11. VETAKO OSEMENJAVANJE

46

Zootehnika i veterinarsko-medicinska metoda ubacivanja doza sperme u odreene delove enskog polnog trakta, primenom odreenih instrumenata i tehnika. U irokoj stoarskoj proizvodnji, vetako osemenjavanje (VO) se koristi ve vie od 50 godina. Primena ove metode, doprinela je velikom napretku intenzivne stoarske proizvodnje.

Prednosti primene vetakog osemenjavanja:

Bre razmnoavanje (dobijanje veeg broja potomaka) jednog genetski superiornog priplodnjaka

Spreavanje irenja zaraznih bolesti Mogunost dugotrajnog uvanja sperme odreenog priplodnjaka Jednostavniji i jeftiniji transport sperme, na vee udaljenosti Iskljuen rizik transporta, adaptacije, aklimatizacije i karantiniranja priplodnjaka Znatno bolja evidencija porekla potomaka Ekonomske utede u proizvodnji, zbog potrebe znatno manjeg broja priplodnjaka

Mogunost prodaje doza sperme i ekonomske koristi od toga Mogunost definisanja pola potomaka, putem sexing-a spermatozoida Mogunosti naunih istraivanjaPostupci u tehnologiji vetakog osemenjavanja:

1. Uzimanje sperme od priplodnjaka se vri: (a) vetakom vaginom, (b)manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) manuelnom masaom ampula semevoda per rectum.

2. Kontrola kvaliteta dobijenog ejakulata se vri neposredno posle uzimanja i obuhvata: (a) makroskopsku ocenu (volumen, gustina, boja, miris, prisustvo stranih primesa) i (b) mikroskopsku ocenu (ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, koncentracija spermatozoida u 1 ml ejakulata, % progresivne pokretljivosti, broj mrtvih i morfoloki abnormalnih spermatozoida, eventualno prisustvo mikroorganizama i td.). Broj spermatozoida se odreuje: hemocitometrijski ili fotometrijski. Mrtvi i morfoloki abnormalni spermatozoidi se odreuju pregledom trajnih histolokih preparata, obojenih adekvatnom metodom (po Blom-u, Supravitalno i td.). Svi opisani postupci kontrole sperme se vre u prostoriji sa oko 20-220C, dok sama sperma, instrumenti i predmeti koji dolaze u direktan kontakt sa spermom, moraju biti zagrejani na 370C.

3. Razreivanje ejakulata se izvodi odmah posle izvrene kontrole. Ejakulat se razreuje zbog toga da se: (a) povea njegov volumen, kako bi se mogao napraviti vei broj inseminacionih doza odreene zapremine i (b) dodaju potrebne hranljive, zatitne i druge materije, koje e produiti ivot i oplodnu sposobnost spermatozoida, tokom njihovog uvanja in vitro. Za razreivanje se koriste posebni razreivai, iji sastav i osobine zavise od vrste priplodnjaka, kao i od naina i duine uvanja razreene sperme.

47

4. Formiranje inseminacionih doza se vri u zavisnosti od vrste priplodnjaka, upotrebljenog razreivaa i naina uvanja. Volumen inseminacione doze je specifian za svaku vrstu priplodnjaka. Nativna razreena sperma se razlije u odreeni broj doza, koje se stavljaju na temperaturu 170C, ako se uvaju kratkotrajno (nekoliko sati ili dana) ili se postepeno rashlauju i podvrgavaju odreenoj obradi, ako se eli njihovo dugotrajno uvanje u zamrznutomstanju (na 1960C).

5. uvanje razreene sperme moe biti kratkotrajno (u tenom stanju) ili dugotrajno u duboko zamrznutom stanju. Bez obzira na vrstu ivotinja, primenjen razreiva, te nain i duinu uvanja, oplodna sposobnost spermatozoida je loija u spermi koja se uvala, u odnosu na onu koja se upotrebila neposredno posle uzimanja i razreivanja.

6. Tehnika inseminacije je jedan od primarnih faktora uspeha vetakog osemenjavanja, mereno brojem (%) postignute uspene koncepcije iveliinom rezultirajueg legla. Izvodi se specijalnim instrumentima (inseminacioni kateteri, vaginalni spekulumi, inseminacione boice i sl.). Izgled i oblik ovih instrumenata zavise od vrste ivotinje za koju su namenjeni. Vrhom inseminacionog katetera se ulazi u odreen deo enskog polnog trakta (cervix, telo materice, rog materice), gde se vri deponovanje doze sperme.

UZIMANJE SPERME OD PRIPLODNJAKA

Sperma (ejakulat = zapremina sperme, koju priplodnjak izbaci u jednom skoku, ejakulaciji) se moe uzeti od priplodnjaka sledeim metodama: (a)vetakom vaginom, (b) manuelnom fiksacijom penisa, (c) elektroejakulacijom i (d) masaom akcesornih polnih lezda.

