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UNIVERSIDAD ARTURO PRAT
DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA DEL DESIERTO Y BIOTECNOLOGIA
AGRONOMIA
EFECTO DE LA INOCULACIÓN CON Glomus intraradices
Schenck & Smith y Trichoderma harzianum Rifai, EN EL
CULTIVO DE MELÓN (Cucumis melo Linneo.; tipo Inodorus
var. Honeydew Orange Flesh), BAJO UN AMBIENTE
CONTROLADO.
TESIS PARA OPTAR AL
TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO
ALUMNO TESISTA: Christian Santander Castro.
PROFESOR GUÍA: Dr. Jorge Olave Vera.
IQUIQUE – CHILE
2012
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Ingeniero Agrónomo.
APROBACIÓN
PROFESOR GUÍA Dr. Jorge Olave Vera. -----------------
Ing. Agrónomo
Dr. en Agricultura intensiva en zona semiáridas
PROFESOR EVALUADOR Dr. Víctor Tello Mercado ------------------
Biólogo
Mg. Sc. Protección Vegetal
Dr. en Ciencias Silvoagropecuarias
PROFESOR EVALUADOR Dr. Jorge Arenas Charlin ------------------
Ing. Agrónomo
Mg. Sc. Producción Vegetal
Dr. En Ciencias Silvoagropecuarias
Enero, 2012
Iquique
I
INDICE GENERAL
INDICE GENERAL ................................................................................................................ I
INDICE DE CUADROS ...................................................................................................... IV INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ VI AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ IX DEDICATORIA .................................................................................................................... X RESUMEN ............................................................................................................................. 1
ABSTRACT ........................................................................................................................... 2 1.- INTRODUCCION ....................................................................................................... 3 1.1. OBJETIVOS ................................................................................................................ 5
1.1.1. Objetivo general: ...................................................................................................... 5 1.1.2. Objetivo específico: ................................................................................................. 5 1.1.3. HIPOTESIS. ............................................................................................................ 5 2.- REVISION BIBLIOGRAFICA ................................................................................... 6
2.1. El suelo ........................................................................................................................ 6
2.1.1. El suelo y sus componentes microbiológicos .......................................................... 6 2.2. Micorrizas .................................................................................................................... 7 2.2.1. Conceptos generales sobre las micorrizas ............................................................... 7
2.2.2. Micorrizas arbusculares ........................................................................................... 9 2.2.3. Colonización de las raíces ........................................................................................ 9
2.2.4. Colonización del suelo ........................................................................................... 10 2.2.5. Efecto de las micorrizas arbusculares en los cultivos ............................................ 11
2.2.5.1. Mejora del estado nutricional de las plantas ...................................................... 11 2.2.5.2. Nutrición nitrogenada ......................................................................................... 12
2.3. Trichoderma .............................................................................................................. 14 2.3.1. Generalidades de Trichoderma .............................................................................. 14 2.3.2. Clasificación Taxonómica ..................................................................................... 14
2.3.3. Ciclo de Vida de Trichoderma harzianum ............................................................ 15 2.3.4. Aspecto Macroscópico ........................................................................................... 15
2.3.5. Condiciones de Crecimiento de Trichoderma ....................................................... 16 2.3.5.1. Nutrición............................................................................................................. 16
2.3.5.2. pH ....................................................................................................................... 17 2.3.5.3. Temperatura ....................................................................................................... 17
2.3.5.4. Humedad ............................................................................................................ 17 2.3.6. Promotor del crecimiento en los cultivos. ............................................................. 18 2.3.7. Interacción hongo micorritico arbuscular – Trichoderma. .................................... 19 2.4. Cultivo de melón (Cucumis melo L.) ........................................................................ 20 2.4.1. Generalidades del cultivo ....................................................................................... 20
2.4.2. Requerimientos del cultivo. ................................................................................... 21 3.- MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................................. 23 3.1. Materiales .................................................................................................................. 23 3.1.1. Lugar del ensayo .................................................................................................... 23
3.1.2. Duración del ensayo ............................................................................................... 23 3.1.3. Material vegetal ..................................................................................................... 23 3.1.4. Producción de plántulas ......................................................................................... 24
II
3.1.4.1. Inoculante Micorríticos ...................................................................................... 24 3.1.4.2. Inoculante Trichoderma ..................................................................................... 24 3.1.4.3. Bandejas ............................................................................................................. 25
3.1.4.4. Sustrato ............................................................................................................... 25 3.1.4.5. Fertirriego ........................................................................................................... 26 3.1.5. Cultivo. .................................................................................................................. 26 3.2. Metodología ............................................................................................................... 27 3.2.1. Semillero ................................................................................................................ 27
3.2.1.1. Siembra............................................................................................................... 27 3.2.1.2. Riego y fertilización. .......................................................................................... 27 3.2.1.3. Inoculación ......................................................................................................... 28
3.2.1.4. Tratamientos ....................................................................................................... 28 3.2.2. Cultivo ................................................................................................................... 29 3.2.2.1. Trasplante: .......................................................................................................... 29 3.2.2.2. Riego y fertilización. .......................................................................................... 29
3.2.2.3. Manejos del cultivo ............................................................................................ 30
3.2.3. Mediciones ............................................................................................................. 31 3.2.3.1. Semillero ............................................................................................................ 31 3.2.3.2. Parámetros Microbiológicos. ............................................................................. 31
3.2.3.3. Parámetros Físicos.............................................................................................. 35 3.2.3.4. Parámetros Bioquímicos .................................................................................... 36
3.2.4. Cultivo ................................................................................................................... 37 3.2.5. Diseño Experimental y Análisis Estadístico .......................................................... 38
4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN. .............................................................................. 39 4.1. Análisis de viabilidad de los productos comerciales utilizados. ............................... 40
4.2. Resultados de la etapa de semillero ........................................................................... 41 4.2.1. Análisis microbiológico ......................................................................................... 41 4.2.1.1. Glomus intraradices ........................................................................................... 41
4.2.1.2. Trichoderma harzianum ..................................................................................... 43 4.2.1.3. Interacción de Glomus y Trichoderma ............................................................... 44
4.2.2. Parámetros físicos y bioquímicos. ......................................................................... 45 4.2.2.1. Efecto de Glomus intraradices en los parámetros físicos y bioquímicos .......... 46
4.2.2.2. Efecto de Trichoderma harzianum en los parámetros físicos y bioquímicos .... 51 4.2.2.3. Efecto de la interacción de Glomus intraradices y Trichoderma harzianum .... 54
4.3. Discusión etapa de semillero ..................................................................................... 58 4.3.1. Análisis microbiológico ......................................................................................... 58 4.3.1.1. Inoculación solo con Glomus intraradices......................................................... 58 4.3.1.2. Variación poblacional de Trichoderma harzianum ............................................ 60 4.3.1.3. Interacción entre G. intraradices y T. harzanium .............................................. 61
4.3.2. Discusión de los parámetros de crecimiento y bioquímicos .................................. 64 4.3.2.1. Efecto de Glomus intraradices. .......................................................................... 64 4.3.2.2. Efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum. ..................................... 67 4.3.2.3. Efecto de la interacción de Glomus y Trichoderma. .......................................... 69
4.4. Cultivo ....................................................................................................................... 72 4.4.1. Análisis microbiológico ......................................................................................... 76 4.4.1.1. Glomus intraradices ........................................................................................... 76
4.4.1.2. Trichoderma harzianum ..................................................................................... 77
III
4.4.1.3. Interacción de Glomus y Trichoderma ............................................................... 78 4.4.2. Parámetros físicos y bioquímicos. ......................................................................... 80 4.4.2.1. Efecto de Glomus intraradices en los parámetros físicos y bioquímicos .......... 80
4.4.2.2. Efecto de Trichoderma harzianum en los parámetros físicos y bioquímicos .... 83 4.4.2.3. Efecto de la interacción de Glomus intraradices y Trichoderma harzianum .... 86 4.4.3. Discusión de los análisis microbiológicos ............................................................. 89 4.4.3.1. Inoculación solo con Glomus intraradices......................................................... 89 4.4.3.2. Variación poblacional de Trichoderma harzianum. ........................................... 90
4.4.3.3. Interacción entre G. intraradices y T. harzianum .............................................. 91 4.4.4. Discusión de los parámetros de crecimiento y bioquímicos .................................. 93 4.4.4.1. Efecto de Glomus intraradices ........................................................................... 93
4.4.4.2. Efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum. ..................................... 95 4.4.4.3. Efecto de la interacción de Glomus y Trichoderma. .......................................... 96 5.- CONCLUSIONES ..................................................................................................... 98 6.- BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................... 100
7.- ANEXO ................................................................................................................... 115
7.1. Semillero .................................................................................................................. 115 7.2. Cultivo ..................................................................................................................... 116 7.3. Mediciones microbiológicas .................................................................................... 117
7.4. Mediciones bioquimicas .......................................................................................... 119
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1.- Clasificación taxonómica de T. harzianum. ....................................................... 15 Cuadro 2.- Superficie nacional de melones. ......................................................................... 20 Cuadro 3.- Temperaturas críticas para melones en sus distintas fases de desarrollo. .......... 22 Cuadro 4.- Propiedades físico - químicas de MYCOSYM Tri-ton ®. ................................. 24 Cuadro 5.- Propiedades físico - química de Tricho – D ®. .................................................. 25
Cuadro 6.- Propiedades físico – químicas de los sustratos. .................................................. 25 Cuadro 7.- Características químicas del agua de riego de la Estación Experimental
Canchones. .................................................................................................................... 26
Cuadro 8.- Disolución (meq L-1
) a utilizar en plántulas de melón Honeydew (tipo
Inodorus). ...................................................................................................................... 27 Cuadro 9.- Tratamientos establecidos para la inoculación de las plantas de melón con
Glomus intraradices y Trichoderma harzanium. .......................................................... 29
Cuadro 10.- Disolución (meq L-1
) a utilizar en el cultivo de melón (tipo Inodorus) desde
entutorado a floración.................................................................................................... 30 Cuadro 11.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Glomus intraradices. ...................................... 48
Cuadro 12.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con G. intraradices a los 50 días de siembra. ............................................. 49
Cuadro 13.- Indicadores Bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con G. intraradices a los 50 días de siembra. ............................................. 50
Cuadro 14.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Trichoderma harzianum. ................................ 52
Cuadro 15.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra. ............................... 53 Cuadro 16.- Indicadores bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra. ............................... 53 Cuadro 17.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum.
....................................................................................................................................... 55
Cuadro 18.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum a los 50 días de
siembra. ......................................................................................................................... 56 Cuadro 19.- Indicadores Bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum a los 50 días de
siembra. ......................................................................................................................... 57 Cuadro 20.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Glomus intraradices. ............ 82 Cuadro 21.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con G. intraradices, a los 118 días postrasplante. ........................................ 83 Cuadro 22.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Trichoderma harzianum. ...... 85 Cuadro 23.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con T. harzianum, a los 118 días postransplante. ......................................... 85
V
Cuadro 24.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Glomus intraradices y
Trichoderma harzianum. ............................................................................................... 87
Cuadro 25.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con G. intraradices y T. harzianum, a los 118 días postrasplante................ 88
VI
INDICE DE FIGURAS
Figura 1.- Ciclo vital de los hongos MA y estructuras características de las fases intra y
extrarradical (Cornejo, 2006). ....................................................................................... 10 Figura 2.- Transporte de nitrógeno, fosfato y carbohidratos entre el hongo micorritico
arbuscular y la planta (Siddiqui et al., 2008). ............................................................... 13 Figura 3.- Aspecto macroscópico de T. harzianum. Crecimiento blanco característico de la
producción de micelio durante los primeros días (Izquierda), posteriormente abundante
producción de esporas de color verde (Derecha). ......................................................... 16 Figura 4.- Puntuación del grado de colonización micorritica según clasificación desde 0 a 5.
....................................................................................................................................... 32 Figura 5.- Metodología preparación diluciones seriadas ...................................................... 33 Figura 6.- A: Raíz de melón micorrizada, se observan esporas fúngicas en el interior (40X).
B: Unidades formadoras de colonias de Trichoderma harzianum. ............................... 40
Figura 7.- Porcentaje de micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los 50
días inoculadas con G. intraradices. Letras distintas en cada barra representan
diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05). ............................................ 42 Figura 8.- Efecto de la dosis de esporas de G. intraradices sobre el porcentaje de
micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los 50 días de siembra. . 42 Figura 9.- Formaciones de colonias de T. harzianum por gramo de suelo seco en melón
Inodorus var. Honeydew a los 50 días de siembra. Letras distintas representan
diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05). ............................................ 43
Figura 10.- Porcentaje de micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los
50 días de siembra inoculados con G. intraradices y T. harzianum. Letras distintas en
cada barra representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05). ....... 44 Figura 11.- Unidades formadoras de colonia por gramo de suelo seco en melón Inodorus
var. Honeydew a los 50 días de siembra inoculadas con T. harzianum y G.
intraradices. Letras distintas representan diferencias significativas según el Test de
LSD (p<0,05). ............................................................................................................... 45
Figura 12.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con G.
intraradices. (A) Peso seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces
(g). (D) Peso seco total (g). Letras distintas en cada barra representan diferencias
significativas según el Test de LSD (p<0,05). .............................................................. 46
Figura 13.- Efecto de la inoculación con G. intraradices en la acumulación de biomasa seca
radical (%),| en plántulas de melón tipo Inodorus cv. Honeydew Orange Flesh a los 50
días de siembra. ............................................................................................................. 47 Figura 14.- Efecto de la inoculación con G. intraradices en la relación Peso seco raíz / Peso
seco vástago, en plántulas de melón tipo Inodorus cv. Honeydew Orange Flesh a los 50
días de siembra. ............................................................................................................. 50 Figura 15.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con T.
harzianum. (A) Peso seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces (g).
(D) Peso seco total (g). Letras iguales en cada barra no representan diferencias
significativas según el Test LSD (p>0,05). .................................................................. 52 Figura 16.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con Glomus
intraradices y Trichoderma harzianum. (A) Peso seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo
VII
(g). (C) Peso seco raíces (g). (D) Peso seco total (g). Letras distintas en cada barra
representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05). ........................ 54 Figura 17.- Temperaturas promedios diarias registradas durante la etapa de cultivo (Abril a
Agosto del 2008). Estación Experimental Canchones. ................................................. 73 Figura 18.- A: síntomas de declinación general en plantas de melón atacada por Fusarium.
B: síntomas en el tallo de la planta de melón. ............................................................... 74 Figura 19.- A: crecimiento de micelio de Fusarium proveniente de las muestras vegetales
de melón. B: macroconidios septados de Fusarium (100x). ......................................... 75
Figura 20.- A: crecimiento de Fusarium a partir de la muestra de sustrato sin uso. B:
resiembra en placas Petri del crecimiento de Fusarium aislado desde la muestra de
turba. Laboratorio de Fitopatología Departamento de Agricultura y Biotecnología,
Universidad Arturo Prat ................................................................................................ 75 Figura 21.- Porcentaje de micorrización con G. intraradices en raíces de melón Inodorus
var. Honeydew a los 118 días desde el trasplante. Letras distintas en cada barra
representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05). ........................ 76
Figura 22.- Variación del porcentaje de micorrización con G. intraradices entre el muestreo
a los 50 días de siembra (Semillero) y a los 118 postrasplante. .................................... 77 Figura 23.- Valores medios para el logaritmo10 de unidades formadoras de colonia de T.
harzianum por gramo de suelo seco en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew a
los 118 días postransplante. Letras distintas representan diferencias significativas
según el Test de LSD (p<0,05). .................................................................................... 77
Figura 24.- Porcentaje de micorrización con G. intraradices y T. harzianum en raíces de
melón Inodorus var. Honeydew a los 118 postrasplante. Letras iguales en cada barra no
son estadísticamente diferente según el Test de LSD (p>0,05). ................................... 78 Figura 25.- Variación del porcentaje de micorrización entre el muestreo a los 50 días
(semillero) y 118 días postrasplante de melón derivado de la inoculación con G.
intraradices y T. harzianum. ......................................................................................... 79 Figura 26.- Valores medios para el logaritmo10 de unidades formadoras de colonia con T.
harzianum y G. intraradices por gramo de suelo seco en el cultivo de melón Inodorus
var. Honeydew a los 118 postransplante. Letras distintas representan diferencias
significativas según el Test de LSD (p<0,05). .............................................................. 80 Figura 27.- Producción de biomasa seca en plantas de melón inoculadas con G.
intraradices. (A) Peso seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces
(g). (D) Peso seco total (g). Letras distintas en cada barra representan diferencias
significativas según el Test de LSD (p<0,05). .............................................................. 81 Figura 28.- Producción de biomasa seca en la etapa de cultivo en melón inoculadas con T.
harzianum. (A) Peso seco hoja (gr). (B) Peso seco de tallo (gr). (C) Peso seco raíces
(gr). (D) Peso seco total (gr). Letras iguales en cada barra no son estadísticamente
diferentes según el Test de LSD (p>0,05). .................................................................... 84
Figura 29.- Producción de biomasa seca en la etapa de cultivo en melón inoculadas con G.
intraradices y T. harzianum. (A) Peso seco hoja (gr). (B) Peso seco de tallo (gr). (C)
Peso seco raíces (gr). (D) Peso seco total (gr). Letras iguales en cada barra no son
estadísticamente diferentes según el Test de LSD (p>0,05). ........................................ 86
Figura 30.- Disposición espacial de los tratamientos. ....................................................... 115 Figura 31.- A: Características morfológicas de las plántulas de melón según tratamientos;
B: Comparación entre planta testigo (izquierda) y planta tratamiento T2 (derecha). .. 115
VIII
Figura 32.- A: Túnel construido en el interior del invernadero en la etapa de cultivo; B:
Disposición espacial de los tratamientos en la etapa de postransplante. ..................... 116 Figura 33: A: Plantas de melón Inodorus a los 15 días postransplante; B: Plantas de melón
a los 35 días postransplante. ....................................................................................... 116 Figura 34.- Estructuras fúngicas de Glomus intraradices colonizando las raíces, tinción con
azul de Tripan. A: Raíz no micorrizada de tratamiento testigo (40X); B: Raíz
micorrizada (40X); C: Esporas (100X); D: Vesículas (100X); E: Arbúsculos (100X); F:
Micelio intrarradical (100X). ...................................................................................... 117
Figura 35.- Crecimiento de microorganismos a partir de la muestra del sustrato utilizado en
la investigación. ........................................................................................................... 118 Figura 36.- A: Unidades formadoras de colonias de T. harzianum; B: Estructura
morfológica de Trichoderma. ...................................................................................... 118 Figura 37.- Recta de calibración para nitrato reductasa, rango de 0 a 4 µM, elaborada con
NaNO2. ....................................................................................................................... 119 Figura 38.- Determinación de nitrato reductasa. ................................................................ 119
IX
AGRADECIMIENTOS
Centro De Investigación Avanzada En Recursos Hídricos y Sistemas Acuosos (CIDERH)
CONICYT-REGIONAL R09I1001.
Al Departamento de Agricultura del Desierto y Biotecnología Dependiente de la
Universidad Arturo Prat del Estado de Chile.
Al Dr. Jorge Olave Vera, por darme la oportunidad de realizar mi tesis de pregrado con el y
confiar en mis capacidades, por darme animo cuando todo se nublaba y por todo el
conocimiento que me ha entregado, sinceramente muchas gracias.
Al Dr. Víctor Tello Mercado, por su constante apoyo y su buena disposición ante mis
dudas.
Al departamento de Química y Farmacia de la Universidad Arturo Prat, especialmente al
cuarto piso.
A la profesora Rossana Leyton, por su gran apoyo de forma desinteresada y a ella le debo
que gran parte de la tesis resulto con éxito, gracias por enseñarme la importancia de la
Química analítica.
A la Dra. Venecia Herrera por permitirme realizar parte de mis ensayos en laboratorio de
Química Ambiental.
A Violeta Maturana y Paola Araneda, por su constante apoyo, por sus palabras de aliento,
por esas tardes de conversaciones tratando de cambiar el mundo y por toda su compresión y
cariño.
A mis compañeros de trabajo del Centro de Investigación y Desarrollo en Recursos
Hídricos (CIDERH).
A todas las personas que han hecho posible que cumple este sueño, seria muy difíciles
nombrarlas, pero que han colaborado de forma especial con su amistad, su motivación
X
DEDICATORIA
A mi familia, especialmente a mi Padre,
por su gran ejemplo de vida y apoyo incondicional.
1
RESUMEN
Diferentes investigaciones establecen que los hongos micorrizicos arbusculares y saprofitos
promueven el crecimiento en los cultivos, mejorando la absorción de agua y nutrientes e
incrementan la resistencia a situaciones de estrés. El objetivo de esta investigación fue
evaluar la inoculación con dos clases de hongos (Glomus intraradices Shenck y Smith. y
Trichoderma harzianum Rifai) en el cultivo de melón tipo Inodorus. Esta investigación fue
realizada en un invernadero semiclimatizado ubicado en la Estación Experimental
Canchones - Pampa del Tamarugal. Se utilizaron bandejas de plástico termoformado de 72
alvéolos y como sustrato una mezcla de turba más perlita en una proporción 70:30. Los
tratamientos evaluados fueron un Control (T0), Glomus intraradices a una dosis de 20, 40 y
80 esporas*planta-1
aplicado al momento de la siembra (T1, T2 y T3); Trichoderma
harzianum 1.5 g*bandeja-1
aplicado al momento de la siembra (T8) y quince días después
(T4); y una mezcla de Glomus intraradices a una dosis de 20, 40 y 80 esporas*planta-1
+
Trichoderma harzianum 1.5 g*bandeja-1
aplicado en siembra (T5, T6 y T7). Se tomaron
muestras en la etapa de semillero a los 50 días postsiembra y en la etapa de cultivo a los
118 días postrasplante. Los resultados obtenidos en la etapa de semillero con un promedio
de 6 hojas verdaderas por planta determinaron un efecto positivo de la aplicación de
Glomus intraradices a una dosis de 40 esporas*planta-1
presentando un mayor porcentaje de
micorrización (T2), altos niveles de micorrización se relacionaron positivamente con altos
valores en la acumulación de materia seca en la raíz, la acumulación de materia seca total,
el diámetro de tallo y la relación Peso seco raíz/Peso seco vástago, igualmente se
relacionaron positivamente con bajos valores de la superficie foliar específica e índice de
ahilamiento. La inoculación con Trichoderma harzianum y con la mezcla de Glomus-
Trichoderma no tuvieron un efecto real como promotor de crecimiento en la etapa de
semillero. La producción de plántulas con buenas condiciones para trasplante generó una
buena respuesta en la etapa de cultivo, siendo el T2 el tratamiento que obtuvo la mejor
respuesta.
