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UNIVERSIDADE BRASIL
INSTITUTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO DA UNIVERSIDADE BRASIL
MESTRADO PROFISSIONAL EM BIOENGENHARIA, CAMPUS ITAQUERA
MÁRCIO VICENTE FERREIRA
FOTOBIOESTIMULAÇÃO EM CULTURA DE CÉLULAS ENDOTELIAIS EXPOSTAS
AO VENENO DA SERPENTE Philodryas olfersii
PHOTOBIOMODULATION IN ENDOTHELIAL CELL CULTURE EXPOSED TO
Philodryas olfersii SNAKE POISON
SÃO PAULO
2019
UNIVERSIDADE BRASIL
2
MÁRCIO VICENTE FERREIRA
FOTOBIOESTIMULAÇÃO EM CULTURA DE CÉLULAS ENDOTELIAIS EXPOSTAS
AO VENENO DA SERPENTE Philodryas olfersii
Orientador: Prof.Dr. José Carlos Cogo
Co-orientador: Profa. Dra. Silvia Cristina Nunez
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade Brasil, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Bioengenharia.
SÃO PAULO
2019
3
VICENTE, Márcio Ferreira
V681f Fotobioestimulação em cultura de células endoteliais
expostas ao veneno da serpente Philodryas olfersii / Marcio
Vicente Ferreira. -- São Paulo, 2019.
39 f.
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Cogo.
Coorientadora: Profa. Dra. Silvia Cristina Nunez.
Dissertação de Mestrado defendida no Programa de Pós-
graduação do Curso de Bioengenharia do Instituto Científico e
Tecnológico da Universidade Brasil.
1. Acidente ofídico. 2. Philodryas olfersii. 3. Fotobiomodulação.
4. Resposta imunomoduladora. 5. Células endoteliais. I. Cogo,
José Carlos. II. Nunez, Silvia Cristina. III. Título.
CDD 620.82
4
5
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AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a Deus, que me deu força para concluir esta etapa de
minha vida.
A universidade, aos docentes, diretores, coordenadores е administração onde
juntos proporcionaram o ambiente para que esse trabalho fosse realizado.
Ao Prof. Dr. José Carlos Cogo, por sua orientação incansável pela confiança
que com muita paciência e dedicação, ensinou-me não somente o conteúdo
programado, mas também o sentido da amizade, respeito, paciência e sempre esteve
presente em todas as etapas deste trabalho.
À Universidade Brasil, juntamente, com as demais instituições de ensino, que
me proporcionaram a oportunidade de concluir meus experimentos.
Aos meus familiares, pelo amor, incentivo, força е apoio incondicional. A todos
os amigos e colegas de trabalho qυе direta ou indiretamente participaram da minha
trajetória, о meu eterno agradecimento.
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FOTOBIOESTIMULAÇÃO EM CULTURA DE CÉLULAS ENDOTELIAIS EXPOSTAS
AO VENENO DA SERPENTE Philodryas olfersii
RESUMO
Serpentes da espécie Philodryas olfersii (P. olfersii) provocam acidentes ofídicos de
importância clínica e promovem manifestações locais como dor, eritema, edema,
inflamação, equimoses e manifestações sistêmicas como hemorragia. O objetivo deste
trabalho foi de examinar a atividade deste veneno em cultura de células endoteliais e
os efeitos do soro antiofídico e da fotobioestimulação (PBM) na proteção dos efeitos
promovidos por este veneno. Foi avaliada a viabilidade e o descolamento celular,
níveis de IL-1 1L-6, IL-10 TNFα e lactado desidrogenase (LDH). Foi aplicado laser de
emissão vermelha (λ= 660nm), com 100mW, 2,5J/cm2, durante 10 segundos, energia
total de 1J, aplicação pontal, área irradiada de 0,4 cm2 e densidade de potência de
0,25 W/cm2, aplicado isoladamente ou em combinação com soro. Foram formados os
seguintes grupos: 1 – Controle; 2 - Células + veneno P. olfersii nas seguinte
concentrações: 10, 25, 50, 100, 150 e 200 µg/mL e foram incubadas por 3 h e as doses
de 100, 150, 200 e 250 µg/mL foram incubadas por 6 horas. A partir dessas doses, foi
escolhida a dose de trabalho, que foi a de 150 µg/mL, e seguiu-se a formação dos
seguintes grupos: 1- Controle; 2 – Células + veneno; 3 – Células + veneno + soro
antiofídico Anti-Bothrópico; 4 Células + veneno + PBM; 5 – Células + veneno + PBM +
soro antiofídico Anti-Botrópico. Foi avaliado a viabilidade celular pelo método MTT, o
descolamento celular por meio do método de cristal violeta, as citocinas pelo método
ELISA, TNFalfa e a liberação de LDH. Foi observado que o veneno foi citotóxico para
as células endoteliais em doses acima de 100 ug após 6 h de incubação. Não foi
observado efeito no deslocamento celular. Tanto o soro AB como a PBM promoveram
proteção de 79,4 % e 61,2% respectivamente, mas quando ocorre a aplicação do soro
AB e PBM em conjunto, observa-se proteção de 92%. Não houve alterações
detectáveis para IL-1 e LHD mas houve aumento de IL-6, IL-10 e TNFα promovidos
pelo veneno. Tanto a PBM como o soro modularam algumas das citocinas avaliadas.
Concluímos que o veneno de P. olfersii é citotóxico para células endoteliais em doses
acima de 100 ug incubados por 6 horas. Tanto o soro quanto a PBM isolados
promovem proteção parcial, mas quando ocorre a associação a proteção é superior a
90%.
Palavras-chave: acidente ofídico. Philodryas olfersii. Fotobiomodulação. resposta
imunomoduladora. células endoteliais.
