UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDAlfonso, del CAI de Microscopía y a Fernando, del CAI de Rayos X. Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmacéutica S.L., con la que el Instituto

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS Departamento de Bioquiacutemica y Biologiacutea Molecular I

QUITOSANTO UN BIOPOLIacuteMERO CON APLICACIONES EN SISTEMAS DE LIBERACIOacuteN

CONTROLADA DE FAacuteRMACOS

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Ruth Expoacutesito Harris

Bajo la direccioacuten de los doctores

Aacutengeles Mariacutea Heras Caballero Niuris Acosta Contreras

Madrid 2010

ISBN 978-84-693-5983-9 copy Ruth Expoacutesito Harris 2010

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS

Departamento de Bioquiacutemica y Biologiacutea Molecular I

QUITOSANO UN BIOPOLIacuteMERO CON APLICACIONES

EN SISTEMAS DE LIBERACIOacuteN CONTROLADA DE

FAacuteRMACOS

MEMORIA DE TESIS DOCTORAL

PRESENTADA POR

Dntildea Ruth Expoacutesito Harris

DIRECTORES DE TESIS

Aacutengeles Mariacutea Heras Caballero

Niuris Acosta Contreras

Madrid 2009

Agradecimientos

Durante estos antildeos he recibido el apoyo de muchas personas a las que quiero mostrar mi

maacutes sincero agradecimiento

Agradezco a mis directoras de Tesis las Dras Aacutengeles Heras y Niuris Acosta el apoyo

y el aacutenimo que me han brindado durante este tiempo y sobre todo el haberme dado la

oportunidad de trabajar con ellas A Aacutengeles tengo que agradecerle el aacutenimo que me ha

dado diacutea tras diacutea para que todo el trabajo realizado durante estos antildeos tuviese su fruto en

esta memoria de tesis A Niuris agradecerle el esfuerzo por ayudarme aun trabajando en

otro centro

Expreso mi agradecimiento al Instituto de Estudios Biofuncionales y al Departamento

de Fiacutesico-Quiacutemica II de la Facultad de Farmacia en las personas que ocupan su

direccioacuten el Dr Joseacute Gonzaacutelez y el Dr Pedro Antonio Galera respectivamente Gracias

tambieacuten a la Dra Begontildea Elorza investigadora principal de los proyectos MAT 2004-

03982 y MAT2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacioacuten durante los antildeos que

la Dra Aacutengeles Heras estuvo en comisioacuten de servicios en el Ministerio de Sanidad y

Consumo

El agradecimiento maacutes grande de todos va dirigido a mi familia sobre todo a Sergio a

David y a mi madre porque esta Tesis es una realidad gracias a ellos a su apoyo

incondicional desde el principio Mencioacuten especial para Sergio por su ayuda y su

paciencia y por estar ahiacute en los momentos buenos y malos Gracias tambieacuten a los que

estaacuten lejos y a los que ya no estaacuten sobre todo a Paquita porque seacute que le hubiese

gustado estar aquiacute y ver mi Tesis terminada

He tenido la suerte de conocer a gente maravillosa en el Instituto de Estudios

Biofuncionales Gracias a mis nintildeas Marian Carol Ana y Alba que han estado

conmigo desde el principio de esta andadura y con quienes he compartido tantos

momentos A las que llegaron despueacutes Inma Susana y Elena por sus consejos su

ayuda en estos uacuteltimos meses y su amistad Y por supuesto a Bea Inma y Gemma por

ayudarme en mis inicios No me olvido de Ineacutes probablemente a quien le debo que el

tema de mi tesis sea el que es y quien me ayudoacute y apoyoacute durante los primeros antildeos Al

resto de compantildeeros del Instituto y del CAI de RMN gracias por los consejos las risas

y todos los buenos momentos

He disfrutado de una estancia en la Universidad de Nottingham Quiero mostrar mi

agradecimiento a las Prof Lisbeth Illum y Snow Stolnik el haberme dado la

oportunidad de realizar parte del trabajo experimental de la Tesis en su grupo de

investigacioacuten Gracias a mis compantildeeros alliacute a Driton y Emilia por dedicar su tiempo a

ensentildearme y ayudarme en el laboratorio

Gracias a la Red Alfa II 0259 de la Unioacuten Europea disfruteacute del curso ―Biopolymers in

materials and life sciences en la Universidad de Potsdam (Alemania) una de las

mejores experiencias que he vivido

En la Universidad Complutense tambieacuten debo mostrar mi agradecimiento a Eugenio y

Alfonso del CAI de Microscopiacutea y a Fernando del CAI de Rayos X

Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmaceacuteutica SL con la que el Instituto de

Estudios Biofuncionales mantuvo un contrato artiacuteculo 83 el financiar esta tesis durante

el primer antildeo

Esta tesis se ha realizado con la financiacioacuten de dos contratos asociados a los proyectos

MAT 2004-03982 y MAT 2007-63757 del Ministerio de Ciencia e Innovacioacuten

Muchas gracias a todos de corazoacuten

FRUTO DE ESTA TESIS HAN SIDO

Publicaciones

I Pantildeos R Harris N Acosta B Miralles A Heras ldquoStudy of the amount of

chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexesrdquo Advances in Quitin

Science Vol IX (2006) Eds A Domard E Guibal K M Varingrum Pags 637-

R Harris I Pantildeos N Acosta A Heras ―Preparation and characterization of

chitosan microspheres for controlled release of tramadolrdquo Journal of

Controlled Release (2008) 132 (3) e76-e77

Inmaculada Aranaz Marian Mengiacutebar Ruth Harris Ineacutes Pantildeos Beatriz

Miralles Niuris Acosta Gemma Galed Aacutengeles Heras ―Functional

characterization of chitin and chitosanrdquo Current Chemical Biology (2009) 3

203-230

B Miralles M Mengiacutebar R Harris and A Heras ldquoSuitability of a colorimetric

method for the selective determination of chitosan in dietary supplementsrdquo

Food Chemistry Aceptado Julio de 2009 Ref FOODCHEM-D-09-01275R1

Inmaculada Aranaz Ruth Harris and Angeles Heras ldquoChitosan Amphiphilic

Derivatives Chemistry and Applicationsrdquo Current Organic Chemistry

Aceptado 2009

R Harris E Lecumberri I Mateos-Aparicio M Mengiacutebar A Heras

―Chitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of natural

antioxidants and their application in cosmeticsrdquo Carbohydrate Polymers (En

revisioacuten CARBPOL-D-09-00950)

R Harris N Acosta A Heras ldquoNovel chitosan hydrochloride - genipin

microspheres for controlled release of tramadol hydrochloriderdquo Journal of

Microencapsulation (Enviado TMNC-2009-0197)

E Lecumberri R Harris A Heras ldquoChitosan microspheres crosslinked with

genipin for controlled release of drugsrdquo En elaboracioacuten para enviar a la revista

Marine Drugs

R Harris I Pantildeos N Acosta A Heras ldquoNew chitosan films for controlled

release of ciprofloxacin hydrochloriderdquo En elaboracioacuten para enviar a la revista

―Drug Delivery

D Vllasaliu R Harris L Casettari A Heras L Illum S Stolnik ―Tight

junction modulation of chitosan solution and chitosan nanoparticlesrdquo En

elaboracioacuten para enviar a la revista ―Journal of Controlled Release

Contribuciones a congresos internacionales

I Pantildeos R Harris I Aranaz G Galed N Acosta A Heras ldquoChitosan films

for the controlled release of ciprofloxacin HCl IV Congreso Internacional de

Biomateriales BIOMAT La Habana Cuba 2006 (Poacutester)

I Pantildeos R Harris B Miralles N Acosta A Heras ldquoStudy of amount of

chitosan bound to alginate in polyelectrolyte complexesrdquo 10th

International

Conference on Chitin and Chitosan 7th

International Conference of the

European Chitin Society Montpellier Francia 2006 (Poacutester)

I Pantildeos R Harris B Miralles N Acosta A Heras ldquoChitosan films for

controlled release of ciprofloxacinrdquo IV Simposio Iberoamericano de quitina

SIAQ Natal Brasil 2007 (Poacutester)

I Pantildeos R Harris N Acosta A Heras ldquoSustained release chitosan

microspheres prepared by a wow emulsion-spray drying methodrdquo 34rd

Controlled Release Society Meeting Long Beach California EEUU 2007

(Poacutester)

R Harris I Pantildeos N Acosta A Heras ldquoPreparation and characterization of

chitosan microspheres for controlled release of tramadolrdquo 10th

European

Symposium of Controlled Drug Delivery Noordwijk aan Zee (Holanda) 2008

(Poacutester)

R Harris I Pantildeos N Acosta A Heras ldquoChitosan-genipin microspheres

prepared by spray-drying characterizationrdquo World Meeting in Pharmaceutics

Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology Barcelona 2008 (Poacutester)

R Harris N Acosta E Lecumberri A Heras ldquoNovel chitosan hydrochloride-

genipin microspheres for controlled release of tramadol hydrochloriderdquo

Controlled Release Society Copenhague (Dinamarca) 2009 (Poacutester)

genipin for controlled release of drugsrdquo European Quitin Society Venecia

(Italia) 2009 (Poacutester)

R Harris E Lecumberri I Mateos-Aparicio M Mengiacutebar SIglesias A

Heras ldquoChitosan nanoparticles and microspheres for the encapsulation of

natural antioxidants and their application in cosmeticsrdquo11th

Internacional

Conference on Chitin and Chitosan Taipei (Taiwan) 2009 (Poacutester)

A Heras R Harris E Lecumberri I Mateos-Aparicio M Mengiacutebar

ldquoChitosan and co-passengers Functional applicationsrdquo 11th

Internacional

Conference on Chitin and Chitosan Taipei (Taiwan) 2009 Keynote lecture

―Quitosano biopoliacutemero creador de sinergias V Iberoamerican chitin

symposium Chile 2010 Plenary conference

Congresos nacionales

R Harris ―Peliacuteculas de quitosano para la liberacioacuten controlada de faacutermacosrdquo

II Jornadas Complutenses y I Congreso Nacional de Investigacioacuten para alumnos

de pregrado en Ciencias de la Salud Facultad de Farmacia Madrid Espantildea

2007 Comunicacioacuten oral

Estancias en centros extranjeros

Estancia de cuatro meses en la Universidad de Nottingham (Reino Unido) Drug

delivery and tissue engineering department Febrero-Mayo 2008

Actividades de transferencia de tecnologiacutea

Integrante del equipo promotor de la empresa de base tecnoloacutegica (EBT) InFiQuS

Fecha 2009

Informes a empresas

1 Matrices de liberacioacuten controlada a base de quitosano aplicaciones a la

claritromicina y a la venlafaxina Vegal Farmaceacuteutica SL Marzo 2007

claritromicina y a la venlafaxina Vegal Farmaceacuteutica SL Junio 2007

3 Matrices de liberacioacuten controlada a base de quitosano y genipina Laboratorios ROVI

SA Junio 2008

Abreviaturas

ANOVA anaacutelisis de la varianza de una viacutea

CS quitosano

DRX difraccioacuten de rayos X

EE eficiencia de encapsulacioacuten

FFLM formas farmaceacuteuticas de liberacioacuten modificada

FT-IR espectroscopiacutea de infrarrojos por transformada de Fourier

FD dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceiacutena (del ingleacutes ―FITC-Dextran)

GD grado de desacetilacioacuten

Gnp genipina

HBSS solucioacuten salina equilibrada de Hank (del ingleacutes ―Hanks balanced salt solution)

HCS hidrocloruro de quitosano

LD 50 dosis letal para el 50 de un conjunto de animales de prueba (del ingleacutes ―lethal

dosis)

LDH test de citotoxicidad en el que se determina la liberacioacuten de lactato

deshidrogenasa de las ceacutelulas

MTS ensayo de citotoxicidad en el que se utiliza una sal del tetrazolio (3-(45-

dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolio)

PBS tampoacuten fosfato salino (del ingles ―phosphate buffered saline)

RA rendimiento de atomizacioacuten

SD desviacioacuten estaacutendar (del ingleacutes ―standard deviation)

SEM microscopiacutea electroacutenica de barrido (del ingleacutes ―scanning electron microscopy)

SGF fluido gaacutestrico simulado (del ingleacutes ―simulated gastric fluid)

SIF fluido intestinal simulado (del ingleacutes ―simulated intestinal fluid)

TPP tripolifosfato soacutedico

UV ultravioleta

UV-Vis ultravioleta-visible

Iacutendice

I INTRODUCCIOacuteN 15

1 Sistemas de liberacioacuten modificada 17

2 Poliacutemeros utilizados en sistemas de liberacioacuten de faacutermacos 18

3 Quitosano Caracteriacutesticas propiedades y aplicaciones 19

4 Microesferas y nanopartiacuteculas de quitosano 22

5 Peliacuteculas de quitosano 25

51 Hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano 26

6 El quitosano como promotor de la absorcioacuten de faacutermacos 28

7 Cultivos celulares como modelo epitelial 32

8 Agentes entrecruzantes 34

9 Faacutermacos empleados 38

10 Modelos matemaacuteticos 42

II MATERIALES Y MEacuteTODOS 49

1 Materiales 51

2 Obtencioacuten de microesferas de hidrocloruro de quitosano 52

3 Obtencioacuten de peliacuteculas de quitosano 53

4 Obtencioacuten de nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano 54

5 Caracterizacioacuten 54

51 Estudios de morfologiacutea 54

52 Determinacioacuten de la caraga eleacutectrica superficial de microesferas y

nanopartiacuteculas 55

53 Estudios de interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero 56

531 Difraccioacuten de rayos X 56

532 Espectroscopia de infrarrojo 56

54 Reaccioacuten de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina 57

Iacutendice

55 Determinacioacuten del grado de entrecruzamiento con genipina 57

56 Estudios de hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano 58

57 Determinacioacuten de la cantidad de quitosano unido a las nanopartiacuteculas 58

6 Estudios de liberacioacuten in vitro 59

61 Microesferas de claritromicina 59

62 Microesferas de hidrocloruro de tramadol 60

63 Peliacuteculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino 61

7 Cultivos celulares 61

71 Ceacutelulas Calu-3 61

72 Ensayo de toxicidad MTS 62

73 Ensayo de liberacioacuten de LDH 63

74 Determinacioacuten de la resistencia transepitelial 63

75 Ensayos de permeabilidad celular 64

III RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 69

1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina obtenidas por

atomizacioacuten 71

11 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas

con tripolifosfato soacutedico 71

111 Obtencioacuten de las microesferas 71

113 Determinacioacuten de la carga superficial de las microesferas 75

114 Interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero 77

con genipina 90

13 Conclusiones parciales del capiacutetulo 95

2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de tramadol obtenidas

por atomizacioacuten 97

22 Determinacioacuten del grado de entrecruzamiento 101

Iacutendice

31 Obtencioacuten de las peliacuteculas 119

33 Grado de hinchamiento de las peliacuteculas 121

342 Espectroscopiacutea de infrarrojo 128

35 Ensayos de liberacioacuten in vitro 131

4 Estudio del efecto del quitosano sobre las uniones estrechas de ceacutelulas Calu-3 139

41 Obtencioacuten y caracterizacioacuten de nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano 140

42 Estudios de citotoxicidad 142

421 Ensayo de MTS 142

422 Ensayo LDH 144

43 Estudio de la resistencia transepitelial 146

IV CONCLUSIONES 153

V BIBLIOGRAFIacuteA 157

Objetivos

OBJETIVOS

Siguiendo la liacutenea de investigacioacuten del grupo ―Investigaciones en el Sistema Quitina-

Quitosano y dentro del aacuterea de sistemas de liberacioacuten controlada de faacutermacos basados

en quitosano en esta Tesis se ha dado un paso maacutes en el conocimiento del quitosano y

las potenciales aplicaciones de este biopoliacutemero en el campo de la tecnologiacutea

farmaceacuteutica

Asiacute el objetivo general de esta Tesis ha sido por una parte obtener microesferas

peliacuteculas y nanopartiacuteculas de quitosano para la encapsulacioacuten de faacutermacos y por otra

parte estudiar la citotoxicidad del quitosano y su capacidad como promotor de

absorcioacuten de macromoleacuteculas en monocapas de ceacutelulas Calu-3

Este objetivo general podriacutea desglosarse en los siguientes objetivos especiacuteficos

Obtencioacuten caracterizacioacuten y estudio de la liberacioacuten in vitro de microesferas de

hidrocloruro de quitosano como sistemas de liberacioacuten controlada de

claritromicina e hidrocloruro de tramadol para administracioacuten oral

Obtencioacuten caracterizacioacuten y estudio de la liberacioacuten in vitro de peliacuteculas de

quitosano como sistemas de liberacioacuten controlada de hidrocloruro de

ciprofloxacino para uso toacutepico

Estudio del efecto del quitosano en solucioacuten o en nanopartiacuteculas sobre una liacutenea

celular de epitelio respiratorio citotoxicidad apertura de uniones estrechas y

permeabilidad celular de macromoleacuteculas

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

1 Sistemas de liberacioacuten modificada

En las uacuteltimas deacutecadas el desarrollo de nuevas formas farmaceacuteuticas de liberacioacuten

modificada (FFLM) tambieacuten llamadas de liberacioacuten controlada ha suscitado gran

intereacutes en la industria farmaceacuteutica Se trata de dispositivos que aportan mejores pautas

posoloacutegicas mejor perfil farmacocineacutetico e incluso reduccioacuten de efectos adversos De

acuerdo con la Real Farmacopea Espantildeola [1] las FFLM son aqueacutellas en las que la

velocidad y el lugar de liberacioacuten de la sustancia o sustancias activas es diferente del de

la forma farmaceacuteutica de liberacioacuten convencional administrada por la misma viacutea En

ellas se introducen modificaciones en la formulacioacuten o en el proceso de produccioacuten con

el fin de alterar la velocidad el tiempo o el lugar de liberacioacuten del faacutermaco [2] De esta

forma se pueden alcanzar los niveles terapeacuteuticos del faacutermaco en el lugar de accioacuten y

mantenerlos a lo largo del tiempo Como consecuencia las FFLM presentan numerosas

ventajas con respecto a las formas farmaceacuteuticas convencionales [3]

Disminucioacuten de la frecuencia de administracioacuten del medicamento mejorando de

esta forma el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente

Reduccioacuten de los efectos secundarios relacionados con dosis elevadas

Disminucioacuten de la fluctuacioacuten de niveles plasmaacuteticos

Efecto terapeacuteutico maacutes uniforme

Sin embargo tambieacuten existen algunos inconvenientes entre los que hay que destacar

Coste elevado

Correlaciones in vitroin vivo difiacuteciles de predecir

Posible sobredosificacioacuten por liberacioacuten inmediata e incontrolada de la dosis

Dificultad en el ajuste de la dosificacioacuten

Dependencia del tiempo de traacutensito intestinal en las formas de administracioacuten

Riesgo de acumulacioacuten del faacutermaco y necesidad de ajuste de pautas posoloacutegicas

Introduccioacuten

En la Tabla I1 se resumen los principales tipos de liberacioacuten modificada [4 5]

Tabla I1 Caracteriacutesticas y ejemplos de los diferentes tipos de liberacioacuten modificada

Tipo de liberacioacuten Caracteriacutesticas

principales Ejemplos

Prolongada o controlada

Disentildeadas para garantizar

una liberacioacuten maacutes lenta del

faacutermaco

Comprimidos o parches

lipiacutedicos hidrofiacutelicos o de

poliacutemeros insolubles

Retardada

Retrasan la liberacioacuten del

principio activo

No prolongan el efecto

terapeacuteutico

Sistemas de cubierta

enteacuterica o formas

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

Modificadas para garantizar

una liberacioacuten secuencial

del faacutermaco

Normalmente presentan dos

fases una inmediata y otra

al cabo de un tiempo

Sistemas que pretenden

hacer coincidir la liberacioacuten

del faacutermaco con ciclos

circadianos hormonales

De control espacial

Liberan el principio activo

cuando la forma

farmaceacuteutica alcanza su

lugar de accioacuten

Sistemas bioadhesivos

Los sistemas de liberacioacuten modificada tambieacuten se pueden clasificar en funcioacuten del

mecanismo por el cual se libera el principio activo La liberacioacuten puede ocurrir por

difusioacuten disolucioacuten presioacuten osmoacutetica fuerza mecaacutenica hinchamiento erosioacuten o

activacioacuten [2]

2 Poliacutemeros utilizados en sistemas de liberacioacuten de faacutermacos

Actualmente en la elaboracioacuten de sistemas de liberacioacuten controlada se utilizan un gran

nuacutemero de poliacutemeros Existen dos grandes grupos de poliacutemeros

Poliacutemeros naturales como el colaacutegeno la albuacutemina o el quitosano

Poliacutemeros sinteacuteticos entre los que se distinguen

o Poliacutemeros biodegradables como los aacutecidos polilaacutectico y poliglicoacutelico

o Poliacutemeros no biodegradables como los aacutecidos poliacriacutelicos

Introduccioacuten

Tanto los materiales empleados en el desarrollo de los sistemas de liberacioacuten asiacute como

sus productos de degradacioacuten han de ser biocompatibles

La liberacioacuten del faacutermaco desde una matriz polimeacuterica puede deberse a tres tipos de

mecanismos liberacioacuten desde la superficie de las partiacuteculas difusioacuten a traveacutes de la

matriz hinchada y liberacioacuten debido a la erosioacuten del poliacutemero En la mayoriacutea de los

casos la liberacioacuten se debe a maacutes de uno de estos mecanismos [6]

En el caso de la liberacioacuten desde la superficie el faacutermaco atrapado en la capa superficial

de las partiacuteculas se disuelve instantaacuteneamente al entrar en contacto con el medio Esto

provoca el llamado efecto estallido del ingleacutes ―burst effect que puede evitarse

utilizando agentes entrecruzantes o lavando las partiacuteculas con solventes apropiados lo

cual puede conducir a una baja eficiencia de encapsulacioacuten

La liberacioacuten por difusioacuten implica tres etapas En la primera el agua penetra en el

sistema lo que hace que la matriz se hinche en la segunda el poliacutemero cristalino se

convierte en una matriz hidratada y en la tercera se produce una difusioacuten del faacutermaco a

traveacutes de dicha matriz hidratada La velocidad global del proceso vendraacute determinada

por la velocidad de cada etapa Ajustando experimentalmente las variables adecuadas se

puede conseguir la velocidad de liberacioacuten del faacutermaco idoacutenea Este tipo de liberacioacuten

es tiacutepico en hidrogeles

En el caso de poliacutemeros biodegradables el principio activo puede liberarse por erosioacuten

de la matriz en la que estaacute encapsulado

3 Quitosano Caracteriacutesticas propiedades y aplicaciones

El quitosano es un poliacutemero natural que se obtiene a partir de la quitina uno de los

biopoliacutemeros maacutes abundantes en la naturaleza La quitina forma parte de la estructura de

soporte de numerosos organismos vivos tales como artroacutepodos (crustaacuteceos e insectos)

moluscos y hongos Se trata ademaacutes de un subproducto importante de varias industrias

como la pesquera y la cervecera La quitina y el quitosano son biopoliacutemeros que en los

uacuteltimos antildeos han encontrado gran cantidad de aplicaciones especialmente en la

industria alimentaria y en la biotecnoloacutegica [7]

La quitina estaacute formada por unidades de 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucosa unidas por

enlaces β-(1rarr4) La obtencioacuten de quitosano a partir de quitina se realiza por

desacetilacioacuten de la misma dejando libre el grupo amino del carbono 2 si bien este

Introduccioacuten

proceso nunca llega al 100 [8] Es por ello que el quitosano es un copoliacutemero de 2-

acetamido-2-deoxy-β-D-glucosa y 2-amino-2-deoxy-β-D-glucosa (Figura I1)

Figura I1 Estructura de la quitina (a) y del quitosano (b)

La fuente y el meacutetodo de obtencioacuten determinan la composicioacuten de las cadenas de

quitosano y su tamantildeo Por este motivo el grado de desacetilacioacuten y el peso molecular

promedio son dos paraacutemetros de obligado conocimiento para la caracterizacioacuten de este

poliacutemero

Las principales propiedades fiacutesico-quiacutemicas del quitosano que determinan sus

propiedades funcionales son su grado de desacetilacioacuten y su peso molecular promedio

aunque la cristalinidad el contenido de agua cenizas y proteiacutenas tambieacuten son

caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas a considerar para la aplicacioacuten de un quitosano

especiacutefico

El porcentaje de grupos amino que quedan libres en la moleacutecula de quitosano es lo que

se denomina grado de desacetilacioacuten y estaacute estrechamente vinculado con su solubilidad

Como consecuencia de la hidroacutelisis del grupo N-acetilo aumenta la capacidad

hidrofiacutelica del quitosano y pasa a ser soluble en soluciones aacutecidas diluiacutedas (aceacutetico

Introduccioacuten

foacutermico clorhiacutedrico entre otros) ya que el pKa del gupo amino del quitosano es de 65

[9] La protonacioacuten de los grupos amino del quitosano en medio aacutecido le confiere un

caraacutecter altamente reactivo

El quitosano es un poliacutemero formado por unidades repetidas de D-glucosamina por lo

que la longitud de la cadena y por tanto su peso molecular es una caracteriacutestica

importante de la moleacutecula

Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son biodegradabilidad

biocompatibilidad mucoadhesioacuten capacidad filmogeacutenica hemostaacutetico promotor de

absorcioacuten actividad antimicrobiana anticolesteroleacutemica y antioxidante [10] Estas

propiedades funcionales han promovido su utilizacioacuten en varios campos distintos como

son agricultura industria y medicina En agricultura el quitosano se ha descrito como

antivirus en plantas y como aditivo en fertilizantes Asiacute mismo se ha investigado como

agente quelante de metales en agricultura e industria y como agente filmogeacutenico en

cosmeacutetica [11] Tambieacuten ha sido utilizado en la industria papelera en la textil y en el

tratamiento de aguas residuales [12] En la industria alimentaria se puede utilizar como

ingrediente funcional y como fibra alimentaria Ademaacutes tiene la capacidad de unirse a

grasas por lo que se utiliza como agente hipocolesteroleacutemico en productos dieteacuteticos

[10] Ha sido altamente utilizado en el campo de la biomedicina debido a su actividad

inmunoestimuladora propiedades anticoagulates accioacuten antibacteriana y antifuacutengica

[13] y por su accioacuten como promotor de la cicatrizacioacuten de heridas [14]

Debido a su caraacutecter catioacutenico y a sus propiedades gelificantes y filmogeacutenicas el

quitosano ha sido estudiado en la industria farmaceacuteutica por su potencial en el

desarrollo de sistemas de liberacioacuten de faacutermacos [15 16] En este sentido hay que

destacar que el hidrocloruro de quitosano fue aprobado por las autoridades e incluido en

la cuarta edicioacuten de la Farmacopea Europea (2002) [17]

Constituye un vehiacuteculo para la encapsulacioacuten del faacutermaco protegieacutendolo y liberaacutendolo

de forma controlada ademaacutes de promover su absorcioacuten a traveacutes del epitelio Asiacute mismo

el quitosano presenta propiedades necesarias para su uso en dicha industria como son

su biodegradabilidad biocompatibilidad y no toxicidad La toxicidad del quitosano por

viacutea oral es baja se ha descrito una LD50 (dosis letal para el 50 de un conjunto de

animales de prueba) de 16gKg en ratas [18] El grado de desacetilacioacuten y el peso

molecular promedio del quitosano son dos caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas

Introduccioacuten

fundamentales ya que afectan a las propiedades de las formulaciones farmaceacuteuticas

basadas en este poliacutemero [10]

En los uacuteltimos antildeos el estudio del quitosano se ha centrado sobre todo en mejorar la

liberacioacuten y la absorcioacuten de las llamadas biomoleacuteculas terapeacuteuticas como son los

faacutermacos proteicos [19] Existen resultados contradictorios sobre la mayor eficiencia del

quitosano en solucioacuten en polvo o en forma de nanopartiacuteculas en la liberacioacuten in vivo

En general se ha visto que la eficiencia de la absorcioacuten de macromoleacuteculas en mucosas

utilizando nanopartiacuteculas de quitosano como vehiacuteculo de encapsulacioacuten es inferior a la

obtenida con formulaciones de quitosano en solucioacuten o en polvo [20]

4 Microesferas y nanopartiacuteculas de quitosano

El uso de sistemas micro y nanoparticulados para la encapsulacioacuten de faacutermacos permite

el transporte de eacutestos al lugar de accioacuten terapeacuteutica el incremento de su vida media y su

liberacioacuten controlada en el tiempo Ademaacutes al ser partiacuteculas pequentildeas presentan una

relacioacuten superficie-volumen alta [21]

La liberacioacuten de un principio activo a partir de sistemas particulados a base de quitosano

depende de la densidad de la matriz polimeacuterica Asiacute mediante la variacioacuten de la

concentracioacuten y del peso molecular del poliacutemero e incorporando copoliacutemeros y agentes

entrecruzantes se pueden obtener sistemas de encapsulacioacuten con los perfiles de

liberacioacuten adecuados en cada caso

Las microesferas son sistemas homogeacuteneos en los que el faacutermaco estaacute disperso en una

matriz polimeacuterica a diferencia de las microcaacutepsulas en las que el principio activo se

encuentra rodeado por una capa de poliacutemero

Las microesferas de quitosano constituyen uno de los sistemas de liberacioacuten controlada

de faacutermacos maacutes estudiados tanto para su administracioacuten parenteral como por viacutea oral

Ademaacutes de controlar la liberacioacuten de principios activos mejoran la biodisponibilidad de

sustancias degradables como las proteiacutenas y promueven la absorcioacuten de faacutermacos

hidrosolubles a traveacutes de las membranas epiteliales

Introduccioacuten

Existen varios meacutetodos para la obtencioacuten de microesferas como son [22]

Gelificacioacuten ionotroacutepica

Precipitacioacuten

Atomizacioacuten o spray-drying

Coacervacioacuten simple

Coacervacioacuten compleja

Entrecruzamiento quiacutemico

Entrecruzamiento teacutermico

Emulsioacuten

La atomizacioacuten o spray-drying es un proceso de evaporacioacuten de solvente que se ha

empleado extensamente en la industria farmaceacuteutica para producir polvos secos

graacutenulos y aglomerados a partir de soluciones y suspensiones Esta teacutecnica se puede

utilizar tanto para faacutermacos resistentes al calor como para faacutermacos sensibles para

faacutermacos solubles o insolubles en agua y para poliacutemeros hidrofiacutelicos o hidrofoacutebicos

[23] Se trata de un proceso de una sola etapa que se puede escalar faacutecilmente es de

bajo coste produce partiacuteculas de pequentildeo tamantildeo y permite reformular las partiacuteculas en

forma de suspensiones caacutepsulas o comprimidos [24] Las microesferas obtenidas tienen

un tamantildeo de una micra a varias decenas de micras y son adecuadas para su

administracioacuten por las viacuteas oral nasal o parenteral [25-28] Los paraacutemetros del proceso

de atomizacioacuten como son el tipo de aguja la velocidad de la bomba y el flujo de air

comprimido permiten modular el tamantildeo de partiacutecula

Las nanopartiacuteculas han suscitado un gran intereacutes en los uacuteltimos antildeos como sistemas de

liberacioacuten de faacutermacos sobre todo para viacuteas de administracioacuten alternativas a la oral

como aquellas que requieren inyeccioacuten o deposicioacuten en superficies mucosas como la

nasal Las nanopartiacuteculas se definen como aquellas partiacuteculas cuyo tamantildeo es inferior a

1microm [29]

Ohya et al (1994) [30] presentaron los primeros resultados de nanopartiacuteculas de

quitosano para aplicaciones en liberacioacuten de faacutermacos Obtuvieron nanopartiacuteculas

cargadas con 5-fluoroacilo por emulsioacuten (wo) y entrecruzadas con glutaraldehido Este

