimicrobianos, eficazes em driblar
essa resistência ou facilitar a ação de antibióticos convencionais, é uma campanha
mundial, e a utilização de diversas fontes naturais pode tornar este objetivo possível. A
DISCUSSÃO
76
caracterização de LmutTX e peptídeos sintéticos possibilitou a identificação de moléculas
com atividades antimicrobianas relevantes, que poderão maneira, contribuir na luta
contra microrganismos patogênicos.
CONCLUSÃO
77
6. CONCLUSÃO
▪ Uma PLA2 homóloga foi isolada do veneno de Lachesis muta muta, denominada
LmutTX, com alta identidade com PLA2s Lys49 dos venenos de serpentes do
gênero Bothrops.
▪ LmutTX apresentou atividade citotóxica sobre miotubos C2C12 a partir de 40
µg/poço.
▪ Peptídeos sintéticos a partir de três regiões distintas da molécula (regiões C-
terminal, N-terminal e segmento 41-52) mostraram baixa citotoxicidade sobre
miotubos C2C12 e não foram hemolíticos.
▪ LmutTX apresentou atividade contra a formação de biofilme de Staphylococcus
epidermidis e Staphylococcus aureus e atividade antibacteriana sobre bactérias
Gram-positivas (S. aureus e MRSA) e Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa
e Klebsiella pneumoniae), porém não mostrou ação significativa contra T. cruzi, L.
infantum e P. falciparum.
▪ Dentre os peptídeos testados, PEP2Cm exibiu relevante atividade antibacteriana,
inibindo 100% do crescimento de MRSA e de P. aeruginosa, prolongando esta
ação pelo período de 48 horas sobre cepas MRSA.
REFERÊNCIAS
78
REFERÊNCIAS
ABBAS, S.; SENTHILKUMAR, R.; ARJUNAN, S. Isolation and molecular characterization of microorganisms producing novel antibiotics from soil sample. European Journal of Experimental Biology, v. 4, n. 5, p. 149–155, 2014. ADADE, C. M. et al. Melittin peptide kills Trypanosoma cruzi parasites by inducing different cell death pathways. Toxicon, v. 69, p. 227–239, 2013. ADADE, C. M. et al. Crovirin, a Snake Venom Cysteine-Rich Secretory Protein (CRISP) with Promising Activity against Trypanosomes and Leishmania. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 8, n. 10, p. e3252, 2014. AGERO, U. et al. Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model. Toxicon, v. 50, n. 5, p. 698–706, 2007. AGUIAR, A. S. et al. Purification and partial characterization of a thrombin-like/gyroxin enzyme from bushmaster (Lachesis muta rhombeata) venom. Toxicon, v. 34, n. 5, p. 555–565, 1996. ALMEIDA, J. R. et al. CoaTx-II, a new dimeric Lys49 phospholipase A2 from Crotalus oreganus abyssus snake venom with bactericidal potential: Insights into its structure and biological roles. Toxicon, v. 120, p. 147–158, 2016. ALTSCHUL, S. F. et al. Basic Local Alignment Search ToolJournal of Molecular Biology, 1990. AMBROSIO, A. L. B. et al. A molecular mechanism for Lys49-phospholipase A2 activity based on ligand-induced conformational change. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 8, p. 7326–7335, 2005. ANDRIÃO-ESCARSO, S. H. et al. Structural and functional characterization of an acidic platelet aggregation inhibitor and hypotensive phospholipase A2 from Bothrops jararacussu snake venom. Biochemical Pharmacology, v. 64, n. 4, p. 723–732, 2002. ANGULO, Y. et al. Immunochemical properties of the N-terminal helix of myotoxin II, a lysine-49 phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom. Toxicon, v. 39, n. 6, p. 879–887, 2001. ANGULO, Y. et al. Myotoxic and cytolytic activities of dimeric Lys49 phospholipase A2 homologues are reduced, but not abolished, by a pH-induced dissociation. Toxicon, v. 46, n. 3, p. 291–296, 2005. ANGULO, Y.; LOMONTE, B. Differential susceptibility of C2C12 myoblasts and myotubes to group II phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms. Cell Biochemistry and Function, v. 23, n. 5, p. 307–313, 2005.
REFERÊNCIAS
79
ARAGÓN-ORTÍZ, F.; BRENES-BRENES, J. R.; GUBENSEK, F. Characterization of a lectin-like protein isolated from Lachesis muta snake venom. Revista de biología tropical, v. 37, n. 1, p. 79–83, 1989. ARAGON-ORTIZ, F.; GUBENSEK, F. A thrombin-like enzyme from bushmaster (Lachesis muta stenophyrs) venom. Toxicon, v. 31, n. 11, p. 1435–1443, 1993. ARAGÓN-ORTIZ, F.; MENTELE, R.; AUERSWALD, E. A. Amino acid sequence of a lectin-like protein from Lachesis muta stenophyrs venom. Toxicon, v. 34, n. 7, p. 763–769, 1996. ARAYA, C.; LOMONTE, B. Antitumor effects of cationic synthetic peptides derived from Lys49 phospholipase A2 homologues of snake venoms. Cell Biology International, v. 31, n. 3, p. 263–268, 2007. ARGIOLAS, A.; PISANO, J. J. Facilitation of phospholipase A2 activity by mastoparans, a new class of mast cell degranulating peptides from wasp venom. The Journal of biological chemistry, v. 258, n. 22, p. 13697–702, 1983. ARNI, R. K. et al. Structure of a calcium-independent phospholipase-like myotoxic protein from Bothrops asper venom. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography, v. 51, n. 3, p. 311–317, 1995. ARNI, R. K.; WARD, R. J. Phospholipase A2--a structural review. Toxicon, v. 34, n. 8, p. 827–41, 1996. AYROZA, G. et al. Juruin: An antifungal peptide from the venom of the amazonian pink toe spider, Avicularia juruensis, which contains the inhibitory cystine knot motif. Frontiers in Microbiology, v. 3, n. SEP, p. 1–10, 2012. BAHNSON, B. J. Structure, function and interfacial allosterism in phospholipase A2: Insight from the anion-assisted dimer. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 433, n. 1, p. 96–106, 2005. BALSINDE, J.; WINSTEAD, M. V; DENNIS, E. A. Phospholipase A2 regulation of arachidonic acid mobilization. FEBS letters, v. 531, n. 1, p. 2–6, 2002. BARROS, G. A. C. et al. In vitro activity of phospholipase A2 and of peptides from Crotalus durissus terrificus venom against amastigote and promastigote forms of Leishmania (L.) infantum chagasi. The journal of venomous animals and toxins including tropical diseases, v. 21, p. 48, 2015. BEA, R. D. L. S.; PETRAGLIA, A. F.; JOHNSON, L. E. L. DE. Synthesis, antimicrobial activity and toxicity of analogs of the scorpion venom BmKn peptides. Toxicon, v. 101, p. 79–84, 2015.