Manuelna fiksacija penisa se koristi za uzimanje sperme od nerasta. Naime, pokazalo se da nerast slabije manifestuje refleks ejakulacije i daje loiji kvalitet ejakulata, ako se sperma uzima vetakom vaginom. To je zbog toga to: (a) nerast ima due trajanje ejakulacije i (b) to je, za stimulaciju refleksa ejakulacije, kod nerasta, primaran stimulus pritiska, koji nije mogue, u dovoljnoj meri, postii vetakom vaginom. Zbog toga se, posle erekcije, rukom u rukavici, vrsto hvata i stiska glans penisa, sve dok nerast ne zavri kompletnu ejakulaciju.

Vetaka vagina je specijalna naprava, kojom se imitiraju uslovi u vagini (temperatura, skliskost i pritisak). Ovi faktori su stimulusi za izazivanje refleksa ejakulacije kod mujaka. Temperatura (oko 39oC) se postie tako to se, u meuprostor izmeu tanke (unutranje) i debele (spoljanje) gume vetake vagine,sipa temperirana voda. Skliskost se postie tako to se unutranji zid vetake vagine namae nekom neutralom mau, dok se pritisak postie naponom vode u meuprostoru izmeu spoljanjeg i unutranjeg zida vagine. Na suprotnom kraju vetake vagine, od otvora kroz koji ulazi penis, fiksira se spermosabira. Vano je da cela vagina, a posebno spermosabira, bude zatien od uticaja spoljanje temperature i svetlosti. To se postie specijalnom navlakom. Ovom metodom se uzima sperma od bika, pastuva i ovna.

68

Elektroejakulacija je pomona metoda, koja se koristi kada priplodnjak nije u stanju da izvri ejakulaciju primenom drugih metoda dobijanja sperme. Ova metoda se ee koristi kod malih vrsta ivotinja. Princip metode se satoji u tome, to se, kroz jednu bipolarnu elektordu, uvedenu u rektum mujaka, proputa niskofrekventna struja (5, 10 ili 15V, maksimalne jaine 200mA). Ova struja stimulie centar za ejakulaciju, koji se nalazi u lumbosakralnom delu kimene modine. Pre poetka stimulacije, mujak se dobro fiksira, a u rektum se ubaci 50 ml (ovan) ili 200 ml (bik) 1% vodenog rastvora NaCl, radi postizanja bolje provodljivosti elektrine struje. Struja se proputa u trajanju 5-6 sekundi, nekoliko puta, sa pauzama isto tolikog trajanja. Ovako dobijeni ejakulati su dobrog kvaliteta, ali imaju neto vei volumen u poreenju sa onim ejakulatima koji se dobijaju vetakom vaginom. To je posledica pojaane sekrecije vezikularnih lezda, kao odgovor na elektrini nadraaj.

Masaa akcesornih polnih lezda i/ili ampula semevoda je, takoe, metod kojim se moe izazvati refleks ejakulacije, odnosno dobiti sperma od priplodnjaka. Izvodi se tako to se, rukom uvedenom u rektum, pronau i masiraju vezikularne lezde i/ili ampule semevoda. I ova metoda se koristi kod priplodnjaka koji nisu sposobni da izvre skok. Pogodna je zbog toga to nije potrebna nikakva oprema. Meutim, po pravilu, ovako dobijen ejakulat je znatno loijeg kvaliteta.

Prilikom uzimanja sperme, vano je znati da bik i ovan ejakuliraju vrlo kratko (za nekoliko sekundi posle skoka), da je njihov ejakulat male zapremine (bik 8 ml, ovan 1,5 ml) i velike koncentracije, kao i da ejakuliraju kompletan ejakulat. Ejakulacija kod pastuva traje due (0,5 do 1 minut), a komponente sperme se izbacuju u frakcijama. Zapremina ejakulata pastuva je oko 70 ml. Nerast ejakulira najdue (oko 5-6 minuta), ejakulat se izbacuje u 3 frakcije, a njegova zapremina je velika (120-500 ml), ali male koncentracije.

METODE UZIMANJE SPERME OD NERASTA

Metoda manuelne fiksacije penisa

49

Metodom vetake vagine

Shematski prikaz vetake vagine za nerasta1. Spoljanji valjak od tvrde gume; 2. Unutranji rukavac od meke gume; 3. Ventil za sipanje tople vode u meuprostor izmeu spoljanje i unutranje gume; 4. upljina vetake vagine, u koju nerast uvodi penis; 5. Prstenovi za stezanje krajeva mekog rukavca, preko otvora tvrdog valjka. 6. Spermosabira.

50

METODE UZIMANJA SPERME OD BIKA

Metodom vetake vagine

51

Vetaka vagina za bika

Spoljanji izgled (A) i popreni presek (B).Prstenati suner na ulazu u vetaku vaginu (1); Ventil za usipanje vode (2); Spoljanji cilindrini zid od tvrde gume (3); Meuprostor u koji se sipa temperirana voda (4); Unutranji cilindrini zid od meke gume (5); Gumena navlaka, kojom se spaja telo vetake vagine sa spermosabiraem (6); Spermosabira (7).

