• Home

  • Documents

  • Tuyển Chọn Và Phân Loại Một Số Chủng Vi Khuẩn Đối Kháng Với Vi Khuẩn...
94
1 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------------------- HỨA THỊ SƠN Tuyển chọn và phân loại một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Tuyển Chọn Và Phân Loại Một Số Chủng Vi Khuẩn Đối Kháng Với Vi Khuẩn Ralstonia Solanacearum Gây Bệnh Héo Xanh Cây Lạc

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Tuyển Chọn Và Phân Loại Một Số Chủng Vi Khuẩn Đối Kháng Với Vi Khuẩn Ralstonia Solanacearum Gây Bệnh Héo Xanh Cây Lạc

Citation preview

  • 1 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn VIN SINH THI V TI NGUYN SINH VT -------------------- HA TH SN Tuyn chn v phn loi mt s chng vi khun i khng vi vi khun Ralstonia solanacearum gy bnh ho xanh cy lc LUN VN THC S KHOA HC H Ni 2010 B GIO DC V O TO VIN KHOA HC V CNG NGH VIT NAM

  • 2 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn VIN SINH THI V TI NGUYN SINH VT -------------------- LUN VN THC S SINH HC Tuyn chn v phn loi mt s chng vi khun i khng vi vi khun Ralstonia solanacearum gy bnh ho xanh cy lc Chuyn ngnh: Ha sinh hc M s: 60 42 40 Hc vin: Ha Th Sn Hng dn khoa hc: TS. L Nh Kiu H Ni 2010B GIO DC V O TO VIN KHOA HC V CNG NGH VIT NAM

  • 3 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn LI CM N Ti xin cm n phng o to v cc thy c gio ti C s o to sau i hc Vin Sinh thi v Ti nguyn Sinh vt, Vin Khoa hc v Cng ngh Vit Nam lun quan tm, to iu kin thun li cho ti trong qu trnh hc tp. Ti mun by t lng bit n su sc ti TS.L Nh Kiu, Ph vin trng Vin Th nhng Nng haVin Khoa hc Nng nghip Vit nam, ngi tn tnh hng dn, ch bo v nh hng cho ti trong sut thi gian thc hin v hon thnh lun vn thc s ny. Ti xin chn thnh cm n tp th b mn Vi sinh vt-Vin Th nhng Nng ha v tp th b mn Sinh hc Mi trng Nng nghip-Vin Mi trng Nng nghip gip , to iu kin cho ti trong qu trnh lm thc nghim cng nh chia s nhng kinh nghim trong cng vic ti c th hon thnh lun vn ng thi gian qui nh. Cui cng ti xin gi li cm n su sc ti nhng ngi thn trong gia nh, bn b v ng nghip to iu kin, ng vin v gip ti trong sut thi gian lm lun vn. Ti chn thnh cm n tt c nhng s gip qu bu ./. H ni, ngy 2 thng 12 nm 2010. Hc vin Ha Th Sn

  • 4 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MC CC T VIT TT A, T, G, C Adenine, Thyamine, Guanine, Cytosine ADN Acid deoxyribonucleic ALIV African lampeye iridovirus BIV bream iridovirus bp base pair DGIV Dwarf gourami iridovirus EBI European Bioinformatics Institute EDTA Ethylenediamin Disodium Tetra Acetate EHNV Epizootic haematopoietic necrosis virus GIV Grouper iridovirus GSDIV Grouper sleepy disease iridovirus ISKNV Infectious spleen and kidney necrosis virus kb kilo base LCDV Lymphocystis disease virus MCP Major capsid protein NCBI National Center for Biotechnology Information OIE World Organisation for Animal Health OSGIV orange spotted grouper iridovirus PCR Polymerase Chain Reaction RBIV Rock bream iridovirus RSIVD red sea bream iridoviral disease SBIV Red sea bream iridovirus SN-PCR Semi-nested - Polymerase chain reaction TAE Tris - Acetic EDTA TE Tris - EDTA 10 mM TGIV Taiwan Grouper Iridovirus

  • 5 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn MC LC Trang M U 1 CHNG I: TNG QUAN TI LIU 2 1.1. Tnh hnh trng trt trn th gii v Vit Nam 2 1.1.1. Tnh hnh sn xut lc trn th gii 2 1.1.2. Tnh hnh sn xut lc trong nc 3 1.2. Tnh hnh bnh hi lc trn th gii v Vit Nam 7 1.2.1. Tnh hnh bnh hi lc trn th gii 7 1.2.2. Tnh hnh bnh hi lc Vit Nam 14 1.3. Khi nim v kim sot sinh hc 16 1.4. Ti sao kim sot sinh hc li ph bin 17 1.5. Nhng vn trong kim sot sinh hc 18 1.6. C ch i khng 19 1.6.1.C ch khng sinh 19 1.6.2.Nhng hp cht d bay hi v enzim 21 1.6.3.S cnh tranh 22 1.6.4.S k sinh 23 1.6.5.S gim c tnh 23 1.6.6.Khng h thng (S kch khng) 24 1.7.Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng trong v ngoi nc 25 1.7.1.Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng ngoi nc 25 1.7.2.Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng trong nc 29 CHNG II.VT LIU V PHNG PHP NGHIN CU 31 2.1.Vt liu nghin cu. 31 2.1.1. Mu nghin cu 31 2.1.2. Cc mi trng phn lp vi khun 31 2.1.3. Thit b nghin cu 31 2.2. Phng php nghin cu. 33 2.2.1. Phng php phn lp v tuyn chn cc chng vi sinh vt i khng 33 2.2.2. Tuyn chn vi khun i khng bng phng php c l thch 34 2.2.3. Tuyn chn vi khun i khng bng phng php cy chm im 35 2.2.4. Nghin cu cc c im sinh hc ca cc chng vi khun i khng 36 2.2.5. Phn loi vi sinh vt i khng bng phng php gii trnh t on gen m ha phn t 16S ARN riboxom 39

  • 6 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1. Phng php PCR thng thng (n) 39 2.2.5.2. Phng php kim tra sch v xc nh nng 40 2.2.5.3 Phng php lm sch sn phm PCR 41 2.2.5.4 Phng php tch dng v xc nh trnh t gen 43 a. Phng php tch dng 43 b. Phng php gii trnh t gen 46 2.2.5.5 Phng php tin sinh hc (s dng phn mm NCBI, EBI, Expasy) 46 CHNG III. KT QU V THO LUN 47 3.1. Thu mu, phn lp v tuyn chn vi khun i khng 47 3.2. nh gi hot lc i khng ca cc chng vi khun 50 3.3. c im sinh hc ca cc chng vi khun i khng 52 3.4. Mt s c im c bn ca cc chng vi khun i khng 54 3.4.1.Mt s c tnh sinh l, sinh ha ca cc chng vi khun i khng 54 3.4.2. nh gi nh hng ca cc chng vi khun i khng n qu trnh ny ca lc 57 3.4.3. nh gi hiu qu phng tr bnh ho xanh do R. solanacearum ca cc chng vi khun i khng 58 3.4.4. nh gi nh hng ca cc chng vi khun i khng ln qu trnh sinh trng v pht trin ca lc 61 3.5. Xc nh vi tr phn loi cc chng vi khun nghin cu bng phng php gii trnh t on gen m ha phn t 16S ARN riboxom 63 CHNG IV. KT LUN 75 CHNG V. KIN NGH 76 CHNG VI. TI LIU THAM KHO 77

  • 7 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn MC LC BNG Trang Bng 3.1 Ngun gc v c im hnh thi ca cc chng vi khun 47 phn lp c Bng 3.2 Hot lc i khng ca cc chng vi khun vi i din cc chng vi khun 50 gy bnh ho xanh R. Solanacearum Bng 3.3 Mt s c im sinh hc ca 8 chng vi khun i khng 52 Bng 3.4 Mt s c im sinh hc c ca cc chng vi khun i khng 55 Bng 3.5 nh hng ca 8 chng vi khun i khng ln kh nng ny mm 57 ca ht lc Bng 3.6 Hiu qu phng tr bnh ho xanh do R. solanacearum ca cc 58 chng vi khun i khng trn lc trong iu kin nh knh Bng 3.7 Cc ch tiu sinh trng ca lc khi c b sung 61 vi khun i khng Bng 3.8 Kt qu so snh trnh t on 16S ARN riboxom chng TH24 vi 71 cc chng vi khun trong ngn hng gen quc t Bng 3.9 Kt qu so snh trnh t on 16S ARN riboxom chng NA10 vi 72 cc chng vi khun trong ngn hng gen quc t Bng 3.10 Mt s c im sinh hc c ca cc chng vi khun i khng 73