REFERÊNCIAS
80
BENAMARA, H. et al. Characterization of membrane lipidome changes in Pseudomonas aeruginosa during biofilm growth on glass wool. PLoS ONE, v. 9, n. 9, 2014. BENLI, M.; YIGIT, N. Antibacterial activity of venom from funnel web spider Agelena labyrinthica (Araneae: Agelenidae). Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, v. 14, n. 4, p. 641–650, 2008. BERG, O. G. et al. Interfacial enzymology: The secreted phospholipase A2-paradigm. Chemical Reviews, v. 101, n. 9, p. 2613–2653, 2001. BERGAOUI, I. et al. In vitro antiviral activity of dermaseptin S4 and derivatives from amphibian skin against Herpes Simplex Virus Type 2. Journal of Medical Virology, v. 85, p. 272–281, 2013. BHAT, R. M.; PRAKASH, C. Leprosy: An overview of pathophysiology. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, v. 2012, p. 1–6, 2012. BORGES, I. P. et al. Anti-parasitic effect on Toxoplasma gondii induced by BnSP-7, a Lys49-phospholipase A2 homologue from Bothrops pauloensis venom. Toxicon, v. 119, p. 84–91, 2016. BRAND, G. D. et al. The skin secretion of the amphibian Phyllomedusa nordestina: A source of antimicrobial and antiprotozoal peptides. Molecules, v. 18, n. 6, p. 7058–7070, 2013. BRASIL et al. Doenças negligenciadas: estratégias do Ministério da Saúde. Revista de Saude Publica, v. 44, n. 1, p. 200–202, 2010. BREGGE-SILVA, C. et al. Isolation and biochemical, functional and structural characterization of a novel L-amino acid oxidase from Lachesis muta snake venom. Toxicon, v. 60, n. 7, p. 1263–1276, 2012. BROGDEN, K. A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature reviews. Microbiology, v. 3, n. 3, p. 238–50, 2005. BURKE, J. E.; DENNIS, E. A. Phospholipase A2 Biochemistry. Cardiovascular Drugs and Therapy, v. 23, n. 1, p. 49–59, 2009. CALVETE, J. J. Snake venomics: From the inventory of toxins to biology. Toxicon, v. 75, p. 44–62, 2013. CASTILLO, J. C. Q. et al. In vitro antiplasmodial activity of phospholipases A2 and a phospholipase homologue isolated from the venom of the snake Bothrops asper. Toxins, v. 4, n. 12, p. 1500–1516, 2012.
REFERÊNCIAS
81
CECILIO, A. B. et al. Molecular characterization of Lys49 and Asp49 phospholipases A2 from snake venom and their antiviral activities against Dengue virus. Toxins, v. 5, n. 10, p. 1780–1798, 2013. CHIOATO, L. et al. Mapping of the structural determinants of artificial and biological membrane damaging activities of a Lys49 phospholipase A2 by scanning alanine mutagenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, v. 1768, n. 5, p. 1247–1257, 2007. CHOI, S.-J. et al. Isolation and characterization of Psalmopeotoxin I and II: two novel antimalarial peptides from the venom of the tarantula Psalmopoeus cambridgei. FEBS letters, v. 572, n. 1–3, p. 109–17, 2004. CINTRA-FRANCISCHINELLI, M. et al. Calcium imaging of muscle cells treated with snake myotoxins reveals toxin synergism and presence of acceptors. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 66, n. 10, p. 1718–1728, 2009. CINTRA-FRANCISCHINELLI, M. et al. Bothrops snake myotoxins induce a large efflux of ATP and potassium with spreading of cell damage and pain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 107, n. 32, p. 14140–14145, 2010. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. [s.l: s.n.]. v. 32 CORDEIRO, F. A. et al. A New Phospholipase A2 from Lachesis muta rhombeata: Purification, Biochemical and Comparative Characterization with Crotoxin B. Protein & Peptide Letters, v. 22, n. 9, p. 816–827, 2015. CORRÊA, E. A. et al. Isolation, structural and functional characterization of a new Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops neuwiedi urutu with bactericidal potential. Toxicon, v. 115, p. 13–21, 2016. CORRÊA, L. C. et al. Crystal structure of a myotoxic Asp49-phospholipase A2 with low catalytic activity: Insights into Ca2+-independent catalytic mechanism. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, v. 1784, n. 4, p. 591–599, 2008. COSTA, T. R. et al. Myotoxic phospholipases A2 isolated from Bothrops brazili snake venom and synthetic peptides derived from their C-terminal region: Cytotoxic effect on microorganism and tumor cells. Peptides, v. 29, n. 10, p. 1645–1656, 2008. COSTA TORRES, A. F. et al. Antibacterial and antiparasitic effects of Bothrops marajoensis venom and its fractions: Phospholipase A2 and L-amino acid oxidase. Toxicon, v. 55, n. 4, p. 795–804, 2010.