Metodom elektroejakulacije

Metodom manuelne masae vezikularnih lezda (A) i manuelne masae ampula semevoda (B).

52

KONTROLA KVALITETA SPERME

Pod kontrolom kvaliteta dobijene sperme (ejakulata) se, pre svega, podrazumeva odreivanje njegove fertilizacione sposobnosti. Osim toga, moe se odrediti njegov mikrobioloki kvalitet (prisustvo patogenih i drugih mikroorganizama), kao i neke fiziko-hemijske osobine. Fertilizacioni kapacitet ejakulata se, najee, odreuje indirektno, odreivanjem nekih osobina i parametara ejakulata, koji su manje ili vie povezani sa njegovom oplodnom sposobnou. Osnovni od ovih parametara su: volumen ejakulata, ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, % progresivno pokretnih, morfoloki abnormalnih i mrtvih, kao i spermatozoida sa proksimalnom citoplazmatinom kapi.

Kontrola kvaliteta sperme se moe odrediti sledeim metodama:

1. Makroskopskim,

2. Mikroskopskim i

3. Fiziko-hemijskim.

Kvalitet dobijenog (nativnog) ejakulata se odreuje neposredno posle uzimanja od priplodnjaka.

53

Makroskopska ocena sperme se vri bez upotrebe posebnih instrumenat i obuhvata: odreivanje volumena, boje, gustine i mirisa ejakulata, kao i eventualno prisustvo stranih (neprirodnih) materija u ejakulatu.

Volumen ejaklulata je specifian za svaku pojedinu vrstu ivotinja. On se meri u graduisanom spermosabirau. Kod domaih ivotinja se kree izmeu 0,1-1 ml do nekoliko stotina mililitara.

Boja ejakulata je specifina za svaku vrstu priplodnjaka. Boja normalanog (dobrog) ejakulata se kree izmeu sivkasto-mleno bele do ukasto-bele boje. To zavisi od vrste priplodnjaka, kao i od gustine ejakulata. Boja ejakulata moe biti znatno promenjena, u zavisnosti od vrsta stranih materija (krv, gnoj, neistoa, mikroorganizmi).

Gustina ejakulata se odreuje prema njegovoj boji, izgledu i stepenu vrtloenja. Gui ejakulati imaju vie mleno-belo do belo-ukastu boju, dok su rei ejakulati blei i prozirniji. Osim toga, intenzitet vrtlonog kretanja se poveava sa poveanjem gustine ejakulata (zbog veeg broja, koncentracije, progresivno pokretnih spermatozoida u jedinici zapremine ejakulata). Gustina ejakulata se izraava ocenom od 1 do 5 ili opisno (retka, gusta i td.).

Miris ejakulata je specifian za svaku vrstu ivotinja. Normalan ejakulat treba da ima specifian miris vrste kojoj pripada priplodnjak, od koga je dobijen.

54

Mikroskopska ocena sperme se izvodi pod svetlosnim mikroskopom i obuhvata odreivanje sledeih parametara i osobina spermatozoida: stepen (%) progresivne pokretljivosti, ukupan broj spermatozoida u ejakulatu, broj ivih, mrtvih i morfoloki promenjenih, prisustvo koagulacije spermatozoida, prisustvo stranih materija (krv, gnoj, epitelne elije, neistoa) i prisustvo mikroorganizama.

Progresivna pokretljivost se izraava procentom progresivno pokretnih, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju. Samo progresivno pokretni spermatozoidi su sposobni za oplodnju. Spermatozoidi se mogu kretati i cirkularno, talasasto, spiralno ili mogu biti nepokretni. Progresivna pokretljivost je osobina, koja je vrlo znaajno povezana sa oplodnom sposobnou spermatozoida.

Broj ivih spermatozoida se odreuje razliitim metodama brojanja: (1) metoda hemocitometrije i (2) metoda fotometrije. Prva metoda se ee koristi u praksi. Za ovu metodu je potreban svetlosni mikroskop, komorica za brojanje eritrocita (hemocitometer), melaner za eritrocite ili leukocite (zavisno od vrste ivotinja) i 3% vodeni rastvor NaCl. Postupak brojanja: Pod mikroskop se postavi hemocitometer i, na malom uveanju, se pronae mreica (komorica) za brojanje. Zatim se, u melaner uvue nativna sperma, do oznake 0,5, a 3% NaCl do oznake 11 (kod melanera za leukocite), ili do oznake 101 (kod melanera za eritrocite). Tako se, u melaneru, napravi razreenje sperme u odnosu 1:20 ili 1:200. Eritrocitarni melaner se koristi za gustu spermu (bik, ovan, jarac), a leukocitarni za retku spermu (nerast, pastuv). Palcem i srednjim prstom se zatvore krajevi melanera i promuka se nekoliko puta. Prva kap, iz kapilare melanera, se ispusti, a ostatak se ubaci izmeu pokrovne ploice i stakla hemocitometra. Objektiv mikroskopa se podesi na srednje uvelianje i broje se spermatozoidi, koji se nalaze u 5 srednjih (80 malih) kvadratia mreice.