  • 8 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn MC LC HNH Trang Hnh 3.1 Hot tnh i khng ca mt s chng vi khun i khng vi 51 R. solanacearum BHT gy bnh ho xanh lc Hnh 3.2 Hnh thi khun lc in hnh ca mt s chng 53 vi khun i khng i din Hnh 3.3 Hnh thi t bo chng vi khun TH24 chp di knh hin vi 54 in t vi phng i 20.000 ln Hnh 3.4 Hiu qu phng tr bnh ho xanh do vi khun ca cc chng 60 vi khun i khng trn Lc Hnh 3.5 in di ADN tng s ca hai chng vi khun nghin cu 64 Hnh 3.6 in di sn phm PCR ca cc chng vi khun nghin cu 65 Hnh 3.7 Tuyn chn cc khun lc mang gen m ha on 16S ARN riboxom 66 ca cc chng vi khun NA10 v TH24 bng phng php colony PCR Hnh 3.8 Tch v kim tra plasmid mang on gen m ha phn t 16S 67 riboxom ca cc chng vi khun i khng Hnh 3.9 Kt qu tinh sch vect ti t hp bng enzim ARNaza 68 Hnh 3.10 Trnh t nucleotit gen m ha phn t 16S ARN riboxom ca 70 chng TH24 Hnh 3.11 Trnh t nucleotit gen m ha phn t 16S ARN riboxom ca 70 chng vi khun NA10

  • 9 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn M U Bnh ho xanh cy trng do khun Ralstonia solanacearum l mt bnh ph bin v nghim trng nhiu loi cy trng nh c chua, khoai ty, lc, t, gng... (1, 2, 54,58,57). y l bnh ch yu lm gim nng sut v mt ma lc nhiu nc nh Trung Quc, Thi Lan, Vit nam, Indonesia... Hng nm dch bnh c th gy thit hi t 50-80% nng sut cy trng. Tnh hnh gy hi l nh vy nhng cho ti nay nhng nghin cu v bnh ho xanh vi khun lc v vng ch yu ch gii hn trong phm vi xc nh mc thit hi, s phn b ca bnh v bc u xc nh ngun gen khng trong tp on cc ging hin c. Kim sot dch bnh bng phng php sinh hc (kim sot sinh hc) ang dn tr thnh xu hng ph bin v c p dng rng ri trong nng nghip nhiu nc trn th gii. Bng vic p dng cc bin php sinh hc ngi ta c th thay th cc loi thuc tr su ha hc c hi n sc khe con ngi v mi trng sinh thi. Trong bin php s dng vi sinh vt nh mt tc nhn kim sot v phng nga bnh hi ang dn tr ln ph bin (5, 7) v hiu qu r rt m n mang li, cc chng vi sinh vt la chn phi c hot tnh i khng cao, n nh trong thi gian di v khng gy hi cho ng, thc vt. Vi mc ch ny ti c giao nhim v thc hin ti Tuyn chn v phn loi mt s chng vi khun i khng vi vi khun Ralstonia solanacearum gy bnh ho xanh cy lc.

  • 10 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn CHNG I. TNG QUAN TI LIU 1.1. Tnh hnh trng lc trn th gii v Vit nam 1.1.1 Tnh hnh sn xut lc trn th gii Trong cc loi cy trng lm thc phm cho con ngi, lc c v tr quan trng. Mc d c ngun gc t lu i nhng tm quan trng kinh t ca cy lc 36 c xc nh cch y khong trn 100 nm. Khi nhng xng p du Macxy (Php) bt u nhp cng lc t Ty Phi, m u cho thi k dng lc p du trn qui m ln. Cng nghip p du hnh thnh v pht trin nhanh chng cc nc Chu u v lan ra trn ton th gii. Phn ln din tch trng lc trn th gii cn sn xut theo li c truyn, k thut canh tc lc hu. Nhng nm gn y nh ng dng cc tin b khoa hc k thut mi vo sn xut nng sut lc c nng ln. Tuy nhin cc tin b k thut cc nc khng ng u, cc nc pht trin nng sut lc tng nhanh cn cc nc chm pht trin th hng nm nng sut lc tng khng ng k. Cc nc c nng sut lc tng nhanh l: M trong vng t nm 1961 n 1975 nng sut bnh qun tng t 1.564kg/ha ln 2.875kg/ha. Trung Quc chng trnh nghin cu nng cao nng sut lc c tin hnh t 1979 v t c kt qu kh quan. Cc thnh tu v chn ging lc trong nhng nm 80 c ng dng vo sn xut to nn cc in hnh nng sut cao nh ging Nonghua 22 t nng sut trung bnh 4.219kg/ha min trung v min nam Trung Quc. Ngoi ra nhiu ging lc mi c nng sut cao v ang c a ra sn xut v m rng (5, 14). Cy lc c trng tt c cc chu lc vi trn 100 nc trn th gii, din tch trng lc khong 20-21 triu ha, nng sut bin ng t 11-12t/ha v

  • 11 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn sn lng t 23-34 triu tn/nm. Din tch trng lc ln nht tp trung chu chim 63,17%. Chu Phi chim 31,81%. Nhng nc trng lc ln trn th gii l n , Trung Quc, M, Indonesia, Xenegal, Min in, Xu ng, Nigeria, Zaia v Achentina (8, 21). Nc c din tch trng lc ln nht l n (8,6triu ha) Sau l trung Quc (2,65 triu ha) tip n l Nigeria (1,0 triu ha). Nng sut lc chu M, chu u v vng cn ng bnh qun t 2,2tn/ha. Nng sut lc chu i Dng ch tng ng nng sut bnh qun ca th gii (1,1 tn/ha) v c bit nng sut lc cc nc chu Phi v cc nc ang pht trin nng sut lc cn thp di 1.000kg/ha (chu Phi ch t 0,7 tn/ha cn thp xa so vi mc bnh qun ca th gii). Nng sut t cao nht th gii l Israel t 6,8 tn/ha, th hai l Irc (3,4 tn/ha) th ba l M vi (2,8 tn/ha) v tip n l Trung Quc 2,1 tn/ha. Tuy nhin mt vi nm tr li y nng sut lc ca mt s nc tng ln ng k. n nng sut trn din tch trng hp t 5 tn/ha, cn Trung Quc trn din rng t 6,0-7,5 tn/ha (Newsletter-ICRISAT, 1997). V xut khu chu v chu M l hai chu lc c khi lng lc xut khu ln nht chim 78,56% khi lng lc xut khu th gii. Trong s cc nc xut khu lc chnh th M l nc ng u v xut khu lc trn th gii chim 28,1%, theo sau l Trung Quc v Achentina. Hu ht cc nc xut khu lc chnh u thuc cc chu lc sn xut nhiu lc nh chu , chu Phi v chu M (21). 1.1.2 Tnh hnh sn xut lc trong nc Theo s liu ca cc thng k : Vit Nam, cy lc c xc nh l cy cng nghip ngn ngy c v tr quan trng, din tch t trng lc chim gn 40% so vi tng s din tch cy cng nghip ngn ngy v chim t trng ln nht. Trong thi k Php thuc din tch lc min Bc khong 4.600ha. Sau

  • 12 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn ngy ho bnh 1954 din tch lc c m rng kh nhanh. Giai on 1975-1989 l giai on m rng sn xut, t nm 1975 din tch trng lc ca c nc mi c 68.000 ha, n u nm 80 th k XX l 100.000 ha. Tc tng trng din tch-nng sut-sn lng tng i u t 1975 n 1998 din tch tng 6,16% nm nhng nng sut ch tng 1,8% nm, sn lng tng 8,08 % nm. - Trong nhng nm u ca thp k 80 din tch v nng sut, sn lng lc ca ta cn rt thp, din tch t trng lc giao ng trong khong 106.000-170.000ha, sau tng dn t nm 1985 v t 237.800ha vo nm 1987 (din tch lc tng gp 3 ln nm 1960) ko theo sn lng tng mc d nng sut tng chm. Trong giai on ny sn lng tng (8,62% nm) ch yu l do tng din tch (8,33%), nng sut tng chm ch t 0,22% nm. - T nm 1988-1991 din tch lc gim do mt th trng tiu th truyn thng, nhng nm 1990 l nm u Vit Nam vt ngng nng sut 1,0 tn/ha. - T nm 1991 c din tch, nng sut v sn lng u tng nhanh, c bit l nng sut. Nm 1995 nng sut tng 34,7% so vi 1989 v 20,8% so vi 1990. Nm 1995 c din tch trng lc 259.000ha, nng sut t 12,8t/ha v sn lng t 334.000 tn. - Nm 1998 din tch trng lc ca c nc t 269.400 ha, nng sut bnh qun 14,3 t/ha, tng sn lng 386.000 tn. Nh vy ch trong vng 10 nm gn y nng sut lc tng gn 30%. - Hin ti cy lc c trng ph bin v quen thuc ca nhn dn ta t Min Bc n Min Nam v c trng hu ht cc tnh thnh trong c nc, lc trng nhiu cc tnh khu 4 c (26,4%), ng nam b (25,5%), Trung du min ni pha Bc (15,7%), Duyn hi Nam trung b (10,7%). Ty Ninh l tnh c din tch trng lc ln nht (40.000ha) sau l Ngh An (28.000ha).