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PHOTOBIOMODULATION IN ENDOTHELIAL CELL CULTURE EXPOSED TO
PHILODRYAS OLFERSII SNAKE POISON
ABSTRACT
Philodryas olfersii (P. olfersii) snakes cause clinically important snakebites and promote
local manifestations such as pain, erythema, edema, inflammation, bruising and
systemic manifestations such as hemorrhage. The objective of this work was to
examine the activity of this poison in endothelial cell culture and the effects of serum
and Photobiomodulatiom (PBM) on the protection of the effects promoted by this
poison. Viability and cell detachment and levels of IL-1 1L-6, IL-10 TNFα and LDH were
evaluated. Red emission laser (λ = 660nm) was applied alone or in combination with
serum the laser parameters were 100mW, 4J/cm2 and 1J. The following groups were
formed: 1 - Control; 2 - Cells + P. olfersii venom in different concentrations; 3 - Cells
plus anti-Bothropic serum; 4 Poisoned cells and PBM; 5 - PBM cells plus Anti-Botropic
serum. Cell viability by MTT method and cell detachment by crystal method were
evaluated, as well as cytokines by ELISA method. The venom was observed to be
cytotoxic to endothelial cells at doses above 100 µg after 6 h incubation. No effect on
cell displacement was observed. Both serum AB and PBM promoted protection of
79.4% and 61.2% respectively, but when applied serum AB and PBM together,
protection raised to 92%. There were no detectable changes in venom-promoted IL-1
and LHD levels, there was an increase in venom-promoted IL-6, IL-10 and TNFα. Both
PBM and serum modulated some of the cytokines evaluated. We conclude that P.
olfersii venom is cytotoxic to endothelial cells at doses above 100 µg. Both serum and
PBM alone promote partial protection, but when the association occurs, protection is
greater than 90%.
Key words: Snake bite, Endothelial cells, Fotobiomodulation, Philodryas olfersii ,
Immunomodulatory response. Endothelial Cell.
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Condiçoes de tratamento..................................................................................23
Tabela 2: Protocolo para aplicação do laser ....................................................................24
Tabela 3: Teste de viabilidade celular...............................................................................25
Tabela 4: Teste de viabilidade celular...............................................................................26
Tabela 5: Escolha da dose de Trabalho............................................................................27
Tabela 6:Efeito da PBM no soro AVB IL1..........................................................................28
Tabela 7: Efeito da PBM no soro AVB IL1.........................................................................29
Tabela 8: Efeito da PBM no soro AVB IL6.........................................................................30
Tabela 9: Efeito da PBM no soro AVB IL10.......................................................................31
Tabela 10: Efeito da PBM no soro AVB TnF alfa .............................................................33
Tabela 11: Efeito da PBM no soro AVB LDH.....................................................................34
10
ABREVISATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
P. olfersii ................................................................................................. Philodryas olfersii
sp ..............................................................................................................................espécie
Ca ................................................................................................................................cálcio
Mg ..........................................................................................................................magnésio
Cu .................................................................................................................................cobre
Mn ........................................................................................................................manganês
Fe ...................................................................................................................................ferro
K ............................................................................................................................ potássio
Na ................................................................................................................................sódio
P ................................................................................................................................fósforo
Co .............................................................................................................................colbalto
Zn .................................................................................................................................zinco
PBM .......................................................................................................fotobioestimulação
MTT .......................................
LDH ...................................................................................................Lactato desidrogenase
IL1 ......................................................................................................................interlecina 1
IL6 ....................................................................................................................interleucina 6
IL 10 .............................................................................................................interleucina 10
TNF alfa .....................................
UNINOVE ................................................................................Universidade Nove de Julho
CE ...........................................................................................................células endoteliais
tEnd ........................................................................................................thimic endothelium
DMEN ................................
SFB ............................................................................................................soro fetal bovino
PBS .............................................................................................solução salina balanceada
EDTA ...................................
cel/poço .......................................................................................................células por poço
ug/mL .............................................................................................microgramas por mililitro
D.O. ............................................................................................................densidade óptica
AvB .......................................................................................................soro anti-Bothrópico
Minuto .............................................................................................................................min
EPM ....................................................................................................erro padrão da média
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 8
2. REVISÃO DA LITERATURA 9
2.1 Serpentes no Brasil 9
2.2 Epidemiologia do acidente ofídico 9
2.3 Considerações gerais dos venenos 9
2.4 A Philodryas olfersii 10
2.5 Fotobiomodulação no acidente ofídico 11
3. JUSTIFICATIVA 11
4. OBJETIVO 13
4.1 Geral 14
4.2 Específicos 14
5. MATERIAL E MÉTODOS 17
5.1 Local de realização 17
5.2 Veneno de P. olfersii 17
5.3 Células Endoteliais (CE) 17
5.4 Cultivo celular 17
5.5 Ensaio curva dose-resposta – viabilidade celular 18
5.6 Ensaio curva dose-resposta descolamento celular 18
5.7 Proteção do soro e da PBM 19
5.8 Condições de tratamento 19
5.9 Irradiação com laser de baixa intensidade 19
5.10 Dosagem de IL-1, IL6, IL10, TNFalfa, CK e LDH 20
5.11 Análise estatística 20
6. RESULTADOS 21
6.1 Teste de viabilidade celular 21
6.2 Teste de descolamento celular 22
6.3 Escolha da dose de trabalho 22
6.4 Efeito da PBM e do soro AVB na liberação das citocinas IL-1 , IL-6, e IL-10 e TNF-α de células endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de P. olfersii
21
6.5 Efeito da PBM e do AvB na liberação da enzima Ldh de células 27
12
endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de P. olfersii
7. DISCUSSÃO 29
8.CONCLUSÕES 33
REFERÊNCIAS 35
13
1 INTRODUÇÃO
No Brasil existe uma diversidade muito grande de espécies de serpentes.
Quando ocorre o encontro com o ser humano ocorre o que chamamos de acidente
ofídico, caracterizado pela inoculação do veneno num animal ou no ser humano. As
serpentes que ocasionam esse tipo de acidente, possuem glândulas que produzem
o veneno conectadas a um dente pequeno modificado para injetar o veneno,
chamada de presa, localizadas na parte posterior da boca (dentição Opistóglifa).
