UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS GELATIN SAPI …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · Judul Skripsi : Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin babi pada Produk

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS GELATIN SAPI DAN GELATINBABI PADA PRODUK CANGKANG KAPSUL

KERAS OBAT VITAMIN DAN MINERALMENGGUNAKAN FTIR DAN KCKT

SKRIPSI

FATHMAH SYAFIQOH

1110102000001

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2014

ivUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISIS GELATIN SAPI DAN GELATINBABI PADA PRODUK CANGKANG KAPSUL

KERAS OBAT VITAMIN DAN MINERALMENGGUNAKAN FTIR DAN KCKT

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

FATHMAH SYAFIQOH

1110102000001

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

SEPTEMBER 2014

vUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang

dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

viUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Fathmah Syafiqoh

NIM : 1110102000001

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin Babi pada Produk

Cangkang Kapsul Keras Obat Vitamin dan Mineral

Menggunakan FTIR dan KCKT

Disetujui oleh

viiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh


NIM : 1110102000001


Judul Skripsi : Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin Babi pada Produk Cangkang

Kapsul Keras Obat Vitamin dan Mineral Menggunakan FTIR

dan KCKT

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelarSarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran danIlmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif HidayatullahJakarta

Ditetapkan di : Jakarta

Tanggal : 29 Agustus 2014

viiiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK



Judul Skripsi : Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin babi pada Produk

Cangkang Kapsul Keras Obat dan Vitamin Menggunakan

FTIR dan KCKT

Gelatin sering digunakan secara luas dalam industri farmasi pada pembuatancangkang kapsul keras. Penggunaan gelatin pada cangkang kapsul kerasmenimbulkan kontroversi karena adanya kekhawatiran konsumen mengenaikehalalan sumber gelatin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaangelatin sapi dan gelatin babi pada cangkang kapsul keras dengan FTIR(Fourier Transform Infared Spectroscopy) dan KCKT (Kromatografi CairKinerja Tinggi). Analisis Komposisi asam amino pada cangkang kapsul kerasdilakukan dengan KCKT, sampel dihidrolisis terlebih dahulu dengan HCl 6Nkemudian diderivatisasi menggunakan AQC (Aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat). Analisis gugus fungsi pada sampel cangkangkapsul keras dilakukan dengan FTIR, sampel diekstraksi terlebih dahulumenggunakan aseton dingin pada suhu -20oC lalu dianalisis dengan alat FTIRpada panjang gelombang 4000-750cm-1. Setelah itu dilakukan analisis datamenggunakan Principal Component Analysis (PCA) untuk mengklasifikasikanantara gelatin sapi dan babi pada cangkang kapsul keras. Berdasarkan kurvascore plot FTIR standar gelatin babi berada pada kuadran 2 dan standar gelatinsapi berada pada kuadran 1. Pada lembar cangkang kapsul babi berada padakuadran 3 dan lembar cangkang kapsul sapi berada pada kuadran 4.Sedangkan hasil kurva score plote KCKT standar gelatin babi dan lembarcangkang kapsul babi berada pada kuadran 2. Standar gelatin sapi dan lembarcangkang kapsul sapi berada pada kuadran 3. Hasil analisis gelatin sapi dangelatin babi dengan metode FTIR dan KCKT dapat disimpulkan bahwametode FTIR dan teknik kemometrik PCA dapat mengklasifikasikan antaragelatin sapi dan gelatin babi sedangkan analisis menggunakan KCKT danteknik kemometrik PCA dapat membedakan komposisi asam amino padastandar gelatin sapi dan babi serta lembar cangkang kapsul yang dibuatsendiri, tetapi belum bisa membedakan sumber gelatin yang dipakai padaproduk cangkang kapsul keras yang diambil dari pasaran.

Kata kunci: gelatin, cangkang kapsul keras, KCKT, FTIR, PCA

ixUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT



Judul Skripsi : Analysis Bovine Gelatin and porcine Gelatin in Hard Shell

Capsule Products on Drugs and Vitamin Using FTIR dan

HPLC

Gelatin was widely used in pharmaceutical industry for manufacturing of hardshell capsules. The use of gelatin in the capsule caused controversy due toconsumer concerns about halal gelatin source. This study aimed to determinedifferences of bovine and porcine gelatin used in the hard shell capsule byFTIR and HPLC. Analysis of amino acid composition in hard shell capsulewas determined by HPLC, the sample was hydrolyzed with HCl 6N andderivatization with AQC (Aminokuinolil- N- hidroksisuksini- midilcarbamate). Analysis of functional groups in hard shell capsule wasdetermined by FTIR, the samples were extracted using cold acetone at -20°Cand analyzed by FTIR at a wavelength 4000-750cm-1. Analysis of the data wasperformed using the Principal Component Analysis (PCA) to classify betweenbovine and porcine gelatin in hard shell capsule. Based on the score plot curveof FTIR standard gelatin of porcine was in quadrant 2 and standard gelatin ofbovine was in quadrant 1. In sheets of hard shell capsule porcine were inquadrant 3 and sheets hard shell capsule bovine were in quadrant 4. Whilebased on the score plot curve of HPLC standard gelatin of porcine and sheetshard shell capsule porcine were in quadrant 2. Standard gelatin of bovine andsheets hard shell capsule bovine were in quadrant 3. The results of the analysisof bovine and porcine gelatin with FTIR and HPLC could be concluded thatthe FTIR method and technique chemometric PCA can classify betweenbovine and porcine gelatin whereas analysis using HPLC and techniqueschemometric PCA could classify standard bovine and porcine gelatin andcapsule shells self made but was not successful for classification ofcommercial capsule shells.

Keywords : gelatin, hard capsule, HPLC, FTIR, PCA

xUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin atas segala nikmat iman, Islam,

kesempatan, serta kekuatan yang telah diberikan Allah Subhanahuwata’ala

sehingga Penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini.

Shalawat serta salam untuk tuntunan dan suri tauladan Rasulullah

Shallallahu‘alaihiwasallam beserta keluarga dan sahabat beliau yang

senantiasa menjunjung tinggi nilai-nilai Islam yang sampai saat ini dapat

dinikmati oleh seluruh manusia di dunia.

Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk mendapat gelar sarjana

farmasi dari Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah. Judul skripsi ini adalah “uji

aktivitas antibakteri ekstrak daun sintok (Cinnamomum sintoc Blume.)

terhadap Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa serta analisa

komponen senyawa fraksi aktif dengan kromatografi gas – spektrometri

massa”.

Penulis menyadari bahwa keberhasilan penelitian dan penulisan skripsi

ini tidak lepas dari bantuan dan bimbingan dari banyak pihak. Oleh karena itu,

pada kesempatan kali ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si, Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu

Zilhadia, M.Si, Apt selaku pembimbing kedua yang senantiasa dengan

sabar tulus dan ikhlas memberikan arahan, bimbingan, dorongan,

semangat, saran dan solusi selama penelitian dan penulisan skripsi.

2. Prof. Dr. (hc) dr. M.K. Tadjudin, Sp. And. selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan

bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program

ix

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Para laboran Farmasi UIN, Ka Liken, Ka Rahmadi, Ka Eris, Mba Rani,

Ka Lisna dan Ka Tiwi yang telah banyak membantu selama praktikum

maupun penelitian.

6. Mama yang selalu memberikan kasih sayang, semangat dan doa yang

tiada henti serta dukungan baik moral maupun materil dan almarhum

ayah yang telah mendidik dan memberi nasehat semasa beliau ada.

Kasih sayang yang kalian berikan sungguh tak ternilai.

7. Kaka dan adikku tersayang, Rahmi Asyifani yang selalu memberikan

dukungan, semangat dan doa, Rahmah Nur Sabrina yang selalu

mendukung dan memberikan bantuan setiap kali dibutuhkan.

8. Teman – teman seperjuangan dalam penelitian ini yaitu Farida

Kusumaningrum dan Afifah Nurul Izzah yang senantiasa dengan sabar

menemani, mendukung dan membantu disaat sedang dibutuhkan.

9. Teman – teman “ngocol” tersayang Amel, Zakiya, Afifah, Dita, Ipho,

Dias, Diah dan Desi Syifa, terima kasih karena kalian selalu mengerti,

membantu, mendukung dan berbagi cerita disaat senang maupun sedih,

semoga ukhuwah kita akan selalu terjaga sampai kapanpun.

10. Teman – teman “Andalusia” Farmasi 2010 yang solid dan selalu

membantu satu sama lain.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak keterbatasan dan

kekurangan. Oleh Karena itu, dengan segala kerendahan hati, penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi

ini. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan member

sumbangan pengetahuan khususnya di Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu kesehatan, Universtas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta dan pembaca pada umumnya.

Jakarta, 1 September 2014

Penulis

xUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGASAKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) SyarifHidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 1110102000001


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiahsaya, dengan judul :

Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin Babi pada ProdukCangkang Kapsul Keras Obat Vitamin dan Mineral

MenggunakanFTIR dan KCKT

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaituDigital Library Perpustakaan Universitas islam Negeri (UIN) SyarifHidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai denganUndang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buatdengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tanggal :

Yang menyatakan,

xiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL.............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ........................................................................................................vii

KATA PENGANTAR .......................................................................................viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ...................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL............................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................xvii

DAFTAR ISTILAH..........................................................................................xviii

BAB 1 PENDAHULUAN...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang....................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.................................................................................. 3

1.3 Tujuan Penelitian................................................................................... 3

1.4 Manfaat penelitian ................................................................................. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5

2.1 Gelatin ................................................................................................... 5

2.1.1 Definisi Gelatin ............................................................................ 5

2.1.2 Komposisi Kimia Gelatin ............................................................. 5

2.1.3 Sifat Fisika Kimia Gelatin ............................................................ 7

2.1.4 Aplikasi Penggunaan Gelatin ....................................................... 9

2.2 Kapsul.................................................................................................... 9

2.2.1 Cangkang Kapsul Keras ........................................................... 10

2.2.2 Cangkang Kapsul Lunak ............................................................ 11

2.3 Protein.................................................................................................. 12

2.3.1 Struktur Primer ........................................................................... 13

xii


2.3.2 Struktur Sekunder....................................................................... 13

2.3.3 Struktur Tersier........................................................................... 14

2.3.4 Struktur Kuartener ...................................................................... 15

2.4 Asam Amino........................................................................................ 15

2.5 Spektroskopi FTIR .............................................................................. 18

2.6 Analisis Asam Amino dengan KCKT ................................................. 20

2.7 PCA (Principal Component Analysis)................................................. 25

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 27

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian.............................................................. 27

3.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 27

3.2.1 Alat ............................................................................................ 27

3.2.2 Bahan.......................................................................................... 27

3.3 Tahapan Penelitian .............................................................................. 27

3.3.1 Pengumpulan Sampel dari Pasaran ............................................ 27

3.3.2 Pembuatan Lembaran Cangkang Kapsul ................................... 27

3.3.3 Analisis Gelatin dengan FTIR ................................................... 28

3.3.3.1 Pemisahan Titanium Dioksida ...................................... 29

3.3.3.2 Ekstrasi Gelatin............................................................. 29

3.3.4 Analisis Profil Gelatin dengan FTIR........................................ ..29

3.3.5 Analisis Data menggunakan PCA .............................................. 29

3.3.6 Analisis Gelatin dengan KCKT................................................ ..30

3.3.6.1 Hidrolisis Asam Amino ................................................ 30

3.3.6.2 Derivatisasi Asam Amino............................................. 30

3.3.7 Analisis Profil Gelatin dengan KCKT...................................... ..30

3.3.8 Analisis Data menggunakan PCA ............................................ ..31

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 32

4.1 Pengumpulan Sampel Dari Pasaran..................................................... 32

4.2 Pembuatan Lembaran Kapsul ............................................................. 32

4.3 Analisis Gelatin dengan FTIR ............................................................. 33

4.3.1 Pemisahan Titanium Dioksida.................................................... 33

4.3.2 Ekstrasi Gelatin .......................................................................... 34

4.3.3 Analisis Profil Gelatin dengan FTIR.......................................... 35

xiii


4.3.4 Analisis Data menggunakan PCA .............................................. 39

4.4 Analisis Gelatin dengan KCKT........................................................... 44

4.4.1 Hidrolisis Asam Amino.............................................................. 44

4.4.2 Derivatisasi Asam Amino .......................................................... 45

4.5 Analisis Profil Asam Amino dengan KCKT ....................................... 47

4.5.1 Analisis Standar Asam Amino ................................................... 48

4.5.2 Analisis Asam Amino pada Standar Gelatin, Lembar

Cangkang Kapsul Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul

Pasaran........................................................................................ 48

4.6 Analisis Data menggunakan PCA ....................................................... 49

BAB 5 PENUTUP ................................................................................................ 54

5.1 Kesimpulan.......................................................................................... 54

5.2 Saran .................................................................................................... 54

xivUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel

2.1 Komposisi Asam Amino Gelatin Kulit Babi dan Sapi ……………….

2.2 Daftar Rantai Samping Asam Amino …………………………………

3.1 Formulasi Lembaran Cangkang Kapsul Keras ……………………….

4.1 Pengumpulan Sampel Kapsul dari Pasaran …………………………...

4.2 Karakteristik Serapan IR Pada Rantai Peptida ………………………..

4.3 Worksheet pada Penyusunan Standar Gelatin, Lembar Cangkang

Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul dari Pasaran

…………………………………………………………………………

4.4 Kontribusi Masing-Masing Variabel terhadap Nilai Komponen Utama

………………………………………………………………................

4.5 Komposisi Asam Amino pada Standar Gelatin, Lembar Cangkang

Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul dari Pasaran

…………………………………………………………………………

4.6 Worksheet pada Penyusunan Standar Gelatin, Lembar Cangkang

Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul keras dari

Pasaran ………………………………………………………………..

4.7 Kontribusi Masing-Masing Variabel Terhadap Nilai Komponen

Utama …………………………………………………………………

Halaman

6

18

28

32

38

40

40

48

50

50

xvUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Gelatin Berbentuk Serbuk, Serbuk Kasar ……………………….

Gambar 2 Struktur Asam Amino Kolagen dan Gelatin …………………….

Gambar 3 Cangkang Kapsul Keras ………………………………………….

Gambar 4 Cangkang Kapsul Lunak …………………………………………

Gambar 5 Tingkatan Struktur Protein ……………………………………….

Gambar 6 Struktur Asam Amino ……………………………………………

Gambar 7 Ion Amfoter ………………………………………………………

Gambar 8 Asam Amino dalam Suasana Asam ……………………………..

Gambar 9 Asam Amino dalam Suasana Basa ……………………………….

Gambar 10 Skema Kerja Alat FTIR ………………………………………….

Gambar 11 Skema Kerja Alat KCKT ………………………………………...

Gambar 12 Lembaran Cangkang Kapsul Gelatin Keras………………………

Gambar 13 Endapan Gelatin diperoleh dari Hasil Ekstraksi …………………

Gambar 14 Penggabungan Spektrum FTIR Standar Gelatin Babi dan Sapi …

Gambar 15 Penggabungan Spektrum FTIR Lembar Cangkang Kapsul Gelatin

Babi dan Gelatin Sapi …………………………………………….

