UNIVERSITA’ DI PISA

Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria

Una nuova preparazione

farmaceutica di GnRH impiegata

nell’allevamento suino

Candidato: Francalacci Chiara Relatori: Prof. Soldani Giulio

Dott. Giorgi Mario

ANNO ACCADEMICO 2008-2009

Alla mia famiglia

ed a tutti coloro che mi vogliono bene

“Non chi comincia

ma quel che persevera”

Motto della nave scuola A. Vespucci

RIASSUNTO

Parole chiave: GnRH, proteine-G rodopsino simili, analoghi di sintesi, vaccino, odore

di verro, Improvac®

In questo lavoro abbiamo caratterizzato i principi generali del GnRH (Gonadotropin-

Releasing Hormone), un decapeptide sintetizzato da specifiche cellule neurosecretrici

dell’ipotalamo che viene riversato in maniera pulsatile direttamente nei capillari del sistema

portale ipotalamo-ipofisario e condotto all’ipofisi anteriore. Sono state descritte le sue

isoforme ed il suo meccanismo d’azione. Il GnRH si lega a specifici recettori della famiglia

delle proteine G rodopsino-simili posti sulla superficie delle cellule gonadotrope, attivando

una serie di meccanismi intracellulari, il cui esito finale è la biosintesi e la secrezione delle

gonadotropine ipofisarie: l’ormone follicolo stimolante (FSH) e l’ormone luteinizzante (LH o

ICSH). Il GnRH svolge un ruolo centrale nella fisiologia riproduttiva dei mammiferi essendo

il regolatore chiave delle funzioni riproduttive. Vengono decritti alcuni analoghi di sintesi ad

attività agonista ed antagonista che vengono utilizzati sia nella pratica clinica veterinaria che

in medicina umana. Infine viene descritto un nuovo preparato: un vaccino contro l’odore di

verro a base di un analogo incompleto di sintesi del GnRH naturale (Improvac®), il quale,

ponendosi come valida alternativa alla castrazione fisica precoce dei suinetti, soddisfa le

recenti norme dell’UE in fatto di rispetto del benessere animale.

ABSTRACT

Keywords: GnRH, rhodopsin-like G-protein, synthetic analog vaccine, boar taint,

Improvac®

In this work the general principles of GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone),

have been characterized. GnRH is a decapeptide synthesized by specific neurosecretory cells

of hypothalamus that is released in a pulsatile manner directly into the hypothalamus-pituitary

portal system capillaries and to the anterior pituitary. Its isoforms and its mechanism of action

have been described. GnRH binds to specific rhodopsin-like G protein-coupled receptors

located onto the gonadotrope cell surface, activating a series of intracellular mechanisms,

whose final outcome is the biosynthesis and secretion of pituitary gonadotropins: follicle

stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH or ICSH). GnRH plays a key role in

mammals reproductive physiology being the key regulator of their reproductive functions.

Thereafter some of its agonist and antagonist synthetic preparations that are commonly used

both in clinical veterinary and human medicine have been described. Finally, a new

preparation has been described. It is a vaccine against boar taint based on an incomplete

synthetic GnRH analog (Improvac®), that, placing itself as a viable alternative to early

surgical castration of piglets, meets the advanced standards of EU in terms of respect of

animal welfare.

5

1 INDICE

1 INDICE.................................................................................................................................. 5

2 GENERALITÀ DEL GnRH............................................................................................... 7

3 ISOFORME DEL GnRH .................................................................................................. 11

3.1 A.GnRH-I (GnRH MAMMIFERO) ............................................................................ 14

3.2 B.GnRH-II (GnRH AVIARE) ..................................................................................... 17

3.3 C.GnRH-III (GnRH del SALMONE) ......................................................................... 20

4 STRUTTURA DEL GnRH E PEPTIDI ANALOGHI.................................................. 21

5 RECETTORI DEL GnRH ................................................................................................. 27

6 PREPARAZIONI FARMACEUTICHE......................................................................... 35

6.1 GENERALITA’ SUI FARMACI CONTENENTI GnRH............................................ 35

6.2 IMPROVAC®............................................................................................................. 48

6.2.1 GENERALITA’ .................................................................................................... 48

6.2.2 PROPRIETA’ CHIMICO-FISICHE .................................................................... 52

6.2.3 MECCANISMO D’AZIONE ............................................................................... 53

6

6.2.4 FARMACOCINETICA ........................................................................................ 57

6.2.5 EFFETTI DELLA VACCINAZIONE CON IMPROVAC®.............................. 61

6.2.5.1 RISPOSTA ANTICORPALE........................................................................ 61

6.2.5.2 FUNZIONE TESTICOLARE ....................................................................... 62

6.2.5.3 PERFORMANCE .......................................................................................... 63

6.2.5.4 ODORE DI VERRO ...................................................................................... 65

6.2.5.5 LESIONI SULLA CARCASSA.................................................................... 65

6.2.6 TOSSICITA’ ......................................................................................................... 66

6.2.6.1 EFFETTI ACUTI ........................................................................................... 66

6.2.6.2 EFFETTI CRONICI....................................................................................... 68

6.2.7 CONCLUSIONI.................................................................................................... 68

7 INDICE DELLE FIGURE................................................................................................ 72

8 BIBLIOGRAFIA................................................................................................................ 73

7

2 GENERALITÀ DEL GnRH

Il gonadotropin-releasing hormone è stato isolato per la prima

volta dall’ipotalamo dei mammiferi (GnRH-I) nel 1971 da un gruppo di

ricercatori guidati da A.V.Schally e R.C.L. Guillemin i quali, per tale

scoperta, ricevettero nel 1977, il premio Nobel. Si tratta di un

decapeptide (pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly.NH2) che

svolge un ruolo centrale nella fisiologia riproduttiva dei mammiferi

dato che è il regolatore chiave delle funzioni riproduttive.

Figura 1 Struttura del GnRH

8

Esso viene sintetizzato da specifiche cellule neurosecretrici

localizzate nel nucleo arcuato e nell’area preottica dell’ipotalamo.

I neuroni responsabili della secrezione del GnRH mostrano

molte caratteristiche inusuali. Per esempio, questi non si originano a

livello del S.N.C. ma migrano nel S.N.C. dal lobo olfattorio che, nelle

prime fasi di sviluppo della vita fetale, è una struttura esterna al

cervello. Durante le fasi iniziali della gestazione, queste cellule

entrano nel S.N.C. attraverso il tratto olfattorio fino alla loro sede

definitiva localizzandosi, prevalentemente, nell’area del nucleo

arcuato dell’ipotalamo. Anomalie nello sviluppo embrionale e nella

normale migrazione dei neuroni del GnRH, spiegano alcuni casi di

carenza di GnRH associata ad assenza totale del bulbo olfattorio o di

sue porzioni nell’uomo (sindrome di Kallmann).

In tali neuroni il GnRH viene processato a partire da un

polipeptide precursore attraverso un processo enzimatico ed

impacchettato in granuli di stoccaggio che vengono trasportati

attraverso gli assoni fino alla zona esterna dell’eminenza mediana,

riversato in maniera pulsatile direttamente nei capillari del sistema

9

portale-ipofisario e condotto, attraverso questo specifico e veloce

sistema di comunicazione, all’ipofisi anteriore (Conn, 1991) . A

questo livello si lega, con elevata affinità, a specifici recettori posti

sulla superficie delle cellule gonadotrope (recettori di tipo I del

GnRH), attivando una serie di meccanismi intracellulari, il cui esito

finale è la biosintesi e la secrezione delle gonadotropine ipofisarie:

l’ormone follicolo stimolante (FSH) e l’ormone luteinizzante (LH o

ICSH), glicoproteine costituite da una catena ! comune ed una

catena " distinta. Tali ormoni agiscono direttamente a livello delle

gonadi di entrambi i sessi dove regolano la steroidogenesi e la

gametogenesi in ovaie e testicoli.Tra le caratteristiche peculiari che

possiede il GnRH, una delle più interessanti è quella per cui in

natura la sua secrezione è di natura pulsatile (viene rilasciato ogni

30-120 minuti) e le cellule gonadotrope richiedono questa forma

intermittente di stimolo-secrezione al fine di secernere le

gonadotropine in maniera fisiologica. Inoltre, la continua

stimolazione dell’ipofisi, sia con GnRH naturale sia con agonisti long-

acting, desensibilizza la secrezione delle gonadotropine come

10

risultato di una soppressione a livello gonadale, cosa questa che ha

importanti applicazioni cliniche. Infine, la secrezione del GnRH da

parte dell’ipotalamo, mostra un preciso modello di sviluppo tale che,

durante il periodo neonatale, la secrezione è transitoriamente attiva

mentre è quiescente nell’infanzia ed aumenta, fino a raggiungere i

livelli degli adulti, nella pubertà.

Dato che l’emivita del GnRH è di 2-3 minuti e data

l’inaccessibilità anatomica del sistema portale-ipofisario, il GnRH

non può essere generalmente rilevato nella circolazione periferica in

maniera significativa. Conseguentemente, la maggior parte delle

informazioni disponibili riguardo alla sua fisiologia nell’uomo, è stata

dedotta in maniera indiretta e cioè esaminando la secrezione

pulsatile di LH nel circolo periferico mediante l’uso di campionamenti

frequenti. La secrezione basale o tonica del GnRH, e quindi di

gonadotropine, è di tipo pulsatile soprattutto per quanto riguarda

l’LH (Levine, Duffy, 1988). Ogni pulsazione del GnRH stimola una

pulsazione di rilascio di LH mentre le pulsazioni di FSH sono meno

distinte. Inoltre la frequenza degli impulsi di GnRH è più elevata

11

durante la secrezione di LH nell’ovulazione (picco preovulatorio) e

più bassa nella fase luteinica del ciclo ovarico. Il modo di rilascio

asincrono di LH ed FSH dipende da diversi fattori: tra questi, oltre

che dai cambiamenti nella frequenza di pulsazione di GnRH, anche

dagli effetti modulanti degli steroidi gonadali e degli ormoni peptidici

sulle risposte dell’FSH ed LH al GnRH e dalle differenze nelle emivite

dei due ormoni.

