Upload
buianh
View
228
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL
1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN
KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT
EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Andy Kurniawan
NIM : 078114076
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2011
ii
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL
1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN
KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT
EKSTRAK ETANOLIK HERBA SELEDRI (Apium graveolens L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Andy Kurniawan
NIM : 078114076
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2011
iii
iv
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
I will lift up my eyes to the hills; From whence comes my help?
My help comes from The Lord, Who made heaven and earth.
He will not allow your foot to be moved;
He who keeps you will not slumber.
Prevailing prayer is almost an
impossibility where there is neglect of the study
of the Word of God (Reuben Archer Torrey)
(Psalms 121 : 1-3)
Karya ini Kupersembahkan untuk :
Mama, Papa, dan kakakku tercinta
Para sahabat yang kusayangi
Almamater
vi
PRAKATA
Puji syukur Penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus karena atas
segala berkat yang dianugerahkan-Nya, sehingga Penulis dapat menyelesaikan
skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-
2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil
Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.)”. Skripsi ini
disusun untuk memenuhi salah satu syarat yang diwajibkan untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Dalam membuat skripsi ini, Penulis menyadari telah mendapat banyak
bantuan, bimbingan, dukungan, dan semangat dari berbagai pihak, baik secara
langsung maupun tidak langsung. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan
hati Penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada :
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
2. Bapak Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah
banyak memberikan bimbingan dan pengarahan kepada Penulis mulai
saat penyusunan proposal penelitian hingga penyelesaian skripsi ini.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi
ini.
4. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
vii
5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., dan Ibu Phebe Hendra, M.Si.,
Ph.D., Apt., yang telah berkenan meluangkan waktu untuk berdiskusi dan
memberikan masukan kepada Penulis.
6. Segenap staf pengajar, laboran, dan karyawan Fakultas Farmasi, terima
kasih atas bantuan, dukungan, dan motivasi yang diberikan kepada
Penulis serta kerja sama yang terjalin baik selama ini.
7. Rekan seperjuanganku, Damianus Listyanta Edhi Sambada dan Yosafat
Rubbyanto Widodo yang telah berjuang bersama dengan Penulis
melakukan penelitian di laboratorium menyelesaikan skripsi ini, terima
kasih untuk kebersamaan yang indah selama ini.
8. Sahabat-sahabatku, Fandri Astika Maranantan, Ardi Prasetyo, Petrus
Wicaksono, serta Anggun Aji Mukti, terima kasih atas dukungan,
semangat, dan kebersamaan kita selama ini serta suka duka yang kita
lewati bersama.
9. Teman-teman kelompok praktikum B1 FST 2007 yang dikenal dengan
“Team Fun”, terima kasih untuk kebersamaan dan keakraban kita saat
praktikum selama ini.
10. Rekan-rekan mahasiswa Fakultas Farmasi angkatan 2007 terutama kelas
FST, terima kasih untuk kebersamaan dan canda tawa yang telah kita
rasakan bersama selama ini.
11. Teman-teman KKN angkatan XL pedukuhan Destan, terima kasih untuk
kebersamaan kita dan kerjasama yang baik, walaupun hanya dalam
waktu yang singkat.
viii
12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu yang telah
memberikan dukungan dan bantuan sehingga skripsi ini dapat
terselesaikan.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih terdapat
banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati Penulis
memohon maaf apabila terdapat hal-hal yang kurang berkenan serta Penulis
mengharapkan saran dan kritik yang membangun.
Akhir kata, Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi pihak-
pihak yang membutuhkan dan dapat memberikan sumbangan bagi kemajuan ilmu
pengetahuan terutama di bidang kefarmasian.
Penulis
ix
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. v
PRAKATA .................................................................................................. vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... ix
DAFTAR ISI ............................................................................................... x
DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xvi
INTISARI .................................................................................................... xvii
ABSTRACT .................................................................................................. xviii
BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1
A. Latar Belakang ................................................................................ 1
B. Perumusan Masalah ......................................................................... 4
C. Keaslian Penelitian .......................................................................... 4
D. Manfaat ............................................................................................ 5
E. Tujuan .............................................................................................. 6
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 7
A. Seledri .............................................................................................. 7
B. Senyawa Fenolik ............................................................................. 9
xi
C. Antioksidan ..................................................................................... 10
D. Metode DPPH ................................................................................. 15
E. Metode Folin-Ciocalteu ................................................................... 16
F. Ekstraksi .......................................................................................... 17
G. Kesahihan Metode Analisis ............................................................. 19
H. Kesalahan dalam Metode Analisis .................................................. 22
I. Landasan Teori ................................................................................ 23
J. Hipotesis .......................................................................................... 24
BAB III. METODE PENELITIAN ............................................................ 25
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 25
B. Variabel ........................................................................................... 25
C. Definisi Operasional ........................................................................ 25
D. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................... 26
E. Tatacara Penelitian .......................................................................... 27
1. Determinasi tanaman .................................................................. 27
2. Pengumpulan bahan .................................................................... 27
3. Preparasi sampel ......................................................................... 27
4. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji ........................ 28
5. Uji pendahuluan .......................................................................... 29
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................. 30
7. Uji aktivitas antioksidan ............................................................. 31
8. Optimasi penetapan kandungan fenolik total ............................. 32
9. Penetapan kandungan fenolik total ............................................. 32
xii
F. Analisis Hasil ..................................................................................... 33
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................... 36
A. Hasil Determinasi Tanaman .............................................................. 36
B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................................. 36
C. Hasil Pembuatan Ekstrak ................................................................... 37
D. Hasil Uji Pendahuluan ....................................................................... 40
E. Optimasi Metode ............................................................................... 42
1. Penentuan OT ................................................................................ 42
2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ................... 44
F. Validasi Metode Analisis ................................................................... 47
1. Uji aktivitas antioksidan ............................................................... 47
2. Penetapan kandungan fenolik total ............................................... 54
G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ................... 57
H. Hasil Uji Penetapan Kandungan Fenolik Total ................................. 63
I. Hasil Analisis Statistik ....................................................................... 67
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 69
A. Kesimpulan ........................................................................................ 69
B. Saran .................................................................................................. 69
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 70
LAMPIRAN ................................................................................................ 75
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 87
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Rentang akurasi yang masih dapat diterima .................................. 20
Tabel II. Rentang KV yang masih dapat diterima....................................... 21
Tabel III. Data recovery larutan pembanding rutin ..................................... 49
Tabel IV. Data recovery larutan uji............................................................. 50
Tabel V. Data Coefficient of Variation (CV) larutan pembanding rutin..... 51
Tabel VI. Data Coefficient of Variation (CV) larutan uji ........................... 52
Tabel VII. Data recovery asam galat........................................................... 55
Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV) larutan asam galat ............ 56
Tabel IX. Data aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH .............. 59
Tabel X. Data aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik
herba seledri dengan metode DPPH ............................................................ 61
Tabel XI. Tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan metode
penangkapan radikal DPPH ........................................................................ 63
Tabel XII. Konsentrasi asam galat dan absorbansinya setelah
ditambah pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang
diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm.............. 64
Tabel XIII. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik
herba seledri yang dinyatakan sebagai massa ekivalen
asam galat (mg GAE/g) ............................................................................... 67
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ............... 14
Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif ...................... 15
Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan ............................... 16
Gambar 4. Skema jalannya penelitian ......................................................... 35
Gambar 5. Uji pendahuluan senyawa fenolik ............................................. 41
Gambar 6. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ...................................... 42
Gambar 7. Kurva penentuan Operating Time (OT) uji aktivitas
antioksidan .................................................................................................. 43
Gambar 8. Kurva penentuan Operating Time (OT)
penetapan kandungan fenolik total ............................................................. 44
Gambar 9. Scanning panjang gelombang maksimum larutan DPPH ......... 45
Gambar 10. Scanning panjang gelombang maksimum
asam galat + pereaksi Folin-Ciocalteu + natrium karbonat ........................ 46
Gambar 11. Kurva regresi linier antara konsentrasi rutin
dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH .................. 48
Gambar 12. Kurva regresi linier antara konsentrasi fraksi
dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH .................. 48
Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat
dengan absorbansinya setelah ditambahkan pereaksi ................................. 54
Gambar 14. Reaksi terbentuknya warna kuning oleh adanya antioksidan .. 58
Gambar 15. Struktur rutin .......................................................................... 59
xv
Gambar 16. Struktur asam galat .................................................................. 63
Gambar 17. Oksidasi fenol dalam suasana basa ......................................... 65
Gambar 18. Reaksi fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu ........................ 66
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman ................................... 75
Lampiran 2. Foto tanaman seledri ............................................................... 76
Lampiran 3. Foto percobaan ....................................................................... 77
Lampiran 4. Perhitungan rendemen ............................................................ 78
Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stok DPPH ........................... 78
Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan stok rutin .............................. 79
Lampiran 7. Spektra pelarut metanol .......................................................... 79
Lampiran 8. Penentuan OT rutin ................................................................. 80
Lampiran 9. Spektra larutan pembanding rutin ........................................... 80
Lampiran 10. Perhitungan pembuatan stok larutan uji ............................... 81
Lampiran 11. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanolik
herba seledri ................................................................................................ 81
Lampiran 12. Spektra larutan uji ................................................................. 82
Lampiran 13. Perhitungan pembuatan stok asam galat ............................... 83
Lampiran 14. Spektra asam galat ................................................................ 83
Lampiran 15. Penimbangan larutan uji untuk penetapan kandungan
fenolik total ................................................................................................. 84
Lampiran 16. Penentuan OT untuk penetapan kandungan fenolik total ..... 84
Lampiran 17. Perhitungan kandungan fenolik total .................................... 84
Lampiran 18. Hasil uji statistik menggunakan program
PASW Statistics 18 ...................................................................................... 86
xvii
INTISARI
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan sumber antioksidan alami yang biasanya terdapat dalam tumbuhan. Herba seledri merupakan salah satu tumbuhan yang berkhasiat dalam pengobatan dan memiliki kandungan flavonoid serta senyawa golongan fenol. Hal tersebut mendorong untuk melakukan pengujian aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total dalam herba seledri. Pengujian aktivitas antioksidan herba seledri (Apium graveolens L.) dilakukan secara kualitatif (uji pendahuluan) maupun kuantitatif menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Prinsip metode ini adalah penurunan intensitas warna atau absorbansi larutan DPPH yang sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan. Hasilnya dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50) yang menunjukkan konsentrasi suatu senyawa antioksidan yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH. Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu menghasilkan larutan berwarna biru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dengan nilai IC50 sebesar 316,294 µg/mL. Kandungan fenolik totalnya sebesar 3,27 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Kata kunci : antioksidan, Apium graveolens L., fraksi etil asetat, DPPH, fenolik
total
xviii
ABSTRACT
Antioxidants are compounds that can counteract the bad effects of free radicals in the body. Phenolic and flavonoid compounds is a source of natural antioxidants that are usually present in plants. Celery herb is one efficacious plant in the treatment and have the content of flavonoids and phenolic group compound. It is encouraging to test the antioxidant activity and total phenolic content in celery herb. Testing the antioxidant activity of celery herb (Apium graveolens L.) was qualitative (preliminary test) and quantitatively using 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical. The principle of this method is the reduction of color intensity or absorbance of DPPH solution that proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds. The result is expressed with a value of Inhibition Concentration 50 (IC50) which indicates the concentration of an antioxidant compound that produces the arrest of 50% DPPH radical. The content of total phenolic determined by the Folin-Ciocalteu method. The principle of this method is the oxidation of phenolic compounds under alkaline conditions by the Folin-Ciocalteu reagent produces a blue solution. The results showed that the ethyl acetate fraction ethanolic extract of celery herb has a weak antioxidant activity with IC50 value of 316,294 µg/mL. Total phenolic content is 3,27 mg gallic acid equivalent per g ethyl acetate fraction.
Keywords : antioxidant, Apium graveolens L., ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menetralkan efek
buruk dari radikal bebas di dalam tubuh. Berdasarkan sumbernya, terdapat dua
macam antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik (buatan)
(Dalimartha dan Sudibyo, 1999). Suatu antioksidan umumnya memiliki kelebihan
pasangan elektron bebas sehingga dapat menyumbangkan elektronnya kepada
suatu radikal dan dapat menstabilkan radikal tersebut sehingga tidak lagi reaktif.