2
ABSTRACT
Different researches establish that arbuscular mycorrhizal fungi and saprophyte better the
crops’ growth, improving the water and the nutrients intake and also increase the resistance
to the conditions of stress. The objective of this research was to evaluate the inoculation
with two types of fungi (Glomus intraradices Shenck y Smith. and Trichoderma harzianum
Rifai) in the cultivation of the Inodorous type Muskmelon. This research was performed in
a semi-acclimatized greenhouse located in the experimental station of “Canchones” in the
Pampa of Tamarugal. Plastic trays with 72 slots and a mixture of peat moss and pearlite as
the substrate in a proportion of 70:30 have been used. The evaluated treatments were: a
Control (T0) , Glomus intraradices at doses of 20, 40 and 80 spores*plant applied during
sowing stages (T1, T2 and T3); Trichoderma harzianum (1.5 g*tray) applied at the sowing
stage (T8) and fifteen days after the sowing stage (T4) ; and a mixture of Glomus
intraradices at a dose of 20, 40 and 80 spores*plant and Trichoderma harzianum (1.5
g*tray) applied in the sowing stages (T5, T6 y T7). The samples were taken at the seedling
stage of 50 days and at post- transplantation stage of 118 days. The results obtained in the
seedling stage with an average of 6 leaves per plant determined a positive effect in the
application of Glomus Intraradices at a dose of 40 spores*plant presenting a greater
percentage of mycorrhization (T2), high levels of mycorrhization were positively related
with high levels of dry matter accumulation in the root, total dry matter accumulation, stem
diameter and the ratio of dry root weight/dry bud weight. A positive relation is also
observed with lower values of the specific leaf area and slenderness index. The inoculation
with Trichoderma harzianum and with the mixture of Glomus-Trichoderma did not have a
significant effect as a growth enhancer in the seedling stage. The production of the
seedlings with good transplantation properties generated a good response in the cultivation
stage, with T2 being the treatment with the best results in this stage.
3
1.- INTRODUCCION
El suelo está formado por cinco componentes principales: minerales, agua, aire, materia
orgánica y microrganismos, cuya proporción varía según cada tipo de suelo. El suelo
constituye un gran reservorio de microrganismos que producen efectos benéficos para las
plantas y otros microrganismos que producen graves enfermedades a los cultivos
implicando grandes pérdidas económicas. La microbiológica del suelo se ha estado
estudiando con el fin de mejorar la productividad agrícola de una manera sustentable.
Los beneficios que ofrece la microbiota a la agricultura se basa principalmente en la
disminución del uso de productos químicos, uso eficiente del agua, mejoras en los
rendimientos potenciales, estimular los procesos biogeoquímicos liberando nutrientes y
compuestos orgánicos que mejoran la calidad de los suelos , permitir una mejor respuesta
de las plantas a suelos fuertemente degradados y conferir a las plantas una gran tolerancia a
suelos contaminados con metales pesados y suelos altamente salinos.
Estos microrganismos se clasifican en dos grupos: los microrganismos promotores del
crecimiento vegetal (PGPM) y agentes de control biológico (BCA). Los dos grupos poseen
efectos beneficiosos que aumentaría su utilidad como bio-inoculantes. Los PGPM, como
Rhizobium y Glomus spp., promueven el crecimiento y la productividad de la planta (efecto
primario) sintetizando hormonas que estimulan un mayor crecimiento, solubilizando
nutrientes independiente del pH del suelo incrementando su disponibilidad, mejorando la
absorción del agua e incrementando la resistencia en situaciones de stress hídrico, suelos
salino y pH elevado, pero también juegan un papel importante en la reducción de
enfermedades (efecto secundario). Por el contrario, BCA, tales como Trichoderma y
Pseudomonas sp son agentes controladores de enfermedades (efecto primario) parasitando
e inhibiendo el crecimiento de hongos patógenos, pero se ha demostrado que tienen un
efecto estimulante en el crecimiento de las plantas (efecto secundario) degradando la
materia orgánica del suelo y dejando disponible nutrientes para las plantas.
4
Entre estos microrganismos están los hongos formadores de simbiosis con las raíces de las
plantas superiores (hongos micorríticos). Estos hongos simbiontes permiten a las plantas
una mayor exploración de la superficie útil del suelo a través de la producción de micelios
externos conectados al sistema radical, aumentado la absorción de nutrimentos y agua, y a
la vez el hongo recibe de la plantas compuestos carbonatados que provienen de la
fotosíntesis que son necesarios para completar su ciclo de vida.
Trichoderma sp es un hongo cosmopolita y saprofito que habita en el suelo degradando
restos vegetales, es dominante en el suelo debido a su agresividad y su capacidad
metabólica para competir en una gran variedad de hábitats. Trichoderma sp. es un hongo no
micorrítico que estimula el crecimiento de las plantas, mejora el desarrollo radicular e
induce resistencia a las plantas frentes a diversas enfermedades.
Se han encontrado interacciones positivas y negativas al realizar inoculaciones con G.
intraradices y T. harzianum, diferentes especies de Trichoderma pueden mejorar el
simbionte micorrítico y a la vez esta interacción tiene influencia directa sobre el
crecimiento de las plantas, por otro parte se han encontrado efectos detrimentales sobre el
porcentaje de micorrización y por ende un efecto neutro o detrimental en el crecimientos de
las plantas.
Las plantas que se producen en los semilleros de la zona norte no presentan una óptima
calidad al momento de ser llevadas a terreno, presentándose plantas con menor porcentaje
de prendimiento, desuniformidad en el crecimiento y con diferentes grados de stress, lo que
se traduce en una pérdida importante en la producción y en la calidad de los frutos, esto esta
dentro de la problemática a la cual se propone dar una solución.
Basados en los antecedentes anteriores se quiere validar la utilización de Glomus
intraradices y Trichoderma harzianum como complemento a la fertilización en la
producción de semilleros y de cultivo, en melón.
5
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. Objetivo general:
Evaluar el efecto de la inoculación con dos clases de hongo (Glomus intraradices,
Shenck y Smith. y Trichoderma harzianum, Rifai) en un cultivo de melón, bajo un
mismo sustrato y nivel de fertilización.
1.1.2. Objetivo específico:
Evaluar el efecto de Trichoderma harzianum en la producción de plántulas y en la
etapa de cultivo.
Evaluar el efecto de Glomus intraradices en la producción de plántines y en la etapa
de cultivo.
Evaluar el efecto de la interacción Glomus + Trichoderma en la producción de
plántulas y en la etapa de cultivo.
1.1.3. HIPOTESIS.
La inoculación con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum en forma independiente
o asociado producirá un mayor crecimiento y vigor en la etapa de semillero y de cultivo.
6
2.- REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. El suelo
El suelo es a menudo definido como la capa superficial de la corteza terrestre explorada por
las raíces de las plantas, está compuesto principalmente por una fase sólida, formada por
materia orgánica y mineral; una fase líquida y una fase gaseosa. La materia mineral viene
dada por las rocas del subsuelo y los procesos edáficos que hayan tenido lugar en su
formación y la materia orgánica procede de la actividad de los organismos vivos del suelo,
su composición y cantidad difieren según las características de cada suelo (Franco, 2008).
En este sistema complejo del suelo habitan una gran cantidad y variedad de especies
vegetales, animales y microbianas, estableciéndose relaciones entre sí de diversas formas
variadas y complejas, contribuyendo a generar la clasificación de los suelos con
características propias mediante la modificación de las fases sólida, líquida y gaseosa del
mismo (Ben-Omar et al., 1997; Nogales, 2005).
2.1.1. El suelo y sus componentes microbiológicos
El suelo contiene una amplia variedad de microrganismos (Paul y Clark 1989); los cuales se
dividen generalmente en cinco grandes categorías taxonómicas: algas, bacterias, hongos,
protistas y virus (Hurst, 2002.).
Los tres principales grupos de microorganismos, son clasificados según sus relaciones con
las plantas (Barea y Azcón-Aguilar, 1982):
(a) saprofitos, microorganismos que obtienen su fuente nutricional a partir de
compuestos orgánicos procedentes de residuos animales, vegetales o microbianos.
7
(b) simbiontes parasíticos o "patógenos", causantes de enfermedades a las plantas, y
causantes de pérdidas considerables en la agricultura.
(c) simbiontes mutualistas o simplemente "simbiontes", como se les denomina en la
literatura científica, los cuales benefician el desarrollo y nutrición vegetal. Entre los
simbiontes más importantes se encuentran los hongos formadores de micorrizas.
Los microorganismos del suelo desempeñan una función importante en el mantenimiento
de la estabilidad del agrosistema, contribuyendo a la fertilidad del suelo, a la estructura y
biodiversidad y tienen un real efecto sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas (Avis
et al., 2008). Según Nogales (2005), los microorganismos tienen una gran importancia en
las características edáficas de los suelos; ciclos biogeoquímicos de elementos como el
carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo, hierro y otros metales; fertilidad de las plantas
y protección frente a patógenos; degradación de compuestos xenobióticos y producción de
fitohormonas.
2.2. Micorrizas
2.2.1. Conceptos generales sobre las micorrizas
Hace aproximadamente 500 a 600 millones años (periodo Devónico temprano), las
primeras asociaciones terrestres mutualistas fueron entre algas fotosintéticas y hongos
terrestres (Redecker et al., 2000). Estos primeros colonizadores de la tierra, presente antes
de la evolución de las plantas superiores, desarrollaron mecanismos para alimentarse de los
nutrientes minerales en el adverso ambiente de la Tierra primitiva (Schüßler, 2002; Janos,
2007; Jordan et al., 2008).
Los hongos formaban micelios finos se dispersaban ampliamente en todo el suelo captando
nutrientes, compitiendo con éxito con otros organismos, y produciendo enzimas para
obtener minerales y nutrientes orgánicos. En este proceso los hongos incrementaban la
absorción de nutrientes más allá de los requeridos por su metabolismo para su uso
8
inmediato, como una medida segura contra la escasez (Brundrett, 2002). Bajo altas
concentraciones de CO2 ambiental y con poca competencia por energía solar, estas algas
evolucionaron rápidamente con estructuras complejas muy similares a las briófitas de hoy
en día con pocas hojas o ramas y raíces subdesarrolladas (Pirozynski y Mallock, 1975;
Brundrett, 2002). Estas primeras plantas aumentaron su capacidad fotosintética y
produjeron grandes cantidades de compuestos de carbono para alimentar a los hongos del
suelo y a la vez los hongos traspasaban nutrientes a las plantas que obtenían del suelo.
Finalmente se llegó a un equilibrio mutualista, con el cual pudieron evolucionar utilizando
material que cada integrante poseía en exceso, traspasando material de uno individuo a
otro, conociéndose hoy en día como simbiosis micorrítica (Redecker et al, 2000; Brundrett,
2002); lo que dio la posibilidad de asentamiento de las plantas al medio terrestre con gran
éxito.
En 1993, el banco mundial de glomeromycota afirmo: "El estudio de las plantas sin sus
micorrizas es el estudio de una sola parte, la mayoría de las plantas, en sentido estricto, no
tienen raíces tienen micorrizas" (Schüßler et al., 2007).
Hoy en día el término micorrizas define como una asociación simbiótica mutualista entre
ciertos hongos del suelo y la mayoría de las plantas que existen en la naturaleza. El 80-90%
de las familias botánicas forman esta asociación simbiótica (Smith y Read, 1997). El
término “micorriza”, procedente del griego “mykos”, hongo y “rhiza”, raíz, fue utilizado en
primera instancia por Frank en el año 1885, pero hasta mediados del siglo XX no se
empezó a poner de manifiesto el significado y la importancia de estas asociaciones, así
como su presencia en la casi totalidad de los ecosistemas suelo–planta (Barea y Jeffries,
1995; Azcón y Barea, 1997; citado por Franco, 2008)
El hongo ayuda a la planta a captar nutrientes más allá de la zona de agotamiento, mejorar
la absorción de agua, aumentar la resistencia a condiciones de estrés y a cambio la planta le
cede al hongo azucares formados durante el proceso de fotosíntesis. El mantenimiento de
esta asociación simbiótica se debe principalmente al papel crucial que el hongo desempeña
en la nutrición mineral de la planta colonizada, de forma que fue posiblemente el
9
establecimiento de esta simbiosis lo que posibilitó la colonización de la superficie terrestre
por las plantas (Simón et al., 1993; Redecker et al., 2000).
2.2.2. Micorrizas arbusculares
Las micorrizas arbusculares, las forman entre el 80 y el 85% de todas las plantas vasculares
y un pequeño grupo de hongos del phylum Glomeromycota (Smith y Read 1997). Los
Glomales son el único grupo monofilético que ha evolucionado conjuntamente con las
plantas terrestres desde su aparición, debido a esta estrecha relación con las plantas estos
hongos son simbiontes obligados (Kandula et al., 2006).
Según lo señalado en párrafos precedentes la mayoría de las plantas silvestres o cultivadas
forman micorrizas arbusculares, entre las plantas de interés agronómico están los cultivos
de cereales, leguminosas, hortícolas y frutales (Smith y Read, 1997).
2.2.3. Colonización de las raíces
El éxito de la simbiosis se basa en un adecuado establecimiento, desarrollo y extensión de
la simbiosis micorritica, siendo varios los factores bióticos y abióticos que afectan esta
simbiosis. Wang et al. (2010), depende de la especie de hongo micorritico y sus
características genéticas, y de la afinidad de este con la especie vegetal e incluso la afinidad
con el cultivar utilizado. Brundrett (2002), afirma que los factores que influyen en la
eficacia de la simbiosis, son la fisiología de las plantas y las propiedades de sus raíces, de
igual forma influye el grado de dependencia micorritica de la planta. Drew et al. (2006),
determinaron que Glomus mosseae tiene una mayor capacidad de exploración del suelo que
Glomus intraradices, lo que se traduce en una mayor capacidad de colonización.
En las micorrizas arbusculares la penetración del micelio se extiende por la endodermis y el
parénquima cortical, sin llegar a penetrar los tejidos vasculares y meristemáticos. Las raíces
micorrizadas no se pueden distinguir de las no micorrizadas a simple vista, ya que no hay
formación de manto ni modificaciones morfológicas evidentes en las raíces (Rodríguez,
10
2005). En una micorriza activa se considera que existe una fase extrarradical del hongo, el
micelio externo, que incluye micelio, esporas y células auxiliares en su caso y una fase
intrarradical del mismo, con hifas intra e intercelulares, arbúsculos y a veces vesículas
(Medina, 2006) (Figura 1).
Figura 1.- Ciclo vital de los hongos MA y estructuras características de las fases intra y
extrarradical (Cornejo, 2006).
2.2.4. Colonización del suelo
La fase externa de la simbiosis está compuesta por una red de hifas que se desarrollan en el
suelo circundante a las raíces. Esta red se forma simultáneamente con la colonización
intrarradical del hongo. El micelio externo es altamente ramificado funcionando como un
sistema radical complementario, de alta efectividad, tiene como función fundamental y
principal la captación de nutrientes y agua más allá de la zona de agotamiento, explorando
microhábitats inaccesible para las plantas (Peterson et al., 2004). Estudios realizados en
condiciones controladas han demostrado que por cada metro de raíz se producen alrededor
de 7 y 259 m de micelio externo (Barea et al., 1991; Smith y Read 1997).
11
2.2.5. Efecto de las micorrizas arbusculares en los cultivos
2.2.5.1. Mejora del estado nutricional de las plantas
Uno de los aspectos más estudiados de las micorrizas arbusculares es la mejora en la
nutrición mineral, debido a la importancia que tiene en el desarrollo vegetal, teniendo una
gran implicación en áreas tan diversas como la nutrición humana, la agricultura sustentable
y en la diversidad de los ecosistemas terrestres.
La mejora nutricional que ocasiona a la planta el establecimiento de la simbiosis se debe a
varias causas, como son:
i) el aumento del volumen de suelo explorado, actuando las hifas como un
sistema radical complementario altamente efectivo; esto se verifica sobre
todo en nutrientes que se difunden con dificultad en la solución del suelo
ii) una mayor competitividad de las hifas del hongo con respecto a otros
microorganismos del suelo que la presentada por las propias raíces
iii) una mayor especificidad de los transportadores del hongo respecto de los
de la planta, y
iv) la posibilidad de absorber fuentes de nutrientes minerales no disponibles
(Sanders y Tinkers (1973); Barea (2005); Linderman (1992); Cress et al.,
(1979); Swaminathan (1979); y Clark y Zeto (2000), (Citado por, Cornejo
2006)).
Las micorrizas arbusculares transportan varios elementos desde el suelo hasta la planta
hospedadora. La simbiosis mejora la captación de fósforo, calcio, cobre, azufre, zinc y
hierro, y esto es especialmente importante en el caso de los elementos inmóviles como
fósforo, zinc y cobre, ya que su disponibilidad para la planta es limitada (Smith y Smith,
1997). Además de absorber PO4-2
, Bürkett y Robson (1994); Tobar et al., (1994); Smith et
al., (2001), han confirmado que el micelio externo de los hongos MA, absorben N-NO3- y
12
N-NH4+ desde la solución suelo (mucho más allá de la zona de agotamiento) y
transferírselos a las plantas con las que están asociados.
2.2.5.2. Nutrición nitrogenada
Los hongos micorríticos arbusculares tienen la capacidad de mejorar la nutrición
nitrogenada absorbiendo N-N03-, N-NH4
+ y N-orgánico (Hodge et al., 2001).
Probablemente la mayor afinidad de los hongos MA parece ser por el amonio, frente al
nitrato, como fuente de N (Johansen et al., 1992). Johansen et al., (1996) proponen que el
amonio absorbido se incorpora rápidamente al glutamato, dando origen a glutamina, y el
mecanismo más probable para que esto ocurra es a través del ciclo Glutamina
sintasa/Glutamato sintasa (GS/GOGAT).
En el caso del nitrato, la incorporación está asociada probablemente a un transporte de
protones (Bago et al., 1996). Se presume que en esta asimilación puede estar implicada la
enzima nitrato reductasa, encontrándose actividad de esta enzima en extracto de raíces
micorrizadas (Subramanian y Charest, 1998) y en esporas (Ho y Trappe, 1975). Tilak y
Dwivedi (1990), encontraron actividad enzimática de nitrato reductasa en clamidosporas
extrarradicales de Glomus fasciculatum, G. mosseae, G. intraradices, G. caledonium,
Gigaspora margarita, G. calospora, Endogone discii, y Acaulospora sp, en simbiosis con
pasto buffel (Cenchrus ciliaris L.), la capacidad de reducción de nitrato vario entre valores
de 1,5 hasta 3,8 mM en 200 clamidosporas 24 hrs-1
.
Bago et al. (2001) propone que para el proceso de transferencia de nitrógeno y la posterior
absorción por la planta, ocurre un proceso asociado al ciclo de la urea y al transporte de
polifosfatos, este proceso fue confirmado por Govindarajulu et al. (2005). El proceso
comienza con la absorción de amonio o nitrato, siendo este último transformado a amonio
mediante la nitrato reductasa, este amonio es convertido a glutamina por la acción de la
glutamina sintasa, la glutamina es convertida a arginina mediante la argininosuccinato
sintasa. Convertido como arginina es translocado al micelio intrarradical asociándose a la
13
trasferencia de polifosfatos. Una vez dentro de la fase intrarradical del hongo, la arginina
forma parte del ciclo de la urea, se libera urea y ornitina, que mediante la acción de la
ureasa y la ornitina aminotransferasa liberaran el amonio que será así transferido a la planta
(Govindarajulu et al., 2005; Jin et al., 2005) (Ver figura 2).
Figura 2.- Transporte de nitrógeno, fosfato y carbohidratos entre el hongo micorritico
arbuscular y la planta (Siddiqui et al., 2008).
14
2.3. Trichoderma
2.3.1. Generalidades de Trichoderma
Trichoderma sp. se describió por primera vez en al año 1974 por Persoon, es un hongo
cosmopolita, filamentoso, anamórfico, aerobio, heterótrofo y facultativo, se encuentra de
manera natural en suelos, en material vegetal y en la materia orgánica en descomposición
(Thornton et al., 2002). Pertenece a la subdivisión Deuteromicetes que se caracterizan por
no poseer o no presentar un estado sexual determinado. Se encuentra en la mayoría de los
suelos agrícolas y en suelos no perturbados, existiendo alrededor de 30 especies y todas
presentan efectos benéficos para la agricultura.
Las especies de Trichoderma varían según su distribución geográfica, siendo algunas
especies altamente distribuidas y otras son limitadas. Especies como T. harzianum se
encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial (Chaverri et al., 2003) y otras especies
que son muy restringidas como T. stromaticum que está presente solo en asociación con
árboles de cacao (Theobroma cacao) en América central (Samuels et al., 2000).
2.3.2. Clasificación Taxonómica
El género Trichoderma fue propuesto por Persoon en 1974, en 1979 Riffai agrego 9
especies más, posteriormente Biset eleva algunas categorías a rango de sección,
agrupándolas en 4 nuevas: Trichoderma, Hypocreanum, Longibrachiatum y Pachybasium.
Actualmente se tienen alrededor de 75 especies descritas, todas las clasificaciones
realizadas a través de análisis morfológicos. Otros métodos taxonómicos incluyen estudios
de metabolitos secundarios (Kuhls et al., 1997). Las características fisiológicas pueden
proporcionar un sistema útil para su identificación.
15
Lieckfeldt et al. (1998), evidencian que el género Trichoderma filogenéticamente es joven
y sigue evolucionando con muchas formas intermedias. La clasificación taxonómica del
hongo Trichoderma sp es la siguiente (Cuadro 1).
Cuadro 1.- Clasificación taxonómica de T. harzianum.
Súper Reino Eucariota
Reino Fungí
Filum Ascomycota
Subfilum Pezizomycotina
Clase Sordariomycetes
Subclase Hypocreomycetidae
Orden Hypocreales
Familia Hypocreaceae
Género Trichoderma
Lieckfeldt et al. (1998).