Introduccioacuten

agente entrecuzante es toacutexico por lo que no es adecuado para la encapsulacioacuten de

faacutermacos

Posteriormente Calvo et al (1997) [31] describieron la preparacioacuten de nanopartiacuteculas

de quitosano por gelificacioacuten ionotroacutepica del quitosano y el tripolifosfato soacutedico (de

ahora en adelante TPP) nanopartiacuteculas biodegradables y biocompatibles preparadas por

un proceso maacutes suave sin altas temperaturas ni solventes orgaacutenicos

Las nanopartiacuteculas de quitosano y TPP presentan una serie de interesantes

caracteriacutesticas que las hacen ser vehiacuteculos prometedores para la liberacioacuten de

macromoleacuteculas tales como proteiacutenas y ADN Algunas de estas propiedades son su

obtencioacuten por un proceso suave su tamantildeo ajustable dependiendo de los paraacutemetros de

obtencioacuten y la modulacioacuten de su carga positiva y su capacidad de asociacioacuten a peacuteptidos

proteiacutenas oligonucleoacutetidos y plaacutesmidos [16 32]

La gelificacioacuten ioacutenica entre el quitosano y el TPP ha sido utilizada en diversos estudios

Por ejemplo Urrusuno et al (1999) [33] estudiaron el efecto de nanopartiacuteculas de

quitosano y TPP cargadas con insulina sobre la absorcioacuten de insulina en conejos

Observaron que las nanopartiacuteculas liberaron el faacutermaco en su forma activa y que

promovieron su absorcioacuten Tambieacuten se ha estudiado en ratones el efecto sobre los

niveles de inmunoglobulina G en suero e inmunoglobulina A en mucosa de

formulaciones preparadas por este meacutetodo con el toxoide del teacutetanos propiciando su

aumento tras la administracioacuten nasal [34] Pan et al (2002) [35] estudiaron la capacidad

de nanopartiacuteculas de quitosano-TPP para promover la absorcioacuten intestinal y la

biodisponibilidad farmacoloacutegica de insulina tras su administracioacuten oral Las

nanopartiacuteculas asiacute formadas mejoraron la absorcioacuten de insulina en relacioacuten con una

solucioacuten de quitosano

El tamantildeo de las nanopartiacuteculas es uno de los factores que maacutes afectan y determinan la

internalizacioacuten de las mismas en mucosas y tejidos epiteliales y su transporte dentro de

las ceacutelulas La carga superficial de las nanopartiacuteculas determina sus propiedades

mucoadhesivas y se ha descrito en la bibliografiacutea que la habilidad de las nanopartiacuteculas

para escapar a la accioacuten de los endolisosomas y liberar el principio activo depende asiacute

mismo de dicha carga superficial [32] Ambas caracteriacutesticas pueden ser controladas

variando ciertas condiciones y variables del proceso de obtencioacuten como la

concentracioacuten de quitosano la proporcioacuten quitosano TPP y el pH de la solucioacuten La

Introduccioacuten

proporcioacuten de quitosanoTPP es ademaacutes la responsable de la formacioacuten de las

nanopartiacuteculas [36]

5 Peliacuteculas de quitosano

El caraacutecter filmogeacutenico del quitosano dio lugar a una de las primeras aplicaciones

investigadas de este poliacutemero natural Es posible formar peliacuteculas de quitosano con

buenas propiedades fiacutesicas y mecaacutenicas a partir de sus disoluciones en aacutecidos diluidos

[37] tales como foacutermico aceacutetico o propioacutenico [38] Las propiedades filmogeacutenicas del

quitosano se deben a la formacioacuten de enlaces de hidroacutegeno intermoleculares entre los

grupos amino e hidroxilo de sus cadenas A pH aacutecido estos enlaces de hidroacutegeno se

disocian debido a la protonacioacuten de los grupos amino y se produce un raacutepido

hinchamiento de la peliacutecula

Muzzarelli planteoacute por primera vez en 1974 dos metodologiacuteas generales de trabajo para

obtener peliacuteculas de quitosano la primera es mediante la evaporacioacuten del aacutecido

empleado en la solucioacuten de quitosano (meacutetodo de evaporacioacuten de solvente) y la

segunda se basa en la preparacioacuten directa de quitosano a partir de la peliacutecula quitinosa

de la jibia (molusco cefaloacutepodo) Este uacuteltimo meacutetodo [39] no resultoacute eficiente pues las

propiedades mecaacutenicas de las peliacuteculas obtenidas no fueron las idoacuteneas por lo cual no

es utilizado en la actualidad

Las posibles aplicaciones de las peliacuteculas de quitosano se extienden a la medicina la

industria fotograacutefica la alimentacioacuten y la cosmeacutetica [40 41] En el campo de la

farmacia las peliacuteculas de quitosano se han empleado para el recubrimiento de

comprimidos [42] y como sistemas de liberacioacuten controlada de faacutermacos

El uso de peliacuteculas de quitosano para el tratamiento de heridas cutaacuteneas presenta un

gran intereacutes puesto que se puede administrar el faacutermaco de forma localizada y sostenida

en el sitio de accioacuten Se trata de un sistema ventajoso con respecto al uso de cremas ya

que eacutestas deben ser aplicadas continuamente y son eliminadas con facilidad Se ha

descrito en la bibliografiacutea el uso de peliacuteculas de quitosano para el vendaje de heridas

cutaacuteneas y peliacuteculas con minociclina para el tratamiento de quemaduras en ratas [44]

Las peliacuteculas de quitosano resultan efectivas porque protegen la herida absorben el

exudado tienen accioacuten antibacteriana [45 46]y favorecen la cicatrizacioacuten de heridas al

estimular la proliferacioacuten de fibroblastos [47 48] Por otro lado tambieacuten se han

realizado estudios de citotoxicidad del quitosano en ceacutelulas cutaacuteneas como

Introduccioacuten

queratinocitos y fibroblastos estudios importantes para este tipo de aplicacioacuten y se ha

comprobado que no presenta citotoxicidad in vitro [49]

El caraacutecter hemostaacutetico del quitosano ha promovido su utilizacioacuten en parches y vendajes

hemostaacuteticos [50] Prueba de ellos es la comercializacioacuten de varios productos de este

tipo a base de quitosano por parte de la empresa HemCon Medical Technologies INC

(Oregon EEUU)

51 Hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano

La hidratacioacuten de los poliacutemeros es uno de los factores que influyen en la liberacioacuten de

principios activos a traveacutes de matrices polimeacutericas La hidrofilicidad en los poliacutemeros

estaacute dada por el grado de hinchamiento el cual se calcula a partir de la relacioacuten entre el

volumen de gel hinchado y el volumen de gel seco Durante el proceso de hinchamiento

se produce la incorporacioacuten del liacutequido en el interior de la matriz producto de la

diferencia de potencial quiacutemico del disolvente dentro y fuera de ella provocando una

dilatacioacuten de la misma Al proceso de dilatacioacuten se opone una fuerza elaacutestica-retraacutectil la

cual se opone a la penetracioacuten del solvente [51] El equilibrio de hinchamiento se

alcanza cuando se igualan la fuerza de hinchamiento y la fuerza elaacutestica-retraacutectil

En los hidrogeles ioacutenicos la presencia de grupos cargados confiere caracteriacutesticas

uacutenicas al hinchamiento Dichas caracteriacutesticas dependen del pH y la fuerza ioacutenica del

medio Peppas y Khare [52] determinaron como factores clave que afectan el

hinchamiento

Grado de ionizacioacuten

Equilibrio de ionizacioacuten

Naturaleza de los contraiones

El modelo maacutes comuacuten para estudiar la difusioacuten es el propuesto en las leyes de Fick En

la primera ley se define que en estado de equilibrio el flujo del penetrante es

proporcional al gradiente de concentracioacuten [51]

J = - D (dcdx) (I1)

donde J representa el nuacutemero de moleacuteculas de sustancia por segundo y por unidad de

superficie perpendicular a la direccioacuten de flujo D es el coeficiente de difusioacuten y dcdx

es el gradiente de concentracioacuten

Introduccioacuten

Existen otros modelos de cineacuteticas que describen el comportamiento del hinchamiento

en los poliacutemeros Un ejemplo de los mismos es el planteado por Schott [53] donde se

estudia la cineacutetica de hinchamiento en peliacuteculas de gelatina y celulosa El autor llega a

una ecuacioacuten empiacuterica que ajusta los valores obtenidos para todo el proceso de

hinchamiento Dicha ecuacioacuten es

donde W representa el hinchamiento a un tiempo t A es la ordenada en el origen y B es

el inverso del hinchamiento maacuteximo El hinchamiento se calcula por la ecuacioacuten [54]

M (I3)

donde M es el peso de la peliacutecula a un tiempo t y M0 es el peso de la peliacutecula antes del

proceso de hinchamiento

Para tiempos grandes Bt gtgtA la pendiente B se define como el inverso del

hinchamiento maacuteximo1

W mientras que para tiempos cortos Bt se puede despreciar y

en este caso A es el reciacuteproco de la velocidad inicial de hinchamiento

A diferencia del comportamiento Fickiano en que el hinchamiento estaacute controlado por

la difusioacuten en el modelo de Schott el hinchamiento esta controlado por la relajacioacuten de

las cadenas

Al representar los valores de t

W en funcioacuten de t Schott demostroacute que el proceso de

hinchamiento de estos materiales respondiacutea a una cineacutetica de segundo orden respecto al

hinchamiento remanente representada por la siguiente ecuacioacuten

K W Wdt

donde Winfin es el hinchamiento a tiempo infinito W el hinchamiento a tiempo t y K la

constante del sistema El proceso completo de transporte en una matriz polimeacuterica

depende principalmente de dos factores los cuales estaacuten gobernados por una amplia

variedad de elementos relacionados con la composicioacuten y las condiciones

Introduccioacuten

experimentales Uno de ellos es la movilidad segmental de las cadenas polimeacutericas y el

otro estaacute relacionado con la estructura y morfologiacutea del poliacutemero En cuanto al primer

factor el movimiento difusivo depende de la movilidad relativa de las moleacuteculas del

penetrante y de los segmentos de la cadena polimeacuterica su tamantildeo concentracioacuten la

interaccioacuten de los componentes la temperatura y otros factores que afectan la movilidad

segmental del poliacutemero[51] La estructura de la red polimeacuterica es un paraacutemetro

determinante cuando se describe el transporte a traveacutes de las peliacuteculas ya que la

magnitud del espacio entre las cadenas polimeacutericas va a determinar coacutemo se produce

dicho transporte

6 El quitosano como promotor de la absorcioacuten de faacutermacos

El uso de promotores de absorcioacuten de faacutermacos en las formulaciones farmaceacuteuticas estaacute

siendo objeto de estudio actualmente para mejorar la liberacioacuten de faacutermacos a traveacutes de

las mucosas Los promotores empleados suelen ser poliacutemeros multifuncionales con

propiedades mucoadhesivas capaces de abrir transitoriamente las uniones intercelulares

en el epitelio que no muestren toxicidad y que no se absorban siendo el quitosano uno

de los poliacutemeros maacutes estudiados [55]

Illum et al (1994) [27] estudiaron el efecto de una solucioacuten de quitosano de alto peso

molecular sobre el transporte de insulina a traveacutes de la mucosa nasal en ratas y ovejas

Sus resultados fueron prometedores y desde entonces se han realizado muchos estudios

sobre el potencial del quitosano para mejorar la absorcioacuten de faacutermacos peptiacutedicos a

traveacutes de las mucosas Por otro lado tambieacuten se ha estudiado la administracioacuten nasal de

antiacutegenos en soluciones de quitosano y quitosano en polvo y se ha visto que promueven

la respuesta inmune del organismo Illum et al (2001) [56] evaluaron en humanos una

vacuna nasal de la gripe basada en una solucioacuten de quitosano Maacutes del 70 de los

voluntarios presentaron niveles protectores tras la administracioacuten intranasal

El efecto positivo del quitosano sobre la liberacioacuten de faacutermacos a traveacutes de los epitelios

se debe a una combinacioacuten entre sus propiedades mucoadhesivas y su capacidad para

abrir las uniones estrechas (del ingleacutes ―tight junctions) entre ceacutelulas epiteliales

facilitando asiacute el transporte de faacutermacos sobre todo faacutermacos macromoleculares a

traveacutes del epitelio

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

La mucoadhesioacuten aumenta el tiempo de permanencia y el contacto entre la membrana y

la formulacioacuten lo cual permite una liberacioacuten del principio activo de forma sostenida en

el tiempo reduciendo asiacute la necesidad de varias dosis Se ha descrito en la bibliografiacutea

que la administracioacuten de principios activos combinados con el quitosano prolonga el

tiempo de contacto entre el faacutermaco y la superficie de absorcioacuten de las mucosas en

general [57]

Las propiedades mucoadhesivas del quitosano se deben a la interaccioacuten entre sus grupos

amino protonados y la capa de mucus Eacuteste estaacute compuesto por una glicoproteiacutena la

mucina que tiene cargas negativas debido a la presencia de residuos de aacutecido siaacutelico La

unioacuten depende de la cantidad de aacutecido siaacutelico presente en la mucina y del grado de

desacetilacioacuten del quitosano o grupos amino libres He et al (1998) [58] estudiaron la

mucoadhesioacuten de microesferas de quitosano en epitelio intestinal de rata y vieron que

eacutesta aumentoacute con el nuacutemero de grupos amino libres debido a los monoacutemeros de

glucosamina del quitosano EL pH tambieacuten influye en las propiedades mucoadhesivas

del quitosano ya que a pH aacutecido el quitosano se encuentra cargado positivamente (pKa

65) Tambieacuten se ha descrito que los quitosanos con cadenas polimeacutericas maacutes largas

penetran maacutes en la capa de mucina por lo que un alto peso molecular del quitosano

tambieacuten puede favorecer la mucoadhesioacuten [59 60] En definitiva un quitosano de peso

molecular alto y grado de desacetilacioacuten alto favorece la mucoadhesioacuten

Apertura de uniones estrechas entre ceacutelulas epiteliales

Los epitelios actuacutean como barreras que separan al organismo del medio externo de

forma que incluso el movimiento de iones a traveacutes del epitelio estaacute retringido dando

lugar a diferencias de potencial eleacutectrico Las moleacuteculas pueden atravesar el epitelio de

varias formas

Por transporte pasivo o difusioacuten que se produce a favor de gradiente de

concentracioacuten o gradiente de carga eleacutectrica y que por lo tanto no supone un

gasto de energiacutea para las ceacutelulas La difusioacuten pasiva puede producirse a traveacutes de

la membrana celular (transporte transcelular) o entre ceacutelulas adyacentes

(transporte paracelular)

Introduccioacuten

Por transporte activo mecanismo que permite a la ceacutelula transportar sustancias a

traveacutes de su membrana desde regiones menos concentradas a otras maacutes

concentradas Es un proceso que requiere energiacutea

Las moleacuteculas lipofiacutelicas atraviesan faacutecilmente la membrana celular por difusioacuten pasiva

Sin embargo las moleacuteculas hidrofiacutelicas no pueden atravesar la membrana hidrofoacutebica

por lo que tienen que atravesar el epitelio por la viacutea paracelular Esta viacutea estaacute restringida

por la presencia de las uniones estrechas estructuras multiproteicas dinaacutemicas y

complejas que constituyen una barrera semipermeable que restringe la difusioacuten

dependiendo de la carga y el tamantildeo del soluto En el epitelio las uniones estrechas se

encuentran en la membrana plasmaacutetica en ceacutelulas adyacentes (Figura I2) y forman una

estructura continua que rodea a las ceacutelulas completamente Las uniones estrechas del

epitelio forman una barrera funcional y morfoloacutegica entre las superficies apical y

basolateral de las ceacutelulas y regulan la difusioacuten a traveacutes de la viacutea paracelular[61]

Complejo de proteiacutenas de unioacuten estrecha

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Transporte paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

Figura I2 Representacioacuten esquemaacutetica de las uniones estrechas entre ceacutelulas epiteliales y el transporte

paracelular

La unioacuten estrecha estaacute formada por un grupo de proteiacutenas transmembrana y citosoacutelicas

que no soacutelo interactuacutean entre ellas sino tambieacuten con la membrana celular y el

citoesqueleto de actina de modo que forman un sistema que une a los componentes de

las uniones estrechas con el citoesqueleto Existen varios tipos de proteiacutenas distintas

dentro del grupo que forma parte de las uniones estrechas[61]

Introduccioacuten

La ocludina es una de las proteiacutenas integrales de membrana que forma parte de las

uniones estrechas Por un lado proporciona la integridad estructural de la unioacuten y por

otro regula su funcioacuten de barrera Hay estudios que asocian las ocludinas a la regulacioacuten

de la difusioacuten de pequentildeos marcadores hidrofiacutelicos por lo que estaacuten implicadas en la

regulacioacuten de la dinaacutemica de las uniones

Las claudinas son las principales responsables del ensamblaje de las bandas formadas

por las uniones estrechas y de la formacioacuten de rutas selectivas de difusioacuten paracelular de

iones ya que diferentes proteiacutenas de la familia de las claudinas permiten el paso de

distintos tipos de iones

Se conocen tres proteiacutenas citosoacutelicas ZO-1 ZO-2 y ZO-3 (del latiacuten ―Zoacutenula

occludens que significa unioacuten estrecha) denominadas proteiacutenas asociadas a uniones

estrechas que interactuacutean entre ellas y ponen en contacto la unioacuten estrecha con el

citoesqueleto Ademaacutes se ha descrito que regulan la funcioacuten de la unioacuten estrecha junto

con la ocludina El estado de fosforilacioacuten de estas proteiacutenas reguladoras se ha asociado

con diferencias en la permeabilidad en modelos in vitro Las mismas rutas de

sentildealizacioacuten cuyo efecto final es la fosforilacioacuten de dichas proteiacutenas pueden tambieacuten

afectar al citoesqueleto de actina asociado a la membrana plasmaacutetica por un grupo de

filamentos de actina situado debajo de la unioacuten estrecha y por un anillo de filamentos a

nivel de la unioacuten de adhesioacuten que tambieacuten contiene miosina II La disrupcioacuten del

citoesqueleto estaacute asociada con la apertura de las uniones estrechas y por tanto al

aumento de la permeabilidad paracelular [62]

Smith et al (2005) [63] describieron que la habilidad del quitosano en solucioacuten y en

forma de nanopartiacuteculas para modular las uniones estrechas se puede explicar por las

posibles interacciones del quitosano con receptores especiacuteficos de la superficie celular

que conlleva la activacioacuten de la transduccioacuten de sentildeales dependiente de la proteiacutena

kinasa C (PKC) La activacioacuten de la PKC ademaacutes induce la peacuterdida de asociacioacuten de las

proteiacutenas de las uniones estrechas la ZO-1 y la ocludina en la membrana plasmaacutetica y

por tanto la peacuterdida de las uniones estrechas Ranaldi et al (2002) [64] tambieacuten

demostraron que el tratamiento con quitosano alteraba la distribucioacuten de F-actina en

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

7 Cultivos celulares como modelo epitelial

Los estudios con cultivos de ceacutelulas epiteliales permiten una faacutecil evaluacioacuten de las

propiedades de las uniones entre ceacutelulas y constituyen un meacutetodo muy utilizado en

experimentos de transporte de principios activos a traveacutes de monocapas celulares

Para llevar a cabo este tipo de experimentos las ceacutelulas epiteliales se suelen sembrar en

soportes permeables (transwells) (Figura I3) que estaacuten constituiacutedos por una membrana

y una caacutemara basal y otra apical Sobre estos soportes las ceacutelulas sembradas forman

monocapas

Compartimento apical

Monocapa de ceacutelulas

Filtro microporosoCompartimento basolateral

Figura I3 Esquema de una monocapa celular en un soporte permeable

Se realizan dos tipos de estudios en relacioacuten con las uniones estrechas la medida de

corrientes eleacutectricas y el estudio del flujo de compuestos marcados a traveacutes de las

monocapas Como se ha comentado en el apartado anterior las uniones estrechas

limitan la difusioacuten paracelular de moleacuteculas hidrofiacutelicas de forma selectiva por carga y

tamantildeo Cuando el movimiento de iones a traveacutes de la monocapa estaacute restringido debido

al correcto funcionamiento de la unioacuten estrecha existe un gradiente de potencial

eleacutectrico a ambos lados de la misma Por ello la integridad y la madurez de las uniones

estrechas se suele determinar midiendo la resistencia eleacutectrica transepitelial (TEER)

que es inversamente proporcional a la permeabilidad empleando para ello un voltiacutemetro

cuyos electrodos pueden aplicarse directamente sobre los soportes permeables Este

estudio se realiza en medio de cultivo por lo que refleja principalmente la

permeabilidad al sodio

Las medidas de TEER se suelen realizar para hacer un seguimiento del crecimiento

celular tras la siembra ya que su valor aumenta a medida que se va formando la

monocapa de ceacutelulas Asiacute mismo se realizan medidas de TEER durante los

Introduccioacuten

experimentos de permeabilidad de sustancias problema para observar cualquier cambio

en la integridad de la monocapa Los experimentos de permeabilidad paracelular se

llevan a cabo con compuestos marcados con fluorescencia como dextranos o bien con

proteiacutenas que se pueden cuantificar con ensayos enzimaacuteticos De esta forma es posible

cuantificar la cantidad de compuesto que pasa de la parte apical a la basal en un periacuteodo

de tiempo concreto Se pueden emplear marcadores de distintos pesos moleculares para

evaluar la eficiencia de un determinado promotor de permeabilidad celular

Existen distintas liacuteneas de ceacutelulas epiteliales que se utilizan como modelos para

experimentos de permeabilidad y de evaluacioacuten de la apertura de uniones estrechas

Ceacutelulas Calu-3

Los modelos celulares in vitro son muy utilizados con el fin de estudiar la deposicioacuten y

absorcioacuten de faacutermacos tras su administracioacuten por la viacutea respiratoria aunque existen

otros meacutetodos como son estudios con modelos de perfusioacuten en pulmoacuten aislado y anaacutelisis

faacutermaco-cineacuteticos in vivo

La liacutenea celular Calu-3 procede de adenocarcinoma de pulmoacuten humano y se utiliza

como modelo del epitelio de las viacuteas respiratorias [65] El lumen y el tejido submucoso

de los conductos respiratorios constituyen el lugar de accioacuten de una gran cantidad de

faacutermacos pero tambieacuten constituye una barrera frente a la absorcioacuten de dichos faacutermacos

Por tanto el epitelio respiratorio es una membrana clave a estudiar tanto por ser una

barrera para el transporte de faacutermacos como por ser un lugar donde los faacutermacos

pueden ejercer su toxicidad El epitelio variacutea entre un epitelio pseudo-estratificado en

columnas con tres tipos principales de ceacutelulas (ciliadas basales y secretoras)

interconectadas por uniones estrechas en los bronquios proximales hasta un epitelio

progresivamente maacutes cuboidal no cicliado y localizado en los bronquiolos distales [65]

Una caracteriacutestica importante del epitelio respiratorio es su diferenciacioacuten en capas de

ceacutelulas interconectadas por uniones estrechas intercelulares que limitan el transporte

paracelular de solutos por lo que afecta a la absorcioacuten y el metabolismo de faacutermacos

Otras caracteriacutesticas propias de este epitelio incluyen la produccioacuten de mucus la

presencia de cilios apicales y la expresioacuten de transportadores y sistemas metaboacutelicos Se

ha demostrado en varios estudios que algunas de estas caracteriacutesticas estaacuten presentes en

las ceacutelulas Calu-3 lo que sugiere la utilidad de esta liacutenea celular como modelo del

epitelio respiratorio [66 67]

Introduccioacuten

Las condiciones de cultivo tienen un efecto importante sobre la diferenciacioacuten de las

ceacutelulas epiteliales respiratorias y deben ser optimizadas para cada modelo celular

individualmente Se han descrito tanto cultivos sumergidos como cultivos con una

interfase aire-liacutequido para ceacutelulas Calu-3 [68 69] La formacioacuten de cilios estaacute

influenciada por el meacutetodo de incubacioacuten siendo maacutes cortos y gruesos en cultivos

sumergidos[70]

Uno de los primeros trabajos sobre transporte de faacutermacos en ceacutelulas Calu-3 fue

realizado por Cavet et al (1997) [71] Estudiaron el transporte de ciprofloxacino a

traveacutes de monocapas constituidas por estas ceacutelulas y observaron que el antibioacutetico era

transportado principalmente por viacutea transcelular por difusioacuten pasiva Este resultado

concidioacute con los resultados de estudios faacutermaco-cineacuteticos en humanos

8 Agentes entrecruzantes

Los sistemas de liberacioacuten a base poliacutemeros biodegradables necesitan ser entrecruzados

para modular sus propiedades y mantener la estabilidad de la matriz y asiacute cumplir el

objetivo de liberar el faacutermaco a lo largo del tiempo deseado El quitosano como se ha

comentado se disuelve en condiciones aacutecidas lo que limita su aplicacioacuten como sistema

de liberacioacuten El entrecruzamiento puede reducir la solubilidad del quitosano en

solventes acuosos aumentar su resistencia a la degradacioacuten quiacutemica o bioloacutegica y

ayudar a controlar la liberacioacuten de principios activos desde la matriz formada El

glutaraldehido es un agente entrecruzante muy utilizado pero su capacidad de

transformacioacuten en especies reactivas toacutexicas ha promovido la buacutesqueda de otros agentes

y procedimientos de entrecruzamiento maacutes seguros como son el tripolifosfato soacutedico y

la genipina [72]

Tripolifosfato soacutedico

El tripolifosfato soacutedico (TPP) es un agente entrecruzante no toacutexico (reconocido como

GRAS por la FDA) que es capaz de formar geles al unirse con el quitosano por

interaccioacuten ioacutenica

Desde que Bodmeier et al (1989) [73] describiesen la preparacioacuten de complejos

quitosanoTPP la formacioacuten de complejos entre estas moleacuteculas con cargas opuestas

para obtener formulaciones que controlan la liberacioacuten de faacutermacos ha ganado intereacutes

puesto que se trata de un proceso muy simple Concretamente la formulacioacuten de micro

Introduccioacuten

y nanopartiacuteculas por interaccioacuten ioacutenica entre el quitosano y el tripolifosfato soacutedico es

muy comuacuten porque implica la mezcla de dos fases acuosas a temperatura ambiente sin

el uso de solventes orgaacutenicos

La reaccioacuten que se produce entre el quitosano y el TPP ha sido descrita en la

bibliografiacutea [74 75] El TPP (Na5P3O10) disuelto en agua se disocia en iones

tripolifosfoacutericos y en OHminus

y la solucioacuten resultante tiene pH 9 Los pKa del TPP son

pK1=1 pK2=2 pK3=279 pK4=647 y pK5=924 [76] Los aniones procedentes del TPP

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

) coexisten en solucioacuten acuosa en funcioacuten del pH

Dependiendo del valor de eacuteste predominaraacuten unos u otros y de ello dependeraacute el tipo de

interaccioacuten que ocurra entre el TPP y el quitosano Cuando el TPP se disuelve en agua

con pH 9 se disocia en iones P3O105-

y eacuteste a su vez en HP3O104-

y en iones OH- Al

antildeadir la solucioacuten de este agente entrecruzante (pH 9) a una solucioacuten de quitosano (pH

aacutecido) los iones P3O105-

y HP3O104-

compiten con los OH- por reaccionar con los grupos

NH3+ del quitosano por entrecruzamiento ioacutenico en el caso de los iones tripolifosfoacutericos

o por desprotonacioacuten en el caso de los OH- (Figura I4)

A pH 9 de la disolucioacuten de TPP por tanto habraacute grupos amino neutralizados por los

grupos hidroxilo y grupos amino entrecruzados ioacutenicamente

Sin embargo si el pH del TPP es ajustado a un pH aacutecido soacutelo existiraacuten iones

tripolifosfoacutericos El tipo de iones tripolifosfoacutericos y su proporcioacuten vendraacuten dados por el

pH de la solucioacuten En este caso el complejo quitosano-TPP se forma exclusivamente

por entrecruzamiento ioacutenico entre los grupos NH3+ y los aniones de TPP

Introduccioacuten

a) neutralizacioacuten de los grupos amino

b) entrecruzamiento ioacutenico

Figura I4 Esquema de la reaccioacuten entre el quitosano en solucioacuten aacutecida y los iones de TPP A-

neutralizacoacuten de los grupos amino B- entrecruzamiento ioacutenico[75]

Genipina

La genipina (Figura I5) es un compuesto de origen natural que se obtiene a partir del

genipoacutesido procedente del fruto de Genipa americana y Gardenia jasminoides Estos

frutos tienen propiedades antiinflamatorias diureacuteticas colereacuteticas y hemostaacuteticas[77]

Una propiedad destacable de la genipina es su capacidad de reaccionar espontaacuteneamente

con aminas primarias dando lugar a pigmentos azules Se ha descrito su reaccioacuten con

materiales que contienen grupos amino como el quitosano y algunos peacuteptidos y

proteiacutenas dando lugar a estructuras entrecruzadas quiacutemicamente Dicha propiedad

permite su utilizacioacuten como agente entrecruzante en sistemas de liberacioacuten de faacutermacos

Introduccioacuten

Se ha comprobado que la genipina presenta una toxicidad 5000-10000 veces maacutes baja

con respecto al glutaraldehido[78]

O OCH3

Figura I5 Estructura quiacutemica de la genipina

Durante la reaccioacuten de entrecruzamiento entre la genipina y el quitosano se producen

dos reacciones separadas La primera reaccioacuten consiste en un ataque nucleofiacutelico por

parte de los grupos amino del quitosano sobre el carbono 3 de la genipina que da lugar

a la formacioacuten de un compuesto heterociacuteclico de la genipina unida al residuo de

glucosamina en el quitosano La segunda reaccioacuten maacutes lenta consiste en una

sustitucioacuten nucleofiacutelica del grupo ester de la genipina liberando metanol y formaacutendose

un enlace amida con el quitosano En la Figura I6 se muestra un esquema del

entrecruzamiento del quitosano con genipina Simultaacuteneamente se puede producir una

polimerizacioacuten entre moleacuteculas de genipina que ya estaacuten unidas a los grupos amino del

quitosano lo cual puede dar lugar al entrecruzamiento del quitosano a traveacutes de

copoliacutemeros de genipina [77]

CH2OH NH2

Figura I6 Esquema del entrecruzamiento del quitosano con la genipina

Introduccioacuten

La genipina ha sido utilizada en la obtencioacuten de diversos sistemas de liberacioacuten de

faacutermacos tales como microcaacutepsulas e hidrogeles Mi et al prepararon complejos

polielectrolitos con la membrana formada por alginato y quitosano y el interior de la

caacutepsula compuesto por quitosano entrecruzado con genipina [79] asiacute como caacutepsulas de

quitosano entrecruzadas simultaacuteneamente por entrecruzamiento ioacutenico con TPP y

quiacutemico con genipina[80] Barck amp Butler (2005) emplearon distintos poliacutemeros

polianioacutenicos entre ellos el alginato para formar complejos polielectrolitos con

quitosano y entrecruzados con genipina[81] Por otro lado microcaacutepsulas de alginato-

quitosano con el interior compuesto de alginato y la membrana de quitosano con

genipina fueron preparadas por Chen et al (2006) para la encapsulacioacuten de ceacutelulas vivas

y otras aplicaciones en liberacioacuten [82] Hidrogeles de quitosano entrecruzados con

genipina han sido preparados y caracterizados en diversos trabajos [83 84] Soacutelo se han

descrito en la biliografiacutea algunos estudios sobre la preparacioacuten caracterizacioacuten y

liberacioacuten in vitro de faacutermacos a partir de microesferas de quitosano entrecruzadas con

genipina Mi et al (2001) prepararon microesferas de quitosano por un meacutetodo de

dispersioacuten agua en aceite utilizando genipina como agente entrecruzante[85] Yuan et

al (2007) obtuvieron microesferas de quitosano albuacutemina bovina y genipina[86]

