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UNIVERSIDAD AU MA METROPOLITANA-IZTAPALAPA '
\ ,
f D M S I ~ N DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE LA SALUD
I
/ EFECTO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum towum Sw.
SOBRE LA PROLIFERACI6N CELULAR
CCk3DlfJACi3N DE SEnVlCiOS DOCUMENTALES - BIBLIOTECA
ALUMNA : VICTORIA CASTILLO RODRIGUEZ L
PROFESORES
M en C: RODOLFO VELASCO LEZAMA Q. B. P: RAFAELA TAPIA AGUILAR
I I
\
La médula bsea es el principal sitio de proliferación y diferenciacibn del
sistema hematopoyético, que se origina de la célula stem o célula madre
pluripotencial hematopoyética, con restricción progresiva del potencial de
diferenciacibn a medida que la célula se compromete y produce las células
precursoras de un solo linaje como son; La unidad formadora de colonias de
macrófagos/monocitos (GM-CFU), unidad formadora de brotes de eritrocitos (E- BFU), unidad formadora de brotes de megacariocito (Meg-BFU), y línea linfoide
(1). La difer%.ciación terminal de cada elemento sanguíneo origina; eritrocitos,
linfocitos, plaquetas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos que se liberan a
la circulación sanguínea (2).
Se ha postulado que bajo la influencia de agentes físicos, químicos,
infecciosos o humorales, las dlulas hematopoykticas normal se transforman y
producen trastornos hematoldgicos como la leucemia, enfermedad maligna del
tejido hematopoyético caracterizada por el reemplazamiento de elementos de
medula ósea normal por células ' neoplásicas que frecuentemente esthn
presentes en la sangre periférica y que invaden órganos del sistema fagocitíco
mononuclear particularmente el bazo, hígado y nódulos linfdticos, además de
otros tejidos u órganos corporales, eventualmente la' leucemia causa la muerte
(3,4). Otros trastornos hematológicos producidos por alteraciones en la célula
stem pluripotencial son; la anemia aplhstica, metaplasia mieloide y neutropenia
cíclica, los que finalmente causaran la muerte de los adultos que las padecen (5).
#
" .
La diferenciación de las células stem hematopoyética sin autorrenovación
adecuada provocar deplesión de elementos sanguíneos, en tanto que la falta de
diferenciación de la d u l a stem da lugar a un número insuficiente de plaquetas,
-x eritrocitos o granulocitos maduros(4).
h
En la medicina alopática las leucemias y la anemia aplhstica son tratadas
con radioterapia quimioterapia y transplantes de médula ósea, sin embargo estos
tratamientos particularmente el ultimo no están al alcance de la población, siendo
costos por ello algunas personas recurren a la medicina herbolaria como un
tratamiento alternativo o complementario de la medicina alophtica para eliminar o
En nuestro país con una extensa variedad de plantas se utilizan al menos
32 de ellas para el tratamiento de cáncer y10 leucemia aunque la gran mayoría de
ellas carecen de estudios que respalden su actividad. Para el presente estudio se
seleccionó Solanum fowurn Sw. Planta de la familia Solanaceae recomendada
comúnmente en Chiapas como antitumoral, antiespasmódico y contra infecciones
de genitales externos y heridas(6). Con base en que Solanum fowum es utilizada
como antitumoral y que la leucemia es un tipo de chncer de tejido blando se
podría esperar que está planta pudiera contrarrestar la proliferación de las células
neoplhsicas.
JUSTIFICACI~N DEL TRABAJO Y DE LA MODIFICACI~N DE
OBJETIVOS
Los objetivos planteados inicialmente, se propusieron considerando una posible colaboración con el grupo de investigación del Dr. Alejandro Marche del
Instituto Nacional de Cancerología, quien aportaría las células transformadas
(leucémias) que deberían ser expuestas a los extractos derivados de S. t o m .