2.3.3. Ciclo de Vida de Trichoderma harzianum
El ciclo de vida de T. harzianum (Rifai), se inicia cuando el organismo crece y se ramifica
con una hifa fúngica que mide entre 5-10 µm de diámetro. Presenta conidióforos de color
verde, erguidos, con ramificaciones perpendiculares, formando en algunos casos ramas
laterales, posee masas de esporas en el ápice y con un tamaño de 60 a 110 µm de altura.
Fiálides cortas y gruesas con un tamaño de 7,2-9,8 × 2,4-2,7 µm, presentan hasta cuatro
conidios en el ápice. Conidios unicelulares con un tamaño aproximado de 2.1-3 µm de
diámetro la forma globosa, y las ovadas 6.4×2.8 a 4.8µm. Clamidosporas terminales e
intercalares, forma subglobosa, de color verde y un tamaño 10 -12.5 µm (Watanabe, 2002).
2.3.4. Aspecto Macroscópico
En etapas tempranas el crecimiento de T. harzianum (Rifai) presenta un color blanco y
posteriormente desarrolla un color verdoso, el blanco corresponde al crecimiento del
16
micelio y el color verde corresponde a la formación de fialosporas que en última instancia
se vuelven de un color verde opaco (Figura 3). Inicialmente se ve como una superficie lisa,
pero la formación de esporas aéreas, permite que se observe una superficie levemente
algodonosa. Así mismo, las colonias de T. harzianum crecen rápidamente bajo condiciones
favorables de temperatura (20ºC - 30ºC) con una temperatura óptima de 25ºC y un período
de incubación de 5 días con luz constante y un pH entre 3.7 y 6.0 (Domsch et al., 1980).
Figura 3.- Aspecto macroscópico de T. harzianum. Crecimiento blanco característico de la
producción de micelio durante los primeros días (Izquierda), posteriormente abundante
producción de esporas de color verde (Derecha).
2.3.5. Condiciones de Crecimiento de Trichoderma
Jensen y Wolffhechel (1995) determinaron que Trichoderma sp se encuentra en diferentes
hábitats y la presencia de variadas especies está directamente influenciada por las
condiciones ambientales. Entre los factores que afectan el crecimiento y desarrollo de las
diferentes cepas de Trichoderma se encuentran factores de tipo físico, químicos y
nutricionales.
2.3.5.1. Nutrición
Trichoderma obtiene fuentes de nitrógeno a partir de compuestos tales como aminoácidos,
urea, nitritos, amoniaco y sulfato de amonio. (Danielson y Davey, 1973; Wakelin et al.,
1999). Generalmente se sabe la necesidad de algunos elementos trazas para el crecimiento
17
de T. harzianum entre los cuales están el hierro, zinc, cobre, manganeso y molibdeno.
Concentraciones altas de cloruro de sodio inhiben el crecimiento de T. harzianum, donde la
salinidad afecta directamente la producción de esporas, ocasionando mutaciones y
perjudicando el proceso de conidiogénesis (Moore, 1996).
2.3.5.2. pH
Trichoderma harzianum puede completar su ciclo de vida en un amplio rango de pH entre
2.0 y 9.0, siendo el rango óptimo entre 4.0 a 7.0 (Gochenaur, 1970).
2.3.5.3. Temperatura
La mayoría de las especies de Trichoderma son mesófilas con una temperatura optima de
25ºC, pero pueden tener un crecimiento entre un rango de temperaturas que varían entre los
10 a los 40 ºC, siendo característico de zonas con temperaturas cálidas, tolerando
temperaturas entre los 30 a 38ºC, con una temperatura media óptima de 20ºC (Knudsen y
Bin, 1990).
2.3.5.4. Humedad
La presencia de humedad y un buen manejo del riego mejoran las condiciones del suelo
donde habitan muchos microorganismos, entre ellos Trichoderma, el cual puede
desarrollarse de manera óptima hasta en un 60% de la capacidad de campo. En suelos muy
saturados disminuyen el crecimiento y la sobrevivencia debido a la baja disponibilidad de
oxigeno (Agosin et al., 1997). Jackson et al. (1991), demostró que T. virens, T.
citrinoviride y T. viride disminuyeron la tasa de crecimiento del micelio a medida que el
potencial hídrico del suelo se hacía más negativo (-0.7 a -14.0MPa).
18
2.3.6. Promotor del crecimiento en los cultivos.
Se ha comprobado que T. harzianum estimula y mejora el crecimiento de las plantas, lo que
puede significar un posible aumento en los rendimientos. La rápida colonización de la
rizosfera y de las capas superficiales de las raíces permiten el control biológico y la
supresión de los hongos fitopatógenos del suelo, siendo una de las principales
características de T. harzianum, que por consecuencia de este Bio-control se estimula el
crecimiento de las plantas (Harman et al., 2004).
Además del efecto biocontrolador, varios mecanismos se han propuesto para explicar el
efecto promotor del crecimiento, entre ellos, Sutton y Peng (1993), señalan que T.
harzianum produce metabolitos que estimulan el crecimiento y desarrollo vegetal;
Windham et al. (1986), determinaron la producción de fitohormonas de crecimiento por
parte del hongo como el ácido 3-indol acético (AIA) y sus análogos, viéndose favorecido el
desarrollo radical.
Igualmente, T. harzianum tiene la capacidad de transformar una gran variedad de sustratos,
como los residuos lignocelulósicos convirtiéndolos en moléculas simples y fácilmente
degradables (Godes, 2007), de esta forma se liberan nutrientes al suelo.
Altomare et al. (1999), reporto la capacidad de solubilizar MnO2, Zn, Fe
+3, Cu
2 y fosforo a
partir de roca fosfatada. La cepa T-22 de T. harzianum reduce los iones metálicos
aumentando su disponibilidad e igualmente produce sideróforos, produciendo la quelación
del hierro. Además, Vinale et al. (2008), señala la producción de algunos ácidos orgánicos
como el ácido glucónico, ácido cítrico y fumárico que reducen el pH del suelo resultando
en la solubilización de los minerales.
Se han reportado aumentos en la producción de biomasa, mejora a la resistencia bajo
condiciones de estrés, mayor productividad e incremento en la absorción de nutrientes en
cultivos como el clavel, crisantemo, Tagetes, petunia, pepino, berenjena, guisante,
19
pimiento, rábano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, maíz, amapola, algodón, mijo,
frijol, cacao, pastos ornamentales y especies forestales (Hoyos-Carvajal et al., 2009).
Estudios realizados por Vinale et al. (2008) con T. harzianum para mejorar el
establecimiento de las plántulas hortícolas frente al trasplante, obteniendo como resultados
más relevantes mayor altura de planta, área foliar, peso seco y mejor vigor que induce a
superar periodos de estrés (bióticos y/o abióticos). Los resultados obtenidos tienen gran
importancia económica, ya que se acortan los periodos de crecimiento de las plantas y el
tiempo en los semilleros y generan un aumento en la productividad (Celar y Valic, 2005).
Por sus características como promotor del crecimiento en las plantas se utiliza
frecuentemente T. harzianum como un organismo biofertilizante en diferentes productos
comerciales y diferentes formulaciones (Moreno-Sarmiento et al., 2007).
2.3.7. Interacción hongo micorritico arbuscular – Trichoderma.
Fracchia et al. (1998), proponen que la interacción entre los hongos micorríticos y las
especies saprofitas del suelo pueden variar entre las especies del mismo género y Martínez
et al. (2004), proponen para que se produzca un efecto sinérgico del hongo saprofito como
estimulador de la micorrización va a depender de las características de ambos hongos.
Saldajeno et al. (2008), la interacción entre las micorrizas arbusculares y Trichoderma
harzianum y su efecto promotor de crecimiento de las plantas varía dependiendo de las
características inherentes de cada especie y cada cepa aislada.
Vivas et al. (2003), indican que si ambos microorganismos tienen un origen en común y
han crecido en un mismo suelo se puede conseguir un efecto positivo
20
2.4. Cultivo de melón (Cucumis melo L.)
La superficie del cultivo de melón en Chile es de 3097 hectáreas, (INE, 2008),
concentrándose entre las Regiones Metropolitana y del Maule. La Región del Libertador
Bernardo O´Higgins concentra el 50% de la superficie; y la Región de Tarapacá representa
un 2% (72 ha) (Escalona et al., 2009) (Cuadro 2).
Cuadro 2.- Superficie nacional de melones.
Región Superficie (ha)
XV de Arica y Parinacota 13
I de Tarapacá 72
II de Antofagasta 0
III de Atacama 53
IV de Coquimbo 83
V de Valparaíso 62
Región Metropolitana de Santiago 714
VI de O’Higgins 1.562
VII del Maule 492
VIII del Bío-Bío 46
Total 3.097
Fuente: INE, 2008
2.4.1. Generalidades del cultivo
Esta especie pertenece a la familia de las cucurbitáceas y su nombre científico es Cucumis
melo L., aunque algunos investigadores han intentado clasificarlo en variedades botánicas
(Münger y Robinson, 1991).
Las plantas de melón poseen un tallo de tipo rastrero con un sistema radical abundante y
ramificado, de crecimiento rápido. Además son herbáceos, pilosos, bastantes flexibles y
presentan zarcillos. El desarrollo del tallo principal se encuentra limitado por la aparición
de las ramas secundarias y por la fructificación. De las axilas de las hojas de este tallo
principal nacen las ramas de segundo orden, siendo las 3 y 4 primeras las más
21
desarrolladas. Las flores son pedunculadas y salen de las axilas de las hojas. Las flores
masculinas aparecen en primer lugar, sobre los entrenudos más bajos, mientras que las
pistiladas (femeninas y/o hermafroditas) empiezan a aparecer en las ramas de segundo o
tercer orden (Gómez et al., 1997).
La variedad utilizada en este estudio es Cucumis melo tipo. Inodorus, es una variedad de
frutos de piel lisa, de producción tardía, en la madurez el fruto permanece unido al
pedúnculo, de una larga vida postcosecha. A este grupo pertenecen varios tipos de melón
con características muy diversas, destacándose el sabor, tamaños de frutos de medio a
grande forma ovalada a esférica y por lo general de piel lisa a suave, el color del fruto varía
de blanco cremoso a amarillo crema, como característica específica de este cultivar es su
tolerancia a Mildiu (Podosphaera xanthii) raza 1 y 2, y a Fusarium oxisporum sp, melonis
raza 0 y 1 y sensible a Fusarium oxisporum sp, melonis raza 2 (Jett, 2006).
2.4.2. Requerimientos del cultivo.
La temperatura óptima de germinación está alrededor de 22-28°C. Las temperaturas del aire
críticas que detienen el desarrollo vegetativo son inferiores a 13-15°C, y a 1°C la planta se
hiela, las raíces se desarrollan poco cuando la temperatura del suelo es inferior a 8-10°C
(Cuadro 3). En la floración la temperatura adecuada para la cuaja de frutos, debe estar
comprendida entre 25 y 30° C. Además la temperatura y las horas luz influyen directamente
en el desarrollo de los tejidos del ovario de la flor; donde los días largos y altas
temperaturas favorecen la formación de flores masculinas; en cambio, los días cortos y
temperaturas moderadas favorecen la formación de flores femeninas (Escalona et al.,
2009). En cuanto a las necesidades de humedad ambiental esta especie en el primer
desarrollo vegetativo requiere de un 65 a 75 %, descendiendo a partir de la floración a un
60-70 %. Además, es una planta muy exigente en luminosidad, la cual influye bastante
sobre la floración (Cantón, 1999).
22
Cuadro 3.- Temperaturas críticas para melones en sus distintas fases de
desarrollo.
Helada 1ºC
Detención del crec. Vegetativo aire 15ºC
suelo 8ºC – 10ºC
Germinación
mínima 15ºC
óptima 22ºC – 28ºC
máxima 39ºC
Desarrollo óptima 20ºC – 23ºC
Floración óptima 25ºC – 30ºC
Maduración del fruto óptima 25ºC
Fuente: Cantón (1999).
Es una especie de moderada tolerancia a la salinidad tanto del suelo (CE de 2,2 dS.m-1
)
como del agua de riego (CE de 1,5 dS.m-1
), aunque cada incremento en una unidad sobre la
conductividad del suelo supone una reducción del 7,5% de la producción (Navarro, 2008).
23
3.- MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Materiales
3.1.1. Lugar del ensayo
La investigación se llevó a cabo en el invernadero semiclimatizado de la Estación
Experimental Canchones perteneciente al Departamento de Agricultura del Desierto y
Biotecnología de la Universidad Arturo Prat de Iquique, ubicado en la localidad de la
Huayca, comuna de Pozo Almonte, provincia del Tamarugal, Región de Tarapacá, Chile.
Se encuentra localizada a una altitud de 980 m.s.n.m; Latitud 20º26'34,2” S.; Longitud
69º32'7,9” W.
3.1.2. Duración del ensayo
El ensayo tuvo una duración de 168 días, considerando la etapa de semillero (50 días) y
cultivo (118 días).
3.1.3. Material vegetal
El ensayo se realizó con melón tipo Inodorus – cv. Orange Flesh Honeydew, comúnmente
llamado melón tuna. Son melones de invierno, cultivar adaptado a climas secos y cálidos.
Sus frutos presentan piel lisa, de forma ovalada, alto contenido en sólidos solubles, carne de
color naranjo, peso promedio entre 1,2 a 1,5 kg, de madurez tardía (70 a 80 días a
maduración) y buenas condiciones para su conservación durante periodos largos (García y
Centeno, 2002).
24
3.1.4. Producción de plántulas
3.1.4.1. Inoculante Micorríticos
La inoculación con Glomus intraradices se realizó con el producto MYCOSYM Tri-Ton ®
fabricado por la empresa Suiza, MYCOSYM International AG, y comercializado en Chile
por BioTriton S.A. cuyas características son las siguientes (Cuadro 4).
Cuadro 4.- Propiedades físico - químicas de MYCOSYM Tri-ton ®.
Componente activo Glomus intraradices (Shenck y Smith).
Contenido activo 150 esporas germinativas gr-1
Sustrato inerte Gránulos de arcilla expandida.
Dosis semillero 6-12 gr-1
litro de sustrato
Granulometría < 4 mm
Densidad aparente 270 - 300 Kg m-3
Humedad Max 6 %
N-amoniacal <0,01%
N-nítrico <0,01%
Fósforo <0,01%
Potasio <0,01%
pH 7,0 – 8,5
Carbón orgánico <0,01%
Fuente: http://www.mycosym.com (2011).
3.1.4.2. Inoculante Trichoderma
Para la inoculación con T. harzianum se utilizó el producto TRICHO D ® producido por la
empresa ORIUS Biotecnología, y comercializado en chile por Sanatrade S.A (Cuadro 5).
25
Cuadro 5.- Propiedades físico - química de Tricho – D ®.
Ingrediente activo Esporas en Latencia del hongo T. harzianum.
Nombre biológico Trichoderma harzianum.
Grupo de insumo Agente Biológico Bio-Fungicida y Bio-Regulador de
Fitopatógenos del suelo
Contenido activo 100 Millones de esporas germinativas gr-1
Formulación Polvo Mojable (WP)
Fuente: http://www.oriusbiotecnologia.com (2011).
3.1.4.3. Bandejas
Se utilizaron bandejas de plástico termoformado de 72 alvéolos con una capacidad de 3096
cc (43 cc cada alveolo), colocadas sobre una mesa de 40 cm de altura del suelo.
3.1.4.4. Sustrato
El sustrato utilizado en esta etapa fue una mezcla de Turba y Perlita en una proporción de
70:30% cuyas principales características son (Cuadro 6):
Cuadro 6.- Propiedades físico – químicas de los sustratos.
Propiedad Perlita1
Turba2
Densidad aparente (g cm-3
) 0,143 0,07
Espacio poroso total (% vol.) 85,9 96,0
Capacidad de aireación (% vol.) 29,1 41,0
Agua fácilmente disponible (% vol.) 24,6 25,0
Agua de reserva (% vol.) 7,0 6,0
Agua total disponible (%vol.) 31,6 31,0
Agua difícilmente disponible (%vol.) 25,2 24,0
pH 7,0-7,5 3,9
CE (dS m-1
) 0,4
C.I.C. (meq 100 g-1
) 1,5 – 2,5 99,0
Materia orgánica (%) 98,0 1B12 y
2Rubia
Abad y Noguera (1998)
26
3.1.4.5. Fertirriego
El fertirriego se realizó a través de un sistema presurizado automático compuesto por un
programador, un estanque de plástico con capacidad de 1.000 litros, una motobomba de 0,5
Hp, y 2 microjet de 360° con un caudal de 50 lph ubicados entre las bandejas a una
distancia de 1m entre microjet. Debajo de cada bandeja se colocaron cubetas receptoras de
drenaje, del cual se midió pH y C.E. Según los valores medidos se efectuó el ajuste de la
solución nutritiva a un pH entre 6,0 a 6,5 y 1,0 a 1,5 de C.E.; así como también el tiempo y
frecuencia del riego según el estado fenológico.
Para la preparación de la solución de fertirriego se utilizaron los siguientes fertilizantes:
nitrato de potasio (KNO3), nitrato de calcio [Ca (NO3)2], nitrato de magnesio [(Mg (NO3)2],
ácido fosfórico concentrado al 85% (H2PO4NH4+) y micronutrientes (Fetrilon Combi 2C)
aplicado según las recomendaciones del fabricante (0,01%) y cuya característica principal
es la ausencia de Boro.
El agua que se utilizó para la preparación de la solución de fertirriego presenta la siguiente
composición (Cuadro 7).
3.1.5. Cultivo.
Se utilizaron contenedores de polietileno negro con capacidad de 20 L, se utilizó la misma
mezcla de sustrato cambiando la proporción a 50-50%.
El fertirriego se realizó a través de un sistema presurizado automático compuesto por un
programador, un estaque de plástico con capacidad de 1.000 litros, una motobomba de 0,5
Hp y cintas de riego con goteros incluidos con un caudal de salida de 5 L h-1
. Los
Cuadro 7.- Características químicas del agua de riego de la Estación Experimental
Canchones.
Aniones (meq L-1
) Cationes (meq L-1
)
PO4= NO3
- SO4
= HCO3
- K
+ Ca
++ Mg
++ NH4
+ pH CE
0,0 0,07 4,28 0,8 0,19 3,54 0,12 0,0 7,95 1.44
1Fuente: AGROLAB (2008).
27
fertilizantes utilizados fueron los mismos de la etapa de semillero. Debajo de 5
contenedores elegidos al azar se colocaron platos plásticos receptores de drenaje de los
cuales se midió el pH y conductividad, con lo que se ajustaba la frecuencia y el tiempo de
riego.
3.2. Metodología
3.2.1. Semillero
3.2.1.1. Siembra
La siembra se realizó de forma manual a una profundidad de 1 cm, depositando una semilla
por alveolo.
3.2.1.2. Riego y fertilización.
Desde la emergencia de los cotiledones hasta la primera hoja verdadera el riego se realizó
solo con agua. A partir de la primera hoja formada se aplicó 1/3 de la concentración de la
disolución de fertirriego, en la segunda hoja formada 2/3 y de la tercera hoja formada hasta
el transplante la concentración final (Cuadro 8, DN1). Esta estrategia permite un
acondicionamiento de la planta y asegura una mejor respuesta de la plántula al
postransplante. La disolución nutritiva se ajustó a un pH entre 6,0 a 6,5, una C.E de 1,6 dS
m-1
equivalente a un Ψs de -0,067 Mpa y se midieron con una frecuencia de tres días para
efectuar los ajustes de frecuencia y el tiempo de riego.
Cuadro 8.- Disolución (meq L-1
) a utilizar en plántulas de melón Honeydew (tipo
Inodorus).
Disoluciones H
2PO
4
-
NO3
-
SO4
=
K+
Ca2+
Mg2+
NH4
+
DN1
1
1,25 7,50 2,50 3,25 5,00 2,50 0,5
1Steiner modificado (Casas, 2005);
2Cadahía (2000);
3Guzmán y Olave (2004);
4Disolución
ajustada con concentraciones de Cl- y Na
+ presentes en aguas de riego salinas.
28
3.2.1.3. Inoculación
La dosis a aplicar se preparó según las recomendaciones de los fabricantes.
a) Glomus intraradices
Para realizar la inoculación el producto fue pesado y aplicado a mano repartiendo el
producto equitativamente en cada alvéolo, según cada tratamiento (ver cuadro 9).
b) Trichoderma harzianum
La inoculación con Trichoderma se realizó con una bombona de 5 litros en una proporción
de 1,5 g bandeja-1
disuelto en 500 ml de agua.
Para los tratamientos T5, T6 y T7 (ver cuadro 9) la inoculación se realizó 15 días después de
la inoculación con G. intraradices, tiempo adecuado para que las esporas germinen y se
produzca el proceso de micorrización.
El tratamiento T8 a diferencia del resto de los tratamientos con T. harzianum fue aplicado
en el momento de la siembra, para diferenciar entre la aplicación en siembra o 15 días
después de siembra.
3.2.1.4. Tratamientos
En Semillero se evaluaron nueve tratamientos (Cuadro 9), donde cada tratamiento
correspondió a una bandeja y cada alveolo fue una seudorepetición (72 alvéolos).
En la etapa de cultivo se evaluaron los mismos tratamientos con cinco repeticiones por
tratamiento, donde una planta corresponde a la unidad experimental.
29
3.2.2. Cultivo
3.2.2.1. Trasplante:
El trasplante se realizó 50 días después de la siembra, cuando las plantas alcanzaron un
estado promedio sobre las cinco hojas verdaderas y un adecuado desarrollo para llevar a
cabo este manejo.
3.2.2.2. Riego y fertilización.
Desde la fase de entutorado hasta la etapa de floración y fructificación se aplicó
fertirrigación (Cuadro 10, DN2). La disolución nutritiva se ajustó a un pH entre 6,0 a 6,5,
una C.E de 2,5 dS m-1
.
Cuadro 9.- Tratamientos establecidos para la inoculación de las plantas de melón con Glomus
intraradices y Trichoderma harzanium.