  • 13 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Cc tnh: c lc, Bnh Dng, Qung Nam, TP H Ch Minh sn lng t trn 10.000-20.000tn/nm. Ty Ninh, Ngh An, Thanh ha, H Tnh, Long An l cc tnh c sn lng t trn 20.000tn/nm. Tng sn lng lc ca 5 tnh ny chim trn 50% tng sn lng lc ca c nc. Trong khi din tch trng lc ch chim hn 40%. Cc tnh c nng sut lc bnh qun 15-19,5t/ha: Long An, Tr Vinh, Bn Tre, Hi Phng, Thi Bnh. Nhng tnh t nng sut bnh qun trn 20t/ha nh Sc Trng 40 t/ha, An Giang 26,7 t/ha, ng Thp 25 t/ha, TP. H Ch Minh 21,5 t/ha, Ty Ninh t nng sut bnh qun 22,8t/ha trn din tch 40.000ha. Nm 2000 din tch v sn lng lc tng r rt, nng sut t 1,5 tn/ha. Mt trong nhng yu t quan trng nht gp phn nng cao nng sut lc l do vic p dng cc tin b k thut. Mc tiu ca nc ta n nm 2005, nng sut bnh qun t 1,5-2,0tn/ha v din tch trng lc t 400.000ha. Nc ta hnh thnh vng sn xut tp trung, c khi lng lc hng ha ln. Cc vng trng lc nc ta gm: (tng quan nng nghip Vit Nam, 2000) : - Vng trung du Bc B ch yu l cc tnh Bc Giang, Thi Nguyn, Vnh Phc, Ph Th. Lc trng trn t bc mu, ngho dinh dng, b ra tri mnh. Nng sut lc khng cao, trung bnh 8,0-9,5t/ha nhng lc l cy trng c kh nng em li hiu qu kinh t cao hn nhiu loi cy trng khc, hn na lc cn ng vai tr tch cc ci to t bc mu. Din tch hin ti khong 41.000 ha (Chim 15,7%). Kh nng m rng cn rt ln.

  • 14 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn - Vng khu 4 c (Vng ven bin Bc trung b): gm cc tnh Thanh Ho, Ngh An, H Tnh y l vng trng lc ln c kh nng cho nng sut cao. Lc trng ch yu trn t ct th ven bin. Vng ny t ai tng i ph hp vi cy lc. Mt phn din tch l t ph sa ven sng v t dc bn sn a. Hin ti din tch t trn 71.000 ha (Chim 26,4%). - Vng ven bin Nam trung b: Lc c trng tp trung hai tnh Qung Nam v Nng vi din tch khong 29.000 ha (chim 10,7%). - Vng ng bng Bc B gm cc tnh H Ni, H Ty din tch 18.900ha, nng sut 10,7t/ha. - Vng ng Nam b: gm thnh ph H Ch Minh, Ty Ninh t trng lc y l t xm nh v thot nc, ti tiu thun li t nc h Du Ting. V th tim nng pht trin lc y l rt ln, din tch 65.900ha, nng sut bnh qun 17,5t/ha. - Vng cao nguyn Nam b, din tch trng lc vo khong 18.600 ha (chim 6,9%), ch yu tnh c Lc v Gia Lai Komtum. Lc tr thnh cy trng quan trng hng u v mt xut khu v nhu cu tiu th ca nhn dn. Nhng nm trc y th trng xut khu lc ca ta ch yu l cc nc ng u v Lin X c. T nm 1988 do khng hong chnh tr su sc khu vc ny lm mt th trng xut khuu lc truyn thng ca nc ta. Nhng nm gn y Vit Nam tip cn vi th trng mi gi lc c phc hi. Tuy nhin gi lc xut khu ca nc ta mi ch bng 60-70% so vi gi xut khu ca M v Trung Quc, do cht lng lc ca Vit Nam thp hn c v trng lng v hm lng du. Ngoi ra lc ca chng ta ch yu vn cn

  • 15 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn phi xut qua cc nc trung gian nh: Singapore, HngKng, gi xut khu nm 1995 l 650 USD/tn. Nm 2001 xut khu 80 nghn tn lc t 39,1 triu USD tng so vi nm 2000 l 105,4%nghn tn, tr gi tng 95,3% USD (s liu ca Cc thng k, sn xut th trng NN&DTNT s 6,7/2002) Nhu cu tiu th lc trong nc cn rt ln. Theo nh gi ca t chc sc khe th gii (WHO) th hin nay mc tiu th du, m ca ngi Vit Nam cn rt thp, bnh qun 3kg/ngi/nm. Trong khi mc khuyn co l 20kg/ngi/nm. 1.2. Tnh hnh bnh hi lc trn th gii v Vit Nam 1.2.1. Tnh hnh bnh hi lc trn th gii. Thc t trng lc cc nc trn Th gii ni chung v Vit Nam ni ring gp rt nhiu kh khn, do xut hin nhiu loi su bnh gy hi ch yu nh 1/ Bnh cht ho cy Bnh cht ho c nhiu nguyn nhn. Bnh cht ho lc: Pht sinh hu ht cc vng trng lc ca th gii v cng nh Vit Nam v bao gm nhiu tc nhn gy hi khc nhau. Theo D.Morris Poster v Donal. H. Smith (34) tp hp cc kt qu nghin cu nhng bnh truyn qua t v cho thy rng c 17 loi bnh gy ho lc do 17 loi vi sinh vt khc nhau gy ra nh nm Sclerotium, Fusarium, Cylindrocladium, Pythium, Rhizoctonia, Aspergillus niger, Aspergillus flavus cng vi mt s nm khc v vi khun Pseudomonas solanasearum. Cc tc gi phn chia cc nhm bnh theo triu chng b hi nh: bnh hi trn thn, trn c r, trn r, tia v qu.

  • 16 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2/ Bnh thi thn lc (Stem rot) Bnh thi thn lc c bit n nh l bnh mc trng, bnh thi thn min Nam, bnh chy l min Nam v bnh thi Sclerotium. Bnh c pht hin thy hu ht cc vng trng lc ch yu trn th gii. Nng sut gim do bnh l 25%. c ni cn ln ti 80%. y l loi bnh gy hi lc nhiu nht M (35). Nghin cu v vi sinh vt gy bnh, cc tc gi cho rng nm Sclerotium rolfsii sn sinh mt lng ln axit axalic, c t c sn sinh lm bin i mu trn ht v cng gy nn nhng m cht hoi ca l giai on u bnh pht trin (40). Nm gy bnh sng st nh l nm hoi sinh trn tn d cy trng, thm tr c trn tn d ca nhng cy trng khng phi l k ch (40). Hch nm tn ti t nm ny n nm khc tng t b mt, nhng khng th tn ti trong nhiu nm khi t b ngp su. Nghin cu cc th nghim phng tr bnh ny bng thuc ho hc, cc tc gi cho rng thuc tr nm Sterol c hiu qu cao. Bin php phng tr sinh hc i vi nm ny iu kin ngoi ng rung c p dng, tc gi dng nm Trichoderma harzianum Ripai, tuy nhin hiu qu phng tr khng cao. 3/ Bnh chy Sclerotinia (Sclerotinia blight) Bnh ny c quan st u tin trn cy lc Argentina nm 1992 v hin nay bnh c pht trin hu ht cc nc trng lc trn th gii (34). Nm Sclerotium minor Jagger l tc nhn gy bnh. Cc tc gi cho thy Sclerotinia minor qua ma ng dng hch, tng t cy c su 20 cm. Di nhng iu kin mi trng thch hp, hch ca Sclerotinia minor pht trin thnh h si nm. Nhng b phn ca cy gn hoc tip xc vi t v gn ni hch ny mm u b nhim bi h si nm trng. Nghin cu cc bip php phng tr, tc gi cho rng s dng thuc ni hp v xng hi c kh nng lm gim bnh.

  • 17 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 4/ Bnh thi Pythium (Pythium disease) Hu ht cc loi pythium c th gy thi qu, gy cht cy con v gy thi r lc (37). Nm Pythium sng trong t v c th tn ti nh l mt loi nm hoi sinh, nm c phm vi k ch rng. Cc tc gi cho rng bo t non l cu trc sng st u tin ca nm Pythium myriotylum trong t. ng bo t v bo t ti c thi gian sng ngn hn. Si nm c sn sinh bi ng bo t hoc ny mm ca bo t non. S xm nhp xut hin trong 2 gi ti 30-340C v khng xut hin nhit di 250C. Nghin cu cc bin php phng tr kt qu cho thy nhng thuc tr nm c ph tc ng rng hoc s dng phi hp mt s thuc tr nm l cn thit phng tr bnh hi ny (39). Mc d vy cc tc gi u thy phng tr bnh Pythium ca lc trn ng rung l rt kh khn, bin php lun canh cy trng l t hiu qu. 5/ Bnh ho Rhizoctonia Nm Rhizoctonia sn sinh nhiu hch trong m cy ch. Hch c kt tp li ca nhng si nm dy, n tn ti trong t vi s c mt ca cy ch v s c ny mm khi c kch thch bi nhng dch r chy ra t cy ch b nhim bi vic b sung cht hu c vo t. Nm Rhizoctonia sn sinh ra enzym Cellulolitic, Pectinolitic v c t thc vt m c t ny git cht m ch. Khi m b cht v b phn hu, n gii phng cht hu c v tip tc lm tng s sinh trng ca nm. 6/ Bnh ho Fusarium Nm Fusarium. spp c mt tt c cc loi t trng lc v tp trung gn m cy lc sng. Nhn chung c phn lp t m r, t ht, tr di ca l mm v l mm ca ht va ny mm.