9 Faacutermacos empleados

Claritromicina

La claritromicina es un antibioacutetico perteneciente al grupo de los macroacutelidos que ejerce

su accioacuten antibacteriana por interferir en la siacutentesis de proteiacutenas de las bacterias

sensibles ligaacutendose a la subunidad ribosomal 50S Se trata de una sustancia baacutesica de

caraacutecter cristalino de color blanco Su masa molecular es 747 gmol En la Figura I7 se

presenta la estructura molecular de la claritromicina

Introduccioacuten

Figura I7 Estructura molecular de Claritromicina

La claritromicina es bactericida para Helicobacter pylori presente en la mucosa gaacutestrica

de la mayoriacutea de los pacientes con uacutelcera duodenal o gastritis La infeccioacuten por

Helicobacter pylori se considera uno de los principales factores patogeacutenicos

responsables de la uacutelcera gaacutestrica

La terapia con antibioacuteticos presenta ciertos inconvenientes como la necesidad de una

dosis frecuente para mantener la concentracioacuten de faacutermaco en plasma al nivel

terapeacuteutico el bajo cumplimiento por parte del paciente infecciones causadas por

microorganismos resistentes y efectos secundarios en el tracto gastrointestinal [87] La

ineficacia descrita en el tratamiento de la infeccioacuten por H pylori puede ser debida a la

baja estabilidad de los antibioacuteticos en el medio aacutecido del estoacutemago a la baja absorcioacuten a

traveacutes de la capa de mucus o a la administracioacuten de una dosis sub-terapeacuteutica[60]

La liberacioacuten especiacutefica de claritromicina en el estoacutemago a traveacutes de un sistema de

encapsulacioacuten basado en quitosano podriacutea ser un tratamiento adecuado frente a

Hpylori El quitosano se hincha en medio aacutecido es un sistema adecuado para la

liberacioacuten controlada de faacutermacos presenta propiedades antiaacutecidas disminuye la

irritacioacuten en el estoacutemago causada por la administracioacuten de faacutermacos[60] y ejerce

actividad antibacteriana debido a la unioacuten de los grupos catioacutenicos del quitosano a las

moleacuteculas anioacutenicas de la superficie externa de la membrana bacteriana [88] Ademaacutes

como se ha explicado anteriormente es bioadhesivo y actuacutea sobre las uniones estrechas

entre ceacutelulas epiteliales por lo que aumenta el tiempo de residencia en el tejido y

promueve la absorcioacuten del faacutermaco a traveacutes de las mucosas Por otro lado la

Introduccioacuten

microencapsulacioacuten de claritromicina en una matriz polimeacuterica la protegeriacutea frente a la

degradacioacuten a pH aacutecido

La claritromicina es soluble a pH aacutecido y su solubilidad disminuye al aumentar el pH

por lo que es maacutes soluble y se absorbe mejor en el estoacutemago que en el intestino

Se han descrito en la bibliografiacutea otros estudios de encapsulacioacuten de claritromicina

Majithiya y Murthy (2005) [60]obtuvieron microesferas de quitosano con claritromicina

por emulsificacioacuten y entrecruzamiento con glutaraldehido Zgoulli et al (1999) [24]

prepararon microesferas cargadas con eritromicina y claritromicina por atomizacioacuten

para enmascarar su sabor aumentar la biodisponibilidad de estos antibioacuteticos y mejorar

su estabilidad

Hidrocloruro de tramadol

El hidrocloruro de tramadol (Figura I8) es un opiaacuteceo sinteacutetico del grupo de los

aminociclohexanoles (clorhidrato de (plusmn) cis-2- [(dimetillamino)metil]-1-(3-metoxifenil)

ciclohexanol) con accioacuten analgeacutesica a nivel central El tramadol es un anaacutelogo sinteacutetico

de la codeiacutena con una menor afinidad que eacutesta hacia los receptores opiaacuteceos Su vida

media es de 55 horas y la dosis adecuada suele ser de 50-100mg cada 4-6 horas La

foacutermula empiacuterica es C16H25NO2 y su masa molecular 263gmol

Figura I8 Estructura molecular del hidrocloruro de tramadol

El tramadol es un analgeacutesico opiaacuteceo con un mecanismo dual de accioacuten Es una mezcla

raceacutemica de los isoacutemeros trans observaacutendose importantes diferencias desde el punto de

vista bioquiacutemico farmacoloacutegico y metaboacutelico entre ambos enantioacutemeros El tramadol

tiene un potencial mucho menor que otros opiaacuteceos para inducir depresioacuten respiratoria y

dependencia pero ambos efectos adversos pueden tener lugar Para disminuir la

frecuencia de administracioacuten seriacutea deseable administrarlo a traveacutes de una forma

farmaceacuteutica de accioacuten retardada

Introduccioacuten

Hidrocloruro de ciprofloxacino

El hidrocloruro de ciprofloxacino (Figura I9) es un antibioacutetico del grupo de las

fluoroquinolonas Se utiliza en casos de pneumoniacutea infecciones cutaacuteneas y es uno de

los antibioacuteticos maacutes utlizados en oftalmologiacutea [89] Su peso molecular es de

33135gmol Es activo frente a un amplio espectro de bacterias Gram-negativas

aerobias incluyendo patoacutegenos enteacutericos Pseudomonas y Serratia marcescens aunque

ya han empezado a aparecer cepas resistentes Igualmente es activo frente a bacterias

Gram-positivas aunque tambieacuten se han detectado resistencias en algunas cepas de

Staphyloccocus aureus y Pneumococos No es activo frente a microorganismos

anaerobios Se utiliza ocasionalmente en combinacioacuten con otros antibacterianos en el

tratamiento de las infecciones por micobacterias

Los efectos antibacterianos del hidrocloruro de ciprofloxacino se deben a la inhibicioacuten

de la topoisomerasa IV y la DNA-girasa bacterianas Estas topoisomerasas alteran el

DNA introduciendo pliegues superhelicoidales en el DNA de doble cadena facilitando

el desenrollado de las cadenas La DNA-girasa tiene dos subunidades codificadas por el

gen gyrA y actuan rompiendo las cadenas del cromosoma bacteriano y luego

pegaacutendolas una vez que se ha formado la superheacutelice Las quinolonas inhiben estas

subunidades impidiendo la replicacioacuten y la transcripcioacuten del DNA bacteriano Las

ceacutelulas humanas y de los mamiacuteferos contienen una topoisomerasa que actuacutea de una

forma parecida a la DNA-girasa bacteriana pero esta enzima no es afectada por las

concentraciones bactericidas del hidrocloruro de ciprofloxacino

Este principio activo puede producir efectos secundarios cuando se administra por viacutea

oral como dolor abdominal nauseas dolor de cabeza entre otros Una forma

alternativa de administracioacuten como la viacutea toacutepica podriacutea minimizar estos efectos

secundarios [90]

Figura I9 Estructura molecular del hidrocloruro de ciprofloxacino

Introduccioacuten

10 Modelos matemaacuteticos

Los estudios de disolucioacutenliberacioacuten in vitro constituyen un eslaboacuten importante dentro

de la cadena del desarrollo de un nuevo medicamento Bajo ciertas condiciones puede

servir para aportar criterios de biodisponibilidad y bioequivalencia

Un objetivo fundamental a la hora de desarrollar nuevos sistemas de liberacioacuten

controlada es poder predecir los niveles plasmaacuteticos que alcanzaraacute el faacutermaco una vez

administrado De esa forma el desarrollo de los procesos de obtencioacuten de nuevos

medicamentos puede ser acelerado de modo que eacutestos pueden ponerse en el mercado

con mayor brevedad y a menor precio Por este motivo se han desarrollado numerosos

modelos matemaacuteticos que permiten predecir las cineacuteticas de disolucioacutenliberacioacuten de

los principios activos incluidos en los sistemas de liberacioacuten controlada y por tanto su

biodisponibilidad in vivo Estos modelos permiten interpretar los resultados

cuantitativos de un ensayo de liberacioacuten in vitro a traveacutes de una ecuacioacuten que relaciona

varios paraacutemetros [91] Para comparar diferentes perfiles de liberacioacuten se pueden

emplear meacutetodos matemaacuteticos (meacutetodos modelo dependiente) y meacutetodos estadiacutesticos

(meacutetodos modelo independiente) que incluyen el anaacutelisis de la varianza de una o dos

viacuteas (ANOVA)

Los modelos matemaacuteticos facilitan el anaacutelisis cuantitativo de los resultados obtenidos en

los ensayos de liberacioacutendisolucioacuten y describen los resultados de liberacioacuten en funcioacuten

de alguna de las caracteriacutesticas o variables de la formulacioacuten empleada [91]

Cineacutetica de orden cero

Las formas farmaceacuteuticas que presentan esta cineacutetica liberan la misma cantidad de

faacutermaco por unidad de tiempo Es el mecanismo de liberacioacuten ideal cuando se quiere

conseguir una accioacuten farmacoloacutegica prolongada

La liberacioacuten del faacutermaco desde formas farmaceacuteuticas que no se disgregan y que liberan

el principio activo lentamente (asumiendo que el aacuterea no cambia y que no se alcanzan

condiciones de equilibrio) puede ser representada por la siguiente ecuacioacuten

W0-Wt = Kt (I5)

donde W0 es la cantidad inicial de faacutermaco en la forma farmaceacuteutica Wt es la cantidad

de faacutermaco presente en la misma a tiempo t y K la constante de proporcionalidad

Introduccioacuten

Si esta ecuacioacuten se divide entre W0 y se simplifica se obtiene

ft = K0 t (I6)

donde )(1 0WWf tt y tf representa la fraccioacuten de faacutermaco liberado a tiempo t y K0

la constante de liberacioacuten aparente o constante de orden cero De esta forma una graacutefica

de la fraccioacuten de faacutermaco liberado en funcioacuten del tiempo seraacute lineal si se cumplen las

condiciones anteriores

Otra forma de expresar este modelo se refleja en la siguiente ecuacioacuten

Qt = Q0 + K0t (I7)

donde Qt es la cantidad de faacutermaco liberado a tiempo t Q0 es la cantidad inicial de

faacutermaco en solucioacuten que generalmente es cero y K0 es la constante de velocidad en la

cineacutetica de orden cero

Cineacutetica de primer orden

La aplicacioacuten de este modelo al estudio de la liberacioacuten de faacutermacos fue propuesto por

primera vez por Gibaldi y Feldman en 1967 [92] La cineacutetica de orden uno presenta la

siguiente ecuacioacuten de velocidad

Qt = Q0 e -K1t

ln Qt= -K1t+ ln Q0 (I9)

o en logaritmos decimales

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

faacutermaco en la solucioacuten y K1 es la constante de primer orden

De esta forma la representacioacuten del logaritmo de la cantidad de faacutermaco disuelto frente

al tiempo transcurrido da lugar a una recta en los procesos con cineacutetica de primer orden

Las formas farmaceacuteuticas que siguen este perfil de disolucioacuten suelen ser matrices

porosas que contienen principios activos hidrosolubles

Modelo de Higuchi

Higuchi (1963) desarrolloacute varios modelos teoacutericos para estudiar la liberacioacuten de

faacutermacos solubles y poco solubles incorporados en matrices soacutelidas o semi-soacutelidas[93]

Introduccioacuten

Este modelo describe la liberacioacuten del faacutermaco como un proceso de difusioacuten a traveacutes de

la matriz de poliacutemero siempre y cuando se mantengan las condiciones ―sumidero (del

ingleacutes sink conditions) es decir que se garantice la solubilidad del faacutermaco en todo

momento durante la liberacioacuten Esta difusioacuten estaacute basada en la ley de Fick que depende

de la raiacutez cuadrada del tiempo Generalmente se emplea lo que se conoce como

ecuacioacuten simplificada de Higuchi

Q = KH t12

donde Q es la cantidad de faacutermaco liberado y KH es la constante de disolucioacuten de

Higuchi

Modelo de Hixson- Crowell o de la raiacutez cuacutebica

Hixson and Crowell (1931) [94] partiendo de la base de que el aacuterea regular de la

partiacutecula es proporcional a la raiacutez cuacutebica de su volumen propusieron la siguiente

ecuacioacuten para describir este modelo

- Wt13

= Kst (I12)

de faacutermaco que queda en la forma farmaceacuteutica a tiempo t y Ks es una constante que

incorpora la relacioacuten superficie-volumen

Dividiendo la ecuacioacuten anterior entre W013

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

donde )(1 0WWf tt y representa la fraccioacuten de faacutermaco disuelto a tiempo t y Kβ es la

constante de liberacioacuten

La graacutefica de la raiacutez cuacutebica de la fraccioacuten de faacutermaco no liberada en funcioacuten del tiempo

seraacute lineal si la forma farmaceacuteutica disminuye de tamantildeo proporcionalmente en el

tiempo Cuando se utiliza este modelo se asume que la velocidad de liberacioacuten estaacute

condicionada por la velocidad de disolucioacuten de las partiacuteculas de faacutermaco y no por la

difusioacuten que pueda ocurrir a traveacutes de la matriz polimeacuterica

Modelo de Korsmeyer-Peppas

Korsmeyer et al (1983) [95] desarrollaron un modelo semiempiacuterico sencillo que

relaciona la liberacioacuten de faacutermaco con el tiempo a traveacutes de una ecuacioacuten exponencial

Estos autores plantearon que en ocasiones el mecanismo de difusioacuten se desviacutea de la

Introduccioacuten

difusioacuten Fickiana siguiendo un comportamiento anoacutemalo o no Fickiano Es un modelo

especialmente uacutetil cuando se desconoce el mecanismo de liberacioacuten o cuando eacutesta

ocurre por maacutes de un mecanismo

MtMinfin= Ktn (I14)

Log MtMinfin= Log K+ n Log t (I15)

donde Mt es cantidad de faacutermaco liberado a tiempo t Minfin es la cantidad de faacutermaco que

se liberariacutea a tiempo infinito (por tanto MtMinfin es la fraccioacuten de faacutermaco liberado a

tiempo t) K es la constante del sistema y n es el exponente difusional La representacioacuten

del Log MtMinfin en funcioacuten del Log t daraacute lugar a una liacutenea recta si el sistema se ajusta a

este modelo

Seguacuten los valores que tome n se pueden definir distintos mecanismos de transporte [96]

En la Tabla I2 se muestran los posibles mecanismos que se pueden observar en la

liberacioacuten controlada de un principio activo utilizando una peliacutecula polimeacuterica como

sistema regulador Cuando n = 05 se trata de una difusioacuten Fickiana y la constante k

puede expresarse como

iDk (I16)

donde Di es el coeficiente de difusioacuten del faacutermaco desde el poliacutemero y δ el espesor de la

matriz de poliacutemero

Valores de n gt 05 se asocian a un mecanismo de difusioacuten anoacutemalo (no Fickiano) En

particular cuando n = 1 se trata de la cineacutetica de orden cero que Peppas considera un

caso liacutemite de transporte no Fickiano denominaacutendolo ―Transporte Caso II En este

caso el transporte del soluto se realiza a velocidad constante debido a que el frente de

hinchamiento del poliacutemero avanza de forma constante Este tipo de transporte estaacute

controlado por la relajacioacuten de las cadenas del poliacutemero

Cuando n lt 05 lt 1 el proceso estaacute dominado por procesos de difusioacuten y relajacioacuten de

las cadenas polimeacutericas Valores de n gt 1 aparecen usualmente cuando los tiempos de

liberacioacuten son muy elevados y a este tipo de transporte lo denominan ―Transporte

Supercaso II Por uacuteltimo valores de n lt 05 se asocian a la presencia de poros en la

matriz polimeacuterica y a la consiguiente difusioacuten simultaacutenea a traveacutes de la matriz hinchada

y a traveacutes de los poros llenos de medio de disolucioacuten

Introduccioacuten

Tabla I2 Resumen de los mecanismos de transporte de solutos dependiendo del exponente difusional n

Exponente de liberacioacuten

Mecanismo de

transporte del faacutermaco

05 Difusioacuten Fickiana

05 n 1 Transporte anoacutemalo

1 Transporte Caso II

ngt1 Transporte Supercaso II

En la Tabla I3 se muestran los valores del exponente difusional (n) para matrices de

liberacioacuten con diferentes geometriacuteas y mecanismos de liberacioacuten

Tabla I3 Valores del exponente difusional en el modelo empiacuterico de Korsmeyer-Peppas para sistemas de

distinta geometriacutea

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por difusioacuten (Caso I)

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Laacutemina n = 05 n = 1

Cilindro n = 045 n = 089

Esfera n = 043 n = 085

Cuando el hidrogel estaacute inicialmente hinchado y contiene un faacutermaco soluble las

ecuaciones que se utilizan en la cineacutetica de liberacioacuten son las mostradas en la Tabla I4

las cuales dependen de la geometriacutea del hidrogel [97]

Tabla I4 Soluciones aproximadas para la liberacioacuten difusional de faacutermacos a partir de matrices

polimeacutericas [97]

Geometriacutea Estados iniciales Estados finales

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

Modelo de Baker- Lonsdale

Este modelo fue desarrollado por Baker and Lonsdale (1974) [98] a partir del modelo de

Higuchi Describe la liberacioacuten de faacutermaco desde una matriz esfeacuterica y viene dado por

la siguiente expresioacuten

3 (I17)

donde Mt es la cantidad de faacutermaco liberada a tiempo t Minfin es la cantidad de faacutermaco

que se liberariacutea a tiempo infinito (por tanto MtMinfin es la fraccioacuten de faacutermaco liberado a

tiempo t) y k la constante de liberacioacuten y pendiente de la recta

Esta ecuacioacuten se ha empleado para la linealizacioacuten de perfiles de liberacioacuten de

microcaacutepsulas y microesferas[99]

Materiales y Meacutetodos

II MATERIALES Y MEacuteTODOS

1 Materiales

En este trabajo se han empleado los siguientes reactivos

Poliacutemeros

Hidrocloruro de quitosano (HCS) (Protasanreg

UP Cl 113 y 213) suministrado por

Novamatrix (Noruega) de 150 y 400 kDa de peso molecular respectivamente y un

grado de desacetilacioacuten del 86 en ambos casos

Quitosano (CS) suministrado por Primex (Islandia) con un peso molecular de

644kDa y un grado de desacetilacioacuten del 90

Principios activos

Claritromicina suministrada por el Laboratorio Farmaceacuteutico Vegal Farmaceacuteutica

SL (Madrid Espantildea)

Hidrocloruro de tramadol suministrado por el Laboratorio Farmaceacuteutico Vegal

Farmaceacuteutica SL (Madrid Espantildea)

Hidrocloruro de ciprofloxacino suministrado por Elfar Drag SL (Madrid Espantildea)

Agentes entrecruzantes

Tripolifosfato soacutedico (TPP) suministrado por Sigma- Aldrich (Espantildea)

Genipina suministrada por Challenge Bioproducts Co Ltd (Taiwan)

Ceacutelulas y reactivos para los ensayos celulares

Las ceacutelulas Calu-3 y el medio de cultivo EMEM (Eagles Minimal Essential Medium) se

obtuvieron de la ATCC (del ingleacutes American Type Culture Collection) ndash LGC

Promochem

La solucioacuten salina equilibrada de Hank (HBSS) el surfactante Triton-X 100 y el kit

para el ensayo LDH (lactato deshidrogenasa) comercialmente conocido como TOX7

fueron suministrados por Sigma Chemical Company (Poole UK) El reactivo para MTS

(3-(45-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazolio)

comercialmente conocido como CellTiter 96 AQueous One Solution Assay fue

suministrado por Promega (USA)

2 Obtencioacuten de microesferas de hidrocloruro de quitosano

Se prepararon soluciones de hidrocloruro de quitosano en agua destilada en diferentes

concentraciones seguacuten el caso (01-1 pv) A continuacioacuten se antildeadioacute el faacutermaco

correspondiente un 30 pp para las microesferas de tramadol y un 50 pp para las de

claritromicina Las soluciones resultantes se atomizaron en un Buumlchi Mini Spray- Dryer

B- 290 (Buumlchi Labortechnik AG Flawil Suiza) representado en la Figura II1 Se

utilizaron las siguientes condiciones flujo de aire 473 NL h-1

flujo de pulverizacioacuten 32

-1 y temperatura de entrada (inlet) 160ordmC Las microesferas resultantes se

recogieron del colector y fueron almacenadas en un desecador Pyrexreg (Afora SA

Barcelona Espantildea) a temperatura ambiente

En el proceso de atomizacioacuten el liacutequido llega a la aguja gracias a la bomba peristaacuteltica

y la fuerza del aire comprimido lo separa en gotas que pasan a una caacutemara donde es

evaporado el solvente El solvente de las gotas es retirado debido a la energiacutea caloriacutefica

producida por el atomizador Se obtiene una eficiencia oacuteptima de atomizacioacuten cuando

existe un equilibrio entre la energiacutea de entrada y la cantidad de energiacutea necesaria que

depende de la muestra que se atomice Puesto que el punto de ebullicioacuten del agua es

100ordmC la temperatura de entrada del atomizador debe ser mayor Se ha descrito en la

bibliografiacutea que la temperatura de entrada oacuteptima para la preparacioacuten de microesferas a

partir de soluciones de quitosano es de 160ordmC A temperaturas inferiores o velocidades

de flujo altas el solvente de las gotiacuteculas no se evapora completamente [25-28]

En el caso de las microesferas entrecruzadas antes del proceso de atomizacioacuten se

antildeadioacute ademaacutes el agente entrecruzante correspondiente Para las microesferas con

claritromicina se empleoacute TPP o genipina Se utilizaron dos concentraciones de TPP (01

y 02 pv) en una proporcioacuten de volumen 103 y a valores de pH 4 y 9 La genipina se

antildeadioacute en una concentracioacuten de 05 (002 pv) y 1mM (004 pv) Las soluciones de

hidrocloruro de quitosano 05 y 1 (pv) entrecruzadas con TPP a pH 9 no se pudieron

atomizar puesto que se formaron agregados al antildeadir el TPP

Las microesferas con hidrocloruro de tramadol fueron sometidas a un entrecruzamiento

con varias concentraciones de genipina (2-20mM) para lo cual se antildeadioacute la solucioacuten

de genipina y se sometioacute la mezcla resultante a dos tiempos de entrecruzamiento (5 y 15

horas) a 50ordmC

Figura II1 Atomizador Buumlchi Mini Spray- Dryer B- 290

El rendimiento de atomizacioacuten (RA) se calculoacute a partir de la cantidad total de soacutelidos

iniciales en la solucioacuten

Para determinar la eficiencia de encapsulacioacuten (EE) de las microesferas de tramadol y

claritromicina obtenidas por atomizacioacuten se tomaron 5mg de microesferas y se

disolvieron en 20mL de HCl 01N durante 24 horas De ahiacute se tomoacute una aliacutecuota que se

centrifugoacute a 20000rpm (Mikro 12-24 Hettich Zentrifugen Andreas Hettich GmbH amp

Co KG Tuttlingen Alemania) y se determinoacute la cantidad de faacutermaco presente por

espectrofotometriacutea UV-VIS (GBC UV-VIS 920) en el caso del tramadol y por

cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC) en el caso de la claritromicina Todas

las medidas se realizaron por triplicado

3 Obtencioacuten de peliacuteculas de quitosano

Las peliacuteculas de quitosano cargadas con hidrocloruro de ciprofloxacino se obtuvieron

por el meacutetodo de evaporacioacuten del solvente Se disolvioacute el quitosano al 3 (pv) en aacutecido

aceacutetico 1 (vv) y se antildeadioacute el faacutermaco en un 30 (pp) respecto al poliacutemero Se vertioacute

una cantidad determinada de la solucioacuten en una placa Petri modelo y se dejoacute secar a

37ordmC durante 48 horas El entrecruzamiento entre el quitosano y el agente entrecruzante

se llevoacute a cabo por inmersioacuten de las peliacuteculas en soluciones acuosas de TPP (100mL) a

4ordmC a diferentes concentraciones (0 1 25 y 5 pv) y tiempos de entrecruzamiento (0

05 1 y 4 horas) Finalmente se extrajo la peliacutecula de la solucioacuten de TPP y se secoacute en

estufa a 37ordmC durante 24 horas

La EE del hidrocloruro de ciprofloxacino se determinoacute midiendo por espectrofotometriacutea

UV-VIS la cantidad de faacutermaco que quedoacute en las soluciones de TPP tras la reaccioacuten de

entrecruzamiento La EE se calculoacute utilizando la siguiente expresioacuten

EE () = [(Q total ndash Q) Q total] middot 100 (II1)

donde Qtotal es la cantidad teoacutericamente encapsulada de faacutermaco y Q la cantidad de

faacutermaco detectada en la solucioacuten de TPP tras el entrecruzamiento

4 Obtencioacuten de nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano

Las nanopartiacuteculas se prepararon por gelificacioacuten ionotroacutepica del TPP y el hidrocloruro

de quitosano con modificaciones del meacutetodo propuesto por Fernandez-Urrusuno et al

[33] Inicialmente se determinoacute la concentracioacuten adecuada de hidrocloruro de quitosano

y TPP para la formacioacuten de las nanopartiacuteculas Para ello se gotearon 18mL de una

solucioacuten de TPP 0084 (pv) sobre soluciones de 4mL de hidrocloruro de quitosano de

diferentes concentraciones (005-02 pv) en agua destilada con agitacioacuten Las

suspensiones resultantes se caracterizaron visualmente como solucioacuten transparente

suspensioacuten opalescente (nanopartiacuteculas) o agregados La formacioacuten de nanopartiacuteculas se

confirmoacute por Dynamic Light Scattering (DLS) con un detector Viscotek Se determinoacute

el pH de la solucioacuten de TPP que dio lugar a nanopartiacuteculas de menor tamantildeo utilizando

soluciones de TPP a tres valores de pH distintos (9 55 y 4)

Para aislar las nanopartiacuteculas del posible quitosano libre se centrifugaron las

suspensiones a 13000 rpm durante 1 hora y se resuspendieron las nanopartiacuteculas en

HBSS (pH 6) para los estudios en cultivos celulares

5 Caracterizacioacuten

51 Estudios de morfologiacutea

Las imaacutegenes de microscopiacutea electroacutenica de barrido (SEM) presentadas en esta

memoria se obtuvieron en el Centro de Microscopiacutea de la Universidad Complutense de

Madrid

Las muestras de microesferas se adhirieron con una cinta de doble haz adhesivo sobre

los portamuestras ciliacutendricos

Para observar los cortes transversales de las peliacuteculas de quitosano se obtuvieron

fragmentos de las mismas mediante criofractura con nitroacutegeno liacutequido y se montaron

sobre los portamuestras

Las muestras se metalizaron con AuPd utilizando un evaporador a vaciacuteo (Balzers SDC

004 Sputter coater Oerlikon Corporate Pfaumlffikon Switzerland) a una presioacuten de vaciacuteo

de 01mbar y a 25mA durante 3 minutos Se empleoacute un microscopio JEOL JSM-6400

(JEOL Tokyo Japan) el cual trabajoacute a un voltaje de aceleracioacuten de electrones de 5kV

nanopartiacuteculas

El potencial zeta de las microesferas se determinoacute por espectroscopia de correlacioacuten

fotoacutenica empleando un Malvern Zetasizer Nanoseries Nano ZS (Malvern Instruments

Herrenberg Alemania) Las muestras se prepararon de la siguiente forma se

suspendieron 25mg de microesferas en 25mL de etanol se tomoacute 05mL de la

suspensioacuten y se diluyoacute hasta 50mL con una solucioacuten de KCl 10-3

M La medida del

potencial zeta se realizoacute utilizando cubetas desechables DTS 1060 (Malvern

Instruments Herrenberg Alemania) con un voltaje efectivo de 150V a 25ordmC

El potencial zeta de las nanopartiacuteculas y de la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano

utilizada para obtenerlas se determinoacute en un Zetasizer 2000 (Malvern instruments) Los

datos de movilidad electroforeacutetica (UE) fueron automaacuteticamente traducidos a valores de

potencial zeta utilizando la ecuacioacuten de Henry [100]

)(2 afUE

donde es la constante dieleacutectrica ζ el potencial zeta la viscosidad y f( a) la funcioacuten

de Henry

La unidad de distancia de Debye es la reciacuteproca de la distancia y generalmente se

toma -1

como el grosor de la doble capa eleacutectrica El paraacutemetro a es el radio de la

partiacutecula y por tanto ∙ a es la relacioacuten del radio de la partiacutecula con la doble capa

eleacutectrica

Se empleoacute la aproximacioacuten de HelmholtzndashSmoluchowski [101] en la que el valor de

F(ka) es 15 Esta aproximacioacuten es vaacutelida para partiacuteculas de tamantildeo superior a 02microm

dispersas en electrolitos con una concentracioacuten de sales superior a

53 Estudios de interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero

531 Difraccioacuten de rayos X

Los estudios de difraccioacuten de rayos X de las muestras en polvo (tanto microesferas

como peliacuteculas) se realizaron con un difractoacutemetro automaacutetico PHILIPS XacutePERT MPD

perteneciente al CAI (Centro de Ayuda a la Investigacioacuten) de DRX (Facultad de

Farmacia Universidad Complutense de Madrid) El equipo tiene un gonioacutemetro

PW3050 (θ-2θ) y la potencia del generador se fijoacute a 45kV y 40mA Las medidas se

realizaron a temperatura ambiente con radiacioacuten Cu Kα1 (longitud de onda 154056Aring)

con monocromador de grafito y en geometriacutea confocalizada (Bragg-Brentano) Se fijoacute el

tamantildeo de paso (2θ) de las medidas en 0040ordm y en 1segundo la duracioacuten del paso El

rango angular estudiado fue de 5ordm a 40ordm 2θ

El iacutendice o porcentaje de cristalinidad (ICr) de las peliacuteculas de quitosano se determinoacute

seguacuten el meacutetodo propuesto por Segal (1959) para la celulosa [102] y adaptado al

quitosano mediante la ecuacioacuten

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

donde I110 es la intensidad maacutexima de la reflexioacuten a 2θ= 20ordm y Iam es la intensidad

miacutenima de la difraccioacuten en la regioacuten amorfa a 2θ= 16ordm aproximadamente[103-105] El

error estaacutendar de este meacutetodo es de 37 [102 106]

532 Espectroscopia de infrarrojo

Los espectros de infrarrojo de las peliacuteculas se obtuvieron con un Magna-IR 750

(Nicolet) por el meacutetodo de transmisioacuten (Unidad de Espectroscopiacutea de Infrarrojo

Facultad de Ciencias Quiacutemicas Universidad Complutense de Madrid) Las muestras se

midieron con un beamsplitter de KBr y un detector DTGS de KBr entre 400 y 4000 cm-

1 de longitud de onda El espectro teniacutea una resolucioacuten de 4 cm

-1 y en el caso del

quitosano en polvo el nuacutemero de acumulaciones fue de 50 Las muestras de peliacuteculas

de quitosano se midieron a 4cm-1

con 64 acumulaciones Los espectros obtenidos se

analizaron con WinfirstTM

(Microsoftreg Windows FTIR software USA)

54 Reaccioacuten de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina

Se preparoacute una solucioacuten de hidrocloruro de quitosano 05 (pv) en agua destilada se

antildeadioacute una solucioacuten de genipina (05-5mM) y se incuboacute la solucioacuten a distintos

intervalos de tiempo (30min-7h) y a diferentes temperaturas (25-50ordmC)

El seguimiento de la reaccioacuten de entrecruzamiento entre el hidrocloruro de quitosano y

la genipina se llevoacute a cabo por espectroscopiacutea UV-VIS Se realizoacute un barrido en el

rango de longitud de onda de 200 a 700nm a 2nm de resolucioacuten para determinar el

espectro de absorcioacuten UV-VIS de la genipina Asiacute mismo se realizaron barridos en el

rango 200-330nm de las soluciones de hidrocloruro de quitosano y genipina con

diferentes condiciones de reaccioacuten (tiempo y concentracioacuten de genipina) para observar

los posibles cambios producidos en el espectro inicial al reaccionar ambos compuestos