Quedando de acuerdo que esta parte del trabajo se realim'a en dicha institucibn,
debido a que el Laboratorio de Hematología Experimental (S-254) del la U A "
Iztapalapa no reunía las condiciones de seguridad para el manejo de células humanas
leucémicas . Sin embargo, debido a dicho grupo no obtuvo l a s líneas celulares
requeridas para el estudio, no se concretó la colaboración, ya que este grupo sólo
contaba con cultivos primarios de la sangre de pacientes con leucemia meilocítica
crónica, pero heterogéneo respecto al a la fase de la enfermedad y a los tratamientos
recibidos previamente.
Por lo anterior y sobre todo porque el realizar dicho trabajo en nuestro
laboratorio representaba gave riesgo para la alumna y los demás integrantes del
grupo de trabajo. Se modificaron los objetivos propuestos inicialmente y se decidió
obtener los extractos acuoso y orgánicos de la planta para evaluar su actividad
hematopoyética en cultivo de células de bazo y de médula ósea de ratones sanos, lo
que complementa los estudios realizados por nuestro grupo, ya que en esta ocasión
se modificó el método de obtención de los extractos, lo cual permitirá determinar cual
de los métodos de obtención preserva la actividad biológica de los extractos.
Considerando que en estudios realizados por el grupo de trabajo S torvum ha
mostrado actividad citotóxica en cultivos de células humanas transformadas, es
posible que esta planta tenga actividad antineoplásica y que la estrategia inicial para
el estudio de los antineoplásicos es evaluar su efecto sobre la, proliferacibn de
modelos de estudio sencillos como bacterias y levaduras, en este trabajo se planteó
también como objetivo conocer el efecto antimicrobiano de los extractos obtenidos,
utilizando cultivos de Escherichia coli, Bacillus subtilis y Candida albicans.
Es importante mencionar que el interés de utilizar células leucémicas es
conocer la gama de células humanas transformadas para las cuales el extracto acuoso
de la planta es citotóxico, Además permitiría conocer si existe algún grado de
especificidad respecto al tipo de leucemia que puede ser tratada con la planta 0 SUS
extractos.
EFECTO DEL EXTRACTO METANdLlCO DE Solanum fotvum Sw. SOBRE LA PROLlFERACldN CELULAR.
Objetivo General :
Determinar el efecto del extracto metanólico de Solanum Towum Sw. sobre la proliferación de dlulas transformadas humanas o murínas.
Objetivos Específicos :
a) Obtención en extracto metanólico de Solanum towum.
b) Determinar el efecto del extracto metanólico de Solanum towum Sw sobre la proliferación in vitro de c6lulas de bazo y de medula ósea de ratdn sano.
c) Determinar el efecto del extracto metanólico de Solanum tonrum Sw sobre la proliferación in vivo.
c) Evaluación del efecto del extracto metanólico de Solanum tomum sobre la
concentración de las c6lulas sanguineas de ratones sanos.
.. .
HIP~TESIS
Dado que la Sosa (Solanum fowum) es una de las plantas que se utilizan en
diversas regiones del país para el tratamiento de cáncer o leucemia, es posible
que la planta contenga compuestos que inhiban la proliferación de células
transformadas, que estimule la proliferación de &lulas normales o ambas, por
tanto el estudio de la actividad de sus extractos sobre la proiiferacibn c6lular h - vivo e in vitro permitiría conocer si esta planta posee las propiedades curativas que el conocimiento popular le atribuye.
METODOLOGíA
OBTENCIóN DE LOS EXTRACTOS:
Se pesaron 200 gramos de hojas secas de Solanum torvum Sw, se colocaron
en maceración en un matraz con 1200 ml de hexano, se dejaron en reposo al
resguardo de la' luz por 48 horas a temperatura ambiente, al término de este
tiempo se filtró la mezcla, para recuperar el sobrenadante y se filtro. Los residuos
del solventes en las hojas se eliminaron por evaporación, substituyéndose el
solvente del macerado por cloroformo, se repitió el mismo procedimiento para
metano1 y agua. En cada una de las fases de la extracción produjo los extractos
hexánico, clorofórmico, metanólico y acuoso, los que fueron llevados a sequedad
por evaporación. Finalmente se prepararon las diluciones con O.O8g, 0.04, 0.02,
0.01 y 0.005 g/ml de los extractos con dimetilfullsóxido (DMSO) al 10% y se
evaluó su efecto sobre la proliferación celular in vitro e in vivo.