3 ISOFORME DEL GnRH

Inizialmente si pensava che il GnRH mammifero, isolato

dall’ipotalamo, fosse una struttura unica. Il suo ruolo cruciale nella

regolazione della secrezione di FSH ed LH e quindi nella

riproduzione, ha avuto come immediata conseguenza,

l’intensificazione della ricerca di peptidi appartenenti alla stessa

famiglia. Attualmente sono state identificate 23 diverse isoforme di

GnRH: 13 nei vertebrati, 9 nei protocordati (Millar et al., 2004) ed

un 12-amino acido omologo da una specie di polpo (Iwakoschi et

al., 2002). Tutte le varianti strutturali del GnRH consistono di 10

12

aminoacidi ed hanno una struttura simile con almeno il 50% di

identità nella loro sequenza (Terakado, 2001). Le diverse varianti

strutturali del GnRH sono state denominate in base alla specie dalla

quale sono state isolate per la prima volta. Nella maggior parte delle

specie vertebrate studiate, coesistono almeno due o, normalmente,

tre forme di GnRH. Per esempio, il GnRH mammifero è ampiamente

conservato negli anfibi e nei pesci ossei primitivi e il GnRH-II del

pollo è presente nella maggior parte delle specie vertebrate, uomo

compreso. Queste varianti strutturali sono distribuite in un gran

numero di tessuti nei vertebrati in cui hanno diverse funzioni tra le

quali: neuroendocrina (per esempio rilascio di GH in alcune specie di

pesci), paracrina (per esempio nella placenta e nelle gonadi),

autocrina (nei neuroni del GnRH, cellule immunitarie, cellule del

cancro alla prostata ed al polmone) e ruolo di

neurotrasmettitore/neuromodulatore nel sistema nervoso centrale e

periferico (gangli del simpatico e del mesencefalo). Dato che,

queste diverse funzioni del GnRH non sono mediate dalla sua

secrezione diretta nel circolo generale, è verosimile che una singola

13

forma di GnRH sia teoricamente capace di svolgere tutti questi ruoli.

Le forme di GnRH coesistenti nelle stesse specie sono localizzate

diversamente nel cervello ed hanno diverse origini embrionali. E’

stato proposto un modello di due sistemi neuronali del GnRH: il

sistema nervo-setto-preottico terminale e il cGnRH-II altrimenti

chiamato sistema mesencefalico (Muske, 1993). Le cellule del primo

sistema hanno la loro origine embriologica nel placode olfattivo;

migrano durante lo sviluppo nel cervello colonizzando il cervello

anteriore ventrale; esse sono principalmente confinate nel

telencefalo ventrale, nell’area preottica, nell’ipotalamo basale e

nell’ipofisi. Questi neuroni esprimono diverse varianti del GnRH a

seconda delle loro rispettive specie e sono responsabili della

regolazione delle funzioni ipofisarie. Il sistema cGnRH-II ha

un’origine embriologica da una struttura non placoidale posta nel

punto di fusione tra mesencefalo anteriore e diencefalo posteriore.

In questi neuroni il GnRH svolge invece un ruolo di

neurotrasmettitore/neuromodulatore. Nei mammiferi il GnRH è stato

isolato per primo e chiamato GnRH-I mentre l’isoforma altamente

14

conservata durante l’evoluzione, scoperta nel pollo, é stata

chiamata GnRH-II. Successivamente, è stata scoperta, nei

mammiferi, una terza isoforma (il GnRH di salmone) chiamata

GnRH-III. Nel genoma umano sono stati trovati soltanto il GnRH

tipo I e II, codificati da due geni diversi. L’espressione di GnRH III

invece, è ritenuta dubbia (Neil, 2002).

3.1 A.GnRH-I (GnRH MAMMIFERO)

Negli anni 60 è stato scoperto che il GnRH-I gioca un ruolo

centrale nella stimolazione della riproduzione dei mammiferi;

l’isolamento e l’identificazione della sua struttura sono avvenuti

successivamente (Matsuo et al., 1971).

pGln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Figura 2 Sequenza del GnRH-I

Il gene del GnRH-I nel genoma umano è localizzato nell’ottavo

cromosoma, più precisamente nella regione 8p11.2 p21 (Yang-Feng

15

et al., 1986). Tale gene codifica la sintesi di un preormone con 92

aminoacidi ed è organizzato in 4 esoni e tre introni. Il primo esone

codifica per la regione non tradotta 5’ e il secondo codifica per un

peptide segnale di 23 aminoacidi, per il decapeptide del GnRH, ed i

primi aminoacidi del peptide associato al GnRH (GAP) il quale

consiste di 56 aminoacidi. Il terzo esone codifica la seconda parte

del GAP ed il quarto esone codifica gli ultimi aminoacidi di GAP e la

regione non tradotta 3’. La funzione del GAP non è ancora chiara; il

suo ruolo può essere quello di sopprimere il rilascio di prolattina e di

incrementare il rilascio di FSH e, secondariamente, quello di LH.

Dopo il legame con il suo recettore sulle cellule gonadotrope

ipofisarie, il GnRH-I stimola la biosintesi e la secrezione di LH ed

FSH ma, oltre a questa funzione endocrina, è ormai chiaro che il

GnRH-I è un regolatore autocrino e paracrino potenzialmente

importante anche in alcuni comparti extraipofisari. Infatti, anche se

l’espressione del GnRH-I non è stata osservata a livelli elevati al di

fuori del cervello (l’immunoreattività del GnRH-I è localizzata

prevalentemente nell’eminenza mediana del cervello umano),

16

nell’uomo l’espressione dell’mRNA del GnRH-I è ritrovata, oltre che

nell’ipotalamo, anche in altri tessuti come la placenta. A questo

livello si rilevano sia l’mRNA del GnRH-I che quello del GnRH-II ma,

solo il GnRH-I, è espresso anche nella fase finale della gravidanza;

inoltre, con metodi immunoistochimici entrambi gli ormoni sono

stati localizzati nei villi mononucleati ed in sottopopolazioni distinte

del citotrofoblasto extravilloso. Il GnRH-I è presente anche nello

strato più esterno del sinciziotrofoblasto multinucleato. Nelle ovaie,

è stata dimostrata l’espressione degli mRNA di entrambi i GnRH a

livello delle cellule della granulosa luteale (GL), delle cellule della

superficie ovarica (OSE) e delle cellule del carcinoma ovarico.

Inoltre l’mRNA del GnRH-I è espresso nelle cellule epiteliali delle

tube di Falloppio durante la fase luteinica del ciclo riproduttivo.

L’immunoreattività del GnRH-I è stata rilevata in tutti i tipi di cellule

endometriali con una colorazione più intensa nella fase luteinica.

Entrambe le forme di GnRH sono espresse nel tessuto mammario

normale dell’uomo e sovraespresse nel cancro alla mammella.

Alcune cellule del sistema immunitario (linfociti T e cellule

17

mononucleate del sangue) producono sia GnRH-I che GnRH-II.

L’mRNA del GnRH-I inoltre è stato rilevato nei tubuli seminiferi e

negli embrioni preimpiantati (Cheng et al., 2005). Per questo

motivo, fin dalla sua scoperta, sono stati sviluppati ed ampiamente

studiati molti analoghi di sintesi del GnRH-I con maggior potenza

biologica, utilizzati nei trattamenti di varie endocrinopatie

riproduttive, mentre altri sono stati ampiamemte adottati in regimi

di iperstimolazione ovarica controllata per tecniche di riproduzione

assistita.

3.2 B.GnRH-II (GnRH AVIARE)

La seconda forma di GnRH, la più diffusa (dato che è stata

rilevata in varie specie), è stata isolata per la prima volta nel

cervello del pollo.

pGln-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2

Figura 3 Sequenza del GnRH-II

18

Tra tutte le isoforme fin ora note probabilmente, quella del

GnRH-II è la più antica e la conservazione completa della sua

struttura (che differisce da quella del GnRH-I per tre residui

aminoacidici nelle posizioni 5, 7 e 8) per più di 500 milioni di anni

(dai pesci meno evoluti fino all’uomo), fa supporre che abbia un

ruolo chiave nel regolare le funzioni riproduttive e non solo.

Nell’uomo il gene che codifica per il GnRH-II è presente sul

ventesimo cromosoma, è organizzato in quattro esoni e tre introni

come quello che codifica il GnRH-I ma è significativamente più corto

(White et al., 1998). La vasta distribuzione del GnRH-II nel sistema

nervoso centrale e periferico, ne suggerisce un ruolo come

neurotrasmettitore/neuromodulatore. Il GnRH-II (ma non il GnRH-I)

ha effetti eccitatori diretti nei roditori ed essendo il GnRH-II

localizzato nelle aree del cervello associate al comportamento

riproduttivo, confermerebbe che questo peptide possa avere un

ruolo fondamentale nell’influenzare tale comportamento. Il GnRH-II

ed un suo analogo, sono entrambi potenti stimolanti del

comportamento riproduttivo nelle tortore dal collare, nei passeri

19

canterini e nel topo muschiato (Temple et al., 2003). Recentemente

si è scoperto che il recettore coniugato del GnRH-II, clonato dal

callitricide, è distribuito in quelle aree del cervello del primate

associate ai comportamenti riproduttivi. L’infusione del GnRH-II nel

terzo ventricolo della femmina di callitricide aumenta i

comportamenti sessuali. Nel cervello dell’uomo, il GnRH-II, è

presente principalmente nell’area preottica ed ipotalamica

mediobasale come il GnRH-I ma è particolarmente espresso nel

mesencefalo in aree come l’ippocampo, nucleo caudato e amigdala.