55 Determinacioacuten del grado de entrecruzamiento con genipina

El grado de entrecruzamiento del hidrocloruro de quitosano y la genipina se determinoacute

por el meacutetodo de la ninhidrina[107] Este meacutetodo determina el porcentaje de grupos

amino que quedan libres en la solucioacuten de quitosano despueacutes de que haya tenido lugar el

entrecruzamiento La solucioacuten de ninhidrina estaba compuesta por Solucioacuten A 105g

aacutecido ciacutetrico 10mL NaOH (1M) y 004g SnCl2 bull 2H2O disuelto en 25mL de agua

bidestilada Solucioacuten B 1g ninhidrina en 25mL de etilenglycol monometil eter Se

mezcloacute la solucioacuten A con la B y se dejoacute en agitacioacuten durante 45 min Para el ensayo se

calentoacute una aliacutecuota de 100μL de cada solucioacuten problema (sin genipina como blanco y

con genipina de diferentes concentraciones) con 1mL de la solucioacuten de ninhidrina a 100

ordmC en un bantildeo durante 20 min Se enfrioacute la muestra en hielo se diluyoacute con 5mL de

isopropanol al 50 y se midioacute la absorbancia a una longitud de onda de 570nm La

cantidad de grupos amino libres en las muestras tras calentarlas con ninhidrina es

proporcional a la absorbancia de la solucioacuten La concentracioacuten de grupos amino libres

se determinoacute a partir de una curva de calibrado de absorbancia frente a la concentracioacuten

de glucosamina (equivalente a la concentracioacuten de grupos amino libres) El grado de

entrecruzamiento (G) se calculoacute mediante la siguiente foacutermula

G () = [(NH2 inicial -NH2 final)NH2 inicial] x 100 (II4)

donde NH2 inicial es la cantidad de grupos amino libres en la muestra sin entrecruzar y

NH2 final es la cantidad de grupos amino libres en las muestras entrecruzadas

Los experimentos se realizaron por triplicado

56 Estudios de hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano

El hinchamiento de las peliacuteculas se llevoacute a cabo en PBS a pH 74 Se utilizaron para ello

muestras de peliacuteculas con una superficie de 2cm2 y que no conteniacutean principio activo

Se pesoacute el fragmento de peliacutecula en una placa Petri y se anotoacute su peso exacto se

antildeadieron 10mL de medio atemperado a 37ordmC y se incuboacute en un agitador orbital

(Rotabit Selecta JP Selecta SA Barcelona Espantildea) a 37ordmC y 100 rpm A intervalos

de tiempos predeterminados la peliacutecula se extrajo y de forma raacutepida y cuidadosa se

secoacute ligeramente sobre un papel de filtro para eliminar el exceso de liacutequido se pesoacute y se

volvioacute a introducir en la placa El grado de hinchamiento (W) se determinoacute mediante la

siguiente expresioacuten [54]

M (II5)

donde M es el peso a tiempo t y Mo el peso a tiempo cero

Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se analizaron por

ANOVA de una viacutea

57 Determinacioacuten de la cantidad de quitosano unido a las nanopartiacuteculas

La concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano presente en las nanopartiacuteculas se

determinoacute por el meacutetodo colorimeacutetrico descrito por Miralles et al (2009) [108] Se

preparoacute una solucioacuten tampoacuten a pH 32 pesando 187g de glicina y 146g de NaCl y

enrasando a 250mL A esta solucioacuten se le antildeadioacute HCl 01M hasta ajustar el pH a 32

Por otro lado se preparoacute la solucioacuten de colorante (Cibacron Brilliant Red 3B-A)

pesando 150mg del colorante y enrasando hasta 100mL con agua bidestilada (15gL)

De esta solucioacuten madre de colorante se diluyoacute 120 (vv) de modo que la concentracioacuten

de trabajo fue 0075gL Se preparoacute una solucioacuten de hidrocloruro de quitosano de 4gL

en agua destilada y se diluyoacute hasta lograr una concentracioacuten de 05mgmL La solucioacuten

de quitosano resultante se utilizoacute para realizar una curva patroacuten a partir de sucesivas

diluciones de la misma entre 23 gmL y 379 gmL Tras centrifugar las suspensiones

de nanopartiacuteculas a 13000rpm durante 1 hora se recuperoacute el sobrenadante se tomaron

distintos voluacutemenes y se le antildeadioacute solucioacuten tampoacuten a pH 32 hasta un volumen de

300 L Despueacutes se le antildeadieron 3mL de solucioacuten colorante y se midioacute su absorbancia

por espectrofotometriacutea UV-VIS a 575nm que es la longitud de onda a la que estaacute el

maacuteximo de absorcioacuten del complejo coloreado formado entre el quitosano y el Cibacron

Brilliant Red Se obtuvo el valor de concentracioacuten extrapolando el valor resultante en la

curva patroacuten Se empleoacute un espectrofotoacutemetro UV-VIS modelo GBC UVVisible 920

(GBC Scientific Equipment Dandenong Australia)

6 Estudios de liberacioacuten in vitro

61 Microesferas de claritromicina

La liberacioacuten in vitro de claritromicina se realizoacute suspendiendo 50mg de microesferas

en 5mL de fluido gaacutestrico simulado (SGF) sin enzimas dentro de una bolsa de diaacutelisis

de celulosa de 12000 Da de diaacutemetro de poro (Sigma- Aldrich Madrid Espantildea) para

evitar la peacuterdida de microesferas durante la toma de muestras La bolsa se introdujo

despueacutes en un recipiente que conteniacutea 50mL de SGF a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten Se

tomaron muestras de 05mL a intervalos de tiempo predeterminados y fueron filtradas a

traveacutes de un filtro de jeringa de acetato de celulosa de 25mm de diaacutemetro y 020microm de

diaacutemetro de poro (Albet Barcelona Espantildea)

Todas las muestras se analizaron por cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten (HPLC)

con un cromatoacutegrafo Watersreg 625 (Waters Corporation Milford Massachusetts Estados

Unidos) acoplado a un detector de tipo fotodiodo array (PDA Watersreg

996 Waters

Corporation Milford Massachusetts Estados Unidos) La separacioacuten se hizo con una

columna Licrospher 100 RP 18 de 125mm x 46mm x 5 m (Sugelabor SA Madrid

Espantildea) El anaacutelisis se realizoacute con un flujo isocraacutetico de 12mLmin utilizando como

fase moacutevil acetonitrilo-metanol-agua con una relacioacuten de voluacutemenes 39952 y una

concentracioacuten de 004M de NaH2PO4 [24] Los analitos se detectaron a una longitud de

onda de = 205nm El volumen inyectado fue 20 L La columna se mantuvo a 50ordmC en

un horno de columna acoplado a un controlador de temperatura (Waters Corporation

Milford Massachusetts Estados Unidos) seguacuten las recomendaciones de la USP

23[109] Los picos cromatograacuteficos se digitalizaron e integraron con ayuda del software

Empower (Waters Corporation Milford Massachusetts Estados Unidos)

Previamente al anaacutelisis de las muestras de antibioacutetico se realizoacute una curva de calibrado

en SGF de la concentracioacuten de claritromicina en funcioacuten del aacuterea bajo la curva del pico

cromatograacutefico de la misma a 21 minutos Las soluciones de claritromicina empleadas

en aacutecido clorhiacutedrico 01N teniacutean un rango de concentraciones entre 005 y 5mgmL

Se realizaron los ajustes de los perfiles de liberacioacuten en SGF de las microesferas a los

modelos matemaacuteticos de orden cero Higuchi Hixon-Crowell Baker-Lonsdale y

Korsmeyer-Peppas reflejados en el Apartado 10 de la Introduccioacuten para describir los

perfiles de disolucioacutenliberacioacuten de las microesferas Se ajustoacute el perfil de liberacioacuten de

faacutermaco en funcioacuten del tiempo a una ecuacioacuten lineal para obtener la constante de orden

cero se representoacute el porcentaje de claritromicina liberada frente al valor de la raiacutez

cuadrada del tiempo para obtener la constante de Higuchi (KH) el valor de la raiacutez

cuacutebica de la cantidad de faacutermaco remanente en las microesferas frente a t para obtener

la constante de Hixon-Crowell y el valor de la funcioacuten ft frente al tiempo para obtener

el valor de la constante de Baker-Lonsdale En los casos en los que se observoacute que el

mecanismo de liberacioacuten era difusional se calculoacute el exponente difusional (n) seguacuten la

ecuacioacuten de Korsmeyer-Peppas (II5) [95] representando los valores de log (MtMmax)

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

log (MtMinfin) = log K+ n log t (II7)

donde Mt es la cantidad de faacutermaco liberado a tiempo t y Minfin la cantidad de faacutermaco que

se liberariacutea a tiempo infinito Al realizar los caacutelculos de las liberaciones se tuvieron en

cuenta los voluacutemenes tomados para las muestras y los del medio antildeadido Los estudios

de liberacioacuten se realizaron por triplicado y los resultados se analizaron por medio de

62 Microesferas de hidrocloruro de tramadol

Se pesaron 25mg de microesferas en 5mL de medio de liberacioacuten (fluido intestinal

simulado (SIF) y fluido gaacutestrico simulado sin enzimas) dentro de una bolsa de diaacutelisis

al igual que en el caso anterior La bolsa se introdujo despueacutes en un recipiente que

conteniacutea 200mL de medio de liberacioacuten a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten A tiempos

predeterminados se tomaron muestras de 2mL reponieacutendose con la misma cantidad de

medio y a la misma temperatura para mantener el volumen constante

Para la cuantificacioacuten del tramadol se utilizoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea UV-VIS

Se seleccionoacute un rango de longitudes de onda tomando como base datos teoacutericos de la

bibliografiacutea consultada Este se fijoacute entre 200 y 400nm y se realizaron varios barridos

del hidrocloruro de tramadol disuelto en varios medios agua destilada SGF y SIF

siendo la maacutexima absorcioacuten a 271nm Una vez seleccionada la longitud de onda

correspondiente a la maacutexima absorcioacuten se realizoacute una curva de calibrado con

concentraciones conocidas del principio activo en los tres medios citados Las muestras

extraiacutedas se leyeron a la longitud de onda determinada frente al blanco correspondiente

y se cuantificaron en funcioacuten de la curva de calibrado obtenida

Se realizaron los ajustes de los perfiles de liberacioacuten en los medios SGF y SIF a los

Korsmeyer-Peppas Los estudios de liberacioacuten se realizaron por triplicado y los

resultados se analizaron por medio de ANOVA

63 Peliacuteculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino

Los ensayos de liberacioacuten se llevaron a cabo introduciendo la peliacutecula de quitosano

cargada con hidrocloruro de ciprofloxacino en 900mL de PBS a pH 74 e incubando en

un agitador orbital en las mismas condiciones experimetales descritas en el apartado

anterior A tiempos predeterminados se tomaron 2mL del medio de liberacioacuten y se

repuso con el mismo volumen de medio La cantidad de faacutermaco liberado en cada

tiempo se determinoacute por espectrofotometriacutea UV-VIS La longitud de onda

correspondiente a la maacutexima absorcioacuten se determinoacute mediante barridos entre 200 y

400nm siendo de 274nm

Se realizaron los ajustes de los perfiles de liberacioacuten a los modelos matemaacuteticos de

Higuchi y Korsmeyer-Peppas Los estudios de liberacioacuten se realizaron por triplicado y

los resultados se analizaron con ANOVA de una viacutea para cada tiempo

7 Cultivos celulares

71 Ceacutelulas Calu-3

Las ceacutelulas Calu-3 se sembraron en flasks de 75 cm3 a 5 CO2 y 37

0C Una vez que las

ceacutelulas alcanzaron la confluencia se sembraron en soportes permeables (Costar

Transwellreg

plates High Wycombe UK) con membranas de poliestireno (12 mm de

diaacutemetro 04 microm tamantildeo de poro) a una densidad de siembra de 100000 ceacutelulas por

pocillo Tras sembrarlas se mantuvieron a 5 CO2 37ordmC en EMEM suplementado con

FBS (suero fetal bovino) antibioacuteticoantimicoacutetico y L-glutamina Durante el tiempo de

cultivo el medio se renovoacute cada dos diacuteas

El crecimiento celular y la formacioacuten de uniones estrechas se comproboacute por

determinaciones de TEER que se realizaron cada dos diacuteas empezando el diacutea 7 despueacutes

de la siembra Se evitoacute la medida diaria de TEER debido a la posibilidad de dantildear la

monocapa celular tanto por el meacutetodo de medida como por la liberacioacuten de iones desde

los electrodos La resistencia basal se tuvo en cuenta midieacutendola a traveacutes de membranas

sin ceacutelulas y restaacutendole esta determinacioacuten a la TEER de la monocapa

72 Ensayo de toxicidad MTS

Con el objeto de estudiar el efecto del hidrocloruro de quitosano en solucioacuten y en forma

de nanopartiacuteculas sobre la actividad metaacutebolica de las dos liacuteneas celulares se realizoacute el

ensayo de toxicidad MTS Este ensayo estaacute basado en la conversioacuten de una sal de

tetrazolio por enzimas celulares en un producto que es soluble en el medio de cultivo

conocido como formazan Esta conversioacuten es producida por la NADH (forma reducida

del dinucleoacutetido nicotinamida adenina) producido por la deshidrogenasa en ceacutelulas

metaboacutelicamente activas

Las ceacutelulas Calu-3 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10000

ceacutelulas por pocillo Se incubaron durante 24 horas antes del ensayo Se aspiroacute el medio

y se sustituyoacute por las soluciones de las muestras que consistiacutean en nanopartiacuteculas o

solucioacuten de quitosano en HBSS a diferentes concentraciones El medio HBSS y el

surfactante Triton-X 100 (01 pv) se emplearon como control Las ceacutelulas se

incubaron con las muestras durante 2 horas tras las cuales se aspiraron y se sustituyeron

por 100microL de medio de cultivo Se antildeadieron 20microL del reactivo MTS (CellTiter 96reg

AQueous One Solution) a los pocillos y tras incubar las ceacutelulas durante 1 hora se midioacute

la absorbancia a 490nm en un lector de placas Los experimentos se realizaron por

cuadruplicado y los resultados se analizaron por ANOVA de una viacutea El porcentaje de

actividad metaboacutelica (AM) se determinoacute mediante la siguiente foacutermula

AM () = (Amuestra AHBSS) ∙ 100 (II8)

donde la Amuestra es la absorbancia de la muestra problema y AHBSS es la absorbancia del

medio HBSS

73 Ensayo de liberacioacuten de LDH

La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima citoplasmaacutetica que estaacute presente en las

ceacutelulas Cuando las membranas citoplasmaacuteticas sufren alguacuten dantildeo se produce la

liberacioacuten de LDH por lo que su cuantificacioacuten en los sobrenadantes del cultivo celular

se puede utilizar como indicador de muerte celular

Se sembraron las ceacutelulas en placas de 96 pocillos a una densidad 10000 ceacutelulas por

pocillo y se incubaron durante 24 horas antes del ensayo Se aspiroacute el medio de cultivo

y se sustituyoacute por las soluciones de muestra (al igual que para el ensayo de toxicidad

MTS) El HBSS y el reactivo Triton-X 100 (01 pv) se emplearon como control Las

ceacutelulas se incubaron con las muestras durante 2 horas tras las cuales se retiraron 50microL

de cada pocillo En una nueva placa multipocillo se antildeadieron 100 microL del reactivo LDH

(TOX7 Sigma-Aldrich) a los 50microL retirados de muestra se incubaron durante 20-30

min a temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia a 490nm en un lector de placas

Los experimentos se realizaron por cuadriplicado y los resultados se analizaron por

ANOVA de una viacutea El porcentaje de LDH liberada se determinoacute mediante la foacutermula

LDH liberada () = (Amuestra Atriton X) ∙ 100 (II9)

donde la Amuestra es la absorbancia de muestra problema y Atriton X es la absorbancia del

Triton X

74 Determinacioacuten de la resistencia transepitelial

Se estudioacute el efecto del hidrocloruro de quitosano en solucioacuten y en forma de

nanopartiacuteculas sobre la resistencia eleacutectrica transepitelial (TEER) de las monocapas de

las ceacutelulas Calu-3 ya que eacutesta indica el estado de las uniones estrechas entre ceacutelulas El

estudio se realizoacute con las ceacutelulas sembradas en soportes permeables que se dejaron

crecer hasta la confluencia de acuerdo con el protocolo explicado anteriormente Las

nanopartiacuteculas y la solucioacuten en HBSS (pH 6) y en distintas concentraciones se

antildeadieron a la parte apical de las monocapas Tras un periacuteodo de incubacioacuten de dos

horas se retiraron las muestras y se lavaron las ceacutelulas con PBS para eliminar cualquier

resto de hidrocloruro de quitosano Se antildeadioacute medio de cultivo fresco y se incubaron las

ceacutelulas otras 22 horas para determinar si cualquier cambio producido en la TEER era

reversible La TEER se midioacute con un voltiacutemetro EVOM World Precision Instruments

UK) equipado con un par de electrodos En la Figura II2 se muestra un esquema de la

medida de la TEER en una placa de soportes permeables y un detalle de la medida en un

uno de los soportes Las medidas se tomaron a 0 05 1 15 2 4 y 24 horas tras la

adicioacuten de las muestras de quitosano Las medidas de 0 05 1 15 y 2 horas se

realizaron en HBSS mientras que las de 4 y 24 horas se hicieron ya en medio de

cultivo Las monocapas celulares incubadas primero con HBSS y despueacutes con medio de

cultivo se utilizaron como referencia (control) Todos los experimentos se realizaron por

triplicado y los resultados se analizaron por ANOVA de una viacutea para cada tiempo

Figura II2 Esquema de la medida de la TEER en soportes permeables y detalle de la medida en uno de

los soportes

75 Ensayos de permeabilidad celular

Para este estudio se empleoacute como modelo macromolecular dextrano marcado con

isotiocianato de fluoresceiacutena Se utilizaron dextranos de dos pesos moleculares

diferentes 4400 (FD 4) y 10000 (FD10) Eacuteste no se incorporoacute a las nanopartiacuteculas sino

que se antildeadioacute a las monocapas junto con el hidrocloruro de quitosano en solucioacuten o en

forma de nanopartiacuteculas Soacutelo las monocapas celulares con una TEER gt 500 Ωcm2

incluyeron en el experimento (las monocapas con una TEER significativamente menor

se consideraron no confluentes)

Se retiroacute el medio de cultivo (EMEM) y se lavaron las monocapas con PBS Se antildeadioacute

HBSS atemperado al compartimento aceptor del soporte permeable (15mL) seguido de

05mL de la solucioacuten muestra en el compartimento donante Las muestras consistieron

en nanopartiacuteculas de HCS y TPP o soluciones de HCS al 0003 (pv) en HBSS (pH 6)

Posteriormente se antildeadioacute el dextrano marcado a una concentracioacuten de 500microLmL para

comenzar el experimento Las monocapas se incubaron a 5 CO2 y 37ordmC Se tomaron

muestras de 100microL del compartimento basolateral a los siguientes tiempos 30 60 90

120 150 y 180 min Este volumen se repuso inmediatamente con HBSS para mantener

las condiciones sumidero Tambieacuten se tomaron muestras de la solucioacuten en el

compartimento apical a t=0 y 180 min para determinar la concentracioacuten de dextrano

marcado al principio y al final del experimento de permeabilidad Las muestras tomadas

se transfirieron a una placa de 96 pocillos se cubrioacute para protegerlas de la luz y se

determinoacute la cantidad de dextrano FD4 y FD10 para cada tiempo por fluorescencia (Ex

506nm Em 529nm)

La permeabilidad (Papp) se expresa como coeficiente de permeabilidad aparente

calculado mediante la ecuacioacuten

Papp=(dQdt)(A∙Co) (II10)

donde Papp es la permeabilidad aparente en cms dQ dt es la tasa de permeabilidad A

es el aacuterea de difusioacuten de la monocapa (cm2) y Co es la concentracioacuten inicial de

dextrano

Tras la uacuteltima muestra las soluciones con FD4 y FD10 se aspiraron de los pocillos y se

lavaron las membranas celulares con PBS dos veces Se antildeadioacute medio de cultivo a los

pocillos y se realizaron medidas de TEER para comprobar el estado de las uniones

estrechas

Cuadro resumen del trabajo realizado

Componentes de las formulaciones

Principios activos (PA)

Claritromicina

Poliacutemeros Quitosano (CS)

Hidrocloruro de quitosano (HCS)

Agentes entrecruzantes Tripolifosfato soacutedico (TPP)

Genipina (Gnp)

Sistemas de liberacioacuten preparados Teacutecnicas utilizadas

Microesferas Atomizacioacuten

Peliacuteculas Evaporacioacuten de solvente

Nanopartiacuteculas Gelificacioacuten ionotroacutepica

Estudios realizados

Microesferas

Caracterizacioacuten

Morfologiacutea distribucioacuten de

tamantildeo potencial zeta DRX

grado de entrecruzamiento

rendimiento de atomizacioacuten y

eficiencia de encapsulacioacuten

Liberacioacuten in vitro de los

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

Morfologiacutea hinchamiento

DRX FT-IR y eficiencia de

encapsulacioacuten

principios activos SIF pH 74

Nanopartiacuteculas

Distribucioacuten de tamantildeo

potencial zeta y cantidad de

quitosano unido

Efecto de nanopartiacuteculas y

solucioacuten de quitosano sobre

ceacutelulas Calu-3

Citotoxicidad resistencia

transepitelial (TEER) y

permeabilidad celular

Resultados y Discusioacuten

III RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

atomizacioacuten

La claritromicina es un faacutermaco de caraacutecter baacutesico y poco hidrosoluble que presenta una

pobre o variable absorcioacuten y que es inestable a pH aacutecido Su combinacioacuten con un

poliacutemero mucoadhesivo como el quitosano puede ademaacutes de proteger al faacutermaco

promover su absorcioacuten a nivel de la mucosa gaacutestrica

La atomizacioacuten es un proceso raacutepido y sencillo para la produccioacuten de microesferas

cargadas con principios activos hidrofiacutelicos y lipofiacutelicos Ademaacutes es un meacutetodo con el

que se pueden obtener altas eficiencias de encapsulacioacuten Por todo ello es utilizado en la

industria farmaceacuteutica para obtener micropartiacuteculas [23]

El objetivo de este capiacutetulo ha sido la obtencioacuten por atomizacioacuten de microesferas de

hidrocloruro de quitosano entrecruzadas con tripolifosfato soacutedico o genipina para la

encapsulacioacuten de claritromicina Una vez obtenidas las microesferas el trabajo se ha

centrado en su caracterizacioacuten morfologiacutea carga superficial e interaccioacuten faacutermaco-

poliacutemero Por uacuteltimo se realizaron estudios de liberacioacuten in vitro

11 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina

entrecruzadas con tripolifosfato soacutedico

El tripolifosfato soacutedico (TPP) es un agente entrecruzante no toacutexico empleado en la

industria farmaceacuteutica para la preparacioacuten de microcaacutepsulas y microesferas ya que su

unioacuten con el quitosano tiene una gran capacidad de gelificacioacuten

Se estudioacute la influencia de tres variables sobre la liberacioacuten de claritromicina

Concentracioacuten de HCS (01-1 pv)

Concentracioacuten de TPP (0-02 pv)

pH de la solucioacuten de TPP (4 y 9)

111 Obtencioacuten de las microesferas

En la Tabla III1 se resumen las caracteriacutesticas de todas las microesferas obtenidas con

las distintas concentraciones de hidrocloruro de quitosano y TPP y los diferentes valores

de pH de la solucioacuten de TPP

Es de destacar que la claritromicina no es soluble en agua por lo que se ajustoacute el pH de

la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano a pH 4 Tambieacuten es importante sentildealar que a

altas concentraciones de hidrocloruro de quitosano la adicioacuten de TPP a pH 9 provocoacute la

formacioacuten de agregados de ahiacute que a este pH soacutelo se obtuvieron microesferas con HCS

01 (pv)

Tabla III1 Condiciones de preparacioacuten de las microesferas de hidrocloruro de quitosano (HCS) cargadas

con claritromicina (CLA) y entrecruzadas con TPP

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Los resultados obtenidos en la determinacioacuten del rendimiento de atomizacioacuten y la

eficiencia de encapsulacioacuten se muestran en la Tabla III2 El rendimiento de

atomizacioacuten varioacute entre un 36 y un 70 La viscosidad de la solucioacuten que se atomiza

influye en el rendimiento final del proceso en general las soluciones maacutes viscosas

dieron lugar a rendimientos inferiores Se obtuvieron rendimientos de atomizacioacuten altos

en el caso de microesferas sin TPP Sin embargo las microesferas con TPP a pH 4

dieron lugar a los rendimientos maacutes bajos debido a la mayor viscosidad de las

soluciones atomizadas Existen varios estudios en los que se han obtenido rendimientos

similares a los obtenidos en este trabajo o inferiores [110-112] Las peacuterdidas de

producto se deben principalmente a la adhesioacuten de material a las paredes del cicloacuten y

del compartimento de secado del equipo[113] Ademaacutes existen peacuterdidas de las

micropartiacuteculas maacutes pequentildeas y ligeras a traveacutes del sistema de aspiracioacuten[111] El

rendimiento tambieacuten es menor cuando los lotes atomizados son pequentildeos [112 114] La

eficiencia teacutermica de la atomizacioacuten estaacute relacionada con la energiacutea teacutermica de entrada y

con la cantidad de calor utilizada para la evaporacioacuten La eficiencia oacuteptima de

atomizacioacuten se puede lograr consiguiendo un balance entre la cantidad de calor aportado

y la cantidad de calor necesaria para la evaporacioacuten que estaacute relacionada con la

cantidad de muestra empleada[25]

En cuanto a la eficiencia de encapsulacioacuten los valores obtenidos fueron altos lo cual es

un factor positivo para la aplicacioacuten industrial de la atomizacioacuten Se han descrito en la

bibliografiacutea eficiencias de encapsulacioacuten altas (gt80) para este meacutetodo de

encapsulacioacuten [110 115 116]

Tabla III2 Rendimiento de atomizacioacuten (RA) y eficiencia de encapsulacioacuten (EE) (media plusmn SD) de

microesferas de claritromicina obtenidas por atomizacioacuten

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

No contiene claritromicina

En las Figuras III1A y III1B se muestra la morfologiacutea de las microesferas de

hidrocloruro de quitosano sin faacutermaco ni agente entrecruzante y de las microesferas

cargadas con claritromicina y entrecruzadas con TPP respectivamente Como puede

observarse las microesferas presentan forma esfeacuterica En ninguacuten caso se observan

cristales en las microfotografiacuteas lo cual indica que todo el faacutermaco ha sido encapsulado

puesto que la claritromicina es una sustancia cristalina Las microesferas de

hidrocloruro de quitosano presentan algunos hundimientos (Figura III1A) mientras que

las microesferas cargadas con claritromicina y TPP aparecen maacutes colapsadas (Figura

III1B) Las mellas o hundimientos se producen como consecuencia del proceso de

secado durante la atomizacioacuten En el proceso de atomizacioacuten se deshidrata la capa

externa de la esfera volvieacutendose riacutegida pero flexible y al eliminarse todo el liacutequido del

interior se produce un hundimiento de la capa externa de forma que la microesfera

presenta al final un aspecto arrugado tal y como describieron Martinac et al (2005) en

el caso de microesferas de etilcelulosa-quitosano cargadas con loratadina [111]

Estos resultados estaacuten en sintoniacutea con otros similares que han sido descritos en la

bibliografiacutea Desai y Park (2005) [117] observaron diferencias en la morfologiacutea

superficial de microesferas atomizadas de quitosano tras la adicioacuten del faacutermaco y el

agente entrecruzante Tanto el entrecruzamiento con TPP como el faacutermaco dieron lugar

a microesferas colapsadas Stulzer et al (2009) y Ventura et al (2008) prepararon

microesferas atomizadas con moxifloxacino entrecruzadas con glutaraldehido y

microesferas con aciclovir y TPP respectivamente observaacutendose en ambos casos

hundimientos en la superficie que atribuyeron a la baja viscosidad de la solucioacuten de

quitosano o al proceso de atomizacioacuten[115 118]

Figura III1 Microfotografiacuteas electroacutenicas de microesferas de A) HCS 1 (pv) y B) HCS 1 (pv) con

claritromicina y TPP 01 (pv)

113 Determinacioacuten de la carga superficial de las microesferas

El potencial zeta se midioacute para determinar la carga externa de las microesferas Esta

propiedad puede determinar el caraacutecter mucoadhesivo de las mismas La mucoadhesioacuten

permite aumentar el tiempo de retencioacuten del sistema de liberacioacuten en el epitelio y

promueve por tanto la absorcioacuten del faacutermaco y una mayor eficacia terapeacuteutica[57]

En general como ocurre en este caso la adicioacuten de polianiones provoca que las cargas

positivas del quitosano se neutralicen lo cual queda reflejado en el descenso del

potencial zeta y como consecuencia es de esperar una disminucioacuten de las propiedades

mucoadhesivas del poliacutemero

En la Tabla III3 se muestran los resultados obtenidos en los estudios de potencial zeta

Como puede observarse las microesferas presentaron mayoritariamente un potencial

zeta positivo lo cual es debido a la presencia de hidrocloruro de quitosano en su

superficie En general se observaron diferencias en el valor del potencial zeta en

funcioacuten del grado de entrecruzamiento con TPP siendo los valores de aquel inferiores

en el caso de microesferas con grado de entrecruzamiento maacutes alto Las diferencias maacutes

significativas se observaron en las microesferas preparadas con HCS 01 (pv) y TPP

a pH 9 en las cuales el potencial zeta disminuyoacute al aumentar la concentracioacuten de TPP

llegando a valores negativos cuando se empleoacute la concentracioacuten maacutes alta (TPP 02

pv) En este caso el balance entre las cargas positivas y negativas de los complejos

formados estaacute ligeramente desplazado al lado negativo lo cual puede ser debido a la

relacioacuten (pp) 12 de HCS-TPP En el resto al ser mayor la cantidad de policatioacuten el

potencial zeta se mantiene positivo Por otra parte en las microesferas sin TPP tambieacuten

se observaron diferencias en los valores del potencial zeta en funcioacuten de la

concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano disminuyendo con la concentracioacuten del

poliacutemero como era de esperar

Tabla III3 Valores del potencial zeta (media plusmn SD) de las microesferas con diferentes concentraciones de

hidrocloruro de quitosano (HCS) (01-1 pv) y de TPP (0-02 pv) y diferentes valores de pH de la

solucioacuten de TPP (pH 4 y pH 9)

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

El quitosano en solucioacuten como hemos visto en el Capiacutetulo de Introduccioacuten estaacute

cargado positivamente debido a la protonacioacuten de los grupos amino El TPP es un

polianioacuten que tiene gran capacidad para reaccionar ioacutenicamente con el quitosano La

reaccioacuten del TPP con el quitosano provoca una disminucioacuten de los grupos amino libres

de eacuteste uacuteltimo y por tanto el potencial zeta debe disminuir Las microesferas con

cargas positivas en su superficie son capaces de adherirse a la mucosa y abrir de forma

transitoria las uniones estrechas entre ceacutelulas epiteliales adyacentes por lo que

favorecen la absorcioacuten del principio activo [119] Es importante que el potencial zeta no

se anule para que las microesferas mantegan sus propiedades mucoadhesivas Por lo

tanto las microesferas que dieron un potencial zeta negativo no favoreceriacutean la

mucoadhesioacuten En el caso especiacutefico de la claritromicina esta mucoadhesioacuten es decisiva

porque promueve la accioacuten local del antibioacutetico en el estoacutemago aumentando el tiempo

de permanencia y promoviendo su absorcioacuten a traveacutes de la mucosa gaacutestrica