SIGLA TRATAMIENTOS Mycosym ( esporas planta-1
)a TRICHO-D (g bandeja
-1)
b
T0 Control 0 0
T1 G. intraradices 20 0
T2 G. intraradices 40 0
T3 G. intraradices 80 0
T4c Trichoderma 0 1,5 (8,17 log10 UFC
e)
T5 G. intraradices + Trichoderma 20 1,5 (8,17 log10 UFC)
T6 G. intraradices + Trichoderma 40 1,5 (8,17 log10 UFC)
T7 G. intraradices + Trichoderma 80 1,5 (8,17 log10 UFC)
T8d Trichoderma 0 1,5 (8,17 log10 UFC)
a Aplicado a mano.
b Diluido en 500 cc de agua.
c Inoculación 15 días después de siembra.
d Inoculación al momento de siembra.
e UFC: Unidades formadoras de colonias.
30
Se utilizó un método de riego presurizado, con goteros cuyo caudal fueron de 4 L*h-1
. El
volumen y la frecuencia de riego se ajustaron a la demanda del cultivo según la fase
fenológica, características del sustrato y pH y C.E del drenaje.
Cuadro 10.- Disolución (meq L-1
) a utilizar en el cultivo de melón (tipo Inodorus) desde
entutorado a floración.
Disoluciones H
2PO
4
-
NO3
-
SO4
=
K+
Ca2+
Mg2+
NH4
+
DN2
1
1,25 18,0 2,50 8,0 10,0 3,50 1.8
1Steiner modificado (Casas, 2005);
2Cadahía (2000);
3Guzmán y Olave (2004);
4Disolución
ajustada con concentraciones de Cl- y Na
+ presentes en aguas de riego salinas.
3.2.2.3. Manejos del cultivo
Se manejó el cultivo a través de un sistema de cultivo vertical a un sola guía con un marco
de plantación de 1,0 x 0,4 m, realizándose una poda apical en el estado de seis hojas
verdaderas y dejando crecer los brotes laterales, posteriormente se dejaron los tres brotes
más vigorosos y mejores ubicados, alcanzando los brotes una longitud de 20 cm se podaron
dos de los tres brazos dejando el que presento las mejores características y este finalmente
se usó como guía.
Se construyo un túnel dentro del invernadero, estructurado con fierro, alambre acerado y
plástico tricapa con tecnología antigoteo, esto se realizó para aumentar las temperaturas
nocturnas y evitar daños por heladas que pudiesen afectar al cultivo en la temporada de
invierno. Las temperaturas fueron tomadas tanto del invernadero como dentro del túnel
(Ver anexo, Figura 32).
31
3.2.3. Mediciones
3.2.3.1. Semillero
Se realizaron tres muestreos destructivos de cinco plantas por cada tratamiento, el
primer muestreo se realizó a los 20 días después de la siembra, el segundo y tercer
muestreo se realizó a los 30 y 50 días, respectivamente.
Las mediciones realizadas en las plántulas fueron de parámetros físicos y bioquímicos; así
como también, se evaluaron los parámetros microbiológicos de G. intraradices y T.
harzianum.
3.2.3.2. Parámetros Microbiológicos.
Se evaluó la población de G. intraradices y T. harzianum a través de:
a) Intensidad micorrítica
Se realizó una tinción de raíces con azul de tripano para identificar las estructuras de G.
intraradices que colonizaron las raíces. Utilizando el método descrito por Phillips y
Hayman (1970), con algunas modificaciones: se realizó lavado de las raíces de las plántulas
con abundante agua potable para retirar el sustrato. De estas raíces se obtuvieron muestras
que se depositaron en tubos de ensayo que fueron cubiertas con solución de KOH al 10%, y
se colocaron en un baño termorregulado a una temperatura de 60ºC durante 30 minutos;
posteriormente se lavaron las raíces con abundante agua potable para eliminar el KOH.
Posteriormente, las muestras de raíces fueron blanqueadas con una solución de H2O2 al
10% por un tiempo de 10 minutos, y luego lavadas con abundante agua potable. Estas
muestras de raíces se acidificaron con una solución de HCl al 1N durante 10 minutos, se
decantó el HCl sin lavar las raíces. La última etapa del proceso consistió en la tinción de las
raíces acidificadas con una solución de Azul de Tripan al 0,05%, colocándolas en un baño a
60ºC por 60 minutos. Para remover el exceso de colorante las raíces fueron puestas en una
solución de glicerol al 50%.
32
La identificación de las estructuras micorríticas se realizaron con una ampliación de 40X y
100X en un microscopio óptico marca Lieder modelo MC 8100. El grado de colonización y
la frecuencia de micorrización de las raíces se determinó mediante el método de Trouvelot
(Trouvelot et al., 1986), que significó cortar 30 fragmentos teñidos de raíces de 1 cm que se
montaron en un portaobjeto y cubreobjeto y se observaron en el microscopio. A cada
fragmento observado se le asignó un valor que va de cero a cinco, según su grado de
micorrización. (Figura 4). Dónde:
0: No se observaron estructuras fúngicas en el segmento de la raíz.
1: Estructuras ocupan menos del 1% del segmento de la raíz.
2: Estructuras ocupan menos del 10% del segmento de raíz.
3: Estructuras ocupan menos del 50% del segmento de raíz.
4: Estructuras ocupan más del 50% en el segmento de la raíz.
5: Estructuras ocupan más del 90% del segmento de raíz.
Figura 4.- Puntuación del grado de colonización micorritica según clasificación desde 0 a
5.
Los resultados relacionados con la abundancia de micorrización se procesaron a
través del software MYCOCALC, con el cual se obtuvo el porcentaje de micorrización.
33
b) Variación poblacional de T. harzianum
Se tomaron muestras del sustrato de cada tratamiento para evaluar el comportamiento
poblacional de T. harzianum en el tiempo. Se utilizó la metodología de diluciones seriadas,
la siembra por extensión en placas Petri con medio de cultivo selectivo y el recuento de
colonias. Para la inoculación de las placas y de los materiales de vidrio se procedió
previamente a la esterilización de éstas en una cámara de calor, con calor seco a 150°C por
2 h. Los materiales de plástico y el medio de cultivo fueron esterilizados en autoclave por
15 minutos, a 121°C a una presión de 15 lbs.
Diluciones seriadas
Para poder facilitar el recuento de las colonias de Trichoderma en las placas Petri se
realizaron diluciones seriadas: se pesó 1 gramo de sustrato y se mezcló en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de agua destilada esterilizada, se colocó en un agitador
orbital por 20 minutos y se obtuvo una solución madre con una concentración de 100; de la
solución madre se extrajo una alícuota de 1 ml con una micropipeta con punta esterilizada y
se depositó en un tubo falcón de 15 ml con 9 ml de agua esterilizada obteniéndose una
dilución de 10-1
, de esta solución se tomó una alícuota de 1 ml de la dilución 10-1
y se
transfirió a otro tubo con 9 ml de agua esterilizada obteniéndose una dilución 10-2
, de la
misma forma se obtuvo las diluciones 10-3
y 10-4
(Figura 5)
Figura 5.- Metodología preparación diluciones seriadas
34
Siembra en medio selectivo
Se utilizó un medio selectivo para la siembra de Trichoderma harzianum propuesto por
Williams (Williams et al., 2003) con algunas modificaciones, el objetivo fue obtener solo
crecimiento de Trichoderma en este medio y evitar el crecimiento de otros microrganismos.
El medio selectivo final se preparó con (todos los valores en un litro): 5 g de peptona, 10 g
de dextrosa, 1 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de sulfato de magnesio, 1 g de nitrato de
amonio, 0,15 g de cloruro de potasio, 0,05 g de rosa de bengala y 15,5 g de agar, todo
preparado en 960 ml de agua destilada y esterilizado a 15 lbs de presión y 121°C.
Los compuestos antimicrobianos y antifúngicos fueron (todos los valores en un litro): 0.1 g
de cloranfenicol, 1,2 mL de propamocarb (772 g de ingrediente activo por litro) diluidos en
40 mL de agua esterilizada. Se aplicó en el medio basal una vez que éste se enfrió con un
filtro de jeringa de 0,22 um.
Se incorporó el medio de cultivo a las placas Petri y se dejó solidificar; posteriormente se
tomó de cada dilución una alícuota de 0,1 mL y se inocularon las placas extendiendo la
muestra con un asa de vidrio, la cual se esterilizó mediante su introducción en alcohol y
posterior flameado. Cada dilución se sembró por triplicado y las muestras se incubaron en
cámara de crecimiento a 25°C por 7 días.
Recuento de colonias
Después de los 7 días se realizó el recuento de colonias a través de la siguiente formula con
lo cual se obtuvo las unidades formadoras de colonias viables presentes en 1 g de sustrato.
(
)
UFC: Unidades formadoras de colonias.
N: número de colonias formadas.
D: Inversa factor de dilución.
35
3.2.3.3. Parámetros Físicos
a) Parámetros de diferenciación
Número de hojas: Se incluyen todas las hojas con una longitud mayor a 1 cm del
limbo, se excluyen los cotiledones (Leskovar, 2001).
b) Parámetros de biomasa
Biomasa (g): Se determinó el peso seco total de la planta y parcial entre sus
componentes principales – raíz, tallo y hojas, se llevó a cabo con una
balanza analítica marca Denver Instrument modelo APX-200.
c) Parámetros de crecimiento
Diámetro de tallo (mm): Se midió justo bajo los cotiledones. (Leskobar,
2001), se llevó a cabo con un Bernier.
Altura de plantas (cm): Se midió desde el cuello de la planta hasta el punto
de crecimiento más alto (Hoyos, 1996).
Índice de ahilamiento: Relación adimensional entre la altura de la planta y
el diámetro del tallo (Cativello et al., 1995).
Superficie foliar (cm2): Se digitalizaron las hojas verdaderas y cotiledones a
través de un escáner, para posterior determinar la S.F. a través del Software
Idrisi ® para tratamientos de imágenes escaneadas.
36
d) Indicadores de estrés
Superficie Foliar Específica (SFE): Se determinó a través de la siguiente
expresión:
SFE (gr cm-1
): Superficie foliar / Peso seco hoja.
Relación peso seco raíz y el peso seco vástago: Es una relación
adimensional y se determinó a través el cociente entre el Peso seco de la raíz
(PSRz) y el vástago (PSVa) (Cuartero y Fernández-Muñoz, 1999).
3.2.3.4. Parámetros Bioquímicos
a) Nitrato Reductasa.
Para determinar el efecto de Glomus y Trichoderma en la absorción de nitratos, se
determinó la actividad endógena e inducida de la enzima nitrato reductasa en tejido verde
(hojas).
Nitrato Reductasa Endógena (ANRend)
Se utilizó la metodología descrita por Bar-Akiva et al. (1970) (Valenzuela et al., 1987;
citado por Sánchez, 1993), con algunas modificaciones. El método se detalla a
continuación:
Se obtuvieron discos de tejido foliar fresco de melón con un diámetro de 5 mm y un peso
de 100 mg. Estos discos fueron colocados en un tubo de ensayo donde se adicionaron 5 mL
de una solución tampón fosfato 100 mM (pH: 7,5) y 1-propanol al 1% (v/v), se sometieron
a un baño ultrasónico marca BRANSON modelo 3510 por 30 minutos para permitir la
infiltración en el tejido foliar de las soluciones tampones. Después del ultrasonido, las
muestras se incubaron durante 120 minutos a 27ºC en oscuridad. La reacción se detuvo por
inmersión de los tubos con las muestras en agua caliente. De esta muestra, 2 mL se hicieron
reaccionar para la obtención de color con 2 ml de sulfanilamida al 1% (p/v) en HCl 1,5N y
37
2 mL de dihidrocloruro de N-(-1-naftil)-etilendiamida al 0,02 % (p/v) preparada en HCl 0,2
N. La intensidad del color desarrollado se midió a una absorbancia de 540 nm en un
espectrofotómetro marca SPECTRONIC, modelo GENESYS 2.
Nitrato Reductasa Inducida (ANRind)
Se determinó por la metodología descrita por Sánchez (1993), que se basa en el método de
Bar-Akiva y Sternbaum en 1966, modificado por Bar-Akiva et al. (1970) y adaptado por
Valenzuela et al. (1990), con algunas modificaciones. El método se detalla a continuación:
La metodología es similar a la Nitrato Reductasa Endógena, incluyendo el baño ultrasónico.
El cambio es sólo en el medio de incubación e infiltración que está compuesto por 5 mL de
50 mM de KNO3-, 100 mM de tampón fosfato (pH: 7,5) y 1-propanol al 1% (v/v).
Las lecturas obtenidas de las muestras se llevaron a una recta de calibración en el rango de
0 a 4 µM, elaborada con NaNO2-, con una concentración de 1 mM como solución patrón y
por dilución volumétrica se realizaron las diferentes concentraciones entre el rango
mencionado, y los resultados se expresaron en µM de NO2- g
-1pf h
-1.
3.2.4. Cultivo
Se realizó un muestreo destructivo a los 150 días de cultivo debido a que se presentó en la
mayoría de las plantas de los diferentes tratamientos, desordenes patológicos que afectaron
principalmente las raíces y los tallos.
De las plantas con desordenes patológicos se tomaron muestras para la determinación del
agente causal y se efectuaron cultivos en placas Petri con sustrato Agar Papa Dextrosa. La
incubación se realizó en cámara de crecimiento a 25ºC por un período de siete días.
Posteriormente se tomo una muestra de micelio que creció en las placas al cual se realizó
una tinción con Azul de Lactofenol para una mejor observación en el microscopio para
efectuar la identificación del hongo.
38
En esta etapa se realizaron los mismos análisis que en la etapa de semillero: parámetros de
diferenciación, parámetros de crecimiento, parámetros bioquímicos y parámetros
microbiológicos.
3.2.5. Diseño Experimental y Análisis Estadístico
Se utilizo un diseño completamente aleatorizado y el modelo estadístico correspondió a:
ijiij TY
i= 1, 2, ……., 9.
j= 1, 2, …..., 5.
Dónde:
Yij: Respuesta en la j-ésima repetición del i-ésimo tratamiento de plantas inoculadas.
µ: efecto medio general.
Τi:Efecto de la i-ésima concentración de G. Intraradices y T. harzianum en plantas de
melón.
εijk: error experimental.
Se realizó un análisis de varianza multifactorial (ANOVA) y para la separación de
medias se utilizó el test LSD, mediante el software estadístico INFOSTAT a un α = 0,05.
Los datos de número de hojas se normalizaron para su análisis a través de la
transformación logarítmica expresada en la ecuación , y los datos porcentuales se
normalizaron con la transformación de Bliss expresada en la ecuación √ .
39
4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
La investigación realizada, ha tenido como propósito principal el contribuir al conocimiento
de los hongos formadores de micorrizas arbusculares y hongos saprofitos biocontroladores,
y la interacción de estos con las plantas, especialmente con el cultivo de melón,
apareciendo como una alternativa viable de manejo en la agricultura en la zona norte de
Chile.
Previo a la presentación de los resultados se consideró que la turba utilizada como sustrato
en la investigación era desinfectada; sin embargo, en la etapa de cultivo las plantas de
melón presentaron diferentes grados de declinación, debido a desordenes patológicos que
fueron comprobados cuando se realizó el cultivo de muestras de tejido y se determinó la
presencia de una lata población de microorganismos (ver anexo, Figura 35), como se
detalla in extenso más adelante en esta investigación, coincidiendo con investigaciones
realizadas en turba que han determinado la presencia de abundante población microbiana en
sustratos hortícolas (Urrestarazu, 2004).
A su vez cuando se aplica la metodología propuesta por Hernández (2001), que consiste en
la siembra e inoculación directa en el sustrato no esterilizado, se logra obtener una visión de
los hongos micorríticos y de los hongos saprófitos (Trichoderma) y su interacción con los
cultivos a nivel de campo. La metodología señalada fue usada en esta investigación.
Para aislar esta variable y evitar que los microrganismos afecten de forma negativa o
positiva se recomienda utilizar la metodología propuesta por García (2006) que se basa en
la esterilización del sustrato a través de la tindalización en autoclave a vapor fluente (100°C
durante 1 h, 3 días consecutivos); de esta forma, el suelo queda libre de propágulos de
micorrizas y otros organismos que pueden interferir en la investigación. Esta metodología
es utilizada para los ensayos realizados en condiciones controladas de laboratorio.
40
4.1. Análisis de viabilidad de los productos comerciales utilizados.
Se realizaron pruebas para demostrar la viabilidad de los productos comerciales utilizados
como inoculantes (Figura 6).
Los valores de micorrización alcanzado en la prueba de viabilidad en las plantas de melón
inoculadas con Glomus intraradices fue de un 49%, valor considerado alto y concuerda con
los valores determinados en este cultivo y para esta especie de hongo micorritico por Wang
et al. (2010); demostrando que el producto comercial utilizado en esta investigación tiene
una alta viabilidad.
En la prueba de viabilidad de Trichoderma harzianum los valores de unidades formadoras
de colonias fue de 100.000.000 millones de esporas por gramo de producto (10 colonias
formadas en una dilución de 106) valores considerados alto y que concuerdan con las
especificaciones del fabricante demostrando un alta concentración y viabilidad de este
producto. Los valores obtenidos con Tricho – D ® superan en gran medida a los valores
obtenidos por Ozbay y Newman (2004) con el producto comercial PlantShield® HC, con
una concentración de 10.000.000 millones de esporas germinativas por gramo de producto
comercial.
Figura 6.- A: Raíz de melón micorrizada, se observan esporas fúngicas en el interior
(40X). B: Unidades formadoras de colonias de Trichoderma harzianum en medio selectivo
A B
41
4.2. Resultados de la etapa de semillero
Se realizaron tres muestreos destructivos en las plántulas de melón a los 20, 30 y 50 días.
Se presentan los resultados obtenidos en las plántulas debido al efecto de las inoculaciones
con G. intraradices y T. harzanium en el tercer muestreo; donde se efectúa el análisis por
separado y también el efecto interactivo entre G. intraradices y T. harzianum, midiéndose
parámetros físicos, análisis microbiológico y análisis bioquímico.
4.2.1. Análisis microbiológico
Se analizan y se discuten por separado el efecto de la inoculación con G. intraradices, T.
harzanium y la interacción sobre los parámetros poblacionales de las dos especies de
hongos, porcentaje de micorrización y la variación poblacional, en plántulas de melón
Inodorus.
4.2.1.1. Glomus intraradices
Porcentaje de micorrización.
La inoculación con diferentes dosis de esporas de G. intraradices en plántulas de melón
presentó diferencias significativas en el porcentaje de micorrización (Figura 7). El
tratamiento que presento un mayor porcentaje de micorrización fue el T2 (40 esporas planta-
1) con un valor de 49,8%, seguido del T3 (80 esporas planta
-1) con 36.32% y el T1 (20
esporas planta-1
) con 16,9 %.
42
Figura 7.- Porcentaje de micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los 50
días inoculadas con G. intraradices. Letras distintas en cada barra representan diferencias
significativas según el Test de LSD (p<0,05).
La respuesta de la micorrización a diferentes dosis de esporas de G. intraradices se ajusta a
una curva sigmoidea (Figura 8).
Figura 8.- Efecto de la dosis de esporas de G. intraradices sobre el porcentaje de
micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los 50 días de siembra.
0
10
20
30
40
50
60
T0 T1 T2 T3
Mic
orr
izac
ion
(%
)
Tratamientos
c
d
b
a
43
Dia 1 Dia 50
T0 0 0
T4 8,17 3,98
T8 8,17 3,74
3
4
5
6
7
8
9
Log
10
UFC
(U
FC *
gr-
1 s
ue
lo)
4.2.1.2. Trichoderma harzianum
Variación poblacional de Trichoderma harzianum
Cuando se inocularon los semilleros de melón con T. harzianum con 8,17 UFC (log10 UFC
*gr-1
suelo) la población decrece en gran medida a través del tiempo (Figura 9),
presentándose diferencias significativas entre la inoculación a los 15 días post siembra (T4)
y la inoculación en siembra (T8), disminuyendo la población a valores de 3,98 (T4) y 3,74
(T8), respectivamente.
Estos resultados determinaron que la inoculación en 15 días postsiembra genero una mayor
supervivencia de Trichoderma en el tiempo, lo cual no asegura un aumento de la población,
al contrario se evidencia una disminución drástica y es posible que la población alcance
valores similares a los del tratamiento T8; a su vez, en el tratamiento testigo no se evidencio
presencia de T. harzianum.
Figura 9.- Formaciones de colonias de T. harzianum por gramo de suelo seco en melón
Inodorus var. Honeydew a los 50 días de siembra. Letras distintas representan diferencias
significativas según el Test de LSD (p<0,05).
c a
b
44
4.2.1.3. Interacción de Glomus y Trichoderma
a) Efecto interactivo entre G. intraradices y T. harzanium en la micorrización
La inoculación con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum en las plántulas de
melón presentó diferencias significativas en el porcentaje de micorrización (Figura 10),
donde los tratamientos T6 y T7 presentaron los índices de micorrización mayores y fueron
estadísticamente diferentes a los tratamientos T5 y T0.
Los valores de micorrización obtenidos de la inoculación con Glomus y Trichoderma
fueron de T5:7,9%; T6:21,4 y T7:15 %. Esta coinoculación tuvo un efecto detrimental en
todos los tratamientos obteniéndose una reducción de 52,8% (T1:T5), 56,9% (T2:T6) y
56,8% (T3:T7) en el porcentaje de micorrización con respecto a los tratamientos inoculados
solo con Glomus (Figura 7).
Figura 10.- Porcentaje de micorrización en raíces de melón Inodorus var. Honeydew a los
50 días de siembra inoculados con G. intraradices y T. harzianum. Letras distintas en cada
barra representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05).
b) Efecto de Glomus en la poblacional de Trichoderma
0
10
20
30
40
50
60
T0 T5 T6 T7
Mic
orr
izac
ión
(%
)
Tratamientos
c c
b a
45
Dia 1 Dia 50
T0 0 0
T5 8,17 3,54
T6 8,17 3,98
T7 8,17 3,74
3
4
5
6
7
8
9
Log
10 U
FC (
Esp
ora
s*gr
-1 s
ue
lo)
Cuando se inoculo con T. harzianum y G. intraradices en semilleros de melón, se observo
una disminución en la población de Trichoderma harzianum a los 50 días post siembra
(Figura 11), presentándose diferencias estadísticas entre los tratamientos evaluados.
El tratamiento T6: 3,98 UFC presento el mayor valor con respecto a los tratamientos T5
(3,54 UFC) y T7 (3,74 UFC), el tratamiento testigo no presento unidades formadoras de
colonias.