O acidente ofídico ocorre geralmente no ambiente urbano, com trabalhadores
do campo ou pessoas que estão no campo a lazer como em pesca, caminhadas,
etc. Nos países em desenvolvimento, os acidentes ofídicos fazem parte da lista de
doenças negligenciadas pelos governos, no Brasil estima-se que esse número
chega a cerca de 30.000 acidentes por ano [1].
A aplicação do soro antiofídico (soroteraia) é o tratamento mais adequado até
momento, embora promova proteção somente a partir da inoculação. Os efeitos
promovidos pelo veneno antes da sua aplicação são irreversíveis. Ele protege dos
efeitos sistêmicos promovidos, mas não protege dos efeitos locais promovidos pelo
veneno. Devido a esse fato, associado ao interesse de se estudar os efeitos
promovidos pelos venenos de serpentes, medidas que visem a redução dos efeitos
adversos locais são interesse de pesquisa.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Serpentes no Brasil
Segundo a Sociedade Brasileira de Herpetologia, o Brasil possui cerca de 760
espécies de serpentes [2]. Dessas, são reconhecidas 386 espécies de serpentes
que podem ocasionar o acidente ofídico de interesse médico. São 2 principais
famílias: a Viperidae, com destaque para os gêneros Crotalus (cascavéis sul
americanas), Bothrops (jararacas) e as Lachesis (surucucus) [2,3,4] e as da família
Elapidae cujo gênero brasileiro responsável pelos acidentes é o gênero Micrurus,
popularmente conhecidas como corais verdadeiras [4].
No entanto, estudos epidemiológicos demonstram um número elevado de
acidentes causados por serpentes pertencentes à família Dipsadidae como as
Philodryas sp. Tais serpentes têm sido cada vez mais responsáveis por
envenenamento humano, ocasionando reações consideráveis no local da picada,
como dor, edema, necrose, eritema, equimose e hemorragia [3,5,6,7].
2.2 Epidemiologia do acidente ofídico
A Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou o acidente ofídico como
doença negligenciada pelos governos dos países em desenvolvimento,
apresentando grande problema de saúde pública. No Brasil ocorrem cerca de
30.000 acidentes ofídicos, com uma incidência de 13,8 casos (100.000 habitantes) e
108 óbitos [1,8,9,10].
Há muitos casos de envenenamento humano promovido por serpentes com
dentição opistóglifa (do grego ópisthen, atrás; posteriormente). Esses acidentes
representam cerca de 20% a 40% do total de acidentes [11,12,13], e são
promovidos pelas serpentes dos gêneros Helicops, Oxyrhopus, Thamnodynastes e
Philodryas [13].
Muitas espécies de Philodryas sp têm sido reportadas como causadoras de
acidentes em humanos, a saber: Philodryas aestivus, Philodryas baroni, Philodryas
patagoniensis e Philodryas olfersii, incluindo um óbito por Philodryas olfersii [11,13].
15
2.3 Considerações gerais dos venenos
Os venenos são produzidos por glândulas secretoras especializadas
localizadas na cavidade oral das serpentes e acopladas às presas por ductos
[14,15].
A princípio, as serpentes utilizam os venenos para defesa, captura de presas
e digestão sendo o mesmo relacionado a uma vantagem evolutiva [15].
Os venenos são compostos por substâncias biologicamente ativas, que agem
nos tecidos biológicos capazes de produzir uma variedade de efeitos locais e/ou
sistêmicos no indivíduo afetado. São constituídos, em sua maior parte, por proteínas
enzimáticas ou não, carboidratos, lipídios, aminas biogênicas, nucleotídeos,
aminoácidos e peptídeos [13,16].
Possuem ainda componentes inorgânicos como, por exemplo, Ca, Cu, Fe, K,
Mg, Mn, Na, P, Co e Zn, alguns dos quais participam como estabilizadores
estruturais de certas proteínas, como as metaloproteinases [16,17,18].
Farmacologicamente os venenos de serpentes são classificados como
miotóxico, hemorrágico, neurotóxico, coagulante, dentre outras de acordo com a sua
composição [18,19].
Consequentemente produzem efeitos teciduais e celulares nas vítimas,
induzindo mionecrose, hemorragia, neurotoxicidade, coagulação sanguínea e
ativação ou desativação de proteínas do complemento [20,21].
A partir dessa classificação, ao longo dos anos, um grande número de
venenos foram estudados em relação aos seus efeitos e muitas toxinas foram
isoladas e purificadas. No entanto, a composição bioquímica e atividades biológicas
decorrem dos venenos de serpentes da família Viperidae [4,10,21,22].
2.4 A Philodryas olfersii (P. olfersii)
O gênero Philodryas é constituído por aproximadamente 13 espécies,
encontradas em todos os países da América do Sul. São reconhecidas por
apresentar corpos alongados, pupilas redondas, coloração verde. Possui a dentição
opistóglifa o que dificulta a inoculação do veneno [4,9,22,23].
Das espécies de Philodryas, a P. olfersii é a espécie que apresenta a maior
distribuição dentro do gênero, podendo ser encontrada em praticamente todos os
16
países da América do Sul, da Amazônia à Patagônia, com exceção do Equador e
Chile [2,3,13,22,24,25].
São animais encontrados em uma grande variedade de ecossistemas,
apresentando hábitos terrestres e semi-arborícolas e são reportadas como
causadoras de acidentes em humanos [13,15,22].
O envenenamento causado por P. olfersii com a presença de efeitos
sistêmicos e locais, têm sido facilmente interpretado como acidente ocasionado por
serpentes do gênero Bothrops (jararacas) pela similaridade dos sinais e sintomas,
por apresentarem efeitos hemorrágicos, edematogênicos, miotóxicos, mionecrose
dentre outros [22,23].