REFERÊNCIAS
82
COUTINHO-NETO, A. et al. ESI-MS/MS identification of a bradykinin-potentiating peptide from Amazon Bothrops atrox Snake Venom using a hybrid Qq-oaTOF mass spectrometer. Toxins, v. 5, n. 2, p. 327–335, 2013. DA SILVA, N. J. et al. A gyroxin analog from the venom of the bushmaster (Lachesis muta muta). Toxicon, v. 27, n. 7, p. 763–771, 1989. DA SILVA GIOTTO, M. T. et al. Crystallographic and spectroscopic characterization of a molecular hinge: Conformational changes in Bothropstoxin I, a dimeric Lys49- phospholipase A2 homologue. Proteins: Structure, Function and Genetics, v. 30, n. 4, p. 442–454, 1998. DAMICO, D. C. S. et al. Neurotoxic and myotoxic actions from Lachesis muta muta (surucucu) whole venom on the mouse and chick nerve-muscle preparations. Toxicon, v. 46, n. 2, p. 222–229, 2005a. DAMICO, D. C. S. et al. Biochemical and enzymatic characterization of two basic Asp49 phospholipase A2 isoforms from Lachesis muta muta (Surucucu) venom. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, v. 1726, n. 1, p. 75–86, 2005b. DAMICO, D. C. S. et al. Functional characterization of a basic D49 phospholipase A2 (LmTX-I) from the venom of the snake Lachesis muta muta (bushmaster). Toxicon, v. 47, n. 7, p. 759–765, 2006. DAMICO, D. C. S. et al. Pharmacological study of edema and myonecrosis in mice induced by venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta) and its basic Asp49 phospholipase A2 (LmTX-I). Protein Journal, v. 27, n. 6, p. 384–391, 2008. DAMICO, D. C. S. et al. LmrTX, a basic PLA2 (D49) purified from Lachesis muta rhombeata snake venom with enzymatic-related antithrombotic and anticoagulant activity. Toxicon, v. 60, n. 5, p. 773–781, 2012. DAS NEVES, R. C. et al. Antimycobacterial activity of a new peptide polydim-i isolated from neotropical social wasp Polybia dimorpha. PLoS ONE, v. 11, n. 3, 2016. DE ASSIS, E. B. et al. Purification and complete primary structure of the first PLA2 from Lachesis stenophrys (the Central American Bushmaster) snake venom. Protein Journal, v. 27, n. 5, p. 327–333, 2008. DE KONING-WARD, T. F. et al. Plasmodium species: master renovators of their host cells. Nature Reviews Microbiology, p. 14, 2016. DE LIMA, P. H. S.; JUNIOR, V. H. A snakebite caused by a bushmaster (Lachesis muta): report of a confirmed case in State of Permambuco, Brazil. v. 48, n. May, p. 636–637, 2015.
REFERÊNCIAS
83
DE MORAES, J. et al. Schistosoma mansoni: In vitro schistosomicidal activity and tegumental alterations induced by piplartine on schistosomula. Experimental Parasitology, v. 132, n. 2, p. 222–227, 2012. DELATORRE, P. et al. Crystal structure of BnIV in complex with myristic acid: A Lys49 myotoxic phospholipase A2 from Bothrops neuwiedi venom. Biochimie, v. 93, n. 3, p. 513–518, 2011. DENNIS, E. A. et al. Phospholipase A2 Enzymes: Physical Structure, Biological Function, Disease Implication, Chemical Inhibition, and Therapeutic Intervention. Chemical Reviews, v. 111, n. 10, p. 6130–6185, 2011. DÍAZ, C. et al. The effect of myotoxins isolated from Bothrops snake venoms on multilamellar liposomes: relationship to phospholipase A2, anticoagulant and myotoxic activities. BBA - Biomembranes, v. 1070, n. 2, p. 455–460, 1991. DÍAZ, C. et al. Modulation of the susceptibility of human erythrocytes to snake venom myotoxic phospholipases A2: role of negatively charged phospholipids as potential membrane binding sites. Archives of biochemistry and biophysics, v. 391, n. 1, p. 56–64, 2001. DINIZ, M. R. V.; OLIVEIRA, E. B. Purification and properties of a Kininogenin from the venom of Lachesis muta (BUSHMASTER ). v. 30, n. 3, p. 247–258, 1992. DOS SANTOS, J. I. et al. Structural, functional, and bioinformatics studies reveal a new snake venom homologue phospholipase A2 class. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, v. 79, n. 1, p. 61–78, 2011. DOS SANTOS, J. I.; SOARES, A. M.; FONTES, M. R. M. Comparative structural studies on Lys49-phospholipases A2 from Bothrops genus reveal their myotoxic site. Journal of Structural Biology, v. 167, n. 2, p. 106–116, 2009. DOUMANOV, J. et al. Effects of vipoxin and its components on HepG2 cells. Toxicon, v. 94, p. 36–44, 2015. EDWARDS, S. H. et al. Articles The Crystal Structure of the H48Q Active Site Mutant of Human Group IIA Secreted Phospholipase A2 at 1.5 Å Resolution Provides an Insight into the Catalytic Mechanism. Biochemistry, v. 41, p. 15468–15476, 2002. EPAND, R. M.; EPAND, R. F. Lipid domains in bacterial membranes and the action of antimicrobial agents. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, v. 1788, n. 1, p. 289–294, 2009. FELICORI, L. F. et al. Kallikrein-like proteinase from bushmaster snake venom. Protein Expression and Purification, v. 30, n. 1, p. 32–42, 2003.