Gambar 16 Penggabungan Spektrum Gelatin yang Diperoleh dari Produk

Cangkang Kapsul yang Ada Dipasaran ………………………….

Gambar 17 Kurva Score Plot PC1 Dan PC2 pada Standar Gelatin, Lembar

Cangkang Kapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul

Pasaran ……………………………………………………………

Gambar 18 Kurva Loading Plot PC1 Dan PC2 Pada Standar Gelatin, Lembar


Pasaran …………………………………………………………...

Gambar 19 Reaksi Derivatisasi Reagen AQC ……………………………….

Gambar 20 Profil Standar Asam Amino ……………………………………

Gambar 21 Kurva Score Plot PC1 Dan PC2 pada Standar Gelatin, Lembar


Keras dari Pasaran ………………………………………………

8

8

11

11

15

16

16

16

17

19

23

33

34

35

36

39

41

43

46

47

51

xvi


Gambar 22 Kurva Loading Plot PC1 Dan PC2…………………………………... 52

xviiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Kerja …………………………………………………………

Lampiran 2. Interferogram FTIR …………………………………………........

Lampiran 3. Kromatogram KCKT ……………………………………………..

Lampiran 4. Rekaman Pengujian Asam Amino HPLC ……………………….

Lampiran 5. Pembuatan Larutan ……………………......................................

Lampiran 6. Gambar Penelitian ………………………………………………..

59

60

69

78

87

88

xviiiUIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

AABA : α-aminobutyric acid

AMQ : 6-aminoquinoline

AQC : 6-amino-quinolil-N-hidroksisuccinimidil karbamate

BPS : Badan Pusat Statistik

DNA : Deoxyribosa Nucleic Acid

FTIR : Fourier Transform Infrared

GMIA : Gelatin Manufacturers Institute Of America

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

KCKT : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

LCMS : Liquid Chromatography Mass Spectrometry

LPPOM : Lembaga Pengkajian Pangan, Obat-obatan dan Kosmetik

MPA : 3 Mercaptopropionic Acid

MUI : Majelis Ulama Indonesia

NHS : N-hidroksisuccimid

OPA : Orto-phatalaldehyde

PC : Principal Component atau Komponen utama

PCA : Principal Component Analysis

PCR : Polymerase Chain Reaction

PEG : Polietilen Glikol

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis

1UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Gelatin merupakan campuran heterogen dari polipeptida yang

diperoleh melalui hidrolisis kolagen dari jaringan ikat hewan (GMIA, 2012).

Gelatin memiliki sifat yang unik sehingga digunakan secara luas dalam

industri makanan dan farmasi. Dalam industri makanan, gelatin ditemukan

dalam produk seperti jelly, es krim, yogurt, ataupun marshmallow. Industri

farmasi menggunakan gelatin sebagai pembuatan kapsul keras dan lunak,

(Nhari, Ismail & Che Man, 2012).

Gelatin bersumber dari tulang hewan yang berasal dari babi dan sapi.

Gelatin yang berasal dari babi dan sapi mempunyai kualitas yang lebih baik

dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan (Jamaludin et al., 2011).

Meskipun demikian, ada masalah lain yang timbul yaitu status kehalalan

produk dengan bahan baku gelatin dari babi. Gelatin umumnya diimpor dari

negara-negara non-muslim yang tidak memperhatikan kehalalan produk

karena sebagian besar bahan dasarnya bersumber dari babi. Penggunaan kulit

babi sebagai bahan baku gelatin di seluruh dunia mencapai 44,9% dari total

gelatin yang dihasilkan. Eropa Barat merupakan penghasil gelatin terbesar di

dunia yaitu 68% gelatin yang diproduksi berasal dari kulit babi. Penghasil

gelatin kedua terbesar di dunia adalah NAFTA (The North American Free

Trade Agreement), konsorsium tiga negara yaitu Amerika, kanada dan

Meksiko (Jamaludin et al., 2011).

Obat vitamin dan mineral merupakan golongan bebas yang boleh

digunakan tanpa resep dan dapat dijual bebas di warung, toko obat berizin,

supermarket, serta apotek. Sediaan obat vitamin dan mineral sebagian besar

dalam bentuk cangkang kapsul keras dan cangkang kapsul lunak (ISO, 2014).

Cangkang kapsul baik keras maupun lunak banyak menjadi perhatian terkait

status kehalalan gelatin yang digunakan, karena dipasaran banyak beredar

produk kapsul yang tidak mencantumkan label halal pada kemasan. Dalam

jurnal halal LPPOM MUI No.94 edisi Maret-April 2012 baru tiga produk

cangkang kapsul gelatin yang terdaftar dalam produk halal LPPOM MUI. Hal


ini menimbulkan kekhawatiran karena mayoritas penduduk Indonesia adalah

muslim dan membawa konsekuensi perlunya perlindungan konsumen dengan

adanya jaminan kehalalan mengenai sumber gelatin (Jamaludin et al., 2011).

Keberadaan gelatin babi dan sapi dalam produk pangan sangat sukar untuk

diidentifikasi karena memiliki sifat fisika dan kimia yang hampir mirip

(Nemati et al., 2004). Oleh karena itu perlu diupayakan metode yang selektif

untuk membedakan gelatin babi dan gelatin sapi.

Berbagai studi telah dilakukan dengan bermacam-macam metode

analisis untuk membedakan gelatin sapi dan babi (Nhari et al., 2012). Di

antaranya analisis berbasis DNA dengan Real Time PCR (Sahilah et al.,

2012) dan LCMS (zhang et al., 2008). Analisis perbedaan gelatin babi dan

gelatin sapi juga dilakukan dengan menggunakan FTIR (Fourier Transform

Infra Red) (Hasyim et al., 2010). FTIR (Fourier Transform Infra Red)

merupakan metode spektroskopi IR yang banyak digunakan untuk analisis

kehalalan (Rohman and Che Man, 2012). Analisis menggunakan FTIR

banyak dikembangkan karena dinilai lebih mudah, cepat, murah dan ramah

lingkungan. Selain itu, analisis perbedaan antara gelatin sapi dan gelatin babi

dapat dilakukan dengan KCKT (kromatografi cair kinerja tinggi). KCKT

merupakan metode yang banyak digunakan untuk analisis asam amino

ditunjang dengan peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom yang

sangat efisien di bawah tekanan yang besar, sehingga analisis asam amino

dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat

dan teliti (Rediatning et al., 1987). Perkembangan metode analisis

menggunakan FTIR dan HPLC sekarang telah digabungkan dengan teknik

kemometrik yaitu analisis komponen utama. PCA (Principal component

analysis) adalah teknik proyeksi data yang sangat membantu dalam

klasifikasi suatu objek (Miller & Miller, 2005).

Analisis pada produk cangkang kapsul lunak komersial telah dilakukan

menggunakan HPLC berdasarkan profil asam amino dengan metode

derivatisasi ortho-phtalaldehyde (OPA) – 2-mercaptoethanol (MCE) dengan

teknik kemometrik (Widyaninggar et al., 2012). Dari hasil penelitian

widyaninggar tersebut dikatakan bahwa analisis profil asam amino dengan


teknik kemometrik komponen utama dapat mengklasifikasikan cangkang

kapsul lunak yang dibuat dari gelatin sapi dan gelatin babi. Akan tetapi, PCA

(Principal component analysis) belum bisa mengklasifikasikan produk

cangkang kapsul lunak komersial yang beredar dipasaran. Analisis perbedaan

gelatin babi dan gelatin sapi juga telah dilakukan menggunakan FTIR dan

teknik kemometrik. Hasil penelitian tersebut metode FTIR dan teknik

kemometrik komponen utama dapat mengklasifikasikan kedua sumber gelatin

(Hasyim et al., 2010). Pada penelitian ini dilakukan analisis gelatin sapi dan

gelatin babi pada produk cangkang kapsul keras obat yang mengandung

vitamin dan mineral menggunakan FTIR dan HPLC, dikarenakan belum

banyak publikasi tentang pembeda gelatin sapi dan gelatin babi pada produk

cangkang kapsul keras. Penggabungan dua metode ini diharapkan dapat

memberikan data komposisi asam amino dan gugus fungsi dari gelatin sapi

dan gelatin babi yang dapat saling melengkapi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah metode FTIR dapat digunakan untuk membedakan antara

gelatin sapi dan gelatin babi yang terdapat dalam cangkang kapsul keras

pada obat vitamin dan mineral yang beredar dipasaran?

2. Apakah metode HPLC dapat digunakan untuk membedakan antara

gelatin sapi dan gelatin babi yang terdapat dalam cangkang kapsul keras

pada obat vitamin dan mineral yang beredar dipasaran?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui perbedaan antara gelatin babi dan gelatin sapi pada

cangkang kapsul keras obat vitamin dan mineral dengan metode FTIR

2. Mengetahui perbedaan antara gelatin sapi dan babi yang digunakan

pada cangkang kapsul keras obat vitamin dan mineral dengan metode

HPLC


1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi bahwa metode

FTIR dan KCKT dapat digunakan dalam mendeteksi adanya gelatin babi dan

sapi, sehingga metode ini dapat diaplikasikan untuk menguji kandungan babi

dalam gelatin pada cangkang kapsul obat. Manfaat lainnya adalah

memberikan informasi kepada masyarakat tentang kehalalan cangkang kapsul

keras pada obat yang beredar di pasaran.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

2.1.1 Definisi Gelatin

Gelatin merupakan campuran heterogen polipeptida yang diperoleh

melalui hidrolisis parsial kolagen dari jaringan ikat hewan dengan perlakuan

asam atau basa (GMIA, 2012). Gelatin adalah istilah umum untuk campuran

fraksi protein murni yang dihasilkan baik dengan hidrolisis parsial asam (tipe

A gelatin) atau dengan hidrolisis parsial basa (tipe B gelatin) dari kolagen

hewan yang diperoleh dari sapi dan tulang babi, kulit sapi (hide), kulit babi,

dan kulit ikan (Rowe et al., 2009).

Istilah gelatin mulai populer sekitar tahun 1700 dan berasal dari bahasa

latin ‘gelatus’ yang berarti kuat atau kokoh. Secara fisik gelatin berbentuk

padat, kering, tidak berasa dan transparan. Ada tiga sifat yang paling

menonjol pada gelatin yaitu: kemampuan untuk membentuk gel, kekenyalan

dan kekuatan lapisan tinggi. Gelatin merupakan polimer tinggi alami yang

memiliki berat molekular dari 20.000 sampai 70.000. Gelatin ini dipersiapkan

dari bahan yang mengandung kolagen termasuk kulit, tulang dan tendon

dengan pemecahan hidrolisis melalui pendidihan dengan air atau dengan

menggunakan uap panas yang tinggi. (Perwitasari, 2008).

2.1.2 Komposisi Kimia Gelatin

Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir sepertiga

dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyd). Struktur

gelatin yang umum adalah: -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyd-Gly-Pro-.

Kandungan 4Hyd berpengaruh terhadap kekuatan gel gelatin, makin tinggi

asam amino ini, kekuatan gel juga lebih baik. Meskipun diturunkan dari

protein hewani, gelatin tergolong sebagai protein dengan nilai biologis yang

rendah dan sering juga dianggap protein tidak lengkap. Hal ini disebabkan

karena tidak adanya triptophan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino

esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).

6


Gelatin terutama mengandung asam amino glisin sebesar 33% , prolin 22%

dan hidroksiprolin 22 %. Gelatin komersial terdiri dari 84–90% protein, 8-

12% air dan 2-4 % adalah garam mineral.

Tabel 2.1 Komposisi asam amino gelatin kulit sapi dan kuilt babi

Asam amino BSG (residu per

1000 total residu

asam amino)

PSG (residu per 1000

total residu

asam amino )

Non polar

hidrofobik Alanin

Valin

Leusin

Isoleusin

Fenilalanin

Metionin

Prolin

Total

33

10

12

7

10

4

63

139

80

26

29

12

27

10

151

335

Polar tidak

bermuatan Glisin

Serin

Threonin

Tirosin

Total

108

15

10

2

135

239

35

26

7

307

Asam polar

Asam aspartat

Asam glutamat

Total

17

34

51

41

83

124

7


Sumber : (Nhari et al.,2011)

Komposisi asam amino mempengaruhi sifat fisika dan kimia gelatin.

Analisis asam amino gelatin menunjukkan bahwa struktur molekul gelatin

memiliki perbedaan yang terlihat pada kandungan asam amino (Nhari et al.,

2011). Gelatin memiliki kadar asam amino yang rendah pada metionin,

sistein dan tirosin. Hal ini disebabkan karena ketiga asam amino ini

mengalami kerusakan karena hidrolisis pada proses pembuatan gelatin

(Hafidz et al., 2011). Perbedaan komposisi asam amino pada gelatin kulit

sapi dan kulit babi ditunjukkan oleh tabel 2.1

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa komposisi asam amino

dinyatakan sebagai residu per 1000 residu asam amino. Bovine skin gelatin

(BSG) dan Porcine skin gelatin (PSG) keduanya memiliki kandungan glisin,

prolin dan arginin dalam jumlah yang tinggi. PSG mengandung jumlah asam

amino glisin, prolin dan arginin yang lebih tinggi dibandingkan dengan BSG.

Kedua gelatin memiliki jumlah tirosin yang rendah dan histidin tidak

terdeteksi pada keduanya (Nhari et al., 2011).

2.1.3 Sifat Fisika Kimia Gelatin

Fraksi protein pada gelatin hampir seluruhnya terdiri atas berbagai

macam asam amino yang bergabung melalui ikatan amida dan membentuk

polimer yang linear. Gelatin memiliki berat molekul yang bervariasi yaitu 20

kDa sampai 200 kDa. Gelatin tidak larut dalam aseton, kloroform, etanol

(95%), eter, dan methanol. Larut dalam gliserin, asam, dan basa meskipun

asam kuat atau alkalis dapat menyebabkan pengendapan (Rowe et al., 2009).

Basa polar

Lisin

Arginin

Histidin

Total

11

47

Tidak terdeteksi

58

27

111

Tidakterdeteksi

138

8


Sumber : Schrieber, 2007

Gambar 1. Gelatin berbentuk serbuk , serbuk kasar

Gelatin merupakan sistem koloidal padat (protein) dalam cairan (air)

sehingga pada suhu dan kadar air yang tinggi gelatin mempunyai kemampuan

cairan yang disebut fase sol, sebalinya pada suhu dan kadar air yang rendah

gelatin mempunyai kemampuan yang lebih kasar atau lebih pekat strukturnya,

yang disebut fase gel. Pemanasan dan penambahan air akan mengubah gelatin

menjadi fase sol, sebaliknya pendinginan dan pengurangan air akan

mengubah gelatin menjadi fase gel (Jannah, 2008). Hal ini seperti terlihat

pada Gambar.

Sumber: http://www.gelatin.in

Gambar 2. Struktur Asam Amino Kolagen dan Gelatin

9


Gelatin larut dalam air minimal pada suhu 490C, atau biasanya pada

suhu 600C sampai 700C (Ward dan Court, 1997). Gelatin tidak larut dalam

air dingin, tetapi hanya akan mengembang. Perendaman dalam air dingin

menjadikan gelatin lunak dan berangsur-angsur menyerap air 5 sampai 10

kali bobotnya. Gelatin larut dalam air panas. Setelah pendinginan sampai 35-

40°C, membentuk gel. Pada suhu 40°C, berbentuk sol (Singh et al., 2002).