Segnali immunopositivi sono localizzati principalmente nella regione

periacqueduttale. Ma ciò che differenzia sostanzialmente il GnRH-II

dal GnRH-I è che i livelli di mRNA codificante il GnRH-II rilevato nei

tessuti extraencefalici come reni, midollo osseo, endometrio, ovaie,

trofoblasto, placenta, cellule del polmone, prostata e cellule del

cancro ovarico a livelli notevolmente più alti rispetto a quelli del

cervello (Grundker et al., 2002).

L’immunoreattività del GnRH-II è espressa nelle cellule dello

stroma ed epiteliali dell’ endometrio soprattutto nelle fasi iniziali e

20

centrali della secrezione piuttosto che nelle fasi finali e proliferative

della secrezione. La sua conservazione per milioni di anni, la sua

larga distribuzione in natura, i molteplici siti della sua espressione

nel corpo umano, suggeriscono che questa isoforma del GnRH abbia

funzioni diverse dal GnRH-I e che serva ad un largo spettro di

funzioni non solo riproduttive (Kang et al., 2003).

3.3 C.GnRH-III (GnRH del SALMONE)

In molte specie di vertebrati una terza forma conservata di

GnRH (GnRH del salmone) è localizzata a livello del nervo terminale

del cervello anteriore dei pesci teleostei ed è denominata GnRH-III.

Oltre che nel GnRH-II, anche nel GnRH-III si assiste ad una

conservazione completa della sequenza ma, quest’ultimo, è

presente solo nei pesci teleostei suggerendo che il gene codificante

questo peptide si sia originato dopo l’allontanamento dei teleostei

dal ramo evolutivo dei vertebrati. Esiste una specie di salmone che

possiede due geni che codificano per il GnRH-III. E’ proprio l’analisi

21

strutturale dei geni che codificano i GnRH, a supportare questa

classificazione generale in tre forme e questa conclusione è

confermata da una più estensiva analisi filogenetica.

4 STRUTTURA DEL GnRH E PEPTIDI

ANALOGHI

La molecola del GnRH ha conservato, nel corso di milioni di

anni di evoluzione, alcune caratteristiche strutturali identiche a

partire dalle specie primitive fino ai mammiferi a conferma

dell’antico e comune ruolo evolutivo del peptide come regolatore

delle funzioni riproduttive nelle diverse specie animali. Tutti i GnRH,

infatti sono costituiti da 10 aminoacidi e sono caratterizzati dalla

conservazione dei terminali -NH2 (pGlu-His-Trp-Ser) e -COOH (Pro-

Gly.NH2) ad eccezione di due sostituzioni conservative della tirosina.

La conservazione della lunghezza del peptide e dei terminali –N e

–C sono caratteristiche criticamente importanti sia per il legame,

che per l’attivazione del recettore. Oltre a ciò, tutti i GnRH delle

specie più evolute (pesci cartilaginei e ossei, anfibi, rettili, uccelli e

22

mammiferi), hanno in comune una parte aminoacidica centrale achirale

in posizione sei (Gly6), mentre (fatta eccezione per il tunicato ciona VI)

nelle specie meno evolute, il residuo in posizione 6 è occupato da

aminoacidi chirali. Questa apparentemente insignificante sostituzione di

un singolo aminoacido, per altro in un sito remoto rispetto ai domini di

legame e di attivazione del GnRH, ha invece un effetto importante sulla

conformazione del ligando ed incide fortemente sulla sua interazione

con i siti di legame del recettore e, quindi sulla sua attività biologica

(Sealfon et al., 1997). La Gly achirale in posizione 6 non solo é

importante per l’attività biologica del peptide ma è essenziale per

permettere al GnRH mammifero di assumere una conformazione a

curva " tipo II' che include i residui Tyr-Gly-Leu-Arg in maniera tale che i

residui –NH2 e –COOH siano posizionati vicini e la molecola del GnRH

assuma, nel complesso, una struttura compatta che fa sì che il peptide

dei mammiferi si presenti al recettore con una conformazione ripiegata.

23

Figura 4 Relazione struttura-attività

I GnRH delle specie meno evolute, invece, hanno un

aminoacido chirale in tale posizione e ciò implica che, il GnRH degli

esseri primitivi si lega in una conformazione più estesa col proprio

recettore. Ciò rivela una co-evoluzione del GnRH e del suo recettore

correlato. Esiste una stretta relazione tra configurazione dei peptidi

e la loro attività biologica. La sostituzione dell’aminoacido chirale

con la glicina nel GnRH, durante l’evoluzione, permette una

conformazione più vincolata per il legame con il recettore e quindi

una più alta attività biologica. Infatti, la sostituzione della glicina

con qualsiasi altro L-aminoacido nel GnRH mammifero ne diminuisce

24

l'attività biologica dato che la conformazione a curva ß tipo II ' è

meno favorita; al contrario, la sostituzione della glicina con D-

aminoacidi in posizione 6 vincola il peptide nella conformazione a

curva ß di tipo II ' ed aumenta l’affinità di legame e l’attività

biologica nei mammiferi, uccelli, anfibi e pesci mascellati. I GnRH

dei protocordati hanno sia un’affinità di legame che un’attività

biologica molto basse a livello dei recettori del GnRH dei mammiferi

ma entrambe queste proprietà vengono notevolmente incrementate

quando il naturale aminoacido chirale in posizione 6 dei protocordati

(che limita la conformazione a curva ß II’) viene sostituito dalla

glicina achirale, caratteristica dei vertebrati. Questa sostituzione

quindi modifica la struttura dei GnRH dei protocordati permettendo

una migliore interazione col recettore mammifero. La capacità dei

GnRH endogeni dei protocordati e del GnRH dei mammiferi, di

stimolare la riproduzione nelle specie protocordate (Powell et al.,

1996) indica anche che i recettori del GnRH dei protocordati non

distinguono il GnRH dei mammiferi, da quello dei protocordati. Ciò

perché i GnRH con aminoacidi chirali o achirali in posizione sei

25

possono entrambi assumere una conformazione lineare estesa,

rilassata. I recettori del GnRH mammifero, aviario, e teleosteo

hanno una affinità di legame molto bassa per i GnRH con aminoacidi

chirali in posizione sei mentre i recettori mammiferi sono altamente

selettivi per i GnRH con glicina achirale. Inoltre, la variazione

considerevole del residuo in posizione 8, nei GnRH naturali,

suggerirebbe che qualunque residuo è virtualmente tollerato in tale

posizione. Questo non è il caso del recettore di tipo I del GnRH dei

mammiferi che richiede Arg in posizione 8 per un’ elevata affinità di

legame con il proprio peptide correlato. L’Arg in posizione 8 gioca un

ruolo fondamentale nella struttura del GnRH mammifero in quanto

essa possiede una catena laterale di guanidina la quale dà luogo ad

interazioni non covalenti che stabilizzano ulteriormente tutta la

struttura principale del peptide contribuendo in maniera

determinante all’assunzione della conformazione a curva "-II’; oltre

a ciò l’Arg8 interagisce con un residuo acidico nel ciclo extracelluare

3 del recettore del GnRH, aumentando l’affinità di legame per il

recettore stesso (Fromme et al., 2001). Quindi la combinazione di

26

Gly6 e Arg8 nel GnRH mammifero produce un peptide configurato

con alta affinità per il recettore dei mammiferi.

Il GnRH-II è un’eccezione intrigante alla generale conclusione

che la sostituzione del D-aminoacido con Gly6 aumenta l’affinità di

legame del GnRH. Una spiegazione può essere che il GnRH-II è già

stabilizzato nella conformazione con curva "-II’ e l’incorporazione di

un D-aminoacido in posizione 6 non stabilizza ulteriormente questa

conformazione. Si pensa che i residui His5, Trp7, Tyr8

contribuiscano alla stabilizzazione del GnRH-II. Gly6 è essenziale

per permettere l’assunzione della conformazione piegata e le

sequenze con i terminali NH2 e COOH sono essenziali per il legame

e l’attivazione del recettore. Quindi sembra che tutti gli aminoacidi

abbiano ruoli cruciali e questo offre una spiegazione della

conservazione totale della struttura del GnRH-II per oltre 500

milioni di anni di evoluzione. In conclusione la struttura del GnRH

nel corso dell’evoluzione è stata cooptata in diversi modi al fine di

regolare la riproduzione nelle varie specie. Mentre nelle specie meno

evolute il GnRH ha un ruolo di feromone (Cameron et al., 1999) e

27

viene secreto direttamente da terminazioni nervose su cellule

gonadali, nei vertebrati invece, esso svolge un ruolo neuroendocrino

più complesso ed i fattori ambientali esterni (come la luce) possono

favorire la secrezione del GnRH nei vasi portali per indurre la

secrezione delle gonadotropine ipofisarie e stimolare infine le

gonadi. La diluizione del GnRH nei vasi portali può pertanto aver

guidato l’evoluzione dei GnRH più compatti con una maggior affinità

di legame per il proprio recettore. Tuttavia, dato che il GnRH ed i

suoi recettori sono presenti nelle gonadi di pesci, anfibi e

mammiferi, ciò suggerisce che esso abbia conservato, come nei

protocordati, effetti diretti sulle gonadi (Dalkin et al., 1981).