Volumen Konc. spermatozoida Ukupan broj

ejakulata u 1ml ejakulata sptz. u ejakulatu

BIK 5 15 ml 800 2000 (x106) 4,5 30 (x109)

OVAN 0,5 2,0 ml 1,5 4,0 (x109) 0,75 8 (x109)

NERAST 100 500 ml 200-700 (x106) 20 350 (x109)

PASTUV 50 100 ml 30 800 (x106) 1,5 80 (x109)

PAS 1,7 21ml 100 300 (x106) 0,2 6,3 (x109)

MAAK 0,1 0,5ml 110 132 (x106) 11 66 (x106)

Fizioloke granine vrednosti osnovnih parametara ejakulata

Hemocitometar za brojanje spermatozoida

Mreica komorice za brojanje spermatozoida (levo).Spermatozoidi se broje u 5 velikih kvadrata mreice (desno).

55

BROJANJA SPERMATOZOIDA METODOM HEMOCITOMETRIJE

Melaner za eritrocite (A) i leukocite (B). Kapilara (1), bulbus (2) gumena cevica (3), plastina sisaljka za usta, crvena kod eritrocitarnog, a bela kod leukocitarnog melanera (4) i plastina perlica, za bolje meanje sperme i NaCl (5).

Metodom hemocitometrije se broje spermatozoidi u malom uzorku razreene sperme, a zatim se, izraunavanjem dobija broj spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosno u celokupnom ispitivanom ejakulatu.

Postupak:

1. U melaneru se izvri razreivanje i umrtvljavanje spermatozoida. Ako se ispituje sperma nerasta ili pastuva (koja je male koncentracije), koristi se melaner za leukocite. Nativna sperma se uvue u melaner do oznake 0,5. Zatim se uvlai 3% (hipertonini) rastvor NaCl, do oznake 11. Tako se dobije razreenje nativne sperme u odnosu 1:20. Hipertonini rastvor NaCl ubija spermatozoide, kako se ne bi kretali u komorici za brojanje. Ako se ispituje sperma preivara (bik, ovan, jarac), koristi se melaner za eritrocite, jer se, u njemu, prave vea razreenja (1:100 ako se sperma uvue do oznake 1, a rastvor NaCl do oznake 101 ili 1:200 - ako se sperma uvue do oznake 0,5, a rastvor NaCl do oznake 101).

2. Zatim se melaner promuka, posle ega se jedna kap izduva iz njegove kapilare (tu je ostao samo rastvor NaCl). Ostatak sadraja melanera se izduva ispod pokrovnog stakla, na komorici hemocitometra, postavljenoj ispod svetlosnog mikroskopa.

3. Pod malim uveanjem mikroskopa, pronae se cela mreica komorice za brojanje. Zatim se, pod srednjim uvelianjem, u vidno polje mikroskopa, postavi jedan veliki kvadrat mreice (oivien je sa dve tanke crte).

4. Kada se spermatozoidi potpuno umire (uginu), pristupa se njihovom brojanju u svakom od 5 odabranih (od ukupno 16) velikih kvadrata mreice. Obino se broje 4 kvadrata u uglovima i jedan u sredini, idui sleva na desno, u obliku slova Z. Broj izbrojanih spermatozoida u svakom kvadratu se zabelei. Time je postupak brojanja u hemocitometru zavren.

56

5. Pristupa se izraunavanju broja spermatozoida u 1ml nativne sperme, odnosnou celokupnom ispitivanom ejakulatu.

Primer izraunavanja:Ispitivan je ejakulat nerasta, zapremine 200ml (V = 200ml).U melaneru za leukocite je napravljeno razreenje nativne sperme, u odnosu 1 : 20 (r = 20).U 5 velikih kvadrata, ukupno je izbrojano 150 spermatozoida (n = 150).

Izraunavanje ukupnog broja (koncentracije - C) spermatozoida u 1ml nativne sperme, vri se po formuli:

C = n x r x 50.000C - ukupan broj spermatozoida u 1ml nativne sperme; n - broj spermatozoida izbrojan u 5 velikih kvadrata mreice hemocitometra; r - stepen razreenja, napravljen u melaneru; 50.000 - koeficijent komorice za brojanje.

Ako, u formuli, zamenimo vrednosti date u naem primeru, dobijamo:

C = 150 x 20 x 50.000 = 3.000 x 50.000 = 15.000.000 sptz./ml.

Znai: u 1ml ispitivanog nativnog ejakulata, ima 150 miliona (150 x 106) spermatozoida. Kako ispitivani ejakulat ima zapreminu 200ml, to u celom ejakulatu ima 150.000.000 x 200 = 30.000.000.000 (30 x 109) spermatozoida.