2.1.4 Aplikasi Penggunaan Gelatin

Gelatin banyak digunakan di berbagai industri pangan, farmasi dan

fotografi. Dalam industry pangan gelatin sebagai pembentuk gel, agen

pembentuk busa, pengental, plasticizer, emulsifier, dan memperbaiki tekstur.

Gelatin banyak digunakan dalam produk susu dan roti terutama pada es krim,

yogurt, keju dan kue. Selain itu gelatin juga digunakan dalam industri

makanan lain seperti cokelat, es krim, marshmallow, permen, permen karet,

mentega, dan sosis (Sahilah et al., 2012).

Gelatin bernilai bagi industri farmasi karena dapat dibuat dalam

berbagai formulasi. Gelatin banyak digunakan pada larutan, sirup, tablet,

tablet salut gula, inhalansia, vagina, dan topikal dan suntikan. Gelatin juga

digunakan untuk membentuk kapsul gelatin keras dan lunak sebagai

pembentuk lapisan film (Singh et al., 2002). Gelatin juga digunakan dalam

bentuk spons untuk mengobati luka dan sebagai koloid untuk menambah

plasma pada luka yang banyak kehilangan darah (Nhari et al., 2012).

Penggunaan gelatin dalam farmasi karena membantu untuk melindungi obat-

obatan terhadap pengaruh berbahaya, seperti cahaya dan oksigen. Kapsul

lunak misalnya terutama digunakan untuk bahan cairan, sedangkan kapsul

keras yang digunakan untuk bahan serbuk (Sahilah et al., 2012).

2.2 Kapsul

Kapsul berasal dari bahasa latin “capsula” yang artinya wadah kecil.

Dalam ilmu farmasi, kapsul merupakan wadah kecil untuk melindungi obat.

Kapsul termasuk bentuk sediaan padat yang dapat diisikan obat atau zat kimia

yang berbentuk serbuk, granul, pasta, atau cair. Berdasarkan elastisitas dan

10


komponen pembentuknya, kapsul dapat dibagi menjadi dua kategori yaitu

kapsul keras (dua cangkang) dan kapsul lunak (satu cangkang). Bahan utama

yang digunakan dalam pembuatan cangkang kapsul keras dan cangkang

kapsul lunak pada umumnya sama, yaitu gelatin, air, dan pewarna. Namun

yang membedakannya adalah bahan tambahan lainnya dan cara

pembuatannya. Selain terbuat dari gelatin, kapsul dapat terbuat dari HPMC,

PVA, dan Starch. (Rabadiya, 2013).

2.2.1 Cangkang Kapsul Keras

Sebagian besar produk kapsul terbuat dari kapsul gelatin keras.

Cangkang kapsul keras gelatin harus dibuat dalam dua bagian yaitu badan

kapsul dan bagian tutupnya yang lebih pendek. Kedua bagian saling menutupi

bila dipertemukan, bagian tutup akan menyelubungi bagian tubuh secara tepat

dan ketat. Cangkang kapsul kosong terbuat dibuat dari campuran gelatin,

gula, dan air, jernih tidak berwarna dan pada dasarnya tidak berasa. Gelatin

USP dihasilkan dari hidrolisis sebagian dari kolagen yang diperoleh dari

kulit, jaringan ikat putih dan tulang binatang-binatang (Ansel, 2005)

Gelatin bersifat stabil di udara bila dalam keadaan kering, akan tetapi

mudah mengalami penguraian oleh mikroba bila menjadi lembab atau bila

disimpan dalam larutan berair. Oleh karena itu kapsul yang lunak

mengandung lebih banyak uap air daripada kapsul keras. Biasanya kapsul

keras gelatin mengandung uap air antara 9-12%. Bilamana disimpan dalam

lingkungan dengan kelembaban yang tinggi, penambahan uap air akan

diabsorbsi oleh kapsul dan kapsul keras ini akan rusak dari bentuk

kekerasannya. Sebaliknya dalam lingkungan udara yang sangat kering,

sebagian dari uap air yang terdapat dalam kapsul gelatin mungkin akan hilang

dan kapsul ini menjadi rapuh serta mungkin akan remuk bila dipegang

(Ansel, 2005). Jenis bahan untuk pengisian ke dalam kapsul gelatin keras

terdiri dari dry solid (Bubuk, pelet, butiran atau tablet), semisolid (suspensi

atau pasta), cairan (cairan non-air) (Rabadiya, 2013). Sebuah kapsul gelatin

keras yang sempurna harus memiliki spesifikasi sebagai berikut:

11


Kekuatan Gel 200-300 Bloom, tergantung pada jenis gelatin

Viskositas (60 ° C/6-23% w/w dalam air) 44-60 MPa, tergantung pada

tipe gelatin

Sumber: www.pharmaceutical-technology.com

Gambar 3. Cangkang kapsul keras

2.2.2 Cangkang Kapsul Lunak

Gelatin lunak disebut juga softgel atau lunak elastis. Kapsul terdiri dari

satu bagian cangkang lunak yang disegel kedap udara. Kapsul dibuat dengan

menambahkan plasticizer seperti gliserin atau sorbitol, plasticizer membuat

gelatin bersifat elastis. Kapsul gelatin lunak terdiri dari berbagai bentuk

seperti bulat, elips, persegi panjang. Kapsul gelatin lunak dapat mengandung

cairan non-air, suspensi, bahan seperti bubur, atau serbuk kering. Kapsul

gelatin lunak ini menjadi sangat penting bila diisi dengan obat dari bahan-

bahan yang mudah menguap atau obat yang mudah mencair bila terkena

udara (Rabadiya, 2013).

Sumber : www.alibaba.com

Gambar 4. Cangkang Kapsul lunak

12


Kapsul gelatin lunak harus memiliki spesifikasi sebagai berikut :

Kekuatan Gel 150-200 Bloom, tergantung pada jenis gelatin

Viskositas (60°C/6-2/3% b / b dalam air) 2,8-4,5 MPa s, tergantung pada

tipe gelatin

Ukuran partikel yang baik untuk memungkinkan disolusi yang cepat.

Pada gelatin konsentrasi tinggi kapsul lunak bentuknya bagus dan lebih

mudah ditelan oleh pasien.

Kapsul gelatin lunak dapat digunakan untuk mengisi macam-macam

jenis bahan, bentuk cair dan kering. Cairan yang dapat dimasukkan ke

dalam kapsul gelatin lunak termasuk :

1. Tidak tersatukan dengan air, cairan yang mudah menguap dan tidak

menguap, seperti minyak nabati, hidrokarbon aromatik dan

hidrokarbon alifatik.

2. Tersatukan dengan air, cairan yang tidak menguap seperti polietilen

glikol dan surfaktan nonionik

3. Tersatukan dengan air dan kelompok kompnen yang tidak meguap

seperti propilen glikol dan isopropil alcohol (Ansel, 1989).

2.3 Protein

Protein berasal dari kata proteos yang berarti pertama atau utama.

Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau

manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein

yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam

pembentukan dan pertumbuhan tubuh (Podjiadi,1994). Protein adalah polimer

dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein

mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur

logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 2004). Komposisi rata rata unsur

kimia yang terdapat dalam protein adalah karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen

23%, nitrogen 16%, belerang 0 – 3 % dan fosfor 0 – 3 %. Protein mempunyai

molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan.

Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim , protein akan

menghasilkan asam asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat

13


dalam molekul protein. Asam asam amino ini terikat satu dengan lain oleh

ikatan peptida. Protein mudah dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH dan pelarut

organik (Poedjiadi, 1994). Terdapat empat tingkatan struktur yang saling

mempengaruhi konformasi fungsional biologis dari protein, yaitu:

2.3.1 Struktur Primer

Struktur ini merupakan urutan asam amino penyusun protein yang

disebutkan dari N-terminal (kiri) ke C-terminal (kanan). Ikatan peptida

kovalen merupakan satu-satunya jenis ikatan yang terlibat pada tingkat

struktur protein ini. Penetapan struktur primer suatu polipeptida atau protein

dapat dilakukan dengan beberapa metode, salah satunya, hidrolisis protein

dengan asam kuat (misalnya HCL 6 N), yang diikuti oleh pemisahan dan

identifikasi konstituen-konstituen dari hidrolisat (produk hidrolisis). Salah

satu pereaksi yang umum dipakai untuk menetapkan asam amino N-terminal

adalah 2,4-dinitrofluorobenzena (pereaksi Sanger). Selama bereaksi, atom

fluor menjalani pergantian nukleofilik oleh gugus amino bebas. Tripeptida

termodifikasi ini kemudian dihidrolisis, produk-produknya dipisahkan, dan

asam aminonya dimodifikasi dengan 2,4-dinitroflourobenzena sehingga dapat

diidentifikasi dengan kromatografi karena berwarna kuning. Enzim

karboksipeptidase mengkatalis dengan efektif reaksi pembelahan hidrolitik

pada ujung C-terminal dari peptide tersebut. Dengan demikian asam amino

C-terminal bisa diidentifikasi dengan segera. Struktur primer akan

menentukan sifat dasar protein dan bentuk struktur sekunder serta tersier. Bila

protein mengandung banyak asam amino dengan gugus hidrofobik, daya

kelarutannya kurang dalam air dibandingkan dengan protein yang banyak

mengandung asam amino dengan gugus hidrofil (Winarno, 2004, h. 65).

2.3.2 Struktur Sekunder

Struktur sekunder protein berkaitan dengan pelipatan struktur primer.

Ikatan hidrogen antara nitrogen amida dan oksigen karbonil merupakan gaya

yang menstabilkan yang utama. Ikatan ini dapat terbentuk antara bagian yang

berbeda pada rantai polipeptida yang sama atau antara rantai yang

14


berdampingan (Deman, 1997, h.110). Berbagai bentuk struktur sekunder

yaitu:

a. Alpha-helix, terbentuk oleh ‘backbone’ ikatan peptida yang membentuk

spiral, dinamakan alpha karena ketika dilihat tidak lurus dari atas, arah

putarannya adalah searah jarum jam menjauhi pengamat. Satu putaran

terdiri atas 3,6 residu asam amino. Struktur ini terbentuk karena adanya

ikatan hidrogen antara atom O pada gugus CO dengan atom H pada

gugus NH.

b. Beta-sheet (lempeng beta), terbentuk karena adanya ikatan hidrogen

atau ikatan tiol (S-H). Ikatan hidrogen terjadi antara dua bagian rantai

yang pararel sehingga membentuk lembaran yang berlipat-lipat.

c. Beta-turn (lekukan beta)

d. Gamma-turn (lekukan gamma)

2.3.3 Struktur Tersier

Struktur ini menggambarkan keseluruhan rantai polipeptida yang

dapat melipat atau menggulung sehingga membentuk struktur 3 dimensi yang

tepat. Pembentukan struktur tersier menyebabkan terbentuknya satuan yang

tersusun padat dan rapat dengan sebagian besar residu asam amino polar

terletak pada bagian luar dan dihidrasi. Hal ini mengakibatkan sebagian besar

rantai samping apolar berada pada bagian dalam dan sebenarnya tidak ada

hidrasi (Deman, 1997). Pelipatan dipengaruhi oleh interaksi antara gugus

samping (R) satu sama lain. Interaksi yang terlibat yaitu:

a. Ikatan ion, terjadi antara gugus samping yang bermuatan positif dan

gugus negatif.

b. Ikatan hidrogen, terjadi antar gugus samping, seperti –OH, -COOH, -

CONH2, atau –NH2.

c. Jembatan Sulfida, seperti pada sistein yang memiliki gugus samping –SH

yang dapat membentuk ikatan sulfida dengan –SH sistein lainnya. Ikatan

ini berupa ikatan kovalen sehingga lebih kuat dibandingkan dengan

ikatan yang lain.

d. Gaya Dispersi Van der Waals.

15


2.3.4 Struktur Kuartener

Polipeptida yang sudah memiliki struktur tersier dapat saling

berinteraksi dan bergabung menjadi suatu multimer. Struktur kuartener

menggambarkan pengaturan sub unit protein dalam ruang (Styer, 2000).

Struktur ini berkaitan dengan interaksi intermolekuler dimana dua atau lebih

rantai polipeptida berasosiasi secara spesifik membentuk protein oligomerik

yang secara biologis aktif.

Sumber : www.sciencebiotech.net

Gambar 5. Tingkatan struktur protein

2.4 Asam Amino

Asam amino merupakan unit penyusun protein. Satu atom C sentral

yang mengikat secara kovalen gugus amino, gugus karboksil, satu atom H

dan rantai samping (gugus R), ditunjukkan pada gambar struktur Asam

Amino.

15











2.4 Asam Amino




Amino.

15











2.4 Asam Amino




Amino.

16


Sumber: www.sciencebiotech.net

Gambar 6. Struktur Asam Amino

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam

pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Apabila asam

amino dilarutkan dalam air, gugus karboksilat akan melepaskan ion H+,

sedangkan gugus amina akan menerima ion H+, seperti pada reaksi berikut

(Poedjiadi, 2009)

COOH ↔ COO- + H+

NH2 + H+ ↔ NH3+

Dengan adanya kedua gugus tersebut, asam amino dalam larutan dapat

membentuk ion yang bermuatan positif dan negatif atau disebut juga ion

amfoter (zwitter ion).

Sumber : Poedjiadi, 2009

Gambar 7. Ion amfoter (Zwitterion)

Keadaan ini bergantung pada pH larutan. Jika asam amino dalam air

ditambahkan asam, maka konsentrasi ion H+ yang tinggi mampu berikatan

dengan ion -COO- sehingga membentuk gugus –COOH. Dalam suasana asam

molekul protein akan membentuk ion positif.


Gambar 8. Asam amino dalam suasana asam

16








(Poedjiadi, 2009)

COOH ↔ COO - + H+

NH2 + H+ ↔ NH3+












16








(Poedjiadi, 2009)

COOH ↔ COO - + H+

NH2 + H+ ↔ NH3+












17


Sedangkan dengan penambahan basa, konsentrasi ion –OH- yang tinggi

mampu mengikat ion-ion H+ pada gugus - NH3+.

Sumber : (Poedjiadi, 2009)

Gambar 9. Asam amino dalam suasana basa

Gugus fungsional pada asam amino merupakan atom karbon

tetrahedral atau dikenal sebagai C alpha (Cα). Asam amino dibedakan pada

rantai samping (gugus R) yang terikat pada Cα. Gugus R yang berbeda-beda

menentukan: struktur, ukuran, muatan elektrik, dan sifat kelarutan di dalam

air (Nelson, D.L., & Cox, M.M,2005). Berdasarkan polaritas atau

kecenderungan berinteraksi dengan air pada pH biologis (dekat pH 7,0)

terdapat lima golongan asam amino yaitu (Nelson, D.L., & Cox, M.M,2005):

1. Asam amino dengan gugus R non polar, bersifat hidrofobik dan memiliki

gugus R alifatik seperti glisin, alanin, valin, metionin, leusin, isoleusin

dan prolin.