  • 18 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn C 17 loi Fusarrium c phn lp t t xung quanh vng r hoc c lc, c r, tia(39). Tuy nhin tc gi xc nh 4 loi gy bnh trn lc - Fusarium solani f.sp phaseoli - Fusarium oxysporium - Fusarium roseum - Fusarium tricinctum Nm Fusarium spp sng hoi sinh trong t v trn tn d cy trng. Nhiu loi Fusarium sn sinh bo t hu (Chlamydospores) v y cng chnh l ngun bnh ly lan cho v sau. Nghin cu cc bin php phng tr bin php lun canh cy trng c ngha lm gim bnh. Trnh trng lc t ngho axt v nng cao ph ca t bng cch bn b sung cht hu c c th lm gim bnh Fusarium gy nn. 7/ Bnh thi thn (Charcoal Rot) Do nm Macrophomina phaseolina gy hi. Nm bnh lan truyn qua t v ht ging. Si nm trong ht v hch tn ti trn tn d cy trng trong t. Hch nm c th duy tr tn ti trong iu kin t kh trong nhiu nm. Nhng chng cng mt sc ny mm nhanh chng. 8/ Bnh thi vng Diplodia (Diplodia collar rot) Bnh thi vng Diplodia xut hin ri rc khp cc vng trng lc trn th gii nhng t gy nn thit hi quan trng v kinh t. Tc nhn gy bnh sng hoi sinh trong t, c th k sinh yu. Tuy nhin nhng din tch trng lc lin tc hoc lc c trng lun canh vi cy trng khc m b nhim bnh ny th t l lc b bnh nng cng lm gim nng sut trn 25% (66).

  • 19 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Bin php phng tr: bin php lun canh lc vi nhng cy ch khng phi l k ch ca nm bnh c th lm gim s gy hi ca bnh v s dng ging chng bnh. 9/ Bnh ho Verticillium (Verticillium Wilt) Bnh pht hin u tin chu t nm 1937. Nm bnh lan truyn trn ng rung nh gi, nc v c qua cng c chm sc lc ca ngi nng dn t nhng din tch b nhim ti nhng din tch cha b nhim (68). hn ch tc hi ca bnh cc tc gi cho rng vic s dng ht ging sch bnh l c ngha, v to dng, ging chng bnh hi ny 10/ Bnh chy Botrytis (Botrytis blight) Bnh c pht hin hu khp cc nc trng lc trn th gii, tuy nhin tc hi ca bnh thng nh. Mc d vy tu tng nm, tu tng iu kin kh hu ca tng nc m bnh tr nn quan trng v lm gim nng sut lc ng k (66) Nm Botrytis cinecea pers. ex fries l nguyn nhn gy bnh chy Botrytis. Nhit di 200C, m nhiu sng hoc c ma nh, ma phn l rt thch hp cho nm bnh pht trin v ly lan. Ngun bnh qua ng dng hch trong t (64). Theo Poter, D.M cho rng trng lc sm cng trnh c giai on mn cm ca bnh. 11/ Bnh thi vng (Aspergillus crown rot) Bnh pht hin u tin Sumatra 1926. Ngy nay bnh thi vng tr thnh mt i tng quan trng ca tt c cc din tch trng lc trn th gii. Nhiu ni nng sut gim 50% do s gy hi ca bnh. Nm gy bnh c xc nh l Aspergillus niger. Chng tn ti trong t v trong ht ging. Dng thuc tr nm nh: Captan v Thiramin x l ht ging nhm tiu dit ngun bnh trn ht v bo v s xm nhim ca nm bnh t t l c hiu qu.

  • 20 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 12/ Bnh mc vng (Yellow mold) Nm bnh xm nhim v pht trin trn cy lc cn non, trn qu lc v ht lc trong t trc khi thu hoch v chng cng xm nhp vo c v ht lc trong giai on thu hoch v bo qun (32) Nm Aspergillus flavus c xc nh l nguyn nhn gy nn bnh mc vng. Theo tc gi y l mt loi nm hoi sinh sng c trong nhiu loi t v c th tn ti trn tn d cy trng. Kh nng gy bnh ca chng lin quan n thnh phn vi sinh vt c trong t, m cy ch v s xut hin ca cc iu kin thun li cho nm bnh. Nm c th sinh trng trong khong nhit t 17-420C. Tuy nhin nhit cho nm pht trin tt l 25-350C v m thp. Nm pht trin trn c v ht lc nhanh chng trong iu kin kh ( m khng kh l khong 70%). Song m ca ht lc t 7-9% l khng thch hp cho s xm nhim v pht trin ca nm ny (42). p dng bin php lun canh cy trng v s dng phn bn thch hp lm gim s gy hi ca vi sinh vt truyn qua t, p dng vic ti nc trong lc kh hn trnh cho cy b hn bt buc. Thu hoch kp thi khi a s qu lc va c chn ti, phi lc t m di 9 % hn ch s xm nhim ca nm vo ht trong thi gian bo qun (65). Trng nhng ging chng chu vi bnh thi qu v nhng nm sn sinh c t khc. 13/ Bnh ho vi khun (Bacterial Wilt) Bnh c quan st t nm 1950 Indonexia. Hin nay bnh phn b rng khp cc vng trng lc trn th gii. Song bnh pht trin tp trung Chu Phi v Chu (52). Nguyn nhn gy bnh c xc nh l Ralstonia solanacearum. y l loi vi khun ho kh, khng hnh thnh bo t, hnh gy, gram m (1954). Vi khun R.solanacearum c phn b vng nhit i c

  • 21 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn iu kin m v m. Vi khun tn ti trong t v tip tc ly bnh cho v sau v trn cy c cng k ch v c nhng cy c di khc. V vy, lun canh lc vi cc cy cng k ch nh thuc l c th lm tng mc bnh (56). Nghin cu v s phn b a l v tm quan trong kinh t ca bnh, cc tc gi cho thy rng bnh ho xanh vi khun gy nn thit hi quan trng v nng sut lc Indonexia (58), Trung Quc (44, 57, 75) v mt phn ca Uganda (70). C nhiu nc bnh ho xanh do vi khun R.solanacearum l cha quan trng hoc tnh trng ca bnh l khng chc chn. Nghin cu cc dng vi khun R.solanacearum trn lc cho thy c 3 trong s 5 biovar ca R .solanacearum l c nh gi i vi vi khun gy ho lc, da trn c s khc nhau ca vic s dng v oxy ho hon ton vng ru v ng a (43). Nghin cu v c tnh v sc gy bnh cc tc gi Kelman v Person (56) ch ra c s sai khc r rng v c tnh trong s nhng dng vi khun R.solanacearum trn lc. Bnh ho xanh vi khun gy hi nng trn t tht nng (57). Mc d vy bnh cng c pht hin thy t ong v t ct mn trng. Trung Quc hu ht cc cnh ng b bnh nng li l t ct. Nhiu th nghim cho thy bnh pht sinh nng hn t st hn l t ct (19). Cng mt loi t, m c ngha i vi bnh ho xanh vi khun lc. m cng cao bnh ho xanh vi khun cng nng (57). Nhit t cao ngay u v lc thch hp cho bnh ho xanh vi khun gy hi giai on cy con. Nhit t khong 250C ti su 5 cm cng vi m t cao thch hp cho s pht trin ca bnh (75). Nghin cu bin php phng tr, kt qu nhiu nc cho thy lun canh lc vi nhng cy trng khc c bit i vi cy la l hiu qu nht (75). Lun canh vi la trong sut 3 nm hoc trn 3 nm coi nh min dch v thm ch khng thy bnh ho xanh vi khun pht sinh. Cc th nghim dng x khun

  • 22 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn i khng phng tr bnh ho xanh vi khun c p dng. Hu ht cc dng ca Streptomyces c nui cy nhn to, nhng khng c hiu qu phng tr bnh ho. 1.2.2. Tnh hnh bnh hi lc Vit Nam. Nhng nghin cu v bnh cht ho: T nhng nm 1960, ngi ta pht hin thy bnh cht ho trn ng rung, c bit nhng cnh ng lc trng tp trung v tip tc gia tng nhng ni m lc c trng lin tip. Mc d vy ngi nng dn vn cha c bin php c th hn ch s gy hi ca bnh ny. Nm 1967-1968, kt qu iu tra mt s tnh trng lc ch yu thuc min Bc Vit Nam, ban iu tra c bn su bnh hi cy trng ca B Nng nghip cng b c 2 hin tng gy bnh cht ho. Nguyn nhn gy ho do nm Aspergillus niger v Fusarium solani. Nhng i tng bnh ny c ghi nhn cc vng trng lc ca tnh Bc Thi, H Bc, Ngh An v Vnh Ph (Vin bo v thc vt- U Ban Nng nghip Trung ng, 1968). Cng trong thi gian ny ng Thi Thun v CTV cng tin hnh nghin cu bnh cht ho hi lc. Tc gi cho rng nguyn nhn gy bnh l do vi khun Ralstonia solanacearum. Tc gi cho thy bnh pht sinh v gy hi hu khp cc vng trng lc thuc cc tnh: Ngh An, H Tnh c bit nhng din tch lc dc sng Lam, Thanh Chng, Hng Nguyn cng c bnh cht ho lc nhng mc nh hn. Nhng ni khc bnh pht sinh v gy hi khng ng k. Bnh cht ho xut hin tt c cc loi t, cc loi rung, rung trn i, rung trn xoi, ngoi bi, trong ng, ni no c trng lc t nhiu u c bnh. mi a phng din tch b hi cng nh mc tht thu c khc nhau. Cc x thuc dc sng Lam b hi nhiu nht (10-30%), nhng ni khc bnh tuy cn nh nhng tr thnh mt iu ng ch . Nghin cu nh hng ca bnh