Saat ini antioksidan alami lebih diminati dibandingkan antioksidan
sintetik karena dianggap lebih aman. Antioksidan sintetik seperti BHT (butylated
hidroxy toluene) dan BHA (butylated hidroxy anisole) telah diragukan
keamanannya karena memiliki efek samping yang besar dan dapat menyebabkan
kerusakan hati. Hal ini menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang
sangat dibutuhkan oleh masyarakat saat ini (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005).
Antioksidan alami mampu melindungi tubuh dari kerusakan akibat
oksidasi oleh reactive oxygen species (ROS), menghambat terjadinya penyakit
degeneratif serta menghambat terjadinya peroksidasi lipid pada makanan
(Sunarni, 2005).
Radikal bebas adalah suatu spesies yang sangat reaktif karena terdapat
elektron yang tidak berpasangan pada bagian terluarnya. Hal ini mengakibatkan
tidak stabilnya atom atau molekul tersebut. Untuk menjadi stabil, radikal bebas
2
memerlukan elektron yang berasal dari elektron molekul disekitarnya, sehingga
terjadi perpindahan elektron dari molekul donor ke molekul radikal bebas untuk
menjadikan molekul radikal bebas tersebut stabil. Beberapa contoh radikal bebas
antara lain: radikal hidroksil (OH·), nitrit oksida (NO·), hidrogen peroksida
(H2O2), dan sebagainya (Windono, Soediman, Yudawati, Ermawati, Srielita, dan
Erowati, 2001).
Sebenarnya dalam tubuh sendiri secara alami terdapat antioksidan
endogen seperti enzim SOD (superoxyde dismutase), glutation, dan katalase yang
dapat menetralkan radikal bebas yang masuk, akan tetapi jumlahnya terbatas
sehingga membutuhkan suplai antioksidan dari luar tubuh untuk mengatasi
paparan radikal bebas dalam jumlah yang berlebih.
Antioksidan alami dapat diperoleh dari buah-buahan maupun sayuran.
Salah satu sumber antioksidan alami dapat berasal dari herba seledri (Apium
graveolens L.). Pada seledri terdapat kandungan flavonoid seperti graveobiosid A
dan B serta senyawa golongan fenol yang diketahui memiliki aktivitas
antioksidan. Selain itu pada herba seledri terdapat pula glikosida apiin (glikosida
flavon), isokuersetin, dan umbelliferon (Sudarsono dkk., 1996).
Seledri memiliki banyak manfaat untuk kesehatan, di antaranya sebagai
antihipertensi, penambah nafsu makan, peluruh air seni, mengurangi rasa sakit
pada rematik dan gout. Seledri juga sering ditambahkan sebagai sayur dan lalap
untuk penyedap masakan (Sudarsono dkk., 1996).
Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid
dan dianjurkan untuk proses pemurnian (Robinson, 1995). Dalam penelitian
3
tentang antioksidan herba ketul (Bidens pilosa L.), didapatkan fraksi etil asetat
memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi dibandingkan rutin, fraksi
kloroform, dan ekstrak metanoliknya (Nusarini, 2007; Wiyatsih, 2007)
Metode yang digunakan untuk pengujian antioksidan pada penelitian ini
adalah metode DPPH (1,1 difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan metode ini,
kemampuan antioksidan suatu senyawa dinyatakan oleh nilai IC50. Metode DPPH
memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.
DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna
violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi
berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding
dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).
Penentuan kandungan fenolik total dalam herba seledri pada penelitian
ini menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah reaksi
oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu
menghasilkan kompleks berwarna biru yang memberikan serapan kuat pada
panjang gelombang 750 nm. Intensitas warna biru yang terbentuk meningkat
sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada dalam sampel. Kandungan
fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat tiap g sampel.
4
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan penelitian dapat
dirumuskan sebagai berikut.
1. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan
IC50?
2. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?
C. Keaslian Penelitian
Beberapa penelitian mengenai aktivitas antioksidan yang telah dilakukan
dengan menggunakan bahan tanaman seledri antara lain :
1. Penelitian mengenai aktivitas antioksidan ekstrak air beberapa tanaman.
Bahan yang digunakan adalah 25 macam tanaman, termasuk daun seledri
yang dikeringkan kemudian diblender dan diekstraksi menggunakan air
deionisasi. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode DPPH
serta Ferric reducing antioxidant potential assay. Selain itu dilakukan pula
penetapan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Wong,
Leong, dan Koh, 2005).
2. Penelitian mengenai perbedaan metode untuk mengontrol dan membandingkan
aktivitas antioksidan sayur-sayuran.
Bahan yang digunakan adalah bermacam sayuran, termasuk daun seledri
yang diblender dan diekstraksi menggunakan pelarut aseton 80% dalam asam
5
format 0,2%. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan adalah metode
TRAP, ORAC, dan HORAC. Dilakukan pula penetapan kandungan polifenol total
menggunakan metode Folin-Ciocalteu (Ciz et al., 2010).
3. Penelitian mengenai peningkatan aktivitas antioksidan setelah perlukaan,
tergantung jenis jaringan pada buah dan sayuran.
Bahan yang digunakan adalah bermacam buah dan sayur, termasuk
seledri yang dilukai menggunakan pisau dan disimpan pada suhu 15°C untuk
meningkatkan respon jaringan. Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan
adalah metode DPPH, sedangkan kandungan fenolik total ditetapkan dengan
metode Folin-Ciocalteu (Reyes, Villarreal, dan Cisneros-Zevallos, 2007).
Uji aktivitas antioksidan yang dilakukan pada penelitian ini berbeda
dengan penelitian sebelumnya. Perbedaannya terletak pada sampel yang
digunakan, yaitu fraksi etil asetat ekstrak etanol herba seledri. Berdasarkan
pengamatan penulis, uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH serta
penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri
belum pernah dilakukan.
D. Manfaat
1. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan dan bukti
ilmiah mengenai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.
6
2. Manfaat metodologis
Penelitian ini dapat dijadikan acuan metode uji aktivitas antioksidan
menggunakan radikal bebas DPPH dan penentuan kandungan fenolik total pada
suatu bahan tumbuhan.
3. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas
antioksidan herba seledri, sehingga bisa dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif
pemeliharaan kesehatan manusia.
E. Tujuan
1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan serta
menetapkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik
herba seledri dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan
dengan IC50.
b. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Seledri
1. Keterangan botani
Seledri (Apium graveolens L.) termasuk dalam familia Apiaceae.
2. Nama tumbuhan
Nama latin: Apium graveolens Linn. (Anonim, 2005).
Nama Indonesia: seledri (Anonim, 2005).
Nama daerah: Jawa: sledri. Sunda: saledri (Dalimartha, 2000).
Common name: Inggris: celery. Perancis: celeri. Italia: seleri. Jerman: selinon;
parsley (Anonim, 2005).
3. Morfologi tanaman
Batang : Tidak berkayu, beralur, beruas, bercabang, tegak, hijau pucat.
Daun : Tipis majemuk, daun muda melebar atau meluas dari dasar,
hijau mengkilat, segmen dengan hijau pucat, tangkai di semua
atau kebayakan daun merupakan sarung.
Daun bunga : Putih kehijauan atau putih kekuningan ½ - ¾ mm panjangnya.
Bunga : Tunggal, dengan tangkai yang jelas, sisi kelopak yang
tersembunyi, daun bunga putih kehijauan atau merah jambu
pucat dengan ujung yang bengkok. Bunga betina majemuk yang
jelas, tidak bertangkai atau bertangkai pendek, sering
8
mempunyai daun berhadapan atau berbatasan dengan tirai
bunga.
Tirai bunga : Tidak bertangkai atau dengan tangkai bunga tidak lebih dari 2
cm panjangnya.
Buah : Panjangnya sekitar 3 mm, batang angular, berlekuk, sangat
aromatik.
Akar : Tebal (Iqbal dan Endang, 2008).
4. Kandungan kimia seledri
Seluruh herba seledri mengandung glikosida apiin (glikosida flavon),
isoquersetin, dan umbeliferon. Juga mengandung manitol, inositol, asparagina,
glutamina, choline, linamarose, pro vitamin A, vitamin C, dan B. Kandungan
asam-asam dalam minyak atsiri pada biji antara lain asam-asam lemak
terutama palmitat, oleat, linoleat, dan petroselinat. Senyawa kumarin lain
ditemukan dalam biji, yaitu bergapten, seselin, isomperatorin, osthenol, dan
isopimpinelin (Sudarsono dkk., 1996).
5. Kegunaan seledri
Secara tradisional tanaman seledri digunakan sebagai pemacu enzim
pencernaan atau sebagai penambah nafsu makan, peluruh air seni, dan penurun
tekanan darah. Di samping itu digunakan pula untuk memperlancar keluarnya
air seni, mengurangi rasa sakit pada rematik dan gout. Selebihnya daun dan
batang seledri digunakan sebagai sayur dan lalap untuk penyedap masakan
(Sudarsono dkk., 1996).
9
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik adalah substansi organik dimana terdiri dari senyawa
aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen hidroksil (OH). Senyawa
induk adalah fenol tetapi kebanyakan senyawa fenolik merupakan polifenol.
Sumber senyawa fenolik sangat sedikit pada sumber hewani akan tetapi sangat
melimpah pada sumber tumbuhan. Diantara 8000 senyawa polifenol tumbuhan
yang diketahui, golongan yang terbanyak adalah flavonoid (Mann, Davidson,
Hobbs, Banthorpe, dan Harborne, 1994).
Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman
digunakan sehingga menjadi senyawa bioaktif dari suatu tumbuhan. Oleh karena
itu, pada perkembangan penelitian akhir-akhir ini, perhatian peneliti telah tertuju
pada identifikasi tumbuhan yang memiliki aktivitas antioksidan yang dapat
digunakan untuk konsumsi manusia sehari-hari (Ebrahimzadeh, Pourmorad,
Hafezi, 2007).
Aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik didapatkan dengan cara
mereduksi radikal untuk tidak terjadinya reaksi samping yang merugikan. Untuk
transfer atom hidrogen, senyawa fenolik mampu mengikat radikal bebas dengan
mendonasikan atom hidrogen dalam transfer elektron tunggal dari senyawa
fenolik kepada elektron tunggal dari radikal bebas (Marxen et al., 2007).
Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara
kolorimetri dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya
reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat oleh
adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki
10
serapan kuat pada panjang gelombang 750 nm. Intensitas serapan pada panjang
gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel
(Waterhouse, 2002).
C. Antioksidan
Definisi antioksidan secara umum adalah senyawa yang melawan
oksidasi atau menghambat reaksi yang dipicu oleh oksigen atau peroksida.
Kebanyakan senyawa ini (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam
berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk
menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet
untuk menunda oksidasi) (Huang, Ou, dan Prior, 2005).
Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila
dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat
menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994).
Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat
dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim
yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoxyde dismutase (SOD);
glutation peroksidase, katalase, tioredoksin reduktase dan peroksiredoksin
(Masella, Di Benedeto, Vari, Filesi, dan Giovannini, 2005). Secara non-enzimatik,
senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai :
a. Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E.
b. Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA.
11
c. Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen.
d. Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation
peroksidase (Huang et al., 2005).
Aktivitas senyawa polifenol (flavonoid) sebagai antioksidan meliputi tiga
mekanisme sebagai berikut.
a. Aktivitas penangkapan radikal seperti reactive oxygen species (ROS) ataupun
radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid seperti R·, RO·, dan ROO·
dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen.
b. Mencegah spesies senyawa reaktif produksi katalisis transisi metal seperti
reaksi melalui khelasi metal.
c. Interaksi dengan antioksidan lainnya, seperti lokalisasi dan penggabungan
dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000).
Antioksidan dan peredam radikal bebas biologis dapat digolongkan
sebagai berikut (Grieb, 1992 dan Himawati, 2001).
a. Berdasarkan sasaran
1) Preventative antioxidant, yaitu antioksidan yang dapat mencegah
terbentuknya oksidan dan mencegah tertimbunnya oksidan. Misalnya :
superoksida dismutase (SOD), katalase, bermacam-macam enzim
peroksidase (misalnya glutation peroksidase), dan senyawa yang
mengandung gugusan sulfidril (glutation, sistein, dan kaptopril).
2) Chain-breaking antioxidant, mekanismenya sebagai berikut.