2. Asam amino dengan gugus R polar, bersifat hidrofilik (mudah larut dalam

air) tetapi tidak bermuatan seperti serin, threonin, sistein, asparagin,

glutamin.

3. Asam amino dengan gugus R aromatik, bersifat relatif non polar,

hidrofobik seperti fenilalanin, tirosin dan triptofan. Asam amino aromatik

mampu menyerap sinar UV λ 280 nm sehingga sering digunakan untuk

menentukan kadar protein.

4. Asam amino dengan gugus R bermuatan positif pada pH netral, bersifat

polar mempunyai gugus yang bersifat basa pada rantai sampingnya,

seperti lisin, arginin, dan histidin.

5. Asam amino dengan gugus R bermuatan negatif pada pH fisiologis,

mempunyai gugus karboksil pada rantai sampingnya, seperti asam

aspartat dan asam glutamate.

17















dan prolin.



glutamin.











17















dan prolin.



glutamin.











18


Tabel 2.2. Daftar rantai samping asam amino

Asam

Amino

Rantai Samping Asam

Amino

Rantai Samping

Asam

Aspartat

—CH2—COOH Tirosin

Serin —CH2—OH Lisin —(CH2)4—H2N

Glutamat —(CH2)2—COOH Metionin —(CH2)2— SCH3

Glisin —H Valin —CH2(CH3)2

Treonin —CHOH—CH3 Leusin —CH2—CH(CH3)2

Alanin —CH3 Sistein —CH2—SH

Sumber : Bailey, 1990

2.5 Spektroskopi FTIR (Fourier Transform Infared Spectroscopy)

Spektroskopi FTIR merupakan salah satu teknik analisa yang tersedia

bagi para ilmuwan saat ini. Spektroskopi FTIR merupakan suatu teknik yang

didasarkan pada vibrasi atom dalam suatu molekul. Spektrum dihasilkan

melalui pelewatan sinar inframerah pada sampel uji dan kemudian

dilanjutkan dengan penentuan fraksi dalam molekul yang menyerap sinar

tersebut pada tingkatan energi tertentu. Energi pada tiap puncak dalam

spektrum absorbsi yang muncul berhubungan dengan frekuensi vibrasi dari

bagian senyawa dari sampel tersebut. Keuntungan analisa menggunakan alat

ini adalah dapat menguji semua bentuk sampel berupa cairan, larutan, pasta,

serbuk ataupun gas.

Infra Red (IR) menyangkut interaksi antara radiasi cahaya di daerah

infra merah dengan materi. Spektra Infra Red dari suatu senyawa

memberikan gambaran keadaan dan struktur molekul. Spektra IR biasa

dihasilkan dengan mengukur absorpsi radiasi di daerah IR. Analisa Infra Red

lebih banyak digunakan untuk analisa bahan-bahan organik, tetapi kadang-

kadang juga untuk molekul poliatomik anorganik atau organometalik. Proses

instrument spektroskopi FTIR diantaranya adalah :

18



Asam

Amino

Rantai Samping Asam

Amino

Rantai Samping

Asam

Aspartat


















serbuk ataupun gas.








18



Asam

Amino

Rantai Samping Asam

Amino

Rantai Samping

Asam

Aspartat


















serbuk ataupun gas.








19


1. Sumber energi: energi infra merah dipancarkan dari sebuah sumber

yang disebut glowing black-body. Sinar ini kemudian melewati celah

yang dapat mengontrol jumlah energi yang mengenai sampel.

2. Interferometer: sinar memasuki interferometer dimana spectral

encoding berlangsung. Sinar tersebut nantinya akan diubah menjadi

sinyal interferogram yang kemudian akan keluar dari interferometer.

3. Sampel : sinar memasuki ruang sampel, sinar ini akan diteruskan atau

dipantulkan oleh permukaan sampel, tergantung pada jenis analisis

yang diinginkan.

4. Detektor : sinar diteruskan ke detektor untuk pengukuran akhir.

Detektor yang digunakan secara khusus dirancang untuk mengukur

sinyal interferogram khusus.

5. Komputer : sinyal yang diukur didigitalkan dan dikirim kekomputer

dimana Fourier transformasi berlangsung. Spektrum inframerah

terakhir ini kemudian disajikan kepada pengguna untuk interpretasi.

Sumber : www.chem.is.try.org

Gambar 10. Skema Kerja Alat FTIR

Untuk ahli kimia organik, fungsi utama dari spektroskopi IR adalah

untuk mengidentifikasi struktur molekul khususnya gugus fungsional.

Dengan adanya interferometer dan penggunaan laser sebagai sumber radiasi

serta komputer untuk memproses data, maka metode pengukuran dengan

spektroskopi IR berkembang dengan adanya metode baru yaitu FTIR

19










yang diinginkan.














19










yang diinginkan.














20


(Fourier Transform Infa Red). Dengan metode ini spektroskopi IR dapat

menyerap radiasi hingga frekuensi 4000-400 cm-1. Perbedaan antara

spektroskopi FTIR dengan spektroskopi IR adalah pada pengembangan

sistem optiknya sebelum berkas sinar infra merah melewati sampel.

Hampir semua molekul menyerap sinar inframerah, kecuali molekul

diatomik homonuklear seperti O2, N2 dan H2. Spektra IR dari molekul

poliatomik relatif kompleks karena adanya beberapa kemungkinan transisi

vibrasi, adanya overtone dan perubahan pita. Namun demikian pita absorpsi

untuk beberapa gugus fungsi tertentu cukup tajam dan karakteristik.

Keseluruhan spektra IR dari satu molekul tertentu adalah karakteristik

sehingga sangat berguna untuk mengidentifikasi senyawa. Ada beberapa hal

yang harus diperhatikan agar terjadi peresapan radiasi inframerah yaitu :

1. Absorpsi terhadap radiasi inframerah dapat menyebabkan eksitasi

molekul ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi.

2. Vibrasi yang normal mempunyai frekuensi sama dengan frekuensi radiasi

elektromagnetik yang diserap.

3. Proses absorpsi (spectra IR) hanya dapat terjadi apabila terdapat

perubahan baik nilai maupun arah dari momen dua kutub ikatan.

ATR adalah peralatan dimana sampel ditempatkan dipermukaan

kontak dengan elemen ATR (ZnSe kristal, 45oujung). ATR digunakan untuk

sampel yang menggunakan pelarut air seperti gelatin. Kelebihan

menggunakan ATR yaitu sensitifitasnya tinggi, tidak memerlukan preparasi

sampel dan dapat meningkatkan reprodusibilitas antar sampel.

2.6 Analisis Asam Amino dengan KCKT (Kromatografi Cair KinerjaTinggi)

Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam

amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi adanya

asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin dengan

sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas, kemudian

kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya. Hidrolisis dapat

21


dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat, atau menggunakan enzim

spesifik untuk memperoleh asam amino (Bailey ,1990 ).

Pada hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6M, suhu 1100

C dan waktu 24 jam. Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang

tertutup. Sementara itu pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus

dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M pada 1000C.

Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein, serin dan treonin.

Selain itu adapula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk

menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang

dapat dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal sebagai

peptidase. Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan

peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N.

Tahap selanjutnya, yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah

dengan cara kromatografi. Diantara teknik kromatografi yang dapat dilakukan

untuk pemisahan yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi kertas, dan

kromatografi cair kinerja tinggi ( Bailey ,1990 ).

Kromatografi penukar ion umumnya sangat efisien dalam memisahkan

campuran asam amino. Metode ini menggunakan kolom penukar ion secara

paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel sehingga

teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis campuran

asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan asam amino

berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki afinitas kuat

terhadap molekul air ,yang terbentuk oleh ikatan hidrogen dengan gugus OH

pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat dipisahkan dengan

sempurna dengan kromatografi kertas sederhana,maka kromatogram dua

dimensi dapat digunakan.

Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat

memisahkan dua atau tiga komponen dalam suatu campuran. HPLC atau

biasa disebut Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikembangkan pada

akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an. KCKT merupakan salah satu teknik

kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan

pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik

22


KCKT didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit dalam

kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar. Pada prakteknya,

pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan

satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan

menggunakan teknik kurva kalibrasi.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan sistem

pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena

didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan

tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT) mampu menganalisa berbagai cuplikan secara

kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun

campuran. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi,

lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah

untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa

biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa

yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan

untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam

amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis,

menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.

Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa,

fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan ke

dalam fasa gerak dengan penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase gerak dan

fase diam. Fase gerak berupa zat cair yang disebut eluen atau pelarut,

sedangkan fase diam berupa silika gel yang mengandung hidrokarbon (Pare,

J.R.J., & Belanger, J.M.R, 1997). Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri

atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran

fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung

buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator

atau perekam.

23


Sumber : www.chem-is-try.org

Gambar 11. Skema Kerja Alat HPLC

Dari diagram alat diatas akan dijelaskan secara singkat komponen HPLC

(High Performance Liquid Chromatography):

1. Pompa : Fase gerak dalam HPLC sudah tentu zat cair dan untuk

menggerakkannya melalui kolom diperlukan adanya pompa.

2. Injektor : Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom

diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.

3. Kolom : Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan analisis

bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat.

4. Detektor : Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen

cuplikan didalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang

baik sangat peka, tidak banyak berbunyi, rentang tanggapan linearnya

lebar dan menanggapi semua jenis senyawa (Johnson dan Stevenson,

1991).

Keuntungan metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

adalah :

1. Waktu analisis cepat

2. Mempunyai daya pisah yang baik dan Kolom dapat digunakan kembali

3. Peka dan Mudah memperoleh kembali cuplikan

24


4. Ideal untuk molekul besar dan ion ( Johnson dan Stevenson, 1991).

KCKT banyak digunakan untuk analisis asam amino karena analisa

memerlukan waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti.

Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor UV atau detektor

fluoresen. Akan tetapi kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan

baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel. Dalam hal ini asam amino

harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya membentuk derivat yang dapat

menyerap cahaya UV, tampak, atau berfluoresensi (Rediatning & Kartini

1987, h. 2-3).

Tujuan dari derivatisasi pada HPLC untuk meningkatkan deteksi,

mengubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan

puncak kromatogram yang lebih baik, mengubah matriks sehingga diperoleh

pemisahan yang lebih baik, dan menstabilkan analit yang sensitif. Suatu

reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yaitu

produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau

sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat

dideteksi dengan spektrofotometri, proses derivatisasi harus cepat dan

menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100%), produk hasil

derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi, serta sisa

pereaksi untuk derivatisasi tidak mengganggu ketika pemisahan pada

kromatografi ( Abdul Rohman et al., 2007 ).

Ada dua macam derivatisasi yaitu derivatisasi pascakolom dan

derivatisasi prakolom. Beberapa metode menggunakan pacakolom

derivatisasi di mana asam amino yang dipisahkan pada kolom pertukaran ion

diikuti dengan derivatisasi dengan ninhidrin, o-phthalaldehyde. Pada

derivatisasi pascakolom, pemisahan asam amino berdasarkan pertukaran ion

antara gugus amino yang terprotonasi dengan ion Na+ dari resin penukar

kation (R-SO3-NA+) pada pH rendah. Pendekatan lain adalah untuk

derivatisasi asam amino sebelum pemisahan pada kolom HPLC fase terbalik

seperti fenil isothiosianat; 6-amino-quinolil-N-hidroksisuccinimidil

karbamate; 9-fluorenil metil kloroformate (Cooper et al., vol. 159). Pada

25


kromatografi fase terbalik, silika non polar dimodifikasi melalui perlekatan

rantai-rantai hidrokarbon panjang berupa atom karbon 8 atau 18 dan

menggunakan pelarut polar berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk

interaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der

waals. Senyawa ini juga kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan

waktu untuk pemutusan hidrogen, sehingga senyawa non polar akan tertahan

lebih lama di dalam kolom, sedangkan molekul-molekul polar akan bergerak

lebih cepat melalui kolom.

2.7 PCA (Principal Component Analysis)

Teknik menggunakan kemometri untuk menginterpretasi sejumlah

besar data yaitu PCA (Principle Component Analysis). PCA adalah teknik

untuk menentukan komponen utama yang merupakan kombinasi linier dari

variabel asli. Analisis data komponen utama menggunakan software Minitab

15. Analisis komponen utama dilakukan dengan cara menghilangkan korelasi

diantara variabel bebas melalui transformasi variabel bebas asal ke variabel

baru yang tidak berkorelasi sama sekali atau multikolinearitas. PCA juga

digunakan untuk mengurangi dimensi dari satu set data, tetapi bisa

memberikan informasi terhadap seluruh variabel asli (Miller, J.N., & Miller,

J.C. 2005). Berdasarkan Kaiser Criterion, komponen utama atau Principal

Component (PC) yang digunakan adalah PC dengan eigen value (nilai ciri

atau varians setiap komponen utama) lebih dari 1 sedangkan proporsi

keragaman yang dianggap cukup mewakili total keragaman data jika

keragaman kumulatif mencapai 70-80% (Miller, J.N., & Miller, J.C. 2005).

Komponen utama dibentuk berdasarkan urutan varians yang terbesar

hingga terkecil. Komponen utama pertama (PC1) merupakan kombinasi linier

dari seluruh variabel yang diamati dan memiliki varians terbesar. Komponen

utama kedua (PC2) merupakan kombinasi linier dari seluruh variabel yang

diamati yang bersifat ortogonal terhadap PC1 dan memiliki varians kedua

terbesar. Komponen utama ke-n (PCn) merupakan kombinasi linier dari

seluruh variabel yang diamati yang bersifat ortogonal terhadap PC1, PC2,

26


PC(n-1) dan memiliki varians terkecil. Sebagian besar variasi (keragaman

atau informasi) dalam keseluruhan variabel cenderung berkumpul pada

komponen utama pertama, dan semakin sedikit informasi dari variabel asal

akan berkumpul pada komponen utama terakhir. Komponen utama bersifat

orthogonal (Miller, J.N., & Miller, J.C. 2005).

Berdasarkan kontribusi PC1 dan PC2 maka dapat dibuat kurva score

plot. Kurva score plot digunakan jika ada 2 komponen pertama merupakan

nilai terbanyak dalam variabilitas di dalam data. Komponen utama pertama

(PC1) sebagai absis sedangkan komponen utama kedua (PC2) sebagai

ordinat. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin

besar pula kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama.

27


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada Maret-Juli 2014 di Laboratorium Product

Halal Analysis, Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan

Laboratorium PT. Saraswanti Indo Genetech Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Waters 2695 HPLC,

Shimadzu FTIR, lemari pendingin (refrigerator), sentrifuge 5417R, oven,

neraca analitik, hote plat, labu ukur, erlenmeyer, kaca arloji, tabung reaksi

bertutup, mikro pipet 100-1000 ul beserta tip nya, spatula, gelas ukur, beaker

glass, vortex, pipet tetes, pinset, syringe filter, termometer, membran filter

0,45 µm ,vial, cawan porselen, batang pengaduk.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: standar

asam amino yaitu: asam L- aspartat, L- serin, asam L- glutamat, glisin, L-

histidin, L- arginin, L- treonin, L-alanin, L- prolin, L- sistein, L- tirosin, L-

valin, L- metionin, L- lisin, L- isoleusin, L- leusin, L- fenilalanin, triptofan,

standar gelatin sapi (sigma aldrich), standar gelatin babi (sigma aldrich),

internal standar AABA (alpha amino butiric acid), Accq-fluor borat, reagen

fluor A, HCl, asetonitril grade HPLC, aquabidest, aseton, sampel cangkang

kapsul, gliserin, titanium dioksida dan pewarna tartrazin.