Pre poetka brojanja, u uzorku nativne sperme, zagrejane na + 37oC, pod svetlosnim mikroskopom, izvri se ocena broja progresivno pokretnih spermatozoida, izraena u %, od ukupnog broja spermatozoida u vidnom polju mikroskopa. Uzmimo, da je, u naem primeru, bilo 80% progresivno pokretnih spermatozoida.

57

Postupak bojenja preparata sperme po Blom-u:

1. Na istu staklenu predmetnu ploicu, zagrejanu na +37oC, stavi se vrlo mala kap nativne sperme (veliine iodine glave), pored nje duplo vea kap 5% vodenog rastvora nigrozina (crna histoloka boja) i troduplo vea kap 10% vodenog rastvora eozina (crvena histoloka boja).

2. Sada se, staklena pokrovna ljuspica postavi pod uglom od oko 45o na predmetnu ploicu, pored kapi sperme i boje, pa se napravi vrlo tanak razmaz po predmetnom staklu. Boja dobrog razmaza treba da je svetlo karmin-crvena.

3. Ovako napravljen preparat se, brzo, osui (prevlaenjem iznad plamena plamenika), ali da se ne zagaravi.

4. Takav trajni preparat se posmatra pod svetlosnim mikroskopom. Spermatozoidi, ije su glave obojene crveno, su bili mrtvi pre poetka pravljenja preparata, jer je elijska membrana mrtvog spermatozoida propustila u citoplazmu crvenu boju eozin. elijske membrane ivih spermatozoida su selektivno propustljive i ne proputaju velike molekule eozina. Zbog toga su njihove glave, pod mikroskopom, providne (nisu obojene crveno). Mogu se videti i spermatozoidi sa razliitim anomalijama grae glave i repa, kao i spermatozoidi sa citoplazmatinom kapi (to so spermatozoidi koji nisu zavrili sazrevanje u epididimisu). Ova citoplazmatina kap moe biti postavljena na repu spermatozoida, odmah iza glave (proksimalna citoplazmatina kap) ili dalje od glave (distalna citoplazmatina kap). Spermatozoidi sa proksimalnom citoplazmatinom kapi su nezreli i nisu sposobni da izvre fertilizaciju oocita.

Kod detaljnijih analiza kvaliteta ejakulata, moe se napraviti i trajni, obojen preparat, na kome se mogu videti morfoloki promenjeni, kao i mrtvi spermatozoidi. Za praksu je naj jednostavnije napraviti preparat bojenjem po Blom-u.

Oblici spermatozoida i nekih elija, koji se mogu nai u spermi:

Normalni spermatozoidi (A), razliiti oblici morfolokih deformacija spermatozoida (B) i razliite nenormalne elije u spermi (C): forme spermatozoida u obliku meduze (a), epitelne elije (b), okruglaste elije (c), eritrociti (d) i gnojne elije (e).

58

Fiziko-hemijske metode ocene kvaliteta sperme su: Temperaturni (hladan) ok, ocena pH vrednosti, odreivanje stepena glikolize i respiracije spermatozoida, obezbojavanje metilenskog plavog i test inkubacije.

Hladan ok je test preivljavanja spermatozoida u vodenom kupatilu, na 00C, tokom 10 minuta. Procentualni odnos ivih i mrtvih spermatozoida, posle temperaturnog oka, govori o stepenu vitalnosti spermatozoida.

pH vrednost sperme je specifina za svaku vrstu, ali se kree u granicama od 6,7 do 7,2 i veoma je bitna za odravanje oplodne sposobnosti spermatozoida.

Vrednost respiracije, tj. potronje kiseonika i njegove konverzije u CO2, tesno je povezana sa stepenom glikolize u spermatozoidima.

Obezbojavanje metilen-plavog. Potronja kiseonika, u spermi sa visokom koncentracijom vitalnih spermatozoida, znatno je via od one u spermi sa niom koncentracijom ovakvih spermatozoida. Brzina obezbojavanja metilen-plavog, kao posledica oksido-redukcijske reakcije, slui kao indirektan nain odreivanja stepena potronje kiseonika, odnosno stepena ivotne aktivnosti spermatozoida.

Inkubacija spermatozoida na temperaturi od 46oC, tokom 45 minuta, poveava sve biohemijske procese spermatozoida. Tako oni bre troe kiseonik i hranljive materije iz spermalne tenosti. Odreivanjem odnosa broja ivih spermatozoida pre i posle inkubacije, meri se vitalnost, odnosno oplodna sposobnost spermatozoida. Sperma je kvalitetnija, ako se, u njoj, posle inkubacije, nae vei broj ivih spermatozoida.