L· + AH → LH + A·
LO· + AH → LOH + A·
12
LOO· + AH → LOOH + A·
Antioksidan (AH) akan mencegah dua tahapan meliputi tahapan inisiasi
terjadi ketika radikal beraksi dengan Lipid (L) dan proses propagasi
(beraksi dengan alkoksi (LO·) ataupun peroksil (LOO·) (Madhavi et al.,
1996).
b. Berdasarkan mekanisme kerja
1) Antioksidan enzimatik, misalnya : katalase (CAT), superoxyde dismutase
(SOD), dan glutation peroksidase (GSH-Px).
2) Antioksidan non-enzimatik, misalnya: vitamin E (α-tokoferol), vitamin C
(asam askorbat), dan β-karoten.
c. Berdasarkan sifat-sifat fisiko-kimia
1) Antioksidan hidrofilik, yaitu antioksidan yang bekerja dalam sitosol dan
cairan ekstrasel, misalnya: vitamin C, asam urat, glutation, sistein,
kreatinin.
2) Antioksidan lipofilik, yaitu antioksidan yang bekerja pada membran sel
(terlarut dalam lipid membran), misalnya: vitamin E, β-karoten, ubikuinon,
bilirubin, protein pengikat logam (transferin, laktoferin, seruloplasmin, dan
albumin).
Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara
kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu
senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode
kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini
dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun.
13
Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat
kelompok, yaitu :
a. senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium
permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat);
b. senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa diazo,
pereaksi diazo, magnesium sulfat, anisaldehid, vanillin dan pereaksi Gibbs
yang membentuk indofenol (akan membentuk garam berwarna dalam kondisi
basa);
c. radikal bebas stabil yang menerima radikal hydrogen dari antioksidan (1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil);
d. senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna (paladium
klorida) (Davidek, 1997).
Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri.
Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan adalah
sebagai berikut.
1. Pengujian penangkapan radikal (radical scavenging test)
Uji ini dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam
pelarut organik polar seperti metanol atau etanol dalam suhu kamar. Radikal
sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal DPPH.
DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm.
Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang
14
kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah
elektron yang diambil.
Gambar 1. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan
2. Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat tiosianat
Prinsip : pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang terbentuk
dari reaksi ion feri dengan amonium tiosianat. Ion feri terbentuk dari oksidasi
ion fero oleh peroksida yang berasal dari oksidasi asam linoleat. Kompleks
feritiosianat yang berwarna merah diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah yang
terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak peroksida yang
terbentuk. Dengan adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan
intensitas warna yang terbentuk semakin rendah.
3. Pengujian dengan asam tiobarbiturat,
Prinsip uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam tiobarbiturat
menghasilkan kromogen merah muda yang dapat diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid terbentuk dari asam lemak bebas
tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap. Adanya
senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat terbentuknya
malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh.
15
4. Pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat
Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna β-
karoten. Karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan
oksigen yang lebih stabil. Energi dari oksigen tersebut dipindahkan ke senyawa
karotenoid. Energi tersebut dilepaskan melalui interaksi rotasional dan
vibrasional antara karotenoid dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid
ke ground state.
Gambar 2. Reaksi antara karotenoid dengan oksigen reaktif
D. Metode DPPH
Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian
antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)
(Windono et al., 2001).
DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah)
serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen,
dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam
suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).
Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan
serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh
keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara
stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa
16
antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning
(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).
Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk
menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dinis,
et al., 1994). DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk
pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva,
van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002).
Gambar 3. Reaksi Radikal DPPH dengan antioksidan (Windono et al., 2001).
E. Metode Folin-Ciocalteu
Metode Folin-Ciocalteu merupakan oksidasi atau reduksi kolorimetrik
untuk mengukur semua senyawa fenolik. Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan
larutan kompleks ion polimerik yang dibentuk dari asam fosfomolibdat dan asam
heteropolifosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium
molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromin (Folin dan
Ciocalteu, 1944). Pada kenyataannya reagen ini mengandung rangkaian polimerik
17
yang memiliki bentukan umum dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO4)3- yang
dikelilingi oleh beberapa unit oktahedral asam-oksi molibdenum. Struktur
tungsten dapat dengan bebas bersubstitusi dengan molibdenum (Singleton dan
Rossi, 1965).
Menurut Waterman dan Mole (cit. Khadambi, 2007), dasar metode Folin-
Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini mengoksidasi
fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks
molibdenum-tungsten (Mo-W). Fenolat hanya terdapat pada larutan basa, tetapi
pereaksi Folin-Ciocalteu dan produknya tidak stabil pada kondisi basa. Selama
reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin-
Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru
dengan struktur yang belum diketahui dan dapat dideteksi dengan
spektrofotometer (Jansoon, 2005). Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat
setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar
konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan
mereduksi asam heteropoli sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat
(Box, 1983; Singleton dan Rossi, 1965).
F. Ekstraksi
Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa
zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari
sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan
18
bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari
semakin luas (Harborne, 1987).
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi
zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
selanjutnya pelarut diuapkan sampai semua atau hampir semua pelarut menguap
(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).
Dalam memilih cairan penyari, seseorang harus mempertimbangkan
banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini.
(1) Murah dan mudah diperoleh,
(2) stabil secara fisika dan kimia,
(3) bereaksi netral,
(4) tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,
(5) selektif,
(6) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan
(7) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku
(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).
Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan
zat dari bahan yang akan disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi :
infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan
penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
19
mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan
pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang
sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam
sel. Dapat dilakukan modifikasi terhadap teknik maserasi, misalnya teknik
remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk
simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan
diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986).
G. Kesahihan Metode Analisis
Kesahihan metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang
digunakan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut dapat memberikan
hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai.
Metode analisis instrumen merupakan metode yang terpilih dan memadai untuk
mengantisipasi persoalan analisis yaitu sangat kecilnya kadar senyawa yang
dianalisis dan kompleksnya matriks sampel yang dianalisis (Mulja dan Suharman,
1995). Untuk itu diperlukan suatu pedoman mengenai kesahihan metode analisis
yang didukung oleh parameter-parameter di bawah ini.
1. Akurasi
Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat
kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan
dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
20
Kriteria kecermatan sangat bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks
sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) (Harmita, 2004).
Tabel I. Rentang akurasi yang masih dapat diterima Analit pada Matrik
Sampel (%) Rata-rata yang Diperoleh (%)
100 98-102 >10 98-102 >1 97-103
>0,1 95-105 0,01 90-107 0,001 90-107
0,000.1 (1 ppm) 80-110 0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115 0,000.000.1 (1 ppb) 40-120
(Harmita, 2004). 2. Presisi
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil
uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika
prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari
campuran yang homogen (Harmita, 2004).
Presisi dari suatu metode analisa meliputi repeatabilitas, presisi antara,
dan reproduksibilitas. Repeatabilitas menyatakan presisi metode analisis yang
dilakukan dalam kondisi yang sama dalam interval waktu yang singkat. Dengan
kata lain uji repeatabilitas dilakukan untuk mengetahui variabilitas data yang
dihasilkan pada dua pengujian berurutan pada kondisi yang sama. Perbedaan
absolut kedua data hasil uji diharapkan berada pada kisaran tingkat kepercayaan
(konfidensi) 95%. Presisi antara menyatakan variasi dalam yang sama baik hari,
analit, ataupun alat yang berbeda (Anonim, 2008).
21
Reproduksibilitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui
variabilitas yang dihasilkan pada dua pengujian contoh identik pada kondisi
berbeda. Perbedaan absolut dari masing-masing data hasil uji diharapkan berada
dalam kisaran tingkat kepercayaan (konfidensi) 95% (Anonim, 2008).
Tabel II. Rentang KV yang masih dapat diterima Analit pada Matrik Sampel (%) KV (%)
>1 2,5 0,001 5
0,000.1 (1 ppm) 16 0,000.000.1 (1 ppb) 32
(Harmita, 2004).
3. Linearitas
Linearitas dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya (pada
rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional
dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).
Persyaratan data linearitas yang dapat diterima jika memenuhi nilai koefisien
korelasi (r) yang diperoleh dari hasil analisis > 0,999 (Anonim, 2004).
4. Range (Kisaran)
Range adalah interval antara kadar terendah sampai kadar tertinggi dari
suatu analit yang masih dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode
tertentu yang masih dapat menghasilkan akurasi, presisi, dan linearitas yang
mencukupi. Biasanya range memiliki satuan yang sama dengan satuan yang
digunakan pada metode analisis, misalnya persen atau ppm (United States
Pharmacopeial Convention, 2007).
22
H. Kesalahan dalam Metode Analisis
Kesalahan dalam metode analisis sangat sukar untuk dihilangkan namun
sumber kesalahan tetap harus ditekan seminimal mungkin. Kesalahan dalam
analisis kimia dapat dikategorikan menjadi dua kelas utama, yaitu:
1. Kesalahan sistemik.
Kesalahan sistemik adalah hasil analisis yang menyimpang secara tetap
dari harga kadar yang sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis,
sehingga kesalahan ini disebut juga kesalahan prosedur (Mulja dan Suharman,
1995). Kesalahan sistematik dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain:
a. Kesalahan personil dan operasi. Kesalahan ini disebabkan oleh cara
pelaksanaan analisis, bukan karena metode. Kesalahan operasi umumnya bersifat
fisis (bukan khemis), misalnya kesalahan pengamatan visual pada titik akhir
titrasi, kekeliruan cara pencucian endapan, dan sebagainya. Jadi kesalahan ini
bersifat individual dan sangat dipengaruhi oleh ketrampilan analis dalam
melakukan pekerjaan analisis.
b. Kesalahan alat dan pereaksi. Kesalahan ini disebabkan oleh pereaksi yang
kurang murni, alat yang kurang valid atau pemakaian alat yang kurang tepat
walaupun alatnya sendiri baik, contohnya pengambilan volume tepat dengan pipet
ukur atau gelas ukur, penggunaan buret 50 mL (buret makro) untuk analisis
mikro, dan sebagainya.
c. Kesalahan metode analisis. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kesalahan
pengambilan sampel, kesalahan akibat reaksi kimia yang tidak sempurna, atau
ikut mengendapnya zat-zat yang tidak diinginkan.
23
Kesalahan sistematik dapat dihindari atau diperkecil dengan cara sebagai
berikut.
(a) Mengkalibrasi instrumen dan melakukan koreksi secara berkala (biasanya
tiap bulan atau disesuaikan dengan frekuensi pemakaian alat).
(b) Memilih metode dan prosedur standar dari badan resmi.
(c) Mamakai bahan kimia dengan derajat untuk analisis.
(d) Meningkatkan pengetahuan dan ketrampilan para analis.
(e) Melakukan penetapan blangko atau kontrol dengan zat baku.
(f) Melakukan penetapan paralel (in duplo atau in triplo) (Mulja dan Suharman,
1995).
2. Kesalahan tidak sistemik
Kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan yang tidak tetap dari
hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan fluktuasi dari
instrument yang dipakai. Penyebab kesalahan ini tidak dapat ditentukan dan tidak
dapat dikontrol maka kesalahan ini disebut juga kesalahan acak (Mulja dan
Suharman, 1995).
I. Landasan Teori
Herba Seledri (Apium graveolens L.) memiliki kandungan flavonoid
seperti graveobiosid A dan B serta senyawa golongan fenol yang diketahui
memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Antioksidan adalah senyawa yang dapat
menangkal efek buruk dari radikal bebas, hal ini dikarenakan pada senyawa
antioksidan terdapat kelebihan pasangan elektron bebas yang dapat disumbangkan
24
untuk menetralkan radikal bebas sehingga menjadi tidak reaktif. Hal tersebut
mendorong untuk dilakukan penelitian terhadap herba seledri terutama untuk
mengetahui aktivitas antioksidan yang dimilikinya.
Metode pengujian antioksidan yang umum digunakan terutama untuk
senyawa dari bahan alam adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan sumber
radikal bebas berupa senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode ini
memiliki kelebihan yaitu mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas
antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.
Kandungan fenolik total dapat ditentukan dengan metode Folin-
Ciocalteu. Adanya senyawa fenolik dalam sampel uji akan mereduksi reagen asam
fosfomolibdat-fosfotungstat menjadi produk berwarna biru. Intensitas warna biru
yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik yang terdapat dalam sampel
uji.
J. Hipotesis
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri mempunyai aktivitas
antioksidan melalui pengujian dengan metode DPPH dan dapat digunakan sebagai
sumber baru senyawa antioksidan alami. Kandungan fenolik dalam fraksi etil
asetat ekstrak etanolik herba seledri berperan dalam aktivitas antioksidannya.