114 Interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero

La teacutecnica de difraccioacuten de rayos X proporciona informacioacuten sobre la estructura

quiacutemica y cristalina de un material puesto que cada soacutelido cristalino posee un patroacuten

caracteriacutestico de difraccioacuten que puede emplearse para su identificacioacuten

La cristalinidad del faacutermaco dentro de la matriz polimeacuterica es un paraacutemetro importante

cuando se estudia la cineacutetica de liberacioacuten de las microesferas

En la Figura III2 se muestran los difractogramas de rayos X del TPP (a) la

claritromicina (b) y el hidrocloruro de quitosano (c) Como puede observarse la

claritromicina y el TPP son sustancias cristalinas La claritromicina presenta reflexiones

a valores de 2θ = 874ordm 962ordm 1102ordm 1166ordm 1430ordm 1534ordm 1710ordm 1918ordm 2014ordm

2062ordm 2246ordm 2338ordm y 2542ordm El TPP presenta reflexiones a valores de 2θ = a 1946ordm

1998ordm 2194ordm 2202ordm 2922ordm 319ordm 3262ordm 3606ordm 3674ordm y 3834ordm El difractograma

del hidrocloruro de quitosano sin embargo es caracteriacutestico de un compuesto amorfo

0 10 20 30 40

Figura III2 Difractogramas de rayos X del TPP (a) la claritromicina (b) y del hidrocloruro de quitosano

Los difractogramas de rayos X de la mezcla fiacutesica (d) de hidrocloruro de quitosano

claritromicina y TPP y de las microesferas (e) de hidrocloruro de quitosano (1 pv)

con claritromicina (50 pp) y TPP (01 pv) ambas muestras con las mismas

proporciones de cada componente se muestran en la Figura III3 Se aprecia que la

mezcla fiacutesica presenta mayor cristalinidad que las microesferas Esto es debido a que

como era de esperar en la mezcla fiacutesica no se ha producido ninguna interaccioacuten entre

los componentes

Las microesferas sin embargo presentan una estructura amorfa de lo que se deduce

que la claritromicina se encuentra totalmente embebida en la matriz polimeacuterica ya que

no se observa la estructura cristalina del faacutermaco [25 117] Tampoco se observan

reflexiones del TPP por lo que eacuteste ha interaccionado completamente con el

hidrocloruro de quitosano

0 10 20 30 40

Figura III3 Difractogramas de rayos X de la mezcla fiacutesica de hidrocloruro de quitosano claritromicina y

TPP (d) y de las microesferas de hidrocloruro de quitosano (1 pv) claritromicina (50 pp) y TPP

(01 pv) (e)

El objetivo de la encapsulacioacuten de la claritromicina es su liberacioacuten a nivel gaacutestrico para

ejercer la accioacuten antibioacutetica frente a las bacterias causantes de la uacutelcera gaacutestrica por lo

que la liberacioacuten in vitro se realizoacute en medio gaacutestrico simulado (SGF)

De los resultados obtenidos es importante destacar que las microesferas de hidrocloruro

de quitosano sin entrecruzar no conservaron su forma al ponerse en contacto con medio

aacutecido se hincharon raacutepidamente y se disolvieron Este hecho estaacute de acuerdo con la

bibliografiacutea que describe que para la obtencioacuten de microesferas maacutes estables es

necesario el uso de agentes entrecruzantes Anal et al (2006) [120] describieron la

disolucioacuten de microesferas atomizadas sin TPP en SGF mientras que entrecruzaacutendolas

con TPP obtuvieron sistemas maacutes estables en medio aacutecido

Se estudioacute la liberacioacuten de claritromicina en funcioacuten de tres variables

Concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano

Grado de entrecruzamiento

pH de la solucioacuten de TPP

Efecto de la concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano

En la Figura III4 se comparan los perfiles de liberacioacuten de microesferas obtenidas con

diferentes concentraciones de HCS (01 05 y 1 pv) Como puede observarse existen

diferencias en la velocidad de liberacioacuten en funcioacuten de la concentracioacuten de poliacutemero

Las microesferas obtenidas con 01 y 05 de HCS liberaron el 100 del faacutermaco total

a las 3 horas de liberacioacuten y sus perfiles no presentaron diferencias significativas entre

ellos para ninguno de los tiempos (p gt 005) Las obtenidas con 1 (pv) de HCS

presentaron una liberacioacuten maacutes lenta pasadas 3 horas liberaron un 77 de

claritromicina cantidad significativamente menor (plt005) El faacutermaco total

encapsulado en estas microesferas fue liberado a las 6 horas

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

Figura III4 Influencia de la concentracioacuten de HCS (01 05 y 1 pv) en la liberacioacuten de claritromicina

de las microesferas en SGF (pH 12) a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

Ko et al (2003) [121] observaron que las micropartiacuteculas con concentraciones altas de

quitosano dieron lugar a matrices maacutes densas con menor capacidad de hinchamiento

menor velocidad de difusioacuten y por tanto menor liberacioacuten de faacutermaco Desai y Park

(2005) [117] describieron una liberacioacuten maacutes lenta del faacutermaco al aumentar la

concentracioacuten del poliacutemero

La viscosidad de la solucioacuten de quitosano utilizada para la formacioacuten de las

microesferas es un factor que afecta a la velocidad de liberacioacuten Al aumentar la

concentracioacuten de quitosano y con ello la viscosidad de la solucioacuten el faacutermaco queda

maacutes atrapado en la matriz polimeacuterica y la velocidad de liberacioacuten es menor

Efecto de la concentracioacuten de TPP

En la Figura III5 se muestran los perfiles de liberacioacuten de las microesferas de HCS

01 (pv) sin TPP y entrecruzadas con diferentes concentraciones de TPP a pH 9 en

SGF Las microesferas con TPP 02 (pv) presentaron las diferencias maacutes

significativas (plt005) con respecto a las no entrecruzadas Las microesferas sin TPP

liberaron el 100 del faacutermaco encapsulado a las 3 horas mientras que las microesferas

entrecruzadas con 01 y 02 (pv) TPP pH 9 liberaron a las 3 horas un 79 y un 47

respectivamente cantidades significativamente menores (plt005) de faacutermaco que las

microesferas sin TPP Por tanto se puso de manifiesto el efecto del grado de

entrecruzamiento sobre la liberacioacuten de faacutermaco

Las microesferas preparadas con HCS 01 (pv) y 01 (pv) TPP presentan una

relacioacuten pp de HCS y TPP de 11 Las preparadas con 02 (pv) TPP presentan una

relacioacuten 12 Eacutesta uacuteltima supone que habraacute un grado de entrecruzamiento maacutes alto entre

TPP e hidrocloruro de quitosano reduciendo asiacute la liberacioacuten de claritromicina con

respecto a la relacioacuten 11 El mayor grado de entrecruzamiento se puso de manifiesto

ademaacutes con los resultados del potencial zeta (Tabla III3) en los que las microesferas

con una relacioacuten HCS-TPP 12 presentaron un ligero desplazamiento de las cargas de

los complejos formados por HCS y TPP hacia un potencial zeta negativo

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

Figura III5 Influencia de la concentracioacuten de TPP (0 01 y 02 pv) a pH 9 en la liberacioacuten de

claritromicina de microesferas de HCS 01 (pv) en SGF (pH 12) a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten (n=3

plusmnSD)

A pH 4 como se detalloacute anteriormente fue posible preparar microesferas con mayores

concentraciones de hidrocloruro de quitosano En las Figuras III6 III7 y III8 se

muestran los perfiles de liberacioacuten de microesferas con diferentes concentraciones de

HCS (01 05 y 1 pv) entrecruzadas con TPP 01 y 02 (pv) a pH 4

Como puede observarse en la Figura III6 las microesferas entrecruzadas con TPP

presentaron una liberacioacuten maacutes lenta respecto a las no entrecruzadas siendo las

diferencias maacutes significativas (plt005) para todos los tiempos en el caso de las

microesferas con TPP 02 (pv) Las microesferas con 1 (pv) de HCS sin TPP

liberaron el total de claritromicina encapsulada a las 4 horas Las microesferas

entrecruzadas con 01 (pv) de TPP liberaron el 100 de claritromicina en 8 horas y

en igual tiempo las microesferas con 02 (pv) de TPP liberaron el 85 Estos

resultados confirman que un mayor grado de entrecruzamiento disminuye la tasa de

liberacioacuten de faacutermaco debido al aumento de la densidad de la matriz Ko et al (2002)

estudiaron la liberacioacuten de felodipina a partir de micropartiacuteculas de quitosano y TPP y

observaron que tanto la disminucioacuten del pH del TPP como el aumento de su

concentracioacuten reduciacutea la cantidad de faacutermaco liberada [74]

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

En la Figura III7 se muestran los perfiles de liberacioacuten de microesferas de hidrocloruro

de quitosano 05 (pv) con diferentes concentraciones de TPP (0 01 y 02 pv) a pH

4 Como puede observarse la liberacioacuten de microesferas sin TPP fue significativamente

maacutes raacutepida (plt005) A las 3 horas se liberoacute el 100 de claritromicina de las

microesferas sin entrecruzar mientras que las entrecruzadas con TPP liberaron el 70

aproximadamente Los perfiles de liberacioacuten de microesferas entrecruzadas con

diferentes concentraciones de TPP fueron muy similares Las diferencias soacutelo fueron

significativas a partir de las 6 horas El entrecruzamiento fue lo suficientemente alto

como para disminuir la liberacioacuten pero no como para que hubiese diferencias

significativas entre las diferentes concentraciones de TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

Los perfiles de liberacioacuten de microesferas de HCS 01 (pv) con diferentes

concentraciones de TPP 0 01 y 02 (pv) a pH 4 se muestran en la Figura III8 Como

puede observarse a las 3 horas se liberoacute el 100 de claritromicina de las microesferas

sin entrecruzar mientras que las entrecruzadas liberaron el 60 aproximadamente Al

igual que en el caso de las microesferas con 05 HCS (pv) los perfiles de liberacioacuten

de las microesferas entrecruzadas no mostraron diferencias significativas (pgt005)

Por lo tanto para las concentraciones de 01 y 05 (pv) de hidrocloruro de quitosano

aunque el entrecruzamiento con TPP disminuyoacute significativamente la velocidad de

liberacioacuten la concentracioacuten de 02 (pv) TPP no dio lugar a una reduccioacuten

significativa en la cantidad de faacutermaco liberado con respecto a la de 01 (pv)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

claritromicina de microesferas de HCS 01 (pv) en SGF 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

Efecto del pH de la solucioacuten de TPP

La influencia del pH de la solucioacuten de TPP sobre la liberacioacuten de claritromicina en las

microesferas de hidrocloruro de quitosano se muestra en la Figura III9 Como puede

observarse la liberacioacuten de microesferas con TPP a pH 9 resultoacute significativamente maacutes

raacutepida (plt005) que las entrecruzadas con soluciones de TPP a pH 4 Pasadas 5 horas

las microesferas entrecruzadas con TPP a valores de pH 9 y 4 liberaron el 91 y 69 de

claritromicina respectivamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

Figura III9 Influencia del pH de la solucioacuten de TPP en la liberacioacuten de claritromicina de microesferas

preparadas con 01 (pv) HCS y 01 TPP (pH 4 y 9) en SGF pH 12 a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten

(n=3 plusmnSD)

Estos resultados concuerdan con otros descritos en la biliografiacutea [16 74 75] Como se

explicoacute en el Capiacutetulo de la Introduccioacuten los pKa del TPP son pK1=1 pK2=2

pK3=279 pK4=647 y pK5=924 [76] El TPP disuelto en agua se disocia en iones

tripolifosfoacutericos (P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

) Durante la preparacioacuten de las

microesferas al poner en contacto la solucioacuten de quitosano con la de TPP a pH 9 los

iones OH- y tripolifosfoacutericos compiten por los grupos amino del quitosano En este

caso el complejo quitosano-TPP se forma por ligero entrecruzamiento ioacutenico ya que

habraacute grupos amino desprotonados por los iones hidroxilo Sin embargo al ajustar el

pH del TPP a un pH aacutecido soacutelo existen iones tripolifosfoacutericos que interaccionaraacuten con

los grupos amino protonados del quitosano En este caso el complejo quitosano-TPP se

forma por enlaces inter o intramoleculares por entrecruzamiento ioacutenico dando lugar a

una mayor densidad de entrecruzamiento ioacutenico y mayor estabilidad del sistema Esto

explica los resultados de los estudios de liberacioacuten que se presentan en esta memoria

donde las microesferas preparadas con TPP a pH baacutesico presentaron una liberacioacuten maacutes

raacutepida del principio activo

Mi y cols (1999) [75] realizaron estudios de hinchamiento en micropartiacuteculas de

quitosano y TPP A pH 1 y 2 las preparadas con TPP a su pH en solucioacuten (pH 9) se

hincharon raacutepidamente y se disolvieron en 12h mientras que las preparadas con TPP a

valores de pH aacutecido soacutelo se hincharon ligeramente y no se disolvieron Por tanto los

complejos quitosano-TPP formados exclusivamente por entrecruzamiento ioacutenico

presentaron una estructura maacutes estable debido al alto grado de enlaces entre las cadenas

Shu y Zhu (2000) [16] obtuvieron resultados similares al estudiar la influencia del pH

de la solucioacuten de TPP sobre la liberacioacuten de FITC-dextrano en caacutepsulas de quitosano y

TPP El aumento del pH de la solucioacuten de TPP dio lugar a una liberacioacuten maacutes raacutepida El

aumento del pH disminuye la ionizacioacuten de los grupos amino del quitosano Como

resultado la densidad de entrecruzamiento a pH baacutesico es menor que a pH aacutecido por lo

que la liberacioacuten en el primer caso seraacute maacutes raacutepida [16]

Ajuste de los perfiles de liberacioacuten a modelos matemaacuteticos

Para estudiar el mecanismo de liberacioacuten de la claritromicina los perfiles de liberacioacuten

de las microesferas entrecruzadas con TPP se ajustaron al modelo de cineacutetica de orden

W0-Wt = Kt (III1)

donde W0 es la cantidad de faacutermaco inicial y Wt el faacutermaco liberado a tiempo t

Los coeficientes de correlacioacuten se alejaban demasiado de la unidad Sin embargo las

microesferas no entrecruzadas siacute se ajustaron a una cineacutetica de orden cero La constante

de velocidad de las microesferas sin TPP con sus respectivos coeficientes de correlacioacuten

se muestran en la Tabla III4 Como puede observarse la constante de orden cero es

significativamente menor en el caso de las microesferas con la concentracioacuten maacutes alta

de hidrocloruro de quitosano lo que indica que la velocidad de liberacioacuten es menor en

este caso

Tabla III4 Valores de la constante de orden cero (K) y coeficientes de correlacioacuten de los perfiles de

liberacioacuten de la claritromicina de microesferas de HCS sin TPP en SGF (pH 12)

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Los perfiles de las liberaciones se ajustaron a la ecuacioacuten simplificada de Higuchi [93]

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

Este modelo estaacute inicialmente disentildeado para describir la liberacioacuten de un soluto desde

una superficie plana siendo el ajuste para otras formas farmaceacuteuticas aproximado En

este caso los buenos ajustes obtenidos (R2gt092) indican que la liberacioacuten de

claritromicina depende de la difusioacuten a traveacutes de la matriz polimeacuterica entrecruzada En

la Figura III10 se muestra el ajuste a la ecuacioacuten de Higuchi para la formulacioacuten C3

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Figura III10 Ajuste a la ecuacioacuten de Higuchi de la liberacioacuten de claritromicina de microesferas de HCS

(1 pv) entrecruzadas con TPP 01 (pv) pH 4

Con el fin de determinar el tipo de difusioacuten los resultados obtenidos se ajustaron a la

ecuacioacuten de Korsmeyer-Peppas [95]

MtMinfin= Ktn (III3)

tiempo t) K es la constante del sistema y n es el exponente difusional

En el caso particular de las microesferas cuando n = 043 se trata de una difusioacuten

Fickiana cuando n = 085 se trata de una liberacioacuten controlada por la relajacioacuten de las

cadenas y cuando se obtienen valores intermedios se trata de una difusioacuten anoacutemala o no

Fickiana que se debe a procesos de difusioacuten-relajacioacuten de las cadenas

Las constantes de Higuchi sus coeficientes de correlacioacuten los valores obtenidos tras el

ajuste de los perfiles de liberacioacuten a la ecuacioacuten de Korsmeyer-Peppas para el

exponente difusional y los coeficientes de correlacioacuten se muestran en la Tabla III5

Tabla III5 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos del ajuste de los perfiles de liberacioacuten de la claritromicina de

microesferas de HCS en SGF (pH 12) a los modelos de Higuchi y Korsmeyer-Peppas

Higuchi Korsmeyer-Peppas

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

Como puede observarse en general todas las formulaciones obtenidas tienen una

difusioacuten de tipo anoacutemala o no-Fickiana que se debe a procesos de difusioacuten-relajacioacuten de

las cadenas En el caso de la formulacioacuten C4 se trata de una difusioacuten Fickiana y en el de

C10 se trata de una liberacioacuten controlada por la relajacioacuten de las cadenas

Los perfiles de liberacioacuten tambieacuten se ajustaron al modelo de Baker-Lonsdale [98]

obteniendo coeficientes de correlacioacuten altos (Tabla III6) Estos resultados corroboran

que la liberacioacuten sigue un proceso de difusioacuten Este modelo describe la liberacioacuten de

solutos desde microcaacutepsulas y microesferas y viene dado por la siguiente ecuacioacuten

3 (III4)

donde Mt es la cantidad de faacutermaco liberado a tiempo t Minfin es la cantidad de faacutermaco

liberado a tiempo infinito y k la constante de liberacioacuten y pendiente de la recta

Tabla III5 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos del ajuste de los perfiles de liberacioacuten de claritromicina de las

microesferas de HCS en SGF (pH 12) al modelo de Baker-Lonsdale

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

entrecruzadas con genipina

La genipina es un producto de origen natural que actualmente estaacute ganando intereacutes

como agente entrecruzante en liberacioacuten controlada de faacutermacos Reacciona con

materiales que contienen grupos amino como el quitosano dando lugar a estructuras

entrecruzadas quiacutemicamente [72]

Se prepararon microesferas de hidrocloruro de quitosano al 05 (pv) con

claritromicina entrecruzadas con genipina con el objetivo de obtener sistemas de

liberacioacuten controlada y determinar el efecto de este agente entrecruzante sobre la

liberacioacuten del faacutermaco

En la Tabla III7 se muestran las condiciones de preparacioacuten de las microesferas

obtenidas

Tabla III7 Condiciones de preparacioacuten de las microesferas de hidrocloruro de quitosano (HCS) con

claritromicina (CLA) y genipina (Gnp)

C13 05 50 05

C14 05 50 1

Se obtuvieron resultados altos tanto para el rendimiento de atomizacioacuten (gt55) como

para la eficiencia de encapsulacioacuten (gt85)

En la Figura III11 se observa la morfologiacutea de las microesferas de hidrocloruro de

quitosano entrecruzadas con genipina 1mM Al igual que en el caso de las microesferas

entrecruzadas con TPP las microesferas presentaron forma esfeacuterica con mellas o

hundimientos producidos como consecuencia del proceso de secado durante la

atomizacioacuten

Figura III11 Microfotografiacuteas de microesferas de HCS (05 pv) con claritromicina entrecruzadas con

genipina 1mM (A) y detalle de las microesferas (B)

En la Tabla III8 se muestran los valores de potencial zeta obtenidos Como puede

observarse las microesferas presentaron un potencial zeta positivo lo cual se debe a la

presencia de hidrocloruro de quitosano en la superficie de la micropartiacutecula Se

observaron diferencias en el valor del potencial zeta dependiendo de la concentracioacuten de

genipina aunque eacutestas no fueron significativas

Tabla III8 Valores del potencial zeta de las microesferas de HCS 05 (pv) con diferentes

concentraciones de genipina (Gnp)

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

Con objeto de estudiar la interaccioacuten del faacutermaco con el poliacutemero y el agente

entrecruzante en las microesferas se realizaron estudios de difraccioacuten de rayos X En la

Figura III12 se observa que la genipina (a) y la claritomicina (b) son sustancias

cristalinas mientras que el hidrocloruro de quitosano (c) y las microesferas presentaron

una estructura amorfa (d) La genipina presentoacute reflexiones de cristalinidad

caracteriacutesticas a 2θ = 1006ordm 1198ordm 163ordm 1726ordm 1846ordm 1934ordm 2234ordm 241ordm 2598ordm

2622ordm y 2658ordm Se deduce por tanto que la claritromicina se encuentra totalmente

embebida en la matriz de poliacutemero y genipina ya que no se observa la estructura

cristalina del faacutermaco[25 117]

0 10 20 30 40

Figura III12 Difractogramas de rayos X de genipina (a) claritromicina (b) HCS (c) y microesferas de

hidrocloruro de quitosano (05 pv) con claritromicina (50 pp) y genipina (1mM) (d)

Los perfiles de liberacioacuten de las microesferas de hidrocloruro de quitosano

entrecruzadas con genipina se muestran en la Figura III13 Como puede observarse las

microesferas entrecruzadas con genipina 1mM (004 pv) liberaron el faacutermaco de

forma significativamente maacutes lenta que las no entrecruzadas (plt005) Pasadas 3 horas

las microesferas no entrecruzadas liberaron el total del faacutermaco encapsulado mientras

que pasado ese mismo tiempo las microesferas con genipina liberaron un 60

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

Figura III13 Perfiles de liberacioacuten de claritromicina de microesferas de HCS 05 (pv) con genipina

(Gnp) 0 y 004 (pv) en SGF (pH 12) a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

Por otra parte las microesferas entrecruzadas con genipina 05mM (002 pv) no

presentaron diferencias significativas con las entrecruzadas con genipina 1mM (004

pv) (pgt005) La adicioacuten de la genipina dio lugar a una reduccioacuten de la liberacioacuten pero

posiblemente sea necesario aumentar la concentracioacuten de este agente entrecruzante para

observar diferencias significativas en funcioacuten su concentracioacuten

El perfil de liberacioacuten de las microesferas con genipina 004 (pv) se comparoacute con el

de las microesferas con TPP 01 (pv) En la Figura III14 se muestran los resultados

obtenidos con ambos agentes entrecruzantes TPP y Gnp Aunque no existen diferencias

significativas (pgt005) la liberacioacuten de las microesferas con genipina fue maacutes lenta que

la de las microesferas con TPP siendo la concentracioacuten de genipina inferior (004

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

Figura III14 Influencia del tipo de agente entrecruzante en la liberacioacuten de claritromicina de

microesferas de HCS 05 (pv) con TPP y Gnp en SGF (pH 12) a 37ordmC y 100 rpm de agitacioacuten (n=3

plusmnSD)

Los perfiles de liberacioacuten de las microesferas entrecruzadas con genipina se ajustaron al

modelo de Higuchi obtenieacutendose coeficientes de correlacioacuten altos (R2gt095) En la

Figura III15 se muestra el ajuste del perfil de liberacioacuten de las microesferas

entrecruzadas con Gnp 1mM a la ecuacioacuten de Higuchi

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

Figura III15 Ajuste de la liberacioacuten de claritromicina de microesferas de HCS (05 pv) entrecruzadas

con genipina 1mM a la ecuacioacuten de Higuchi

Los datos obtenidos para microesferas entrecruzadas con genipina 05 y 1mM se

ajustaron a la ecuacioacuten de Korsmeyer-Peppas con exponentes difusionales de 0834 y

07936 respectivamente por lo que la liberacioacuten de las microesferas se produjo por un

proceso de difusioacuten anoacutemala o no Fickiana aunque los valores son muy proacuteximos a

085 Como se explicoacute en el Apartado 10 de la Introduccioacuten para microesferas cuando

n=085 el proceso de difusioacuten se produce por la relajacioacuten de las cadenas del poliacutemero

13 Conclusiones parciales del capiacutetulo

De los estudios realizados para la encapsulacioacuten de claritromicina en microesferas

obtenidas por atomizacioacuten se puede concluir

El meacutetodo de atomizacioacuten resultoacute adecuado para la encapsulacioacuten de

claritromicina en microesferas de hidrocloruro de quitosano entrecruzadas con

tripolifosfato de sodio o genipina con alta eficiencia de encapsulacioacuten Esto

hace posible el empleo de esta teacutecnica en la industria farmaceacuteutica

El valor del potencial zeta demostroacute la capacidad mucoadhesiva de las

microesferas obtenidas excepto para el caso de las microesferas con

hidrocloruro de quitosano 01 (pv) y TPP 02 (pv) a pH 9 en las que el alto

grado de entrecruzamiento dio lugar a un valor de potencial zeta negativo

La influencia de la concentracioacuten del poliacutemero sobre la liberacioacuten soacutelo fue

significativa cuando no se utilizoacute un agente entrecruzante Cuando se

entrecruzaron las microesferas con tripolifosfato soacutedico una concentracioacuten maacutes

alta de quitosano no produjo necesariamente resultados maacutes satisfactorios por lo

que se recomienda trabajar con soluciones de hidrocloruro de quitosano de

menor concentracioacuten (01 y 05 pv)

La velocidad de liberacioacuten de claritromicina disminuyoacute para las formulaciones

que incorporaron tripolifosfato soacutedico o genipina como agentes entrecruzantes

Se alcanzoacute un grado de entrecruzamiento oacuteptimo en ambos casos

Los perfiles de liberacioacuten del principio activo se ajustaron a la ecuacioacuten

simplificada de Higuchi con un mecanismo de difusioacuten a traveacutes de la matriz

polimeacuterica

2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de tramadol

obtenidas por atomizacioacuten

El hidrocloruro de tramadol es un principio activo altamente hidrofiacutelico Esta

caracteriacutestica influye en la encapsulacioacuten del faacutermaco en una matriz polimeacuterica

hidrosoluble como el quitosano y en su posterior liberacioacuten Al poner en contacto el

sistema con el medio de liberacioacuten se produce una difusioacuten raacutepida del faacutermaco hacia el

exterior provocando un ―efecto estallido al inicio de la liberacioacuten

Existen diferentes agentes entrecruzantes que han sido utlizados para modular la

liberacioacuten de faacutermacos a partir de sistemas a base de poliacutemeros biodegradables como el

quitosano como son el glutaraldehido el tripolifosfato el etilenglicol o el diisocianato

En estudios anteriores se ha visto que la liberacioacuten de hidrocloruro de tramadol de

microesferas de quitosano y TPP presenta igualmente un efecto estallido al inicio de la

liberacioacuten [5] Ademaacutes los agentes entrecruzantes sinteacuteticos presentan cierta toxicidad

Por ello en este caso se ha abordado el uso de un agente entrecruzante de origen

natural la genipina puesto que presenta baja citotoxicidad y da lugar a productos

entrecruzados estables y biocompatibles [72]

El objetivo de este capiacutetulo ha sido la obtencioacuten de microesferas de hidrocloruro de

quitosano entrecruzadas con genipina para la encapsulacioacuten de hidrocloruro de

tramadol Las microesferas obtenidas se caracterizaron en teacuterminos de morfologiacutea

potencial zeta e interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero Asiacute mismo se estudioacute la influencia de

dos variables sobre la liberacioacuten in vitro del faacutermaco encapsulado la concentracioacuten de

genipina y el tiempo de la reaccioacuten de entrecruzamiento

La reaccioacuten de la genipina con el hidrocloruro de quitosano es una reaccioacuten que produce

un aumento de la viscosidad de la solucioacuten resultante en funcioacuten del tiempo dando

lugar a un hidrogel elaacutestico Se estudioacute el efecto de tres variables sobre la reaccioacuten de

entrecruzamiento el tiempo de reaccioacuten la concentracioacuten de genipina y la temperatura

de reaccioacuten El seguimiento de la reaccioacuten se llevoacute a cabo por espectrofotometriacutea UV-

visible

En la Figura III16 se muestra el espectro UV-vis de la genipina pura en el medio de

disolucioacuten (agua destilada) A partir de eacuteste se determinoacute que la maacutexima absorcioacuten de la

genipina se produce a una longitud de onda de 240nm

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

Longitud de onda (nm)

Figura III16 Espectro UV-Vis (λ= 200-700nm) de una solucioacuten de Gnp 2mM en el medio de disolucioacuten

a 25ordmC

En las Figuras III17 III18 y III19 se muestran los espectros UV-vis de las soluciones

de hidrocloruro de quitosano y genipina respecto a las tres variables experimentales

tiempo de reaccioacuten concentracioacuten de genipina y temperatura de entrecruzamiento

respectivamente

Con el incremento del tiempo de reaccioacuten (Figura III17) entre el hidrocloruro de

quitosano y la genipina se produjo una disminucioacuten en el pico de 240nm maacuteximo de

absorcioacuten caracteriacutestico de la genipina Ademaacutes aparecioacute un nuevo pico de absorcioacuten a

290nm que aumentoacute con el tiempo de entrecruzamiento La disminucioacuten de la

absorbancia a 240nm se debe a la conversioacuten del grupo ester de la genipina en el enlace

amida [122] Por otra parte el aumento de la absorcioacuten a 290nm se atribuye a la

formacioacuten de un compuesto heterociacuteclico de la genipina y el hidrocloruro de quitosano

[123] Como se explicoacute en el Capiacutetulo de Introduccioacuten durante el entrecruzamiento

entre la genipina y el quitosano se producen dos reacciones separadas El ataque

nucleofiacutelico por parte de los grupos amino del quitosano sobre el carbono 3 de la

genipina da lugar a la formacioacuten de un compuesto heterociacuteclico de la genipina unida al

residuo de glucosamina en el quitosano A la formacioacuten de dicho compuesto se le

atribuye el pico de absorcioacuten a 290nm Por otra parte a la sustitucioacuten nucleofiacutelica del

grupo ester de la genipina formaacutendose un enlace amida con el quitosano se le atribuye

la disminucioacuten del maacuteximo de absorcioacuten a 240nm y se trata de una reaccioacuten maacutes lenta

Esto queda demostrado en el espectro UV-vis obtenido donde el maacuteximo de absorcioacuten

a 240nm disminuye lentamente con el tiempo mientras que el maacuteximo a 290nm

aumenta significativamente con el tiempo de reaccioacuten

210 230 250 270 290 310 330

Figura III17 Evolucioacuten del espectro UV-vis (λ= 210-330nm) de una solucioacuten de HCS 05 (pv) y Gnp

5mM a 50ordmC en funcioacuten del tiempo de reaccioacuten (05h-7h)

La intensidad de la absorcioacuten a 290nm tambieacuten aumentoacute con la concentracioacuten de

genipina (Figura III18) y la temperatura de reaccioacuten (Figura III19) La presencia de

esta banda de absorcioacuten y su incremento es por tanto un indicador del grado de

entrecruzamiento entre el hidrocloruro de quitosano y la genipina

Las soluciones entrecruzadas presentaron ademaacutes una coloracioacuten azul cuya intensidad

aumentoacute con el tiempo de reaccioacuten y la concentracioacuten de genipina La coloracioacuten azul

indica por tanto la presencia de entrecruzamiento y se atribuye a la polimerizacioacuten de la

genipina en presencia de oxiacutegeno asiacute como a la reaccioacuten con el quitosano [77] El hecho

de que la coloracioacuten azul apareciese primero en la superficie de la muestra en contacto

con el aire y despueacutes se distribuyera por el resto de la solucioacuten o gel apoya esta

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

Figura III18 Espectros UV-vis (λ= 210-330nm) de soluciones de HCS (05 pv) a diferentes

concentraciones de Gnp (05-5mM) entrecruzados a 50ordmC durante 5 horas

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

Figura III19 Espectros UV-vis (λ= 210-330nm) de soluciones de HCS 05 (pv) y Gnp 2mM

entrecruzados a diferentes temperaturas de entrecruzamiento (25ordmC 37ordmC y 50ordmC) durante 5h