  • 23 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn cht o n cy lc mt s tc gi cho rng cy b bnh lm nh hng s pht trin ca b r lm gim s nt sn trn r, s qu trn cy gim r rt. T nhng nm 1966-1967, kt qu iu tra bnh cht o Nam n, Hng Nguyn, Nghi Lc, Din Chu, Yn Thnh, Qunh Lu, Thanh Chng, Lng trn cc loi rung t khc nhau. Cc tc gi c nhn xt nh sau: t c hm lng kali cao bnh nh hn t ngho kali. Kt qu thu c t th nghim phn bn cng cho thy rng: Ln, Kali lm tng sc chng bnh (4,13). Cc bin php nh: x dch thi gian gieo trng; iu chnh mt , khng nh hng n s pht trin ca bnh. Tc gi cng cho rng cha c bin php no khng ch c hiu qu mt khi pht sinh bnh. Bin php phng tr bnh l bin php lun canh. Thc tin ca nhng vng trng lc nh: Thanh Chng, Nam n, Hng Nguyn cho thy ni no c lun canh vi cy ma mt, hai v sau tr li trng lc th hu nh khng b bnh hoc b bnh rt nh. Nm 1977-1978, kt qu iu tra su bnh hi lc ca Vin Bo v thc vt mt s tnh trng lc thuc cc tnh min Nam Vit Nam cho thy, bnh cht o do nm Rhizoctonia v Sclerotium rolfsii gy nn. Tu theo tng loi t v iu kin canh tc m mc gy hi ca chng c khc nhau (Vin Bo v thc vt, 1977-1978). Cui nhng nm 1980 phng Bnh cy Vin Bo v thc vt tin hnh nghin cu bnh hi lc. Kt qu cho thy trn cy lc b ho do cc tc nhn sau: Nm A. niger, fusarium, Verticillium. Rhizoctonia v vi khun R. solanacearum. Nhm tc gi tin hnh x l ht ging phng tr nhm bnh hi ny. Song kt qu thu c ch dng li th nghim trong phng v th nghim nh. Vit Nam c nhng kt qu iu tra v nghin cu bnh gy ho trn lc. Song so vi ti liu nc ngoi th thnh phn bnh vn ngho

  • 24 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn nn. Mt s bnh cht ho c pht hin Min Bc Vit Nam. Bnh gy cht ho lc ch yu do nm gy nn, ch c mt bnh do vi khun (bnh ho xanh). Hin nay bnh ho xanh (R.solanacearum) l bnh ph bin trn cy lc. Bnh thng pht sinh trn r, thn, tia, c, v c v ht lc nhiu din tch lc, c bit vng t ct ven sng Lam t l bnh ho xanh vi khun ln ti 40-50%. Cy b bnh gy hin tng ho t ngt ca thn v l. Cy lc cht nhng b l vn gi xanh song v sau b l chuyn sang mu vng. Nhng cnh ring r c th ho v cht hoc ton b cy cht. Trong thi gian gn y c phn hu c vi sinh a chc nng c kh nng hn ch bnh ho xanh trn lc t 15-20 %. Tuy nhin do bn cht khng bnh v s bin i c tnh c ca cc chng vi khun gy bnh ho xanh trn ton Th gii, cho nn cc bin php phng tr bnh ny cng tr nn phc tp v kh khn. c bit s dng thuc bo v thc vt ha hc khng mang li hiu qu nh mong mun m cn gy nh hng nghim trng ti mi trng. Ngy nay, cc bin php phng chng thay th bng phng tr sinh hc ang thu ht c s quan tm ca nhiu phng th nghim trn Th gii v trong nc, kt qu cho thy nhiu ha hn v y cng s l bin php rt cn thit thay th cc loi thuc bo v thc vt ho hc trong tng lai. 1.3. Khi nim v kim sot sinh hc. Kim sot sinh vt hc l s dng cc sinh vt t nhin hoc sinh vt bin i gen, gen hoc cc sn phm ca gen, lm gim bt s nh hng ca cc sinh vt hi nh mm bnh thc vt theo hng c li cho cc ma v (69). Khi nim v kim sot sinh hc rt rng v n bao gm c s bin i gen ca cy ch. Tuy nhin, tiu im chnh ca kim sot sinh vt hc s l s dng cc sinh

  • 25 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn vt t nhin v sinh vt bin i gen nh l nhng tc nhn kim sot bnh thc vt. Tc nhn sinh hc c bit n l nhng sinh vt i khng v nhng sinh vt i khng ny s s dng cc c ch i khng t nhin lm gim kh nng sng st hoc s hot ng ca cc mm bnh thc vt. S i khng nhm mc ch lm tng s chng li nhau ca cc sinh vt bao gm s khng sinh, s cnh tranh v s k sinh. Sinh vt i khng kim sot c bnh thc vt bng cch tiu dit nhng cht cha ngun bnh, loi tr mm bnh ra khi vt ch, ngn cn hoc chim ch ca mm bnh sau khi mm bnh xut hin (29). 1.4. Ti sao kim sot sinh hc li ph bin ? Kim sot sinh hc bnh cy ngy cng nhn c nhng s quan tm ln ca cc nh khoa hc v nht l ca ngi dn. V y l bin php phng tr bnh cy khng gy nh hng xu n sc khe ca con ngi v mi trng nh mt s loi thuc tr su ha hc. Ngoi ra kim sot sinh hc cn c kh nng phng tr c nhiu loi bnh khc nhau, trong c nhng bnh m hin nay cy trng khng c kh nng kim sot hoc ch kim sot c mt phn v cy trng khng c hoc c rt t gen khng bnh. Thm ch c nhng bnh m ngay c thuc ha hc, s lun canh cy trng cng khng kim sot c hoc nu kim sot c th cng khng mang li hiu qu kinh t. V d nh bnh nt sn, nu s dng thuc ha hc phng tr th s khng mang li hiu qu m phi s dng bin php kim sot sinh hc, c th l s dng Agrobacterium radiobacter K84 th mi kim sot c (28). Ngoi ra, kim sot sinh hc c ng k nhn hiu vi s ln ti pht bnh t v thi gian c php s dng trc thu hoch l ngn hn so vi thuc tr su ha hc truyn thng. iu ny a ra cho ngi nng dn nhng bin php canh tc v quy trnh kim sot su bnh rt linh hot (60).

  • 26 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.5. Nhng vn trong kim sot sinh hc. Mc d, c c mt Qu gen nhng vi sinh vt c kh nng bo v cy trng khi bnh di iu kin thc nghim, nhng s pht trin thng mi ca nhiu chng sinh vt i khng lm nh hng n nhng li ch c to ra do s mu thun gia v tr cnh ng vi thi gian canh tc. S thay i trong hot ng ca cc tc nhn kim sot sinh hc c quy cho nhiu yu t. Trong bao gm: kh nng tng thch ca cy ch vi cc tc nhn kim sot sinh hc c hnh thnh t kiu di truyn ca cy ch, phng php canh tc nng nghip, sinh vt i khng b t bin lm mt hot tnh, s khng ca mm bnh vi cc c ch kim sot sinh hc, tnh cht c th b tn thng ca tc nhn kim sot sinh hc do cc c ch chng ca mm bnh, cui cng l tc ng ca mi trng n s sng st v hot tnh ca tc nhn kim sot sinh hc. Sinh vt i khng l nhng c th sng nn d c ly nhim trc tip trn cy ch, trn ng rung, hoc trn mi trng giu dinh dng trong nh knh th chng cng khng c c s sinh trng, pht trin v hot lc i khng mnh bng nu chng c sinh ra v ln ln ngoi t nhin. Ch cn thay i mt trong nhng iu kin ngoi cnh trong thi gian sinh trng c th c nhng tc ng su sc n kh nng kim sot mt mm bnh thc vt ca mt tc nhn kim sot sinh hc no . Nhng ngc li, khi thay i cng nhng iu kin ging nh trn th ch nh hng rt nh n kh nng kim sot bnh ca mt loi thuc tr su ha hc. S chun b v tch ly cht gi ging v nui cy cc sinh vt i khng i hi nhiu iu kin tt yu. Nhng cht nui, gi cc tc nhn kim sot sinh hc thng khng th tch ly c nhng iu kin nhit khc nghit. Ngoi ra, thi gian bo qun ca nhiu cht gi

  • 27 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn ging sinh vt i khng l khng c di nh ca thuc tr su ha hc; Bi vy, khng th bo qun c mt s lng ln cc sinh vt i khng trc khi s dng. 1.6. C ch i khng Nhng sinh vt i khng c s dng kim sot sinh hc bnh thc vt bao gm vi khun, nm, giun trn, ng vt n bo v virt. Vi mt s ngoi l, cc sinh vt i khng thng khng tc ng ln mt bnh c th, thay vo chng tc ng ln mt mm bnh thc vt ngu nhin (29). V d, mt sinh vt i khng no xm chim, nh c mt vng r v n c kh nng bo h vng r chng li cc mm bnh nhng hiu ng chng li bt c mm bnh c bit no cng hon ton l ngu nhin. Tuy nhin, c nhng sinh vt i khng c mi quan h k sinh tht s vi sinh vt ch ca chng. Cc sinh vt i khng gy tr ngi cho cc mm bnh thc vt theo c ch khng sinh, s k sinh, s cnh tranh. Nhng c ch ny khng loi tr ln nhau. Mt sinh vt i khng c th s dng nhiu c ch khc nhau tc ng bt li ti mt tc nhn gy bnh thc vt hoc c th s dng mt c ch chng li mt kiu tc nhn gy bnh v mt c ch khc chng li mt tc nhn gy bnh khc. Vi d, s dng nm i khng Trichoderma kim sot Botrytis gy bnh trn cy Nho (Vitus) bng s cnh tranh dinh dng v k sinh trn mng cng. C hai c ch trn u ng gp vo s ngn chn kh nng tim n v pht sinh bnh (33). 1.6.1. C ch khng sinh C ch khng sinh l s km hm hay ph hy mt sinh vt bi mt cht chuyn ha c sn xut ra bi mt sinh vt khc. Sinh vt i khng c th sn xut ra nhng hp cht km hm sinh trng mnh c tc dng chng li mt