Do ponto de vista experimental, estudos realizados com veneno de P. olfersii,
descrevem a presença de atividade proteolítica, hemorrágica, fibrinolítica,
edematogênica e neurotoxicidade [22.23]. Na junção neuromuscular foram
observadas alterações morfológicas, em decorrência da presença de componentes
miotóxicos. Estudos sobre a miotoxicidade do veneno de P. olfersii, verificaram
atividade edematogênica, atividade miotóxica e mionecrose [22,26,27].
Estudos realizados caracterizando os venenos de P. olfersii e Philodryas
patagoniensis, verificaram que os venenos apresentam teor proteico entre 75-90% e
na realização da purificação do veneno de P. olfersii foram cinco enzimas com
atividade fibrinolítica, sendo quatro metaloproteínases e uma serina proteinase
[16,22,28].
Verificou-se que o veneno da P. olfersii não promove mudanças nos
parâmetros hematológicos como hematócrito e hemoglobina, mas causa
trombocitopenia, leucopenia e neutropenia. Histologicamente foi verificado edema,
infiltrado inflamatório, migração de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares
no músculo [16].
2.5 Fotobiomodulação no acidente ofídico
A ação terapêutica do laser em baixa intensidade, hoje chamada de
Fotobiomodulação (PBM – do inglês PhotoBioModulation) nos diversos tecidos
biológicos é ampla e promissora, com ação regenerativa, anti-inflamatória e
analgésica, tanto em estudos in vitro como in vivo, tais como o aumento da
microcirculação local [29,30,32]. Este aumento está relacionado ao efeito
17
biomodulador pela ação indireta da luz laser sobre o esfíncter pré-capilar por meio
de mediadores químicos, que o mantem aberto constantemente, estimulando a
microcirculação periférica local [31,32,33].
A PBM, por ser uma modalidade de tratamento não invasiva e de baixo custo,
vem sendo amplamente utilizada na prática clínica para o alívio da dor e
regeneração tecidual no acidente ofídico [24,33].
Nos efeitos causados pelo envenenamento ofídico, a PBM reduz os danos
dos efeitos locais promovidos pelos venenos das serpentes do gênero Bothrops por
reduzir a mionecrose, o edema e a inflamação. O mesmo efeito é observado quando
combinado com a terapia antiveneno, ou seja, é também capaz de reduzir o efeito
edematogênico ocasionado pelo veneno de Bothrops jararacuçu [24,30].
Acredita-se que a PBM possa ser um instrumento eficaz e complementar para
o tratamento dos acidentes com serpentes, mas se faz necessário pesquisas para
melhor compreensão do mecanismo de proteção promovido pela PBM.
18
3 JUSTIFICATIVA
A soroterapia é o tratamento mais utilizado hoje em dia e o mais eficaz. A
administração do soro antiofídico até 3 horas após a picada da serpente, é o tempo
adequado para que sejam minimizados os efeitos sistêmicos, reduzindo a taxa de
letalidade. O soro não protege conta os efeitos locais promovidos pelos venenos,
podendo desencadear necrose local, com perda do membro afetado.
Ainda, o soro antiofídico pode ocasionar reações adversas como choque
sistêmico, secundário à introdução de substâncias estranhas ao organismo,
exantema, urticária, espasmo brônquico, edema de glote, choque periférico e onde
não há tratamento imediato, podendo levar o indivíduo à morte.
Ainda que a soroterapia seja sistemicamente eficaz, os efeitos adversos
locais no membro afetado podem persistir levando a comorbidades. Portanto,
estudar um método que leve a proteção local é altamente desejável e neste contexto
observar o efeito do veneno sobre células endoteliais, bem como, da ação da PBM
como protetor celular pode apontar novos caminhos para o tratamento dos acidentes
ofídicos causados pelas serpentes da espécie P. olfersii.
19
4 OBJETIVO
4.1 Geral
Verificar o efeito do veneno da serpente Philodryas olfersii (P. olfersii) em
cultura de células endoteliais.
4.2 Específicos
1 – Verificar os efeitos de diferentes doses e determinar a dose de trabalho;
2 - Verificar a viabilidade e citotoxicidade celular pelo teste de MTT;
3 - Verificar a integridade celular verificando o deslocamento celular pelo teste
de cristal violeta;
4 – Verificar os efeitos do soro antiofídico e da PBM como protetores celulares
após exposição ao veneno separados e juntos;
5 – Dosar Lactato Desidrogenase (LDH);
6 – Dosar mediadores inflamatórios IL-1; IL6 – IL10 e TNF-alfa.
20
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Local de realização
Este estudo foi realizado em colaboração com a Dra. Stella Zamuner do
Laboratório de Cultivo Celular do curso de Mestrado em Medicina da Universidade
Nove de Julho (UNINOVE) e no Laboratório de Fisiologia e Histologia Aplicado à
Engenharia Biomédica do Instituto de Ciências e Tecnologia da Universidade Brasil
5.2 Veneno de P. olfersii
O veneno utilizado foi de exemplares adultos de serpentes da espécie P.
olfersii, provenientes do Serpentário do Centro de Estudos da Natureza da
Universidade do Vale do Paraíba. O veneno foi doado pelo Dr. Jose Carlos Cogo. O
veneno foi extraído através de capilares posicionados nas presas na parte posterior
da boca das serpentes. Assim que foi extraído, o veneno foi colocado em
Eppendorfs e colocados em gelo. Imediatamente após foi homogeneizado, liofilizado
e armazenado em geladeira a 4º C.