Figura 11.- Unidades formadoras de colonia por gramo de suelo seco en melón Inodorus var.
Honeydew a los 50 días de siembra inoculadas con T. harzianum y G. intraradices. Letras
distintas representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05).
La disminución poblacional de Trichoderma cuando fue inoculado en conjunto con
Glomus, presentó la misma tendencia que cuando se inoculo solo Trichoderma
comprobando que el hongo micorritico no ejerció ningún efecto sobre la población de
Trichoderma.
4.2.2. Parámetros físicos y bioquímicos.
Se analizan y se discuten por separado el efecto de la inoculación con G. intraradices, T.
harzanium y la interacción de estos sobre la producción de biomasa, diferenciación de
a
b
d
c
46
tejidos, crecimiento, indicadores de estrés y la actividad enzimática de nitrato reductasa en
plántulas de melón Inodorus.
4.2.2.1. Efecto de Glomus intraradices en los parámetros físicos y bioquímicos
a) Producción de biomasa
El efecto de la inoculación con G. intraradices en la producción de biomasa seca de hojas,
tallo, raíz y total en plántulas de melón a los 50 días de siembra se presentan en la Figura
12.
Figura 12.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con G. intraradices. (A) Peso
seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces (g). (D) Peso seco total (g). Letras distintas
en cada barra representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
T0 T1 T2 T3
Pes
o s
eco
ho
ja (
g)
Tratamientos
a
a
a a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T1 T2 T3
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
Tratamientos
a a a a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T1 T2 T3
Pes
o s
eco
raí
z (g
)
Tratamientos
a b
c d
0
0,4
0,8
1,2
T0 T1 T2 T3
Pes
o s
eco
to
tal (
g)
Tratamientos
a a
a a
A B
C D
47
La inoculación con G. intraradices no afectó la producción de biomasa foliar, tallo y total.
El efecto principal obtenido fue en la producción de biomasa seca de la raíz, presentándose
diferencias altamente significativas entre los tratamientos (p-valor = 0,0001), donde el T2
(40 esporas*planta-1
) presentó el mayor peso seco con un valor de 0,21 gr, con un
incremento de un 31,25% y un 75% de peso seco respecto al T3 (80 esporas*planta-1
) y el
T1, (20 esporas*planta-1
), y de un 133% respecto al tratamiento testigo.
En cuanto a la producción de materia seca total no se presentaron diferencias estadísticas
entre los tratamientos, obteniéndose 0,76 g (T0); 0,61 g (T1); 0,87 g (T2) y 0,75 g (T3).
El ajuste lineal entre el porcentaje de micorrización y el porcentaje de materia seca
acumulada en la raíz en plántulas de melón a los 50 días de siembra se presentan en la
figura 13. Se obtuvo una relación positiva con un R2
= 0,74; siendo la recta distinta de cero
y altamente significativa, tendiendo a aumentar este parámetro cuando mayor es el
porcentaje de micorrización.
Figura 13.- Efecto de la inoculación con G. intraradices en la acumulación de biomasa seca
radical (%),| en plántulas de melón tipo Inodorus cv. Honeydew Orange Flesh a los 50 días
de siembra.
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
p-valor = ˂ 0,0001
48
La inoculación con G. intraradices no afectó la diferenciación de hojas y los parámetros de
crecimiento (diámetro de tallo, altura de planta y superficie foliar) en plántulas de melón
Inodorus; solo se obtuvo diferencias significativas en el índice de ahilamiento (p-valor =
0.0340).
Sin embargo, aún cuando no se presentaron diferencias significativas en la mayoría de los
parámetros, las plántulas de melón del T2 (40 esporas*planta-1
) presentaron la mejor
respuesta en los parámetros de crecimiento y diferenciación, excepto en altura de planta
(Cuadro 11).
Respecto al índice de ahilamiento el tratamiento T2 presentó el menor valor (25.89) con un
nivel de significancia de p = 0.0340, en comparación con los tratamientos T0, T3 y T1 los
cuales presentaron valores superiores en un 52, 26 y 6%, respectivamente.
Cuadro 11.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Glomus intraradices.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) IA SF (cm2) N° de hojas
T0 0,43a 16,76a 39,46b 80,31a 5,6a
T1 0,45a 12,28a 27,49a 62,89a 5,6a
T2 0,53a 13,32a 25,89a 82,71a 6,0a
T3 0,46a 14,72a 32,62ab 72,55a 5,2a
p-valor 0,2908 0,0968 0,0340 0,1791 0,5405
DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; IA. Índice de ahilamiento (AP/DT); SF:
Superficie Foliar. Valores medios seguidos por diferentes letras en la misma columna
difieren significativamente según el Test LSD (p<0,05).
c) Indicadores de estrés.
Respecto de los indicadores de estrés indirecto, -Superficie Foliar Específica (SFE) y la
relación Raíz/Vástago -, se obtuvo una respuesta diferencial a los 50 días post siembra en
las plántulas de melón inoculadas con G. intraradices.
49
Las plántulas inoculadas con G. intraradices y las no inoculadas presentaron el mismo
nivel de estrés cuando se determinó la Superficie Foliar Específica (Superficie Foliar/Peso
Seco de la Hoja).
Cuadro 12.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con G. intraradices a los 50 días de siembra.
Parámetros
TRATAMIENTOS SFE R(PSRz/PSVa)
T0 184,84a 0,14a
T1 194,31a 0,26b
T2 171,09a 0,33c
T3 176,54a 0,27b
p-valor 0,7754 0,0001
SFE: Superficie Foliar Especifica (SF/Peso Seco Hojas); R (PSRz/PSVa): Relación (Peso
seco Raíz/Peso seco Vástago). Valores medios seguidos por diferentes letras en la misma
columna difieren significativamente según el Test LSD (p<0,05).
Una respuesta diferente, se obtuvo cuando se determinó la relación Peso Seco raíz / Peso
Seco Vástago, donde se presentaron diferencias significativas (p-valor = 0,0001). Las
plántulas inoculadas con G. intraradices presentaron una mayor relación con respecto a las
no inoculadas y fueron estadísticamente diferentes. Entre las plantas inoculadas, el
tratamiento T2 fue el que presentó la mayor relación PSRz/PSVa (0,33), determinado por el
mayor peso radicular. El valor de este tratamiento es mayor en un 26 y 22% con respecto al
T1 y T3, respectivamente (cuadro 12).
p-valor = 0,0002
50
Figura 14.- Efecto de la inoculación con G. intraradices en la relación Peso seco raíz / Peso
seco vástago, en plántulas de melón tipo Inodorus cv. Honeydew Orange Flesh a los 50 días
de siembra.
El ajuste lineal entre los valores de micorrización y la relación peso seco raíz / peso seco
vástago en las plántulas de melón a los 50 días de siembra se presentan en las Figuras 14.
Se obtuvo una correlación positiva con un R2 = 0,56; siendo la recta distinta de cero y
altamente significativa, tendiendo a aumentar este parámetro cuando mayor es el porcentaje
de micorrización.
d) Actividad enzimática de nitrato reductasa.
Los resultados del efecto de la inoculación con G. intraradices en la actividad enzimática
de la nitrato reductasa en tejidos verdes de plántulas de melón a los cincuenta días de
siembra se presentan en el Cuadro 13. No se encontraron diferencias significativas entre los
tratamientos inoculados con Glomus y el tratamiento testigo, en los parámetros NRE, NRI y
la relación NRI/NRE.
Cuadro 13.- Indicadores Bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con G. intraradices a los 50 días de siembra.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 1,52a 1,53a 1,01a
T1 1,47a 1,59a 1,18a
T2 1,29a 1,58a 1,24a
T3 1,12a 1,54a 1,39a
p-valor 0,1557 0,9870 0,2750
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
letras iguales en la misma columna no difieren estadísticamente según el Test LSD
(p>0,05).
La fertilización nitrogenada aplicada en la disolución nutritiva en la etapa de semillero fue
de 7,5 meq L
-1 NO3, determinando en el tratamiento testigo una eficiencia del 100% en la
51
actividad de la enzima al obtenerse una relación NRI/NRE:1, lo que significa que todo el
nitrato aportado era reducido y utilizado por la planta en su metabolismo. En cambio, en los
tratamientos micorrizados la eficiencia en la actividad de la enzima nitrato reductasa fue de
un 82, 76 y 61% en los tratamientos T1, T2 y T3, respectivamente quedando sustrato
enzimático disponible para la reducción del nitrato.
4.2.2.2. Efecto de Trichoderma harzianum en los parámetros físicos y bioquímicos
a) Producción de biomasa
El efecto de la inoculación con T. harzianum en la producción de biomasa seca de hojas,
tallo, raíz y total en plántulas de melón a los 50 días de siembra se presentan a continuación
(Figura 15). Al inocular con T. harzianum, las plántulas de melón no se obtuvieron
diferencias estadísticas entre los tratamientos, en los parámetros de peso seco hojas, tallo,
raíz y total. A pesar de no encontrar diferencias significativas, se observa que el tratamiento
T8 presento valores superiores en la producción de biomasa seca de hoja, tallo y total.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
T0 T4 T8
Tratamientos
Pes
o s
eco
ho
ja (
g)
a a
a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T4 T8
Tratamientos
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
a a
a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T4 T8
Tratamientos
Pes
o s
eco
raí
z (g
)
a
0
0,4
0,8
1,2
T0 T4 T8
Tratamientos
Pes
o s
eco
to
tal
(g)
a a
a
A B
C D
52
Figura 15.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con T. harzianum. (A) Peso
seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces (g). (D) Peso seco total (g). Letras iguales
en cada barra no representan diferencias significativas según el Test LSD (p>0,05).
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
La inoculación con Trichoderma harzianum en las plántulas de melón no determinó ningún
efecto significativo en los parámetros de crecimiento y diferenciación, a los cincuenta días
después de la siembra (Cuadro 14). Aun cuando no hay diferencias estadísticas se obtuvo
un incremento en el diámetro del tallo y en la altura de planta en el tratamiento T8 de un 4,6
y 15,8% respectivamente; además de un 15 y 3,5% en la superficie foliar y número de hojas
al compararlos con los tratamientos testigo y T4.
Cuadro 14.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Trichoderma harzianum.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) IA SF (cm2) N° de hojas
T0 0,43a 16,76a 39,46a 80,31a 5,6a
T4 0,44a 16,38a 38,07a 70,68a 5,2a
T8 0,45a 19,42a 42,46a 92,42a 5,8a
p-valor 0,9412 0,5339 0,7473 0,4760 0,5462
DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; IA. Índice de ahilamiento (AP/DT); SF:
Superficie Foliar. Valores medios seguidos por letras iguales en la misma columna no
difieren estadísticamente según el Test LSD (p>0,05).
c) Indicadores de estrés.
La inoculación con Trichoderma harzianum no afectó la respuesta de las plántulas de
melón respecto de los indicadores de estrés determinados (Cuadro 15), cuando fueron
inoculadas al momento de la siembra (T8) y quince días después de la siembra (T4), con
respecto al testigo.
53
Cuadro 15.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra.
Parámetros
TRATAMIENTOS SFE R(PSRz/PSVa)
T0 184,84a 0,14a
T4 177,77a 0,18a
T8 174,2a 0,13a
p-valor 0,9142 0,2048
SFE: Superficie Foliar Especifica (SF/Peso Seco Hojas); R (PSRz/PSVa): Relación (Peso
seco Raíz/Peso seco Vástago. Valores medios seguidos por letras iguales en la misma
columna no difieren estadísticamente según el Test LSD (p>0,05).
d) Actividad enzimática de nitrato reductasa
La inoculación con T. harzianum no afectó la actividad enzimática de la nitrato reductasa
en tejidos verdes de plántulas de melón a los 50 días de siembra (Cuadro 16). A pesar de
encontrase diferencias significativas en NRE y NRI/NRE.
Cuadro 16.- Indicadores bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 1,52a 1,53a 1,01b
T4 1,50a 1,36a 0,92b
T8 1,97b 1,53a 0,78a
p-valor 0,0081 0,1480 0,0054
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
diferentes letras en la misma columna difieren estadísticamente según el Test LSD
(p<0,05).
Los resultados obtenidos de la actividad de la enzima nitrato reductasa endógena en las
hojas de las plántulas de melón son erráticos al obtenerse en el tratamiento T8 un valor que
supera en un 29% al tratamiento T4 y al Control, que determinó diferencias significativas
(p-valor = 0,0081). Estos resultados condicionaron la relación NRI/NRE. A partir de estos
resultados no se observa efecto de la inoculación con T. harzianum en la actividad de la
nitrato reductasa en las plántulas de melón Inodorus, no observándose sustrato disponible.
54
4.2.2.3. Efecto de la interacción de Glomus intraradices y Trichoderma harzianum
a) Producción de biomasa
El efecto de la coinoculación con G. intraradices y T. harzianum en la producción de
biomasa seca de hojas, tallo, raíz y total en plántulas de melón a los 50 días de siembra se
presentan en la Figura 16.
Figura 16.- Producción de biomasa seca en plántulas de melón inoculadas con Glomus intraradices y
Trichoderma harzianum. (A) Peso seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces (g). (D)
Peso seco total (g). Letras distintas en cada barra representan diferencias significativas según el Test de
LSD (p<0,05).
No se obtuvieron diferencias significativas en las plántulas de melón entre los tratamientos,
en los parámetros de peso seco foliar, peso seco tallo y peso seco total. Solo se obtuvieron
diferencias significativas para el peso seco de la raíz (p-valor = 0,0001), donde el T6 (40
0
0,2
0,4
0,6
0,8
T0 T5 T6 T7
Pes
o s
eco
ho
jas
(g)
Tratamientos
a a a a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T5 T6 T7
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
a a
a a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
T0 T5 T6 T7
Tratamientos
Pes
o s
eco
raí
z (g
)
b c
b a
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
T0 T5 T6 T7
Pes
o s
eco
to
tal
(g)
a a a a
A B
C D
55
esporas*planta-1
de Glomus + Trichoderma.) presentó el mayor peso seco con un valor de
0,16 g superior en un 33%, 45% y 77% respecto de los tratamientos T7, T5, y T0,
respectivamente.
Al comparar los resultados obtenidos en los tratamientos inoculados con T. harzianum y
Glomus intraradices (T5, T6 y T7), y los inoculados solo con G. intraradices se aprecia un
efecto detrimental en la producción de biomasa radicular por parte de T. harzianum. Esta
disminución fue de un 9% (T1:T5), 31% (T2:T6) y 33% (T3:T7).
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
La coinoculación con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum en las plántulas de
melón no afectaron los parámetros de crecimiento y diferenciación a los cincuenta días post
siembra, no encontrándose diferencias significativas entre los tratamientos (Cuadro 17).
Cuadro 17.- Parámetros de crecimiento en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew a
los 50 días de siembra, inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) IA SF (cm2) N° de hojas
T0 0,43a 16,76a 39,46a 80,31a 5,6a
T5 0,45a 18,66a 41,23a 81,78a 6,0a
T6 0,50a 14,70a 30,69a 75,20a 5,8a
T7 0,43a 15,82a 37,27a 74,0a 5,4a
p-valor 0,4045 0,2959 0,2815 0,8545 0,7033
DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; IA. Índice de ahilamiento (AP/DT); SF:
Superficie Foliar. Valores medios seguidos por letras iguales en la misma columna no
difieren estadísticamente según el Test LSD (p>0,05).
Se observo un efecto detrimental de la coinoculación con respecto a la inoculación solo con
Glomus, viéndose afectado el índice de ahilamiento al obtener plantas con menor diámetro
de tallo y una mayor altura.
56
c) Indicadores de estrés.
La coinoculación con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum en plántulas de
melón solo genero un efecto significativo en la relación PSRz/PSVa (p-valor = 0,0003),
parámetro que igualmente fue afectado significativamente por la inoculación solo con G.
intraradices y esta influenciado por los altos valores de peso seco radical alcanzado
(Cuadro 18).
Al comparar los valores de la relación PSRz/PSVa con los obtenidos en la inoculación solo
con G. intraradices, observamos que los valores de T5, T6 y T7 disminuyeron en un 96; 37
y 73%, respectivamente, con respecto al T2 lo que se puede atribuir principalmente a un
efecto detrimental de T. harzianum al disminuir el peso seco radical en las plántulas,
relacionado con los bajos niveles de micorrización que presentaron estos tratamientos.
d) Actividad enzimática de nitrato reductasa
Los resultados obtenidos con la coinoculación con G. intraradices y T. harzianum en la
actividad enzimática de la nitrato reductasa en tejidos verdes de plántulas de melón a los 50
días de siembra una tendencia similar cuando se inoculó solo con G. intraradices (Cuadro
19).
Cuadro 18.- Indicadores de estrés en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra.
Parámetros
TRATAMIENTOS SFE R(PSRz/PSVa)
T0 184,84a 0,14a
T5 174,36a 0,17ab
T6 158,68a 0,24c
T7 164,45a 0,19b
p-valor 0,7081 0,0003
SFE: Superficie Foliar Especifica (SF/Peso Seco Hojas); R (PSRz/PSVa): Relación (Peso
seco Raíz/Peso seco Vástago). Valores medios seguidos por diferentes letras en la misma
columna difieren estadísticamente según el Test LSD (p<0,05).
57
Cuadro 19.- Indicadores Bioquímicos en plántulas de melón Inodorus var. Honeydew
inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum a los 50 días de siembra.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 1,52b 1,53ab 1,01a
T5 1,32ab 1,74bc 1,32a
T6 1,46b 1,99c 1,42a
T7 1,13a 1,33a 1,19a
p-valor 0,0119 0,0005 0,0507
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
diferentes letras en la misma columna difieren estadísticamente según el Test LSD
(p<0,05).
Se determinaron diferencias significativas entre los tratamientos coinoculados con respecto
a los tratamientos testigos en los parámetros NRE, NRI y la relación NRI/NRE. Donde el
tratamiento testigo presento el mayor valor en la actividad de la reductasa endógena, el
tratamiento T6 el valor mayor en la actividad inducida de la nitrato reductasa.
En la relación NRI/NRE se observa el mismo comportamiento de las plántulas inoculadas
solo con Glomus (Cuadro 13), en las cuales se observa sustrato disponible de nitrato
reductasa con valores que van desde 32; 42 y 19%, T5, T6 y T7, respectivamente y en el
tratamiento testigo un 1% de enzima disponible.
58
4.3. Discusión etapa de semillero
4.3.1. Análisis microbiológico
4.3.1.1. Inoculación solo con Glomus intraradices
La inoculación con diferentes dosis de esporas por plántulas determinó resultados
diferenciados, donde la dosis media de 40 esporas por plántulas dio como resultado el
mayor porcentaje de micorrización, con un valor de 49%, no así la dosis menor y mayor,
con valores de 16,0 y 36,3%, respectivamente.
Resultados similares fueron obtenidos en el cultivo de tomate cv. Mara por Mujica y
Medina (2008), donde no se incrementó el crecimiento con la aplicación del doble de la
dosis de Glomus mosseae y Glomus Hoi-like. A su vez Anaya et al. (2009), obtuvieron la
mejor respuesta en el crecimiento de plántulas de tomate cuando fueron inoculados con
EcoMic (Glomus fasciculatum) a la dosis media. Sin embargo, Solares (2007) obtuvo la
mejor respuesta en el cultivo de melón con la dosis mayor de Glomus fasciculatum.
Dado estos resultados obtenidos en estas especies hortícolas, el éxito de la micorrización
utilizando productos comerciales depende en gran medida de la formulación del producto
utilizado, de la concentración de propágulos infectivos y de la viabilidad que este presente,
coincidiendo con lo determinado por Fernández et al. (2007).
A su vez, Akond et al. (2008), realizaron investigaciones en Bangladesh (India), en quince
cultivos de hortalizas, donde se determinó la afinidad simbiótica con los hongos
micorríticos arbusculares, obteniéndose en catorce de los quince cultivos simbiosis, dos de
ellos, Cucúrbita máxima y Cucumis sativus obtuvieron porcentajes altos de micorrización
con un 71% y 59% respectivamente demostrando una mayor dependencia micorrítica, con
respecto a los resultados obtenidos en esta investigación con Cucumis melo.
Wang et al. (2010), obtuvieron resultados similares en semilleros de melón cv. 901 y en el
cultivar 908 a los 45 días post siembra respecto a la dosis de inoculo aplicada en el T2, con
59
porcentajes de micorrización de 39,89% para Glomus versiforme y 51,75% para Glomus
mosseae (cv. 901) y de 46,38 para G. versiforme y 57,08 para G. mosseae (cv. 908)
respectivamente, presentándose diferentes intensidades de micorrización para un mismo
cultivar pero con diferentes especies de hongos micorríticos. A su vez, Huang et al. (2011)
obtuvieron valores de un 70% de micorrización en semilleros de melón cv. “Zhongmi 3”
inoculados con G. intraradices y Martínez-Medina et al. (2011) obtuvieron valores de 8%
de micorrización en plántulas de melón cv. “Giotto” con Glomus intraradices.
En esta investigación los valores obtenidos en semilleros de melón cv. “Honey Dew” con
Glomus intraradices fue de un 49% de micorrización, con lo cual se deduce que las
especies vegetales e inclusos los cultivares presentan diferentes grados de micorrización
para una misma especie de hongo micorrítico, diferenciándose entre cultivos con mayor o
menor sensibilidad a ser micorrizados.
Lo indicado anteriormente concuerda con lo determinado por Wang et al. (2010), señalando
que el éxito en la simbiosis de las plantas se basa en un adecuado establecimiento,
desarrollo y extensión de la simbiosis micorrítica; y estos a su vez dependen de la especie
de hongo micorrítico, sus características genéticas, del medio ambiente de donde fue
aislado, como también de la afinidad de este con la especie vegetal y/o e incluso de la
afinidad con el cultivar.
De igual manera Brundrett, (2002), señala que otro factor influyente es la fisiología de las
plantas y las propiedades de sus raíces, y Drew et al. (2006) señalan que que también
depende como se desarrolle el proceso de colonización de los hongos micorríticos, es así
que Glomus mosseae tiene una mayor capacidad de exploración del suelo que Glomus
intraradices, lo que se traduce en una mayor capacidad de colonización.