A partir de los resultados obtenidos se seleccionaron los paraacutemetros maacutes adecuados

para la preparacioacuten de microesferas entrecruzadas con genipina por el meacutetodo de

atomizacioacuten A tiempos cortos de reaccioacuten no se observaron diferencias significativas

en el espectro de absorcioacuten por lo que se seleccionoacute como tiempo de reaccioacuten las 5

horas En cuanto a la concentracioacuten de genipina las concentraciones de 2 y 5mM

despueacutes de 5 horas de reaccioacuten produjeron un cambio significativo sobre la intensidad

de los maacuteximos de absorcioacuten descritos La temperatura seleccionada fue de 50ordmC puesto

que aceleroacute de forma significativa la reaccioacuten de entrecruzamiento y es una temperatura

a la que son estables los compuestos utilizados

22 Determinacioacuten del grado de entrecruzamiento

El grado de entrecruzamiento de las soluciones de hidrocloruro de quitosano y genipina

se calculoacute determinando la cantidad de grupos amino libres del quitosano despueacutes de la

reaccioacuten La absorbancia a una longitud de onda de 570nm en funcioacuten de la

concentracioacuten de grupos amino de la glucosamina se representa en la Figura III20

En la Tabla III9 se muestra el grado de entrecruzamiento de las soluciones de

hidrocloruro de quitosano con diferentes concentraciones de genipina (2 5 y 20mM) El

grado de entrecruzamiento (G) se calculoacute tomando como referencia la cantidad de

grupos amino libres en las microesferas sin genipina utilizando la siguiente foacutermula

G = [(NH2 inicial -NH2 final)NH2 inicial] x 100 (III5)

Como puede observarse el grado de entrecruzamiento disminuye conforme aumenta la

concentracioacuten de genipina

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Figura III20 Curva de calibrado que relaciona la absorbancia (λ=570nm) de la glucosamina con la

concentracioacuten de grupos amino (micromol NH2microl solucioacuten)

Tabla III9 Grado de entrecruzamiento de las soluciones de HCS 05 (pv) entrecruzadas durante 5h a

50ordmC con diferentes concentraciones de genipina (2 5 y 20mM)

Genipina

Grado entrecruzamiento

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Otros autores obtuvieron un grado de entrecruzamiento maacuteximo de 33-34 para

microesferas sumergidas en una solucioacuten de genipina 05mM durante 8 y 16 horas o en

soluciones 1 y 2mM durante 4 horas[86] Las microesferas entrecruzadas con genipina

05mM durante 4 horas presentaron un grado de entrecruzamiento menor de alrededor

del 24 Con mayores concentraciones de genipina no obtuvieron grados de

entrecruzamiento maacutes altos

En este trabajo el maacuteximo grado de entrecruzamiento fue un 29 y se obtuvo al

entrecruzar la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano 05 (pv) con genipina 20mM

durante 5 horas Estos resultados no son comparables a los de otros autores puesto que

las condiciones experimentales son distintas se han empleado distintos quitosanos y en

el trabajo que se presenta la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano se entrecruzoacute antes

de la formacioacuten de las microesferas Ademaacutes se emplearon distintas condiciones de

tiempo de reaccioacuten y concentracioacuten de genipina

La Tabla III10 muestra las caracteriacutesticas de las microesferas obtenidas por

atomizacioacuten con las diferentes concentraciones de genipina utilizadas y dos tiempos de

entrecruzamiento distintos Hay que destacar que ademaacutes de las variables

experimentales seleccionadas a partir de los estudios de espectrofotometriacutea UV-VIS se

utilizoacute un tiempo de reaccioacuten de entrecruzamiento maacutes alto (15h) para las microesferas

con genipina 2mM y una concentracioacuten maacutes alta de genipina (20mM) Se eligioacute este

tiempo y esta concentracioacuten mucho maacutes alta con el objetivo de ver si estas condiciones

afectariacutean significativamente a la liberacioacuten de tramadol

Tabla III10 Condiciones de preparacioacuten de las microesferas de hidrocloruro de quitosano (HCS)

cargadas con tramadol (TRA) y entrecruzadas con genipina (Gnp)

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

Tiempo de entrecruzamiento

En la Tabla III11 se muestra el rendimiento de atomizacioacuten y la eficiencia de

encapsulacioacuten de los lotes preparados

El rendimiento del proceso de atomizacioacuten fue relativamente alto entre 60 y 70

excepto en el caso de las microesferas del lote T6 cuya solucioacuten presentoacute una alta

viscosidad y parte de la muestra se perdioacute en el cicloacuten

La eficiencia de encapsulacioacuten de las microesferas en todos los casos resultoacute alta

cercana a un 100

Tabla III11 Rendimiento de atomizacioacuten (RA) y eficiencia de encapsulacioacuten (EE) (media plusmn SD) de las

microesferas obtenidas

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

La morfologiacutea de las microesferas de hidrocloruro de quitosano cargadas con

hidrocloruro de tramadol y entrecruzadas con genipina 2 y 20mM se puede observar en

la Figura III21 Las microesferas presentaron forma esfeacuterica mostrando hundimientos

debidos al proceso de atomizacioacuten Al entrecruzar aumentando las concentraciones de

genipina se obtuvieron microesferas menos colapsadas Por lo tanto el

entrecruzamiento con una mayor concentracioacuten de genipina aumentoacute la rigidez de las

microesferas de hidrocloruro de quitosano

Figura III21 Microfotografiacuteas de SEM de microesferas de HCS 05 (pv) cargadas con hidrocloruro de

tramadol y entrecruzadas con Gnp 2mM (A) y 20mM (B) durante 5 horas a 50ordmC

En la Tabla III12 se resumen los resultados obtenidos en la determinacioacuten del potencial

zeta de las microesferas Como puede observarse los valores de potencial zeta se

mantuvieron positivos en todos los casos Esto indica la presencia de grupos amino del

hidrocloruro de quitosano en la superficie de las microesferas lo que es beneficioso

para mantener las propiedades mucoadhesivas y promotoras de absorcioacuten del

quitosano[124]

El valor del potencial zeta de las microesferas disminuyoacute significativamente (plt005) al

antildeadir la genipina lo cual es indicativo de la disminucioacuten de grupos amino libres y por

tanto de entrecruzamiento Las microesferas obtenidas con una concentracioacuten 20mM de

genipina mostraron un potencial zeta significativamente maacutes bajo que las microesferas

con concentraciones maacutes bajas El efecto del tiempo de entrecruzamiento sobre la carga

externa se estudioacute para las microesferas con genipina 2mM No se observaron

diferencias significativas entre las microesferas entrecruzadas durante 5 y 15 horas

Tabla III12 Valores del potencial zeta (media plusmn SD) de las microesferas de HCS (05 pv) e

hidrocloruro de tramadol (30 pp) en funcioacuten de la concentracioacuten de genipina (2-20mM) y del tiempo

de entrecruzamiento (5 y 15h)

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

No contiene hidrocloruro de tramadol

Se realizaron estudios de difraccioacuten de rayos X para determinar el grado de cristalinidad

del faacutermaco en las microesferas Como puede observarse en los difractogramas de la

Figura III22 la genipina (a) y el hidrocloruro de tramadol (b) son sustancias cristalinas

mientras que el hidrocloruro de quitosano (c) tiene una estructura amorfa El tramadol

presenta reflexiones de cristalinidad a valores de 2θ = 1042ordm 1302ordm 1538ordm 167ordm

185ordm 2058ordm 2158ordm 2446ordm 2618ordm y 3094ordm Por otra parte la genipina presenta

reflexiones de cristalinidad a valores de 2θ = 1006ordm 1198ordm 163ordm 1726ordm 1846ordm

1934ordm 2234ordm 241ordm 2598ordm 2622ordm y 2658ordm

En la Figura III23 se muestra el difractograma de las microesferas (d) de hidrocloruro

de quitosano (05 pv) tramadol (30 pp) y genipina (2mM) y el de la mezcla fiacutesica

(e) con los tres componentes en las mismas proporciones que en las microesferas El

difractograma de las microesferas de hidrocloruro de quitosano y genipina con tramadol

presenta baja cristalinidad lo cual indica la incorporacioacuten del hidrocloruro de tramadol

en la matriz polimeacuterica en forma de dispersioacuten molecular [25 117] El faacutermaco estaacute

embebido completamente en la matriz de hidrocloruro de quitosano entrecruzada con

genipina y la reaccioacuten entre estos dos uacuteltimos fue completa lo cual favorece la

liberacioacuten retardada Sin embargo la mezcla fiacutesica presenta reflexiones de cristalinidad

aportada por el tramadol y la genipina mostrando que no existe interaccioacuten entre los

componentes mezclados

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura III22 Difractogramas de rayos X de la genipina (a) el hidrocloruro de tramadol (b) y del

hidrocloruro de quitosano (b)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura III23 Difractogramas de rayos X de las microesferas (d) de hidrocloruro de quitosano (05 pv)

con genipina (2mM) y tramadol (30 pp) y de la mezcla fiacutesica (e) de hidrocloruro de quitosano

genipina y tramadol

Los estudios de liberacioacuten se realizaron en medio gaacutestrico simulado y medio intestinal

simulado puesto que el hidrocloruro de tramadol se administra por viacutea oral y su

absorcioacuten se produce en el intestino Se estudioacute el efecto de dos variables sobre la

liberacioacuten

La concentracioacuten de genipina

El tiempo de entrecruzamiento

Efecto de la concentracioacuten de genipina sobre la liberacioacuten in vitro

En las Figuras III24 y III25 se muestran los perfiles de liberacioacuten en SGF y SIF de

hidrocloruro de tramadol de las microesferas con diferentes concentraciones de genipina

(0-20mM)

En SGF (Figura III24) la disminucioacuten de faacutermaco liberado soacutelo fue significativa

(plt005) durante todo el tiempo de la liberacioacuten en el caso de las microesferas con

genipina 5 y 20mM Durante los primeros 30 minutos del experimento se liberoacute un

65 del tramadol encapsulado de las microesferas sin genipina Las microesferas

preparadas con genipina 2 5 y 20mM redujeron significativamente la cantidad de

faacutermaco liberado en esos primeros 30 minutos (plt005) con respecto a las no

entrecruzadas liberaacutendose un 48 39 y 41 de faacutermaco respectivamente Las

microesferas no entrecruzadas liberaron todo el faacutermaco encapsulado a las 2 horas de

liberacioacuten las entrecruzadas con genipina 2mM a las 3 horas y con genipina 5 y 20mM

a las 4 horas Por lo tanto estas microesferas retardaron la liberacioacuten 2 horas con

respecto a las primeras No se observaron diferencias significativas (plt005) entre los

perfiles de liberacioacuten de las microesferas entrecruzadas con genipina 5 y 20mM

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

Figura III24 Influencia del grado de entrecruzamiento en la liberacioacuten de tramadol de microesferas de

HCS 05 (pv) con genipina (Gnp) a diferentes concentraciones (0-20mM) en SGF (pH 12) a 37ordmC y

100rpm de agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

En SIF (Figura III25) las microesferas sin genipina liberaron un 55 del faacutermaco

encapsulado en la primera media hora mientras que la liberacioacuten a este mismo tiempo

de las microesferas con genipina fue significativamente menor (plt005) La cantidad de

tramadol liberado soacutelo fue significativamente menor durante todo el experimento en el

caso de las microesferas entrecruzadas con la concentracioacuten maacutes alta de genipina

20mM El total del faacutermaco encapsulado fue liberado por las microesferas sin genipina

y con concentraciones 2 y 5mM de genipina pasadas 3 horas mientras que las

entrecruzadas con una concentracioacuten 20mM de genipina liberaron el faacutermaco despueacutes

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

HCS 05 (pv) con genipina (Gnp) a diferentes concentraciones (0-20mM) en SIF (pH 74) a 37ordmC y

100 rpm de agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

Los resultados obtenidos muestran que la genipina retarda la liberacioacuten de hidrocloruro

de tramadol Los resultados descritos por Pantildeos et al (2007) [5]muestran un efecto

estallido en los primeros momentos de la liberacioacuten de este faacutermaco en microesferas de

quitosano entrecruzadas con TPP Con TPP 05 (pv) se liberoacute cerca de un 80 de

tramadol en los primeros 20 minutos en SIF

Se compararon los perfiles de liberacioacuten de las microesferas en SGF y SIF Como puede

observarse en la Figura III26 las microesferas de hidrocloruro de quitosano sin

genipina presentaron una liberacioacuten maacutes lenta de tramadol en SIF que en SGF siendo

las diferencias significativas entre 05 y 2 horas (plt005) Esto se debe a la disolucioacuten

del hidrocloruro de quitosano a pH gaacutestrico que provoca una raacutepida liberacioacuten del

principio activo encapsulado

De las concentraciones de genipina estudiadas las maacutes altas 5 y 20mM le confirieron

mayor resistencia a las microesferas a la degradacioacuten en medio aacutecido Como se observa

en la Figura III27 al entrecruzar las microesferas con genipina 20mM disminuyoacute la

liberacioacuten de tramadol en SGF y los perfiles de liberacioacuten en ambos medios (SGF y

SIF) fueron similares Esto ocurre porque el entrecruzamiento con concentraciones maacutes

altas de genipina disminuye la cantidad de grupos amino libres y por tanto la

liberacioacuten a pH aacutecido

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

Figura III26 Influencia del pH del medio de liberacioacuten SGF y SIF (pH 12 y 74 respectivamente) en la

liberacioacuten de tramadol de microesferas de HCS 05 (pv) no entrecruzadas a 37ordmC y 100 rpm de

agitacioacuten (n=3 plusmnSD)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

liberacioacuten de tramadol de microesferas de HCS 05 (pv) entrecruzadas con genipina 20mM a 37ordmC y

Efecto del tiempo de entrecruzamiento

El estudio del efecto del tiempo de entrecruzamiento (0-15h) se llevoacute a cabo a una

concentracioacuten 2mM de genipina Las microesferas sin genipina se consideraron el

tiempo cero (0h) La liberacioacuten de las microesferas se realizoacute en SGF y SIF Los

resultados obtenidos se muestran en las Figuras III28 y III29 respectivamente

Como puede observarse en la Figura III28 las microesferas sin genipina liberaron maacutes

del 80 del tramadol en 1 hora mientras que las entrecruzadas con una concentracioacuten

2mM de genipina durante 5 y 15 horas liberaron el 72 y el 60 respectivamente

cantidades significativamente inferiores (plt005) El 100 del tramadol encapsulado

fue liberado a las 2 horas de las microesferas sin entrecruzar y de las entrecruzadas

durante un periacuteodo de 5 horas mientras que las que fueron sometidas a un

entrecruzamiento durante un periacuteodo de 15 horas lo liberaron pasadas 3 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Figure III28 Influencia del tiempo de entrecruzamiento (0-15h) en la liberacioacuten in vitro de tramadol en

SGF (pH 12) de microesferas de HCS 05 (pv) entrecruzadas con genipina 2mM (n=3 plusmnSD)

En medio SIF la liberacioacuten de tramadol de las microesferas entrecruzadas durante 5 y

15h horas fue maacutes baja que la de microesferas no entrecruzadas Por otra parte no se

observaron diferencias significativas en todo el rango de tiempo estudiado para tiempos

de entrecruzamiento de 5 y 15 horas

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

Figura III29 Influencia del tiempo de entrecruzamiento en la liberacioacuten in vitro de tramadol en SIF

(pH 74) de microesferas entrecruzadas con genipina 2mM durante un periacuteodo de 5 y 15h (n=3 plusmnSD)

Existen pocos estudios sobre la preparacioacuten de microesferas de quitosano entrecruzadas

con genipina Yuan et al (2007) obtuvieron microesferas de quitosano y genipina para

la encapsulacioacuten de albuacutemina bovina Observaron que el grado de entrecruzamiento de

las microesferas y su tasa de hinchamiento aumentoacute con el tiempo de entrecruzamiento

y la concentracioacuten de genipina Ademaacutes la liberacioacuten de albuacutemina se produjo de forma

maacutes lenta que en el caso de microesferas sin genipina

Mi et al (2001) prepararon microesferas para la encapsulacioacuten de indometacina por un

meacutetodo de dispersioacuten agua en aceite utilizando genipina como agente entrecruzante En

este caso el tiempo de entrecruzamiento tambieacuten influyoacute en la liberacioacuten

Los perfiles de liberacioacuten obtenidos en este apartado se ajustaron a varios modelos

matemaacuteticos descritos para estos sistemas La liberacioacuten de hidrocloruro de tramadol

resultoacute ser bifaacutesica diferenciaacutendose dos etapas una primera en la que la liberacioacuten es

maacutes raacutepida y una segunda en la que ya se ha liberado casi todo el faacutermaco y aumenta la

liberacioacuten soacutelo ligeramente En general el punto de inflexioacuten entre las dos etapas se

encuentra a 1 hora de liberacioacuten Por tanto los perfiles de liberacioacuten no se ajustaron a la

cineacutetica de orden cero los coeficientes de correlacioacuten obtenidos se alejaban demasiado

de la unidad

Los perfiles de liberacioacuten se ajustaron bien al modelo de Higuchi [93] cuya ecuacioacuten se

muestra a continuacioacuten

Q = KH t12

(III2)

Higuchi que describe la liberacioacuten por un proceso de difusioacuten basado en la ley de Fick

En la Tabla III13 se muestran los valores de las constantes de Higuchi obtenidas con

sus respectivos coeficientes de correlacioacuten en ambos medios SGF y SIF Como puede

observarse

Tabla III13 Paraacutemetros cineacuteticos obtenidos del ajuste de los perfiles de liberacioacuten de hidrocloruro de

tramadol de microesferas de HCS en SGF y SIF al modelo de Higuchi

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

Los resultados indican por tanto que la liberacioacuten del principio activo de las

microesferas sigue un mecanismo de difusioacuten En la Figura III30 se muestra el ajuste

de las microesferas con HCS 05 (pv) entrecruzadas con genipina 20mM (T6) a la

ecuacioacuten de Higuchi

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

Figura III30 Ajuste a la ecuacioacuten de Higuchi de la liberacioacuten de hidrocloruro de tramadol en SIF (pH

74) de microesferas de HCS 05 (pv) entrecruzadas con Gnp 20mM

Una vez conocido el mecanismo de liberacioacuten se determinoacute el tipo de difusioacuten tanto en

medio SGF como SIF ajustando los datos a la ecuacioacuten de Korsmeyer-Peppas [95]

se liberariacutea a tiempo infinito K es la constante del sistema y n es el exponente

difusional

Los valores obtenidos para el exponente difusional (n) se muestran en la Tabla III14

Los resultados obtenidos indican que las formulaciones presentaron diferentes

comportamientos dependiendo del pH del medio y de la presencia o no de genipina En

SGF las microesferas sin entrecruzar y entrecruzadas con genipina 2mM presentaron un

mecanismo de difusioacuten Fickiana mientras que las microesferas entrecruzadas con

genipina de mayor concentracioacuten (5 y 20mM) mostraron una liberacioacuten por difusioacuten

anoacutemala En SIF soacutelo las microesferas no entrecruzadas presentaron una difusioacuten

Fickiana En el caso de las formulaciones entrecruzadas la difusioacuten resultoacute anoacutemala

Stulzer et al (2009) observaron diferencias en el mecanismo de liberacioacuten de aciclovir

desde microesferas de quitosano con TPP En condiciones aacutecidas (pH 12) la liberacioacuten

correpondiacutea a una cineacutetica de difusioacuten no-Fickiana mientras que a pH 68 mostraron

una liberacioacuten Fickiana [115]

tramadol de microesferas de HCS en SGF y SIF al modelo de Korsmeyer-Peppas

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

El ajuste de Baker-Lonsdale [98] tambieacuten presentoacute coeficientes de correlacioacuten altos

(Tabla III15) lo cual corrobora que la liberacioacuten sigue un proceso de difusioacuten

3 (III4)

tramadol de microesferas de HCS en SGF y SIF al modelo de Baker-Lonsdale

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

De los estudios realizados para la encapsulacioacuten de hidrocloruro de tramadol en

microesferas obtenidas por atomizacioacuten se puede concluir

hidrocloruro de tramadol con alta eficiencia de encapsulacioacuten

La velocidad de liberacioacuten del hidrocloruro de tramadol es raacutepida debido a la

alta hidrofilia de este faacutermaco El entrecruzamiento con genipina redujo el

efecto estallido al inicio de la liberacioacuten y retardoacute la liberacioacuten del faacutermaco en el

tiempo

El aumento de la concentracioacuten de genipina dio lugar a una liberacioacuten maacutes baja

del principio activo Con una concentracioacuten 20mM de genipina se alcanzoacute un

grado de entrecruzamiento oacuteptimo en ambos medios de liberacioacuten

Los valores de potencial zeta fueron todos positivos lo cual favorece la

mucoadhesioacuten de las microesferas

Los perfiles de liberacioacuten se ajustaron a la ecuacioacuten simplificada de Higuchi con

un mecanismo de difusioacuten a traveacutes de la matriz polimeacuterica El tipo de difusioacuten

varioacute en funcioacuten del pH del medio y del grado de entrecruzamiento

En el campo de la farmacia las peliacuteculas de quitosano podriacutean ser utilizadas para el

recubrimiento de comprimidos y como sistemas de liberacioacuten controlada de faacutermacos En

los uacuteltimos antildeos el uso de peliacuteculas de quitosano para el tratamiento de heridas e

infecciones cutaacuteneas ha suscitado un gran intereacutes puesto que se puede administrar el

faacutermaco de forma localizada y sostenida en el sitio de accioacuten[44] Ademaacutes el caraacutecter

antimicrobiano y cicatrizante del quitosano aporta propiedades favorables a los sistemas

de liberacioacuten de uso toacutepico [45 47 125]

El objetivo de este capiacutetulo del trabajo ha sido la obtencioacuten por el meacutetodo de evaporacioacuten

de solvente de peliacuteculas de quitosano para la encapsulacioacuten de hidrocloruro de

ciprofloxacino

Una vez obtenidas las peliacuteculas se realizaron estudios de caracterizacioacuten morfologiacutea

hinchamiento e interaccioacuten faacutermaco-poliacutemero Asiacute mismo se llevaron a cabo estudios de

liberacioacuten in vitro estudiando el efecto de tres variables sobre la liberacioacuten del faacutermaco

la concentracioacuten de agente entrecruzante el tiempo de entrecruzamiento y el espesor de

las peliacuteculas

31 Obtencioacuten de las peliacuteculas

La eficiencia de encapsulacioacuten de todas las peliacuteculas obtenidas fue mayor del 80 una

eficiencia de encapsulacioacuten alta teniendo en cuenta que las peliacuteculas cargadas con

faacutermaco fueron sumergidas en soluciones de TPP para ser entrecruzadas

En la Tabla III16 se muestran las caracteriacutesticas de las peliacuteculas obtenidas a diferentes

concentraciones de TPP tiempos de entrecruzamiento y espesores

Tabla III16 Condiciones de preparacioacuten de las peliacuteculas de quitosano (CS) cargadas con hidrocloruro de

ciprofloxacino (CIP)

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

En la Figura III31 se muestran las microfotografiacuteas de los cortes transversales de

diferentes peliacuteculas de quitosano Las peliacuteculas de quitosano y las peliacuteculas de quitosano

entrecruzadas con TPP ambas sin faacutermaco presentaron una superficie lisa y un corte

homogeacuteneo Como ejemplo de esto en la Figura III31A se muestra una peliacutecula de

quitosano Las peliacuteculas cargadas con hidrocloruro de ciprofloxacino y entrecruzadas con

TPP sin embargo presentaron una morfologiacutea irregular con cambios en la superficie y

en el corte como se puede observar en la Figura III31B Por lo tanto la presencia de

principio activo cambioacute notablemente la estructura del interior de las peliacuteculas Shu et al

(2001) tambieacuten observaron cambios en la morfologiacutea superficial y en el corte de peliacuteculas

de quitosano entrecruzadas con citrato despueacutes de antildeadir el faacutermaco[126]

En general el espesor de las peliacuteculas varioacute dentro del rango de 100-300 μm en funcioacuten

del volumen de quitosano utilizado para obtener la peliacutecula Las peliacuteculas que se

presentan en la Figura III31 se obtuvieron a partir de soluciones de quitosano de 5mL

Figura III31 Microfotografiacuteas de SEM de los cortes transversales de las peliacuteculas A) peliacutecula de quitosano

(3 pv) B) peliacutecula de quitosano (3 pv) cargada con hidrocloruro de ciprofloxacino y entrecruzada con

5 TPP (pv) durante 30 minutos

33 Grado de hinchamiento de las peliacuteculas

El estudio del grado de hinchamiento de las peliacuteculas en el medio en el que se realizan los

estudios de liberacioacuten in vitro es necesario puesto que su comportamiento en dicho

medio va a afectar a la liberacioacuten del faacutermaco El hinchamiento de las peliacuteculas de

quitosano y TPP dependeraacute del pH del medio de liberacioacuten ya que las interacciones

electrostaacuteticas existentes entre ambos polianiones estaacuten controladas por el pH del

medio[127]

Se estudioacute el efecto la concentracioacuten de TPP y del tiempo de entrecruzamiento sobre el

hinchamiento de las peliacuteculas sin faacutermaco en PBS a pH 74 El hinchamiento se determinoacute

por la ecuacioacuten

M (III5)

Efecto de la concentracioacuten de TPP sobre el grado de hinchamiento

La Figura III32 muestra las diferencias del grado de hinchamiento de las peliacuteculas al ser

entrecruzadas con soluciones de TPP de diferentes concentraciones (0-5 pv) Las

peliacuteculas no entrecruzadas con TPP presentaron un grado de hinchamiento de 2 mientras

que las entrecruzadas con soluciones de TPP al 1 y 5 (pv) durante 1 hora presentaron

un grado de hinchamiento significativamente maacutes bajo (plt005) 08 y 06

respectivamente Esto indica que la interaccioacuten ioacutenica entre el quitosano y el TPP dio

lugar a una matriz entrecruzada que impidioacute la entrada de agua y por este motivo las

peliacuteculas entrecruzadas se hincharon muy poco Por otra parte el hinchamiento no fue

significativamente distinto (pgt005) para las dos concentraciones de TPP estudiadas (1 y

5 pv) Esto puede deberse a que el entrecruzamiento con 1 (pv) TPP diese lugar a

una matriz lo suficientemente entrecruzada como para no permitir la entrada de agua

Shu et al (2002) [127] comprobaron que las peliacuteculas de quitosano y TPP se hinchan

deacutebilmente a pH 74-95 lo que coincide con nuestros resultados Estos mismos autores

en 2001 [126] observaron el mismo comportamiento en peliacuteculas de quitosano

entrecruzadas con citrato Por lo tanto el entrecruzamiento de las peliacuteculas con

polianiones da lugar a un bajo grado de hinchamiento y este hecho favoreceraacute el control

de la liberacioacuten del faacutermaco

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

Figura III32 Grado de hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano (3 pv) entrecruzadas con 0 1 y 5

(pv) de TPP en PBS (pH 74) a 37ordmC y 100rpm de agitacioacuten

Efecto del tiempo de entrecruzamiento sobre el grado de hinchamiento

La Figura III33 muestra el hinchamiento de las peliacuteculas entrecruzadas con 1 (pv) de

TPP a pH 9 y sometidas a distintos tiempos de entrecruzamiento (1 y 4 horas) El grado

de hinchamiento a 45 minutos para las peliacuteculas sumergidas en la solucioacuten de TPP

durante 1 y 4 horas fue de 08 y 07 respectivamente Como se puede observar un

aumento del tiempo de entrecruzamiento provocoacute una ligera disminucioacuten del grado de

hinchamiento aunque no existen diferencias significativas entre los perfiles de

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

Figura III33 Grado de hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano (3 pv) entrecruzadas con 1 (pv) de

TPP durante 1 y 4 horas en PBS (pH 74) a 37ordmC y 100rpm de agitacioacuten

Los perfiles de hinchamiento se ajustaron a la ecuacioacuten de Schott

(III6)

donde W representa el hinchamiento a tiempo t y B es el inverso del hinchamiento

maacuteximo

Como se observa en la Figura III34 los ajustes presentaron coeficientes de correlacioacuten

altos (R2 ge 098) Por consiguiente el proceso de hinchamiento de estas peliacuteculas estaacute

gobernado por la relajacioacuten de las cadenas del poliacutemero Como se ha visto en la

Introduccioacuten los materiales que se ajustan a la ecuacioacuten de Schott siguen una cineacutetica de

segundo orden [53] hecho que cumplen los resultados de este apartado

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

Figura III34 Perfiles de hinchamiento de las peliacuteculas de quitosano (3 pv) ( ) y de las peliacuteculas de

quitosano (3 pv) entrecruzadas durante 1 hora con 1 (pv) de TPP () y 5 (pv) de TPP () en PBS

(pH 74) ajustados a la ecuacioacuten de Schott

El iacutendice de cristalinidad del quitosano en polvo la peliacutecula de quitosano la mezcla fiacutesica

de quitosano faacutermaco y TPP la peliacutecula con faacutermaco y la peliacutecula con faacutermaco y TPP se

determinoacute por el meacutetodo de Segal para la celulosa [102]

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

donde I110 es la intensidad maacutexima de la reflexioacuten a 2θ= 20ordm y Iam es la intensidad miacutenima

de la difraccioacuten en la regioacuten amorfa a 2θ= 16ordm aproximadamente[103-105]

En la Tabla III17 se muestran los valores del iacutendice de cristalinidad obtenidos

Tabla III17 Iacutendice de cristalinidad () de quitosano (CS) peliacutecula de quitosano mezcla fiacutesica de

quitosano TPP y ciprofloxacino (MF) peliacutecula de quitosano con ciprofloxacino (peliacutecula CIP) y peliacutecula de

quitosano con ciprofloxacino y TPP (peliacutecula CIP TPP)

Muestra IC

CS 7326

Peliacutecula de CS 5932

Peliacutecula CIP 67

Peliacutecula CIP TPP 50

Los resultados obtenidos para el iacutendice de cristalinidad muestran que el quitosano en

polvo presentoacute mayor cristalinidad que en la peliacutecula formada En la Figura III35 se

representan los difractogramas comparados del quitosano en polvo (a) y en forma de

peliacutecula (b) En el caso del quitosano en polvo se observan dos reflexiones a 2θ=1062ordm y

2018ordm las cuales son propias de quitosanos de la forma II La cristalinidad depende en

gran medida del grado de desacetilacioacuten del quitosano que en este caso es del 90

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura III35 Difractogramas de rayos X de quitosano en polvo (a) y de la peliacutecula de quitosano (b)

Los difractogramas de rayos X del hidrocloruro de ciprofloxacino (c) y de la peliacutecula de

quitosano con el pincipio activo (d) se muestran en la Figura III36 El hidrocloruro de

ciprofloxacino presenta reflexiones a valores de 2θ = 824ordm 908ordm 1936ordm 2656ordm y 2928ordm

Sin embargo en el difractograma de la peliacutecula con hidrocloruro de ciprofloxacino no

aparecen las reflexiones caracteriacutesticas del faacutermaco aunque siacute una nueva reflexioacuten a 2θ =

638 El iacutendice de cristalinidad determinado para dicha peliacutecula fue del 67 valor maacutes

alto que el de la peliacutecula de quitosano

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura III36 Difractogramas de rayos X del hidrocloruro de ciprofloxacino (c) y de la peliacutecula de

quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino (d)

Por otra parte en la Figura III37 se pueden observar los difractogramas de la mezcla

fiacutesica (e) de quitosano TPP e hidrocloruro de ciprofloxacino y de la peliacutecula (f) con estos

componentes El iacutendice de cristalinidad tambieacuten se calculoacute siendo del 75 para la

mezcla fiacutesica de los componentes y del 50 para la peliacutecula Por lo tanto la cristalinidad

de la mezcla fiacutesica resultoacute mayor que la de la peliacutecula lo cual verifica que los tres

componentes de la peliacutecula no interaccionaron en la mezcla fiacutesica Sin embargo en las

peliacuteculas de quitosano se produjo una incorporacioacuten del hidrocloruro de ciprofloxacino y

una reaccioacuten de tipo ioacutenico entre el quitosano y el TPP La cristalinidad disminuyoacute

notablemente tras la formacioacuten de las peliacuteculas lo cual indica que el ciprofloxacino y el