Manutenção, manipulação das serpentes e extração do veneno: O processo de
obtenção do veneno das serpentes desta espécie é complexo e requer o trabalho de
várias pessoas. As serpentes foram mantidas em caixas apropriadas que foram
limpas e higienizadas todos os dias e observado o estado de saúde do animal. A
alimentação foi feita 1 vez por mês e a extração de veneno intercalado num intervalo
de 15 dias. Para extrair o veneno desta serpente, foi necessário o trabalho de pelo
menos 4 pessoas, onde a primeira pessoas segurava a cabeça da serpente, uma
segunda pessoa com uma pinça abria a boca da serpente e expunha as presas
localizadas no fundo da arcada dentária, uma terceira pessoa posicionava o capilar
nas presas onde o veneno ia escorrer, e uma quarta pessoa fazia massagem na
glândula de veneno para que o veneno fosse liberado e escorresse no capilar. Assim
que o veneno era liberado no capilar, ele era colocado em recipientes apropriados
em banho de gelo e enviados para liofilização. Ocorreram 4 extrações (1 vez ao
mês) o que permitiu a quantidade de veneno para este estudo. Portanto no semestre
passado, de setembro a dezembro de 2018, foram realizadas as extrações e
21
preparação do veneno para o estudo. Qualquer contaminação do veneno com a
saliva da serpente na hora da extração ou mesmo no processo de manutenção e
liofilização do veneno, pode comprometer a composição do veneno, alterando seus
efeitos e não reproduzindo os efeitos que o veneno produz quando injeta o veneno
na suas vítimas. Neste ano, de fevereiro a junho, foram realizados os experimentos
em cultura de células.
5.3 Células Endoteliais (CE)
Foram utilizadas células endoteliais murinas (hibridomas) da linhagem tEnd
(thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo Dr. Bruno Lomonte, do Instituto
Clodomiro Picado, da Universidade da Costa Rica, Costa Rica.
5.4 Cultivo celular
As CE obtidas foram cultivadas em frascos de poliestireno de 25 cm²
(COSTAR), contendo 5 mL de meio de cultura DMEM (SIGMA), suplementado com
soro fetal bovino (SFB) 10%, gentamicina (40 πg/mL) e L-glutamina (2 mM/L) e
mantidas em incubadora, em atmosfera de 5% C02, a 37°C. O meio de cultura foi
trocado a cada 24 horas e as células foram, então, subcultivadas. Para tanto, o meio
de cultura DMEM foi aspirado com pipeta Pasteur e as células lavadas com 2 mL de
uma solução salina balanceada (PBS). Em seguida, 2 mL de uma solução de
tripsina 0.05%/ EDTA 0.02% foram adicionados ao frasco de cultura, o qual retornou
à estufa de cultura (5% CO2), a 37°C, por um período de até 5 minutos. Decorrido
esse período, as células foram observadas ao microscópio de luz invertida (Carl
Zeiss), para a verificação do destacamento das mesmas. Em seguida, as células,
tripsinizadas e homogeneizadas, foram colocadas em um tubo de 50 mL (COSTAR)
e centrifugadas a 1200 x g, por 5 min. O sobrenadante foi descartado e as CE foram
ressuspendidas em meio DMEM/SFB. A partir daí as células foram semeadas em
frascos de cultura de 75 cm² com meio DMEM/SFB, previamente ambientado na
estufa de cultura.
22
5.5 Ensaio curva dose-resposta – viabilidade celular
As células foram plaqueadas 1X104 cel/poço em placa de cultura de 96 poços
e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período as células
receberam o veneno nas respectivas concentrações 10, 25, 50, 100, 150 e 200
µg/mL e foram incubadas por 3 h e as concentrações de 100, 150, 200 e 250 µg/mL
foram incubadas por 6 horas. O grupo que não recebeu o veneno serviu como grupo
controle. Para análise da viabilidade celular foi realizado o método MTT. Após cada
período de incubação com o veneno, o sobrenadante das culturas foi removido e as
células foram lavadas com 100 µL de PBS 1X. Em seguida, foi adicionado 50 µL de
MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) e
incubadas por 3 horas a 37ºC. Terminado o tempo de incubação foi adicionado 100
µL de isopropanol para ressuspender e solubilizar o precipitado. Por fim, foi
realizada a leitura da absorbância em λ= 620 nm com auxílio de um leitor de placas
(2020, Anthos, Eugendorf, Áustria).
5.6 Ensaio curva dose-resposta descolamento celular
O ensaio dose-resposta foi realizado para verificar qual a concentração do
veneno que produziria efeitos nas células. Assim, foram ensaiadas várias
concentrações e escolhida a concentração ideal de trabalho para prosseguir com os
experimentos aplicando o laser e ozônio. As células foram plaqueadas 1X104
cel/poço em placa de cultura de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão
celular. Após esse período as células receberam o veneno nas respectivas
dosagens 10, 25, 50, 100, 150 e 200 µg/mL em meio de cultura e incubadas por 3h
e, 100, 150, 200 e 250 µg/mL e incubadas por 6 h. O grupo que não recebeu o
veneno serviu como grupo controle. Para análise da porcentagem de descolamento
celular foi utilizado método cristal violeta que nos fornece informações quantitativas
sobre a densidade relativa de células aderidas em placa de cultura. Após cada
período de incubação, os sobrenadantes das culturas foram removidos e as células
lavadas com 100 µL PBS 1X. Em seguida, foram adicionados 40 L de cristal violeta
(0,5%) em ácido acético (30%) por poço. Decorridos 15 minutos, a placas foi lavada
e colocadas para secar. A seguir, 100 L de metanol absoluto (MERCK) foram
adicionados em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) realizada em leitor
23
de ELISA emλ=620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de
descolamento celular observada na monocamada submetida à ação do veneno.
5.7 Proteção do soro e da PBM
Para verificar a proteção do soro Anti-Bothrópico (AvB) (Instituto Butantan
série 0710222/D) e da PBM foi realizado o seguinte protocolo: foram adicionados
nos poços da placa de cultura antiveneno numa concentração 3 vezes maior que a
recomendada pelo fabricante (1 ml neutraliza 5 mg de veneno). Em um grupo, o soro
foi adicionado imediatamente e em outro grupo, após 30 min. à adição do veneno. O
mesmo procedimento foi realizado com aplicação do Laser somente e soro
antiveneno + Laser.