5 RECETTORI DEL GnRH

La presenza di tre forme di GnRH nella maggior parte delle

specie vertebrate, ha suggerito l’ esistenza di altrettanti sottotipi di

recettori coniugati che sarebbero andati incontro ad un’evoluzione

parallela a quella dei rispettivi ligandi. I recettori del GnRH sono

stati raggruppati in 3 classi distinte: recettori di tipo I, tipo II e tipo

28

III. La sequenza aminoacidica del recettore di tipo I del GnRH è

stata dedotta per la prima volta per il recettore del topo clonato

dalla linea cellulare !T3 delle cellule gonadotrope dell’ ipofisi

(Tsutsumi et al., 1992). Questa sequenza ha fornito le basi per la

clonazione dei recettori ipofisari di tipo I del GnRH di altre specie

quali ratto, uomo, ovino, bovino, suino che condividono una

composizione aminoacidica comune all’80%, mentre i recettori non

mammiferi (che, tra di loro, condividono dal 58 al 67% degli

aminoacidi) hanno al massimo una similitudine del 42-47% con i

recettori dei mammiferi. Oltre ai recettori di tipo I, nei vertebrati

primitivi sono presenti anche recettori di tipo II e III del GnRH.

Esiste però un’intrigante e sporadica inattivazione o eliminazione del

gene del recettore di tipo II nell’uomo, nello scimpanzé, nei bovini e

negli ovini o, addirittura, una sua eliminazione nel topo e

apparentemente anche nei pesci per cui, in tali specie, non è stato

identificato un recettore di tipo II del GnRH mentre, un recettore di

tipo II pienamente funzionante, è presente nelle scimmie, nel suino

così come in anfibi e rettili. Questo apparente silentamento del

29

recettore di tipo II è paradossale se confrontato con la straordinaria

conservazione del GnRH-II dai pesci ossei fino all’ uomo. Inoltre

solo i pesci e gli anfibi hanno conservato un recettore di tipo III. Il

GnRH-I, il GnRH-II (eccetto che nel topo) ed il recettore di tipo I si

sono universalmente conservati in contrasto alla soppressione del

recettore di tipo II in un gran numero di specie. Conseguentemente

il recettore di tipo I è in grado di legare, non solo il GnRH I ma

anche il GnRH-II con elevata affinità in modo da assumere il ruolo

del recettore di tipo II mentre l’ inverso non può avvenire a causa

dell’elevata selettività del recettore di tipo II per il GnRH-II (Millar,

2003). Il quadro che ne emerge è che, più una specie è evoluta e

strutturalmente complessa e meno sottotipi di recettore e ligando

sembrano esserci. Un’interpretazione di questi risultati è che ogni

famiglia recettore-ligando può essersi evoluta per soddisfare diverse

funzioni in fisiologia riproduttiva e che l’inattivazione, la

modificazione o la perdita del gene specie-specifico può essere

avvenuta durante l’evoluzione quando particolari ruoli sono diventati

30

obsoleti o soggetti a regolazione per mezzo di un altro percorso

biochimico (Pawson et al., 2003).

I recettori del GnRH appartengono alla superfamiglia dei

recettori accoppiati alle proteine G (GPCR). Dal punto di vista

strutturale i GPCR sono costituiti da un’unica catena polipeptidica

che attraversa sette volte la membrana plasmatica e che presenta

un’estremità aminoterminale rivolta verso lo spazio extracellulare e

un’estremità carbossiterminale all’interno della cellula. I 7 domini

elicoidali TM (responsabili della configurazione del recettore) sono

connessi da 3 domini intracellulari e 3 domini extracellulari. Dalle

informazioni strutturali derivanti dall’analisi di circa 500 sequenze

della famiglia dei GPCR-rodopsino-simili, è stato dimostrato che i 7

domini TM di tutti i GPCR hanno una struttura molto simile, mentre i

domini EC e IC sono altamente variabili nella sequenza aminoacidica

e probabilmente nella loro struttura terziaria. Le catene laterali dei

residui TM2 e TM7 del recettore del GnRH svolgono un ruolo

fondamentale nello stabilizzare il recettore nello stato inattivo.

Esistono altre interazioni (legami ad idrogeno, ponti disolfuro, forze

31

di Van Der Waals, ecc.) che contribuiscono a mantenere il recettore

nello stato base. Tra i domini EC, l’EC3 è il principale determinante

della selettività del recettore per le varianti strutturali del GnRH

(Troskie et al., 1998) ma anche le regioni superficiali dei TM sono

normalmente coinvolte nel legame con il GnRH.

Figura 5 Struttura del recettore del GnRH

In seguito all’interazione ligando-recettore, si assiste ad un

cambiamento conformazionale di TM3 (attivazione del recettore)

che si trasmette direttamente ed indirettamente alle altre TM

32

generando dei movimenti di rotazione di circa 30 gradi in senso

orario (vista dalla superficie citoplasmatica) che a loro volta

modificano la configurazione dei domini IC i quali interagiscono con

la proteina G posta in loro stretta vicinanza, attivando la

trasduzione intracellulare del segnale. La porzione intracellulare del

recettore è una zona ricca di siti di fosforilazione importanti per il

disaccoppiamento funzionale del recettore dalla proteina G, alla

base del fenomeno della desensibilizzazione. Una caratteristica

unica del recettore di tipo I mammifero del GnRH è l’assenza della

coda terminale carbossilica che invece è presente in tutti gli altri

GPCR ed in tutti i recettori di tipo II mammiferi e non. La perdita

della coda carbossi-terminale è alla base dell’efficiente

funzionamento del recettore mammifero di tipo I. Essa impedisce

che il recettore venga sottoposto alla rapida internalizzazione e

conseguente desensibilizzazione tipica dei GPCR. Quindi, il recettore

di tipo I, rimane attivo più a lungo sulla membrana cellulare

cosìcché, gli analoghi del GnRH, legandosi a tale recettore, portano

ad un’attivazione protratta dei vari percorsi di segnalazione

33

intracellulare tra i quali, quelli che inibiscono la proliferazione

cellulare e che sono alla base degli effetti antiproliferativi diretti del

GnRH e dei suoi analoghi, sulle cellule cancerose (Everest et al.,

2001; Franklin et al., 2003). Secondo il modello classico, le GPCR si

trovano in una stato di equilibrio tra la conformazione attiva R* ed

uno stato inattivo R. La conformazione R* ha un’alta affinità per gli

agonisti i quali stabilizzano tale conformazione spingendo l’equilibrio

ulteriormente verso R*. Al momento dell’ attivazione del recettore

da parte dell’agonista (R*), il recettore subisce un cambiamento

conformazionale che si trasmette alla proteina G la quale è un

eterotrimero costituito da 3 subunità denominate in base al peso

molecolare !, " , e #. Nello stato di riposo la subunità ! della

proteina G lega il GDP ed è strettamente connessa a sua volta al

complesso "#; con l’attivazione, il GDP viene sostituito da GTP nel

complesso proteina G eterotrimerico. Tale sostituzione promuove un

ulteriore cambiamento conformazionale della proteina G con

separazione della subunità ! dal complesso "# che consente ad

entrambi di interagire con gli effettori regolandone l’attività. Tale

34

dissociazione, successivamente, dà luogo ad idrolisi di GTP a GDP

grazie all’attività GTPasica della sub-unità !, con la riformazione del

complesso G!-GDP"# ed un ritorno del recettore allo stato inattivo

(R) (Carli et al., 2008). L’ occupazione dei recettori da parte

dell’agonista del GnRH porta alla attivazione di molteplici vie di

trasduzione del segnale. Nelle cellule gonadotrope per esempio, il

GnRH attiva un enzima citoplasmatico, la fosfolipasi di tipo ß (PLCß)

via Gq/11 ! (ed in alcuni casi via Gq-11"#), provocando l'idrolisi del

fosfolipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5-difosfato (PIP2), in

inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG), entrambi

secondi messaggeri; l’IP3 diffonde a livello citoplasmatico e

mobilizza il calcio intracellulare mentre il DAG (rimanendo confinato

a livello di membrana plasmatica) attiva le proteinchinasi C (PKC),

promuovendone la traslocazione dal citoplasma alla membrana.

Questi a loro volta stimolano la biosintesi e la secrezione delle

gonadotropine, LH e FSH. Il recettore del GnRH è accoppiato

prevalentemente alla proteina Gq/11 ma una serie di studi hanno

dimostrato che altre proteine G possono mediare l’azione dei

35

recettori del GnRH. Tra queste Gi, la cui attivazione sarebbe alla

base degli effetti antiproliferativi del GnRH in molti tumori (Grundker

et al., 2000) e Gs. Per queste proteine G invece l’effettore è

rappresentato da un enzima di membrana ubiquitario, l’adenilato

ciclasi, la cui attività esita nella sintesi di AMPc. Anche i MAPK

(Mitogen Activated Protein Kinase) svolgono un ruolo fondamentale

nella segnalazione intracellulare GPCR-mediata. Anche se le vie di

segnalazione che portano all’avvio di una serie di reazioni a cascata

indotte sia da parte della subunità !, che dal complesso "# delle

GPCR, siano meno chiare, sembra che esse siano PKC-dipendenti

(Naorr et al., 2000).

6 PREPARAZIONI FARMACEUTICHE

6.1 GENERALITA’ SUI FARMACI CONTENENTI GnRH

La sostituzione di numerosi aminoacidi nella struttura iniziale

del GnRH ha portato allo sviluppo di composti agonisti molte volte

più potenti rispetto al GnRH naturale (GnRH-a). Queste molecole di

36

sintesi sono infatti caratterizzate da una più alta affinità per i

recettori, da una elevata resistenza alla degradazione proteolitica e

da una ridotta eliminazione renale e dunque una maggiore emivita.