25
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena subjek uji
diberi perlakuan.
B. Variabel
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total
fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.
3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu
pemanenan, umur tanaman, dan cara panen.
4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari dan cuaca.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanolik herba seledri adalah sari hasil proses maserasi herba seledri
dengan penyari etanol.
2. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik herba seledri dengan
menggunakan etil asetat.
3. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri untuk menangkap
radikal DPPH.
26
4. Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat
ekstrak etanolik herba seledri yang menghasilkan penangkapan 50% radikal
DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: herba seledri
(Apium graveolens L.) yang diambil dari daerah Banyuroto di Muntilan;
akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma); bahan kualitas p.a. E. Merck yaitu: methanol,
asam galat; bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH (1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil), reagen Folin-Ciocalteu dan rutin; bahan kualitas teknis
Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV.
General Labora, yaitu: metanol; dan aluminium foil.
2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: blender, neraca
analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Janke &
Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel),
spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), corong Buchner, oven,
mikropipet 10-1000µL; 1-10mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup,
dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-
Germany dan Iwaki).
27
E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman seledri dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi,
Fakultas Farmasi USD menurut Backer dan Bakhuizen van den Brink (1963) serta
Backer dan Bakhuizen van den Brink (1965).
2. Pengumpulan bahan
Tanaman seledri diperoleh dari daerah Banyuroto di Muntilan.
Pengumpulan pada musim kemarau bulan September. Pemanenan dilakukan pada
tanaman yang menjelang berbunga saat pagi hari, dipilih herba seledri yang masih
segar, berwarna hijau, serta tidak layu.
3. Preparasi sampel
Sebanyak 1 kg herba seledri segar, dibersihkan, kemudian dihaluskan
dengan blender. Ketika dihaluskan, herba tersebut ditambahkan sedikit cairan
penyari (etanol). Simplisia yang telah dihaluskan dituang ke dalam bejana
maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen.
Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh
melalui penyaringan menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong
Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol
secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya dicampurkan dengan filtrat
terdahulu. Keseluruhan filtrat yang diperoleh diuapkan pelarutnya hingga
diperoleh ekstrak etanol herba seledri.
Ekstrak etanol herba seledri ditambah 300 mL air hangat dan dilakukan
ekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak :
28
wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air
akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian
atas.
Dari hasil ekstraksi cair-cair tersebut diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi
wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi lagi menggunakan etil
asetat dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga
didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan
dengan vacuum rotary evaporator. Lalu fraksi yang telah kering digunakan untuk
dianalisis lebih lanjut.
4. Pembuatan larutan DPPH, pembanding, dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh
larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan
alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0, dan 2,5 mL larutan stok rutin,
kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan pembanding rutin sebesar 12,5; 25; 37,5; 50; dan 62,5 µg/mL.
29
d. Pembuatan larutan uji
1) Larutan uji untuk uji aktivitas antioksidan
Sebanyak 100 mg ekstrak ditimbang, lalu ditambahkan metanol p.a
sampai 25,0 mL. Dari larutan tersebut kemudian diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0
mL untuk kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga
diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 400; 800; 1200; 1600; dan 2000 µg/mL.
2) Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total
Sebanyak 20 mg hasil fraksi etil asetat pada preparasi sampel ditimbang,
lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi
larutan uji sebesar 2000,0 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Dibuat larutan asam galat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam akuades
: metanol p.a. (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a. (1:1) sampai 10,0 mL,
sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;
dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sebanyak 0,5 mL metanol p.a, larutan pembanding asam galat 150,0
µg/mL, dan larutan uji 2000,0 µg/mL dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi.
Lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan
dengan akuades (1:10; v/v). Larutan tersebut selanjutnya ditambahkan dengan 4,0
mL Na2CO3 1M. Setelah 10 menit, amati warna pada larutan tersebut.
30
b. Uji aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga
labu takar 5 mL. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan
pembanding rutin 37,5 µg/mL, dan larutan uji 1200,0 µg/mL. Selanjutnya larutan
tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut
kemudian divortek selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan
tersebut.
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-
masing tiga labu takar 5,0 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1,0 mL
larutan pembanding rutin 12,5; 37,5; dan 62,5 µg/mL kemudian tambahkan
metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30
detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada
panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan
uji 400; 1200; dan 2000 µg/mL.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tiga labu takar 5,0 mL, dimasukkan masing-masing 0,2; 0,6; dan 1,0
mL larutan DPPH 0,4 mM. Masing-masing larutan tersebut ditambahkan metanol
p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi larutan DPPH menjadi 0,016; 0,048;
dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30 detik. Diamkan
selama OT. Lalu dilakukan scanning absorbansinya dengan spektrofotometer
visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
31
7. Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode
spektrofotometri sesuai dengan penelitian Armala (2009).
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol
Pada labu takar 5,0 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4
mM kemudian ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut
dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum.
Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan
kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-
masing labu takar 5,0 mL kemudian ditambah dengan 1,0 mL larutan pembanding
dan uji pada berbagai seri konsentrasi larutan yang telah dibuat. Selanjutnya
tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek
selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter akurasi
(%recovery), presisi (%CV), linearitas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
% Recovery =
% CV =
32
d. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin dan
fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.
8. Optimasi penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time (OT)
Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150
µg/mL dalam metanol p.a. Masing-masing diambil sebanyak 0,5 mL dan
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:10; v/v) serta 4,0 mL larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1M. Ukur
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teroritis 750 nm selama 30
menit. Operating Time diperoleh saat nilai absorbansi larutan tersebut telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150
µg/mL dalam metanol p.a. Masing-masing diambil sebanyak 0,5 mL dan
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:10; v/v) serta 4,0 mL larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1M. Diamkan
selama OT, lalu dilakukan scanning absorbansinya dengan spektrofotometer
visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
9. Penetapan kandungan fenolik total
Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode
spektrofotometri sesuai dengan penelitian Veeru, Kishor, dan Meenakshi (2009).
33
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:10; v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL Na2CO3 1M. Setelah
10 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 750 nm terhadap blanko
yang terdiri atas akuades : metanol p.a. (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan
Na2CO3 1M.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 9 a divalidasi berdasarkan parameter akurasi
(%recovery), presisi (%CV), linearitas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 2000 µg/mL, lalu dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva
baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen
asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).
F. Analisis Hasil
Uji aktivitas antioksidan menghasilkan aktivitas penangkapan radikal
DPPH yang dilaporkan sebagai %IC dihitung dengan rumus:
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan
persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding dan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalis secara statistik menggunakan
34
program PASW Statistics 18 untuk menentukan apakah rutin memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih besar dibanding fraksi uji.
Kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri dihitung sebagai massa ekivalen asam galat. Caranya dengan memasukkan
nilai absorbansi larutan uji ke dalam persamaan kurva baku asam galat sehingga
diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Nilai tersebut kemudian
dikalikan volume larutan uji yang diambil kemudian dibagi dengan massa fraksi
uji yang ditimbang.
Kandungan fenolik total =
Nilai ekivalen asam galat (GAE)
35
Determinasi tanaman
Pengumpulan bahan
Pembuatan ekstrak etanolik herba seledri
Fraksi air
Ekstraksi cair-cair dengan wasbensin dan air
Fraksi wasbensin Fraksi air
Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat
Fraksi etil asetat
Uji pendahuluan
Gambar 4. Skema jalannya penelitian
Optimasi metode penetapan kandungan
fenolik total
Optimasi uji aktivitas antioksidan
Validasi metode penetapan kandungan
fenolik total
Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Estimasi kandungan fenolik total
Estimasi aktivitas antioksidan
Analisis statistik dengan PASW Statistics 18
36
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang harus dilakukan
apabila ingin menggunakan tanaman sebagai sampel penelitian. Determinasi
bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang
akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam
pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Determinasi tanaman seledri (Apium
graveolens L.) dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi
Sanata Dharma menurut Backer dan Bakhuizen van den Brink (1963) serta Backer
dan Bakhuizen van den Brink (1965). Hasil determinasi didapatkan bahwa sampel
tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah benar herba seledri (Apium
graveolens L.).
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Herba seledri yang akan digunakan dalam penelitian diperoleh dari
daerah Banyuroto, Dusun Banyuroto, Kecamatan Sawangan, Kabupaten
Magelang, Jawa Tengah. Waktu panen suatu tanaman bergantung pada bagian
tanaman yang hendak digunakan, tujuannya agar didapat kandungan aktif yang
optimal.
Herba seledri yang digunakan pada penelitian ini dipilih berdasarkan tiga
kriteria, yaitu dipanen pada musim kemarau, pagi hari, dan sebelum tanaman
37
berbunga. Alasan herba seledri dipanen pada musim kemarau adalah supaya
kandungan lembab tidak terlalu tinggi sehingga meminimalkan pertumbuhan
mikroorganisme seperti jamur dan bakteri yang dapat menurunkan kualitas
tanaman. Dipanen pada pagi hari tujuannya agar didapatkan bahan yang masih
segar serta kandungan aktifnya masih banyak tersimpan dalam tanaman karena
belum mengalami metabolisme. Selain itu, dipilih herba seledri yang menjelang
berbunga karena konsentrasi kandungan aktifnya akan lebih besar terdapat pada
daun dan batangnya apabila tanaman tersebut belum berbunga, karena pada
penelitian ini digunakan daun dan batang tanaman seledri.
Herba seledri dipilih yang masih segar, berwarna hijau serta tidak layu.
Sebelum digunakan untuk penelitian, herba seledri dicuci dan dibersihkan dahulu
menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pengotor atau kontaminan
berupa partikel debu maupun tanah yang masih menempel pada tanaman. Herba
seledri dikumpulkan sebanyak 1 kg basah. Herba seledri segar harus segera diolah
untuk menghindari terjadinya fenomena phenolic browning, yaitu warna tanaman
berubah menjadi kecoklatan bahkan menghitam, hal ini terjadi karena oksidasi
senyawa fenolik yang terdapat dalam tanaman (Galati, Angie., McKay, Allan.,
dan Tan, Soon Chye., 2005).
C. Hasil Pembuatan Ekstrak
Ekstrak dibuat dari herba seledri segar tanpa melalui proses pengeringan
terlebih dahulu. Alasan digunakan bahan segar dalam penelitian ini karena banyak
kandungan aktif dalam herba seledri yang belum diketahui secara pasti sifat fisika
38
kimianya sehingga dikhawatirkan akan mengalami perubahan apabila dikeringkan
dahulu (Markham, 1988). Selain itu, selama proses pengeringan dapat terjadi
reaksi oksidasi enzimatis karena kandungan air yang masih cukup tinggi sehingga
senyawa fenolik dan flavonoid dalam herba seledri menjadi terurai dan aktivitas
antioksidannya menurun (Harborne, 1987). Seledri biasa dikonsumsi dalam
keadaan segar sehingga akan lebih sesuai bila menggunakan bahan herba seledri
yang masih segar untuk penelitian ini.
Herba seledri yang telah dicuci dan dibersihkan kemudian dihaluskan
menggunakan blender sambil ditambahkan sedikit cairan penyari, yaitu etanol
96%. Simplisia tersebut diblender agar ukuran partikel tanaman menjadi lebih
kecil sehingga kontak dengan cairan penyari lebih efektif dan semakin banyak
kandungan aktif dalam tanaman yang dapat tersari. Pemilihan etanol sebagai
cairan penyari dikarenakan etanol dapat bercampur dengan air sehingga
diharapkan dapat menyari sebagian besar kandungan kimia dalam bahan segar
yang memiliki kandungan air cukup tinggi.