REFERÊNCIAS
84
FERNANDES, C. A. H. et al. Comparison between apo and complexed structures of bothropstoxin-I reveals the role of Lys122 and Ca2+-binding loop region for the catalytically inactive Lys49-PLA2s. Journal of Structural Biology, v. 171, n. 1, p. 31–43, 2010. FERNANDES, C. A. H. et al. Structural bases for a complete myotoxic mechanism: Crystal structures of two non-catalytic phospholipases A2-like from Bothrops brazili venom. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, v. 1834, n. 12, p. 2772–2781, 2013. FERNANDEZ-PRADA, C. et al. Different Mutations in a P-type ATPase Transporter in Leishmania Parasites are Associated with Cross-resistance to Two Leading Drugs by Distinct Mechanisms. PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 10, n. 12, p. 1–20, 2016. FERNÁNDEZ, J. et al. Muscle phospholipid hydrolysis by Bothrops asper Asp49 and Lys49 phospholipase A2 myotoxins - Distinct mechanisms of action. FEBS Journal, v. 280, n. 16, p. 3878–3886, 2013. FORTES-DIAS, C. L.; BARCELLOS, C. J.; ESTEVÃO-COSTA, M. I. Molecular cloning of a γ-phospholipase A2 inhibitor from Lachesis muta muta (the bushmaster snake). Toxicon, v. 41, n. 7, p. 909–917, 2003. FRANCISCO, A. F. et al. Nitroheterocyclic drugs cure experimental Trypanosoma cruzi infections more effectively in the chronic stage than in the acute stage. Scientific reports, v. 6, n. August, p. 1–11, 2016. FULY, A. L. et al. Myotoxic activity of an acidic phospholipase A2 isolated from Lachesis muta (Bushmaster) snake venom. Toxicon, v. 38, n. 7, p. 961–972, 2000. FULY, A. L. et al. Purification and characterization of a phospholipase A2 isoenzyme isolated from Lachesis muta snake venom. Biochemical Pharmacology, v. 63, n. 9, p. 1589–1597, 2002. FULY, A. L. et al. Myotoxicity induced by an acidic Asp49 phospholipase A2 isolated from Lachesis muta snake venom: Comparison with lysophosphatidylcholine. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, v. 35, n. 10, p. 1470–1481, 2003. GEBRIM, L. C. et al. Antitumor effects of snake venom chemically modified Lys49 phospholipase A2-like BthTX-I and a synthetic peptide derived from its C-terminal region. Biologicals, v. 37, n. 4, p. 222–229, 2009. GEORGIEVA, D. N. et al. The X-ray structure of a snake venom Gln48 phospholipase A2 at 1.9 Å resolution reveals anion-binding sites. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 316, n. 1, p. 33–38, 2004. GIAMMANCO, A. et al. Global Assessment of the Activity of Tigecycline against Multidrug-Resistant Gram-Negative Pathogens between 2004 and 2014 as Part of the Tigecycline Evaluation and Surveillance Trial. mSphere, v. 2, n. 1, p. 1–10, 2017.
REFERÊNCIAS
85
GIJÓN, M. A.; LESLIE, C. C. Regulation of arachidonic acid release and cytosolic phospholipase A2 activation. Journal of leukocyte biology, v. 65, n. 3, p. 330–336, 1999. GRAHAM, R. L. J. et al. Identification and functional analysis of a novel bradykinin inhibitory peptide in the venoms of New World Crotalinae pit vipers. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 338, p. 1587–1592, 2005. GU, L. et al. Structure of an acidic phospholipase A2 from the venom of Deinagkistrodon acutus. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, v. 58, n. 1, p. 104–110, 2002. HAN, S. K. et al. Structural Aspects of Interfacial Adsorption. The Journal of Biological Chemistry, v. 272, n. 6, p. 3573–3582, 1997. HMED, B.; SERRIA, H. T.; MOUNIR, Z. K. Scorpion peptides: potential use for new drug development. Journal of toxicology, v. 2013, p. 958797, 2013. HOLLAND, D. R. et al. The Crystal Structure of a Lysine 49 Phoppholipase A2 from the Venom of the Cottonmouth Snake at 2.0-A Resolution*. The Journal of Biological Chemistry, v. 265, n. 29, p. 17649–17656, 1990. HUANCAHUIRE-VEGA, S. et al. Structural and functional characterization of brazilitoxins II and III (BbTX-II and -III), two myotoxins from the venom of Bothrops brazili snake. Toxicon, v. 54, n. 6, p. 818–827, 2009. JALAEI, J. et al. In vitro antibacterial effect of wasp (Vespa orientalis) venom. The journal of venomous animals and toxins including tropical diseases, v. 20, p. 22, 2014. JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO, I. L. M. et al. Lachesis muta (Viperidae) cDNAs reveal diverging pit viper molecules and scaffolds typical of cobra (Elapidae) venoms: Implications for snake toxin repertoire evolution. Genetics, v. 173, n. 2, p. 877–889, 2006. KARAM, G. et al. Antibiotic strategies in the era of multidrug resistance. Journal of intensive care medicine, v. 20, p. 1–9, 2016. KINI, R. M. Excitement ahead: Structure, function and mechanism of snake venom phospholipase A2 enzymes. Toxicon, v. 42, n. 8, p. 827–840, 2003. KLEIN, R. C. et al. A C-type lectin from Bothrops jararacussu venom disrupts staphylococcal biofilms. PLoS ONE, v. 10, n. 3, p. 1–16, 2015. KROEMER, R. T. et al. Prediction of the three-dimensional structure of human interleukin-7 by homology modeling. Protein engineering, v. 9, n. 6, p. 493–8, 1996. LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, n. 5259, p. 680–5, 1970.