Inizialmente, la somministrazione degli agonisti del GnRH determina

un’aumentata secrezione di FSH ed LH (effetto flare-up). La

somministrazione prolungata, invece, induce una parziale

desensibilizzazione dei recettori ipofisari del GnRH (d o w n

regulation) con coseguente soppressione della secrezione di FSH ed

LH, una condizione simile all’ipopituitarismo, con conseguente

ipogonadismo (Rabin et al., 1980). Dunque, la somministrazione del

GnRH e dei suoi analoghi permette di influenzare l’asse ipotalamo-

ipofisario-gonadale e ciò trova diverse applicazioni cliniche.

Da un lato è possibile mimare la fisiologica secrezione pulsatile di

GnRH da parte dell’ipotalamo attraverso l’uso di una pompa ad

infusione portatile utilizzata in medicina umana, che permette di

ripristinare potenzialmente la fertilità in uomini e donne sterili a

causa di disordini della secrezione endogena di GnRH. L’uso di

questo tipo di impianti è legato al fatto che, essendo di natura

37

peptidica, gli analoghi del GnRH hanno l’inconveniente di avere una

emivita troppo breve e di non poter essere somministrati per os.

Quindi si ricorre a impianti parenterali che consentono, con una sola

applicazione, di mantenere bassa la concentrazione ematica degli

ormoni gonadotropi per periodi di 1, 3 e 12 mesi. Tali impianti sono

di due tipi:

-impianti biodegradabili

-impianti non biodegradabili (questi ultimi hanno lo

svantaggio di dover essere rimossi al termine del periodo di rilascio

del farmaco).

Figura 6 Pompa osmotica

38

Per uso veterinario è disponibile una preparazione a base di

gonadorelina, un derivato di sintesi del GnRH, molte volte più

potente del composto naturale, la quale viene impiegata per il

trattamento delle cisti follicolari nel bovino e nel coniglio, per

migliorare il tasso di concepimento nella bovina e per indurre

l’ovulazione nella cavalla. I vantaggi di questo derivato di sintesi

sono molteplici rispetto alle sostanze ad attività gonadotropino-

simile: esso non provoca anafilassi, né problemi di refrattarietà al

prodotto (Drost e Thatcher, 1992), è più economico e meglio

conservabile (Ngategize e coll., 1987). Come precedentemente

accennato invece, la somministrazione sia di GnRH naturale che di

agonisti a lunga durata d’azione, provoca una desensibilizzazione

paradossa della secrezione delle gonadotropine ipofisarie; ciò a sua

volta determina un completo annullamento delle funzioni dell’asse

riproduttivo. Nell’uomo, questa castrazione chimica completa,

selettiva e prontamente reversibile con l’interruzione della

somministrazione dell’agonista, si ottiene attraverso l’uso di

formulazioni deposito mensile o somministrazioni quotidiane per via

39

intranasale o intramuscolare e viene utilizzata per eliminare la

produzione di ormoni steroidei che aggravano malattie quali

l’endometriosi, i fibromi uterini nella donna, il tumore della prostata

nell’uomo e la precocità sessuale in entrambi i sessi (triptorelina

formulazione depot). Diversi sono i farmaci in commercio che

sfruttano le proprietà antiproliferative ed antimetastatiche degli

analoghi del GnRH nella terapia dei tumori ormono-dipendenti

come, ad esempio, la goserelina C la quale viene impiegata nel

trattamento ormonale del carcinoma prostatico. Essa, agendo

sull’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi, riduce la produzione di

testosterone a livelli di castrazione; la somministrazione di

formulazioni deposito di goserelina, in diversi trial clinici controllati,

é risultata efficace quanto l’orchiectomia. La stessa evidenza si ha

anche per la triptorelina, la buserelina e la leuprolide. In genere,

nella malattia avanzata, entro i primi 3 mesi di trattamento, le

risposte obiettive si aggirano intorno al 50%; un ulteriore 25%

mostra una stabilità della malattia, mentre il restante 25%

progredisce. Sulla base dello stesso principio buserelina, goserelina

40

e leuprolide sono impiegati nella terapia dei tumori mammari

ormono-dipendenti in quanto sopprimono la funzionalità ovarica,

riducendo gli estrogeni circolanti (AIFA-Bollettino d’informazione sui

farmaci, 2006).

In ambito veterinario recentemente è stato studiato un sistema a

rilascio prolungato (SABER™) per somministrare deslorelina, un

altro potente analogo del GnRH, per indurre l’ovulazione ad un

preciso e prevedibile momento sia nelle giovenche, che nelle scrofe,

prima dell’inseminazione artificiale (Rothen Weinhold et al., 2000).

Il sistema di somministrazione SABER™ utilizza una composto base

ad elevata viscosità per fornire il rilascio controllato del farmaco

durante uno specifico periodo di tempo. E’ costituito da una

molecola di saccarosio completamente esterificata (SAIB); si tratta

di un prodotto a basso peso molecolare con molte proprietà tipiche

dei materiali polimerici. Con l’aggiunta di una piccola quantità di

solvente, SAIB si converte in un liquido facilmente iniettabile. Una

volta all’interno del corpo il solvente si dissipa e si forma un

impianto semisolido biodegradabile. L’uso di diversi solventi ed

41

additivi permette di modificare la durata del rilascio di questo

sistema di somministrazione da alcune ore a mesi.

Per il bovino, è attualmente in studio un altro prodotto che

utilizza la tecnologia SAIB per il rilascio controllato di deslorelina a

breve termine: il SABER Mate B, una formulazione acetato che viene

utilizzata nel trattamento con OVSYNC® (GnRH/PGF2!/GnRH) per

indurre la sincronizzazione della maturazione dei follicoli, la

regressione del corpo luteo e l’ovulazione al fine di rendere possibile

l’inseminazione programmata entro 12-24 ore dopo il

completamento del protocollo con OVSYNC® (Rathbone et al.,

2002). Per il suino invece, é stata prodotta una formulazione per il

rilascio controllato di deslorelina a breve termine, per indurre lo

sviluppo follicolare e l’ovulazione entro 40 ore dalla

somministrazione, nelle scrofe e scrofette in estro (SABER Mate P).

Con lo scopo di sopprimere la funzionalità dell’intero asse

riproduttivo, sono stati studiati impianti a lento rilascio di

deslorelina acetato o di leuprolide per il cane ed il gatto; anche in

queste specie infatti, la somministrazione protratta di alte dosi di

42

analoghi del GnRH, si é dimostrata efficace nel sopprimere la

produzione di spermatozoi nel maschio ed indurre l’anestro nelle

femmine (Junaidi et al., 2003). Limitazioni al loro uso nella pratica

clinica di routine però, sono rappresentate da un lato dal fatto che,

per ottenere questi effetti, il trattamento deve iniziare due mesi

prima della stagione riproduttiva e dall’altro, dall’elevato costo di

questi prodotti (Gobello et al., 2002).

Anche nell’allevamento dei pesci si sta sempre più diffondendo

l’uso di agonisti sintetici del GnRH i quali vengono sfruttati al fine di

indurre lo sviluppo dell’ovario, la maturazione finale degli oociti

(FOM), l’ovulazione e la spermiazione. I peptidi di sintesi, essendo

molto piccoli, non innescano una risposta immunitaria e quindi,

hanno il vantaggio di poter essere utilizzati nella successiva

stagione riproduttiva, senza che si verifichi una riduzione della loro

efficacia. Inoltre, data la similarità nella struttura dei GnRH di molte

specie di pesci (Sherwood et al., 1994), è possibile utilizzare con

successo lo stesso analogo del GnRH per un vasto gruppo di specie

ittiche. Come molti animali non domestici allevati in cattività, la

43

maggior parte dei pesci allevati in acquacoltura mostra alcuni gradi

di disfunzioni riproduttive. Molte specie di pesci non spermiano in

cattività oppure la spermiazione non è sincrona ed è imprevedibile,

il che rappresenta un ostacolo per l’allevamento.

Per ottenere la deposizione sono necessari trattamenti

multipli, ma ciò nei pesci determina un forte stress che può causare

un’elevata mortalità, oltre a richiedere un elevato costo in termini di

tempo e di personale. Per tale motivo sono stati sviluppati dei

sistemi di trasporto per l’analogo del GnRH a lento e continuo

rilascio.

Si tratta di un sistema di trasporto fabbricato in forma di

microsfere biodegradabili; tale formulazione, è stata studiata

tenendo conto della bassa temperatura corporea dei pesci.

Le microsfere comprendono una molteplicità di piccole

particelle sferiche con un diamentro minore di 200 !m. Queste,

sono sistemi di riserva monolitici consistenti di una matrice

polimerica in cui il farmaco è, o disperso o dissolto, a seconda della

propria solubilità (Mylonas et al., 1995; Zohar et al., 1990). Sono

44

stati sviluppati diversi tipi di microsfere contenenti analoghi del

GnRH. Alcuni con copolimeri di dimeri di acidi grassi ed acido

sebacico, altre con copolimero di acido lattico e glicolico (PLGA),

altre ancora contenenti copolimeri di etilene vinile acetato (EVAC);

queste formulazioni vengono utilizzate per stimolare l’aumento a

lungo termine di gonadotropine plasmatiche ed indurre la

spermiazione in molti pesci.