59

RAZREIVANJE EJAKULATA I FORMIRANJE INSEMINACIONIH DOZA SPERME

Stepen razreenja (odnos volumena ejakulata i volumena razreivaa) se odreuje na osnovu sledeih parametara: volumen ejakulata, koncentracija i ukupan broj spermatozoida, % progresivne pokretljivosti, broj mrtvih i morfoloki abnormalnih spermatozoida, tolerancija datog ejakulata na odreen (maksimalan) stepen razreenja i na maksimalnu duinu uvanja u tom razreenju, kao i od broja, odnosno volumena, inseminacionih doza, koji se eli napraviti od datog ejakulata. Posle razreenja, sperma se stavi u vodeno kupatilo, na +370C, u trajanju oko 30-60 minuta, da se stabilizuje.

U naem primeru, imali smo ejakulat nerasta, zapremine 200ml, u kome se nalazi ukupno 30 milijardi spermatozoida, od kojih je progresivno pokretno 80% ili 24 milijarde. Ovaj broj progresivno pokretnih spermatozoida, koristimo da izraunamo broj doza, koje moemo napraviti od datog ejakulata.

Jedna doza tene razreene sperme, za (klasino) intracervikalno osemenjavanje svinja, treba da sadri 2 do 5 milijardi progresivno pokretnih spermatozoida. Uzmimo primer da jedna doza sadri 2 milijarde progresivno pokretnih spermatozoida. Znai, od ejakulata iz naeg primera, moe da se napravi 12 inseminacionih doza (24 : 2 = 12).

Svaka doza treba da ima zapreminu od 100ml razreene sperme. To znai da e, u naem primeru, ukupna zapremina 12 doza iznositi 1.200ml. Kako ejakulat, iz naeg primera, ima zapreminu 200ml nativne sperme, u njega treba da dospemo 1.000ml razreivaa. Tako smo dobili zapreminu od 1.200ml razreene sperme, koju razdelimo u 12 boica, od kojih svaka ima zapreminu 100ml razreene sperme (to su inseminacione doze).

Svi postupci manipulacije sa spermom, od uzimanja do razreivanja, rade se na sobnoj temperaturi (200C ), a sve to dolazi u direktan kontakt sa spermom (spermosabira, predmetnice, pokrovne ploice, melaneri, menzure, boice za inseminacione doze i razreiva), kao i sama sperma, moraju biti zagrejani na +370C. Posle razreivanja, doze tene razreene sperme nerasta se, do inseminacije,uvaju na temperaturi +17oC. U zavisnosti od primenjenog razreivaa, doze tene razreene sperme nerasta se mogu uvati, na ovoj temperaturi, kratkotrajno (do 3 dana) ili dugotrajno (4 do 14 dana). Treba imati na umu da oplodna sposobnost spermatozoida pada sa duinom uvanja in vitro!

Inseminacione doze se mogu dugotrajno uvati (vie desetina godina) dubokim zamrzavanjem u pari tenog azota, na temperaturi -196oC. Ovom metodom dubok zamrzavanja, vrlo uspeno se uvaju inseminacione doze bika, ovna i jarca, a znatno manje uspeno doze nerasta i pastuva.

60

2 - 12Min. 50,05MAAK

6 - 30150 - 10000,5 8 PAS

10 20 300 500 12 20 PASTUV

5 - 302000 - 500080 - 100NERAST

10 40**150 350 0,02 0,05OVAN

15 500 20 30*0,25 0,50BIK

Broj doza po ejakulatu

Broj sptz. u dozi (x106)

Volumen doze (ml)

* Danas se prave doze sa 12 15 miliona spermatozoida. ** U sezoni se pravi znatno vei broj doza od jednog ejakulata, od onog izvan sezone parenja.

OPTIMALNO VREME I TEHNIKA VO

Optimalno vreme osemenjavanja. Maksimalna vrednost uspene koncepcije se postie osemenjavanjem izvedenim 10-12h pre ovulacije. Kako moment ovulacije, u praktinim uslovima, nije mogue precizno odrediti na direktan nain, to se ovaj moment odreuje u odnosu na poetak estrusa. Ustanovljeno je da su poetak manifestacije standing estrusa, kao i njegovo trajanje, znaajno povezani sa momentom ovulacije. Zbog toga se optimalno vreme inseminacije odreuje na osnovu to preciznije ustanovljenog poetka standing estrusa. Kako je trajanje estrusa razliito kod vrsta razliitih ivotinja, to je i optimalno vreme osemenjavanja razliito, ali je uvek oko 12h pre ovulacije.

Trajanje estrusa Moment ovulacije Optimalno vreme VO

KRAVA 18-24h oko 10-12h posle pri kraju standing estrusa

standing estrusa

OVCA 24-31h blie kraju estrusa u drugoj polovini estrusa

KRMAA 24-72h na poetku zadnje oko 0 do 36h posle

treine estrusa* poetka estrusa**

KOBILA 2-9 dana pri kraju estrusa u drugoj polovini estrusa

KUJA 3-21 dan unutar 5 dana posle u toku estrusa

posle poetka estrusa

MAKA pros. 7 dana provocirana ovulacija! u estrusu

* Bez obzira na trajanje estrusnog perioda; ** Interval zaluenje-estrus je obrnuto proporcionalan trajanju estrusa. Zbog toga, krmae sa kraim trajanjem IZE treba osemenjavati kasnije, a one sa duim trajanjem IZE ranije posle poetka standing estrusa.