5.8 Condições de tratamento
Os experimentos foram realizados em um ambiente com obscuridade parcial
para não sofrer interferência da luz externa. A cultura de células endoteliais foi
dividida em cinco grupos, conforme Tabela 1:
Tabela 1- Grupos experimentais e aplicabilidade
NOME GRUPOS CELULARES TRATAMENTO
Grupo 1 Controle Células + meio de cultura
DMEM
Grupo 2 Veneno Células + Veneno
Grupo 3 Veneno + PMB Veneno + veneno + PMB
Grupo 4 Veneno + AvB Células + veneno + AvB
Grupo 5 Veneno + PBM + AvB Células + PBM + AVB
5.9 Irradiação com laser de baixa intensidade
Utilizou-se o Laser da marca DMC® modelo Therapy EX, com meio ativo de
Arseneto de Gálio, conforme resumo na Tabela 2:
24
Tabela 2- Protocolo para aplicação do laser
Parâmetros Laser Vermelho
Comprimento de onda
(nm)
660
Densidade de energia
(J/cm2)
2,5
Energia total (J) 1
Potência (mW) 100
Densidade de Potência
(W/cm2)
0,25
Área irradiada (cm2) 0,4
Área do feixe (cm2) 0,028
Modo de aplicação Pontual
Tempo de irradiação (s) 10
5.10 Dosagem de IL-1, IL6, IL10, TNF-α e LDH
A dosagem dessas substâncias foi realizada utilizando Kits de dosagens
comerciais, realizados conforme orientação do fabricante utilizando protocolos
padrão. Foi utilizado leitor de Elisa (Labsystems Multiscan) a 450 nm para
determinar a absorbância e os resultados comparados com a curva padrão.
5.11 Análise estatística
Para a análise dos dados foram utilizados a média, erro padrão. Para as
comparações entre os grupos foi utilizada e análise de variância (ANOVA) com teste
Tukey pos-hoc com auxílio dos softwares R-studio e Excel, e a significância
estatística foi considerável aceitável quando p0.05. Todas as amostras foram feitas
em quadruplicata e três experimentos independentes foram realizados.
25
6 RESULTADOS
Primeiramente foram realizados experimentos para verificar a concentração
do veneno que produziria efeitos nas células endoteliais. Foram utilizadas várias
doses e após definir a dose de trabalho, seguiu-se os testes com o soro e PBM.
6.1 Teste de viabilidade celular
Para verificar se o veneno de P. olfersii seria citotóxico para as células
endoteliais, realizamos o teste de MTT, que mede a viabilidade celular com base no
dano induzido nas mitocôndrias das células. De acordo com os resultados obtidos,
verificamos que o veneno promove lesão celular em altas doses, acima de 100
µg/mL (Figuras 1 e 2).
Figura 1: Efeito do veneno de P. ofersii na viabilidade de células endoteliais tEND. Células endoteliais tEND foram colocadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. Não foi verificado diferença estatística entre as doses utilizadas
26
Figura 2: Efeito do veneno de P. ofersii na viabilidade de células endoteliais tEND. A integridade celular foi determinada pelo método de MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três
experimentos independentes. (*p 0,05).
6.2 Teste de descolamento celular
A capacidade do veneno de P ofersii em afetar a integridade das
monocamadas das células endoteliais, em cultura, foi avaliada pelo descolamento
das monocamadas. Nos experimentos realizados, em todas as doses, não
observamos diferença estatística em relação ao controle indicando que o veneno
não age promovendo o descolamento das células (dados não mostrados).
6.3 Escolha da dose de trabalho
De acordo com os resultados dos experimentos, a concentração de 150
µg/mL mostrou-se a melhor para a realização dos próximos experimentos. A partir
da escolha da dose de trabalho, realizou-se os experimentos para verificação do
efeito citoprotetor do soro AvB, da PBM e da aplicação do soro AvB + PBM e
liberação de IL1, IL6, IL10, CK e LDH (Figura 3 A e B).
*
27
Figura 3: Efeito da PBM e do soro AvB na viabilidade de células endoteliais tEND incubadas com o veneno de P. ofersii. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o veneno (150 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com laser ou aplicado o soro AvB e incubadas por 6 h. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal violeta. A – AvB e PBM aplicados imediatamente após a
adição do veneno. B – AvB e PBM aplicados 30 minutos após a adição do veneno. (* e # p 0,05).
* #
(A)
(B)
*
28
6.4 Efeito da PBM e do soro AVB na liberação das citocinas IL-1, IL-6, e IL-10 e
TNF-α de células endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de P. olfersii
IL1 – não foi observada diferença entre os grupos na liberação de IL1beta
imediatamente e nem após 30 minutos de incubação das células com o veneno de
P. olfersii. (Figuras 4Ae 4B).
(A)
29
Figura 4: Efeito do veneno na liberação de IL1. A liberação foi verificada nos diversos tratamentos. Foram utilizados doses de veneno na concentração de 150 µg e incubadas por 6h. A – liberação imediatamente após a adição do veneno. B – liberação após 30 minutos após a adição do veneno. Não foi observado diferença estatística entre os tratamentos.
IL6 – quando dosamos a liberação dessa citocina no sobrenadante de células
endoteliais, observamos que não houve liberação imediata promovido pelo veneno e
em nenhum dos tratamentos estudados. Observamos que o veneno sozinho libera
essa citocina embora não tenha sido observado diferença estatística com o controle.
No entanto, após 30 minutos, o veneno causou aumento significativo da liberação
dessa citocina. A PBM sozinha teve efeito inibidor na liberação dessa citocina, caso
não observado quando utilizado somente o soro. Contudo, o tratamento em conjunto
do AvB + PBM, acentuou a inibição de liberação quando comparado apenas com o
grupo de Veneno + Fotobiomodulação (Figuras 5 A e B).
(B)
30
Figura 5: Efeito do veneno na liberação de IL6. A liberação foi verificada nos diversos tratamentos. Foram utilizados doses de veneno na concentração de 150 µg e incubadas por 6h. A – liberação imediatamente após a adição do veneno. Não foi observado diferença estatística entre os grupos. B – liberação após 30 minutos a adição do veneno. Cada valor representa a média ± EPM de três
experimentos independentes (* e # p0.05).