  • 28 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn mng ln nhng vi sinh vt. Nhng hp cht nh vy c nhc n nh l mt loi thuc khng sinh c phm vi tc ng rng. Mt khc, mt s cht chuyn ha nh bacteriocins ch c hiu qu chng li mt nhm vi sinh vt c th no . T vi khun i khng Agrobacterium radiobacter K84 ngi ta c th sn xut ra agrocin 84 v thuc khng sinh agrocin 84 ch c tc dng chng li nhng vi khun c quan h gn gi vi A. radiobacter, nh vi khun A. tumefaciens gy bnh sng r. Nhng vi sinh vt sinh khng sinh c mt li th cnh tranh trong vic chim lnh mt ni ring bit v ngun thc n bi v cht khng sinh ca chng ngn chn s sinh trng v pht trin ca nhng vi sinh vt khc. C ch khng sinh c th l mt c ch c hiu qu bo v cho ht ging ny mm. V d nh vi khun i khng Pseudomonas fluorescens Q287 c th bo v vng r ca la m chng li mi tc nhn gy bnh, Gaeumannomyces graminis var. tritici, khi c ph ln trn ht ging. Cng nhng ht ny mm, vi khun nhn ln trong vng r v chng s dng nhng cht c tit ra t r lm ngun thc n. Vng r l lp t mng dnh cht vo gc, sau khi loi b phn t ri ra khi vng r bng cch lc mnh s lm nh hng trc tip n nhng cht c tit ra t r v ha tan vo t. Cht khng sinh 2,4-diacetylphloroglucinol c to ra bi P. fluorescens Q287 c tc dng chng li bnh take-all trong thi gian c tnh bng pht v c th phn lp c n t vng r cy la m (24). Tuy nhin, hiu lc ca nhng cht khng sinh ny trong t c th b bin i nh l chng c th tr thnh mt phn t ca t st. Chng c chn lc qua s hot ng ca vi sinh vt, hoc c tch t t vng r bng cc phng php lc khc nhau. C rt nhiu loi thuc khng sinh c sn sinh ra bi cc sinh vt i

  • 29 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn khng nhng khng nhm c ch n mt mm bnh c th no. Khng mt sinh vt i khng no c th sn xut ra c nhng thuc khng sinh tng t nhau di nhng iu kin mi trng khc nhau. Mt s vi sinh vt i khng c th sn xut ra nhng hp cht sinh hc c tc dng chng li c nhiu mm bnh thc vt khc nhau. V d t chng vi khun i khng P. fluorescens Pf-5 ngi ta c th sn xut ra nhiu loi hp cht cht khng sinh khc nhau, bao gm pyoluteorin, pyrrolnitrin 2,4 diacetylphloroglucinol v Pyoluteorin c ch c Pythium ultimum, mt ngun bnh ph bin trn cy bng non (Gossypium hirsutum). Tuy nhin, n cng c nhng tc ng nht nh no ln nhng mm bnh khc trn cy bng non, nh l Rhizoctonia solani, Thielaviopsis basicola vVerticillium dahliae (49). Pyrrolnitrin ngn chn R. solani, T. basicola v V. dahliae, nhng khng c tc dng chng li P.ultimum (48). Mt s loi vi khun i khng c kh nng sn sinh ra cht khng sinh bao gm: Bacillus, Pseudomonas v Streptomyces. Mt s loi nm i khng c kh nng sn sinh ra cht khng sinh gm Gliocladium v Trichoderma 1.6.2. Nhng hp cht d bay hi v enzyme C mt s hp cht d bay hi ng vai tr quan trng trong vic kim sot bnh thc vt, bao gm Amoniac (sn phm ca vi khun i khng Enterobacter cloacae c tc dng chng li cc mm bnh thc vt nh P. ultimum, R. solani, v V. dahliae), Ankyl mch vng (sn phm ca T. harzianum c tc dng chng li R. solani) v Hydro xyanua (sn phm ca P. fluorescens chng li T. basicola gy bnh thi r). Mc d, c ch kim sot sinh hc ca s k sinh lin quan n nhiu loi Enzyme, nhng loi enzyme li ch lin quan n s khng sinh. V d, nm i khng Talaromyces flavus

  • 30 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Tf1 ngn chn bnh ho xanh ca cy C (Solanum melongena). Talaromyces flavus c sn xut bi enzyme glucose oxidase; hydrogen peroxide l mt sn phm c to ra do s hot ng ca glucose oxidase v hydrogen peroxide tn cng vo kt cu si ca Verticillium trong t (38). Nu ch c mt enzyme th khng th ph hy c kt cu si nm. 1.6.3. S cnh tranh S cnh tranh l kt qu ca hai hay nhiu sinh vt c gng s dng ngun thc n (carbon v nitrogen) hoc ngun khong ging nhau, chim lnh ni sinh sng v ni xm nhim ging nhau. Nhng sinh vt c ch c nhng sinh vt khc th chng s sinh trng pht trin nhanh, sinh sn mnh, hoc chng c kh nng ginh c cht dinh dng t ngun thc n. Pseudomonas fluorescens sinh ra siderophore, pseudobactin. Nhng cht ny c kh nng ly i nhng cht cn thit cho s sinh trng v pht trin ca cc sinh vt gy bnh, v d nh Fusarium oxysporum s ly i cht st. Siderophore l nhng hp cht ngoi bo, c phn t lng thp, c ngun gc t vi khun, c sc ht cc cht st mnh. Hu bo t ca F. oxysporum i hi phi c ngun st ngoi sinh ny mm. Mc d, F. oxysporum cng sn sinh ra Siderophore, nhng Siderophore ca P. fluorescens lin kt vi st tt hn. Nn P. fluorescens c th sinh trng, pht trin tt iu kin mi trng t c hm lng st thp, cn hu bo t ca F. oxysporum s ri vo trng thi ngh v khng th ny mm. Kim sot sinh hc bnh thi r nhng cy h C v nhng cy l Kim l ging nhau, v d nh s dng s cnh tranh trong kim sot bnh thc vt. Bnh thi r nhng cy h C l do nm Heterobasidion annosum, nm ny c th sng c nhiu nm trong gc v thn nhng cy b cht, n l nguyn nhn gy hi ln trong vic qun l v trng rng. Qua s kim sot bnh thi r

  • 31 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn nhng cy h c, ngi ta p dng kim sot nm H. annosum gy bnh trn nhng cy l Kim bng cch tm cc chng nm i khng Phlebia gigantea vo nhng gc cy mi b cht. H si ca Phlebia gigantea s ngn chn H. annosum theo bn nng t nhin t gc cy , n s s dng nh l ngun thc n c bn thay cho vic tn cng vo cc cy Thng non (pinus) (29). 1.6.4. S k sinh S k sinh l s nui ln mt sinh vt ny trn mt sinh vt khc. N cng l mt c ch ca kim sot sinh hc, s k sinh c th c s dng hon ton trong vic lm gim bt cht hnh thnh vch nm hoc ngn chn bnh thi r, nhng c th c hiu lc km trong vic bo v s ny mm ca ht bi v s hnh thnh mt mi quan h k sinh gia sinh vt i khng v sinh vt gy bnh v c th thi gian cn cho s hnh thnh mi quan h ny s nhiu hn thi gian ht cn khng b nhim bnh. Nm sng k sinh trn nm khc c gi l k sinh nm. S k sinh bi nm i khng Trichoderma thng bt u bng s nhn ra nm ch (cy ch) t khong cch xa. Si nm ca Trichoderma s pht trin hng v mt cht kch thch c sn ca mm bnh. S nhn ra tip theo l nhng vt cht hoc ha cht trong t nhin v s gn si ca Trichoderma vo nm ch. Si ca Trichoderma s cun xung quanh si ca nm bnh. Trichoderma s sn sinh ra cc enzyme sinh tan (lytic enzymes) lm tan thnh t bo nm. Trong mt vi trng hp, enzyme ph hy thnh t bo v thuc khng sinh c nhng tc ng h tr nhau trong qu trnh kim sot sinh hc (27, 30). Mt s k sinh nm c bit n l: T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. virens, T. viride, Pythium nunn v P. oligandrum. 1.6.5. S gim c tnh Kim sot sinh hc bng s gim hot tnh thng xy ra khi mt chng