Penyarian kandungan aktif dilakukan dengan maserasi karena umumnya
kandungan aktif dalam tanaman tidak tahan terhadap pemanasan sehingga lebih
dipilih ekstraksi cara dingin serta proses maserasi dianggap lebih sederhana dan
mudah dilakukan dibanding cara ekstraksi yang lain seperti perkolasi. Perkolasi
memerlukan banyak pelarut serta proses ekstraksinya cukup lama sehingga kurang
efisien untuk penelitian ini. Selain itu, penelitian ini menggunakan bahan segar
sehingga tidak memungkinkan untuk dilakukan ekstraksi dengan cara lain seperti
perkolasi yang mempersyaratkan bahan berupa serbuk atau yang mudah dialiri
39
oleh pelarut (susunannya harus kompak). Maserasi dilakukan terhadap campuran
bahan dan cairan penyari selama dua hari dan dilanjutkan tahap remaserasi ampas
selama dua hari. Selama proses maserasi dilakukan penggojogan dengan bantuan
shaker sehingga meningkatkan kontak simplisia dengan cairan penyari. Hal ini
dilakukan untuk memaksimalkan jumlah kandungan aktif yang dapat tersari dari
simplisia tersebut. Filtrat dari kedua tahapan tesebut dikumpulkan lalu disaring
menggunakan bantuan corong Buchner yang dilapisi kertas saring serta pompa
vakum sehingga prosesnya lebih cepat. Hasil penyaringan filtrat tersebut
kemudian diuapkan pelarutnya sehingga diperoleh ekstrak etanol herba seledri.
Ekstrak etanol yang diperoleh sebanyak 27,3421 g.
Ekstrak kental yang telah diperoleh kemudian difraksinasi. Sebelum
difraksinasi maka ekstrak kental tersebut ditambahkan 300 mL air hangat terlebih
dahulu karena dengan air dingin ekstrak etanolik sukar larut. Fraksinasi dilakukan
dengan pelarut wasbensin yang bersifat non polar dengan perbandingan 1:1 v/v.
Bagian yang polar seperti polifenol dan flavonoid akan tersari ke air sedangkan
bagian non polar seperti lipid dan klorofil akan tersari ke wasbensin. Fraksi air
akan berada pada bagian bawah sedangkan fraksi wasbensin akan berada di
bagian atas. Hal tersebut dikarenakan bobot jenis (bj) air (1 g/mL) lebih besar
daripada bj wasbensin (0,730 g/mL). Selanjutnya, fraksi air yang telah dipisahkan
dari fraksi wasbensin difraksinasi menggunakan etil asetat yang kepolarannya
berada diantara air dan wasbensin dengan perbandingan 1:1 v/v. Tahapan
fraksinasi menggunakan etil asetat-air sama seperti tahapan fraksinasi wasbensin-
air. Pada fraksinasi air dengan etil asetat, fraksi air juga akan berada pada bagian
40
bawah karena bj air (1 g/mL) lebih besar dibandingkan etil asetat (0,903 g/mL).
Setelah proses fraksinasi selesai, didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi
etil asetat selanjutnya diuapkan menggunakan bantuan vacuum rotary evaporator
untuk menghilangkan pelarutnya. Pada saat hampir semua pelarut telah menguap,
fraksi tersebut diletakkan dalam cawan porselen yang telah ditara sebelumnya
kemudian dipanaskan di atas waterbath sambil diaduk agar terbentuk ekstrak yang
benar-benar kental. Setelah kental, fraksi etil asetat yang berwarna kehijauan
ditimbang dan diperoleh 0,5446 g.
D. Hasil Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan ini dilakukan untuk mengetahui apakah dalam fraksi etil
asetat ekstrak etanolik herba seledri terdapat kandungan senyawa fenolik serta
apakah fraksi tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Pada uji pendahuluan
keberadaan senyawa fenolik, senyawa uji ditambahkan pereaksi fenol Folin-
Ciocalteu, didiamkan selama dua menit kemudian ditambahkan larutan natrium
karbonat 1M. Pembanding yang digunakan untuk uji ini adalah asam galat yang
merupakan senyawa fenolik.
41
Gambar 5. Uji pendahuluan senyawa fenolik
Keterangan : 1 : Pereaksi Folin-Ciocalteu + Na2CO3 sebagai kontrol; 2 : Asam galat; 3 : Fraksi uji
Adanya senyawa fenolik dalam fraksi uji akan mengubah warna larutan
menjadi biru. Perubahan warna tersebut terjadi karena oksidasi senyawa fenol
dalam fraksi uji oleh pereaksi Folin-Ciocalteu. Hasil pengujian pada fraksi etil
asetat ekstrak etanolik herba seledri menunjukkan positif terdapat kandungan
fenolik karena terbentuk warna biru, hal tersebut terjadi pula pada senyawa
pembanding asam galat.
Pada uji pendahuluan aktivitas antioksidan, baik senyawa uji maupun
senyawa pembanding, yaitu rutin ditambahkan pada larutan DPPH dalam metanol.
Adanya aktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH yang semula
berwarna ungu menjadi kekuningan. Hasil pengujian baik untuk senyawa uji
maupun senyawa pembanding kesemuanya positif karena terjadi perubahan warna
pada larutan DPPH dalam metanol menjadi kekuningan, dibandingkan dengan
kontrol berupa larutan DPPH dalam metanol yang berwarna ungu.
1 12
3
42
Gambar 6. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Keterangan : 1 : Larutan DPPH sebagai kontrol; 2 : Rutin; 3 : Fraksi uji
E. Optimasi Metode
1. Penentuan Operating Time (OT)
Penetuan operating time dimaksudkan untuk memperoleh waktu
pengukuran absorbansi dengan nilai yang stabil. Waktu pengukuran absorbansi
ditentukan saat warna yang terbentuk stabil, ditandai dengan nilai absorbansi yang
stabil dari senyawa yang diukur.
a. Uji aktivitas antioksidan
Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan larutan
DPPH yang telah ditambahkan senyawa uji maupun senyawa pembanding rutin
pada tiga konsentrasi berbeda (low, med, dan high). Larutan divorteks dahulu
selama 30 detik sebelum diukur untuk menghomogenkan campuran tersebut agar
bereaksi optimal. Pembacaan absorbansi dilakukan menggunakan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis dari DPPH yaitu 517
nm selama 1 jam. Pengukuran absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan
instrumen yang digunakan tidak dapat digunakan untuk mengukur OT secara
1 12 3
43
otomatis. Waktu operasi (OT) yang diperoleh untuk larutan pembanding rutin
maupun larutan uji adalah 30 menit, ditandai dengan nilai absorbansi yang tetap.
Gambar 7. Kurva penentuan Operating Time (OT) uji aktivitas antioksidan
b. Penetapan kandungan fenolik total
Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan kompleks
molybdenum blue yang terbentuk oleh reaksi antara senyawa fenolik yaitu asam
galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dalam suasana basa. Pembacaan absorbansi
dilakukan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis
kompleks molybdenum blue yaitu 750 nm selama 30 menit. Pengukuran
absorbansi dilakukan tiap 5 menit dikarenakan instrumen yang digunakan tidak
dapat digunakan untuk mengukur OT secara otomatis. Waktu operasi (OT) yang
diperoleh untuk larutan asam galat adalah 10 menit, ditandai dengan nilai
absorbansi yang tetap.
44
Gambar 8. Kurva penentuan Operating Time (OT) penetapan kandungan fenolik total
2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
a. Uji aktivitas antioksidan
Meskipun telah diketahui dari sejumlah literatur (Blois, 1958; Lu dan
Foo, 2000; Zhu et al., 2002) bahwa panjang gelombang serapan maksimum DPPH
yaitu pada λ 517 nm, tetapi tetap perlu untuk dilakukan penentuan dikarenakan
panjang gelombang serapan maksimum dapat mengalami perubahan (pergeseran)
dikarenakan perbedaan kondisi percobaan yang dilakukan. Perubahan tersebut
dapat berupa perbedaan instrumen, waktu pengukuran, pelarut, iklim, maupun
individu yang melakukan.
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan terhadap
larutan DPPH dalam pelarut metanol pada tiga konsentrasi, setelah sebelumnya
divorteks dan didiamkan selama OT. Scanning dilakukan pada panjang
45
gelombang 400-600 nm. Hasilnya diperoleh panjang gelombang serapan
maksimum untuk penelitian ini adalah 515,8 nm. Selisih panjang gelombang ini
dengan panjang gelombang maksimum teoritis sebesar 1,2 nm, selisih nilai ini
masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi
IV, yaitu kurang dari 2 nm. Karena hal diatas, panjang gelombang maksimum
yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.
Gambar 9. Scanning panjang gelombang maksimum larutan DPPH
Keterangan : A : larutan DPPH 0,016 mM; B : larutan DPPH 0,048 mM; C : larutan DPPH 0,08 mM
b. Penetapan kandungan fenolik total
Dilakukan pula penentuan panjang gelombang serapan maksimum untuk
pengujian kandungan fenolik total. Scanning dilakukan pada tiga seri konsentrasi
asam galat (low, med, dan high) pada panjang gelombang 600-800 nm. Dari hasil
46
scanning diperoleh panjang gelombang maksimum untuk penentuan kandungan
fenolik total adalah 750 nm. Hasil tersebut sesuai dengan panjang gelombang
maksimum teoritis dari kompleks molybdenum blue yaitu 750 nm.
Gambar 10. Scanning panjang gelombang maksimum asam galat + pereaksi
Folin-Ciocalteu + natrium karbonat
Keterangan : A : konsentrasi rendah; B : konsentrasi sedang; C : konsentrasi tinggi
Panjang gelombang maksimum merupakan faktor penting dalam analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis karena pada panjang gelombang tersebut
diperoleh serapan optimum dari suatu senyawa yang diukur. Selain itu, panjang
gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang
bersifat karakteristik. Panjang gelombang serapan maksimum tidak bergantung
pada struktur senyawa melainkan pada gugus yang mengabsorbsi radiasi sinar
UV-Vis, sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama,
belum tentu keduanya adalah senyawa yang sama. Hal inilah yang menyebabkan
47
panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis
kualitatif.
Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi selalu dilakukan pada
panjang gelombang serapan maksimum dikarenakan perubahan absorbansi untuk
tiap perubahan konsentrasi adalah paling besar sehingga memberikan kepekaan
analisis yang tinggi. Selain itu, bila dilakukan pengukuran pada panjang
gelombang serapan maksimum maka untuk pengukuran berulang hasilnya lebih
reprodusibel sehingga kesalahan yang terjadi makin kecil (Mulja dan Suharman,
1995).
F. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter
tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan yang digunakan (Harmita, 2004).
Validasi metode analisis perlu dilakukan baik untuk uji aktivitas antioksidan
dengan metode DPPH maupun penetapan kandungan fenolik total dengan metode
Folin-Ciocalteu. Parameter validasi yang dinilai meliputi akurasi, presisi,
linearitas serta spesifisitas pengukuran.
1. Uji aktivitas antioksidan
Berikut ini adalah kurva regresi linier antara konsentrasi rutin atau
fraksi uji dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH.
48
Gambar 11. Kurva regresi linier antara konsentrasi rutin dengan aktivitas
antioksidannya menggunakan metode DPPH
Gambar 12. Kurva regresi linier antara konsentrasi fraksi dengan aktivitas
antioksidannya menggunakan metode DPPH
a. Akurasi
Penilaian akurasi suatu metode didasarkan pada nilai perolehan kembali
(recovery) dari data hubungan antara konsentrasi larutan pembanding ataupun
larutan uji dengan absorbansi yang dihasilkan.
49
Tabel III. Data recovery larutan pembanding rutin
Rutin Konsentrasi
Teoritis (µg/mL)
% IC Konsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery
Seri I 2,4 7,738 2,26 94,14 2,5 8,452 2,36 94,33 2,5 8,333 2,34 93,67
Seri II 4,8 27,619 5,01 104,44 5 28,452 5,13 102,57 5 28,214 5,10 101,91
Seri III 7,2 43,81 7,26 100,78 7,5 45,476 7,49 99,83 7,5 45,357 7,47 99,61
Seri IV 9,6 63,571 9,99 104,10 10 65,119 10,21 102,08 10 65 10,19 101,91
Seri V 12 78,69 12,09 100,73
12,5 80,357 12,32 98,55 12,5 80,119 12,29 98,29
Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan
pembanding rutin berada dalam rentang 93,67-104,44%. Hasil tersebut masih
berada dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 2,4-12,5
µg/mL. Nilai recovery yang masih bisa diterima berkisar antara 90-107%
(Harmita, 2004).
50
Tabel IV. Data recovery larutan uji Fraksi
Etil Asetat
Konsentrasi Teoritis (µg/mL)
% IC Konsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery
Seri I 80,08 18,69 81,99 102,39
80 19,405 87,33 109,16 80 19,167 85,55 106,94
Seri II 160,16 28,333 153,96 96,13
160 28,81 157,51 98,45 160 29,048 159,29 99,56
Seri III 240,24 38,333 228,58 95,15
240 39,286 235,69 98,21 240 39,048 233,92 97,47
Seri IV 320,32 49,405 311,21 97,16
320 50,357 318,31 99,47 320 50,119 316,54 98,92
Seri V 400,4 61,905 404,49 101,02 400 62,5 408,93 102,23 400 62,381 408,04 102,01
Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan
uji berada dalam rentang 95,15-109,16%. Nilai recovery yang masih bisa diterima
berkisar antara 90-107% untuk kadar analit 10-100 µg/mL serta 95-105% untuk
kadar analit >100-1000 µg/mL (Harmita, 2004). Hasil tersebut masih berada
dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 80-400,4 µg/mL.