ACTIVIDAD BlOLOGlCA IN VITRO.
Se obtuvieron cultivos de 24 horas de Escherichia coli, BacilZos subtilis en caldo
nutritivo, se sembraron por dispersión en placa en medios Agar M,iüller-Hinton,
sobre el medio con bacterias se colocaron discos de papel filtros impregnados con
diferentes concentraciones de los extractos de prueba, se incluyeron discos
testigos con peniciiina-estreptomicina I O5 pg/ml y con solución al 10% de
dimetilsulfóxido (DMSO) como testigos de inhibición y no inhibici6n del
crecimiento bacteriano respectivamente.
2 2 2 5 1 3 Para conocer el efecto de los extractos sobre la proliferaci6n de Candida albicans
se preparó un cultivo de 24 horas en caldo sabouraud, se sembr6 en placas'de
agar Sabouraud-dextrosa y se colocaron Jos discos impregnados de A n t h 1 OX y
con soluci6n de dimetilsulf6xido (DMSO) al 10% como testigo positivo y negativo
de actividad antifúngica respectivamente. Todas las placas se incubaron a 37°C
durante 24horas.
La actividad antimicrobiana fue medida por el halo de inhibicibn del desarrollo en
los cultivos.
ENSAYOS DE ACTlVlDA HEMATOPOYÉTICA In Vitro DE LOS EXTRACTOS
DE Solanum torvum Sw.
Cada extracto fue centrifugado a 3000 rpm/l5 minutos, se recuperó el
sobrenadante, se filtr6 con membrana milipore 0.22 pm y se guardó en
congelaci6n hasta su uso.
CULTIVO DE BAZO: Se sacrificó por dislocaci6n cervical un ratón macho de la
cepa CD1 de 8-12 semanas de edad, se extrajo el bazo, se obtuvo una suspenci6n
de cklulas con 3 ml de medio a- MEM un 15% de suero de caballo ( a-15 ),
después de cuantificar las dlulas totales y determinar su viabilidad con azul
tripan, se ajust6 la concentraci6n a 2 X IO5 cels./mL Se depositó por duplicado
0.01 ml de la suspensión celular en pozos de cultivo que contenían 0.8 ml del
medio a-15 y 0.1 ml del extracto de prueba (hex&&, clorofórmico, metanólico o
acuoso a las concentraciones 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 g/ml), se prepararon testigos
acuoso y oleoso, todos los cultivos se incubaron a 37"C/48 horas y se
cuantificaron las células en cámaras de Newbauer por microscopio de luz. Cada
extracto fue ensayado por duplicado tres veces.
QBTESJCl6N DE MÉDULA 6SEA: .Se sacrifEó por dislocación cervical un rat6n
macho de la cepa CDI, se extrajo el fémur, se ajustó la concentración a 2x1 O5
cel/mL, después de cuantificar las células totales y determinar su viabilidad con
azul tripan. S e deposit6 par duplicado 0.1 mt de la suspensidn celular en pozos de
cultivo que contenían 0.8ml del medio de Leibovitz ( L-I 5) y 0.1 ml del extracto de
prueba (hexánico, clorofórmico, metanólico o acuoso a las concentraciones 0.4,
0.2, 0.1, 0.05 g/ml ), se prepararon testigos acuosos y oleoso. Todos los cultivos
se incubaron a 37OCn2horas y se cuantificaron las células en camaras de
Newbauer por microscopia de luz.