3.3 Tahapan Penelitian

3.3.1 Pengumpulan Sampel dari Pasaran

Pengumpulan sampel dilakukan secara acak dengan cara mendata

berbagai macam produk kapsul dari populasi obat vitamin dan mineral yang

28


terdapat di dalam buku mims edisi 2014. Lalu didata semua produk vitamin

bercangkang kapsul keras dan diperoleh 25 produk vitamin bercangkang

kapsul keras. Kemudian diambil secara acak 5 produk kapsul bercangkang

keras dengan produsen yang berbeda-beda yang resmi beredar di Indonesia.

3.3.2 Pembuatan Lembaran Cangkang Kapsul Gelatin Keras SimulasiMenggunakan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi

Formulasi lembaran cangkang kapsul gelatin keras simulasi dapat dilihat pada

tabel berikut :

Tabel 3.1 Formulasi Lembaran Cangkang kapsul gelatin keras

Bahan Jumlah

Gelatin 50%

Gliserin 10%

Titanium dioksida 1,25%

Tartrazin 0,05%

Aquadest Ad 100%

Dibuat total sediaan : 10 mL

Sebanyak 5 g gelatin dimasukkan ke dalam becker glass 50 mL,

dibasahi dengan 5 mL aquadest. Kemudian dipanaskan pada suhu 60oC

sampai membentuk larutan jernih. Lalu ditambahkan 1 mL gliserin, 0,125 g

titanium dioksida (yang telah didispersikan dalam 1 mL aquadest) dan 5 mg

pewarna tartrazin (yang telah dilarutkan dalam 1 mL aquadest) lalu di add

kan dengan aquadest hingga 10 mL. Diaduk hingga homogen. Campuran

dituangkan ke dalam cetakan untuk memperoleh lapisan tipis larutan gelatin.

Lalu disimpan di dalam desikator bersilika untuk menurunkan kandungan air

pada lembaran cangkang kapsul keras (Widyaninggar et al., 2012).

29


3.3.3 Analisis Gelatin dengan FTIR (Fourier Transform InfaredSpectroscopy)

3.3.3.1 Pemisahan Titanium Dioksida

Sebanyak 0,3 g lembaran cangkang kapsul keras simulasi dari standar

gelatin sapi dan babi, dan sampel uji cangkang kapsul keras dilarutkan

dengan 2 mL aquadest panas pada suhu 60oC. Campuran dimasukkan ke

dalam mikrotube dan disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan

10.000 rpm.

3.3.3.2 Ekstraksi Gelatin

Sebanyak 2 mL supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi pada

proses pemisahan titanium dioksida dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge

dan ditambahkan dengan 8 mL aseton dingin dengan perbandingan 1:4. Lalu

divortex selama 5 menit sampai homogen. Diinkubasi pada suhu -20oC

selama semalam kemudian disentrifuge selama 25 menit dengan kecepatan

6000 rpm. Supernatan dibuang dan endapan yang diperoleh kemudian dicuci

dengan aseton sebanyak 3 kali. Setelah itu endapan ditimbang (Fic et al.,

2010)

3.3.4 Analisis Profil Gelatin dengan FTIR

Sebanyak 0,5 g standar gelatin sapi dan babi dilarutkan dengan

aquadest 1 mL. Sebanyak 0,2 g endapan yang diperoleh dari hasil ekstraksi

lembaran cangkang kapsul keras simulasi, dan sampel uji cangkang kapsul

keras dilarutkan dengan aquadest 600 μL pada suhu 60oC hingga homogen

lalu dimasukkan ke dalam ATR (Attenuated total reflectance). Scanning

sampel dilakukan menggunakan spektroskopi FTIR pada panjang gelombang

4000-750 cm-1 (Hasyim et al., 2010 )

3.3.5 Analisa Data menggunakan PCA

Data gugus fungsi yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan teknik

PCA dengan cara memasukkan data absorbansi dari bilangan gelombang baik

standar gelatin sapi dan babi, lembaran cangkang kapsul keras simulasi sapi

30


dan babi serta sampel uji cangkang kapsul keras ke dalam software Minitab

15 untuk membedakan gugus fungsi pada standar gelatin, lembaran cangkang

kapsul keras simulasi dan sampel uji cangkang kapsul keras (Miller, J.N., &

Miller, J.C. 2005).

3.3.6 Analisis Gelatin dengan KCKT (Kromatografi Cair KinerjaTinggi)

3.3.6.1 Hidrolisis Asam Amino

Ditimbang sebanyak 0,1 gram masing-masing sampel standar gelatin

sapi dan babi, lembaran kapsul gelatin keras yang dibuat sendiri dari standar

gelatin sapi dan babi, dan produk kapsul keras yang telah dikeluarkan isinya,

ditambahkan 5 mL HCl 6 N dan dialiri gas nitrogen untuk mencegah

oksidasi. Tabung reaksi ditutup, kemudian divortex selama 5 menit.

Dihidrolisis pada suhu 1100C selama 22 jam di dalam oven. Setelah

dihidrolisis, campuran didinginkan pada suhu ruang (Hafidz et al., 2011;

Fountoulakis & Lahm, 1998). Lalu dipindahkan isi tabung reaksi ke dalam

labu ukur 50 mL, ditambahkan aquabides sampai tanda batas. Disaring

dengan filter 0,45µm. Dipipet 500 µL filtrat lalu ditambahkan 40 µL larutan

standar internal (6,45 mg α-aminobutyric acid dalam 25 mL HCl 0,1M) dan

460 µL aquabides.

3.3.6.2 Derivatisasi

Dipipet 10 µL campuran larutan dari hasil hidrolisis dan larutan

standar internal, ditambahkan 70 µL AccQ.Tag Fluor borate, divortex.

Ditambahkan 20 µL reagen fluor A, divortex, diamkan selama 1 menit. Di

inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu disuntikkan 5 µL filtrat pada

HPLC (Kabelova et al., 2009).

3.3.7 Analisis Profil Gelatin dengan KCKT (Kromatografi Cair KinerjaTinggi)

Sebanyak 5 µL filtrat diinjeksikan ke dalam kolom HPLC dengan

kondisi : Waters AccQ•Tag kolom Nova-Pak C18, 4 μm (3,9 x 150 mm),

temperatur kolom 37°C, laju alir fase gerak 1,0 mL/menit, kromatografi

31


menggunakan sistem gradien dengan fase gerak AccQTag Eluent A (buffer

asetat-fosfat) dan Acetonitril 60% grade HPLC (campuran 60% asetonitril

dan 40% aquabidest); detektor fluoresen tipe 2475 (Waters, Milford,

Massachusetts, USA) pada panjang gelombang eksitasi 250 nm dan emisi 395

nm (Kabelova et al., 2009).

Konsentrasi asam amino dalam sampel dihitung sebagai berikut:

( ) = ( )( ) x 100%

3.3.8 Analisis Data menggunakan PCA

Data kromatogram yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan teknik

PCA dengan cara memasukkan data % height dari kromatogram baik standar

gelatin sapi dan babi, lembaran kapsul gelatin keras sapi dan babi serta pada

produk kapsul keras ke dalam software Minitab 15 untuk membedakan

komposisi asam amino pada standar gelatin, lembaran cangkang kapsul keras

simulasi dan sampel cangkang kapsul keras


BAB IV

HASIL dan PEMBAHASAN

4.1 Pengumpulan Sampel dari Pasaran

Pengumpulan sampel dilakukan secara acak terhadap 5 sampel obat

bercangkang kapsul keras dari populasi obat vitamin dan mineral dengan

produsen yang berbeda-beda yang belum teridentifikasi dengan jelas sumber

bahan baku gelatinnya. Masing-masing sampel diberi identitas sebagai

berikut :

Tabel 4.1 Pengumpulan sampel kapsul keras dari pasaran

No Sampel Kategori

1. Kapsul merk E A

2. Kapsul merk D B

3. Kapsul merk V C

4. Kapsul merk C D

5. 5. Kapsul merk I E

4.2 Pembuatan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Simulasi dariStandar Gelatin Sapi dan Gelatin Babi

Lembaran cangkang kapsul keras simulasi dibuat dari bahan dasar

gelatin dan air dengan penambahan gliserin, TiO2 (titanium dioksida) dan

pewarna tartrazin. Tujuan penggunaan TiO2 (titanium dioksida) adalah

sebagai opacifier agent. Titanium dioksida memiliki indeks bias yang tinggi

sehingga mempunyai sifat yang dapat menghamburkan cahaya dalam

penggunaannya sebagai pigmen pemutih atau pengopak (Rowe et al., 2003).

Lembaran cangkang kapsul keras simulasi yang dihasilkan berupa lapisan

tipis, bewarna kuning, opaque dan dapat digulung. Secara organoleptis dapat

dilihat bahwa lembaran cangkang kapsul keras simulasi yang dibuat dari

standar gelatin sapi memiliki warna kuning pucat atau kuning kecoklatan

sedangkan lembaran cangkang kapsul keras yang dibuat dari standar gelatin

babi memiliki warna kuning terang. Hal ini sebagaimana dengan serbuk

33


gelatin standar yang digunakan pada standar gelatin babi memiliki warna

putih dan standar gelatin sapi memiliki warna kecoklatan.

(a) (b)

(c) (d)

Keterangan gambar: (a): serbuk standar gelatin sapi, (b) : lembar cangkang kapsul yangdibuat dari standar gelatin sapi, (c): serbuk standar gelatin babi, (d) : lembar cangkangkapsul yang dibuat dari standar gelatin babi.

Gambar 12. Lembaran cangkang kapsul gelatin keras

4.3 Analisis Gelatin dengan FTIR

4.3.1 Pemisahan TiO2 (Titanium dioksida)

Pada penelitian ini dilakukan pemisahan titanium dioksida pada

sediaan lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel cangkang

kapsul keras dari pasaran. Tujuan dilakukan pemisahan titanium dioksida

terhadap kapsul keras dilakukan karena memiliki serapan IR yang tidak

spesifik namun menujukkan beberapa puncak pada bilangan gelombang

sekitar 1450 nm dan 1950 nm yang di duga dapat mengganggu proses analisis

dengan FTIR (Fourier Transform Infared Spectroscopy) (Rowe et al., 2009).

Pemisahan Titanium dioksida dapat dilakukan dengan teknik sentrifugasi.

Sentrifugasi dilakukan bertujuan mengendapkan atau memisahkan titanium

dioksida dari cangkang kapsul keras. Pemisahan titanium dioksida dilakukan

34


dengan sentrifugasi dikarenakan adanya gaya sentrifugasi yang menyebabkan

partikel-partikel menuju dinding tabung dan terakumulasi membentuk

endapan.

4.3.2 Ekstraksi Gelatin dari Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasidan Produk Cangkang Kapsul Keras dari Pasaran

Pada penelitian ini untuk menganalisis gelatin pada lembaran cangkang

kapsul keras simulasi dan sampel cangkang kapsul keras dari pasaran,

dilakukan terlebih dahulu ekstraksi gelatin agar diperoleh gelatin yang bebas

dari bahan tambahan dalam cangkang kapsul keras. Ekstraksi gelatin

dilakukan dengan menggunakan aseton dingin perbandingan 1;4 yang

menyebabkan denaturasi pada protein atau gelatin (Winarno, 1974). Aseton

dapat mengendapkan protein lebih banyak dibandingkan dengan

menggunakan pelarut organik lainnya seperti metanol, kloroform (Fic et al.,

2005). Kemudian diinkubasi semalaman bertujuan menyempurnakan proses

pengendapan gelatin. Hasil yang diperoleh berupa endapan gelatin yang

berbentuk seperti permen karet. Lalu endapan tersebut dicuci dengan aseton

sebanyak 3 kali dengan tujuan menghilangkan endapan tersebut dari

pengotor.

Gambar 13. Endapan gelatin diperoleh dari hasil ekstraksi

35


4.3.3 Analisis Profil Gelatin pada Standar Gelatin, Lembar CangkangKapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul Keras dariPasaran Menggunakan FTIR

Spektroskopi FTIR merupakan metode analisis yang cepat dan

memiliki potensi untuk membedakan spektrum diantara dua sampel (Hasyim

et al., 2010). Analisa ini bertujuan untuk mengidentifikasi gugus fungsi dari

asam amino kedua sumber gelatin. Identifikasi dengan FTIR dilakukan

berdasarkan karakteristik gugus fungsi asam amino penyusun gelatin.

Scanning sampel dilakukan pada panjang gelombang 4000-750 cm-1 dengan

resolusi 4 cm-1 . Hasil perbedaan sperktrum antara gelatin babi dan sapi dapat

dilihat pada Gambar 14. Kedua spektrum ini menunjukan pola spektrum yang

hampir sama. Perbedaan yang dapat terlihat yaitu tinggi atau rendahnya

serapan pada masing-masing pola spektrum.

Keterangan; 1: Standar gelatin sapi, 2: standar gelatin babi

Gambar 14. Penggabungan spektrum FTIR standar gelatin babi dangelatin sapi

36


Berdasarkan gambar 14 terlihat bahwa kedua sumber gelatin memiliki polaspektrum yang hampir sama jika dibandingkan denganpenelitian sebelumnya (Hasyim et al., 2010). Dimanaspektrum pada standar gelatin babi dan gelatin sapimemiliki ciri khas pada daerah-daerah yang spesifikyaitu di daerah 3600-2300 cm-1 (Amida A), 1656-1644cm-1 (Amida I), 1560-1335 cm-1 (Amida II) dan 1240-670 cm-1 (Amida III) (Hasyim et al., 2010). Setelahdilakukan analisis pada standar gelatin sapi dan babiselanjutnya dilakukan analisis pada lembaran kapsulkeras simulasi yang dibuat dari gelatin sapi dan babi.Hasil spektrum yang diperoleh dapat dilihat pada gambar15.

Keterangan; 1: lembar cangkang kapsul simulasi sapi, 2: lembar cangkang kapsulsimulasi babi.