(B)
*
#
(A)
31
IL10 – também não foi observada diferença estatística significativa na
liberação dessa citocina pelas células endoteliais cultivadas nos grupos controle,
veneno e tratamentos imediatamente após a adição do veneno. Quando verificamos
a liberação promovida pelo veneno, vimos que há uma tendência no aumento na
liberação, mas não mostrou se estatisticamente diferente. Porém, observamos que
após 30 min., os tratamentos PBM e PBM + AvB inibiram a liberação dessa citocina.
Quando estes tratamentos foram associados o efeito de liberação desta citocina foi
atenuado não sendo diferente do controle (Figura 6 A e B).
32
Figura 6: Efeito do veneno na liberação de IL10. A liberação foi verificada nos diversos tratamentos. Foram utilizados doses de veneno na concentração de 150 µg e incubadas por 6h. A – liberação imediatamente após a adição do veneno. Não foi observado diferença entre os grupos. B – liberação após 30 minutos a adição do veneno. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos
independentes. (*p 0,05).
(B)
*
(A)
33
TNFα – Observamos que imediatamente após a adição do veneno
observamos que houve diminuição da liberação no grupo veneno + AvB e veneno +
AvB + PBM (Figuras 7 A e B).
Figura 7: Efeito do veneno na liberação de TNFalfa. A liberação foi verificada nos diversos tratamentos. Foram utilizados doses de veneno na concentração de 150 µg e incubadas por 6h. A – liberação imediatamente após a adição do veneno. B – liberação após 30 minutos a adição do
veneno. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. (* e # p 0,05).
(A)
#
*
(B)
*
34
6.5 Efeito da PBM e do AvB na liberação da enzima LDH de células endoteliais
submetidas aos efeitos do veneno de P. olfersii
LDH – A enzima LDH participa do processo de utilização da glicose para
formação de energia e como marcador de lesão de membrana celular. O veneno de
P. olfersii não promoveu liberação dessa enzima, em ambos os tempos testados
(Figura 8 A e B).
Figura 8: Efeito do veneno na liberação de LDH. A liberação foi verificada nos diversos tratamentos. Foram utilizados os tratamentos com dose de veneno na concentração de 150 µg e incubadas por 6h. A – liberação imediata após a adição do veneno. B – liberação após 30 min. a adição do veneno. Observamos que não houve diferença estatística na liberação desta enzima.
(B)
(A)
35
7 DISCUSSÃO
Neste trabalho, a linhagem endotelial tEnd foi utilizada para examinar o efeito
direto do veneno de P. olfersii em células endoteliais. Nossos resultados
demonstraram que o veneno de P. olfersii induz uma perda de integridade celular e
diminuição da viabilidade celular em doses acima de 100 µg/mL incubadas por 6 h.
Estes resultados estão de acordo com as atividades citotóxicas dos componentes
venenosos de botrópicos como miotoxinas e metaloproteinases, estudadas em
células endoteliais [34,35]. O endotélio tem um papel protetor na o sistema
cardiovascular, liberando substâncias que modulam a contração do músculo liso,
sua proliferação, inflamação, adesão e agregação plaquetária e controle da
homeostase [36,37]. Portanto, em termos de lesão ou disfunção desse tecido, há
repercussões na estrutura vascular, no tecido adjacente e, finalmente, no sistema
cardiovascular [37].
Estudos experimentais demonstraram a eficácia do tratamento com PBM na
redução de reações locais induzidas por várias espécies de veneno de Bothrops in
vivo [29,30,32].
Em estudos realizados anteriormente o tratamento com PBM diminuiu o efeito
hemorrágico causado pelo veneno de Bothrops moojeni in vivo [27], porém, os
efeitos para veneno da P. ofersii ainda são desconhecidos. Neste estudo, o efeito
da PBM, utilizando laser de emissão vermelha λ= 660 nm com a densidade de
energia de 2,5 J/cm2 na citotoxicidade causada pelo veneno de P. olfersii sobre
células endoteliais, foi avaliada. A dosimetria empregada neste estudo foi escolhida
com base na literatura consultada, que apresentou resultados significantes da PBM
tanto com laser de emissão vermelha, quanto infravermelha com densidades de
energia semelhantes a empregada neste estudo [38,39].
Em uma tentativa de investigar se a PBM poderia modificar os componentes
do veneno e, portanto, diminuir a sua toxicidade, a solução do veneno liofilizado foi
irradiada antes da incubação com as células tEnd (dados não apresentados). Os
resultados demonstraram não haver foto-modificação no veneno, sendo que, o
veneno irradiado promoveu o mesmo efeito que o veneno não irradiado. Este
resultado indica que a irradiação do laser não modifica os componentes ou estrutura
36
do veneno, portanto, o efeito seria devido a efeitos fisiológicos em células e tecidos
confirmado por resultados relatados em um modelo experimental in vivo [33].
No presente estudo, nenhum tratamento reduziu o descolamento causado
pelo veneno de P. olfersii em células endoteliais. O descolamento de células
endoteliais é um dos primeiros efeitos associado com a perda de integridade celular
e a presença de hemorragia [40,41]. A hemorragia local e sistêmico causada pelo
veneno ofídico parece estar diretamente relacionado a uma ação indireta de
metaloproteinases do veneno na membrana basal agindo nos componentes da
matriz extracelular capilar relacionada a estabilidade da estrutura dos microvasos na
vasculatura [41,19].
Em nosso modelo experimental, não foi possível verificar a ação da radiação,
pois não houve diferença estatística no descolamento de células endoteliais. Esse
dado foi corroborado pelos resultados obtidos com as medidas de LDH que é uma
das principais enzimas contida no citoplasma que em circunstâncias normais não
pode permear a membrana celular. A enzima LDH participa do processo de
utilização da glicose para fornecimento energético e como marcador de lesão de
membrana celular. Neste estudo, o veneno de P. olfersii não promoveu liberação
dessa enzima, em todas as condições experimentais sugerindo que pelo menos na
dose e tempo estudados, o veneno não promoveu lesões significativas nas células a
ponto de liberar essa enzima.