ACTIVIDAD BIOLOGICAS IN VIVO
Con el extracto metanólico se prepararon diluciones con 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 g/ml en solución salina fisiológica, las diluciones fueron suministradas por vía oral
a 5 sendos grupos de ratones machos de 11 a 13 semanas de edad, en una
relacidn 0.01 mI/g. de peso corporal, durante tres días consecutivos, al quinto día
se sangraron, sacrificaron y se realizaron las siguientes determinaciones:
Cuantificación de plaquetas:
Los ratones se sangraron por vena caudal, después de eliminar la primera gota de
sangre se lleno la pipeta de Thomas hasta la marca 0.5 y con Oxalato de
Amonio se llevó hasta la marca de 101, se agitó por 3 minutos y después de
desechar las primeras cinco gotas se llenó las cámaras de Newbauer para la
cuantificación directa de plaquetas al microscopio con objetivos de 40X.
CUENTA DIFERENCIAL:
Se deposit6 una gota de sangre de la venaacaudal sobre un portaobjeto, se hizo
un frotis y se tiAo con colorante de Wright, se- realiz6 la cuenta diferencial por
observación directa al microscopio con objetivo de IOOX.
Para la cuantificación de leucocitos, eritrocitos, hematocrito, hemoglobina y
reticulocitos, se utilizó sangre heparinizada obtenida por punción cardiaca.
Para hematocrito: se absorbi6 la sangre por capilaridad tapando uno de los
extremos del tubo capilar con plastilina, se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos y
se midió el paquete globular.
Para reticulocitos: En un criotubo se adicionó una gota del colorante azul de
cresilo brillante y una gota de sangre, se incubo a 37"C/15 minutos. Realizando
frotis para el conteo de eritrocitos y reticulocitos en diez campos.
Para hemoglobina: se prepar6 una curva patr6n con reactivas de Drabkin y
Cianometahemoglobina , adicionalmente se prepararon las disoluciones problema
por duplicado con 4.98 ml de reactivo de Drabkin y 0.02ml de sangre. Se
mezclaron perfectamente dejandolos a temperatura ambiente durante 5 minutos
para el desarrollo de la reacción, posteriormente se ley6 la absorbancia a.540nm.
Para eritrocitos y Leucocitos: se cuantificaron en el contador de partículas
COULTER Z1 , los eritrocitos se diluyeron 1 :I O00 y los leucocitos 1500 con la
disolucidn lsoton II.
.I 8/ >
E a 4 S S w n
n a n 5 F: o a W n
I,
L o
I DISEÑO EXPERIMENTAL I
I
I
OBTENC16N DE EXTRACTOS A PARTIR DE LAS HOJAS DE Solanum tuwum Sw.
a temp. ambiente Reposo por 48 h. Reposo por 48 h.
a temp. ambiente
Concentracidn por evaporacidn hasta
sequedad evaporacidn hasta
I Reposopor48h. a temp. ambiente
Recuperacidn y secado del
evaporaci6n hasta sequedad
PRUEBAS DE ACTIVIDAD BIOL6GICA " "IN VIVO" E 3 VITRO"
Recuperacidn y secado del sedimento J
evaporaci6n hasta
t
ESQUEMA DE INOCULACIóN DEL EXTRACTO METAN~LICO
' PANGRADO
1 2 3 4 5 días
LOTE I 0.4 g/mL
LOTE 2 0.2 g1mL
LOTE 3 0.1 g/mL
LOTE 4 0.05 g/mL
LOTE 5 Solución Salina Fisiológica
RESULTADOS
I 1
EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE S. torvum SOBRE LA PROLIFERACIóN DE MICROORGAN1SMOS
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Candida albicans
cn I a 3 I ‘W c) W PL m O cn E 3 L O .c,
m
m 8 W n
W n O + 0 W L W
O .r O
I
I. EFECTO DE S. torvum SOBRE CÉLULAS DE MÉDULA ÓSEA
Acuoso I Metandico Clorofórmico Hexdnico T. Acuoso
EXTRACTOS DE S. towurn
T. Oleoso
Hoja3 Chart 1
i
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum torvum Sw.
0.4 0.2 0.1 0.05 SS
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL. ~- ~.
PBgina 1
I
i
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum towum Sw
0.4 0.2 0.1 0.05 SS
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL.
t
i
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum torvum 3w.