Gambar 15. Penggabungan Spektrum FTIR lembaran cangkang kapsulgelatin babi dan gelatin sapi simulasi

Berdasarkan gambar 15 terlihat bahwa kedua sumber gelatin dari

lembar cangkang kapsul keras simulasi memiliki pola spektrum yang hampir

sama dengan spektrum standar gelatin babi dan sapi. Di mana spektrum pada

lembaran cangkang kapsul keras simulasi juga memiliki ciri khas di daerah-

daerah spesifik untuk gelatin yaitu 3600-2300 cm-1 (Amida A), 1656-1644

cm-1 (Amida I), 1560-1335 cm-1 (Amida II) dan 1240-670 cm-1 (Amida III)

(Hasyim et al., 2010). Dari spektrum di atas dapat disimpulkan bahwa

gelatin dari lembaran cangkang kapsul simulasi berhasil diekstraksi dari

37


komponen lainnya. Namun demikian untuk mengkonfirmasi hal tersebut

perlu dilakukan pengujian lebih lanjut yaitu dengan optimasi preparasi

sampel karena bisa jadi bilangan gelombang ini adalah pengotor yang ikut

terbawa dalam sampel gelatin. Dari spektrum FTIR gambar 14 dan gambar 15

terlihat bahwa secara umum gelatin sapi dan gelatin babi memiliki puncak-

puncak serapan pada bilangan gelombang yang hampir identik. Namun jika

dibandingkan lebih rinci, diantara puncak-puncak serapan yang dihasilkan

(absorbansi) pada masing-masing bilangan gelombang secara kualitatif relatif

berbeda. Misalnya spektrum gelatin sapi pada daerah Amida A relatif lebih

tinggi jika dibandingkan dengan spektrum gelatin babi begitu pula pada

daerah amida I dan II (1656-1644 cm-1 dan 1560-1335 cm-1).

Serapan pada daerah 3290-3280 cm-1 berkaitan dengan ikatan N-H

stretching dan ikatan hidrogen intramolekuler pada gugus amina dalam rantai

asam amino. Absorpsi terpolarisasi paralel pada ikatan N-H, menunjukkan

adanya interaksi ikatan hidrogen pada struktur alpha heliks dalam struktur

gelatin tersebut. Puncak yang dihasilkan dapat bergeser ke frekuensi yang

lebih rendah ketika kekuatan ikatan hidrogennya meningkat (Hasyim et al.,

2010)

Ikatan rangkap stretching pada gugus karbonil C=O berinterkasi

dengan gugus N-H dari ikatan peptida (C-N), muncul pada daerah 1660-1620

cm-1 yang sering disebut sebagai daerah amida I. Rentang frekuensi 1660-

1650 cm-1 merepresentasikan sturktur alpha heliks dan 1640-1620 cm-1

sebagai struktur beta sheet. Frekuensi pada daerah amida II yaitu 1550-1520

cm-1 menunjukkan deformasi gugus N-H dari struktur alpha heliks (1550-

1540 cm-1) dan struktur beta sheet (1525-1520 cm-1) (Fischer et al., 2005).

Sedangkan frekuensi pada 1500-1200 cm-1 merupakan representasi dari

deformasi CH2. Daerah ini juga bersifat spesifik dan menjadi ciri khas dari

beberapa gugus hidrokarbon yang terdapat pada beberapa senyawa

makromolekul seperti asam lemak, protein dan polisakarida. Gugus peptida

merupakan struktur berulang dari protein yang memberikan 9 karakteristik

ikatan yang dinamakan amida A, B dan I-VII. Karakteristik serapan IR pada

protein dan peptide terlihat pada tabel 4.2

38


Tabel 4.2 Karakteristik Serapan IR pada rantai peptida

Rantai Peptida Bilangan Gelombang(cm-1)

Keterangan

Amida A 3300 NH stretching

Amida B 3100 NH stretching

Amida I 1600-1690 C=O stretching

Amida II 1480-1575 CN stretching, NH

bending

Amida III 1229-1301 CN stretching, NH

bending

Amida IV 625-767 OCN bending

Amida V 640-800 Out-of-plane NH

bending

Amida VI 537-606 Out-of-plane C=O

bending

Amida VII 200 Skeletal torsion

Sumber : Kong, J. and Yu, S. 2007

Selanjutnya dilakukan analisis pada produk cangkang kapsul keras

yang beredar dipasaran. Hasil spektrum yang diperoleh dapat dilihat pada

gambar 16 bahwa spektrum sampel B terlihat sedikit berbeda di daerah amida

III yang memiliki serapan lebih tinggi dibandingkan dengan sampel lainnya.

Hal ini diduga adanya pengotor yang ikut terbawa dalam sampel gelatin

sehingga memiliki serapan yang tinggi. Hal ini dapat dilihat pada gambar 16.

39


Keterangan; a: sampel A, b: sampel B, c: sampel C, d: sampel D, e: sampel E

Gambar 16. Penggabungan spektrum gelatin yang diperoleh dari produkcangkang kapsul keras yang ada dipasaran

Walaupun ketiga bentuk spektrum gelatin sapi dan gelatin babi pada

gambar 14, 15 dan 16 memiliki spektrum yang sangat mirip satu sama lain,

namun melalui analisis diskriminasi yang berfokus pada profil protein dan

struktur sekunder dari kedua sampel tersebut akan terlihat perbedaan diantara

gelatin babi dan gelatin sapi terutama karena spektrum yang dihasilkan sangat

dipengaruhi oleh coupling dari vibrasi gugus peptida tetangga (Hasyim et al.,

2010)

4.3.4 Analisis PCA (Principal Components Analysis) pada StandarGelatin, Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi dan ProdukCangkang Kapsul Keras dari Pasaran

Dalam penelitian ini jumlah variabel yang digunakan sebanyak 8

variabel. Setelah itu 8 variabel absorbansi dari bilangan gelombang hasil

analisis standar gelatin babi dan sapi, lembar cangkang kapsul keras simulasi

dan Produk cangkang kapsul keras dari pasaran dimasukkan ke dalam

software Minitab 15. Kemudian dilakukan analisis PCA

40


Tabel 4.3 Worksheet pada penyusunan standar gelatin, lembarcangkang kapsul keras simulasi dan produk cangkangkapsul keras dari pasaran dengan PCA

698 1243 1338 1409 1455 1556 1633 3263GB 1 1,12 0,36 0,32 0,34 0,39 0,65 0,96 1,09GB 2 1,14 0,36 0,32 0,33 0,39 0,65 0,96 1,06GS 1 1,22 0,41 0,36 0,39 0,45 0,73 0,99 1,13GS 2 1,20 0,44 0,38 0,41 0,48 0,80 1,07 1,11KGS 1 1,37 0,40 0,39 0,40 0,45 0,69 1,13 1,37KGS 2 1,37 0,30 0,37 0,38 0,44 0,66 1,10 1,37KGB 1 1,22 0,26 0,26 0,26 0,32 0,51 0,89 1,20KGB 2 1,22 0,32 0,30 0,32 0,37 0,60 0,95 1,23Kapsul A1 1,14 0,30 0,28 0,30 0,32 0,52 0,81 1,05KapsulA2 1,13 0,26 0,25 0,27 0,28 0,45 0,77 1,09Kapsul B1 1,27 0,44 0,44 0,45 0,46 0,61 0,91 1,23Kapsul B2 1,28 0,45 0,44 0,46 0,48 0,66 0,94 1,23Kapsul C1 1,31 0,32 0,37 0,34 0,35 0,51 0,90 1,25Kapsul C2 1,30 0,33 0,37 0,35 0,36 0,52 0,90 1,25Kapsul D1 1,20 0,33 0,31 0,33 0,37 0,62 0,94 1,12Kapsul D2 1,21 0,34 0,31 0,33 0,37 0,62 0,93 1,13Kapsul E1 1,31 0,36 0,34 0,36 0,39 0,62 1,01 1,31Kapsul E2 1,31 0,37 0,34 0,36 0,40 0,63 1,00 1,31

Tabel 4.4 Kontribusi masing-masing variabel terhadap komponen utama

41



plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai

dasar perbedaan gelatin sapi dan babi (Minitab 15 Statguide, 2007). Semakin

dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin besar pula

kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan

nilai score plot yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir

sama. Pada software Minitab 15, pengelompokan dilakukan berdasarkan

posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang

positif ataukah negatif. Pada gambar 17 merupakan kurva score plot PC1 dan

PC2 pada standar gelatin, lembaran kapsul keras dan sampel uji.

Keterangan: GB : standar gelatin babi, GS : standar gelatin sapi, KGB : kapsul gelatin babi,KGS : kapsul gelatin sapi, A: sampel 1, B: sampel 2, C: sampel 3, D: sampel 4, E: sampel 5

Gambar 17. Kurva score plot FTIR PC1 dan PC2 pada standar gelatin,lembar cangkang kapsul Keras Simulasi dan produk cangkangkapsul keras dari pasaran

Berdasarkan hasil kurva score plot diatas tampak bahwa lembar

cangkang kapsul yang dibuat dari gelatin babi berada pada kuadran 3 yang

memiliki nilai PC1 dan PC2 negatif. Lembar cangkang kapsul keras yang

dibuat dari gelatin babi tersebut dapat dibedakan dari kapsul yang dibuat dari

43210-1-2-3-4-5

2

1

0

-1

-2

-3

First Component

Se

con

dC

om

po

ne

nt

Score Plot of 702, ..., 3263

KGB

KGB

CC E

E

KGS

KGS

BBGS

GS

DD

A

A

GBGB

IIi

IvIii

42


gelatin sapi yang berada pada kuadran 4 yang memiliki nilai PC1 positif dan

PC2 negatif. Sementara itu standar gelatin babi berada pada kuadran 2 yang

memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif dan standar gelatin sapi berada

pada kuadran 1 yang memiliki nilai PC1 dan PC2 positif. Hal ini dapat

disimpulkan bahwa standar gelatin babi dan standar gelatin sapi memiliki

profil asam amino yang berbeda dengan lembar cangkang kapsul simulasi

yang dibuat dari gelatin yang sama. Hal ini dapat disebabkan karena pada saat

formulasi dilakukan pemanasan, penambahan bahan-bahan tambahan atau

proses ekstraksi yang kurang baik yang dapat mempengaruhi komposisi asam

amino.

Pada sampel uji A dan D berada pada kuadran yang sama dengan

standar gelatin babi yaitu pada kuadran 2. Begitu juga dengan sampel uji C

berada pada kuadran yang sama dengan lembar cangkang kapsul yang dibuat

dari standar gelatin babi. Hal ini diduga bahwa sampel uji A, C dan D

memiliki kemiripan sifat fisika kimia yang sama dengan standar gelatin babi.

Pada sampel uji B berada pada kuadran yang sama dengan standar gelatin

sapi yaitu berada pada kuadran 1 sedangkan sampel uji E berada pada

kuadran yang sama dengan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari gelatin

sapi. Hal ini diduga bahwa sampel uji B dan E memiliki kemiripan sifat fisika

kimia yang sama.

Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh

terhadap pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat berdasarkan

kurva loading plot yang dihasilkan dari analisis PCA. Kurva loading plot

digunakan untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi

dalam pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel

dari titik asalnya (0,0) maka kontribusinya terhadap proses PCA akan

semakin besar (Widyaninggar et al., 2011). Gambar 18 adalah kurva yang

menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2.

43


0.40.30.20.10.0

0.4

0.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

First Component

Seco

nd

Com

ponent

3263

1633

1556

1455

1409

1338

1243

698

Loading Plot of 698, ..., 3263

Gambar 18. Kurva loading plot FTIR PC1 dan PC2 pada standar gelatin,lembar cangkang kapsul keras simulasi dan produk cangkangkapsul keras dari pasaran.

Dari kurva loading plot diatas diketahui bahwa bilangan gelombang

1455 cm-1, 1409 cm-1 dan 1338 cm-1 memiliki jarak horisontal terjauh dari

garis x = 0. Artinya variabel tersebut memiliki kontribusi paling besar

terhadap pembentukan nilai PC1 dengan nilai koefisien masing-masing 0,420,

0,408, dan 0,392. Sedangkan variabel – variabel yang berkontribusi paling

besar terhadap pembentukan PC2 memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y

= 0 adalah bilangan gelombang 1556 cm-1, 698 cm-1 dan 3263 cm-1 dengan

nilai koefisien masing-masing 0,341, 0,276, 0,235. Variabel-variabel lain

dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap berpengaruh pada nilai PC1

dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada score plot dan menentukan

hasil pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi. Walaupun demikian

kontribusinya tidak sebesar variabel-variabel utama diatas.

44


4.4 Analisis Gelatin dengan KCKT

4.4.1 Hidrolisis Asam Amino

Hidrolisis asam amino dilakukan dengan menimbang 0,1 gram kapsul

gelatin keras dengan menambahkan larutan HCl 6 N sebanyak 5 ml dengan

konsentrasi 2%. Proses hidrolisis dilakukan pada suhu 110oC selama 22 jam

di dalam oven. Hidrolisis dilakukan menggunakan HCl karena HCl bersifat

oksidator kuat yang dapat memecah ikatan peptida secara sempurna. Setelah

dihidrolisis, campuran didinginkan pada suhu ruang. Pada hidrolisis asam,

asparagin dan glutamin dihidrolisis menjadi asam aspartat dan asam glutamat,

triptofan secara lengkap dirusak, sistein tidak dapat ditentukan, tirosin

sebagian dirusak, serin dan treonin dapat dihidrolisis tetapi masih rusak

sekitar 10% dan 5% berturut-turut (Fountoulakis, M., & Lahm, H.W, 1998).

Kemudian isi tabung tersebut dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml dan

ditambahkan aquabidest sampai tanda batas sehingga konsentrasi larutan

menjadi 0,2%. Hasil hidrolisis menghasilkan larutan hitam kecoklatan,

sehingga di filter terlebih dahulu dengan menggunakan membran filter

berpori 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dari

komponen lain yang dapat mengganggu proses pada saat analisis. Setelah

proses filtrasi menggunakan membran filter 0,45 µm, larutan akan terlihat

bening dan bersih.

Hidrolisis dilakukan untuk melepaskan asam amino - asam amino yang

terdapat dalam gelatin, yaitu melalui pemotongan ikatan peptida asam amino

penyusun gelatin. Selama proses hidrolisis ini, hubungan antara ikatan rantai

polipeptida dari kolagen dengan ikatan rantai polipeptida yang lain akan

menjadi terpisah. Hal ini disebabkan karena rusaknya struktur fibrosa dari

kolagen (See et al., 2010). Setelah itu dipipet sebanyak 500µL, ditambahkan

40µL larutan standar internal (6,45mg α-aminobutyric acid dalam 25 mL HCl

0,1M) ditambahkan 460 µL aquabides sehingga konsentrasi larutan menjadi

0,1%. Penambahan larutan standar internal digunakan sebagai faktor koreksi

kesalahan volumetrik selama persiapan sampel dan mengkoreksi hilangnya

residu asam amino selama proses hidrolisis yang akan dideteksi dengan

45


berkurangnya standar internal, sehingga penggunaan larutan standar internal

dapat meningkatkan presisi.

4.4.2 Derivatisasi Asam Amino

Derivatisasi asam amino dilakukan dengan menambahkan 70 µL

AccQ.Tag Fluor borate dan 20 µL reagen fluor A ke dalam 10 µl filtrat

dengan konsentrasi 0,01%. Kemudian di vortex dan diamkan selama 1 menit.

Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu disuntikkan 5 µL filtrat ke

dalam HPLC. Proses ini merupakan proses derivatisasi pra kolom. Asam

amino akan diderivatisasi terlebih dahulu di dalam hidrolisat, kemudian

derivat dipisahkan pada HPLC fase terbalik. Kelebihan dari derivatisasi pra

kolom yaitu waktu analisa cepat, dan cocok untuk analisa dengan jumlah

residu yang sedikit atau sekitar 20 residu (Fountoulakis, M., & Lahm, H.W,

1998). Kolom yang digunakan Waters AccQtaq ( 3,9 x 150 mm) dengan

temperatur kolom 37°C, laju alir fase gerak 1,0 mL/menit, kromatografi

menggunakan sistem gradien dengan fase gerak AccQTag Eluent A (buffer

asetat-fosfat) dan Acetonitril 60% grade HPLC (campuran 60% asetonitril

dan 40% aquabidest).