  • 32 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn nm bnh c c tnh yu lin kt vi mt chng nm bnh c c tnh mnh v truyn cc iu kin lm gim c tnh t chng c c tnh yu sang chng c c tnh mnh. Hin tng truyn cc c tnh yu t loi ny sang loi khc c c l do s lm nhim c ca ngun bnh cng vi mt hoc nhiu dsRNA (ARN s kp) c ngun gc t virt. V d in hnh ca s gim hot tnh l s kim sot sinh hc bnh tn li cy ht D (Castanea) gy ra bi nm Cryphonectria parasitica bng cc chng nm c c tnh yu. chu u, n nhn c nhiu s quan tm trong vic phng v cha bnh lot cy ht D. Nhng chng khng in hnh ca C. parasitica c phn lp t nhng vt bnh ang lnh li ca cy. Chng gim bt s hnh thnh sc t v s hnh thnh bo t. Nhng chng khng in hnh ny c c t thp hn nhng chng c phn lp t nhng vt bnh cha lnh. Ngoi ra, khi si ca nhng chng c c tnh cao chp nhn lin kt vi si ca chng khng in hnh c phn lp t nhng vt bnh ang lnh th chng c c tnh cao s b gim c tnh. V c bn, nhng chng c c tnh thp ci to nhng chng c c tnh cao thnh nhng chng c c tnh thp bng cch chuyn dsRNA qua cc si nm c ni vi nhau (45). 1.6.6. Cm ng khng h thng (s kch khng) Trong t nhin, mt s loi vi sinh vt lnh tnh c kh nng xm nhp (Plant-growthpromotingrhizobacteria-PGPR) v gip cy trng kch hot h thng cm ng khng hay cn gi l kch khng (Induced Systemic Resistance- ISR). ISR l mt c ch kim sot gin tip cc tc nhn gy hi thc vt. Theo , h thng bo v thc vt c kch thch v cy trng s c bo v c h thng. Mc phn ng ca cy ch trc cc tc nhn gy kch thch c

  • 33 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn iu chnh bng mc hin axit jasmonic v ethylene (74). Do cc tc nhn gy kch khng thng to ra nhiu loi hot cht khc nhau nh: khng sinh, siderophores, enzyme trnh tan, hay kh nng gy cm ng ca h thng ngn chn bnh c th bao gm nhiu hn mt c ch. PGPR c th lm trung gian kim sot dch bnh sinh hc, thc y tng trng thc vt hoc c hai. Mt s chng hoc t hp ca cc chng c sn nh sn phm thng mi bo v cy trng (59). 1.7.Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng trong v ngoi nc 1.7.1. Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng ngoi nc Vi sinh vt i khng vi mt s bnh cy trng c cc nh khoa hc trn Th gii nghin cu v ng dng t nhng nm u ca th k XX (5, 6, 9, 28, 36, 71, 72, 75, 76). - Nm 1924, Porter x l ht la m vi nhng th vi khun i khng, ri nhim vi nm Helminthosporium. Kt qu nhng ht ny mm bnh thng hoc khng b nhim bnh, hoc b nhim rt nh. - Nm 1939, Cholonyi quan st thy c tnh ca dch chit khoai ty c kh nng git cht vi khun v tnh c ca dch chit tng khi c ny mm. - Nm 1940, 1948, Weindling s dng nm Trichoderma lignorum bo v nhng cy cam con khi bnh do Rhizoctonia gy ra. Theo nhiu tc gi loi nm ny cng bo v c da chut v qu l. - Nm 1952, Gregory nui cy Bacillus sp. B-6, Actinomycetes No 67, nm Pecillium patulum v quan st s hnh thnh nhng cht khng khun trong t. - Nm 1953, Petrusheva s dng dch nui cy ca Actinomycetes nh l mt cht i khng vi bnh thi ht thuc l gy nn bi nm Thielaviopsis

  • 34 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn basicola. Khi t c x l vi dch vi khun i khng th cy pht trin bnh thng, khi khng c dch i khng trong t th t l cy cht l 70%. - Nm 1953, Gurinovich s dng dch nui cy ca Actinomycetes v nhng th i khng vi khun chng li bnh thi ca bp ci, gy nn bi vi khun khng hnh thnh bo t Pseudomonas campestris khi nhng th i khng c a vo t th cy vn pht trin bnh thng. - Nm 1955, Kuzina s dng vi khun i khng bnh ho ca bng gy nn bi Verticillum. Tc gi x l ht bng vi vi khun trc khi gieo. Kt qu t l cy cht phn i chng l 54%, sau khi c x l vi vi khun i khng t l ny l 8% - 9%. - Nm 1978, Cuppels v cs kt lun rng, nhiu chng vi khun c kh nng sn sinh bacteriocin v mt s chng sinh bacteriocin khng c c kh nng gim bnh ho xanh ca c chua. - Nm 1986, Aspiras R.B v Cruz A. R cho rng Bacillus polymyxa v P. fluorescens c kh nng gim bnh ho xanh c chua iu kin nh knh. - Nm 1990, Tanaka v cs pht hin c cc thc khun th khng c c vai tr tim tng trong phng tr sinh hc i vi R. solanacearum. - Nm 1993, Hsu cho rng ci to t bng mt hn hp theo cng thc ammonium sulphat, bt xng, bt hi ly, cua, glixerin, s silic v valin lm tng tn xut to khun lc ca cc chng P. fluorescens u r, chnh v vy lm tng kh nng phng chng bnh ho xanh cho cy trng cc thc nghim trong chu. - Nm 1993, Elphinstone v Aley ch ra mt loi khc l P. cepacia c phn lp t r ng c kh nng i khng vi vi khun gy bnh ho xanh trong phng th nghim v trong chu.

  • 35 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn - Jaime R. Montealegre s dng chng vi khun i khng trong kim sot bnh do Rhizoctonia solani gy c chua. - Karden Mulya cng b kt qu vic s dng phng php nhng r cy c chua non trong dung dch nui cy P. fluorescens PfG32 trc khi trng, P. fluorescens PfG32 c phn lp t vng r cy hnh. - A. Muslim cng b kh nng kim sot bnh do nm Fusarium oxysporum f. spp. spinaciae (FOS) ca 4 chng Rhizoctonia (G1, L2, W1 v W7) t 77% - 97%. - Nobutaka cng b chng Serratia marcescens B2 c phn lp t vng r cy c chua, c kh nng c ch s pht trin ca mt vi loi nm gy bnh v mc xm cy hoa anh tho gy nn bi Botrytis cinerea v Fusarium oxysporum f.spp. cyclaminis. S. marcescens B2 c to ra enzym phn gii nh chitinaza. - Nhiu tc gi a ra c ch siderophores v khng sinh nh l nhng nhn t i khng nm v vi khun rt hiu qu (20, 21, 23, 26, 31, 38). - B.F. Hu phn lp c 2 chng vi khun i khng Pseudomonas spp. (P751) v Bacillus cereus (B752) t l thng. Chng c kh nng c ch sinh trng v pht trin ca 9 loi nm v cn trng, 2 chng ny an ton i vi ngi, thc vt v ng vt, c ch bnh v tng nng sut cy trng nh la, la m, thuc l, vi, tr, rau v c... - Ciampi-Panno tch c chng P. fluorescens BC8 c th c ch mnh vi khun gy bnh ho xanh khoai ty, c bit khi ht c bao bc mt lp v vi khun P. fluorescens BC8. Dng nh vi khun ny c th xm nhp c vo cy ch qua h thng r, song hiu qu khng bnh cha cao, thc t s nhim bnh c vn xy ra.

  • 36 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn - Hin nay, nhiu loi ch phm phng tr sinh hc c ngun gc sinh hc khc nhau c lu hnh trn Th gii nh: Xentari 35 WDG l sn phm ca hng Abbott, thnh phn chnh gm Bacillus thuringensis var. aizawai..3500 BIU/mg. Delfin WG 32 BIU l sn phm ca hng Sandoz Agro, Thy S, thnh phn chnh gm Bacillus thuringensis var. kurstaki 32 BIU/kg. - MVP 10 FS l sn phm ca M. MVP 10 FS c c ch bng cng ngh bin np gen cao cp ca M, cha c t Bacillus thuringensis var. kurstaki, c bo qun bng mng t bo cng ca vi khun Pseudomonas fluorescens, thnh phn gm c t delta-endotoxin ca Bacillus thuringensis var. kurstaki, nc v cc ph gia. VBt l sn phm ca Vin Cng ngh Sinh hc Hi Nam- Trung Quc. Aztron 7000DBMU l sn phm ca hng Abbott, M. Tp k 1.8EC l sn phm ca x khun Streptomyces avermitilis...v...v... - Mt s tc gi pht hin c mt s chng vi sinh vt c kh nng i khng vi R. solanacearum nh: Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas glumae; Pseudomonas cepacia; Bacillus sp.; Erwinia sp. v cc th t bin ca R. solanacearum khng c. Theo nh nghin cu bnh hc thc vt David Schisler thuc s Nng nghip Hoa K (ARS), vi khun pht sinh t nhin c th cnh tranh vi vi nm F. graminearum v cht dinh dng tit ra t cc bao phn ca cy la m. Trong cc cuc th nghim, cc cng thc phun xt vi khun c li trn cc ming t trng hai loi cy la thng mi lm gim i tnh khc nghit ca bnh vy nm c 63%. Kt qu l cc dng trao i cht choline (CM) c th tham gia vo cc vi khun i khng chng bnh vy nm khc m nhm ca Schisler nghin cu c, trong c men v vi khun tit cht khng sinh. Schisler hnh dung s kt hp cc vi khun i khng ny li trong mt cng