I I I I I
0.4 0.2 o. 1 0.05 SS
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL
L
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum towum Sw.
0.4 0.2 o. 1 0.05 SS
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓCICO DE Solanum torvum Sw.
0.4 0.21 o. 1 0.05
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN g/mL.
SS
20
16
12
8
4
O
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO METANÓLICO DE Solanum torvum Sw.
0.4 0.2 o. 1 0.05 SS "
ps Iv
CONCENTRACIóN DEL EXTRACTO EN glmL. 6n )Ir m
d
Hoja7 Chart I
RATONES TRATADOS CON EXTRACTO-METANÓLICO DE Solanum torvum sw
Linfocitos Monocitos Basdfilos Eosin6filos N. banda N.meta N. Segmentados
M0.4
M 0.2 00.1 0 0 . 0 5
M SS
DISCUSI~N
En la actividad antimicrobiana de los extractos de Solanum torvum Sw. Sobre
Escherichia coli observamos que tanto el extracto metan6lico como el hexhico
presentaron halos de inhibici6n en relaci6n directa con la concentraciones
probadas, mientras que el extracto acuoso únicamente a la concentraci6n de
0.08 g/ml y el extracto clorof6rmico no present6 ningún efecto inhibitorio, por su
parte el testigo positivo de inhibici6n ( mezcla penicilina/estreptomicina) presento
un halo de 16 a 17.5 mm de dihmetro y el testigo negativo ( DMSO al 10%) no
present6 inhibicibn. La actividad inhibitoria sobre Bacillus subtiMs la present6
principalmente el extracto acuoso en las mas altas, seguido del extracto hexhnico
con las dos primeras concentraciones y finalmente el extracto metan6lico a la
concentraci6n de 0.08 g/ml . Ninguno de los extractos presento actividad
antifúngica sobre Candida albicans .
Al probar la actividad de los extractos Solanum fowum en cultivo de &lulas de
Bazo de rat6n, observamos que los extractos acuoso y metan6lico a la
concentraci6n de 0.4 g/ml presentaron actividad inductora de la proliferacidn
significativa (desviacibn esthdar de 2.82X104 cel/ml ) mientras que a las
concentraciones de 0.2, 0.1 y 0.05 g/ml disminuyo tal efecto.
Por otro lado, los extractos clorof6rmico y hexsnico presentaron efectos
significativo sobre la inducci6n de la proliferaci6n, tal vez debido a su pobre
solubilidad en los constituyentes del medio de cultivo.
En cultivo de medula &ea los extractos probados no presentaron efectos
significativos sobre la proliferaci6n celular.
" - - """
En los ratones tratados con extracto metan6lico se indujo un incremento
significativo en eritrocitos con la concentraci6n de 0.4, plaquetas en la
concentraci6n de 0.2 y 0.1 g/ml y leucocitos en 0.2 g/ml.
Por otro lado los reticulocitos, hematocrito, concentracibn de hemoglobina y
cuenta diferencial no presentan variacibn significativo.
Nota: Las conclusiones se presentarhn durante la exposici6n.
CONCLUSIONES
Los extractos acuoso, metanólico y hexánico.de Solanum torvum inhiben la proliferación de Escherichia coli y Bacillus subtilis
Ninguno de los extractos inhibió la proliferación de Candida albicans
La concentración 0.4 g/ml de los extractos acuoso y metanólico estimuló plenamente la proliferación de células de bazo in vitro
222513
CONCLUSIONES EXTRACTO METANÓLICO
Bajo las condiciones de experimentación únicamente la concentración de 0.4 g/mL provoco un aumento significativo en la concentración de eritrocitos, sin originar cambios en los valores de hematocrito, hemoglobina y reticulocitos.
Ninguna de las concentraciones ensayadas modificó significativamente la concentración absoluta y relativa de leucocitos.
Las concentraciones de 0.2 y 0.1 g/mL indujeron aumento significativo en la cuenta de plaquetas.
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