Detektor yang digunakan adalah detektor fluoresen. Detektor fluoresen

memonitor emisi dari cahaya fluoresen dari fase gerak. Detektor fluoresen

lebih selektif dan sangat sensitif (pikogram sampai femtogram) untuk

komponen dengan daya fluoresen tinggi (Ahuja, S., & Dong, M.W, 2005).

Detektor fluoresen yang digunakan adalah detektor fluoresen 2475 dengan

panjang gelombang emisi 395 nm dan panjang gelombang eksitasi 250 nm.

Hal ini dapat diartikan bahwa detektor memancarkan gelombang pada

panjang gelombang 250 nm dan menangkap emisi fluoresensi yang

dipancarkan oleh sampel pada panjang gelombang 395 nm. Ada beberapa

agen penderivat yang dapat digunakan untuk menderivatisasi asam amino

antara lain ortho-phtalaldehyde (OPA), 7-kloro-4-nitrobenzo2-oksa-1,3-

diazol (NBD-Cl), 3-mercaptopropionic acid (MPA), aminokuinolil -N-

hidroksisuksini-midil karbamat (AQC). Metode derivatisasi yang digunakan

adalah metode AccQTaq yang menggunakan reagen aminokuinolil -N-

46


hidroksisuksini-midil karbamat (AQC). Pemilihan digunakan aminokuinolil -

N-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC) sebagai agen derivatisasi

dikarenakan aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC) ini

prosesnya cepat dan sederhana selain itu produk yang dihasilkan stabil dan

adanya kelebihan AQC tidak mengganggu proses pemisahan (Rohman dan

Sumantri, 2007). AQC ini merupakan agen penderivat yang paling stabil jika

dibandingkan dengan agen penderivat lainnya. Agen penderivat AQC ini

stabil selama 7 hari pada suhu ruang. Selain itu juga AQC dapat bereaksi

dengan asam amino primer dan asam amino sekunder (Masuda dan Domae,

2011) sehingga paling cocok digunakan dalam proses derivatisasi. .

Kelebihan reagen AQC akan bereaksi secara cepat di dalam air membentuk

6-aminoquinoline (AMQ), N-hidroksisuccimid (NHS) dan CO2 (t½ = 15

detik) (Marten, S., & Naguschewski, M., 2011). AMQ bereaksi lambat

dengan reagen AQC berlebih untuk membentuk bis aminoquinolin urea.

Produk-produk samping tidak mengganggu identifikasi dan kuantisasi dari

salah satu asam amino (www.waters.com/aaa).

Sumber: www.waters.com/aaa

Gambar 19. Reaksi Derivatisasi Reagen AQC

47


4.5 Analisis Profil Asam Amino dengan KCKT

4.5.1 Analisis Standar Asam Amino

Penelitian ini dilakukan analisis terhadap standar asam amino, standar

gelatin babi dan sapi, lembar cangkang kapsul keras simulasi yang dibuat dari

gelatin babi dan gelatin sapi dan analisis terhadap sampel uji yang beredar

dipasaran. Analisis standar asam amino dapat dilihat bahwa ada 18 Asam

amino yang digunakan sebagai standar adalah L-asam aspartat (Asp), L-serin

(Ser), L-asam glutamat (Glu), L-glisin (Gly), L-histidin (His), L-arginin

(Arg), L-treonin (Thr), L-alanin (Ala), L-prolin (Pro), L-tirosin (Tyr), L-valin

(Val), L-metionin (Met), L-lisin (Lys), L-isoleusin (Ile), L-leusin (Leu), L-

fenilalanin (Phe), L- sistein (Cys), dan triptofan. Penentuan standar asam

amino dilakukan dengan menambahkan campuran dari hidrolisat asam amino

dengan larutan baku standar internal, reagen fluor borat, dan reagen fluor A.

Hasil kromatogram dari standar asam amino ditunjukkan pada gambar

berikut.

Keterangan : 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin;6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9 : prolin; 10: tirosin ; 11 : valin ; 12 : metionin;13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 20. Profil standar asam amino

48


4.5.2 Analisis Asam Amino pada Standar Gelatin, Lembar CangkangKapsul Keras Simulasi dan Produk Cangkang Kapsul Kerasdari Pasaran.

Tabel 4.5 Komposisi Asam Amino pada Standar Gelatin dan LembarCangkang Kapsul keras dalam % b/b (1 gram/100 gram)

Berdasarkan tabel di atas menunjukkan bahwa asam amino glisin,

prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki kadar yang lebih tinggi

dibandingkan dengan gelatin sapi. Gelatin memiliki kadar asam amino

metionin, sistin dan tirosin yang rendah. Semua jenis asam amino terdapat

dalam gelatin kecuali triptofan (Nhari et al., 2011). Pada penelitian ini juga

dihasilkan asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki

Asam Amino Standargelatin babi(210,2200)

Standargelatin sapi(210,2199)

LembaranKapsulkeras daristandargelatinbabi(209,2244)

LembaranKapsulkeras daristandargelatinsapi(209,2245)

L-Asparticacid

5,258 4,471 1,293 1,331

L-Serine 3,213 3,017 1,128 1,181L-Glutamicacid

8,219 7,344 2,531 2,490

Glycine 21,944 20,493 7,442 7,936L-Histidine 1,642 1,552 0,409 0,481L-Arginine 11,448 9,319 2,940 3,109L-Threonine 2,360 1,934 0,635 0,737L-Alanine 6,659 6,187 2,980 2,491L-Proline 10,274 9,542 1,008 1,563L-Cystine 0,461 0,201 0,000 0,000L-Tyrosine 0,925 0,474 0,398 0,546L-Valine 2,635 2,361 0,722 0,715L-Metheonine

0,648 0,856 0,461 0,622

L-Lysin HCl 2,771 2,647 0,892 0,829L-Isoleucine 1,347 1,616 0,362 0,454L-Leucine 2,900 2,879 0,904 0,872L-Phenylalanine

3,229 2,276 0,729 0,831

Triptophan 0,000 0,000 0,000 0,000

49


kadar yang lebih tinggi dibandingkan dengan gelatin sapi dan memiliki kadar

asam amino metionin dan tirosin yang rendah sedangkan asam amino

triptofan rusak selama proses hidrolisis.

Selanjutnya dilakukan penetapan kadar masing-masing asam amino

pada standar gelatin, lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji

cangkang kapsul keras. Untuk mengetahui kadar masing-masing asam amino

pada gelatin, dapat dilakukan pehitungan sebagai berikut :

Contoh: Asam amino asam L-aspartic (mg/100gram) pada sampel uji

cangkang kapsul B = µ, ( )(µ ), ( ) x 100%

= 4571,9 mg/100gram b/b

4.6 Analisis PCA (Principal Components Analysis) pada Standar Gelatin,Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi dan Produk CangkangKapsul Keras dari Pasaran.

Pengelompokkan masing-masing sampel gelatin dapat dilakukan

dengan menggunakan teknik kemometrik yaitu PCA (Principal Components

Analysis). Pada puncak kromatogram PCA dapat mengekstrak komponen

utama dan mengklasifikasikan gelatin sapi dan babi (Nemati et al., 2004).

Dalam penelitian ini variabel yang digunakan adalah % tinggi puncak dari

masing masing asam amino dalam kromatogram. Variabel % tinggi puncak

dipilih karena % tinggi puncak berbanding lurus dengan konsentrasi asam

amino pada sampel. Jumlah variabel yang digunakan 15 variabel (% tinggi

puncak 15 asam amino). Setelah itu data % tinggi puncak masing-masing

asam amino pada kromatogram hasil analisis standar gelatin babi dan sapi,

lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji dimasukkan ke

dalam software minitab 15. Kemudian dilakukan analisis PCA.

( ) = ( )( ) x 100

%

50


Tabel 4.6 Worksheet pada penyusunan standar gelatin, lembar cangkangkapsul keras simulasi dan produk cangkang kapsul keras daripasaran dengan PCA

Tabel 4.7 Kontribusi masing-masing variabel terhadap nilai komponen utama

50




50




51



plot. Kurva score plot digunakan untuk menaksir struktur data yaitu sebagai

dasar perbedaan gelatin sapi dan babi (Minitab 15 Statguide, 2007). Semakin

dekat letak antar sampel pada score plot, maka semakin besar pula

kemiripannya atau sampel merupakan kelompok yang sama. Sampel dengan

nilai score plot yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir

sama. Pada Minitab, pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel

pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif ataukah

negatif. gelatin, lembaran cangkang kapsul keras simulasi dan sampel uji.

Pada gambar 21 dapat dilihat kurva score plot PC1 dan PC2 penyusun standar

gelatin, lembaran kapsul simulasi dan sampel uji.

Keterangan: GB : standar gelatin babi, GS : standar gelatin sapi, KB : lembaran kapsul kerasgelatin babi, KS : lembaran kapsul keras gelatin sapi, A: sampel 1, B: sampel 2, C: sampel 3,D: sampel 4, E: sampel 5

Gambar 21. Kurva score plot HPLC PC1 dan PC2 pada standar gelatin danlembaran kapsul Keras Simulasi dan sampel uji

Berdasarkan kurva score plot diatas bahwa standar gelatin babi dan

lembar cangkang kapsul yang dibuat dari standar gelatin babi berada dalam

satu kuadran yaitu kuadran 2 yang memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif.

Standar gelatin sapi dan lembar cangkang kapsul yang dibuat dari standar

43210-1-2-3-4-5

3

2

1

0

-1

-2

-3

First Component

Seco

ndCo

mpo

nent

Score Plot of aspartat, ..., penilalanin

KSGSGS

GB

GB

KBKB

EE

C

C

AA

DD

BB

KS

IIi

Iii

i

Iv

52


gelatin sapi berada dalam satu kuadran yaitu kuadran 3 yang memiliki nilai

PC1 dan PC2 negatif. Hal ini menunjukkan bahwa standar gelatin babi dengan

lembar cangkang kapsul simulasi babi dan standar gelatin sapi dengan lembar

cangkang kapsul simulasi sapi memiliki komposisi asam amino yang sama dan

dapat dipisahkan dengan proses ekstraksi yang baik oleh sistem HPLC.

Sementara itu kurva score plot pada sampel uji A,B,C dan D memiliki nilai

PC1 dan PC2 positif. Sedangkan sampel uji E memiliki nilai PC1 positif dan

PC2 negatif. Hal ini diduga bahwa sampel A,B,C,D dan E terbuat dari

campuran antara gelatin babi dan sapi atau terbuat dari selain gelatin sapi atau

gelatin babi.

Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh

terhadap pembeda gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat dari kurva

loading plot yang dihasilkan dari analisis PCA. Loading plot ini digunakan

untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi dalam

pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel dari

titik asalnya (0,0) maka kontribusinya terhadap proses PCA akan semakin

besar (Widyaninggar et al., 2011). Gambar 22 adalah kurva yang

menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2.

Gambar 22. Kurva loading plot PC1 dan PC2 pada standar gelatin,lembar cangkang kapsul keras simulasi dan produkcangkang kapsul keras dari pasaran

0.40.30.20.10.0-0.1-0.2-0.3-0.4

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

First Component

Seco

ndCo

mpo

nent

penilalanin

leucin

isoleusin

lysin hcl

metionin

valine

tyrosine

prolin

alanin

threonin

arginin

glycine

glutamat

serine

aspartat

Loading Plot of aspartat, ..., penilalanin

53


Berdasarkan kurva loading plot diatas bahwa variabel tirosin, treonin

dan leusin memiliki jarak horizontal yang jauh dari garis x = 0, artinya asam

amino tersebut memiliki kontribusi yang besar pada pembentukan nilai PC1

dengan nilai koefisien masing-masing -0.321, 0.102 dan 0.305. Sedangkan

variabel – variabel yang berkontribusi paling besar terhadap pembentukan

PC2 memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y = 0 adalah lysine hcl, valin

dan glisin dengan nilai koefisien masing-masing -0.341, 0.317 dan 0.341.

Variabel variabel lain dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap

berpengaruh pada nilai PC1 dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada

score plot dan menentukan hasil pembeda gelatin sapi dan gelatin babi.

Walaupun demikian kontribusinya tidak sebesar variabel-variabel utama

diatas.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode FTIR

dan teknik kemometrik PCA (Principal Component Analysis) dapat

mengklasifikasikan kedua sumber gelatin.

2. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode HPLC

dengan teknik kemometrik PCA (Principal Component Analysis) baru

bisa membedakan komposisi asam amino pada standar gelatin sapi dan

babi serta lembaran kapsul keras yang dibuat sendiri, tetapi belum bisa

membedakan sumber gelatin yang dipakai pada produk kapsul keras

yang diambil dari pasaran.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan pengujian lebih lanjut yaitu dengan optimasi preparasi

sampel pada metode FTIR karena bisa jadi masih terdapat pengotor yang

ikut terbawa dalam sampel gelatin.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap cara membedakan

gelatin babi dan gelatin sapi pada produk kapsul keras yang diperoleh

dari pasaran dengan metode HPLC dengan teknik PCA serta perlu

dilakukan variasi lebih banyak yaitu dengan membuat lembaran

cangkang kapsul keras yang dibuat dengan menggunakan campuran

gelatin babi dan sapi dengan berbagai konsentrasi.


DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S., & Dong, M.W. 2005. Handbook of Pharmaceutical Analysis byHPLC Volume 6 of Separation Science and Technology. New York:Elsevier Academic Press

Ansel, Howard. 2005. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi edisi keempat.Jakarta : UI Press

Bailey ,P.D.1990. An Introduction to peptide Chemistry. Wiley Interscience.New York

Bennion, M. 1980. The Science of Food. John Wiley and Sons. New York.

Brauner, J. W., Flach, C, R., & Mendelsohn, R. (2005). A quantitativereconstruction of the amide I contour in the IR spectra of globularproteins: From structure to spectrum. Journal of the American ChemicalSociety, 127, 100-109.

Carr, J. M., K. Sufferling, dan J. Poppe. 1995. Hydrocolloids and their use inthe confectionery Industry. Journal of Food Tech. 32 (7): 41-42

Cooper, C., Packer, N., dan Williams, N. Methods in Molecular Biology,vol.159: Amino Acid Analysis Protocols. Humana Press Inc 16.