Hanya terdapat satu data yang tidak memenuhi persyaratan, yaitu untuk kadar 80
µg/mL yang nilai recoverynya 109,16 %. Dapat dikatakan bahwa metode DPPH
yang digunakan memiliki akurasi yang baik.
b. Presisi
Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of
Variation (CV). Tabel berikut menunjukkan persentase CV untuk tiap konsentrasi
larutan pembanding rutin.
51
Tabel V. Data Coefficient of Variation (CV) larutan pembanding rutin
Rutin Konsentrasi
Teoritis (µg/mL)
% IC Konsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery SD CV (%)
Seri I 2,4 7,738 2,26 94,14
0,3398 0,36132,5 8,452 2,36 94,33 2,5 8,333 2,34 93,67
Seri II 4,8 27,619 5,01 104,44
1,3123 1,27445 28,452 5,13 102,57 5 28,214 5,10 101,91
Seri III 7,2 43,81 7,26 100,78
0,6218 0,62147,5 45,476 7,49 99,83 7,5 45,357 7,47 99,61
Seri IV 9,6 63,571 9,99 104,10
1,2183 1,186310 65,119 10,21 102,08 10 65 10,19 101,91
Seri V 12 78,69 12,09 100,73
1,34 1,351012,5 80,357 12,32 98,55 12,5 80,119 12,29 98,29
Nilai % CV untuk larutan pembanding rutin pada tabel diatas berada
pada rentang 0,3613-1,3510%. Untuk kadar analit antara 2,4-12,5 µg/mL, nilai
presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri
konsentrasi larutan pembanding rutin telah memenuhi nilai presisi yang baik.
52
Tabel VI. Data Coefficient of Variation (CV) larutan uji Fraksi
Etil Asetat
Konsentrasi Teoritis (µg/mL)
% IC Konsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery SD CV (%)
Seri I 80,08 18,69 81,99 102,39
3,4512 3,250880 19,405 87,33 109,16 80 19,167 85,55 106,94
Seri II 160,16 28,333 153,96 96,13
1,7502 1,7851160 28,81 157,51 98,45 160 29,048 159,29 99,56
Seri III 240,24 38,333 228,58 95,15
1,5965 1,6469240 39,286 235,69 98,21 240 39,048 233,92 97,47
Seri IV 320,32 49,405 311,21 97,16
1,2067 1,2249320 50,357 318,31 99,47 320 50,119 316,54 98,92
Seri V 400,4 61,905 404,49 101,02
0,6445 0,6334400 62,5 408,93 102,23 400 62,381 408,04 102,01
Nilai % CV untuk larutan uji pada tabel diatas berada pada rentang
0,6334-3,2508%. Untuk kadar analit antara 80-400,4 µg/mL, nilai presisi yang
masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri konsentrasi
larutan uji diketahui telah memenuhi nilai presisi yang baik. Dari hasil tersebut,
dapat dikatakan bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki presisi yang baik.
c. Linearitas
Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) yang
dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Semakin nilai r mendekati ± 1
maka linearitasnya semakin baik. Nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan
pembanding rutin adalah sebagai berikut
replikasi I = 0,9990; replikasi II = 0,9991; dan replikasi III = 0,9991. Menurut
Mulja dan Suharman (1995) dan Anonim (2004), data linearitas dapat diterima
53
jika memenuhi nilai r > 0,999. Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk
ketiga replikasi larutan pembanding rutin telah memenuhi persyaratan lineraitas
yang baik.
Untuk larutan uji, nilai koefisien korelasinya adalah sebagai berikut
replikasi I = 0,9985; replikasi II = 0,9989; dan replikasi III = 0,9989. Persyaratan
linearitas untuk larutan uji mengacu kepada nilai r tabel untuk taraf kepercayaan
95% dan degree of freedom (df) 3, yakni 0,878 (Muth, 1999). Dari hasil tersebut,
persamaan kurva baku untuk ketiga replikasi larutan uji telah memenuhi
persyaratan lineraitas yang baik. Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan
bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki linearitas yang baik.
d. Spesifisitas
Parameter spesifisitas dinilai dari ketepatan suatu metode untuk
mengukur analit tertentu dalam sampel yang kompleks. Pada pengujian ini
spesifisitas dapat dilihat dari spektra yang dihasilkan baik oleh pelarut, senyawa
uji, senyawa pembanding rutin, asam galat, maupun larutan DPPH.
Spesifisitas uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat
dari spektra pelarut metanol, senyawa uji, maupun senyawa pembanding rutin
yang tidak memberikan serapan pada panjang gelombang maksimum larutan
DPPH yang akan diukur absorbansinya sehingga nilai absorbansi yang terukur
merupakan absorbansi larutan DPPH tanpa ada intervensi absorbansi pelarut
maupun senyawa lain yang ditambahkan (lampiran 7, 9, dan 12).
54
2. Penetapan kandungan fenolik total
Berikut ini adalah kurva baku larutan asam galat setelah ditambahkan
pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat.
Gambar 13. Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat dengan
absorbansinya setelah ditambahkan pereaksi
a. Akurasi
Penilaian akurasi suatu metode didasarkan pada nilai perolehan kembali
(recovery) dari data hubungan antara konsentrasi larutan pembanding ataupun
larutan uji dengan absorbansi yang dihasilkan.
55
Tabel VII. Data recovery asam galat
Asam galat
Konsentrasi Teoritis (µg/mL)
AbsorbansiKonsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery
Seri I 50 0,317 51,26 102,52 50 0,319 52,00 104,00
50,4 0,322 53,11 105,38
Seri II 75 0,383 75,70 100,94 75 0,386 76,81 102,42
75,6 0,391 78,67 104,06
Seri III
100 0,452 101,26 101,26 100 0,454 102,00 102,00
100,8 0,458 103,48 102,66
Seri IV
125 0,52 126,44 101,16 125 0,523 127,56 102,04 126 0,529 129,78 103,00
Seri V 150 0,591 152,74 101,83 150 0,595 154,22 102,81
151,2 0,602 156,81 103,71
Berdasarkan data pada tabel diatas, persentase perolehan kembali larutan
asam galat berada dalam rentang 100,94-105,38%. Hasil tersebut masih berada
dalam rentang recovery yang baik untuk analit dengan kadar 50-151,2 µg/mL.
Nilai recovery yang masih bisa diterima berkisar antara 90-107% untuk kadar
analit 10-100 µg/mL serta 95-105% untuk kadar analit >100-1000 µg/mL
(Harmita, 2004). Dari data diatas, diketahui semua recovery memenuhi nilai yang
dipersyaratkan. Dapat dikatakan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan
memiliki akurasi yang baik.
b. Presisi
Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of
Variation (CV). Tabel berikut menunjukkan persentase CV untuk tiap konsentrasi
larutan pembanding rutin.
56
Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV) larutan asam galat
Asam galat
Konsentrasi Teoritis (µg/mL)
AbsorbansiKonsentrasi
Terukur (µg/mL)
Recovery SD CV (%)
Seri I 50 0,317 51,26 102,52
1,4303 1,375750 0,319 52,00 104,00 50,4 0,322 53,11 105,38
Seri II 75 0,383 75,70 100,94
1,5607 1,523175 0,386 76,81 102,42 75,6 0,391 78,67 104,06
Seri III
100 0,452 101,26 101,26 0,7004 0,6868100 0,454 102,00 102,00
100,8 0,458 103,48 102,66
Seri IV
125 0,52 126,44 101,16 0,9203 0,9017125 0,523 127,56 102,04
126 0,529 129,78 103,00
Seri V 150 0,591 152,74 101,83
0,9403 0,9148150 0,595 154,22 102,81 151,2 0,602 156,81 103,71
Nilai % CV untuk larutan asam galat pada tabel diatas berada pada
rentang 0,6868-1,5231%. Untuk kadar analit antara 50-151,2 µg/mL, nilai presisi
yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri
konsentrasi larutan asam galat telah memenuhi nilai presisi yang baik. Dari hasil
tersebut, dapat dikatakan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan memiliki
presisi yang baik.
c. Linearitas
Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) yang
dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Semakin nilai r mendekati ± 1
maka linearitasnya semakin baik. Nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan asam
galat adalah sebagai berikut
57
replikasi I = 0,9999; replikasi II = 0,9999; dan replikasi III = 0,9999. Menurut
Mulja dan Suharman (1995) dan Anonim (2004), data linearitas dapat diterima
jika memenuhi nilai r > 0,999. Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk
ketiga replikasi larutan asam galat telah memenuhi persyaratan linearitas yang
baik. Dapat disimpulkan bahwa metode Folin-Ciocalteu yang digunakan memiliki
linearitas yang baik.
d. Spesifisitas
Spesifisitas penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-
Ciocalteu juga dapat dilihat dari spektra pelarut metanol, senyawa uji, maupun
asam galat yang tidak memberikan serapan pada panjang gelombang maksimum
kompleks molybdenum-blue yang akan diukur absorbansinya sehingga nilai
absorbansi yang terukur merupakan kompleks molybdenum-blue tanpa ada
intervensi absorbansi pelarut maupun senyawa lain yang ditambahkan (lampiran
7, 12, dan 14).
G. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Pada penelitian ini, pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan
metode DPPH. Metode ini menggunakan senyawa radikal bebas, yaitu (DPPH)
karena terdapat elektron yang tidak berpasangan pada strukturnya sehingga dapat
digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan suatu senyawa yang dapat
mendonorkan elektronnya sehingga terjadi penurunan intensitas warna atau
absorbansi larutan DPPH.
58
Gambar 14. Reaksi terbentuknya warna kuning oleh adanya antioksidan
Pengurangan intensitas warna larutan DPPH tersebut dihasilkan oleh
bereaksinya molekul radikal DPPH dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan
komponen bahan uji sehingga terbentuk senyawa 1,1 difenil-2-pikrilhidrazin yang
berwarna kuning. Pengurangan intensitas warna ungu larutan DPPH karena
adanya penambahan senyawa penangkap radikal bebas dapat dihitung secara
kuantitatif dari berkurangnya absorbansi larutan tersebut.
Pada prinsipnya absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH
yang tidak bereaksi dengan bahan uji atau DPPH yang masih tersisa dalam
larutan, sehingga dengan bertambahnya konsentrasi senyawa penangkap radikal
bebas dalam larutan, maka absorbansi larutan akan berkurang. Hal ini berarti
bahwa aktivitas penangkapan radikal bebasnya semakin meningkat.
Menurut metode ini, aktivitas antioksidan dari senyawa uji dinyatakan
dengan IC50. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier yang menyatakan
hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan radikal
yang dimilikinya. Semakin kecil nilai IC50, maka semakin aktif suatu
fraksi/ekstrak tanaman sebagai antioksidan.
Antioksidan
1,1 difenil-2-pikrilhidrazil (ungu) 1,1 difenil-2-pikrilhidrazin (kuning)
59
Rutin digunakan sebagai senyawa pembanding dalam uji aktivitas
antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri ini karena rutin
merupakan senyawa antioksidan alami golongan flavonoid yang telah diketahui
memiliki potensi penangkapan radikal yang poten. Dalam uji ini, rutin akan
mereduksi radikal DPPH menjadi senyawa 1,1 difenil-2-pikrilhidrazin sehingga
terjadi penurunan intensitas warna pada larutan dari yang semula ungu menjadi
kekuningan.
Gambar 15. Struktur rutin (Mabry et al., 1970).