61

Tehnika vetake inseminacije je, takoe, vrlo bitan faktor uspeha VO. Sastoji se u tome da se, pogodnim instrumentima i na pogodan nain, sperma unese u odreeni deo reproduktivnog traktaenke. Instrumenti i nain unoenja sperme su specifini za pojedine vrste ivotinja, to je uslovljeno (a) anatomskom graom i veliinom enskih polnih organa, (b) mestom u reproduktivnom traktu gde sperma treba da bude deponovana i (c) volumenom i drugim karakteristikama inseminacione doze.

Inseminacija krave se vri specijalnim tankim kateterom, duine oko 50 cm i debljine oko 5 mm, koji se, kroz vulvu i vaginu, uvodi u grli materice, gde se deponuje doza sperme. Kateter se moe uvesti u cervikalni kanal: (a) metodom transrektalne manuelne fiksacijecerviksa i (b) metodom vaginalnog spekuluma. Obe metode imaju svoje prednosti i mane.

Inseminacija ovce se vri na slian nain kao kod krave. Inseminacioni kateter je neto krai, prilagoen dimenzijama polnog trakta ovce. Kako je ovca mala, mnogo je lake uvesti kateter metodom vaginalnog spekuluma. Vano je da se kateter uvede bar 1-2 cm u cervikalni kanal, gde se deponuje doza sperme.

Inseminacija krmae traje due, jer se: (a) ubacuje znatno vea doza sperme (80-100 ml) i (b) ova doza se rasporeuje u oba roga uterusa, naizmeninim kontrakcijama rogova, u toku 3 do 6 minuta. Vrh katetera se uvodi do zadnje treine cervikalnog kanala, tako da se doza sperme deponuje u telo materice. Pri tome se ne koristi ni vaginalni spekulum, ni rektalna fiksacija cerviksa. Vano je da istiskivanje sperme traje onoliko dugo, koliko krmaa sama usisava spermu!

Inseminacija kobile se izvodi tako to se kateter, dugaak 50-70 cm i prenika 6 mm, uvede, kroz cervikalni kanal, do tela materice, gde se doza sperme, pomou brizgalice, deponuje.

Inseminacija kuje i make se vri uvoenjem katetar u vaginu, gde se deponuje doza sperme.

62

Uvoenje katetera u cerviks krave, rektalnom fiksacijom cerviksa Uvoenje katetera u cerviks krmae

Uvoenje katetera u cerviks ovce, primenom vaginalnog spekuluma

1. Kateter za inseminaciju

2. Vaginalni spekulum

3. Telo cerviksa

4. Kanal cerviksa

5. Telo materice

6. Rektum

7. Mokrana beika

8. Sinfiza pelvis

63

12. TRANSPLANTACIJA EMBRIONA

Transplantacija embriona (embriotransfer, ET) je biotehnologija, putem koje se embrioni jedne genetski superiorne plotkinje (davaoc, donator) presauju (transplantuju) u matericu druge enke (primaoc, recipijent), koja slui kao fizioloka (surogat) majka, odnosno zavrava gravidnost do kraja. Na ovaj nain, viekratnim uzimanjem veeg broja embriona od jednog donatora, mogue je dobiti znatno vei broj njegovih potomaka, nego to bi to bilo mogue prirodnim ritmom reprodukcijue.

Primenom ove tehnologije, mogue je:

Dobijanje znatno veeg broja potomaka od jedne, genetski superiorne, enke.

Dugotrajno uvanje embriona od odreene enke. Laki transport embriona na vee udaljenosti Izbegavanje rizika transporta, aklimatizacije i karantina genetski visokovrednih enki.

Spreavanje irenja zaraznih bolesti. Definisanje pola dobijenih potomaka. Ekonomska korist od prodaje embriona.

64

Tehnologija transplantacije embriona obuhvata sledee postupke:

Superovulacija donatora se izvodi tretmanom donatora veim dozama gonadotropina (PMSG i HCG ili FSH i LH).

Sinhronizacija estrusnih ciklusa donatora i recipijenata, primenom adekvatnih hormonskih tretmana (videti poglavlje o sinhronizacije estrusa).

Prikupljanje embriona od donatora se moe izvesti hirurkom metodom (putem laparotomije ili laparoskopije) ili nehirurkom metodom (ispiranjem embriona iz uterusa, primenom pogodnih katetera, koji se uvode u vrhove rogova uterusa kroz vaginu i cerviks).

Kontrola kvaliteta dobijenih embriona se vri u laboratoriji, pod svetlosnim ili faznokontrastnim mikroskopom. Koriste se samo embrioni koji su morfoloki potpuno ispravni.