In particolare, le microsfere di PLGA sono biodegradabili e

vengono preparate con il metodo dell’evaporazione del solvente

(Okada et al., 1994a,b); al loro interno il GnRH è sciolto in gocce di

acqua microscopiche, che vengono intrappolate in una a matrice di

LGA. Il rilascio dell’ormone dalle microsfere è immediato e può

durare fino ad alcuni mesi. La maggior parte dei sistemi a lento

rilascio costituiti da microsfere biodegradabili, utilizzati per

l’induzione della deposizione nei pesci, sono disponibili in commercio

sotto forma di prodotti già confezionati (Zohar, 1988; Zohar et al.,

1990; Breton et al., 1990; Chang et al., 1995; Barbaro et al., 1997)

essendo utilizzati anche per il controllo della fertilità negli uomini e

45

nel bestiame (Favero et al., 1995; Barbieri e Hornstein, 1999) o per

trattamenti antitumorali (Emons e Schally, 1994). Un altro

vantaggio è che lo stesso preparato può essere utilizzato

indifferentemente per trattare pesci di taglia diversa da pochi

grammi fino ad alcuni chili. Ciò perché le microsfere sono costituite

da prodotti naturali e vengono completamente riassorbite dai pesci

trattati, consentendo di vendere e consumare il prodotto senza

alcun rischio di residui nelle carni.

Gli antagonisti del GnRH, bloccano immediatamente la

produzione di GnRH e dunque delle gonadotropine legandosi

competitivamente al recettore. Inducono quindi una ipofisectomia

fisiologica. Dato il loro meccanismo d’azione, non determinano gli

svantaggi legati alla profonda soppressione ipofisaria che si ottiene

invece con gli agonisti. Gli antagonisti del GnRH sopprimono la

secrezione di LH in maniera dose-dipendente. A piccole dosi la

soppressione dell’LH è minima, mentre a dosi elevate può essere

raggiunta una completa soppressione della secrezione dell’ormone.

46

Figura 7 Analoghi antagonisti di sintesi del GnRH

Gli antagonisti vengono somministrati per via sottocutanea ad

alte dosi o come preparati a lento rilascio. Le limitazioni all’uso degli

antagonisti risiedono sostanzialmente nei loro parametri

farmacocinetici. Nell’uomo trovano applicazione nella fecondazione

in vitro con embryo transfer, come antitumorali (anche se i loro

efftetti a lungo termine e la sopravvivenza non sono stati ancora

determinati da studi clinici), nelle malattie ginecologiche benigne,

nella pubertà precoce e nella contraccezione ormonale maschile.

Provocano effetti collaterali limitati come prurito o bruciore nel sito

di inoculo.

47

In medicina veterinaria ci sono alcune situazioni in cui è

desiderabile sopprimere in parte o del tutto il sistema riproduttivo

endocrino di una specie animale. In particolare è noto che, nei

cavalli da competizione, l’allenamento, le prestazioni o le

performance atletiche possono essere compromesse da

comportamenti sessuali o aggressivi. Gli approcci terapeutici più

utilizzati per ottenere la soppressione della funzionalità riproduttiva

includono la gonadotomia e la somministrazione di progestageni; il

primo sistema comporta rischi chirurgici (soprattutto nei soggetti

anziani con frequenti emorragie) e comprende la perdita

irreversibile del potenziale riproduttivo, mentre il secondo sistema,

per essere efficace, richiede frequenti somministrazioni per periodi

estesi ed è vietato in alcuni animali da competizione come

potenziale anabolizzante. In questo contesto prevenire l’azione del

GnRH bloccando i suoi recettori ipofisari, potrebbe essere una valida

alternativa per sopprimere la secrezione di testosterone o la

spermatogenesi negli stalloni. A questo scopo sono stati fatti alcuni

studi su antarelix e cetrorelix i quali permettono, una volta

48

interrotta la loro somministrazione, il ritorno a normali livelli di

testosterone circolante (Stout et al., 2004).

E’ stato inoltre riportato che l’aciclina, un altro analogo del

GnRH, provoca l’interruzione della gravidanza in cagne gravide

senza indurre effetti collaterali di particolare rilievo.

6.2 IMPROVAC®

6.2.1 GENERALITA’

Nel maggio 2009 la Commissione Europea ha dato il via libera

in tutta Europa alla commercializzazione di Improvac®, un

innovativo vaccino per suini destinato a prevenire il cosiddetto

“odore di verro”. Anche se il vaccino è una novità assoluta per

l’Europa, in realtà ha già oltre 10 anni di vita ed è in uso con

successo in molte nazioni di diversi continenti. Improvac® è stato

sviluppato in Australia da una partnership fra governo e Pfizer a

partire dal 1990 per poi essere registrato in tale paese ed in Nuova

Zelanda nel 1998. A partire dal 2004 fino al 2006, é seguita poi una

rapida diffusione, che ha coinvolto Medio Oriente, Sud Africa e

49

Centro-Sud America. Improvac® può essere definito un vaccino

zootecnico destinato, non a proteggere da una patologia, ma a

prevenire quegli odori e sapori sgradevoli, tipici delle carni

provenienti da suini maschi interi, che le rendono praticamente

immangiabili (Bonneau, 1982). Rappresenta un’alternativa efficiente

e rispettosa del benessere animale, alla castrazione fisica precoce

dei suinetti. L’odore di verro è un odore sgradevole rilasciato dalla

carne di maiale durante la cottura. Il livello di odore di verro varia a

seconda del suino ma è particolarmente intenso nella carne dei suini

maschi interi. E’ causato da alcune sostanze che si accumulano nel

tessuto adiposo quando il verro raggiunge la maturità sessuale. I

due composti principali che lo determinano sono: l’androstenone e

lo scatolo.

Figura 8 Struttura chimica dell’androstenone.

50

L’androstenone é un feromone maschile prodotto nei testicoli

che si accumula nelle ghiandole salivari. Il livello di androstenone è

direttamente influenzato dall’attività testicolare e per questo,

aumenta notevolmente quando l’animale raggiunge la pubertà. E’

altamente lipofilo, per cui si accumula nel tessuto adiposo,

contribuendo all’insorgenza dell’odore di verro.

Lo scatolo viene prodotto sia nelle scrofe, sia nei verri

castrati; é un prodotto di scarto derivante dalla digestione batterica

dell'aminoacido triptofano nell’intestino, dal quale viene assorbito e

metabolizzato a livello epatico.

Figura 9 Struttura chimica dello scatolo

La metabolizzazione epatica dello scatolo é meno efficiente nei

suini maschi interi rispetto alle femmine ed ai maschi castrati in

quanto essa è inibita dagli steroidi sessuali; al raggiungimento della

51

pubertà le gonadi cominciano a produrre una maggiore quantità di

ormoni sessuali ed anch’esso tende ad accumularsi nel tessuto

adiposo (EFSA Journal., 2004). Poiché l’odore di verro aumenta con

la maturità sessuale, l'aumento di peso alla macellazione, è

associato con un aumento del rischio di odore di verro. Essendo il

GnRH il regolatore chiave delle funzioni riproduttive degli individui,

l’immunizzazione contro il GnRH rappresenta un metodo efficace e

sicuro per inibire lo sviluppo sessuale e ridurre, conseguentemente,

l’odore di verro (Caraty e Bonneau, 1986; Dunshea et al., 1993;

Bonneau et al., 1994). Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di

vaccinazione utilizzati fin’ora sono stati inadeguati poiché richiedono

più iniezioni o si verificano reazioni nel sito di iniezione che

richiedono un lungo intervallo di tempo tra vaccinazione e

macellazione.

Improvac® è un vaccino che contiene una forma modificata

del GnRH con un sistema adiuvante acquoso che determina scarse

lesioni tissutali.

52

La formulazione del vaccino e il protocollo, consentono ai suini

di ricevere la seconda dose del vaccino circa 4-5 settimane prima

della macellazione.

Le sostanze responsabili dell’odore di verro già presenti al

momento della somministrazione vengono progressivamente

metabolizzate, consentendo la macellazione del suino intero ad un

peso vivo maggiore, senza odori e dopo che ha beneficiato degli

effetti sulla crescita dovuti ai propri steroidi endogeni.

6.2.2 PROPRIETA’ CHIMICO-FISICHE

Improvac® si presenta come una soluzione acquosa priva di

odori particolari. Come accennato il vaccino è formulato con un

adiuvante non lipidico, il tiomersale, che lo rende solubile in acqua e

quindi somministrabile per inoculazione.

Ha un peso specifico di 1,052 ed un punto di fusione a 0° C ;

il PH è compreso tra 7,4 e 7,8. Improvac® non ha proprieta’

ossidanti, né corrosive, non è infiammabile. La pressione di vapore

53

è: 3,19 kPa a 25°C. Deve essere conservato tra 2 ed 8°C, può

essere refrigerato ma non congelato (www.improvac.com).

6.2.3 MECCANISMO D’AZIONE

Improvac® è un analogo incompleto di sintesi del GnRH

naturale costituito da 9 aminoacidi. Di per se’ l’analogo non è

immunologicamente attivo, per cui, è stato coniugato con una

proteina carrier di maggiori dimensioni, ottenuta dal

Corynebacterium Diphtheriae, che lo rende immunogeno. Tali

modifiche impediscono qualunque legame dell’analogo di sintesi con

i recettori ipofisari per il GnRH e quindi, ne eliminano

completamente ogni attività ormonale. L’immunizzazione con

Improvac® stimola il sistema immunitario del suino a produrre

anticorpi specifici contro il GnRH endogeno, neutralizzandone gli

effetti. Come precedentemente detto, il GnRH endogeno, liberato

dall’ipotalamo, si lega a specifici recettori nella ghiandola ipofisaria,

dove induce il rilascio di LH ed FSH i quali, nel maschio, stimolano e

54

controllano la crescita e l'attività dei testicoli che determinano il

raggiungimento della maturità sessuale, le modificazioni del

comportamento, nonché la comparsa dell’odore di verro (Dunshea

et al., 2001).