Tabel IX. Data aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH
Replikasi I
Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,4 0,775 7,738 4,8 0,608 27,619 7,2 0,472 43,810 9,6 0,306 63,571 12 0,179 78,690
Persamaan garis regresi linier : y = 7,411 x – 9,071 r = 0,9990 IC50 = 7,971 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840
60
Replikasi II
Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,5 0,769 8,452 5 0,601 28,452
7,5 0,458 45,476 10 0,293 65,119
12,5 0,165 80,357 Persamaan garis regresi linier : y = 7,219 x – 8,572 r = 0,9991 IC50 = 8,114 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840 Replikasi III
Konsentrasi rutin (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%) 2,5 0,770 8,333 5 0,603 28,214
7,5 0,459 45,357 10 0,294 65
12,5 0,167 80,119 Persamaan garis regresi linier : y = 7,214 x – 8,703 r = 0,9991 IC50 = 8,137 (µg/mL) x = konsentrasi rutin y = aktivitas antioksidan rutin Absorbansi kontrol 0,840 Rata-rata IC50 = 8,074 µg/mL
SD = 0,090
CV = 1,115 %
Dari analisis regresi linier diperoleh nilai IC50 rata-rata rutin sebesar
8,074 µg/mL. Hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50%
diperlukan konsentrasi rutin sebesar 8,074 µg/mL.
Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri
dengan metode DPPH disajikan pada tabel berikut.
61
Tabel X. Data aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri dengan metode DPPH
Replikasi I
Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)
80,08 0,683 18,690 160,16 0,602 28,333 240,24 0,518 38,333 320,32 0,425 49,405 400,4 0,320 61,905
Persamaan garis regresi linier : y = 0,134 x + 7,083 r = 0,9985 IC50 = 320,276 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840 Replikasi II
Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)
80 0,677 19,405 160 0,598 28,810 240 0,510 39,286 320 0,417 50,357 400 0,315 62,5
Persamaan garis regresi linier : y = 0,135 x + 7,751 r = 0,9989 IC50 = 312,956 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840
62
Replikasi III
Konsentrasi fraksi (µg/mL) Absorbansi Aktivitas antioksidan (%)
80 0,679 19,167 160 0,596 29,048 240 0,512 39,048 320 0,419 50,119 400 0,316 62,381
Persamaan garis regresi linier : y = 0,134 x + 7,703 r = 0,9989 IC50 = 315,649 (µg/mL) x = konsentrasi fraksi y = aktivitas antioksidan fraksi Absorbansi kontrol 0,840 Rata-rata IC50 = 316,294 µg/mL
SD = 3,702
CV = 1,170 %
Dari analisis regresi linier diperoleh nilai IC50 rata-rata fraksi sebesar
316,294 µg/mL. Hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50%
diperlukan konsentrasi fraksi sebesar 316,294 µg/mL.
IC50 merupakan konsentrasi antioksidan yang diperlukan untuk
menangkap 50% radikal DPPH. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan regresi linier
yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji (x) dengan aktivitas
antioksidan yang dihasilkan (y). Semakin kecil nilai IC50, maka sampel uji
mempunyai keefektifan sebagai antioksidan yang lebih baik. Dari hasil regersi
linier diperoleh IC50 rutin adalah 8,074 µg/mL, sedangkan untuk fraksi etil asetat
ekstrak etanolik herba seledri memiliki IC50 sebesar 316,294 µg/mL. Dari nilai
tersebut dapat diketahui bahwa rutin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih
baik bila dibandingkan dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri.
63
Rutin memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena nilai IC50 < 50
µg/mL, sedangkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki
aktivitas antioksidan yang lemah karena nilai IC50 > 150 µg/mL.
Tabel XI. Tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan metode penangkapan radikal DPPH (Ariyanto cit., Kurniasih, 2008).
Sampel IC50 (µg/mL)
Tingkatan aktivitas antioksidan (IC50) dengan metode penangkapan radikal DPPH
Sangat kuat (< 50 µg/mL)
Kuat (<50-100 µg/mL)
Sedang (101-150 µg/mL)
Lemah (>150
µg/mL) Rutin 8,074 √
Fraksi etil asetat 316,294 √
H. Hasil Uji Penetapan Kandungan Fenolik Total
Penetapan kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah
kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri
karena senyawa fenolik memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Penetapan
kandungan fenolik dilakukan secara spektrofotometri dan hasilnya dinyatakan
sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar karena
merupakan senyawa fenolik yang telah dikenal memiliki aktivitas antioksidan.
Gambar 16. Struktur asam galat (Lopez, et al., 2003).
64
Tabel XII. Konsentrasi asam galat dan absorbansinya setelah ditambah pereaksi Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang diukur secara
spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm
Replikasi I
Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi
50 0,317
75 0,383
100 0,452
125 0,520
150 0,591
Persamaan garis regresi linier : y = 0,0027 x + 0,1786 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi
Replikasi II
Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi
50 0,319
75 0,386
100 0,454
125 0,523
150 0,595
Persamaan garis regresi linier : y = 0,0028 x + 0,1798 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi
65
Replikasi III
Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi
50,4 0,322
75,6 0,391
100,8 0,458
126,0 0,529
151,2 0,602
Persamaan garis regresi linier : y = 0,0028 x + 0,1812 r = 0,9999 x = konsentrasi asam galat y = absorbansi
Dasar penetapan kandungan fenolik total secara spektrofotometri ini
adalah adanya oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-
Ciocalteu menghasilkan senyawa yang berwarna. Fenol dalam suasana basa akan
berubah menjadi ion fenolat yang bersifat lebih reaktif sehingga lebih mudah
bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu (gambar 17). Suasana basa diakibatkan
oleh adanya penambahan natrium karbonat.
OH
fenol
OH
O
ion fenolat
Gambar 17. Oksidasi fenol dalam suasana basa
66
Ion fenolat dioksidasi oleh asam dalam pereaksi Folin-Ciocalteu dan
kompleks molybdenum-tungstat akan direduksi sebagian oleh sampel sehingga
menghasilkan warna biru (molybdenum-blue) (gambar 18).
H3PO4(MoO3)12
pereaksi Folin-Ciocalteu
+
OH
gugus fenol sampel
+ H2O
O
O
kuinon
+
H5(PMo12O40)
atau
H7(PMo12O40)
kompleks oktahedralmolybdenum-blue
Gambar 18. Reaksi fenol dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
Saat reaksi terjadi, pereaksi Folin-Ciocalteu mendapatkan proton (H+)
dari gugus fenol sampel dan air (tereduksi), sedangkan gugus fenol akan
mendapatkan tambahan oksigen dari air dan pereaksi (teroksidasi), sehingga
membentuk kompleks oktahedral molybdenum-blue dan kuinon. Kompleks
octahedral yang terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P)
sebagai pusatnya. Molibdat pada kompleks dapat disubstitusi oleh tungsten (W).
Kompleks molybdenum-blue yang terbentuk berupa koloid dan akan
menjadi encer dengan adanya asam fosfat pada pereaksi Folin-Ciocalteu, sehingga
dapat dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel.
Hasil penetapan kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak
etanolik herba seledri dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat dan
dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Hasilnya disajikan pada tabel berikut.
67
Tabel XIII. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg GAE/g)
Replikasi Absorbansi Kadar (mg/mL) Kandungan fenolik total (mg GAE/g)
I 0,613 0,161 3,284 II 0,609 0,159 3,275 III 0,607 0,159 3,25
Rata-rata kandungan fenolik total = 3,27 mg GAE/g
SD = 0,018
CV = 0,550 %
I. Hasil Analisis Statistik
Dari hasil uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba
seledri, dapat dilakukan analisis statistik untuk mengetahui apakah ada perbedaan
signifikan antara aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh fraksi uji dengan
aktivitas antioksidan yang dimiliki senyawa pembanding rutin. Analisis statistik
dilakukan menggunakan program PASW Statistics 18. Untuk mengetahui
kenormalan distribusi data dilakukan analisis statistik deskriptif menggunakan
perhitungan Kolmogorov-Smirnov, hasilnya diperoleh nilai signifikansi sebesar
0,200. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa Hnull diterima karena nilai p
lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Jadi, data uji aktivitas antioksidan
mengikuti distribusi normal.
Karena distribusi datanya normal maka dapat dilanjutkan pengujian
statistik induktif menggunakan uji parametrik yaitu Independent Sample t Test.
Alasan pemilihan uji ini karena tujuannya untuk mengetahui perbedaan antara dua
sampel yang tidak saling berhubungan, yaitu rutin dan fraksi etil asetat. Uji ini
digunakan untuk mengetahui apakah aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh rutin
68
lebih besar dibandingkan dengan fraksi uji. Hipotesis yang diujikan sebagai
berikut.
Hi : Aktivitas antioksidan rutin lebih besar dibandingkan fraksi uji.
Hnull : Aktivitas antioksidan rutin tidak lebih besar dibandingkan fraksi uji.
Hasil pengujian memperoleh nilai signifikansi 0,000 antara rutin dengan fraksi etil
asetat. Bila dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05
maka Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada
nilai signifikansi yang ditentukan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa rutin
memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dibandingkan fraksi uji. Data
analisis statistik tercantum pada lampiran 18.
69
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri memiliki aktivitas antioksidan
melalui pengujian dengan metode DPPH, dengan IC50 sebesar 316,29 ± 3,70
µg/mL.
2. Kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri sebesar
3,27 ± 0,018 mg GAE/g.
B. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian aktivitas antioksidan untuk serbuk herba seledri.
2. Perlu dipertimbangkan adanya pengaruh absorbansi larutan uji pada hasil
pengukuran aktivitas antioksidan.
3. Perlu dilakukan orientasi konsentrasi larutan uji yang dibuat agar nilai
absorbansinya masuk dalam range absorbansi kurva baku dan didapatkan hasil
pengukuran yang memenuhi parameter validasi.
70
DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2004, Guidelines for the Validation of Analitical Methods for Active
Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products, 4-5, www.apvma.gov.au/guidelines/downloads /g169_analytical_methods.pdf, diakses tanggal 2 September 2010.
Anonim, 2005, Tanaman Obat Indonesia, Seledri,
http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=127, diakses tanggal 30 April 2010.
Anonim, 2008, Proposal KTI Validasi Metode Pemeriksaan Timbal Dara dengan
AAS, http://ninjabiru.wordpress.com/, diakses tanggal 5 September 2010.
Armala, M. M., 2009, Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir
(Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.
Backer, C.A., dan Bakhuizen van den Brink, 1963, Flora of Java, Vol. I, NV.
P.Noordhooff –Groningen, Groningen, the Netherlands, pp. 3-11. Backer, C.A., dan Bakhuizen van den Brink, 1965, Flora of Java, Vol. II, NV.
P.Noordhooff –Groningen, Groningen, the Netherlands, pp. 171-175. Blois, M.S., 1958, Antioxidant Determinations by the Use of A Stable Free
Radical, Nature, 181 , 1199-1200. Box, J.D., 1983, Investigation of the Folin-Ciocalteu Phenol Reagent for the
Determination of Polyphenolic Substances in Natural Waters, Water Res, 17, 511-525.
Ciz, Milan., Cizova, Hana., Denev, Petko., Kratchanova, Maria., Slavov, Anton.,
dan Lojek, Antonin., 2010, Different Methods for Control and Comparison of Antioxidant Properties of Vegetables, Food Control, 21, 518-523.
Dalimartha, S. dan Sudibyo, M., 1999, Awet Muda dengan Tumbuhan Obat dan
Diet Suplemen, Trubus Agriwidya, 36-40. Dalimartha, S., 2000, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid II, PT. Trubus
Agriwidya, Jakarta, pp. 172
71
Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Applications of Thin Layer Chromatography, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York, pp. 569, 608-611.
Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009,
Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60 (4), 405-412.
Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic
Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, Archives of Biochemistry and Biophysics 315, 161–169.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986, Sediaan Galenik,
Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope
Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7, 1061.
Ebrahimzadeh, M.A., Pourmorad, F., Hafezi, S., 2007, Antioxidant Activities of
Iranian Corn Silk, Turk J Biol, 32, 43-49. Folin, Octo, Ciocalteu, Vintila, 1944, On Tyrosine and Tryptophane
Determinations in Proteins, Jour.Bio.Chem., 73 : 627-650, 1927, in. Todd-Sanford, 10, 412.
Galati, Angie., McKay, Allan., dan Tan, Soon Chye., 2005, Minimising Post-
Harvest Losses of Carrots, Farmnote, 75, 95. Grieb, P., 1992, Antioxidant Systems – Physiology and Pharmacotherapy Trends,
Materia Medica Polona, Fasc. 4 (84), 217-222. Halliwell, B., 1994, Free Radicals and Antioxidants : a Personal View, Nutr. Rev.,
52, 253-265. Halliwell, B., dan Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and
Medicine, Third Edition, Oxford University Press, New York, pp. 368-369.
Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata K. dan Sudiro I., hal. 47-109, Penerbit ITB, Bandung.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan,
Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.