REFERÊNCIAS
86
LAMADRID-FERIS, F. et al. Identification of compounds from white frog (Anura: Hylidae) cutaneous secretions with potential to be used in biotechnological processes. Pharmacologyonline, v. 2, p. 118–123, 2015. LAMBEAU, G. et al. Structural elements of secretory PLA2 involved in the binding to M-type receptors. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, v. 270, n. 10, p. 5534–5540, 1995. LAMBROS, C.; VANDERBERG, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology, v. 65, n. 3, p. 418–420, 1979. LASKOWSKI, R. A. et al. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography, v. 26, n. November, p. 283–291, 1993. LEANDRO, L. F. et al. Antimicrobial activity of apitoxin, melittin and phospholipase A2 of honey bee (Apis mellifera) venom against oral pathogens. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, v. 87, n. 1, p. 147–155, 2015. LEE, W. et al. Structural Basis for Low Catalytic Activity in Lys49 Phospholipases A2 - A Hypothesis : The Crystal Structure of Piratoxin II Complexed to Fatty Acid. Biochemistry, v. 40, p. 28–36, 2001. LEONARDI, A. et al. Partial primary structure of a fibrinogenase from the venom of the snake Lachesis stenophrys. Journal of Chromatography A, v. 852, n. 1, p. 237–243, 1999. LIMA, R. M. et al. Phospholipase A2 inhibitors (BPLIs) are encoded in the venom glands of Lachesis muta (Crotalinae, Viperidae) snakes. Toxicon, v. 57, n. 1, p. 172–175, 2011. LOMONTE, B. et al. Neutralizing Interaction between Heparins and Myotoxin II, a Lysine 49 Phospholipase A2 from Bothrops asper Snake Venom. v. 269, n. 47, p. 29867–29873, 1994. LOMONTE, B. et al. Comparative study of the cytolytic activity of myotoxic phospholipases A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal muscle (C2C12) cells in vitro. Toxicon, v. 37, n. 1, p. 145–158, 1999. LOMONTE, B.; ANGULO, Y.; CALDERÓN, L. An overview of lysine-49 phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms and their structural determinants of myotoxic action. Toxicon, v. 42, n. 8, p. 885–901, 2003. LOMONTE, B.; ANGULO, Y.; MORENO, E. Synthetic Peptides Derived from the C-Terminal Region of Lys49 Phospholipase A2 Homologues from Viperidae Snake Venoms : Biomimetic Activities and Potential Applications. Current Pharmaceutical Design, v. 16, p. 3224–3230, 2010.
REFERÊNCIAS
87
LOMONTE, B.; ANGULO, Y.; SANTAMARÍA, C. Comparative study of synthetic peptides corresponding to region 115-129 in Lys49 myotoxic phospholipases A2 from snake venoms. Toxicon, v. 42, n. 3, p. 307–312, 2003. LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, v. 193, n. 2, p. 265–275, 1951. LOWY, F. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Investigation, v. 111, n. 9, p. 1265–1273, 2003. MADRIGAL, M. et al. Snake venomics across genus Lachesis. Ontogenetic changes in the venom composition of Lachesis stenophrys and comparative proteomics of the venoms of adult Lachesis melanocephala and Lachesis acrochorda. Journal of Proteomics, v. 77, p. 280–297, 2012. MAGALHAES, A. et al. The complete amino acid sequence of a thrombin-like enzyme/gyroxin analogue from venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta). FEBS Letters, v. 329, n. 1–2, p. 116–120, 1993. MAGALHAES, A. et al. Coagulant thrombin-like enzymes from the venoms of Brazilian and Peruvian bushmaster (Lachesis muta muta) snakes. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology, v. 136, n. 2, p. 255–266, 2003. MAGALHÃES, A. et al. Thrombin-like enzyme from Lachesis muta muta venom: Isolation and topographical analysis of its active site structure by means of the binding of amidines and guanidines as competitive inhibitors. Toxicon, v. 35, n. 10, p. 1549–1559, 1997. MAGRO, A. J. et al. Influence of quaternary conformation on the biological activities of the Asp49-phospholipases A2s from snake venoms. Protein and peptide letters, v. 16, n. 8, p. 852–9, 2009. MARAGANORE, J. M. et al. A new class of phospholipases A2 with lysine in place of aspartate 49. Functional consequences for calcium and substrate binding. Journal of Biological Chemistry, v. 259, n. 22, p. 13839–13843, 1984. MARCHI-SALVADOR, D. P. et al. Crystal structure of a phospholipase A2 homolog complexed with p-bromophenacyl bromide reveals important structural changes associated with the inhibition of myotoxic activity. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, v. 1794, n. 11, p. 1583–1590, 2009. MARCUSSI, S. et al. Genotoxic effect of Bothrops snake venoms and isolated toxins on human lymphocyte DNA. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology, v. 65, p. 9–14, 2013. MARTINEZ, J. L. et al. A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiology Reviews, v. 33, n. 1, p. 44–65, 2009.