TPP estaacuten molecularmente dispersos en la matriz polimeacuterica [25]

0 10 20 30 40

Figura III37 Difractogramas de rayos X de la mezcla fiacutesica de quitosano faacutermaco y TPP (e) y de una

peliacutecula de quitosano con faacutermaco y TPP (f)

342 Espectroscopiacutea de infrarrojo

Se obtuvieron los espectros de infrarrojo (FT-IR) del quitosano utilizado y de las

peliacuteculas de quitosano de quitosano con faacutermaco y entrecruzadas con TPP En la Figura

III38 se muestran los espectros de una peliacutecula de quitosano (a) sin faacutermaco y sin agente

entrecruzante y del quitosano (b)

El quitosano en polvo presentoacute bandas de absorcioacuten a 1594cm-1

y 1650cm-1

que se

atribuyen a la amida II (N-H) y la amida I (C=O) respectivamente bandas a 1380cm-1

debido a la vibracioacuten del grupo C-CH3 y a 3441cm-1

la cual corresponde a la vibracioacuten

del grupo ndashOH e indica la presencia de enlaces de hidroacutegeno intramoleculares en las

moleacuteculas de quitosano

En el caso de la peliacutecula de quitosano las bandas de absorcioacuten a 1594cm-1

y 1650cm-1

que aparecieron en el quitosano en polvo disminuyeron a 1634 y 1558cm-1

debido a la

relajacioacuten de las cadenas

Figura III38 Espectros FT-IR de una peliacutecula de quitosano (a) y de quitosano en polvo (b)

El espectro de una peliacutecula de quitosano cargada con hidrocloruro de ciprofloxacino (c) y

el del principio activo (d) se muestran en la Figura III39

El hidrocloruro de ciprofloxacino presentoacute bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas a 1273 y

1625cm-1

indicando la vibracioacuten del enlace C-F y la vibracioacuten del grupo fenilo conjugado

al grupo ndashCOOH respectivamente a 1709cm-1

debido a la vibracioacuten del grupo -COOH y

a 2918 y 3084cm-1

debido a las vibraciones de C-H del grupo fenilo [129]

En el espectro de la peliacutecula cargada con el principio activo se observa que la banda de

absorcioacuten a 3441cm-1

varioacute a un nuacutemero de onda maacutes bajo (3427cm-1

) y que la misma

resultoacute ser maacutes ancha lo cual indica que se formaron enlaces de hidroacutegeno e

interacciones ioacutenicas entre el hidrocloruro de ciprofloxacino y la matriz de la peliacutecula de

quitosano Asiacute mismo se observoacute que aparecieron nuevas bandas de absorcioacuten a 1723 y

1271cm-1

debido a la incorporacioacuten del principio activo a la matriz

Figura III39 Espectros FT-IR de una peliacutecula cargada con hidrocloruro de ciprofloxacino (c) y del

hidrocloruro de ciprofloxacino (d)

Por uacuteltimo como puede observarse en la Figura III40 se analizaron los espectros de una

peliacutecula de quitosano y TPP (e) de una peliacutecula con ciprofloxacino y TPP (f) y del TPP

El TPP presentoacute bandas de absorcioacuten caracteriacutesticas a 1092 1148 y 1213cm-1

debido al

grupo P=O y a 3389cm-1

debido a la vibracioacuten del ndashOH [130] El espectro de la peliacutecula

de quitosano con faacutermaco y TPP muestra la desaparicioacuten de la banda de absorcioacuten a

1709cm-1

que corresponde a la vibracioacuten del grupo ndashCOOH del hidrocloruro de

ciprofloxacino lo cual significa que se produjo una reaccioacuten del faacutermaco con la sal

Por otra parte la interaccioacuten ioacutenica entre el quitosano y el TPP dio lugar a una banda de

indicando la presencia de un grupo P=O Mi y col describieron en

2003 que al interaccionar quitosano y TPP la intensidad de la banda de P=O aumentaba

Figura III40 Espectros de FT-IR de una peliacutecula de quitosano sin faacutermaco entrecruzada con TPP 5 (pv)

(e) de una peliacutecula con hidrocloruro de ciprofloxacino y entrecruzada con TPP 5 (pv) (f) y del TPP (g)

35 Ensayos de liberacioacuten in vitro

Los ensayos de liberacioacuten se llevaron a cabo en PBS (pH 74) Se estudioacute el efecto de tres

variables sobre la liberacioacuten de hidrocloruro de ciprofloxacino

La concentracioacuten de TPP

El espesor de las peliacuteculas

La Figura III41 muestra los perfiles de liberacioacuten del faacutermaco de las peliacuteculas de

quitosano entrecruzadas durante una hora con diferentes concentraciones de TPP (0 1

25 y 5 pv) Las diferentes concentraciones de TPP provocaron una reduccioacuten

significativa (plt005) en la liberacioacuten con respecto a las peliacuteculas sin TPP Ademaacutes un

aumento de la concentracioacuten del agente entrecruzante dio lugar a una liberacioacuten maacutes lenta

del principio activo aunque las diferencias fueron poco significativas (pgt005) Despueacutes

de 24 horas de ensayo se liberoacute el 85 60 50 y 44 del faacutermaco de las peliacuteculas

sumergidas en soluciones con 0 1 25 y 5 (pv) de TPP respectivamente

Por lo tanto peliacuteculas de quitosano entrecruzadas con TPP presentaron una liberacioacuten

controlada del principio activo utilizado

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

Figura III41 Perfiles de liberacioacuten del hidrocloruro de ciprofloxacino de peliacuteculas de quitosano (3 pv)

entrecruzadas durante 1hora con diferentes concentraciones de TPP (0 1 25 y 5 pv) en PBS (pH 74) a

37ordmC y 100rpm de agitacioacuten

Se observaron diferencias en la liberacioacuten en funcioacuten del tiempo de entrecruzamiento en

la solucioacuten de TPP En la Figura III42 se muestran los perfiles de liberacioacuten de peliacuteculas

sumergidas en TPP al 1 (pv) durante distintos periacuteodos de tiempo (0 05 1 y 4 horas)

La cantidad de faacutermaco liberado en 24 horas fue significativamente menor (plt005) para

las peliacuteculas entrecruzadas durante los diferentes tiempos de entrecruzamiento con

respecto a las no entrecruzadas Ademaacutes las peliacuteculas entrecruzadas durante 4 horas

presentaron diferencias significativas con respecto a las entrecruzadas durante menos

tiempo (plt005) A las 24 horas se liberoacute el 86 60 60 y 48 del total del ciprofloxacino

cargado de las peliacuteculas sumergidas en TPP al 1 (pv) durante 0 05 1 y 4 horas

respectivamente El efecto del tiempo de entrecruzamiento soacutelo se observoacute cuando se

mantuvieron durante 4 horas en la solucioacuten de TPP a tiempos mayores de incubacioacuten no

se observaron diferencias en la cantidad total de faacutermaco liberado

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

sumergidas en TPP al 1 (pv) durante 0 05 1 y 4 horas en PBS (pH 74) a 37ordmC y 100rpm de agitacioacuten

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en los estudios de hinchamiento ya que las

peliacuteculas que no fueron sometidas a entrecruzamiento presentaron un raacutepido

hinchamiento y una liberacioacuten maacutes raacutepida del faacutermaco que las peliacuteculas entrecruzadas

Esto es debido a que un mayor grado de entrecruzamiento dio lugar a una matriz maacutes

reticulada y compacta controlando por tanto el hinchamiento de las peliacuteculas y la

cantidad de faacutermaco liberado

Otros estudios descritos en la bibliografiacutea sobre peliacuteculas de quitosano entrecruzadas con

TPP muestran resultados que concuerdan con los mostrados en este trabajo Wang et al

(2007) [131] estudiaron la liberacioacuten in vitro de hidrocloruro de ciprofloxacino de

peliacuteculas preparadas a partir de una mezcla de quitosano y polietilenglicol Estos autores

tambieacuten observaron un descenso significativo de la liberacioacuten en PBS (pH 74) de

peliacuteculas entrecruzadas con TPP llegando a liberar soacutelo un 40 del faacutermaco encapsulado

en 24 horas Tambieacuten observaron un efecto del tiempo de entrecruzamiento sobre la

liberacioacuten Los resultados son diacuteficiles de comparar con los obtenidos en el presente

trabajo puesto que la cantidad de faacutermaco cargado en las peliacuteculas fue diferente lo cual

influye sobre la liberacioacuten como tambieacuten demostraron estos autores A pesar de ello

ambos resultados muestran un control de la liberacioacuten del principio activo mediante el

entrecruzamiento con TPP

Shu amp Zhu (2002) [127] realizaron ensayos de liberacioacuten in vitro de riboflavina

encapsulada en peliacuteculas de quitosano entrecruzadas con TPP para comprobar la

sensibilidad de la interaccioacuten quitosano-TPP en funcioacuten del pH del medio de liberacioacuten

Tanto el incremento del tiempo de entrecruzamiento como de la concentracioacuten de TPP

disminuyeron la liberacioacuten de riboflavina en SGF y SIF siendo significativamente menor

en SIF (pH 74) Despueacutes de 24 horas se liberoacute un 20 de riboflavina en SIF de peliacuteculas

entrecruzadas con 5 TPP (pv) durante 1 hora

Remuntildeaacuten amp Bodmeier (1997) [43]observaron un efecto de la concentracioacuten de TPP sobre

la difusioacuten de faacutermaco a traveacutes de peliacuteculas de glutamato de quitosano La liberacioacuten de

faacutermaco fue maacutes lenta con concentraciones maacutes altas de TPP lo que concuerda con los

resultados que obtuvieron en los estudios de hinchamiento el cual fue menor en peliacuteculas

entrecruzadas con mayor concentracioacuten de TPP

Efecto del espesor de las peliacuteculas de quitosano

Se estudioacute el efecto del espesor de las peliacuteculas sobre la liberacioacuten de hidrocloruro de

ciprofloxacino Se prepararon soluciones de distintos voluacutemenes 5 y 10mL para obtener

peliacuteculas de quitosano de distinto espesor aproximadamente 100 y 300 m

respectivamente En la Figura III43 se muestran los perfiles de liberacioacuten de peliacuteculas de

diferentes grosores En los ensayos de liberacioacuten se observoacute coacutemo efectivamente las

peliacuteculas de menor espesor liberaron el faacutermaco de forma significativamente maacutes raacutepida

(plt005) que las peliacuteculas maacutes de mayor espesor Las primeras liberaron despueacutes de 24

horas un 50 del total de faacutermaco cargado mientras que las segundas liberaron un 25

en 24 horas debido a la mayor distancia que debe recorrer el faacutermaco para atravesar la

matriz de quitosano y TPP

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

con diferente espesor 100 m (CP6) y 300 m (CP11) entrecruzadas con TPP al 25 (pv) durante 1 hora

en PBS (pH 74) a 37ordmC y 100rpm de agitacioacuten

Ajustes de los perfiles de liberacioacuten a modelos matemaacuteticos

Los perfiles de liberacioacuten del hidrocloruro de ciprofloxacino se ajustaron a la ecuacioacuten

simplificada de Higuchi

Q = KH t12

(III2)

donde Q es la cantidad de faacutermaco liberado y KH es la constante de disolucioacuten de Higuchi

que describe la liberacioacuten por un proceso de difusioacuten basado en la ley de Fick

Como se puede observar en la Tabla III18 los coeficientes de correlacioacuten obtenidos para

todas las peliacuteculas resultaron altos (ge 092) Esto significa que la liberacioacuten del principio

activo desde la matriz siguioacute un mecanismo de difusioacuten

Con el fin de determinar el mecanismo de difusioacuten los datos se ajustaron a la ecuacioacuten de

Korsmeyer-Peppas [132]

donde Mt es cantidad de faacutermaco liberado a tiempo t Minfin es la cantidad de faacutermaco que se

liberariacutea a tiempo infinito K es la constante del sistema y n es el exponente difusional

Los valores obtenidos para el exponente difusional (n) se muestran en la Tabla III18 Las

peliacuteculas presentaron un exponente difusional proacuteximo a 05 en todos los casos excepto

la peliacutecula que no fue sometida a entrecruzamiento que presentoacute un valor maacutes bajo Para

valores de n = 05 se observa una difusioacuten Fickiana y para n gt 05 se trata de una difusioacuten

anoacutemala A la vista de los resultados en general la liberacioacuten de las peliacuteculas

entrecruzadas con TPP siguioacute un proceso de difusioacuten Fickiana

ciprofloxacino de las peliacuteculas de quitosano a los modelos de Higuchi y Korsmeyer-Peppas

Higuchi Peppas

Peliacuteculas KH R2 n R

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

De los resultados obtenidos se pueden extraer una serie de conclusiones que se exponen a

continuacioacuten y que muestran el potencial empleo de las peliacuteculas de quitosano para la

administracioacuten de faacutermacos por viacutea toacutepica

Se obtuvieron peliacuteculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino por el

meacutetodo de evaporacioacuten de solvente

Los estudios de difraccioacuten de rayos X espectroscopiacutea de infrarrojo y microscopiacutea

electroacutenica de barrido mostraron que el principio activo se encuentra

completamente incluido en la matriz polimeacuterica

El entrecruzamiento con tripolifosfato soacutedico conlleva una disminucioacuten del grado

de hinchamiento de las peliacuteculas lo cual indica que la matriz polimeacuterica es maacutes

El aumento del grado de entrecruzamiento disminuyoacute la velocidad de liberacioacuten

del faacutermaco Se alcanzoacute un grado de entrecruzamiento oacuteptimo con una

concentracioacuten de 1 (pv) de tripolifosfato soacutedico y a tiempos cortos de

entrecruzamiento

Los perfiles de liberacioacuten se ajustaron a la ecuacioacuten simplificada de Higuchi El

principio activo fue liberado siguiendo un mecanismo de difusioacuten a traveacutes de la

peliacutecula de quitosano

4 Estudio del efecto del quitosano sobre las uniones estrechas de ceacutelulas Calu-3

Actualmente la mayor parte de los faacutermacos proteicos y peptiacutedicos son administrados por

viacutea parenteral Esto es debido a su gran tamantildeo su hidrofilia y su inestabilidad en el

medio gastrointestinal dando lugar a una baja biodisponibilidad cuando son

administrados por viacutea oral Sin embargo el coste y el riesgo potencial de la ruta

parenteral precisan la investigacioacuten de rutas alternativas Como se describioacute en el

Capiacutetulo de la Introduccioacuten la viacutea de administracioacuten nasal estaacute recibiendo gran atencioacuten

como alternativa debido a la alta vascularizacioacuten de la mucosa nasal y a su alta superficie

de absorcioacuten [33 133]

En cualquier caso la liberacioacuten adecuada y la absorcioacuten sisteacutemica de los faacutermacos

macromoleculares en la cavidad nasal requiere superar varias barreras bioloacutegicas que

presenta la mucosa nasal dentro de las cuales destacan el mecanismo de limpieza

mucociliar la presencia de proteasas y la existencia de uniones estrechas entre las ceacutelulas

epiteliales que limitan la permeabilidad de moleacuteculas a partir de 1000 Da [133] Se han

propuesto diversos promotores de la absorcioacuten de los faacutermacos para superar estas

limitaciones siendo una de las propuestas maacutes estudiadas el uso de soluciones de

poliacutemeros bioadhesivos o sistemas de liberacioacuten producidos a partir de ellos En este

sentido es conocido que el quitosano tiene la capacidad de promover la absorcioacuten de

moleacuteculas debido a su accioacuten sobre las uniones estrechas entre las ceacutelulas epiteliales

[134-136]

Por todo ello el objetivo de este capiacutetulo ha sido estudiar el efecto de la solucioacuten de

hidrocloruro de quitosano y de las nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano sobre la

apertura de las uniones estrechas intercelulares y sobre la permeabilidad de

macromoleacuteculas a traveacutes de las monocapas de ceacutelulas Calu-3

La liacutenea celular utilizada deriva de carcinoma de pulmoacuten (bronquial) y se trata de una

liacutenea relativamente establecida que se utiliza como modelo de epitelio bronquial o nasal

41 Obtencioacuten y caracterizacioacuten de nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano

Se obtuvieron nanopartiacuteculas por gelificacioacuten ionotroacutepica del hidrocloruro de quitosano y

el TPP [33]y se caracterizaron determinando su tamantildeo y su potencial zeta

Las Tablas III19 y III20 muestran la influencia de dos variables sobre el tamantildeo de las

nanopartiacuteculas obtenidas el pH de la solucioacuten de TPP y la concentracioacuten de hidrocloruro

de quitosano respectivamente

Al disminuir el pH del TPP de 9 a 4 se obtuvieron nanopartiacuteculas de menor tamantildeo por

lo que se utilizoacute la solucioacuten de TPP a pH 4 en los siguientes experimentos

La concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano tambieacuten influyoacute en el tamantildeo de las

nanopartiacuteculas obtenieacutendose tamantildeos menores con una concentracioacuten de HCS de 015

(pv) Con las concentraciones de HCS maacutes altas (008 y 005 pv) se formaron

agregados al antildeadir la solucioacuten de TPP a pH 4 a la solucioacuten de HCS

Tabla III19 Efecto del pH del TPP sobre el tamantildeo de las nanopartiacuteculas con HCS 02 pv y TPP 0084

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

Tabla III20 Efecto de la concentracioacuten de HCS (005-020 pv) sobre el tamantildeo de las nanopartiacuteculas con

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

Las nanopartiacuteculas que se obtuvieron con una solucioacuten de hidrocloruro de quitosano de

015 (pv) y una solucioacuten de TPP 008 (pv) a pH 4 presentaron menor tamantildeo y por

tanto se utilizaron en los experimentos posteriores Las nanopartiacuteculas seleccionadas

resuspendidas en KCl presentaron un valor de potencial zeta de 371plusmn03

Las concentraciones de hidrocloruro de quitosano y TPP establecidas como oacuteptimas para

la obtencioacuten de nanopartiacuteculas son comparables con las utilizadas previamente por Calvo

et al (1997) en el orden de 01-03 (pv) para el quitosano y de 002-001 (pv) para

el TPP Por otra parte la proporcioacuten HCSTPP (pp) oacuteptima resultoacute ser 4 lo cual es

comparable con los resultados obtenidos en el estudio de Calvo et al (1997) que

emplearon proporciones entre 3 y 5 [31] Asiacute mismo Papadimitriou et al (2008)

estudiaron el efecto de la proporcioacuten CSTPP sobre el tamantildeo de las nanopartiacuteculas y

obtuvieron partiacuteculas de menor tamantildeo al aumentar la proporcioacuten CSTPP siendo la

proporcioacuten pp oacuteptima de 5 [137]

Las nanopartiacuteculas fueron caracterizadas en teacuterminos de tamantildeo y potencial zeta despueacutes

de ser resuspendidas en medio HBSS a pH 6 medio utilizado en los ensayos celulares

Presentaron un radio medio de 3399 663nm (Figura III44) y un valor de potencial zeta

de 113 27mV Se determinoacute el potencial zeta de la disolucioacuten de hidrocloruro de

quitosano de referencia en el medio (pH 6) y presentoacute un valor de 308 24mV el cual es

aproximadamente tres veces mayor que el de las nanopartiacuteculas El valor del potencial

zeta obtenido resultoacute positivo tanto para la solucioacuten como para las partiacuteculas de

hidrocloruro de quitosano lo cual es importante pues se mantienen las propiedades

mucoadhesivas de ambos [124]

Esta marcada diferencia en el valor del potencial zeta puede explicarse si tenemos en

cuenta que en las nanopartiacuteculas el hidrocloruro de quitosano estaacute cargado positivamente

e interacciona con el TPP cargado negativamente por lo que la cantidad de cargas

positivas en la superficie de las nanopartiacuteculas seraacute menor que la cantidad de cargas de la

solucioacuten de hidrocloruro de quitosano sin TPP

Figura III44 Distribucioacuten de tamantildeo de nanopartiacuteculas de HCS-TPP resuspendidas en HBSS El resultado

representa una media de 10 determinaciones realizadas a 25ordmC

La determinacioacuten de la cantidad de hidrocloruro de quitosano presente en las

nanopartiacuteculas es otro resultado a tener en cuenta en la caracterizacioacuten de las mismas El

gran nuacutemero de cargas positivas que posee el quitosano lo hace susceptibe de reaccionar

con colorantes anioacutenicos como el Cibacron Brilliant Red Despueacutes de aislar las

nanopartiacuteculas por centrifugacioacuten y determinar la cantidad de hidrocloruro de quitosano

libre en el sobrenadante por el meacutetodo colorimeacutetrico descrito por Miralles et al (2009)

[108] la concentracioacuten media de hidrocloruro de quitosano unido a las nanopartiacutecuas fue

de 0056 0006 (pv) Por lo tanto teniendo en cuenta que la concentracioacuten inicial era

de 0103 (pv) aproximadamente un 55 del hidrocloruro de quitosano inicial se

encontraba formando parte de las nanopartiacuteculas Es decir la eficacia del meacutetodo

utilizado fue de un 55

42 Estudios de citotoxicidad

Un paraacutemetro importante a la hora de valorar el potencial de un nuevo vehiacuteculo de

liberacioacuten de faacutermacos es su toxicidad celular Teniendo esto en cuenta se estudioacute el

efecto del hidrocloruro de quitosano en solucioacuten y en forma de nanopartiacuteculas sobre la

actividad metaboacutelica (MTS) y la integridad de la membrana plasmaacutetica (LDH) de las

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

En primer lugar se estudioacute el efecto de diferentes concentraciones de hidrocloruro de

quitosano en solucioacuten sobre la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas Calu-3 Los resultados

obtenidos representados en la Figura III45 muestran diferencias en la actividad

metaboacutelica en funcioacuten de la concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano La actividad

metaboacutelica de las ceacutelulas disminuyoacute significativamente (plt005) con respecto al control

(HBSS) para las concentraciones de HCS 0010-0100 (pv) con una reduccioacuten de maacutes

del 50 Concentraciones de HCS maacutes bajas (0006-0002 pv) sin embargo tuvieron

un menor efecto sobre la actividad metaboacutelica Las concentraciones de 0003 y 0002

(pv) no presentaron diferencias significativas (pgt005) con respecto al control por lo que

no produjeron un efecto adverso sobre las ceacutelulas Calu-3

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

Figura III45 Efecto de diferentes concentraciones de HCS (0002-0100 pv) del HBSS y del Triton-X

sobre la actividad metaboacutelica de Calu-3 medida por MTS Resultados presentados como media plusmn DS (n=4)

Posteriormente a partir de los datos obtenidos se comparoacute el efecto del hidrocloruro de

quitosano en solucioacuten con el efecto de las nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano

sobre la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas Calu-3 a las concentraciones de HCS

comprendidas entre 0002 y 0025 (pv)

Como muestra la Figura III46 las concentraciones de HCS de 0002 y 0003 pv tanto

en nanopartiacuteculas como en solucioacuten de hidrocloruro de quitosano no mostraron un efecto

supresivo en la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas comparado con el control (HBSS)

Sin embargo las nanopartiacuteculas y la solucioacuten de HCS con concentraciones maacutes altas de

HCS (0006-0025 pv) mostraron una reduccioacuten significativa (plt005) de la actividad

metaboacutelica celular comparada con el medio HBSS siendo esta reduccioacuten mayor en el

caso del HCS en solucioacuten Por tanto la concentracioacuten de 0003 (pv) fue identificada

como la concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano maacutes alta que no presentoacute una

disminucioacuten significativa de la actividad metaboacutelica tanto en forma de nanopartiacuteculas

como en solucioacuten

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

Figura III46 Efecto de diferentes concentraciones de HCS en forma de nanopartiacuteculas (0002-0025 pv)

y en solucioacuten (0002-0025 pv) del HBSS y del Triton-X sobre la actividad metaboacutelica de las ceacutelulas

Calu-3 determinada por el meacutetodo MTS Resultados presentados como media plusmn DS (n=4)

422 Ensayo LDH

Cualquier dantildeo en la membrana plasmaacutetica celular se puede determinar indirectamente

por la liberacioacuten de la enzima intracelular lactato deshidrogenasa (LDH) Este ensayo se

utilizoacute para evaluar el efecto de diferentes concentraciones de hidrocloruro de quitosano

en solucioacuten y en forma de nanopartiacuteculas sobre la membrana plasmaacutetica

Como muestra la Figura III47 se produjo un aumento de liberacioacuten de LDH en funcioacuten

de la concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano tanto para la solucioacuten como para las

nanopartiacuteculas Las nanopartiacuteculas con 0003 (pv) de HCS concentracioacuten maacutes alta que

no afectoacute al metabolismo celular (ensayo MTS) causaron un incremento del 98 en la

liberacioacuten de LDH en comparacioacuten con el control (HBSS) mientras que la solucioacuten de

hidrocloruro de quitosano con igual concentracioacuten provocoacute un aumento del 113

Ambas diferencias son estadiacutesticamente significativas con respecto al control (HBSS)

pero las diferencias entre la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano y las nanopartiacuteculas

con dicha concentracioacuten no fueron significativas

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y en solucioacuten (0002-0025 pv) del HBSS y del Triton-X sobre la liberacioacuten de LDH en ceacutelulas Calu-3

Resultados presentados como media plusmn DS (n=4)

La reduccioacuten de la actividad metaboacutelica y el incremento de liberacioacuten de LDH mostrados

en estos resultados pueden estar relacionados con el grado de desacetilacioacuten del quitosano

y por tanto con la densidad de carga del mismo Aunque las propiedades mucoadhesivas

del quitosano sean debidas a sus grupos amino cargados positivamente debe existir un

compromiso entre su capacidad de mucoadhesioacuten y sus efectos adversos sobre las ceacutelulas

Esto estariacutea en acuerdo con los efectos citoliacuteticos y toacutexicos que se han observado en otros

poliacutemeros catioacutenicos con alta densidad de carga como son poli-L-lisina poli-L-arginina

y protamina [64]

Excepto para las concentraciones maacutes bajas de hidrocloruro de quitosano las

nanopartiacuteculas dieron lugar a un descenso significativo de su citotoxicidad con respecto al

poliacutemero en solucioacuten Esto puede ser debido al entrecruzamiento del quitosano con TPP

proceso por el cual disminuye la carga positiva del poliacutemero como quedoacute demostrado

con los valores de potencial zeta obtenidos En desacuerdo con estos resultados Huang et

al [138]no describieron diferencias en la citotoxicidad del quitosano en solucioacuten y en

forma de nanopartiacuteculas en ceacutelulas A549

Aunque el quitosano ha sido muy estudiado como agente mucoadhesivo y promotor de la

absorcioacuten soacutelo existen algunos estudios sobre el efecto de este poliacutemero sobre la

viabilidad de las ceacutelulas Calu-3 y otras liacuteneas celulares procedentes del tracto respiratorio

Se ha descrito que una solucioacuten de quitosano de l5 (pv) redujo la viabilidad de ceacutelulas

Calu-3 hasta alrededor de un 68 en comparacioacuten con el control [139] Huang et al

(2004) [138]observaron que unas nanopartiacuteculas preparadas por un meacutetodo similar a las

obtenidas y testadas en este estudio indujeron una reduccioacuten de la viabilidad en ceacutelulas

A549 (procedentes de carcinoma de epitelio alveolar humano) hasta aproximadamente un

70 con una concentracioacuten de quitosano del 01 (pv) Por otro lado Huang et al

(2005) [140] describieron que el quitosano en forma de micropartiacuteculas indujo

respuestas proinflamatorias en pulmoacuten de rata La comparacioacuten directa entre estos

estudios y el presente trabajo es problemaacutetica debido a la variabilidad de los quitosanos

utilizados en teacuterminos de peso molecular grado de desacetilacioacuten y tipo de quitosano

(quitosano o sal de quitosano) En cualquier caso otros estudios han descrito una baja

toxicidad del quitosano en solucioacuten y en forma de nanopartiacuteculas en liacuteneas celulares

respiratorias [63 141 142]

43 Estudio de la resistencia transepitelial

La resistencia eleacutectrica transepitelial (TEER) nos da una indicacioacuten de la integridad de las

uniones estrechas entre ceacutelulas Una disminucioacuten de la misma puede indicar la apertura de

la viacutea paracelular y dicha disminucioacuten debe ser reversible para asegurar que la membrana

celular no ha perdido su integridad

Se realizoacute un seguimiento de la variacioacuten de la TEER en monocapas de ceacutelulas Calu-3

con el fin de estudiar el efecto del hidrocloruro de quitosano en solucioacuten y en

nanopartiacuteculas sobre la integridad de las uniones estrechas

La Figura III48 muestra la disminucioacuten de los valores de la TEER con las nanopartiacuteculas

preparadas con HCS 0006 pv durante las dos horas de experimento Estos valores se

mantuvieron bajos aun despueacutes de haber retirado las nanopartiacuteculas del compartimento

donador del soporte prermeable Por lo tanto para las nanopartiacuteculas con esta

concentracioacuten de hidrocloruro de quitosano la TEER no fue reversible despueacutes de

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

Figura III48 Efecto de las nanopartiacuteculas con 0006 (pv) hidrocloruro de quitosano sobre la TEER de las

monocapas de ceacutelulas Calu-3 Resultados mostrados como media plusmn DS (n=3)

A continuacioacuten se estudioacute la capacidad de las suspensiones de nanopartiacuteculas y de la

solucioacuten de hidrocloruro de quitosano ambos con la concentracioacuten seleccionada en los

estudios de citotoxicidad (0003 pv de HCS) de disminuir el valor inicial de la TEER

de las monocapas de ceacutelulas Calu-3

En la Figura III49 se observa que tanto las nanopartiacuteculas como el hidrocloruro de

quitosano en solucioacuten provocaron una reduccioacuten significativa (plt005) de la TEER de las

monocapas con respecto a la TEER inicial y con respecto al control (HBSS) Ademaacutes el

efecto de la solucioacuten de hidrocloruro de quitosano sobre la TEER fue significativamente

mayor que el de las nanopartiacuteculas (plt005) La TEER permanecioacute baja durante el

periodo de tiempo en el que las ceacutelulas fueron incubadas con las muestras (2 horas)

(Figura 6A) recuperaacutendose completamente despueacutes de 24 horas (Figura 6B) Por lo tanto

el efecto del hidrocloruro de quitosano a esta concentracioacuten fue reversible

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

Figura III49 Efecto de la solucioacuten y las nanopartiacuteculas de HCS al 0003 pv sobre la TEER de las

monocapas de ceacutelulas Calu-3 Detalle del efecto sobre TEER hasta 4h (A) y recuperacioacuten de TEER tras 24h

(B) Datos presentados como media plusmn DS (n=3)

El descenso de la TEER se observoacute tanto con el hidrocloruro de quitosano en solucioacuten

como con las nanopartiacuteculas aunque el efecto fue maacutes pronunciado en el caso de la

solucioacuten Esto puede ser debido al efecto de la carga superficial positiva que resultoacute maacutes

alta en la solucioacuten que en las nanopartiacuteculas Una mayor cantidad de cargas positivas

provoca una interaccioacuten maacutes fuerte con las cargas negativas de las membranas celulares

Por tanto esto puede hacer que el efecto sobre la apertura de las uniones estrechas sea

maacutes prominente La influencia de las cargas positivas del quitosano sobre la absorcioacuten ha

sido estudiada anteriormente por otros grupos Shipper et al (1996) [143] observaron que

los quitosanos de menor grado de desacetilacioacuten y por tanto con menos grupos amino

libres y menos cargas positivas promueven menos la absorcioacuten Sadegui et al (2008)