72
Himawati, E.R., 2001, Antioksidan dan Peredam Radikal Bebas Biologis,
Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 55-60. Huang, D., Ou, B., dan Prior, R. L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant
Capacity Assays, J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856. Iqbal, M., dan Endang Sulistyorini, 2008, Seledri (Apium graveolens L.),
http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com/ensiklopedia-tanaman-anti-kanker/s/seledri/, diakses tanggal 30 April 2010.
Jansoon, Ninna, 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green
Tea, http://209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/scess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteu+method+colorimetric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 5 Mei 2010.
Khadambi, T.N., 2007, Antimicrobial Activities of Sorghum CPE and The Effects
of Phenolic Compound Concentration and Bacterial Species on Inhibition, Thesis, 69, University of Pretoria.
Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N.,
2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis 13, 8-17.
Kurniasih, Kepundan, 2008, Daya Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Herba
Kenikir (Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, Fakultas MIPA Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.
Lopez, M., Martinez, F., Del Valle, C., Ferrit, M., dan Luque, R., 2003, Study of
Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method, Talanta, 60, 609-616.
Lu, Y., dan Foo, L.Y., 2000, Antioxidant and Radical Scavenging Activities of
Polyphenols from Apple Pomace, Food Chemistry, 68, 81-85. Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic
Identification of Flavonoid, Springer-Verlag, New York-Heidelberg-Berlin, pp. 1-343.
Madhavi, D.L., Deshpande, S.S., dan Salunkhe, D.K., 1996, Introduction. Food
Antioxidants : Technological, Toxicological, and Health Perspectives, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 1-4.
73
Mann, J., Davidson, R.S., Hobbs, J.B., Banthorpe, D.V., dan Harborne, J.B., 1994, Natural Products: Their Chemistry and Biological Significance, Longman Group UK Limited, London England, pp. 361-367.
Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh
Padmawinata, K., hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.
Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., dan Hansen, U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements, Sensors, 7, 2080-2095.
Masella, R., Di Benedeto, R., Vari, R., Filesi, C., dan Giovannini, C., 2005, Novel
Mechanism of Natural Antioxidant Compounds in Biological Systems : Involvement of Glutathione and Glutathione-Related Enzymes, J. Nutr. Biochem., 16, 577-586.
Mulja, H.M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang
Baik, Majalah Farmasi Indonesia, 3(2), 72, Airlangga University Press, Surabaya.
Mulja, H.M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University
Press, Surabaya, pp. 26-33. Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Analysis, Marcel, Dekker,
Inc., New York, Basel, pp. 585. Niki, E., dan Noguchi, N., 2000, Evaluation of Antioxidant Capacity ; What
Capacity is Being Measured by Which Method?, IUBMB Life, 50, 323-329.
Nusarini, Ni Made Rahayu., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat
Ekstrak Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Reyes, L. Fernando., Villarreal, J. Emilio., dan Cisneros-Zevallos, Luis., 2007,
The Increase of Antioxidant Capacity After Wounding Depends on the Type of Fruit or Vegetable Tissue, Food Chemistry, 101, 1254-1262.
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh
Padmawinata, K., hal.191-213, Penerbit ITB, Bandung. Rohdiana, D., 2001, Aktivitas Daya Tangkap Radikal Polifenol dalam Daun Teh,
Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 53-58.
74
Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147.
Sudarsono, Pudjoanto, A., Gunawan, D., Wahyuono, S., Donatus, I. A., Drajad,
M., Wibowo, S., dan Ngatidjan, 1996, Tumbuhan Obat, Hasil Penelitian, Sifat-sifat dan Penggunaan, Pusat Penelitian Obat Tradisional, UGM, Yogyakarta, pp. 44-52.
Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa
Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, 2 (2), 53-61.
United States Pharmacopeial Convention, 2007, The United States Pharmacopeia
30th The National Formulary 25th, Vol II, United States Pharmacopeial Convention, Inc., New York, pp. 680, 2308.
Veeru, P., Kishor, M.P., dan Meenakshi, M., 2009, Screening of Medicinal Plant
Extracts for Antioxidant Activity, Journal of Medicinal Plants Research, 3(8), 608-612.
Waterhouse, A.L., 2002, Determination of Total Phenolics, Current Protocols in
Food Analythical Chemistry, John Wiley & Sons Inc, I1.1.1-I1.1.8. Windono,T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, A., dan Erowati,
T.I., 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.) Probolinggo Biru dan Bali, Artocarpus, Surabaya, 1 (1), 34-43.
Wiyatsih, Esti., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform Ekstrak
Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Wong, Shih Peng., Leong, Lai Peng., dan Koh, Jen Hoe William., 2005,
Antioxidant Activities of Aqueous Extracts of Selected Plants, Food Chem, 10, 775-783.
Zhu, Q.Y., Hackman, R.M., Ensunsa, J.L., Holt, R.R., dan Keen, C.L., 2002,
Antioxidative Activities of Oolong Tea, J.Agric.Food Chem, 50, 6929-6934.
75
LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman
76
Lampiran 2. Foto tanaman seledri
77
Lampiran 3. Foto percobaan
Penyaringan dengan bantuan Maserasi dengan bantuan shaker corong Buchner dan pompa vakum
Pengeringan fraksi uji di waterbath Ekstrak etanol herba seledri
78
Lampiran 4. Perhitungan rendemen
Bobot herba seledri = 1 kg
Bobot ekstrak etanol = 27,3421 g
Rendemen =
=
= 2,7342% b/b
Bobot fraksi etil asetat = 0,5446 g
Rendemen =
=
= 0,0545% b/b
Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stok DPPH
Pembuatan larutan stok DPPH
Bobot kertas : 0,2455 g
Bobot kertas + DPPH : 0,2495 g
Bobot kertas + sisa : 0,2456 g
Bobot DPPH : 0,0039 g
Konsentrasi larutan stok DPPH = 0,4 mM
79
Lampiran 6. Perhitungan pembuatan larutan stok rutin
Pembuatan larutan stok rutin
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Bobot kertas 0,2473 g 0,2362 g 0,2574 g
Bobot kertas + rutin 0,2499 g 0,2389 g 0,2599 g
Bobot kertas + sisa 0,2475 g 0,2363 g 0,2574 g
Bobot rutin 0,0024 g 0,0026 g 0,0025 g
Konsentrasi larutan stok rutin yang dibuat
Rep I = = 240 µg/mL Rep III = = 250 µg/mL
Rep II = = 260 µg/mL
Lampiran 7. Spektra pelarut metanol
80
Lampiran 8. Penentuan OT rutin
Penentuan Operating Time (OT)
Waktu (menit) 2,4 µg/mL 7,2 µg/mL 12 µg/mL
5 0,752 0,501 0,220
10 0,748 0,495 0,208
15 0,745 0,484 0,185
20 0,743 0,478 0,173
25 0,741 0,472 0,159
30 0,740 0,470 0,156
35 0,740 0,470 0,156
40 0,740 0,470 0,156
45 0,740 0,470 0,156
OT yang diperoleh adalah 30 menit.
Lampiran 9. Spektra larutan pembanding rutin
81
Lampiran 10. Perhitungan pembuatan stok larutan uji
Pembuatan larutan stok fraksi uji
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Bobot cawan 22,1305 g 23,0473 g 25,2348 g
Bobot cawan + fraksi uji 22,2307 g 23,1474 g 25,3348 g
Bobot cawan + sisa 22,1306 g 23,0474 g 25,2348 g
Bobot fraksi uji 0,1001 g 0,1000 g 0,1000 g
Konsentrasi larutan stok fraksi yang dibuat
Rep I = = 4004 µg/mL Rep III = = 4000 µg/mL
Rep II = = 4000 µg/mL
Lampiran 11. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri
Penentuan Operating Time (OT) larutan fraksi uji
Waktu (menit) 400 µg/mL 1200 µg/mL 2000 µg/mL
5 0,689 0,615 0,488
10 0,683 0,590 0,473
15 0,676 0,567 0,451
20 0,665 0,545 0,428
25 0,656 0,525 0,412
30 0,643 0,507 0,389
35 0,643 0,507 0,389
40 0,643 0,507 0,389
45 0,643 0,507 0,389
OT yang diperoleh adalah 30 menit.
82
Lampiran 12. Spektra larutan uji
83
Lampiran 13. Perhitungan pembuatan stok asam galat
Penimbangan larutan stok asam galat
Bobot kertas : 0,2369 g
Bobot kertas + asam galat : 0,2495 g
Bobot kertas + sisa : 0,2370 g
Bobot asam galat : 0,0125 g
Konsentrasi larutan stok asam galat = = 500 µg/mL
Lampiran 14. Spektra asam galat
84
Lampiran 15. Penimbangan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik
total
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Bobot cawan 23,0473 g 22,1305 g 25,2348 g
Bobot cawan + fraksi 23,0675 g 22,1506 g 25,2548 g
Bobot cawan + sisa 23,0474 g 22,1306 g 25,2348 g
Bobot fraksi 0,0201 g 0,0200 g 0,0200 g
Lampiran 16. Penentuan OT untuk penentuan kandungan fenolik total
Waktu (menit)
Absorbansi 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL
5 0,311 0,446 0,583 10 0,317 0,452 0,591 15 0,317 0,452 0,591 20 0,317 0,452 0,591 25 0,317 0,452 0,591 30 0,317 0,452 0,591
OT yang diperoleh adalah 10 menit.
Lampiran 17. Perhitungan kandungan fenolik total
Penentuan kandungan fenolik total larutan uji (ekivalen dengan massa asam galat)
Replikasi I
y = 0,0027 x + 0,1786
0,613 = 0,0027 x + 0,1786
x = 160,889 µg/mL
Replikasi II
y = 0,0027 x + 0,1786
0,609 = 0,0027 x + 0,1786
x = 159,407 µg/mL
85
Replikasi III
y = 0,0027 x + 0,1786
0,607 = 0,0027 x + 0,1786
0,607 = 0,0027 x + 0,1786
Kandungan fenolik total = GAE
Replikasi I
GAE = 160,889 µg/mL = 0,161 mg/mL
= 0,161 mg/mL = 3,284 mg GAE/g
Replikasi II
GAE = 159,407 µg/mL = 0,159 mg/mL
= 0,159 mg/mL = 3,275 mg GAE/g
Replikasi III
GAE = 158,667 µg/mL = 0,159 mg/mL
= 0,159 mg/mL = 3,25 mg GAE/g
86
Lampiran 18. Hasil uji statistik menggunakan program PASW Statistics 18
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
% IC rutin .159 15 .200* .908 15 .127
% IC fraksi etil asetat .152 15 .200* .910 15 .137
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
Independent Samples Test
Levene's
Test for
Equality
of
Variances t-test for Equality of Means
F
Sig
. t df
Sig.
(2-
taile
d)
Mean
Difference
Std.
Error
Differenc
e
95% Confidence
Interval of the
Difference
Lower Upper
IC5
0
Equal
variance
s
assume
d
6.39
9
.06
5
-
144.15
1
4 .000 -
308.2196
67
2.13817
6
-
314.1561
94
-
302.2831
39
Equal
variance
s not
assume
d
-
144.15
1
2.00
2
.000 -
308.2196
67
2.13817
6
-
317.4091
09
-
299.0302
24
87
BIOGRAFI PENULIS
Andy Kurniawan, penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.)”, lahir di Surakarta pada tanggal 9 Februari 1989. Penulis adalah putra dari Bapak Irawan dan Ibu Lo Lan Fie. Penulis menyelesaikan pendidikan di TK Kristen Widya Wacana IV Kartasura pada tahun 1995, SD Kristen Widya Wacana X Kartasura pada tahun 2001, SMP PL Bintang Laut Surakarta pada tahun 2004, dan SMA Negeri 3 Surakarta pada tahun 2007. Penulis melanjutkan studi di program S1 Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama menjadi mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah Praktikum Spektroskopi pada semester ganjil 2009-2010, Praktikum Kromatografi dan Farmakognosi Fitokimia II pada semester genap 2009-2010, Praktikum Farmakognosi Fitokimia I dan Analisis Sediaan Obat Tradisional pada semester ganjil 2010-2011. Penulis juga pernah mengirimkan karya tulis untuk Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dengan judul “Uji Aktivitas Antikanker Herba Ketul (Bidens pilosa) Secara In Vitro Terhadap Kultur Sel Kanker Leher Rahim (HeLa) Dengan Metode MTT”.