REFERÊNCIAS
88
MILLER, W. R.; MUNITA, J. M.; ARIAS, C. A. Mechanisms of antibiotic resistance in enterococci. Expert review of anti-infective therapy, v. 12, n. 10, p. 1221–36, 2014. MOERMAN, L. et al. Antibacterial and antifungal properties of alfa-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from southern Africa. European Journal of Biochemistry, v. 269, n. 19, p. 4799–4810, 2002. MOGHADAMTOUSI, S. Z. et al. Anticancer and antitumor potential of fucoidan and fucoxanthin, two main metabolites isolated from brown algae. The Scientific World Journal, v. 2014, 2014. MULLER, V. D. M. et al. Crotoxin and phospholipases A2 from Crotalus durissus terrificus showed antiviral activity against dengue and yellow fever viruses. Toxicon, v. 59, n. 4, p. 507–515, 2012. MURAKAMI, M. T. et al. Inhibition of myotoxic activity of Bothrops asper myotoxin II by the anti-trypanosomal drug suramin. Journal of Molecular Biology, v. 350, n. 3, p. 416–426, 2005. MURILLO, L. A et al. Fungicidal activity of a phospholipase-A2-derived synthetic peptide variant against Candida albicans. Revista espanola de quimioterapia : publicacion oficial de la Sociedad Espanola de Quimioterapia, v. 20, n. 3, p. 330–333, 2007. NICOLAS, J.; LAMBEAU, G.; LAZDUNSKI, M. Identification of the Binding Domain for Secretory Phospholipases A2 on Their M-type 180-kDa Membrane Receptor*. The Journal of biological chemistry, v. 270, n. 48, p. 28869–28873, 1995. NÚNEZ, C. E.; ANGULO, Y.; LOMONTE, B. Identification of the myotoxic site of the Lys49 phospholipase A2 from Agkistrodon piscivorus piscivorus snake venom: Synthetic C-terminal peptides from Lys49, but not from Asp49 myotoxins, exert membrane-damaging activities. Toxicon, v. 39, n. 10, p. 1587–1594, 2001. OHLSEN, K.; LORENZ, U. Novel targets for antibiotics in Staphylococcus aureus. Future.Microbiol., v. 2, n. 1746–0921, p. 655–666, 2007. OLIVEIRA, J. C. R. et al. Toxicity of South American snake venoms measured by an in vitro cell culture assay. Toxicon, v. 40, n. 3, p. 321–325, 2002. PÁRAMO, L. et al. Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2 from Bothrops asper snake venom: Synthetic Lys49 myotoxin II-(115-129)- peptide identifies its bactericidal region. European Journal of Biochemistry, v. 253, n. 2, p. 452–461, 1998. PARK, H. G. et al. Dual function of a bee (Apis cerana) inhibitor cysteine knot peptide that acts as an antifungal peptide and insecticidal venom toxin. Developmental and Comparative Immunology, v. 47, n. 2, p. 247–253, 2014.
REFERÊNCIAS
89
PEACOCK, S. J.; PATERSON, G. K. Mechanisms of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus. Annual Review of Biochemistry, v. 84, n. 1, p. 577–601, 2015. PERUMAL SAMY, R. et al. Antibacterial activity of snake, scorpion and bee venoms: a comparison with purified venom phospholipase A2 enzymes. Journal of applied microbiology, v. 102, n. 3, p. 650–9, 2007. PETROVIC, N. et al. A simple assay for a human serum phospholipase A2 that is associated with high-density lipoproteins. Journal of lipid research, v. 42, n. 10, p. 1706–13, 2001. PETTERSEN, E. F. et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry, v. 25, n. 13, p. 1605–1612, 2004. PLA, D. et al. Snake venomics of Lachesis muta rhombeata and genus-wide antivenomics assessment of the paraspecific immunoreactivity of two antivenoms evidence the high compositional and immunological conservation across Lachesis. Journal of Proteomics, v. 89, p. 112–123, 2013. PRAJAPATI, K. K.; UPADHYAY, R. K. Antimicrobial Activity of Purified Toxins from Yellow Wasp Polistes flavus ( Vespidae ) against Certain Bacteria and Fungi. Journal of Biosciences and Medicines, v. 4, n. July, p. 95–104, 2016. PUSHPANATHAN, M.; GUNASEKARAN, P.; RAJENDHRAN, J. Antimicrobial Peptides : Versatile Biological Properties. International Journal of Peptides, v. 2013, n. Table 1, p. 1–15, 2013. QUISTAD, G. B. et al. Purification and characterization of insecticidal toxins from venom glands of the parasitic wasp, Bracon hebetor. Insect Biochemistry and Molecular Biology, v. 24, n. 10, p. 955–961, 1994. RAMACHANDRAN, G. N.; RAMAKRISHNAN, C.; SASISEKHARAN, V. Stereochemistry of polypeptide chain configurations. Journal of molecular biology, v. 7, n. 1, p. 95–99, 1963. RAY, S.; SCOTT, J. L.; TATULIAN, S. A. Effects of Lipid Phase Transition and Membrane Surface Charge on the Interfacial Activation of Phospholipase A2. Biochemistry, v. 46, p. 13089–13100, 2007. RENETSEDER, R. et al. A comparison of the crystal structures of phospholipase A2 from bovine pancreas and Crotalus atrox venom. The Journal of biological chemistry, v. 260, n. 21, p. 11627–11634, 1985. RIGDEN, D. J. et al. The structure of the D49 phospholipase A2 piratoxin III from Bothrops pirajai reveals unprecedented structural displacement of the calcium-binding loop: Possible relationship to cooperative substrate binding. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography, v. 59, n. 2, p. 255–262, 2002.