DeMan, J.M. 1997. Kimia Makanan diterjemahkan oleh KosasihPadmawinata. Bandung: Penerbit ITB

Fischer, G., Cao, X., Cox, N., & Francis, M. (2005). The FTIR spectra ofglycine and glycylglycine zwitterions isolated in alkali halide matrices.Journal of Chemical Physics, 313, 39-49

Fountoulakis, M., & Lahm, H.W. 1998. Hydrolysis and amino acidcomposition analysis of proteins. Journal of Chromatography A, 826(1998) 109–134

Gui-Feng, Z., Tao, L., Qian, W., Jian-Du, L., Guang-Hui, MA., dan Zhi-Guo,SU. 2008. Identification of Marker Peptides in Digested Gelatins byHigh Performance Liquid Chromatography / Mass Spectrometry.Chinese Journal of Analytical Chemistry Volume 36, Issue 11,November 2008

GMIA, 2012. Gelatin Handbook, USA: Gelatin Manufacturers Institute ofAmerica

Hafidz, R.M, Yaakob, R.N, Amin I, C.M, dan Noorfaizan, A. 2011.Chemical and Functional Properties of Bovine and Porcine Skin Gelatin.International Food Research Journal 18: 813-817 (2011)

Hashim, D.M, Che Man, Y.B., Norakasha, R., Shuhaimi, M., Salmah, Y., &Syahariza, ZA. 2010. Potensial Use of Fourier Transfor Infared

56


Spectroscopy for Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins.Journal of Food Chemistry 118: 856-860

Jamaludin, M.A., Zaki, N.N.M., Ramli, M.A., Hashim, D.M., dan Ab.Rahman,S. 2011. Istihalah: Analysis on The Utilization of Gelatin in FoodProducts. 2011 2nd International Conference on Humanities, Historicaland Social Science IPEDR vol. 17. Singapore: IACSIT Press.

Jannah, A. 2008. Gelatin: Tinjauan Kehalalan dan Alternatif Produksi.Malang: UIN-Malang Press

Johnson,E.L dan Stevenson,R.1991.Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB

Jurnal Halal LPPOM MUI No.94 edisi Maret-April Tahun 2012 ISSN 0852-4947

Kabelova, I., Dvořáková, M., Čížková, H., Dostálek, P., dan Melzoch, K.2009. Determination of free amino acids in cheeses from the Czechmarket. Czech J. Food Sci. Vol. 27, 2009, No. 3: 143–150

Kong, J. and Yu, S. 2007. Fourier transform infrared spectroscopic analysis ofprotein secondary structures. Acta Biochimica et Biophysica Sinica39(8): 549- 559.

Kurniawati, Farida Dewi. 2006. Studi Pengaruh Metode dan TahapanEkstraksi Multistage Terhadap Mutu Gelatin [skripsi]. DepartemenTeknologi Industri Pertanian. Fakultas Teknologi Pertanian. IPB. Bogor.

Marten, S., & Naguschewski, M. 2011. Application Note: High speedseparation and detection of 18 AQC derivatized amino acids usingUHPLC-ESI-MS. Diakses tanggal 30 September 2012 pukul 11.08 padawww.knauer.net

Miller, J.N., & Miller, J.C. 2005. Statistics and Chemometrics for AnalyticalChemistry Fifth edition. Inggris : Pearson Education Limited

Miyazawa T, Shimanouchi T, Mizushima S. 1956. Characteristic InfaredBands of Monosubtited. Journal of Chem Phys 1956, 24: 408

Nhari, R.M.H.R., Ismail, A., dan Che Man, Y.B. 2012. Analytical Methods forGelatin Differentiation from Bovine and Porcine Origins and FoodProducts. Journal of Food Science Vol. 71, Nr.1 2012

Nelson, D. L., & Cox, M. M. 2005. Lehninger Principles of BiochemistryFourth Edition. W.H. Freeman and Company

Nemati, M., Oveisi, M.R., Abdollahi, H., dan Sabzevari, O. 2004.Differentiation of bovine and porcine gelatins using principal componentanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 34(2004)485–92

57


Nur Azira, T., Amin, I. dan Che Man, Y. B. 2012. Differentiation of bovineand porcine gelatins in processed products via Sodium DodecylSulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) andprincipal component analysis (PCA) techniques. International FoodResearch Journal 19 (3): 1175-1180 (2012)

Pare, J.R.J., & Belanger, J.M.R. 1997. Instrumental Methods in Food Analysis.Elsevier science

Perwitasari,D.S. 2008. Hidrolisis tulang sapi menggunakan HCl untukpembuatan gelatin. Makalah seminar nasional soebardjobrotohardjono.ISSN 1978-0427.

Poedjiadi, A. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press

Rediatning, W., & Kartini, N. 1987. Analisis Asam Amino denganKromatografi Cair Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom danPascakolom; Proceedings ITB Vol. 20 No. ½, 1987

Rohman,A dan Che Man,Y.B. 2011. Analysis of Pig Derivatives for HalalAuthentication Studies,Food review international, 28:97-112.

Rohman,A dan Sumantri, 2007. Analisis Makanan.Jogjakarta :Gadjah MadaUniversity press.

Rowe, R. C., Sheskey, P. J., dan Quinn, M. E. 2009. Handbook ofPharmaceutical Excipient Sixth Edition. USA: Pharmaceutical Press andAmerican Pharmacists Association 2009

Sahilah, A.M., Mohd. Fadly, L., Norrakiah, A.S., Aminah, A., Wan Aida,W.M., Ma’aruf, A.G dan Mohd. Khan, A. 2012. Halal MarketSurveillance of Soft and Hard Gel Capsules in Pharmaceutical ProductsUsing PCR and Southern-Hybridation on the Biochip Analysis.International Food and Research Journal 19 (1): 371-375 (2012)

Schrieber, R., & Gareis, H. 2007. Gelatine Handbook : Theory dan IndustrialPractice. Jerman: Wiley VCH Verlag GmbH dan Co. KGaA

Singh, S., Rao, K.V.R., Venugopal, K., Manikandan, R. 2002. Alteration inDissolution Characteristics of Gelatin-Containing Formulations; AReview of the Problem, Test Methods, and Solutions. PharmaceuticalTechnology April, 2002 tersedia online pada www.pharmtech.com

Waters. 2009. Amino acid analysis. Diambil dari www.waters.com/aaa,diakses pada 30 September 2012 pukul 11.45

Waters AccQTag Chemistry Package: Instruction Manual. MilliporeCorporation, April 1993

Widyaninggar, A., Triwahyudi., Triyana, K., dan Ab.Rohman. 2012.Differentiation between porcine and bovine gelatin in commercial

58


capsule shells based on amino acid profiles and principal componentanalysis. Indonesian J.Pharm Vol. 23 No. 2: 96-101 ISSN-p : 0126-1037

Winarno,F.G.1997.Kimia pangan dan gizi.jakarta.PT.gramedia pustaka utama.

Winarno, F. G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia.

59


LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Kerja

Ekstraksi gelatinmenggunakan aseton

Hidrolisis asam amino

DerivatisasiAnalisis menggunakan FTIR

Analisis menggunakan HPLC

Analisa data dengan PCA

Hasil Analisa

Kesimpulan

Hasil Spektrum

Hasil Kromatogram

Lembaran Kapsul Keras Simulasi 5 produk pasaran

Standar Gelatin

60


Lampiran 2. Hasil Interferogram

Spektrum FTIR Standar Gelatin Babi Duplo

Spektrum FTIR Standar Gelatin Babi 3

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs 3346

.50

3304

.06

3269

.34

3242

.34

1633

.71

1556

.55

1454

.33

1408

.04

1338

.60

1282

.66

1244

.09

1203

.58

1163

.08

1082

.07

1031

.92

721.

38

GB 50% 1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3315

.63

3292

.49

3278

.99

3265

.49

1633

.71

1552

.70

1454

.33

1408

.04

1336

.67

1282

.66

1244

.09

1203

.58

1165

.00

1082

.07

1033

.85

702.

09

GB 50% 2

61


Spektrum FTIR Standar Gelatin Sapi Duplo

Spektrum FTIR Standar Gelatin Sapi 2

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3319

.49

3305

.99

3273

.20

3261

.63

1633

.71

1556

.55

1454

.33

1408

.04

1338

.60

1282

.66

1244

.09

1203

.58

1165

.00 10

82.0

7

1033

.85

702.

09

GS 50% 2

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3315

.63

3304

.06

3273

.20

3261

.63

1631

.78

1554

.63

1454

.33

1406

.11

1338

.60

1282

.66

1244

.09

1203

.58

1163

.08 10

82.0

7

1033

.85

GS 50% 1.10

62


Spektrum FTIR Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Babi Simulasi Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3325

.28

3309

.85

3282

.84

3273

.20

3261

.63

1633

.71

1556

.55

1456

.26

1408

.04

1338

.60

1284

.59

1246

.02

1203

.58

1080

.14

1031

.92

KGB 1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3327

.21

3300

.20

3284

.77

3263

.56

1631

.78

1552

.70

1456

.26

1411

.89

1338

.60

1280

.73

1246

.02

1203

.58

1080

.14

1031

.92

KGB 2

63


Spektrum FTIR Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Sapi Simulasi Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3311

.78

3307

.92

3290

.56

3271

.27

3265

.49

3257

.77

1633

.71

1556

.55

1456

.26

1409

.96

1338

.60

1280

.73

1246

.02

1203

.58

1082

.07

1033

.85

709.

80

KGS 1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3317

.56

3307

.92

3298

.28

3282

.84

3271

.27

3263

.56

1633

.71

1556

.55

1456

.26

1409

.96

1338

.60

1280

.73

1246

.02

1203

.58

1082

.07

1031

.92

700.

16

KGS 2

64


Spektrum FTIR Sampel Kapsul A Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

3309

.85

3282

.84

3263

.56

3253

.91

1631

.78

1552

.70

1456

.26

1406

.11

1336

.67

1282

.66

1247

.94

1203

.58

1166

.93

1082

.07

1031

.92

kapsul A

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

3331

.07

3319

.49

3253

.91

1633

.71

1562

.34

1458

.18

1408

.04

1338

.60

1249

.87

1199

.72

1153

.43

1072

.42 10

26.1

3

kapsul A3

65


Spektrum FTIR Sampel Kapsul B Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

3354

.21

3317

.56

3255

.84

1631

.78

1552

.70

1452

.40

1408

.04

1336

.67

1247

.94

1203

.58

1151

.50

1078

.21 10

28.0

6

kapsul B1.1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3352

.28

3307

.92

3259

.70

3248

.13

1631

.78

1552

.70

1454

.33

1409

.96

1336

.67

1247

.94

1203

.58 11

47.6

5

1078

.21

1026

.13

709.

80

kapsul B2.1

66


Spektrum FTIR Sampel Kapsul C Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3356

.14

3329

.14

3309

.85

3253

.91

1635

.64

1556

.55

1458

.18

1411

.89

1369

.46

1340

.53

1240

.23

1166

.93

1083

.99 10

16.4

9

kapsul C1.1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3356

.14

3329

.14

3309

.85

3253

.91

1635

.64

1556

.55

1458

.18

1411

.89

1369

.46

1340

.53

1240

.23

1166

.93

1083

.99 10

16.4

9

kapsul C1.1

67


Spektrum FTIR Sampel Kapsul D Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3332

.99

3317

.56

3284

.77

3250

.05

1631

.78

1566

.20

1452

.40

1413

.82

1369

.46

1238

.30

1149

.57

1080

.14

1018

.41

715.

59

kapsul D1

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3321

.42

3315

.63

3280

.92

3265

.49

3251

.98

1631

.78

1554

.63

1454

.33

1406

.11

1336

.67

1246

.02

1203

.58

1165

.00

1082

.07

1031

.92

kapsul D2.1

68


Spektrum FTIR Sampel Kapsul E Duplo

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

Abs

3313

.71

3302

.13

3284

.77

3261

.63

1633

.71

1554

.63

1460

.11

1408

.04

1338

.60

1246

.02

1203

.58

1165

.00

1080

.14

1033

.85

704.

02

KAPSUL E

7501000125015001750200025003000350040001/cm

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Abs

3354

.21

3319

.49

3296

.35

3273

.20

3259

.70

1631

.78

1554

.63

1456

.26

1406

.11

1338

.60

1246

.02

1203

.58

1165

.00

1082

.07

1031

.92

KAPSUL E 2

69


Lampiran 3. Hasil Kromatogram

Kromatogram KCKT Standar Gelatin Babi Duplo

70


Kromatogram KCKT Standar Gelatin Sapi Duplo

71


Kromatogram KCKT Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Babi Simulasi Duplo

72


Kromatogram KCKT Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Sapi Simulasi Duplo

73


Kromatogram KCKT Sampel Kapsul A Duplo

74


Kromatogram KCKT Sampel Kapsul B Duplo

75


Kromatogram KCKT Sampel Kapsul C Duplo

76


Kromatogram KCKT Sanpel Kapsul D Duplo

77


Kromatogram KCKT Sampel Kapsul E Duplo

78


Lampiran 4. Rekaman Pengujian Asam Amino HPLC

Informasi Data KCKT Standar Gelatin Sapi Duplo

79


Informasi Data KCKT Standar Gelatin Babi Duplo

80


Informasi Data KCKT Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Sapi Simulasi

Duplo

81


Informasi Data KCKT Lembar Cangkang Kapsul Gelatin Babi Simulasi

Duplo

82


Informasi Data KCKT Sampel Uji A Duplo

83


Informasi Data KCKT Sampel Uji B Duplo

84


Informasi Data KCKT Sampel Uji C Duplo

85


Informasi Data KCKT Sampel Uji D Duplo

86


Informasi Data KCKT Sampel Uji E Duplo

87


Lampiran 5. Pembuatan Larutan

A. Pembuatan larutan standar asam amino

Dipipet 40 µl standar campuran asam amino, tambahkan 40 µl larutan

standar internal (6,45 mg α-aminobutyric acid dalam 25 ml HCl 0.1M)

dan 920 µl aquabides, homogenkan. Diambil 10 µl campuran standar,

tambahkan 70 µl AccQTag fluor borate, vortex selama 5 menit,

tambahkan 20 µl reagen fluor A, vortex, diamkan selama 1 menit.

Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C lalu suntikkan 5 µl pada

HPLC (Kabelova et al., 2009).

B. AccQ·Tag Fluor Reagen serbuk (Waters Corporation): serbuk kering

reagen derivatisasi AQC (Salazar et al., 2012).

C. AccQ·Tag buffer borat (Waters Corporation): buffer Borate digunakan

untuk memastikan pH optimum (8.8) untuk derivatisasi (Salazar et al.,

2012).

D. Pembuatan AccQ.Tag Flour Reagen

1 ml AccQ•Tag Fluor Reagen Diluent dimasukkan kedalam vial yang

berisi Waters AccQ•Tag Fluor Reagen serbuk, tutup vial kemudian

campuran di vortex selama 10 detik dan dipanaskan pada hot plate

55°C sampai larut (pemanasan tidak lebih dari 10 menit). Reagen dapat

disimpan di dalam lemari pendingin sampai 2 minggu (Kabelova et al.,

2009).

E. Pembuatan AccQ.Tag eluent A

Buffer asetat-fosfat (tambahkan 200 ml konsentrat dalam 2 L MiliQ-

Water) (Kabelova et al., 2009).

88


Lampiran 6. Gambar Penelitian

Serbuk standar gelatin sapi Serbuk standar gelatin babi

Pemisahan TiO2 Ekstraksi gelatin denganaseton -20oC

Endapan gelatinhasil ekstraksi

Larutan gelatin dimasukkanke dalam plat ATR Plat ATR

Seperangkat alat FTIR shimadzu

89


Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS GELATIN SAPI …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · Judul Skripsi : Analisis Gelatin Sapi dan Gelatin babi pada Produk