Figura 10 Meccanismo di azione di Improvac®

La vaccinazione con Improvac®, causa una castrazione

chimica del suino, bloccando la funzione delle gonadi e quindi

l'accumulo dei composti che generano l’odore di verro.

55

Come per molti altri vaccini, un’immunizzazione completa del

soggetto si verifica a seguito di due somministrazioni effettuate ad

una distanza minima di quattro settimane l’una dall’altra.

La prima dose di innesco viene effettuata generalmente allo

svezzamento (intorno alle 8 settimane di vita) ed è seguita da una

seconda dose di richiamo effettuata almeno 4 settimane più tardi.

L’effetto desiderato si manifesta tra le quattro e le sei

settimane dalla somministrazione della seconda dose. Per tale

motivo la seconda dose deve essere ben calibrata in funzione della

data prevista per la macellazione (http://www.evsrl.it/

vet.journal/approfondimento.php?codnotizia=3265). La dose iniziale

del vaccino, stimola le cellule della memoria del sistema

immunitario dell'animale, ma non stimola la produzione di livelli

effettivi di anticorpi anti-GnRH (Font i Furnols et al., 2009).

Pertanto, non è sufficiente a sopprimere la funzione testicolare ed il

suino continua a crescere normalmente potendo beneficiare dei

propri fattori di crescita naturali. Ciò si traduce in un potenziale

aumento dei ricavi per l’allevatore dal momento che i maschi

56

vaccinati possono crescere come maschi interi per gran parte del

periodo di ingrasso, vantaggio che si perde quando i suinetti

vengono castrati precocemente.

Figura 11 Rappresentazione schematica delle variazioni della concentrazione degli

anticorpi anti-GnRH e dell’odore di verro, a seguito della somministrazione di Improvac®.

La seconda dose, somministrata in prossimità della

macellazione (in genere quattro, sei settimane prima), produce un

rapido e marcato aumento di anticorpi circolanti specifici anti-GnRH,

i quali si legano con il GnRH endogeno, neutralizzandolo. Ciò arresta

57

temporaneamente la stimolazione dell’ipofisi e quindi inibisce la

funzione testicolare. Quando la produzione testicolare di

testosterone diminuisce, allo stesso modo si riduce la produzione di

androstenone, portando l’odore di verro a livelli analoghi a quelli dei

suini castrati chirurgicamente (Bernal et al., 2006).

Contemporaneamente il fegato riacquista la propria capacità di

metabolizzare in modo efficace lo scatolo accumulato. Gli studi

clinici indicano che, entro 3-4 settimane dopo la seconda dose, i

livelli di androstenone e scatolo diminuiscono a livelli trovati in

femmine e suini maschi castrati e che ogni contaminazione già

presente al momento della vaccinazione, viene eliminata.

6.2.4 FARMACOCINETICA

Poiché il prodotto è formulato con un adiuvante acquoso, la

vaccinazione viene effettuata tramite somministrazione per via

sottocutanea alla base dell’orecchio. Numerosi sono stati gli studi

per dimostrare che Improvac® non ha alcuna attività ormonale

58

intrinseca ma che si tratta, semplicemente, di un prodotto che

sfrutta il sistema immunitario del suino per ottenere una

temporanea e reversibile castrazione chimica.

A dimostrazione di ciò, in alcune pecore è stato inoculato

direttamente nel circolo sanguigno sia 1µg di GnRH naturale, sia 50

µg dell'antigene Improvac® o di soluzione salina . I campioni di

sangue prelevati ad intervalli regolari dopo l’iniezione ed analizzati,

per valutare la concentrazione di LH, hanno dimostrato che l'attività

di stimolazione del rilascio dell’LH da parte dell’ipofisi, è pari a zero

(Lagerkvist et al., 2006).

59

Figura 12 Effetti dell’antigene Improvac® o della soluzione salina e del GnRH

naturale sulla liberazione di LH.

Generalmente, le molecole biologiche complesse presenti nei

vaccini, vengono rapidamente degradate nel soggetto vaccinato;

nell’eventualita’ che l’animale dovesse essere macellato

precocemente, tali molecole vengono inattivate con la cottura o, nel

caso di consumo crudo, nel tratto gastro-intestinale del

consumatore. Studi efettuati nel suino (che rappresenta un ottimo

modello della fisiologia gastrica umana) per valutare la

biodisponibilita’ orale dell’antigene Improvac®, hanno rivelato che,

60

a seguito di due dosi orali di Improvac®, non c’é alcuna risposta

anticorpale e che la concentrazione di testosterone nei suini trattati

non é diversa da quella dei suini di controllo (Clarke et al., 2008).

Quindi l’antigene Improvac® non é biodisponibile quando

somministrato per via orale e non produce né effetti immunologici,

nè ormonali. Lo stesso vale per ripetute assunzioni orali di antigene.

Animali da laboratorio trattati con dosi 70 volte superiori a quelle

della massima esposizione possibile se un essere umano mangiasse

un intero sito di iniezione crudo subito dopo la vaccinazione (pari

all’assunzione di una dose completa di 2!L di vaccino), ha

dimostrato di non produrre alcuna attività sul sistema immunitario,

sulla funzione testicolare, biochimica, ematologica o sulla salute e il

benessere generale degli animali. Oltre a non avere biodisponibilità

orale, non esistono antigeni quantificabili rilevabili nel siero se il

vaccino è somministrato per via SC (Giffin et al., 2008).

A conferma che l’ipotetico consumo di carne contenente

residui di vaccino, non avrebbe effetti biologici sia immunologici che

ormonali, il tempo di sospensione per questo prodotto é di 0 giorni.

61

6.2.5 EFFETTI DELLA VACCINAZIONE CON IMPROVAC®

6.2.5.1 RISPOSTA ANTICORPALE

I titoli anticorpali contro il GnRH sono stati utilizzati per

monitorare l'effetto primario della vaccinazione con Improvac®

nello stimolare una risposta immunologica nei suini. Una risposta

immunitaria contro il GnRH e’ rilevabile in tutti i suini trattati con

due dosi di Improvac® somministrate ad una distanza di 4

settimane l’una dall’altra. Anche se la risposta può essere più bassa

in alcuni singoli soggetti, non ci sono suini trattati con Improvac® in

cui non venga rilevata una risposta immunitaria. Nel caso in cui i

suini vengano macellati 7-8 settimane dopo la seconda dose, il titolo

anticorpale decresce al di sotto dei livelli efficaci, la funzione

testicolare riprende gradualmente così come l’accumulo dei

composti che generano odore di verro.

62

6.2.5.2 FUNZIONE TESTICOLARE

La prima dose del vaccino contro il GnRH sembra non avere

alcun effetto fisiologico sulla funzione testicolare valutata attraverso

la dimensione dei testicoli e le concentrazioni di testosterone sierico.

Comunque, entro 2 settimane dalla somministrazione della seconda

dose di vaccino, la crescita dei testicoli e la secrezione di

testosterone risultano soppressi (www.pfizer.com). La soppressione

della crescita testicolare si mantiene per almeno 4 settimane dopo

la seconda vaccinazione. Al momento della macellazione, i pesi di

entrambi i testicoli e delle ghiandole bulbo-uretrali dei suini trattati

con Improvac®, è circa la metà di quello dei verri interi della stessa

eta’ (Dunshea et al., 2001). Ciò indica chiaramente l'efficacia del

vaccino e, contemporaneamente, fornisce un possibile mezzo di

monitoraggio, da parte dell’allevatore stesso, per individuare quei

pochi individui in cui la vaccinazione non é stata pienamente

efficace.

63

L'effetto del vaccino, nel sopprimere la concentrazione del

testosterone plasmatico, si mantiene almeno per le 4 settimane

successive alla seconda dose.

6.2.5.3 PERFORMANCE

Le performance di crescita non vengono compromesse dalla

riduzione del testosterone conseguente alla seconda dose del

vaccino (Campbell e Taverner, 1988; Dunshea et al., 1993). Da un

confronto tra suini immunocastrati e suini interi, é emerso che i

suini immunocastrati ed i suini interi hanno le stesse performances

e che i soggetti immunocastrati hanno un’efficienza di conversione

degli alimenti dal 10 al 12% maggiore ed un rendimento in carne

magra dal 3 al 4% più elevato, rispetto ai castrati (Bonneau et al,

1994).

Questo perché, prima della seconda vaccinazione, i verri

vaccinati con Improvac® beneficiano dei naturali fattori di crescita

anabolizzanti presenti nei maschi interi. La castrazione fisica

64

precoce per il controllo dell’odore di verro invece, elimina i fattori di

crescita naturali, riducendo così l'efficienza della crescita, l'efficienza

della conversione degli alimenti e la massa magra.

Nelle 4 settimane successive alla seconda dose del vaccino, i

suini trattati crescono del 7% più velocemente rispetto ai suini

castrati precocemente.

Il maggiore accrescimento degli immunocastrati rispetto ai

suini interi è collegato ad una diminuzione del comportamento

aggressivo e sessuale, conseguenza della soppressione della

funzione testicolare e quindi della riduzione del testosterone

circolante; gli animali impiegano il tempo ad alimentarsi piuttosto

che ad aggredirsi (Stookey e Gonyou, 1994). Infine la riduzione

dello stress nelle ultime settimane precedenti la macellazione da’

luogo a migliori performance nella fase di finissaggio (Finnerty et al.

1996) e si traduce in ultima analisi in una migliore qualità della

carne e in una riduzione dell’incidenza di DFD (Sather et al., 1985;

D'Souza et al., 1999) e di PSE (D'Souza et al., 1998).