REFERÊNCIAS
90
ROLÓN, M. et al. Development of resazurin microtiter assay for drug sensibility testing of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research, v. 99, n. 2, p. 103–107, 2006. RUCAVADO, A. et al. Characterization of the local tissue damage induced by LHF-II, a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity isolated from Lachesis muta muta snake venom. Toxicon, v. 37, n. 9, p. 1297–1312, 1999. SALI, A.; BLUNDELL, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology, v. 234, n. 3, p. 779–815, 1993. SAMY, R. P. et al. Viperatoxin-II: A novel viper venom protein as an effective bactericidal agent. FEBS Open Bio, v. 5, p. 928–941, 2015. SAMY, R. P.; SETHI, G.; LIM, L. H. K. A brief update on potential molecular mechanisms underlying antimicrobial and wound-healing potency of snake venom molecules. [s.l.] Elsevier Inc., 2016. v. 115 SANCHEZ, E. F. et al. Isolation of a proteinase with plasminogen-activating activity from Lachesis muta muta (bushmaster) snake venom. Archives of biochemistry and biophysics, v. 378, n. 1, p. 131–141, 2000. SANCHEZ, E. F. et al. Biochemical characterization and molecular cloning of a plasminogen activator proteinase (LV-PA) from bushmaster snake venom. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, v. 1760, n. 12, p. 1762–1771, 2006. SÁNCHEZ, E. F. et al. Purification and characterization of the hemorrhagic factor II from the venom of the Bushmaster snake (Lachesis muta muta). Biochimica et biophysica acta, v. 1074, n. 3, p. 347–56, 6 ago. 1991. SÁNCHEZ, E. F. et al. Biological activities of venoms from south american snakes. Toxicon, v. 30, p. 95–103, 1992. SÁNCHEZ, E. F. et al. Resolution of isoforms of mutalysin II, the metalloproteinase from bushmaster snake venom. Toxicon, v. 41, n. 8, p. 1021–1031, 2003. SANCHEZ, E. F.; COSTA, M. I. E.; ASSAKURA, M. T. Characterization of a hemorrhagic factor, LHF-I, isolated from Bushmaster snake (Lachesis muta muta) venom. Toxicon, v. 33, n. 12, p. 1653–1667, 1995. SANCHEZ, E. F.; MAGALHAES, A.; DINIZ, C. R. Purification of hemorrhagic factor (LHF-I) from the venom of the bushmaster snake, Lachesis muta muta. Toxicon, v. 25, n. 6, p. 611–619, 1987.
REFERÊNCIAS
91
SANTAMARÍA, C. et al. Bactericidal and Antiendotoxic Properties of Short Cationic Peptides Derived from a Snake Venom Lys49 Phospholipase A2 Bactericidal and Antiendotoxic Properties of Short Cationic Peptides Derived from a Snake Venom Lys49 Phospholipase A2. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 49, n. 4, p. 1340–1345, 2005. SANZ, L. et al. Snake venomics of the South and Central American Bushmasters. Comparison of the toxin composition of Lachesis muta gathered from proteomic versus transcriptomic analysis. Journal of Proteomics, v. 71, n. 1, p. 46–60, 2008. SCARBOROUGH, R. M. et al. Characterization of the integrin specificities of disintegrins isolated from American pit viper venoms. Journal of Biological Chemistry, v. 268, n. 2, p. 1058–1065, 1993. SCOTT, D. L. et al. Interfacial catalysis: the mechanism of phospholipase A2. Science, v. 250, p. 1541–1546, 1990. SCOTT, D. L. et al. Crystallographic and biochemical studies of the (inactive) Lys-49 phospholipase A2 from the venom of Agkistrodon piscivorus piscivorus. Journal of Biological Chemistry, v. 267, n. 31, p. 22645–22657, 1992. SCOTT, D. L.; SIGLER, P. B. Structure and catalytic mechanism of secretory phospholipases A2. Advances in Protein Chemistry, v. 45, p. 53–88, 1994. SHOPSIN, B.; KREISWIRTH, B. N. Molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Emerging Infectious Diseases, v. 7, n. 2, p. 323–326, 2001. SILVA, L. M.; DINIZ, C. R.; MAGALHÃES, A. Purification and partial characterization of an arginine ester hydrolase from the venom of the bushmaster snake, Lachesis muta noctivaga. Toxicon, v. 23, n. 4, p. 707–718, 1985. SILVEIRA, A. M. V. et al. Purification and properties of the thrombin-like enzyme from the venom of Lachesis muta muta. International Journal of Biochemistry, v. 21, n. 8, p. 863–871, 1989. SMILKSTEIN, M. et al. Simple and Inexpensive Fluorescence-Based Technique for High-Throughput Antimalarial Drug Screening Simple and Inexpensive Fluorescence-Based Technique for High-Throughput Antimalarial Drug Screening. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 48, n. 5, p. 1803–1806, 2004. SOARES, A. M. et al. Structural and functional characterization of BnSP-7, a Lys49 myotoxic phospholipase A2 homologue from Bothrops neuwiedi pauloensis venom. Archives of biochemistry and biophysics, v. 378, n. 2, p. 201–9, 2000a. SOARES, A. M. et al. Structural and functional characterization of myotoxin I, a Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops moojeni (Caissaca) snake venom. Archives of biochemistry and biophysics, v. 373, n. January 1, p. 7–15, 2000b.