Também não foi observado neste estudo variação da IL-1β, ela é
primariamente produzida por macrófagos e monócitos, mas também por células não
imunológicas como células endoteliais ativadas por lesão celular, sendo considerada
uma citocina pró-inflamatória. Esta citocina é considerada um dos mais importantes
marcadores de indução de resposta inflamatória aguda. Porém, nas condições deste
estudo, não foram observadas diferenças nos níveis detectáveis desta citocina
[42,43,44].
Resultado diferente foi observado com os valores obtidos para IL-6, onde, o
maior tempo de contato com o veneno resultou no aumento de sua expressão. A
ação do soro não modificou essa expressão, porém, nos casos em que ouve
emprego da PBM houve redução dos níveis de IL-6. Este fato pode ser relevante
para efeito das comorbidades associadas ao acidente ofídico. A IL-6 tem múltiplas
vias de atuação, ela é um sinalizador para a degradação tecidual por estímulo da
expressão de metaloproteinases e pode promover perda óssea pois aumenta
37
atividade osteoclástica e diminui atividade de osteoblastos. Estudos clínicos indicam
que o emprego de bloqueadores de IL-6 é eficiente para controlar, por exemplo,
sintomas de artrite reumatoide e perda óssea de origem inflamatória, indicando o
papel da IL-6 na inflamação e também nas doenças relacionadas a inflamação
[48,49].
Vários relatos estabeleceram o envolvimento de citocinas pró-inflamatórias na
inflamação local induzida por venenos ofídicos, como IL-1β, IL-6 e TNF-α [42].
Outras investigações mostraram que mRNAs codificadores de IL-1β, IL-6 e TNF-α
foram supra-regulados após a injeção de jararagina, uma metaloproteinase isolada
do veneno de Bothrps jararaca em músculo de camundongos [43,47]. Além disso, a
jararagina pode estimular diretamente a expressão de mRNA codificando citocinas
pro-inflamatórias em células endoteliais [17,19,21,46,48].
Neste aspecto, as células endoteliais são reguladores chave da resposta
inflamatória, já que, no caso de lesão eles revestem o vaso sanguíneo, controlam a
aderência e migração de leucócitos e a troca de fluidos da corrente sanguínea para
o tecido lesado [44,45,51].
Nas medidas realizadas para verificação dos níveis de IL-10 os resultados
foram diferentes dos observados nas demais citocinas. O emprego da PBM e do
soro isoladamente em células expostas ao veneno promoveu diminuição nos níveis
detectáveis de IL-10. Quando a PBM foi empregada em conjunto com o soro ocorreu
supressão deste efeito, logo os níveis de IL-10 foram iguais aos das células apenas
expostas ao veneno [50,20].
A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória que tem a capacidade de suprimir
diversos eventos inflamatórios, incluindo a produção de outras citocinas e moléculas
sinalizadoras, i.e., IL-1, IL-6 e interferon-α em macrófagos e monócitos [50]. De
acordo com alguns autores os níveis mais altos de IL-10 podem estar relacionados
com processos de down regulation das demais citocinas e, portanto. levar a uma
resposta inflamatória mais controlada promovendo regeneração tecidual49. Em
nosso estudo os maiores níveis de proteção celular foram observados na
combinação da PBM com o soro, e esses dados podem estar relacionados com os
maiores níveis de IL-10 observados nesse grupo experimental. Porém, eventos
contraditórios em relação ao papel desta citocina podem ser observados na
literatura. No estudo de Eming et al. [50], ratos com deficiência na produção de IL-10
apresentaram evolução mais rápida da cicatrização de lesões, sendo que os autores
38
concluíram que a IL-10 pode ser responsável por retardos no processo de reparo de
feridas. Portanto, a fim de compreender o papel deste resultado estudos in vivo com
avaliação dos níveis desta citocina e acompanhamento da cicatrização da lesão
poderão esclarecer melhor seu papel no caso de acidentes ofídicos [51,52].
O resultado para a avaliação da presença de TNFα demonstraram diminuição
ao longo prazo para todos os grupos tratamento em relação ao grupo apenas
exposto ao veneno. O TNFα em baixas concentrações age em células endoteliais
promovendo vasodilatação e liberação de quimioquinas que tem ação quimiotáxica
para leucócitos. Também é descrito que TNFα apresenta deposição irregular dobre
células endoteliais que apresentam heterogeneidade nos receptores para TNFα o
que pode resultar em altas concentrações locais de trombina e deposição de fibrina
na ausência de trombina [51]. As menores concentrações de TNFα nos grupos
tratados podem indicar o menor grau de agressão sofrido por estas células
diminuindo a necessidade de expressão aumentada desta citocina.
Em conclusão, este estudo indica que a PBM resultou em citoproteção nas
células endoteliais após exposição ao veneno, envolvendo preservação da
membrana plasmática e inibição da liberação de TNFα, IL-6 e IL-10.
Novos estudos devem ser realizados para melhor compreensão dos
mecanismos que envolvem tais efeitos, a fim de encontrar o desenvolvimento de
estratégias complementares para tratamento de envenenamento causado por
serpentes.
39
8 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos, concluímos que o veneno de P. Olfersii:
1 – É citotóxico para as células endoteliais em altas concentrações (maior do
que 100 µg) incubados por 6h.
2 - A aplicação da PBM associado ao antiveneno botrópico, exerceu maior
efeito protetor nas células endoteliais.
3 – O antiveneno botrópico somente exerceu efeito protetor, mas em menor
intensidade quando comparado com associado à PBM.
4 – A PBM isoladamente exerceu efeito protetor, mas em menor intensidade
quando comparado com associação ao soro.
5 – O contato com o veneno não aumentou na liberação IL1 e LDH mas
promoveu liberação IL6, IL10 e TNFα.
6 – A PBM diminuiu os níveis de IL-6, IL-10 2 TNFα, enquanto o soro diminuiu
não afetou os níveis de IL-6, a combinação PBM e soro apresentou efeito supressor
na inibição de IL-10.
40
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