Otros factores considerados como determinantes en la efectividad de la simbiosis son las
características medioambientales y los suelos o sustratos utilizados, presentándose
diferentes comportamientos según las especies de hongos micorríticos (Siqueira y Franco,
1988), siendo reafirmado por Cornejo, (2006) quien señala que los factores abióticos que
afectan el éxito de la simbiosis son de tipo edáfico, donde el pH es el más relevante y en
plano secundario se encuentra la: conductividad del suelo, concentración de nutrientes,
60
presencia de metales pesados, capacidad de retención de humedad, temperatura y por
diferentes manejos agronómicos realizados.
4.3.1.2. Variación poblacional de Trichoderma harzianum
La población de Trichoderma harzianum presentó en esta investigación una tendencia a
disminuir en el tiempo; obteniendo resultados similares Sosa et al. (2006) y Martínez et al.
(2004), quienes determinaron una disminución poblacional de T. harzianum en el tiempo.
Según Fonseca (1998), los factores que afectan el crecimiento poblacional de Trichoderma
son de tipo biótico y abiótico: como por ejemplo, periodos largos de baja humedad
ambiental, pH, concentración de CO2, HCO3, sales y el contenido de materia orgánica son
factores físicos y químicos determinantes para la variación de la poblacional de
Trichoderma.
Danielson y Davey (1973), determinaron un efecto supresor del crecimiento cuando se
aplicaron en el medio de cultivo niveles altos de fertilizantes y Rabeendran et al. (2000),
determinaron un efecto detrimental del nitrato de calcio, generando una supresión del
crecimiento poblacional.
La fertirrigación aplicada en la etapa de semillero en forma de N-NO3 fue de 0,47 g L-1
generando un efecto supresor del crecimiento de Trichoderma, coincidiendo con lo
determinado por Wakelin et al. (1999), quienes determinaron el mayor crecimiento de este
hongo a una concentración de 0,3 g L-1
de N-NO3 y una disminución significativa del
crecimiento a una concentración de 0,5 g L-1
de N-NO3, lo cual coincide con los resultados
obtenidos por Indra y Subbaiah (2003), quienes a su vez también determinaron una
disminución del crecimiento del micelio y de la esporulación de Trichoderma a
concentraciones de 0,52 g L-1
de N-NO3.
Entre los factores de tipo bióticos que afectan el crecimiento de Trichoderma Fonseca
(1998) considera la presencia o ausencia de otros microrganismos en el medio,
61
coincidiendo con Wakelin et al. (1999), quienes determinaron una disminución del
crecimiento de Trichoderma por la presencia de forma natural de microflora en el sustrato.
Lo propuesto por estos investigadores coinciden con los resultados de esta investigación ya
que se determino una alta población de microrganismos existente en el sustrato utilizado,
(ver anexo, Figura 35), y a la vez se coincide con Urrestarazu (2004), el cual afirma que
una gran población de microrganismos se pueden encontrar en turbas utilizadas como
sustratos para la producción de plántulas y en cultivos hortícolas.
4.3.1.3. Interacción entre G. intraradices y T. harzanium
a) Efecto interactivo entre G. intraradices y T. harzanium en la micorrización
La coinoculación entre el hongo micorrítico y Trichoderma harzianum tuvo un efecto
detrimental sobre el porcentaje de micorrización, obteniéndose porcentajes menores a los
tratamientos inoculados solo con Glomus intraradices.
Los resultados de las investigaciones presentan variabilidad y no siguen una sola tendencia;
es así que, Martínez-Medina et al. (2011), determinaron en semilleros de melón un efecto
sinérgico entre Trichoderma harzianum cepa “CECT 20714” y Glomus intraradices
aumentando el porcentaje de micorrización en un 10% cuando ambos fueron inoculados;
sin embargo estos resultados contractan con los resultados obtenidos en esta investigación
ya que al inocular semilleros de melón con Trichoderma harzianum cepa “T-22” y Glomus
intraradices se observo un efecto antagónico disminuyéndose los porcentajes de
micorrización con respecto al mayor valor obtenido, resultados coincidentes a los obtenidos
por Rosseau (1996), quien afirma que T. harzianum presenta una naturaleza agresiva frente
a Glomus intraradices parasitando micelios y esporas y con ello disminuyendo la
intensidad micorrítica.
De lo anterior, se puede deducir que los hongos micorríticos interactúan de diversas formas
con los microrganismos presentes en el suelo, y esta interacción variara según la especie de
62
microrganismos e incluso la cepa aislada. Estas conclusiones coinciden con lo propuesto
por Azcón-Aguilar et al. (2002), quienes señalan que los hongos micorríticos interactúan
con una amplia gama de microrganismos en la rizósfera y cuyos efectos pueden ser
positivos, neutrales o negativos.
Otra explicación, según los autores Fracchia et al. (1998), es la producción y liberación por
parte de Trichoderma sp en la rizósfera compuestos fungistáticos que inhiben el
crecimiento de otras especies de hongos, y además de compuestos tóxicos volátiles y no
volátiles. Por otra parte los microrganismos saprófitos pueden producir anticuerpos u
ocupar rápidamente nichos ecológicos de la micorrizosfera, siendo capaces de utilizar un
amplio grupo de moléculas complejas orgánicas como ligninas, proteínas, glicoproteínas,
celulosa y otros polisacáridos.
La afinidad y los efectos positivos entre las diferentes especies de hongos micorríticos y de
Trichoderma viene dada por las características de ambos hongos, dependiendo de las
características inherentes de cada especie y cada cepa aislada, como también de las
características medioambientales de donde fueron aislados y un origen común son
indicadas por Fracchia et al. (1998); Martínez-Medina et al. (2004); Saldajeno et al. (2008);
Vivas et al. (2003).
Mc Govern et al. (1992), obtuvieron resultados positivos cuando inocularon plantas de
tomate con G. intraradices con un porcentaje de micorrización de un 58,5% pero esto se
revierte cuando se inoculó en conjunto con T. harzianum disminuyendo en un 22,1 %. Esta
disminución también fue determinada por Green et al. (1999), bajo condiciones de
laboratorio cuando se coinocularon diferentes cultivos, obteniéndose una disminución del
14% la micorrización. En semilleros de tomate, Nzanza et al. (2011) obtuvieron también
con la coinoculación una reducción del porcentaje de micorrización en un 15%.
Sin embargo, en frutales, estudios realizados por Camprubí et al. (1995) en plántulas de
Citrus reshni inoculadas con G. intraradices y T. aureoviride, no encontraron diferencias
significativas en el porcentaje de micorrización entre los tratamientos coinoculados con G.
intraradices y T. aureoviride y el tratamiento inoculado solo con G. intraradices.
Resultados similares los obtuvieron Larsen et al. (1999) en la cual el crecimiento y la
63
germinación de esporas de G. intraradices no se vio afectado por la presencia de los hongos
saprófitos como T. harzianum y Fusarium culmorum. Igualmente Fracchia et al. (1998),
determinaron en plantas de soya que la germinación de esporas, la longitud del micelio y el
porcentaje de micorrización de G. mosseae no se afectó por la presencia de T. harzianum y
T. pseudokoningii, al contrario este hongo promovió un mayor porcentaje de micorrización.
b) Efecto de Glomus en la poblacional de Trichoderma
Se observo la misma disminución poblacional entre los tratamientos inoculados solo con
Trichoderma tratamientos (T4 y T8)), y los tratamientos coinoculados (T5, T6 y T7)
deduciéndose que G. intraradices no tuvo un efecto detrimental sobre la población de
Trichoderma, al contrario el efecto por parte de Glomus se considera neutro, coincidiendo
con lo determinado por los autores como Rodríguez et al. (2006); Martínez-Medina et al.
(2004); McAllister et al. (1994) y Calvet et al. (1993) los cuales encontraron efectos
negativos, positivos y neutros en el crecimiento poblacional de Trichoderma sp cuando
fueron inoculados en conjunto con los hongos micorríticos.
Los resultados obtenidos en la población de Trichoderma cuando se coinoculo con Glomus
(T5, T6 y T7) fueron similares a los que se obtuvieron cuando se inoculo solo son
Trichoderma (T4 y T8) por lo que se propone que los factores que influyeron en la
población fueron de tipo biótico y abiótico (ver capitulo 4.3.1.2.).
64
4.3.2. Discusión de los parámetros de crecimiento y bioquímicos
4.3.2.1. Efecto de Glomus intraradices.
Los resultados obtenidos de la inoculación con Glomus intraradices en plántulas de melón
fueron de tipo diferenciado en cuanto a la producción de biomasa, parámetros de
crecimiento, indicadores de estrés y diferenciación de tejidos.
La micorrización con Glomus intraradices en las plántulas de melón ejerció un movimiento
de los fotoasimilados en forma descendente coincidiendo con Wu et al. (2006) que afirman
que el hongo micorrítico genera un movimiento de los fotosintatos en forma basipetala
hacia las raíces. Este movimiento es generado principalmente por el intercambio de
nutrientes entre el hongo y la planta, el hongo aumenta el sistema radicular efectivo a través
de las hifas externas y traspasa a la planta nutrientes mas allá de la zona de agotamiento, a
la vez la planta transporta hacia la raíz carbohidratos que sirven como sustrato para el
crecimiento y desarrollo del hongo micorrítico. Se ha observado que mientras mayor son
los niveles de micorrización mayor son las demandas por sustrato del hongo por ende
mayor es el movimiento de fotoasimilados.
La micorrización de las plántulas estimulo el crecimiento radicular, observándose una
mayor acumulación de materia seca en este compartimento con respecto al tratamiento
testigo, con un ajuste lineal de un 74% entre el porcentaje de micorrización y la
acumulación de materia seca, coincidiendo con lo determinado por González-Monterrubio
et al. (2005), que reportaron un aumento significativo de un 59,2% en la producción de
biomasa seca radical en plántulas de Opuntia streptacatha inoculadas con hongos
micorríticos, y con Huang et al. (2011), al inocular semilleros de melón, obtuvieron
diferencias significativas en el peso seco de la raíz respecto al testigo.
Los parámetros evaluados determinaron plántulas con un mayor vigor al incrementar
significativamente el porcentaje acumulado de materia seca en la raíz hasta un 4% con
respecto al testigo. Estos resultados concuerdan con lo propuesto por Tessi (1991) y Hoyos
(1996), quienes señalan que mientras mayor es la acumulación de materia seca en las
plántulas mayor será la resistencia de estas frente al trasplante, además Tessi (1991),
65
propone que al aumentar en un 1% la materia seca de las plántulas, se incrementa en un
30% el porcentaje de plantas arraigadas, a la vez Oseni et al. (2010), proponen que al
aumentar el peso de las raíces en plántulas micorrizadas hay una correlación positiva con la
absorción de nutrientes y una mejor respuesta en postrasplante expresada en un mayor
crecimiento de las plantas.
Además en plántulas hortícolas micorrizadas se han determinado incrementos en la
producción de biomasa seca total, cilantro, perejil y pimiento (Aguilera-Gómez, 1999),
esparrago y cebolla (Gianinazzi et al., 1989), ají (Castillo et al., 2010), tomate (Javaid y
Riaz, 2008; He et al., 2010; Oseni et al., 2010), pepino (Ortas, 2010).
A pesar de que no se obtuvieron diferencias significativas en el de número de hojas,
superficie foliar y diámetro de tallo, la micorrización estimulo el crecimiento de estos
parámetros; el aumento del diámetro de tallo es concordante con diversos autores que
determinaron un aumento este parámetro cuando las plántulas de Poncirus trifoliata (Wu et
al., 2010), Cucumis melo (Huang et al., 2011), Leucaena leucocephala (Flores-Bello et al.,
2008), Tomate (He et al., 2010), Calocedrus decurrens (Amaranthus y Steinfeld, 2005)
cuando son inoculados con hongos micorrizicos, a su vez, Preciado et al. (2002), afirma
que el diámetro del tallo es un buen indicador del vigor de las plántulas, ya que refleja
directamente la acumulación de fotosintatos, los cuales posterior al trasplante pueden
traslocarse a los sitios de demanda, lo que ha sido confirmado por Ortiz et al. (2009),
señalando que un tallo más grueso implica una mayor área del floema y en consecuencia un
transporte más eficiente y una mayor capacidad de reservas de fotoasimilados.
La micorrización genero un menor índice de ahilamiento favoreciendo una mejor
arquitectura de las plántulas, siendo más robustas y compactas, características deseadas
para obtener plántulas con una mayor capacidad de superar el trasplante y soportar la parte
aérea sin doblarse y evitar la muerte por estrangulamiento de los haces vasculares,
coincidiendo con Preciado et al. (2002). A la vez el parámetro de índice de Ahilamiento
esta ligado a la altura de la planta y al diámetro de tallo, plantas con menor altura y mayor
diámetro de tallo presentan menor grado de etiolación y por lo tanto menor índice de
Ahilamiento.
66
En los indicadores de estrés la micorrización genero plántulas con una mayor relación
PSRz/PSVa con un ajuste lineal de un 56% entre este parámetro y el porcentaje de
micorrización, coincidiendo con Tobar et al. (1994) que señalan que un aumento en la
relación PSRz/PSVa refleja un alto grado de eficacia de los hongos micorrizicos. Este
indicador de estrés nos da una orientación de la respuesta que tendrá la planta frente al
trasplante, donde plántulas con un mayor relación PSRz/PSVa tienen un mayor crecimiento
radicular y un equilibrado crecimiento vegetativo, siendo capaz de soportar el estrés
postrasplante y la demanda hídrica que se genera. Estos resultados concuerdan con los
obtenidos por Meddad-Hamza et al. (2010) en plántulas micropropagas de Olivo, plántulas
de Pepino (Lee y Kim, 2004), plántulas de tomate (Oseni et al., 2010), donde las plántulas
micorrizadas aumentaron la relación PSRz/PSVa.
En cuanto a los parámetros de producción de biomasa seca de tallo y hojas, la altura de
planta y la superficie foliar específica no se observo una diferencia significativa de las
plantas inoculadas con respecto al tratamiento no inoculado, a pesar de que el tratamiento
que obtuvo un mayor porcentaje de micorrización (T2) presento mayores valores en estos
parámetros con respecto al testigo, estos resultados coinciden con los resultados
determinados por Meddad-Hamza et al. (2010) en semilleros de olivo y Oseni et al. (2010)
en semilleros de tomate. Como se explico anteriormente la micorrización genera un
desplazamiento de fotoasimilados hacia la raíz y como consecuencia de esto no se genera
una estimulación del crecimiento vegetativo en los semilleros debido a la menor
disponibilidad de carbohidratos en las hojas, coincidiendo con Mummey et al. (2009), los
cuales determinaron que durante la etapa de semillero las plántulas no aumentan su
crecimiento vegetativo debido a la demanda por carbohidratos que generan los hongos
micorríticos, determinándolo como el costo inicial de las plantas en la etapa de semillero.
Este ultimo punto puede ser en gran parte un beneficio para la producción de semilleros y
las características de las plántulas, ya que al generarse un movimiento basipetalo de los
fotoasimilados se genera un crecimiento controlado en la altura de las plantas, evitando un
crecimiento vegetativo exacerbado y disminuyendo la competencia por la energía lumínica
que se producen en los semilleros, cuya competencia genera plantas con un mayor grado de
etiolación y afecta negativamente la calidad de los semilleros.
67
En la actividad enzimática de la nitrato reductasa la inoculación con G. intraradices no
afectó significativamente la actividad endógena e inducida en la hoja y la relación entre
ellas según los análisis estadísticos, pero al realizar un análisis mas detallados de los datos
arrojados en la relación NRI/NRE se observa que las plantas micorrizadas aun presentan
una disponibilidad enzimática para reducir el nitrato, con valores de 18; 24 y 39% T1, T2 y
T3, respectivamente, a diferencia del tratamiento testigo que su sustrato disponible solo es
de 1%.
Esta mayor disponibilidad de enzima en los tejidos verdes es causada por que gran parte del
nitrato que fue aportado a través de la fertilización era captado por el micelio externo de los
hongos micorríticos y reducido por estos coincidiendo con lo determinado por Bago et al.
(1996) y Johansen et al. (1996) afirman que el micelio externo de los hongos micorríticos
son capaces de captar nitrógeno nítrico desde la solución suelo, y Tilak y Dwivedi (1990) y
Subramanian y Charest (1998), señalan que los hongos micorríticos poseen la capacidad de
reducir el nitrato a través de la enzima nitrato reductasa en el micelio.
Govindarajulu et al. (2005) y Jin et al. (2005), afirman que el nitrato es reducido al interior
del micelio extra radical y convertido en amonio, posteriormente el amonio es convertido
en forma secuencial en glutamina, arginina, urea y por ultimo es convertido nuevamente a
amonio, el cual es transferido a la planta para la producción de proteínas. A su vez,
Fuensanta et al. (2003) determinaron una mayor actividad de la enzima nitrato reductasa en
raíces de plantas colonizadas con hongos micorrizicos.
4.3.2.2. Efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum.
Con los resultados expuestos podemos afirmar que la inoculación con T. harzianum en las
plántulas de melón no tuvo un efecto real como promotor de crecimiento bajo las
condiciones climáticas y de manejo agronómico en las que se realizo esta investigación, no
encontrándose diferencias significativas en los parámetros bioquímicos y de crecimiento.
68
Los resultados de esta investigación coinciden con los resultados reportados por Mastouri et
al. (2010), los cuales en semilleros de tomate bajos condiciones normales de crecimiento no
encontraron un efecto de Trichoderma harzianum cepa “T-22”, como promotor de
crecimiento, a la vez coincidiendo con Martínez et al. (2004) en plántulas de soya (Glicine
max) y Mwangi et al. (2011) en plántulas de tomate que fueron inoculadas T. koningii y T.
pseudokoningii respectivamente, en la cual no encontraron efecto alguno en la producción
de biomasa aérea y radical respecto a las plantas testigos. De igual manera Ozbay et al.
(2004) en semilleros de tomate inoculados con T. harzianum cepa T-22 y T-95, no
encontraron un efecto significativo sobre los parámetros de crecimiento.
Mastouri et al. (2010), afirma que el efecto de Trichoderma en las plantas es mayor bajo
condiciones estresantes para los cultivos, y que su efecto en ausencia de estas condiciones
puede o no ser positivo, confirmado por Bae et al. (2009), quienes determinaron un efecto
promotor de Trichoderma hamatum en la producción de biomasa en plántulas de cacao bajo
condiciones de estrés hídrico, atribuyendo este crecimiento a que Trichoderma aumenta la
tolerancia a condiciones de estrés abióticos debido al mejoramiento del crecimiento de la
raíz, con lo cual se mejora la capacidad de absorción de agua y nutrientes. Otros autores,
que coinciden son McGorven et al. (1992) encontraron un efecto promotor en la producción
de biomasa seca foliar y un efecto neutral en la producción de biomasa seca radicular en
plántulas de tomate bajo condiciones de estrés hídrico inoculadas con T. harzianum.
En contraste a los resultados de esta investigación Azarmi et al. (2011) inocularon
semilleros de tomate con T. harzianum cepa T-969 y cepa T-447, encontrando que ambas
cepas inoculadas por si solas tuvieron un efecto promotor sobre los parámetros de
crecimiento, ensayo llevado a cabo bajos condiciones optimas de crecimiento.
El efecto que produzca Trichoderma sobre los cultivos dependerá mucho de las
características intrínsecas de la especie del hongo y la cepa aislada, y la afinidad que tenga
con el cultivo. Es así que Yedidia et al. (2001), determinaron un efecto promotor en
plántulas de pepino inoculadas con T. harzianum cepa T-203, generando un aumento en el
peso seco y mejoramiento de la nutrición mineral, principalmente por la acción
solubilizadora de nutrientes y la capacidad de producir hormonas que estimulan el
69
crecimiento, contractando con los resultados de esta investigación en semilleros de melón
tipo Inodorus inoculados con Trichoderma harzianum cepa “T-22”.
En cuanto a los resultados obtenidos de la actividad de la enzima nitrato reductasa, los
resultados obtenidos de la actividad de la enzima nitrato reductasa endógena e inducida son
sólo de carácter orientativo, ya que al observar los valores de la relación NRI/NRE se
evidencia que no hay sustrato disponible para la reducción de nitratos en las células
vegetales, siendo 1% el valor en T0, en T4 y T8 de 0%, lo que significa que todo los nitratos
aplicados a través de la fertilización fueron absorbidos por las plantas y reducidos por éstas,
por lo que se considera que Trichoderma no tuvo ningún efecto en la absorción de nitratos
por consecuencia no presento efecto sobre la actividad de la enzima nitrato reductasa.
4.3.2.3. Efecto de la interacción de Glomus y Trichoderma.
Los resultados obtenidos muestran un efecto supresor de Trichoderma sobre los efectos
positivos que fueron determinados en las plántulas cuando se inoculó solamente con
Glomus, por lo tanto no se observo un efecto positivo con la coinoculación, al contrario
como se discutió anteriormente Trichoderma tuvo un efecto detrimental sobre los niveles
de micorrización lo que afecto el crecimiento de las plántulas.
Mwangi et al. (2009) determinaron para el parámetro altura de planta resultados similares a
los de esta investigación en semillero de tomate, no así en esquejes de Camellia sinensis
encontrando resultados que contractan a los de esta investigación; de igual manera
diferentes autores obtuvieron en sus investigaciones resultados neutros, sinérgicos y
detrimentales. Es así como Melgar (2007), encontraron un efecto neutro en plántulas de
pepino, tomate y pimiento cuando fueron inoculadas con Trichoderma sp y Glomus sp; sin
embargo, Martínez et al. (2004) y Mesa et al. (2006), determinaron un efecto detrimental
en plántulas de soya y Carica papaya cuando fueron inoculadas con Gigaspora rossea y T.
harzianum y G. fasciculatum y T. harzianum, respectivamente.
Mwangi et al. (2011) en semilleros coinoculados con Trichoderma y hongos micorrizicos
alcanzaron los valores más altos en diferenciación y crecimiento. El inóculo utilizado por
70
estos investigadores fue una mezcla de hongos micorríticos cuyo producto contenía cuatro
especies del genero Glomus, tres de Acaulospora y una de Gigaspora y cada especie de
hongo micorrítico tuvo un comportamiento diferenciado frente a Trichoderma. La ventaja
del uso de varias especies radica en que cada especie de hongo micorrítico presenta una
característica diferente, algunos aumentan la absorción de fosforo, otros de nitrógeno, otros
aumentan la resistencia a estrés de tipo biótico y abióticos, con lo cual se obtiene una
amplia gama de posibilidades para mejorar el comportamiento de las plantas.