REFERÊNCIAS
92
SOARES, M. R. et al. Identification of novel bradykinin-potentiating peptides and C-type natriuretic peptide from Lachesis muta venom. Toxicon, v. 46, n. 1, p. 31–38, 2005. SOBRINHO, J. C. et al. Antitumoral Potential of Snake Venom Phospholipases A2 and Synthetic Peptides. Current Pharmaceutical Biotechnology, v. 17, p. 1–12, 2016. STÁBELI, R. G. et al. Bothrops moojeni myotoxin-II, a Lys49-phospholipase A2 homologue: An example of function versatility of snake venom proteins. Comparative Biochemistry and Physiology - C Toxicology and Pharmacology, v. 142, n. 3–4 SPEC. ISS., p. 371–381, 2006. STACEVIČIENĖ, I. et al. Antibiotic resistance of Streptococcus pneumoniae, isolated from nasopharynx of preschool children with acute respiratory tract infection in Lithuania. BMC infectious diseases, v. 16, n. 1, p. 1–8, 2016. STARK, M.; LIU, L. P.; DEBER, C. M. Cationic hydrophobic peptides with antimicrobial activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, n. 11, p. 3585–3590, 2002. STEPANOVIC, S. et al. Quantification of biofilm in microtiter plates: Overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. Apmis, v. 115, n. 8, p. 891–899, 2007. STRATEVA, T.; YORDANOV, D. Pseudomonas aeruginosa - a phenomenon of bacterial resistance. Journal of medical microbiology, v. 58, n. Pt 9, p. 1133–48, set. 2009. SUDARSHAN, S.; DHANANJAYA, B. L. Antibacterial activity of an acidic phospholipase A2 (NN-XIb-PLA2) from the venom of Naja naja (Indian cobra). Springer Plus Journal, v. 112, n. 7, p. 1–7, 2016. SUDHARSHAN, S.; DHANANJAYA, B. L. Antibacterial potential of a basic phospholipase A2 (VRV-PL-VIIIa) from Daboia russelii pulchella (Russell’s viper) venom. The journal of venomous animals and toxins including tropical diseases, v. 21, p. 17, 2015. TANUS JORGE, M. et al. Snakebite by the bushmaster (Lachesis muta) in Brazil: Case report and review of the literature. Toxicon, v. 35, n. 4, p. 545–554, 1997. TARAZI, S. Scorpion venom as antimicrobial peptides (AMPs): A review article. The International Arabic Journal of Antimicrobial Agents, n. February, 2015. TEIXEIRA, S. S. et al. Molecular characterization of an acidic phospholipase A2 from Bothrops pirajai snake venom: Synthetic C-terminal peptide identifies its antiplatelet region. Archives of Toxicology, v. 85, n. 10, p. 1219–1233, 2011. THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, v. 22, n. 22, p. 4673–4680, 1994.
REFERÊNCIAS
93
TONELLO, F. et al. A Lys49-PLA2 myotoxin of Bothrops asper triggers a rapid death of macrophages that involves autocrine purinergic receptor signaling. Cell death & disease, v. 3, p. 1–9, 2012. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10. ed. [s.l: s.n.]. TRAGER, W.; JENSEN, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. [s.l: s.n.]. ULLAH, A. et al. Crystallographic portrayal of different conformational states of a Lys49 phospholipase A2 homologue: Insights into structural determinants for myotoxicity and dimeric configuration. International Journal of Biological Macromolecules, v. 51, n. 3, p. 209–214, 2012. VARGAS, L. J. et al. An acidic phospholipase A2 with antibacterial activity from Porthidium nasutum snake venom. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology, v. 161, n. 4, p. 341–347, 2012. VEGA, C. et al. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing Beta-galactosidase. Parasitology Research, v. 95, n. 4, p. 296–298, 2005. VERNON, L. P.; BELL, J. D. Membrane structure, toxins and phospholipase A2 activity. Pharmacology & therapeutics, v. 54, n. 3, p. 269–95, 1992. VILLALOBOS, J. C. et al. Cytotoxicity induced in myotubes by a Lys49 phospholipase A2 homologue from the venom of the snake Bothrops asper: Evidence of rapid plasma membrane damage and a dual role for extracellular calcium. Toxicology in Vitro, v. 21, n. 8, p. 1382–1389, 2007. VU, T. T. et al. In vitro antibacterial activity of selected medicinal plants traditionally used in Vietnam against human pathogenic bacteria. BMC complementary and alternative medicine, v. 16, n. 1, p. 32, 2016. WIEZEL, G. A. et al. Identification of hyaluronidase and phospholipase B in Lachesis muta rhombeata venom. Toxicon, 2015. WINDLEY, M. J. et al. Spider-venom peptides as bioinsecticides. Toxins, v. 4, n. 3, p. 191–227, 2012. YAMAZAKI, Y. et al. Identification of vascular endothelial growth factor receptor-binding protein in the venom of eastern cottonmouth: A new role of snake venom myotoxic LYS49-phospholipase A2. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 34, p. 29989–29992, 2005. YARLEQUE, A. et al. Isolation and Characterization of a Fibrinogen- Clotting Enzyme From Venom of the Snake, Lachesis muta muta ( Peruvian Bushmaster ). Toxicon, v. 27, n. 11, p. 1189–1197, 1989.
REFERÊNCIAS
94
YU, B. Z. et al. Catalytic significance of the specificity of divalent cations as Ks* and kcat* cofactors for secreted phospholipase A2. Biochemistry, v. 37, n. 36, p. 12576–12587, 1998. ZAMUDIO, K. R.; GREENE, H. W. Phylogeography of the bushmaster (Lachesis muta: Viperidae): implications for neotropical biogeography, systematics, and conservation. Biological Journal of The Linnean Society, v. 62, p. 421–442, 1997. ZHAO, H. et al. Structure of a snake venom phospholipase A2 modified by p-bromo- phenacyl-bromide. Toxicon, v. 36, n. 6, p. 875–886, 1998.