65

6.2.5.4 ODORE DI VERRO

L'efficacia di Improvac nella prevenzione dell’odore di verro è

inequivocabile; nel 100% dei suini vaccinati, i livelli di androstenone

e di scatolo sono ridotti al di sotto dei livelli soglia sopra la quale

l’odore di verro può essere rilevato dai comitati dei consumatori. Le

concentrazioni medie dei due composti, nei soggetti vaccinati, sono

a livelli simili a quelli osservati nei castrati (Desmoulins e Bonneau,

1982; Bonneau et al., 1982; Bonneau, 1998).

6.2.5.5 LESIONI SULLA CARCASSA

I primi studi su vaccini a base oleosa, permisero di ottenere

alti titoli anticorpali ma questi vaccini erano associati con

un'incidenza inaccettabile di reazioni nel sito di somministrazione

(Hall et al., 1989; Straw et al., 1985, 1990).

Anche se questo può non essere un grosso problema nei suini

macellati molti mesi dopo la vaccinazione (Oishi et al., 1997), lo

diventa quando i suini vengono macellati poco dopo la vaccinazione.

66

Improvac® non contenendo olio, provoca un’incidenza molto bassa

di qualsiasi reazione cutanea visibile o palpabile. In uno studio

condotto su 200 suini vaccinati, c’è stato un solo caso di ascesso o

di grave reazione nel sito di inoculum attribuibile al vaccino.

L’ascesso è comparso 21 giorni dopo la prima vaccinazione ma, al

momento della macellazione, si presentava completamente

scomparso e residuava solo una piccola cicatrice.

6.2.6 TOSSICITA’

6.2.6.1 EFFETTI ACUTI

Questo prodotto non viene considerato patogeno per l’uomo,

tuttavia, particolari attenzioni devono essere prese in sede di

somministrazione del vaccino, da parte dell’operatore addetto

all’intervento. Improvac, infatti, non è specie-specifico, quindi

agisce anche sull’operatore qualora accidentalmente se lo

inoculasse, inducendo gli stessi effetti che produce nel suino ovvero

una temporanea riduzione degli ormoni sessuali ed una ridotta

67

capacita’ riproduttiva nell’uomo e nella donna, compresi problemi in

caso di gravidanza. Al riguardo sono state studiate speciali siringhe

di sicurezza che, grazie ad un particolare sistema a scomparsa

dell’ago, tutelano al meglio l’operatore da eventuali auto-

vaccinazioni (www.anmvi.it/files/39_2008pdf). Inoltre in caso di

contatto prolungato con la pelle, questo prodotto può causare

reazioni allergiche o, nel caso di iniezione accidentale, reazioni nel

sito di iniezione a causa di coadiuvante usato.

Improvac® non è tossico, ma può essere nocivo se ingerito in

grandi quantità.

Nel caso di contatto con gli occhi la soluzione, a causa di un

conservante utilizzato, può determinare leggere irritazioni.

L’inalazione non costituisce normalmente un rischio data la

natura non-volatile del prodotto. L’esposizione a nebulizzazioni

ripetute (prodotte per esempio con la siringa) può arrecare danni

alle vie respiratorie superiori e ai polmoni, determinando fenomeni

di sensibilizzazione e / o allergia fino all’asma.

68

6.2.6.2 EFFETTI CRONICI

Non sono disponibili dati specifici per il prodotto per i sintomi

da esposizione cronica. Gli ingredienti non sono classificati come

cancerogeni.

6.2.7 CONCLUSIONI

Per eliminare l’odore di verro, in alcuni paesi, per esempio nel

Regno Unito, i suini maschi non vengono sottoposti a castrazione

ma sono macellati precocemente, prima che aumenti il rischio di

accumulo delle sostanze responsabili dell’odore di verro nella carne.

Questo però impedisce agli allevatori di beneficiare del vantaggio

economico relativo alle performance produttive dell’animale durante

l’ingrasso, con il rischio di produrre una carne meno “matura” quindi

di qualità inferiore.

Tra gli altri metodi consigliati per il controllo dell’odore di

verro c’è l’uso del seme sessato per l’allevamento delle sole

femmine. È stata inoltre vagliata la possibilità di seguire diete

69

speciali in grado di ridurre l’odore di verro e di eseguire analisi

chimiche della carne nella linea di macellazione per identificare ed

eliminare le carcasse che presentano il problema.

Tutti questi sistemi suggeriti al fine di ridurre l’odore di verro,

presentano il fianco a diversi limiti, soprattutto di ordine pratico, ed

è per tale motivo che a livello mondiale circa il 95% dei suinetti

maschi vengono castrati in età precoce. Tuttavia la castrazione

fisica non è esente da pecche, quali ad esempio:

• Calo della crescita a causa di infezioni, ferite o ernie

• Criptorchidi che sfuggono alla pratica chirurgica

• Dolore e stress per l’animale

le quali sono da tenere in giusta considerazione al momento

dell’applicazione di questa pratica.

Molti studi condotti in condizioni commerciali hanno

dimostrato che i suini vaccinati con Improvac®, in alternativa alla

castrazione fisica, presentano una migliore efficienza alimentare ed

una maggiore percentuale di massa magra della carcassa, grazie

alle caratteristiche di performance più simili a quelle dei maschi

70

interi. Quindi anche in sede di macellazione la carcassa risulta più

apprezzata di quanto non sia quella del castrato, decisamente più

grassa. In definitiva il maschio vaccinato si colloca, in termini di

presenza di grasso, in posizione intermedia fra il soggetto intero e

quello castrato. Ne consegue che, il ritorno economico in termini

zootecnici, sia in grado da solo di ripagare pienamente il costo

dell’intervento vaccinale. I benefici derivanti dall’utilizzo di

Improvac® potrebbero rivoluzionare l’allevamento del suino nel

nostro continente.

L’assenza di residui nelle carni garantisce la sicurezza

dell’alimento.

Da considerare anche la riduzione dell’impatto ambientale

legato all’uso del vaccino il quale permette di ottenere carcasse di

peso maggiore di quelle ottenute da suini castrati chirurgicamente

ma con un consumo minore della razione da parte dell’animale. Ciò

si traduce in un minore impatto ambientale dell’allevamento per la

riduzione della produzione di feci, quindi meno azoto e fosforo;

71

minor movimento di mezzi in azienda e quindi riduzione delle

emissioni di anidride carbonica.

Da non dimenticare infine che, oltre ai vantaggi zootecnici,

l’uso del vaccino, ponendosi come valida alternativa alla castrazione

fisica dei suinetti, soddisfa le presenti e future norme dell’UE in fatto

di rispetto del benessere animale. La Svizzera è il primo paese

dell’UE ad aver vietato la castrazione precoce dei suinetti, senza

anestesia, con una legge entrata in vigore nel gennaio del 2010 ed

è anche il primo Stato ad aver autorizzato l’uso di Improvac®; é

quindi probabile che, ad una prima fase di applicazione all’interno di

alcune nazioni, segua una estensione del provvedimento legislativo

anche al resto dell’Europa ed una diffusione dell’uso di questo

farmaco nell’allevamento del suino, anche nel vecchio continente.

72

7 INDICE DELLE FIGURE

Figura 1 Struttura del GnRH...................................................... 7

Figura 2 Sequenza del GnRH-I .................................................14

Figura 3 Sequenza del GnRH-II ................................................17

Figura 4 Relazione struttura-attività..........................................23

Figura 5 Struttura del recettore del GnRH..................................31

Figura 6 Pompa osmotica.........................................................37

Figura 7 Analoghi antagonisti di sintesi del GnRH........................46

Figura 8 Struttura chimica dell’androstenone..............................49

Figura 9 Struttura chimica dello scatolo.....................................50

Figura 10 Meccanismo di azione di Improvac®...........................54

Figura 11 Rappresentazione schematica delle variazioni della

concentrazione degli anticorpi anti-GnRH e dell’odore di verro, a

seguito della somministrazione di Improvac®.......................56

Figura 12 Effetti dell’antigene Improvac® o della soluzione salina e

del GnRH naturale sulla liberazione di LH. ............................59

73

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RINGRAZIAMENTI

Ringrazio di cuore il Chiarissimo Prof. Soldani per avermi costantemente seguito

ed incoraggiato nella stesura di questo lavoro.

Grazie ai miei genitori, a nonna ed a mio fratello che finalmente si è deciso a far

ripartire la mia Vespa, quale regalo più bello per la mia laurea !!

Grazie a Cecco, per la pazienza e tutto il tempo che mi ha dedicato; senza il tuo

aiuto, probabilmente, sarebbero passati altri eoni prima di tagliare il traguardo. Ringrazio

le mie amiche Silvia e Manu per essere sempre state al mio fianco in questa “crociata”

con le parole e, spesso, con i silenzi.

Ringrazio Giacomo (per i suoi mitici appunti) e tutti quelli che in questi anni hanno

fatto un pezzetto di strada con me: Silvia P., Michela, Ele, Baby, Ombretta, Roberta,

Alessandro e tante altre persone che non ho citato ma che sono nel mio cuore.

Ringrazio Martina per la sua amicizia ed il suo incredibile tifo da stadio, Marisa

perché mi ricorda sempre che io sono “la torre preziosa” ed Alessandro per il suo

contagioso ottimismo e costante sostegno.

Grazie a Filippo, caro amico ed esperto di Mac per aver fatto del mio super Mac,

un super-mega-Mac veloce come una saetta.

Grazie al Dott. Galli per la sua assistenza. Ringrazio, inoltre, tutti coloro che

hanno contribuito a fare in modo che questo obbiettivo fosse raggiunto.

E per ultimo grazie anche a me: perché, a volte, essere testardi è un pregio!

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