El motivo por qué no se observo en esta investigación un efecto promotor de crecimiento y
se obtuvieron efectos detrimentales sobre las plántulas cuando se realizo una doble
inoculación con hongos micorríticos y Trichoderma se debe principalmente por la
competencia que se produce entre ambos microrganismos por un nicho ecológico y por
nutrientes. Trichoderma disminuyo e inhibió el crecimiento de Glomus durante los
primeros días que este fue aplicado, teniendo como consecuencia la disminución del
porcentaje de micorrización y por consecuencia el efecto promotor de crecimiento por parte
de Glomus fuera menor.
Esta competencia entre ambos microrganismos se acentúa mas en condiciones de campo,
siendo muy diferentes a los resultados encontrados en investigaciones realizadas en
condiciones controladas de laboratorio, concordando con lo determinado por Calvet et al.
(1992) y McAllister et al. (1994). Los resultados benéficos obtenidos entre la interacción de
hongos micorríticos y T. harzianum en condiciones controladas de laboratorio no siempre
se reflejarán la respuesta en experimentos de campo debida a la participación de otros
factores.
Las líneas investigativas que analizan el efecto de la coinoculación con hongos micorríticos
y hongos saprofitos en los cultivos han demostrado resultados diversos, como se explico
anteriormente, obteniendo como conclusión que para que exista afinidad y esto resulte en
un efecto sinérgico sobre el mejoramiento de la producción de biomasa, hay que evaluar las
características intrínsecas de ambos microrganismos: dependiendo de la especie y de la
cepa aislada, como también de las condiciones medioambientales de donde fueron aislados
71
e igualmente si ambos tienen un origen en común, y esto concuerda con lo publicado por
Fracchia et al. (1998), Martínez et al. (2004), Saldajeno et al. (2008) y Vivas et al. (2003).
Los resultados de la actividad enzimática de nitrato reductasa demuestran que la
inoculación en conjunto de Glomus y Trichoderma no tuvo ningún efecto, observándose el
mismo comportamiento enzimático de la inoculación solo con Glomus, determinando a
través de la relación NRI/NRE, la presencia de enzima disponible para la reducción de
nitratos.
72
4.4. Cultivo
Se realizo un muestreo destructivo a los 118 días post trasplante. En estas plantas se
realizaron análisis físicos, microbiológicos y bioquímicos, presentándose los resultados por
separado para G. intraradices y T. harzianum y el efecto interactivo entre G. intraradices y
T. harzianum.
A continuación se presentan antecedentes generales del régimen térmico durante el
desarrollo del cultivo y desordenes fitopatológicos que afectaron al cultivo.
Con respecto al régimen térmico los antecedentes obtenidos son los siguientes:
a) Temperatura
En la etapa de cultivo se realizó un registro continuo de temperaturas a través de un sensor
Keytag (Keylog Recorder ®) localizado en el interior del invernadero, desde el 19 de abril
(día del trasplante) hasta el 13 de agosto (día 118 postrasplante).
Se instaló un túnel dentro del invernadero con la finalidad de aumentar las temperaturas
nocturnas, las cuales fueron registradas de forma continua a través de un sensor Keytag
(Keylog Recorder ®).
En la Figura 17, se presenta el promedio de temperaturas diarias registradas en la etapa de
cultivo en el invernadero y túnel, además se incluyen las temperaturas mínimas y máximas
óptimas que requiere el cultivo de melón, que según Canton (1999), están entre 30 °C y 15
ºC.
73
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Temperatura Tunel
Temperatura Invernadero
Figura 17.- Temperaturas promedios diarias registradas durante la etapa de cultivo (Abril a
Agosto del 2008). Estación Experimental Canchones.
Las temperaturas máximas y mínimas absolutas registradas en el invernadero superaban en
8ºC y en 14 ºC las óptimas del cultivo de melón, produciéndose estrés en las plantas por
altas y bajas temperaturas; sin embargo, en el túnel sólo se presentaron restricciones debido
a las temperaturas mínimas que durante 14 horas estaban por debajo del umbral de los 15
ºC determinando un menor crecimiento en el cultivo. En el túnel se consiguió propiciar
condiciones más favorables para el crecimiento del cultivo.
Las temperaturas minimas (2-4°C) y máximas (30-40°C) registradas en esta investigación
ejercieron un efecto detrimental en el desarrollo del cultivo. Las temperaturas registradas
estaban bajo la temperatura minima biológica de 15°C y sobre la temperatura máxima
biológica de 30°C. Según Canton (1999) bajo la temperatura minima biolgica en las plantas
se produce detención del crecimiento vegetativo, daños fisiológicos y malformaciones en
las hojas, y Lorenzo et al. (2000) propone que a temperaturas superiores a los 30°C se
observan desordenes fisiológicos.
Temp. Max. Biológica.
Temp. Min. Biológica.
74
b) Desorden Fitopatológico
Con motivo de la observación de síntomas fitopatológicos principalmente en las raíces y
tallo en las plantas de melón a los 118 días postrasplante se realizó un muestreo destructivo
(Figuras 18).
Figura 18.- A: síntomas de declinación general en plantas de melón atacada por Fusarium.
B: síntomas en el tallo de la planta de melón.
Para certificar los síntomas visuales observados en las plantas se tomaron muestras de
tejidos (raíz y tallo) para la realización de cultivos utilizando como sustrato Agar Papa
Dextrosa, sembrando el material vegetal en placas Petri (30 placas) e incubadas en una
cámara de crecimiento a 25 ºC por un tiempo de 7 días.
Posterior al período de incubación se tomaron muestras del micelio del hongo colocándose
sobre un portaobjeto y se realizó una tinción con Azul de lactofenol para facilitar la
observación en el microscopio (100x). Los resultados obtenidos determinaron la presencia
de Fusarium sp, observándose las estructuras típicas de este fitopátogenos causante de los
desórdenes fitopatológicos, comprobándose a través de bibliografía (Figura 19).
A B
75
Figura 19.- A: crecimiento de micelio de Fusarium proveniente de las muestras vegetales
de melón. B: macroconidios septados de Fusarium (100x).
Se logró identificar además a la turba utilizada como sustrato como la fuente de infección.
Para determinar la presencia del hongo se tomó muestra de la turba que fue diluida a una
proporción de 1:10 y sembradas en placas Petri utilizando Agar Papa Dextrosa como fuente
de carbono. Los resultados determinaron un crecimiento de micelio rosado, el cual se aisló
y se resembro obteniendo de esta forma un cultivo puro el cual fue identificado en el
microscopio como Fusarium sp a través del reconocimiento de sus estructuras típicas
(Figura 20).
Figura 20.- A: crecimiento de Fusarium a partir de la muestra de sustrato sin uso. B:
resiembra en placas Petri del crecimiento de Fusarium aislado desde la muestra de turba.
Laboratorio de Fitopatología Departamento de Agricultura y Biotecnología, Universidad
Arturo Prat
A B
A B
76
4.4.1. Análisis microbiológico
Se analizan y se discuten por seprados el efecto de la inoculación con G. intraradices, T.
harzanium y la interacción sobre los parámetros poblacionales de las dos especies de
hongos: porcentaje de micorrización y la variación poblacional, en el cultivo de melón
Inodorus.
4.4.1.1. Glomus intraradices
Porcentaje de Micorrización
En la fase de cultivo, el porcentaje de micorrización con G. intraradices en las plantas de
melón a los 118 días postrasplante se obtuvieron diferencias significativas entre los
tratamientos T2 y T3 con respecto al testigo, el tratamiento T1 fue estadísticamente igual a
los tratamientos T2 y T3 y al tratamiento testigo.
El tratamiento T2, presentó el mayor porcentaje de micorrización con un valor de 37,9%
superior en un 10,8 y 23,7% comparado con los tratamientos T1 y T3, respectivamente, el
tratamiento testigo al igual que en la etapa de semillero no presento estructuras fúngicas en
sus raíces (Figura 21).
Figura 21.- Porcentaje de micorrización con G. intraradices en raíces de melón Inodorus
var. Honeydew a los 118 días desde el trasplante. Letras distintas en cada barra representan
diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05).
0
10
20
30
40
50
60
T0 T1 T2 T3
Mic
orr
izac
ión
(%
)
Tratamientos
b
ab
b
a
77
Al comparar los resultados de la micorrización de la etapa post trasplante con la etapa de
semillero, se observa una disminución en la intensidad de micorrización en todos los
tratamientos inoculados (Figura 22). El porcentaje de micorrización disminuyó en un
35,7% el T1, 23.8% el T2 y un 36,2% el T3, con respecto a la etapa de semillero (Día 50).
Figura 22.- Variación del porcentaje de micorrización con G. intraradices entre el muestreo
a los 50 días de siembra (Semillero) y a los 118 postrasplante.
4.4.1.2. Trichoderma harzianum
Variación poblacional de Trichoderma harzianum
En la etapa de cultivo se presentaron diferencias significativas (p-valor = 0,0001) en la
población de T. harzianum en las muestras de sustrato, donde el T4 presentó un número
mayor de colonias con respecto al T8 (Figura 23).
Figura 23.- Valores medios para el logaritmo10 de unidades formadoras de colonia de T. harzianum
por gramo de suelo seco en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew a los 118 días
postransplante. Letras distintas representan diferencias significativas según el Test de LSD
(p<0,05).
0,00
20,00
40,00
60,00
T0 T1 T2 T3
Mic
orr
izac
ión
(%
)
Dia 50 Dia 118
78
Se observa que la poblacion disminuyo entre el dia 50 y el dia 168, siendo esta disminucion
en menor medida con respecto a la disminucion que se observo en entre el dia 1 y el dia 50.
Los poblacion de Trichoderma disminuyo en un 12 y 24%, T4 y T8 respectivamente.
4.4.1.3. Interacción de Glomus y Trichoderma
a) Efecto interactivo entre G. intraradices y T. harzanium en la micorrización
En la etapa de cultivo, a los 118 días postrasplante no se encontraron diferencias
significativas en el porcentaje de micorrización, entre el tratamiento testigo y los
tratamientos que fueron inoculados con G. intraradices y T. harzianum (Figura 24).
Figura 24.- Porcentaje de micorrización con G. intraradices y T. harzianum en raíces de
melón Inodorus var. Honeydew a los 118 postrasplante. Letras iguales en cada barra no son
estadísticamente diferente según el Test de LSD (p>0,05).
A su vez, el porcentaje de micorrización obtenido en las plantas de melón cuando fueron
coinoculadas con G. intraradices y T. harzanium fueron menores al compararlos con los
valores obtenidos en la inoculación solo con G. intraradices (ver capitulo 4.4.1.1.), y se
presenta una tendencia similar a la obtenida en semillero (ver capitulo 4.2.1.1). Los valores
obtenidos en la etapa de cultivo en los tratamientos T1, T2 y T3 inoculados con G.
intraradices fueron de 10,85; 37,95 y 23,17%, respectivamente, siendo mayores que los
0
5
10
15
20
25
30
T0 T5 T6 T7
Mic
orr
izac
ion
(%
)
Tratamientos
a
a
a
a
79
tratamientos T5, T6 y T7 inoculados con G. intraradices y T. harzianum con valores de 3,1;
8,78 y 4,58%, respectivamente.
Por otro lado al comparar el porcentaje de micorrización entre el último muestreo realizado
en la etapa de semillero (50 días) y en la etapa de cultivo (168 días), se presentó una
disminución con valores de un 61; 59 y 70% para los tratamientos T5, T6 y T7
respectivamente (Figura 25), siendo similares a la tendencia de los resultados determinados
solo con la inoculación con G. intraradices (Figura 23).
Figura 25.- Variación del porcentaje de micorrización entre el muestreo a los 50 días
(semillero) y 118 días postrasplante de melón derivado de la inoculación con G.
intraradices y T. harzianum.
b) Efecto de Glomus en la poblacional de Trichoderma
La variacion poblacional de T. harzianum cuando se coinocula con G. intraradices se
presenta en la figura 26. Los resultados obtenidos determinaron que no se presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos que fueron inoculados con las dos especies
de hongos. El tratamiento testigo no presentó presencia de los hongos evaluados.
Se observo una disminución de la población de Trichoderma en el tiempo, siendo mayor
esta disminución entre el día 1 y 50, posteriormente la diminución es menor y la población
tiende a estabilizarse. La población disminuyo en un 9; 20 y 18% en el T5, T6 y T7,
respectivamente.
0,00
20,00
40,00
60,00
T0 T5 T6 T7
Mic
orr
izac
ión
(%
)
Dia 50 Dia 118
80
Figura 26.- Valores medios para el logaritmo10 de unidades formadoras de colonia con T.
harzianum y G. intraradices por gramo de suelo seco en el cultivo de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 postransplante. Letras distintas representan diferencias significativas
según el Test de LSD (p<0,05).
4.4.2. Parámetros físicos y bioquímicos.
Se analiza y se discuten por separado el efecto de la inoculación con G. intraradices, T.
harzanium y la interacción de estos sobre la producción de biomasa, diferenciación de
tejidos, crecimiento y la actividad enzimática de nitrato reductasa en el cultivo de melón
Inodorus.
4.4.2.1. Efecto de Glomus intraradices en los parámetros físicos y bioquímicos
a) Producción de biomasa
En el muestreo destructivo realizados a los 118 días postrasplante se determinó el efecto de
la inoculación con G. intraradices en la producción de biomasa seca de hojas, tallo y raíz
en el cultivo de melón (Figura 27).
81
Figura 27.- Producción de biomasa seca en plantas de melón inoculadas con G. intraradices. (A) Peso
seco hoja (g). (B) Peso seco de tallo (g). (C) Peso seco raíces (g). (D) Peso seco total (g). Letras distintas
en cada barra representan diferencias significativas según el Test de LSD (p<0,05).
Los resultados obtenidos determinaron que la inoculación con la dosis de 40 esporas *plata-
1 de G. intraradices en la etapa de siembra, determinó en la etapa de postransplante una
mayor producción de biomasa seca compartamentalizada en hoja, tallo y raíz y
estadísticamente diferentes a los otros tratamientos inoculados con Glomus y el Testigo.
Los valores obtenidos son mayores en un 543% en el peso seco de hojas, 458% en el peso
seco de tallo, 121% en el peso seco de raíz y un 424% en el peso seco total, con respecto al
tratamiento testigo.
0
4
8
12
16
20
T0 T1 T2 T3
Tratamientos
a a
b
a
Pes
o s
eco
Ho
ja (
g)
0
1
2
3
4
5
6
T0 T1 T2 T3
Tratamientos
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
a
b
a a
0
1
2
3
T0 T1 T2 T3
Tratamientos
Pes
o s
eco
raí
z (g
) b
a a a
0
5
10
15
20
25
30
T0 T1 T2 T3
Tratamientos
Pes
o s
eco
to
tal
(g
)
b
a a a
A B
C
82
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
Los parámetros de crecimiento y diferenciación en las plantas de melón inoculadas con
Glomus en la etapa de cultivo fueron afectados significativamente por la inoculación con G.
intraradices (Cuadro 20).
Los resultados obtenidos muestran que la inoculación con dosis 40 esporas*planta-1
de
Glomus (T2) determinó plantas con una arquitectura más equilibrada al compararla con los
otros tratamientos que fueron inoculados con Glomus y el tratamiento control. Este
tratamiento presentó un mayor desarrollo en el diámetro del tallo y una mayor superficie
foliar determinada por el número de hojas diferenciadas.
El número de hojas fue el doble a los otros tratamientos inoculados con Glomus y control y
la superficie foliar en 3,7 veces al control. Estos resultados muestran un efecto promotor de
la micorrización con Glomus en plantas de melón.
Cuadro 20.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Glomus intraradices.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) SF (cm2) N° de hojas
T0 0,63a 69,60a 329,84a 19,5a
T1 0,57a 80,45a 456,89a 21,0a
T2 1,09b 166,0b 1243,41b 52,0b
T3 0,65a 99,43a 489,06a 22,33a
p-valor 0,0078 0,0364 0,0187 0.0213
: DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; SF: Superficie Foliar. Valores medios
seguidos por diferentes letras en la misma columna difieren estadísticamente según el Test
LSD (p<0,05).
c) Actividad enzimática de nitrato reductasa
Los resultados del efecto de la inoculación con G. intraradices en la actividad enzimática
de la nitrato reductasa en muestras de tejidos verdes (hojas) tomadas a los 118 días
postrasplante en el cultivo se presentan en el cuadro 21. La inoculación con G. intraradices
83
no afectó significativamente la actividad de la enzima endógena e inducida y su relación en
la hojas de melón en todos los tratamientos inoculados y el control.
Cuadro 21.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con G. intraradices, a los 118 días postrasplante.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 0,96a 2,34a 2,61a
T1 0,60a 1,57a 2,65a
T2 0,45a 1,71a 3,87a
T3 0,58a 1,70a 2,94a
p-valor 0,0683 0,0519 0,1590
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
letras iguales en la misma columna no difieren estadísticamente según el Test LSD
(p>0,05).
La fertilización nitrogenada aplicada en la disolución nutritiva en la etapa de cultivo fue de
18 meq L
-1 NO3, sustrato que no fue utilizado en un 100% por la enzima nitrato reductasa,
quedando reflejado en una relación NRI/NRE > 1, lo que significa que no todo el nitrato
aportado era reducido y utilizado por las plantas. Observándose nitrato reductasa disponible
con valores que van desde 161, 165, 287 y 194%, T0, T1, T2 y T3, respectivamente.
4.4.2.2. Efecto de Trichoderma harzianum en los parámetros físicos y bioquímicos
a) Producción de biomasa
El efecto de la inoculación con T. harzianum en la producción de biomasa seca
compartamentalizada y total en el cultivo de melón a los 118 días postrasplante se
presentan en la Figura 28. La inoculación con Trichoderma no determinó diferencias
significativas en la producción de biomasa entre el tratamiento inoculado y el tratamiento
testigo.
84
Figura 28.- Producción de biomasa seca en la etapa de cultivo en melón inoculadas con T. harzianum.
(A) Peso seco hoja (gr). (B) Peso seco de tallo (gr). (C) Peso seco raíces (gr). (D) Peso seco total (gr).
Letras iguales en cada barra no son estadísticamente diferentes según el Test de LSD (p>0,05).
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
La inoculación con Trichoderma harzianum en el cultivo de melón solo determinó
diferencias estadísticas significativas en la diferenciación de tejidos a los 118 días
postrasplante (Cuadro 22). Observándose en el número de hojas el tratamiento T4 fue
superior en un 103% con respecto al tratamiento control.
0
2
4
6
8
T0 T4
Tratamientos
Pes
o s
eco
Ho
ja (
g)
a
a
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
T0 T4Tratamientos
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
a
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
T0 T4
Tratamientos
Pe
so s
eco
raí
z (g
)
0
2
4
6
8
10
12
T0 T4
Tratamientos
Pe
so s
eco
to
tal
(g)
a
a
a
a
A
D C
B
85
Cuadro 22.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Trichoderma harzianum.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) SF (cm2) N° de hojas
T0 0,63a 69,60a 329,84a 19,50a
T4 0,74a 92,73a 717,23a 39,67b
p-valor 0,4132 0,4414 0,1177 0,0242
DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; SF: Superficie Foliar. Valores medios seguidos por
diferentes letras en la misma columna difieren estadísticamente según el Test LSD
(p<0,05).
c) Actividad enzimática de nitrato reductasa
La inoculación con T. harzianum no afectó la actividad enzimática de la nitrato reductasa
en tejidos verdes (hojas) del cultivo de melón Inodorus a los 118 días postsiembra (cuadro
23). Se presenta un remanente de sustrato para que ser reducido, siendo mayor en las
plantas control en un 15% con respecto a las plantas inoculadas. Observándose nitrato
reductasa disponible con valores de 161 y 126%, T0 y T4, respectivamente.
Cuadro 23.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con T. harzianum, a los 118 días postransplante.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 0.96a 2.34a 2.61a
T4 0.90a 1.95a 2.26a
p-valor 0.8275 0.3649 0.6570
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
letras iguales en la misma columna no difieren estadísticamente según el Test LSD
(p>0,05).
86
4.4.2.3. Efecto de la interacción de Glomus intraradices y Trichoderma harzianum
a) Producción de biomasa
El efecto de la coinoculación con G. intraradices y T. harzianum en la producción de
biomasa seca compartamentalizada y total en el cultivo de melón a los 118 días
postrasplante se presentan en la Figura 29. No se encontraron diferencias significativas
entre los tratamientos inoculados y el tratamiento control, determinándose que no hubo un
efecto sinérgico entre los dos hongos inoculados sobre la producción de biomasa.
Figura 29.- Producción de biomasa seca en la etapa de cultivo en melón inoculadas con G.
intraradices y T. harzianum. (A) Peso seco hoja (gr). (B) Peso seco de tallo (gr). (C) Peso seco raíces
(gr). (D) Peso seco total (gr). Letras iguales en cada barra no son estadísticamente diferentes según el
Test de LSD (p>0,05).
0
1
2
3
4
5
6
7
T0 T5 T6 T7
Pes
o s
eco
ho
ja (
g)
Tratamientos
a
a a
a
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
T0 T5 T6 T7Tratamientos
Pes
o s
eco
tal
lo (
g)
a
a a
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
T0 T5 T6 T7
Tratamientos
Pes
o s
eco
raí
z (g
)
a a a a
012345678
T0 T5 T6 T7
Tratamientos
Pes
o s
eco
to
tal
(g)
a a a
a
D C
B A
87
b) Parámetros de diferenciación y crecimiento
La coinoculación con Glomus intraradices y Trichoderma harzianum en plantas de melón
no generó ningún efecto significativo entre los tratamientos con plantas inoculadas y
control en los parámetros de crecimiento y diferenciación a los 118 días postrasplante
(Cuadro 24). Al igual que en el parámetro de producción de biomasa no se genero un efecto
sinérgico entre ambos inoculantes, por lo tanto no hubo un efecto promotor sobre los
parámetros de crecimiento y diferenciación de tejido en las plantas de melón.
Cuadro 24.- Parámetros de crecimiento y diferenciación en plantas de melón Inodorus var.
Honeydew a los 118 días postrasplante, inoculadas con Glomus intraradices y Trichoderma
harzianum.