[144]estudiaron el efecto de formulaciones basadas en soluciones de quitosano y

nanopartiacuteculas sobre la TEER de ceacutelulas Caco-2 y explicaron sus resultados basaacutendose en

la densidad de carga superficial de las formas particuladas comparada con el quitosano en

solucioacuten El quitosano en forma de nanopartiacuteculas presentoacute un efecto menor sobre la

TEER porque el potencial zeta de las mismas era menor que el del quitosano en solucioacuten

El descenso de la TEER no implica necesariamente la apertura de las uniones estrechas

intercelulares sino que tambieacuten puede producirse por efectos citotoacutexicos Sin embargo el

hecho de que la TEER se recupere apoya la teoriacutea de la apertura de las uniones

En la bibliografiacutea existen otros estudios sobre el efecto de las nanopartiacuteculas de quitosano

sobre la TEER y por tanto sobre la apertura de uniones estrechas Teijeiro-Osorio et al

(2009) [145] demostraron la reduccioacuten de la TEER de monocapas de ceacutelulas Calu-3 tras

la aplicacioacuten de nanopartiacuteculas de quitosano ciclodextrina El descenso de la TEER es

maacutes bajo (hasta un 3382 plusmn 598 del valor inicial) en comparacioacuten con los resultados

obtenidos en este trabajo (~50 de la TEER inicial) aunque la dosis de nanopartiacuteculas

empleada en el primer estudio conteniacutea una cantidad de quitosano mayor (~2207microgcm2

de la monocapa) que en el presente estudio (1364microgcm2) Estos autores observaron una

mejora en la reduccioacuten de glucosa en sangre en ratas despueacutes de la administracioacuten de las

nanopartiacuteculas cargadas con insulina Explican los resultados por una combinacioacuten de

varios factores incluyendo la apertura de uniones estrechas la translocacioacuten de

nanopartiacuteculas a traveacutes de la mucosa nasal y la proteccioacuten de la insulina incorporada

contra la degradacioacuten enzimaacutetica

Por otro lado un estudio realizado por Bravo-Osuna et al (2008) [146] investiga el

efecto del quitosano en solucioacuten de nanopartiacuteculas de quitosano y nanopartiacuteculas de

cianoacrilato recubiertas de quitosano tiolado sobre la permeabilidad y la TEER de

mucosa procedente de yeyuno de rata Los resultados muestran un descenso de la TEER y

una mejora del transporte paracelular de manitol con las soluciones de ambos tipos de

quitosano y con las nanopartiacuteculas recubiertas con quitosano tiolado pero no con las

recubiertas con quitosano Los autores explican que la fuerza mucoadhesiva de las

nanopartiacuteculas de quitosano provoca la inmovilizacioacuten de las mismas en la capa de

mucus por lo que no pueden difundir dentro de ella y llegar a las proteiacutenas de las uniones

estrechas lo cual es imprescindible para la apertura de las uniones estrechas En el caso

de las nanopartiacuteculas de quitosano tiolado observan que tienen una fuerza mucoadhesiva

maacutes baja en comparacioacuten con las anteriores y soacutelo una parte de ellas interactuacutea

fuertemente con la capa de mucus Las demaacutes que no se encuentran adheridas al mucus

difunden y llegan a las uniones estrechas mejorando asiacute la permeabilidad paracelular En

el presente trabajo aunque se empleoacute un modelo epitelial basado en ceacutelulas productoras

de mucus (ceacutelulas Calu-3) se observoacute un importante efecto sobre las uniones estrechas

Estas diferencias pueden deberse a varios factores como son el uso de hidrocloruro de

quitosano en lugar de quitosano y el de un modelo de monocapas de ceacutelulas epiteliales en

lugar de un tejido mucoso

Asiacute mismo existen estudios en los que no se ha observado ninguacuten efecto de las

nanopartiacuteculas de quitosano sobre la TEER de monocapas de distintas liacuteneas celulares

Grenha et al (2007) [142] estudiaron el efecto de nanopartiacuteculas de quitosano-TPP

incorporadas en micropartiacuteculas por atomizacioacuten sobre la TEER de ceacutelulas Calu-3 No

observaron ninguacuten efecto sobre las uniones estrechas (TEER) para la concentracioacuten

maacutexima de nanopartiacuteculas que utilizaron (13mgml nanoparticulas correspondientes a

150 μg de quitosano) Otro estudio que empleoacute nanopartiacuteculas de quitosano y ceacutelulas

Caco-2 tampoco mostroacute cambios significativos sobre las uniones estrechas [147] Dyer et

al (2002) [20]observaron que las nanopartiacuteculas insulina-quitosano eran

significativamente menos efectivas en la disminucioacuten de los niveles de glucosa en sangre

en ratas y ovejas que la formulacioacuten basada en solucioacuten de quitosano

Sin embargo Fernandez-Urrusuno et al (1999)[33] observaron una eficiencia mayor de

las nanopartiacuteculas cargadas con insulina en comparacioacuten con las soluciones de quitosano

en su efecto sobre la absorcioacuten por la viacutea de administracioacuten nasal Lim et al (2001)

observaron un descenso de la TEER del 50-60 en ceacutelulas 16HBE14o tras su incubacioacuten

con una solucioacuten de glutamato de quitosano (10 mgml) y micropartiacuteculas (2ndash3 mg)

El hidrocloruro de quitosano a una concentracioacuten de 0003 (pv) en forma de

nanopartiacuteculas y en solucioacuten se seleccionoacute para estudiar su efecto sobre el transporte de

dos moleacuteculas hidrofiacutelicas modelo de diferente peso molecular a traveacutes de monocapas de

ceacutelulas Calu-3 Se utilizoacute dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceiacutena (FD4 y

FD10) como modelo

La Figura III50 muestra la permeabilidad de FD4 y FD10 en presencia de solucioacuten de

HCS o nanopartiacuteculas de HCS y la permeabilidad en ausencia de HCS Tanto las

nanopartiacuteculas como la solucioacuten de HCS aumentaron significativamente la permeabilidad

de FD4 y FD10 (plt005)

Figura III50 Efecto de las nanopartiacuteculas de HCS y la solucioacuten de HCS sobre la permeabilidad de FD4 y

FD10 a traveacutes de monocapas de ceacutelulas Calu-3 Resultados expresados como media+DS (n=3)

La permeabilidad de FD4 fue de 22710-6

cms cuando se antildeadioacute junto con las

nanopartiacuteculas y 25310-6

cms cuando se antildeadioacute a la solucioacuten de HCS Por tanto con

nanopartiacuteculas y con solucioacuten resultoacute 107 y 119 veces maacutes alta con respecto al control

(21310-7

cms) En el caso de FD10 las nanopartiacuteculas mostraron una permeabilidad de

66710-7

cms y la solucioacuten de 10310-6

cms es decir 65 y 101 veces maacutes alta que el

control (10210-7

cms) respectivamente

Por lo tanto las nanopartiacuteculas y el hidrocloruro de quitosano en solucioacuten presentaron un

efecto promotor de la absorcioacuten significativamente maacutes bajo para FD10 que para FD4

(plt005) Tanto para FD10 como para FD4 el efecto promotor de la absorcioacuten de las

nanopartiacuteculas fue menor que el del hidrocloruro de quitosano en solucioacuten aunque la

diferencia soacutelo fue significativa para el FD10

A la vista de los resultados podemos decir que existe un menor efecto modulador de las

uniones estrechas por parte de las nanopartiacuteculas y esto concuerda con los resultados

obtenidos para la TEER la cual se vio menos afectada con nanopartiacuteculas que con

solucioacuten de hidrocloruro de quitosano Ademaacutes probablemente sea necesario provocar un

mayor efecto sobre las uniones estrechas para promover la permeabilidad de FD10

teniendo en cuenta su mayor peso molecular

Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Sadegui et al (2008)[144] en los que

tanto la solucioacuten de quitosano como las nanopartiacuteculas promovieron la absorcioacuten de

insulina a traveacutes de ceacutelulas Caco-2 aunque el efecto de las nanopartiacuteculas sobre el

transporte fue mucho menor Estos autores explican sus resultados por la menor

reduccioacuten de la TEER causada por las nanopartiacuteculas y por los valores de potencial zeta

obtenidos que eran menores que los del quitosano en solucioacuten Los valores de potenial

zeta obtenidos en el presente estudio tambieacuten fueron menores para las nanopartiacuteculas

Los resultados obtenidos muestran que las nanopartiacuteculas de hidrocloruro de

quitosano tienen un efecto promotor de la permeabilidad similar al del

hidrocloruro de quitosano en solucioacuten para una macromoleacutecula de 4kDa pero

inferior al hidrocloruro de quitosano en solucioacuten para una macromoleacutecula de

Las nanopartiacuteculas de hidrocloruro de quitosano seleccionadas abren de forma

reversible las uniones estrechas de las ceacutelulas Calu-3 y promueven la

permeabilidad de macromoleacuteculas a traveacutes de las mismas sin inducir efectos

toacutexicos irreversibles

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

El intereacutes de esta tesis surgioacute directamente del intereacutes del sector farmaceacuteutico para

generar conocimiento en el desarrollo de nuevos sistemas de liberacioacuten de principios

activos por lo que los resultados obtenidos tienen un potencial caraacutecter aplicado Se han

obtenido resultados con interesantes aportes e innovaciones en el campo de la tecnologiacutea

farmaceacuteutica

Los resultados obtenidos permiten extraer las siguientes conclusiones

Se han obtenido microesferas de hidrocloruro de quitosano con

claritromicina por atomizacioacuten con altas eficiencias de encapsulacioacuten lo

cual hace posible la utilizacioacuten de esta teacutecnica en la industria farmaceacuteutica

El uso de agentes entrecruzantes permitioacute controlar la liberacioacuten de

claritromicina en el tiempo Se alcanzoacute un grado de entrecruzamiento

oacuteptimo tanto con tripolifosfato soacutedico como con genipina liberaacutendose un

95 y un 85 de claritromicina en 8 horas respectivamente

Se han obtenido microesferas de hidrocloruro de quitosano por

atomizacioacuten con hidrocloruro de tramadol y entrecruzadas con genipina

agente entrecruzante de origen natural

El uso de la genipina permitioacute controlar la liberacioacuten de hidrocloruro de

tramadol principio activo hidrosoluble en el tiempo y reducir el efecto

estallido al inicio de la liberacioacuten Se alcanzoacute un grado de

entrecruzamiento oacuteptimo con genipina 20mM Por tanto el quitosano y la

genipina constituyen un buen sistema de liberacioacuten controlada del

principio activo

Las microesferas obtenidas mantienen las propiedades mucoadhesivas del

quitosano ya que presentaron una carga superficial positiva Por tanto

estos sistemas pueden favorecer la absorcioacuten del faacutermaco a traveacutes del

epitelio correspondiente

Se han obtenido peliacuteculas de quitosano con hidrocloruro de ciprofloxacino

para su uso a nivel toacutepico

El uso de tripolifosfato soacutedico como agente entrecruzante de las peliacuteculas

permitioacute controlar la liberacioacuten del faacutermaco disminuyendo eacutesta

notablemente con el tiempo de entrecruzamiento y la concentracioacuten de

Conclusiones

TPP Se alcanzoacute un grado de entrecruzamiento oacuteptimo con 1 (pv) TPP y

a tiempos de entrecruzamiento cortos liberaacutendose menos del 60 del

faacutermaco en 24 horas

Se ha demostrado el efecto del quitosano como modulador de las uniones

estrechas intercelulares y como promotor de la absorcioacuten de

macromoleacuteculas sin inducir efectos toacutexicos irreversibles Las

nanopartiacuteculas aunque en menor medida que el quitosano tambieacuten

muestran estas propiedades por lo que constituyen un sistema de

encapsulacioacuten adecuado para macromoleacuteculas terapeacuteuticas tales como los

faacutermacos proteicos

Aunque no hay una mejora de la permeabilidad con el uso de las

nanopartiacuteculas puede ser ventajoso liberar las biomacromoleacuteculas a traveacutes

de superficies mucosas incorporaacutendolas en las nanopartiacuteculas Eacutestas

pueden proteger al principio activo de la degradacioacuten enzimaacutetica

prolongar el tiempo de contacto con la mucosa y controlar su liberacioacuten

Bibliografiacutea

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Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales






52 Determinacioacuten de la caraga eleacutectrica superficial de microesferas y nanopartiacuteculas

















1 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina obtenidas por atomizacioacuten

11 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas con tripolifosfato soacutedico

12 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con claritromicina entrecruzadas con genipina


2 Microesferas de hidrocloruro de quitosano con hidrocloruro de tramadol obtenidas por atomizacioacuten






















IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOacuteGICAS

Departamento de Bioquiacutemica y Biologiacutea Molecular I

QUITOSANO UN BIOPOLIacuteMERO CON APLICACIONES

EN SISTEMAS DE LIBERACIOacuteN CONTROLADA DE

FAacuteRMACOS

MEMORIA DE TESIS DOCTORAL

PRESENTADA POR

Dntildea Ruth Expoacutesito Harris

DIRECTORES DE TESIS

Aacutengeles Mariacutea Heras Caballero

Niuris Acosta Contreras

Madrid 2009

Agradecimientos

otro centro

Consumo

el primer antildeo

Publicaciones

203-230

Aceptado 2009

Marine Drugs

―Drug Delivery

International

(Poacutester)

European

(Poacutester)

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

Bibliografiacutea

V BIBLIOGRAFIacuteA

Bibliografiacutea

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Pure Appl Chem A32 (4) (1995) 629-640

(2) (2009) 203-230

Bibliografiacutea

1326-1331

(2004) 1-7

Bibliografiacutea

Pharm 187 (1999) 53-65

233-240

125-132

Bibliografiacutea

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Release 27 (1993) 149-156

(1997) 215-225

Wound Rep Reg 4 (1996) 48-52

Bibliografiacutea

(1992) 1-9

Release 39 (1996) 131

(2005) 235-242

Bibliografiacutea

228-234

Release 87 (2003) 131-138

1135-1146

Bibliografiacutea

(2002) 165-174

Sci Polym 10 (1999) 63-74

98 (2005) 1581-1593

Bibliografiacutea

Release 89 (2003) 151-165

Eur J Pharm Sci 13 (2) (2001) 123-133

forms J Pharm Sci 56 (10) (1967) 1238-1242

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Pharm Acta Helv 60 (1985) 110-111

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Text Res J 29 (1959) 786-794

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(2002) 27-33

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Rockville USA 2006

(1992) 151-159

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Biopharm 68 (2008) 235-244

Chem 38 (2000) 2804-2814

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Biomaterials 22 (2) (2001) 165-173

(1977) 3197-3202

Bibliografiacutea

(2007) 336-343

Press 1986

Release 87 (2003) 187-198

1358-1361

(1992) 43-48

73 (2008) 44-54

(2004) 344-353

Bibliografiacutea

Pharm Res 20 (2003) 1812-1819

Eur J Pharm Sci 31 (2007) 73-84

Pharm Sci 4 (1996) S153-S153

70 (2008) 270-278

Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

Agradecimientos

otro centro

Consumo

el primer antildeo

Publicaciones

203-230

Aceptado 2009

Marine Drugs

―Drug Delivery

International

(Poacutester)

European

(Poacutester)

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

Bibliografiacutea

V BIBLIOGRAFIacuteA

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Pure Appl Chem A32 (4) (1995) 629-640

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73 (2008) 44-54

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Eur J Pharm Sci 31 (2007) 73-84

Pharm Sci 4 (1996) S153-S153

70 (2008) 270-278

Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

el primer antildeo

Publicaciones

203-230

Aceptado 2009

Marine Drugs

―Drug Delivery

International

(Poacutester)

European

(Poacutester)

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

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(2002) 27-33

Bibliografiacutea

Rockville USA 2006

(1992) 151-159

Bibliografiacutea

Biopharm 68 (2008) 235-244

Chem 38 (2000) 2804-2814

York 1998

Biomaterials 22 (2) (2001) 165-173

(1977) 3197-3202

Bibliografiacutea

(2007) 336-343

Press 1986

Release 87 (2003) 187-198

1358-1361

(1992) 43-48

73 (2008) 44-54

(2004) 344-353

Bibliografiacutea

Pharm Res 20 (2003) 1812-1819

Eur J Pharm Sci 31 (2007) 73-84

Pharm Sci 4 (1996) S153-S153

70 (2008) 270-278

Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

Publicaciones

203-230

Aceptado 2009

Marine Drugs

―Drug Delivery

International

(Poacutester)

European

(Poacutester)

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

Bibliografiacutea

V BIBLIOGRAFIacuteA

Bibliografiacutea

237-247

Pure Appl Chem A32 (4) (1995) 629-640

(2) (2009) 203-230

Bibliografiacutea

1326-1331

(2004) 1-7

Bibliografiacutea

Pharm 187 (1999) 53-65

233-240

125-132

Bibliografiacutea

461-472

Release 27 (1993) 149-156

(1997) 215-225

Wound Rep Reg 4 (1996) 48-52

Bibliografiacutea

(1992) 1-9

Release 39 (1996) 131

(2005) 235-242

Bibliografiacutea

228-234

Release 87 (2003) 131-138

1135-1146

Bibliografiacutea

(2002) 165-174

Sci Polym 10 (1999) 63-74

98 (2005) 1581-1593

Bibliografiacutea

Release 89 (2003) 151-165

Eur J Pharm Sci 13 (2) (2001) 123-133

forms J Pharm Sci 56 (10) (1967) 1238-1242

Bibliografiacutea

Pharm Acta Helv 60 (1985) 110-111

wwwmalverncomuk

Text Res J 29 (1959) 786-794

Polym 12 (1990) 405-418

(2002) 27-33

Bibliografiacutea

Rockville USA 2006

(1992) 151-159

Bibliografiacutea

Biopharm 68 (2008) 235-244

Chem 38 (2000) 2804-2814

York 1998

Biomaterials 22 (2) (2001) 165-173

(1977) 3197-3202

Bibliografiacutea

(2007) 336-343

Press 1986

Release 87 (2003) 187-198

1358-1361

(1992) 43-48

73 (2008) 44-54

(2004) 344-353

Bibliografiacutea

Pharm Res 20 (2003) 1812-1819

Eur J Pharm Sci 31 (2007) 73-84

Pharm Sci 4 (1996) S153-S153

70 (2008) 270-278

Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

International

(Poacutester)

European

(Poacutester)

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

Bibliografiacutea

V BIBLIOGRAFIacuteA

Bibliografiacutea

237-247

Pure Appl Chem A32 (4) (1995) 629-640

(2) (2009) 203-230

Bibliografiacutea

1326-1331

(2004) 1-7

Bibliografiacutea

Pharm 187 (1999) 53-65

233-240

125-132

Bibliografiacutea

461-472

Release 27 (1993) 149-156

(1997) 215-225

Wound Rep Reg 4 (1996) 48-52

Bibliografiacutea

(1992) 1-9

Release 39 (1996) 131

(2005) 235-242

Bibliografiacutea

228-234

Release 87 (2003) 131-138

1135-1146

Bibliografiacutea

(2002) 165-174

Sci Polym 10 (1999) 63-74

98 (2005) 1581-1593

Bibliografiacutea

Release 89 (2003) 151-165

Eur J Pharm Sci 13 (2) (2001) 123-133

forms J Pharm Sci 56 (10) (1967) 1238-1242

Bibliografiacutea

Pharm Acta Helv 60 (1985) 110-111

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Text Res J 29 (1959) 786-794

Polym 12 (1990) 405-418

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Rockville USA 2006

(1992) 151-159

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Biopharm 68 (2008) 235-244

Chem 38 (2000) 2804-2814

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Biomaterials 22 (2) (2001) 165-173

(1977) 3197-3202

Bibliografiacutea

(2007) 336-343

Press 1986

Release 87 (2003) 187-198

1358-1361

(1992) 43-48

73 (2008) 44-54

(2004) 344-353

Bibliografiacutea

Pharm Res 20 (2003) 1812-1819

Eur J Pharm Sci 31 (2007) 73-84

Pharm Sci 4 (1996) S153-S153

70 (2008) 270-278

Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

Internacional

Fecha 2009

Informes a empresas

SA Junio 2008

Abreviaturas

CS quitosano

Gnp genipina

dosis)

UV ultravioleta

Iacutendice

1 Materiales 51

Iacutendice

atomizacioacuten 71

con genipina 90

Iacutendice

422 Ensayo LDH 144

IV CONCLUSIONES 153

Objetivos

OBJETIVOS

farmaceacuteutica

Introduccioacuten

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

Coste elevado

Introduccioacuten

faacutermaco

Retardada

principio activo

terapeacuteutico

farmaceacuteuticas

gastrorresistentes

Pulsaacutetil

del faacutermaco

De control espacial

cuando la forma

activacioacuten [2]

Introduccioacuten

poliacutemero

especiacutefico

Introduccioacuten

Precipitacioacuten

Emulsioacuten

1microm [29]

Introduccioacuten

faacutermacos

Introduccioacuten

(Oregon EEUU)

hinchamiento

J = - D (dcdx) (I1)

Introduccioacuten

M (I3)

las cadenas

K W Wdt

Introduccioacuten

dicho transporte

Introduccioacuten

Mucoadhesioacuten

general [57]

varias formas

Introduccioacuten

Zona basal

Zona apical

Membrana celular

Espacio paracelular

Unioacuten estrecha

Membranaapical

Membranabasolateral

paracelular

Introduccioacuten

ceacutelulas Caco-2

Introduccioacuten

monocapas

Introduccioacuten

Ceacutelulas Calu-3

Introduccioacuten

sumergidos[70]

la genipina [72]

Introduccioacuten

(P3O105-

HP3O104-

y H2P3O103-

y en iones OH- Al

y HP3O104-

Introduccioacuten

Genipina

Introduccioacuten

O OCH3

CH2OH NH2

Introduccioacuten

Claritromicina

Introduccioacuten

su estabilidad

Introduccioacuten

secundarios [90]

Introduccioacuten

viacuteas (ANOVA)

W0-Wt = Kt (I5)

Introduccioacuten

ft = K0 t (I6)

Qt = Q0 + K0t (I7)

Qt = Q0 e -K1t

log Qt = -(K1t2303) +log Q0 (I10)

Modelo de Higuchi

Introduccioacuten

Q = KH t12

Higuchi

- Wt13

= Kst (I12)

y simplificando

(1 ndash f t) 13

= 1- Kβ t (I13)

Introduccioacuten

MtMinfin= Ktn (I14)

este modelo

iDk (I16)

Introduccioacuten

Mecanismo de

Geometriacutea de

la matriz

Sistema controlado

por hinchamiento

(Caso II)

Esfera n = 043 n = 085

Peliacuteculas

r = espesor

Cilindros

r = radio 2

4052exp

Esferas

r = radio 2

Introduccioacuten

3 (I17)

1 Materiales

Poliacutemeros

Principios activos

Promochem

horas) a 50ordmC

Madrid

nanopartiacuteculas

M La medida del

)(2 afUE

de Henry

toma -1

eleacutectrica

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (II3)

-1 y en el caso del

M (II5)

996 Waters

frente al log t

MtMinfin= Ktn (II6)

0C Una vez que las

Transwellreg

medio HBSS

Triton X

los soportes

506nm Em 529nm)

dextrano

estrechas

Claritromicina

Genipina (Gnp)

Estudios realizados

Microesferas

principios activos

SGF pH 12

SIF pH 74

Peliacuteculas

encapsulacioacuten

Nanopartiacuteculas

quitosano unido

ceacutelulas Calu-3

atomizacioacuten

01 (pv)

Lote HCS

C1 1 --- --- ---

C2 1 50 --- ---

C3 1 50 01 4

C4 1 50 02 4

C5 05 50 --- ---

C6 05 50 01 4

C7 05 50 02 4

C8 01 50 --- ---

C9 01 50 01 9

C10 01 50 02 9

C11 01 50 01 4

C12 01 50 02 4

Lote RA () EE ()

C1 52 -

C2 57 9657plusmn389

C3 4656 9231plusmn435

C4 3655 8513plusmn397

C5 566 100plusmn638

C6 3762 8549plusmn397

C7 4682 8854plusmn077

C8 647 9657plusmn074

C9 697 9584plusmn578

C10 699 8074plusmn327

C11 4567 8262plusmn595

C12 5031 7554plusmn407

Lote HCS

( pv) pH TPP

Potencial zeta

C1 1 --- --- 581plusmn25

C2 1 --- --- 493plusmn54

C3 1 01 4 219plusmn14

C4 1 02 4 210plusmn14

C5 05 --- --- 330plusmn62

C6 05 01 4 233plusmn15

C7 05 02 4 175plusmn14

C8 01 --- --- 239plusmn09

C9 01 01 9 189plusmn09

C10 01 02 9 -45plusmn03

C11 01 01 4 166plusmn08

C12 01 02 4 89plusmn09

0 10 20 30 40

los componentes

0 10 20 30 40

(01 pv) (e)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

05 HCS

01 HCS

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

in lib

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

plusmnSD)

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

02 TPP

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

(n=3 plusmnSD)

HP3O104-

y H2P3O103-

W0-Wt = Kt (III1)

este caso

HCS ( pv) K R2

01 32815 0942

05 32531 0929

1 23511 0906

Q = KH t12

(III2)

Higuchi

y = 4034x - 5582Rsup2 = 09832

0 05 1 15 2 25 3

Lote KH R2 n R

C2 46962 0947 0766 0919

C3 40340 0983 0691 0957

C4 29801 0973 0403 0984

C5 60753 0972 0687 0955

C6 32740 0982 0504 0976

C7 30935 0939 0642 0949

C8 60374 0969 0602 0962

C9 40788 0957 0517 0935

C10 30165 0922 0858 0868

C11 29092 0978 0549 0899

C12 28455 0961 0530 0956

3 (III4)

Baker-Lonsdale

Lote K R2

C2 0092 0914

C3 0096 0956

C4 0073 0946

C5 0065 0949

C6 0065 0969

C7 0156 0875

C8 0065 0994

C9 0065 0979

C10 0049 0977

C11 0080 0890

C12 0102 0939

obtenidas

C13 05 50 05

C14 05 50 1

atomizacioacuten

Lote Gnp

Potencial zeta

C13 05 386plusmn410

C14 1 329plusmn715

0 10 20 30 40

aproximadamente

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

004 Gnp

0 2 4 6 8

Tiacuteempo (h)

01 TPP

004 Gnp

plusmnSD)

y = 19433x + 48192Rsup2 = 09469

0 1 2 3 4

polimeacuterica

visible

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

a 25ordmC

respectivamente

210 230 250 270 290 310 330

hipoacutetesis

210 230 250 270 290 310 330

25ordmC

37ordmC

50ordmC

y = 2575x + 0045Rsup2 = 09912

0 01 02 03 04 05

Genipina

2 1425plusmn249

5 2338plusmn0077

20 2964plusmn421

Lote HCS

Tiempo

T1 05 --- --- ---

T2 05 30 --- ---

T3 05 30 2 5

T4 05 30 2 15

T5 05 30 5 5

T6 05 30 20 5

cercana a un 100

Lote RA () EE ()

T1 6852 ---

T2 6143 9627plusmn349

T3 6719 9777plusmn429

T4 6212 9983plusmn101

T5 6757 9969plusmn312

T6 4515 9529plusmn298

quitosano[124]

Lote Genipina

(mM) Tiempo (h)

Potencial zeta

T1 --- --- 327plusmn385

T2 --- --- 246plusmn315

T3 2 5 1484plusmn106

T4 2 15 1592plusmn106

T5 5 5 1450plusmn046

T6 20 5 1224plusmn045

0 5 10 15 20 25 30 35 40

genipina y tramadol

liberacioacuten

(0-20mM)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

de 4 horas

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

Gnp 0mM

Gnp 2mM

Gnp 5mM

Gnp 20mM

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 1 2 3 4

Tiacuteempo (h)

0 05 1 15 2 25 3

Tiacuteempo (h)

de la unidad

Q = KH t12

(III2)

observarse

SGF SIF

KH R2 KH R

T2 74511 0965 59477 0966

T3 63088 0981 60087 0996

T4 53843 0983 60211 0981

T5 60414 0998 61762 0973

T6 51930 0987 53010 0995

y = 5301x - 02321Rsup2 = 09945

0 05 1 15 2

difusional

SGF SIF

n R2 n R

T2 0330 0959 0346 0983

T3 0353 0962 0515 0992

T4 0395 0969 0675 0977

T5 0531 0989 0714 0977

T6 0439 0988 0528 0991

3 (III4)

Lote SGF SIF

K R2 K R

T2 0139 0982 0162 0995

T3 0022 09649 0311 0906

T4 0116 0989 0132 0936

T5 0165 0934 0143 0968

T6 0115 0987 0122 0968

tiempo

ciprofloxacino

las peliacuteculas

Peliacutecula CS

( pv) V (mL)

Tiempo

CP1 3 30 -- 5 --

CP2 3 30 1 5 05

CP3 3 30 1 5 1

CP4 3 30 1 5 4

CP5 3 30 25 5 05

CP6 3 30 25 5 1

CP7 3 30 25 5 4

CP8 3 30 5 5 05

CP9 3 30 5 5 1

CP10 3 30 5 5 4

CP11 3 30 25 10 1

CP12 3 30 25 10 4

medio[127]

M (III5)

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

0 TPP 1 TPP 5 TPP

hinchamiento

0 10 20 30 40 50

Tiempo (min)

1 h 4 h

(III6)

maacuteximo

Rsup2 = 09951

Rsup2 = 09824

Rsup2 = 0986

0 5 10 15 20 25

Tiempo (min)

ICr ()= (I110-IamI110) ∙ 100 (III7)

Muestra IC

CS 7326

[106128]

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40

y 1650cm-1

que se

y 1650cm-1

debido a la

1625cm-1

a 2918 y 3084cm-1

) y que la misma

1271cm-1

debido al

1709cm-1

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 TPP 1 TPP

25 TPP 5 TPP

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 h 05 h

1 h 4 h

0 5 10 15 20

Tiacuteempo (h)

CP6 CP11

Q = KH t12

(III2)

Higuchi Peppas

CP1 21294 0967 0303 0977

CP2 17873 0958 0503 0966

CP3 15922 0997 0509 0985

CP4 9189 0977 0460 0978

CP5 15139 0980 0449 0959

CP6 14001 0990 0554 0964

CP7 12492 0986 0602 0941

CP8 18361 0968 0504 0942

CP9 11728 0929 0410 0947

CP10 11422 0927 0420 0911

entrecruzamiento

[134-136]

pH TPP 90 55 40

Radio (nm) 5240 3365 2547

TPP 0084 (pv) a pH 40

( pv) 020 018 015 01 008 005

(nm) 2547 2389 1204 1454 --- ---

ceacutelulas Calu-3

421 Ensayo de MTS

boacute

HCS 0100

HCS 0050

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

boacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

422 Ensayo LDH

cioacute

maacute

NP 0025

NP 0010

NP 0006

NP 0003

NP 0002

HCS 0025

HCS 0010

HCS 0006

HCS 0003

HCS 0002

Triton X

y protamina [64]

retirarlas

0 5 10 15 20 25

Tiacuteempo (h)

0 5 10 15 20

Tiempo (h)

0 1 2 3 4

Tiempo (h)

NP 0003

HCS 0003

FD10) como modelo

(21310-7

66710-7

control (10210-7

Conclusiones

IV CONCLUSIONES

Conclusiones

farmaceacuteutica

principio activo

Conclusiones

Bibliografiacutea

V BIBLIOGRAFIacuteA

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Agradecimientos

Abreviaturas

IacuteNDICE

OBJETIVOS

I INTRODUCCIOacuteN













1 Materiales

















































IV CONCLUSIONES

V BIBLIOGRAFIacuteA

Documents

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDAlfonso, del CAI de Microscopía y a Fernando, del CAI de Rayos X. Quiero agradecer a la empresa Vegal Farmacéutica S.L., con la que el Instituto