Kratkotrajno ili dugotrajno uvanje embriona od momenta uzimanja do momenta transplantacije. Mogu se uvati u tenom medijumu, kratko (nekoliko sati) ili u posebnom medijumu, dugotrajno, dubokim zamrzavanjem.

Transplantacija embriona u recipijente se moe izvesti hirurukim ili nehirurukim putem.

Osnovni postupci embriotransfera goveda

65

13. SEXING ODREIVANJE POLA SPERMATOZOIDA I EMBRIONA

Proizvodnja mesa se znatno poveava, ako se tove samo muka grla, koja imaju znatno bolju konverziju hrane i vei dnevni prirast od enskih. Vei broj mukih grla se moe obezbediti kontrolom odnosa polova roenih jedinki, tako to se: (a) izvri razdvajanje spermatozoida na muke (sa Y-hromozomom) i enske (sa X-hromozomom), ili (b) razdvajanjem ranih embriona na enske i muke.

U poslednje vreme se koriste dosta precizne metode razdvajanja mukih i enskih spermatozoida: (a) metoda protone citometrije i (b) metoda specijalnog bojenja spermatozoida, fluorescentnom bojom, koja se vezuje za specifian segment na Y-hromozomu. Kada se takvi spermatozoidi osvetle ultravioletnom svetlou, muki daju ljubiastu boju, dok enski nisu obojeni i oni su svetli.

Odreivanje pola ranih embriona se vri specijalnom metodom replikacije specifinog segmenta DNK, na Y-hromozomu, ili imunolokom metodom, kojom se detektuje specifian antigen za muke elije (H-Y antigen). Ovaj antigen se nalazi na povrini blastomera mukih embriona, dok ga kod enskih plodova nema. Obe metode zahtevaju biopsiju ranog embriona (morule), radi uzimanja jednog broja blastomera za testiranje. Pol embriona se moe predodrediti i tako to se oocit mikroinjektira samo jednim spermatozoidom, poznatog pola (sa X ili Y-hromozomom).

Razdvajanje mukih i enskih spermatozoida protonom citometrijom

Oplodnja (fertilizacija) oocita se moe izvriti u jajovodu enke (in vivo) ili u laboratorijskim uslovima, izvan organizma enke (in vitro). Za in vitrofertilizaciju je potrebno obezbediti posebne uslove, kojima se, to je mogue bolje, imitiraju uslovi koji vladaju u jajovodu, prilikom in vivo fertilizacije. To su, pre svega, medijumi odreenog hemisjkog sastava, temperatura, pritisak, koncentracija CO2, zreli oociti (u stadijumu MfII), kapacitirini spermatozoidi i td. Mogu se koristiti oociti isprani iz jajovoda, posle superovulacije, ili tzv. folikularni oociti, dobijeni iz jajnika ivih ivotinja (hirurukim putem, laparotomojom ili laparoskopijom) ili iz jajnika uzetih neposredno posle rtvovanih ivotinja.

Folikularni oociti se dobijaju aspiracijom vidljivih antralnih folikula na povrini jajnika, ili totalnom resekcijom jajnika. U oba sluaja, veina dobijenih oocita (preko 95%) se nalaze u diplotenu prve mejotike deobe. Tako de se jedro ovih oocita nalazi u obliku germinativnog vezikula (GV-oociti). Ovakvi oociti nisu sposobni za oplodnju, nego ih treba podvrgnuti procesu dozrevanja (maturacije) in vitro (IVM). Posle oko 24h sata kultivacije oocita, u kultivacionom medijumu, veina oocita postaje zrela, jer dostie stadijum metafaze druge mejoze (MfII), i sposobni su za oplodnju. Pre kultivacije, folikularni oociti morajubiti denudirani, tj. moraju se odstraniti kumulusne elije sa zone pelucide, s obzirom na to da se ivi folikularni oociti dobijaju u obliku kumulus-oocitarnog kompleksa. Prisustvo kumulusnih elija inhibira nastavak deobe nukleusa!

14. FERTILIZACIJA IN VITRO

Oocit sa kumulusom (kumulus-oocitarni kompleks), neposredno posle aspiracije iz folikula (levo) i posle 24 sata kultivacije in vitro (zreo oocit, jer se, u perivitelusnom prostoru, nalazi prvo polarno telace) (desno).

66

15. POSTUPAK DOBIJANJA HIMERA

Pojam himere oznaava jedinku nastalu vetakom kombinacijom dvaili vie razliitih genoma (vrsta). Na primer, iz blastocista kobile, izvadi se unutranja elijska masa (iz koje bi se razvio plod konja), pa se, na to mesto, ubaci unutranja elijska masa zebre, izvaena iz blastocista zebre. Tako kobila odrebi zebru, a ne meleza izmeukonja i zebre. Himere nemaju praktian znaaj u stoarstvu, nego se koriste u naunim istraivanjima.

67