Parámetros
TRATAMIENTOS DT (cm) AP (cm) SF (cm2) N° de hojas
T0 0,63a 69,60a 329,84a 19,5a
T5 0,59a 85,87a 392,09a 22,33a
T6 0,61a 69,88a 387,92a 20,75a
T7 0,54a 95,55a 497,39a 23,25a
p-valor 0,6191 0,8883 0,9241 0,9339
DT: Diámetro de tallo; AP: Altura de Planta; SF: Superficie Foliar. Valores medios
seguidos por letras iguales en la misma columna no difieren estadísticamente según el Test
LSD (p>0,05).
c) Actividad enzimática de nitrato reductasa
Los resultados del efecto de la coinoculación con G. intraradices y T. harzianum en la
actividad enzimática de la nitrato reductasa se presentan en el Cuadro 25. No se obtuvieron
diferencias significativas en la actividad endógena de la enzima nitrato reductasa entre los
tratamientos inoculados y el control, pero si se observo diferencias significativas en la
actividad de nitrato reductasa inducida entre los tratamientos inoculados con respecto al
control, siendo este ultimo el que presento el mayor valor.
A la vez se observa altos niveles de enzima disponible al obtenerse una relación NRI/NRE
˃ 1, no presentándose una reducción total de los nitratos aplicados a través de la
fertilización.
88
Cuadro 25.- Indicadores Bioquímicos en el cultivo de melón Inodorus var. Honeydew
inoculado con G. intraradices y T. harzianum, a los 118 días postrasplante.
TRATAMIENTOS
Parámetros
NRE
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI
(µM de NO2- g-1
pf h-1
.) NRI/NRE
T0 0,96a 2,34b 2,61a
T5 0,65a 1,66a 2,57a
T6 0,70a 1,55a 2,30a
T7 0,81a 1,64a 2,10a
p-valor 0,3510 0,0055 0.6610
NRE: Nitrato Reductasa Endógena; NRI: Nitrato Reductasa Inducida; NRI/NRE: Relación
(Nitrato Reductasa Endógena/Nitrato Reductasa Inducida). Valores medios seguidos por
diferentes letras en la misma columna difieren estadísticamente según el Test LSD
(p<0,05).
89
4.4.3. Discusión de los análisis microbiológicos
4.4.3.1. Inoculación solo con Glomus intraradices.
Se observo una disminución entre los porcentajes de micorrización obtenidos en la etapa de
semillero y los porcentajes de la etapa de cultivo, en todos los tratamientos inoculados,
siendo varios los factores que pueden determinar esta disminución.
La fertilización es uno de los factores críticos que afecta el éxito de la micorrización, siendo
de suma importancia que sea evaluado en futuras investigaciones, coincidiendo con lo
propuesto por Sánchez (1993) el cual afirma que la alta disponibilidad de nutrientes en el
sustrato disminuye las estructuras micorríticas en el interior de las raíces y al contrario
niveles reducidos de fertilizantes aumentan la masa endófita del hongo micorrítico. En la
etapa de semillero se fertilizo con niveles de nitrato de 0,46 g L-1
y en la etapa de
postrasplante estos niveles aumentaron a 1,2 g L-1
disminuyendo la micorrización en un
55,7% el T1, 31,3% el T2 y un 53,1% el T3, coincidiendo con lo determinado por Martínez-
Medina et al. (2011), quienes al aumentar los niveles de nitrato de 0,17 a 0,51 g L-1
el
porcentaje de micorrización disminuyo sobre un 30%. A la vez Gianinazzi (1989), y
Hernández (2001), proponen que una disminución de la relación carbono/nitrógeno
determina una menor susceptibilidad de las raíces a ser micorrizadas.
Otro de los factores que afectan los niveles de micorrización es la alta oscilación térmica
registrada durante la etapa de cultivo que alcanzo oscilación de 25 °C (T° Mín: 5°C y T°
Máx: 30 °C), afectando principalmente el proceso de fotosíntesis en las plantas, lo que
conlleva a una baja producción de fotoasimilados translocables hacia las raíces (Brundrett,
2002). Los carbohidratos producidos en la fotosíntesis y translocados hacia las raíces son el
sustrato principal utilizado por los hongos micorríticos en su ciclo de vida, al disminuir los
carbohidratos disponibles en las raíces se afecta el proceso de micorrización disminuyendo
la masa endófita del hongo micorrítico al interior de las raíces. Las temperaturas óptimas
para el proceso de micorrización van desde los 10 °C hasta los 35 °C según Daniels y
Trappe (1980), variando según la especie del hongo micorrítico y las condiciones
medioambientales de donde fue aislado.
90
También se ha observado un menor crecimiento de los hongos micorríticos respecto a las
raíces a temperaturas bajas según Hayman (1974), quien además propuso que las
temperaturas desfavorables e intensidades luminosas extremas influyen en la eficacia
infectiva de los hongos micorrizicos. También, Verkade y Hamilton (1982) obtuvieron una
disminución del 150% en el crecimiento de los hongos micorríticos respecto de las raíces a
una temperatura de 10°C. Un mayor crecimiento de las raíces con respecto de los hongos
micorríticos afecta el porcentaje de micorrización ya que el hongo no puede colonizar toda
la raíz disminuyendo la intensidad relativa de micorrización.
4.4.3.2. Variación poblacional de Trichoderma harzianum.
Los resultados obtenidos muestran un fuerte descenso en la población de T. harzianum
entre el día 1 y 50 equivalente a un 51% y un descenso más estabilizado entre este punto y
los 118 días equivalente a un 11%. Entre el muestreo a los 50 dias postsiembra y 118
postrasplante no se observa un crecimiento de la poblacion de Trichoderma en el sustrato,
sobre todo si se considera que Trichoderma es muy eficiente en la colonizacion de suelos y
especie dominante de la microflora del suelo, al contrario se observa un decenso en la
poblacion.
Las causas de la diminucion son las mismas que fueron determinadas en la etapa de
semillero (capitulo 4.3.1.2.), las cuales corresponden a factores de tipo biotico y abioticos,
como son los nieveles de nitrato aplicados, siendo mayores en la etapa de cultivo (1,2 g L-1
de nitrato), y la poblacion microbiana presente en el sustrato. Ademas a estos factores se
suma las temperaturas registradas en la etapa de postrasplante (ver Figura 17), con
temperaturas inferiores a los 15 °C durante 14 horas, coincidiendo con lo determinado por
Knudsen y Bin (1990), los cuales confirman que T. harzianum crece mejor en condiciones
de temperaturas calidas, tolerando temperaturas entre los 30 a 35°C, con una temperatura
media de 25°C.
91
4.4.3.3. Interacción entre G. intraradices y T. harzianum
a) Efecto interactivo entre G. intraradices y T. harzianum en la micorrización
Los resultados obtenidos siguen la misma tendencia que los determinados en la etapa de
semillero, donde se demostró que la cepa de Trichoderma harzianum presente en el
producto comercial aplicado ejerció un efecto detrimental sobre el proceso de
micorrización en la etapa de semillero, determinando que ambas especies utilizadas tanto
Glomus intraradices y Trichoderma harzianum presentan antagonismo. Los resultados
obtenidos concuerdan con los determinados por Mc Govern et al. (1992), Green et al.
(1999) y (Nzanza et al., 2011). Al igual que lo discutido en la etapa de semillero, la
disminución de la micorrización puede ser explicado por la naturaleza agresiva de la cepa
de T. harzianum utilizada en esta investigación pudiendo estar parasitando a Glomus
intraradices, afectando a micelios externos y esporas con lo cual se inhibe el crecimiento
del hongo micorrítico y por ende disminuye la micorrización. Otros factores que influyen la
micorrización son los niveles de fertilización aplicados, principalmente los niveles de
nitrato y las temperaturas ambientales registradas durante el ensayo en la etapa de
postransplante (ver capitulo 4.4.3.2.).
b) Efecto de Glomus en la poblacional de Trichoderma
El mayor número de colonias fue aplicado en la etapa de semillero durante la inoculación
(día uno) la que sin embargo a los 50 días postsiembra desciende 5 puntos; y a partir de este
punto y hasta los 118 días postransplante (ultimo muestreo) se presenta una disminución
menor, observándose una estabilización en la población de Trichoderma en todos los
tratamientos.
Al igual que en la etapa de semillero, G. intraradices no tuvo un efecto detrimental sobre la
población de Trichoderma, al contrario el efecto por parte de Glomus se considera neutro,
coincidiendo con lo determinado por los autores como Rodríguez et al. (2006); Martínez-
Medina et al. (2004); McAllister et al. (1994) y Calvet et al. (1993) los cueles encontraron
efectos negativos, positivos y neutros en el crecimiento poblacional de Trichoderma sp
92
cuando fueron inoculados en conjunto con los hongos micorríticos. Por lo tanto la
disminución poblacional de Trichoderma fue causada por los factores bióticos y abióticos
discutidos anteriormente.
93
4.4.4. Discusión de los parámetros de crecimiento y bioquímicos
4.4.4.1. Efecto de Glomus intraradices
La inoculación con Glomus intraradices en semillero de melón determino plántulas con un
mayor desarrollo radical, mayor diámetro de tallo y un desarrollo vegetativo equilibrado,
con lo cual se obtuvo una buena respuesta en la etapa de postransplante. En la etapa de
postransplante las plantas micorrizadas (40 esporas *planta-1
) presentaron la mayor
producción de biomasa seca de raíz, hojas, tallo y total. La mayor producción de raíces
mejora la absorción de nutrientes y mejora el desarrollo postransplante, coincidiendo con
Wang et al. (2010), quienes proponen que la micorrización de los semilleros promueve un
mejor crecimiento de las plántulas y como consecuencia se mejora la respuesta al
trasplante. Los resultados obtenidos son coincidentes cuando Glomus se ha aplicado en
otros cultivos hortícolas tales como ají, lechuga y pepino. Es así que Aguilera et al, (1999),
obtuvo incrementos de un 142% el peso seco radical, 488% peso seco foliar y en un 613%
el peso seco total en el cultivo de ají ancho (Capsicum annun L. cv. San Luis). Aguilar et
al. (2004), determinaron incrementos en la producción de materia seca en cultivo ecológico
de lechuga. A su vez, Rouphael et al. (2010), en dos cultivares de pepino (Ekron y
Marketmore) cultivados bajo invernadero obtuvieron un aumento en la producción de
materia seca en hojas, tallo, raíces y total con respecto a las plantas no inoculadas.
También en especies frutales se han obtenido resultados en la misma tendencia de
incremento en la producción de biomasa con la inoculación con Glomus, Mengue et al.
(1977), determinaron un aumento de un 83% en el peso seco total y un 123% en el peso
seco de la raíz en plantas de paltos inoculadas con micorrizas arbusculares; posteriormente
Mengue et al. (1980), en la misma especie frutal determinaron un aumento entre un 49 y
254% en el peso seco en plantas micorrizadas con respecto a las plantas no micorrizadas.
En general, según Jeffries et al. (2003), el efecto estimulador de las micorrizas arbusculares
en el crecimiento de los cultivos está dado por el aumento del suelo explorado a través de
las hifas externas del hongo que forman un sistema radical complementario altamente
94
efectivo con el cual se aumenta la absorción de agua y nutrientes, producción de hormonas,
vitaminas y otras sustancias fitoactivas. También, Barea et al. (2005), señalan que los
hongos micorríticos protegen a las plantas frente a estreses del tipo biótico o abióticos,
contribuyendo a los procesos de control de fitopatógenos e incrementa la resistencia de las
plantas a la salinidad o estados deficientes de nutrientes.
En los parámetros de crecimiento las plantas con mayor porcentaje de micorrización
presentaron mayor diámetro de tallo, altura de planta, superficie foliar y un mayor numero
de hojas, coincidiendo con lo determinado por Hernández (2001), donde la inoculación con
G. intraradices provocó un efecto positivo en los parámetros de crecimiento y
diferenciación en portainjertos en paltos. Según Preciado et al. (2002) la importancia
fisiológica del número de hojas y del área foliar radica en un incremento de la fotosíntesis,
obteniéndose una mayor producción de fotoasimilados, los cuales pueden ser utilizados o
almacenados en el tallo. Según Ortiz et al. (2009), un diámetro mayor del tallo implica un
área mayor del floema y en consecuencia un transporte más eficiente, mayor capacidad de
reservas de fotoasimilados que serán posteriormente usados, como por ejemplo en el
llenado de frutos. Además en cultivos hortícolas, Aguilera et al. (1999), determinaron un
aumento significativo en el número de hojas y en el área foliar obteniéndose un incremento
de un 613% en las plantas inoculadas con Glomus con respecto al testigo. Por otra parte,
Román (2003) determinó un 8% más de altura en plantas de ají ancho y en un 16% en ají
marisol; así como también, en ambos cultivares, un mayor número de hojas y aumento en el
diámetro de tallo, obteniendo plantas con un mayor crecimiento.
La micorrización genero tolerancia a las bajas temperaturas que fueron registradas en la
etapa postrasplante, temperaturas que superaron la mínima y máxima biológica (Figura 18),
plantas inoculadas con la dosis de 40 esporas*planta-1
de Glomus (T2), no vieron afectado
la producción de biomasa compartamentalizada y total. Resultados similares fueron
obtenidos por Sannazzaro et al. (2006), que señalan que estos hongos micorríticos
proporcionar a las plantas tolerancia a condiciones de estrés salino, pH adverso, patógenos,
los hongos micorríticos también le proporcionan a las plantas tolerancia a temperaturas
climáticas adversas.
95
En la etapa de cultivo la actividad enzimática de la nitrato reductasa la inoculación con G.
intraradices no afectó significativamente la actividad endógena e inducida en la hoja y la
relación entre ellas según los análisis estadísticos, observándose la misma tendencia que la
etapa de semillero, presentando una mayor disponibilidad de enzima en el tejido verde
(hoja), debido a la capacidad de reducción de nitrato por parte de los hongos micorrízicos,
lo cual es confirmando por Tilak y Dwivedi (1990), Subramanian & Charest (1998), Bago
et al. (1996) y Johansen et al, (1996) en sus investigaciones realizadas. A su vez esta menor
eficiencia de reducción del nitrato por la enzima nitrato reductasa fue condicionada por las
condiciones de estrés térmico que presentaron las plantas de melón en todos los
tratamientos.
4.4.4.2. Efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum.
En la etapa de postransplante se observo la misma tendencia que en la etapa de semillero, no
encontrándose un efecto promotor del crecimiento en las plantas de melón por parte de
Trichoderma harzianum, no encontrándose un aumento en la producción de biomasa seca de
raíz, tallo, hojas y total, a la vez tampoco se determino un aumento en el diámetro de tallo,
altura de planta y la superficie foliar. Solo se encontraron diferencias significativas en el
número de hojas donde el T4 presento mayor número de hojas con respecto al control, esta
diferencia no representa la realidad del cultivo y es atribuida al menor número de
repeticiones muestreadas en el T4, o habrá que determinar en otros estudios que factor o
factores están involucrados en esta diferencia. Los resultados obtenidos coinciden con lo
determinado por Altintas y Bal (2007) y Bal y Altintas (2006) en cultivo de cebolla y
tomate; y a su vez, Valderrama (2007), utilizando mutantes de Trichoderma harzianum
obtuvo efectos detrimentales y neutros en la producción de biomasa en plantas de tomate.
Sin embargo, se han reportado efectos promotores de crecimiento en cultivos
hortofrutícolas: repollo, lechuga, pepino, fresa y otros cultivos: algodón, crisantemo,
tulipán, balsamina aumentando principalmente la producción de biomasa y sus
rendimientos (Bal y Altintas, 2008). Según Yedidia et al., (2001) la estimulación del
crecimiento en los cultivos viene dado principalmente por el aumento de la superficie
radical, con lo cual se aumenta el área de contacto entre la planta y la rizósfera, aumentando
96
la absorción de agua y nutrientes. El efecto que produzca Trichoderma sobre los cultivos
dependerá mucho de las características intrínsecas de la especie del hongo y la cepa asilada,
al igual de la afinidad que tenga con el cultivo
En la actividad de la enzima nitrato reductasa al igual que en los tratamientos inoculados
con Glomus se presenta un remanente de sustrato para la actuación de la enzima Nitrato
Reductasa, siendo mayor en las plantas del tratamiento control respecto a las inoculadas
con Trichoderma en un 15%. No hay un efecto real de Trichoderma sobre la actividad
enzimática por lo tanto estos resultados fueron determinados por factores externos que
afectaron el crecimiento del cultivo, principalmente las temperaturas que se registraron
durante la etapa de cultivo, por ende se afecto la capacidad de las plantas para reducir el
nitrato aportado en la fertilización a través de la enzima nitrato reductasa.
4.4.4.3. Efecto de la interacción de Glomus y Trichoderma.
En la etapa de cultivo se observo la misma tendencia que en la etapa de semillero (capitulo
4.2.2.3), lo que se indica que no hay un efecto real de la coinoculación, obteniéndose un
efecto supresor de Trichoderma sobre Glomus lo que afecta la expresión de los parámetros
de crecimiento y diferenciación, siendo mayor el efecto supresor en la etapa de cultivo. Con
relación a los resultados obtenidos en esta investigación, otros autores han obtenidos
resultados en esta línea y otros divergentes. Es así como, Rodríguez et al. (2006)
obtuvieron resultados supresores en plantas de Bachiaria decumbens; en cambio, Dubský et
al. (2002), obtuvieron en plantas de Euphorbia pulcherrima y Cyclamen persicum un
efecto estimulador en la producción de biomasa.
Al igual a lo discutido en la etapa de semillero la coinoculación entre hongos micorríticos y
Trichoderma han demostrado resultados diversos, la afinidad entre ambos microrganismos
depende de las características de la especie y de la cepa aislada, como también de las
condiciones ambientales donde fueron aislados y de las condiciones edafoclimaticas del
lugar donde se realice la investigación.
97
Los resultados de la actividad enzimática de nitrato reductasa demuestran que la
inoculación en conjunto de Glomus y Trichoderma no tuvo ningún efecto, observándose el
mismo comportamiento enzimático de la inoculación solo con Glomus, determinando a
través de la relación NRI/NRE la presencia de sustrato disponible para la reducción de
nitratos. En cuanto al alto valor obtenido de NRI en el tratamiento control pudo deberse a
un error experimental y posiblemente este sea erróneo, el cual origino diferencias
significativas en la actividad de nitrato reductasa inducida.
98
5.- CONCLUSIONES
El tratamiento de inoculación con Glomus intraradices que presentó la mejor
respuesta de las plantas de melón Inodorus en las etapas de semillero y cultivo fue
con la dosis de 40 esporas*planta-1
, reflejado en:
o A esta dosis de inoculación se obtuvo el mayor porcentaje de micorrización:
49%.
o Las plantas de melón Inodorus en la etapa de semillero presentaron una
compartamentalización equilibrada en sus tres componentes: Raíz - tallo –
hojas, y el mayor porcentaje de producción de biomasa radicular y total.
o Las plantas de melón Inodorus en la etapa de semillero presentaron un
menor nivel de estrés lo que determinó una mejor respuesta en la etapa de
postransplante.
o A los 118 días postransplante las plantas presentaron mayor crecimiento en
los parámetros de diferenciación, producción de biomasa y de crecimiento.
La inoculación con Trichoderma harzianum en los dos tiempos de aplicación (en
siembra y 15 días postsiembra) bajo las condiciones de estudio, no ejerció efecto en
los procesos de crecimiento, diferenciación y producción de biomasa en las plantas
de melón tipo Inodorus cultivar “Honeydew” en las etapas de semillero y cultivo.
La inoculación conjunta de Glomus+Trichoderma no se encontró un sinergismo
entre ambos microorganismos, por consecuencia en las plantas de melón Inodorus
no determinó un efecto sumatorio de la acción de los dos hongos en los parámetros
de crecimiento, diferenciación de tejidos y producción de biomasa, obteniéndose un
efecto supresor de Trichoderma sobre los parámetros evaluados.
Por los antecedentes expuestos se acepta la hipótesis planteada cuando se inocula
Glomus intraradices en forma independiente.
99
En estudios posteriores se deben evaluar diferentes especies de hongos micorríticos,
ya sean de formulaciones comerciales como también especies autóctonas aisladas de
zonas áridas y semiáridas. Determinando las respuestas que tienen los cultivos
inoculados con estas especies frente a condiciones de estrés abióticos presentes en la
Pampa del Tamarugal.
De igual manera se deben evaluar otras especies de Trichoderma u hongos
saprofitos como Penicillium, Rhizopus, etc., ya sean de formulaciones comerciales
como de especies autóctonas. Determinando las respuestas de los cultivos frente a
condiciones de estrés abióticos presentes en la Pampa del Tamarugal.
De las especies autóctonas y comerciales de hongos micorríticos y saprofitos, se
deben realizar pruebas de coinoculación y ver cuales presentan sinergismo
traduciéndose en efectos beneficiosos sobre el crecimiento y nutrición de los
cultivos.
100
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115
7.- ANEXO
7.1. Semillero
Figura 30.- Disposición espacial de los tratamientos.
Figura 31.- A: Características morfológicas de las plántulas de melón según tratamientos;
B: Comparación entre planta testigo (izquierda) y planta tratamiento T2 (derecha).
B A
116
7.2. Cultivo
Figura 32.- A: Túnel construido en el interior del invernadero en la etapa de cultivo; B:
Disposición espacial de los tratamientos en la etapa de postransplante.
Figura 33: A: Plantas de melón Inodorus a los 15 días postransplante; B: Plantas de
melón a los 35 días postransplante.
A
B A
B
117
7.3. Mediciones microbiológicas
Figura 34.- Estructuras fúngicas de Glomus intraradices colonizando las raíces, tinción con
azul de Tripan. A: Raíz no micorrizada de tratamiento testigo (40X); B: Raíz micorrizada
(40X); C: Esporas (100X); D: Vesículas (100X); E: Arbúsculos (100X); F: Micelio
intrarradical (100X).
A B
C
E
D
F
118
Figura 35.- Crecimiento de microorganismos a partir de la muestra del sustrato utilizado
en la investigación.
Figura 36.- A: Unidades formadoras de colonias de T. harzianum; B: Estructura
morfológica de Trichoderma.
A B
119
7.4. Mediciones bioquimicas
Figura 37.- Recta de calibración para nitrato reductasa, rango de 0 a 4 µM, elaborada con
NaNO2.
Figura 38.- Determinación de nitrato reductasa.
y = 0,0951x R² = 0,9986
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 5,0000
Ab
sorv
an
cia
Concentración nitrito de sodio