  • 37 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn thc tr su sinh hc cc nng dn c th xt ln la m, b sung vo phng php bo m chng li bnh vy nm. Tm li, vi sinh vt i khng c nhiu nh khoa hc trn Th gii nghin cu v a vo sn xut nhiu loi ch phm. Tuy nhin, hiu qu trong lnh vc phng chng bnh ho xanh cy trng ni chung, lc v vng ni ring cn nhiu hn ch, v phi ph thuc vo nhiu yu t nh: k thut thm canh, tiu vng kh hu, ging cy trng, nhit , thi v canh tc v chnh bn thn ca ch phm. .v...v... 1.7.2. Tnh hnh nghin cu vi sinh vt i khng trong nc Xut pht t thc t v bnh ho xanh cy trng Vit Nam, cc bin php phng tr sinh hc bnh ny v ang c s quan tm ca nhiu nh khoa hc cng nh nhiu phng th nghim nc ta trong nhiu thp k qua. Trng i hc Khoa hc T nhin nghin cu kh nng sinh khng sinh chng vi khun gy bnh ho xanh ca Streptomyces arabicuss 112 v ch phm sinh hc Fluorecent t Pseudomonas fluorescens. Sn phm c kh nng phng tr bnh thi thn, thi r v vng l mt s loi cy nht nh. Trng i hc S phm I - H Ni nghin cu chng x khun Streptomyces V6 c kh nng sinh khng sinh chng nm v vi khun R. solanacearum [1]. Vin Cng ngh Sinh hc cng sn xut cc ch phm Bt v mt s ch phm sinh hc khc c ngun gc t vi khun, x khun v vi nm...v..v Cc ch phm ny c tc dng trong phng chng mt s su v bnh hi cy trng. Vin Khoa hc K thut Nng nghip Vit Nam (c) nghin cu to ch phm phn bn vi sinh trn c s mt tp hp a chng vi sinh vt, trong

  • 38 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn c vi khun i khng, sn phm c s dng trong trng trt va c tc dng kch thch sinh trng ca cy, va c kh nng c ch mt s bnh thc vt gy ra bi vi khun hoc nm [14]. Vin Bo v thc vt cng s dng mt s ch phm sinh hc c ngun gc t nm Metarhizium ansopliae c c tnh cao i vi b da, Bt (Bacillus thuringensis) v NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) c tc dng trong phng tr mt s su hi rau. Nm Trichoderma c kh nng i khng vi nm gy bnh cy trng. Bacterin BT l ch phm ca Lin hip Khoa hc sn xut ho cht, Tng cng ty Ho cht cng nghip v tiu dng, B Cng nghip nng, thnh phn chnh gm Bacillus thuringensis var. kurstaki . Cc kt qu nghin cu ca Trng i hc Cn th, Vin La ng Bng Sng Cu Long, Cng ty thuc st trng Vit Nam, Vin Sinh hc Nhit i cho thy hiu qu rt r rng ca nm Trichoderma trn mt s cy trng ng Bng Sng Cu Long v ng Nam B. Cc nghin cu cho thy nm Trichoderma c kh nng tiu dit nm Furasium solani (gy bnh thi r trn cam qut, bnh vng l cht chm trn tiu) hay mt s loi nm gy bnh khc nh Sclerotium rolfsii, F.oxysporum, Rhizoctonia solani. B mn Vi sinh vt Vin Th nhng Nng ho v phng Di truyn v Cng ngh Vi sinh - Vin Di truyn Nng nghip phn lp c mt s chng vi khun i khng c kh nng c ch sinh trng v pht trin ca R. solanacearum (5, 6).

  • 39 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn CHNG II.VT LIU V PHNG PHP NGHIN CU 2.1.Vt liu nghin cu. 2.1.1. Mu nghin cu Mu t, cy c thu t t trng lc, v cc cy lc, c, t, hnh v c chua khe phn lp vi sinh vt i khng. 2.1.2. Cc mi trng phn lp vi khun + Mi trng TTC: nghin cu hnh thi khun lc R. solanacearum (54): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5 g; thch 20 g; nc ct 1 ln 1000ml; pH = 7,0. Kh trng 0,5 at, 1210C, 20 pht, lm lnh n 600C v thm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %. + Mi trng King B (KB): phn lp v thu sinh khi vi khun i khng: Yeast extract 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5 %) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25 %) 25 ml; nc ct 1000 ml; pH = 7,0. + Mi trng LB: nui cy vi khun i khng (Luria Broth: Difco Bacto): tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 5 g; nc ct 1000 ml; pH = 7,0. 2.1.3. Thit b nghin cu 01 T cy vi sinh vt (AVC4-D1) ESCO-Singarpore 2008 02 T Hood (EFH-4AX) ESCO-Singarpore 2008 03 T m lc n nhit (JSSI 200CL) JS Research-Hn Quc 2009 04 T m lc nc n nhit (JSSI 30T) JS Research-Hn Quc 2009 05 T Sy (JSOF-150) JS Research-Hn Quc 2009

  • 40 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 06 My quang ph t ngoi kh bin (BioMate 3) Thermol Scientific - 2009 07 My chu trnh nhit (MultiGene II) Labnet- M,2009 08 T Thao tc PCR (PCR - 4A1) ESCO Singapore, 2009 09 B gi lnh bn (IC25) Torrey - M, 2009 10 My ly tm thng (380R) Hettich Zentrifugen c, 2008 11 My li tm lnh (Prism R) Labnet- M, 2008 12 My ph v mng t bo km lc rung (HD 2070) Bandelin - c, 2009 13 B in di nm ngang Labnet- M, 2008 14 Bn soi UV (T1000) Labnet- M, 2008 15 My c ADN (UNIVAPO 100 ECH) Uniequip- c, 2007 16 Ni kh trng(JSAC-100) JS Research-Hn Quc 2009 17 My lc rung (Vortex) (MS 3 Digital/Basic IKA-c, 2009 18 My lc ng nghim (Wizard) Velp Italy, 2009 19 My khuy t (F60) FALC-Italy 20 Cn in t (PW254) Adam-Anh, 2007 21 Cn in t (PGW 253i) Adam-Anh, 2007 22 Tn gi my: My o pH (pH 211) Hanna Instrument-Italy, 2008

  • 41 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2. Phng php nghin cu. phn lp vi sinh vt i khng ngi ta c nhiu phng php khc nhau. Sau y l mt s phng php chnh. 2.2.1. Phng php phn lp v tuyn chn cc chng vi sinh vt i khng - Thu mu: Mu l cc on thn st c r v b r ca nhng cy kho, ang thi k ra hoa kt qu. Mu t c thu su 15 cm 20 cm, mi im thu 100g t, mu c ng trong tng ti polyetilen ring bit, ghi ngy thng nm v a im thu mu. - Phn lp v tuyn chn: Chun b mu: 10g t c khuy u trong 90 ml nc ct kh trng, lc 30 pht, lng t nhin, ly phn dch trong phn lp vi khun i khng. Mu thu t cc cy c nghin trong ci s c cha 1 ml nc ct kh trng, b cn, s dng phn dch phn lp vi khun i khng. Bc 1: Mi mu dch trn c pha long n nng nht nh, sao cho khi dng 0,1 ml tri u trn b mt mi trng KB hoc PDA, nhit 280C 300C trong 24 48 gi c th nhn r cc khun lc ring bit. Bc 2: Nhng khun lc c sc t vng, nu hoc xanh nht c ho long trong cc ng eppendorf ring bit, dng 100l dung dch tri u trn b mt a mi trng KB hoc PDA (mt t bo trong dung dch sao cho sau khi 280C 300C trong 24 48 gi c th nhn r cc khun lc ring bit). Bc 3: Phun dch vi khun gy bnh ho xanh ph ln b mt mi trng, nhit 280C 300C trong 24 48 gi. Bc 4: Quan st cc a mi trng, nu xut hin nhng vng c ch (vng v khun), ngha l c vi khun i khng ti im .

  • 42 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Bc 5: Nhng t bo vi khun i khng c lm sch v gi trong nc ct kh trng hoc glyxerol 30% - 800C s dng cho th nghim tip theo. - nh gi hot lc ca vi khun i khng + Chng vi khun i khng cn kim tra c cy bng tm v trng ln im gia ca b mt mi trng KB (mi trng c), vi khun pht trin 280C 300C trong 24 48 gi, cc t bo pht trin thnh cm khun lc hnh trn. + Dng bng v trng loi b cc t bo trong cm khun lc. + X l nhng t bo cn sng st bng cch xng hi chloroform t 45 n 60 pht. + Phun dung dch vi khun gy bnh ho xanh t mt 107108 t bo/ml kn b mt mi trng. + nhit 280C 300C, sau 48 gi quan st kh nng i khng ca vi khun c th hin qua hin tng c hay khng c vng c ch. + Da vo kch thc vng c ch nh gi hiu lc i khng ca chng. 2.2.2. Tuyn chn vi khun i khng bng phng php c l thch Bc 1: Tri u vi sinh vt gy bnh (hoc vi sinh vt kim nh) ph ln b mt mi trng, nhit thch hp (i vi vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh Lu : Sao cho b mt mi trng kh Bc 2: Dng ng kim loi v trng c l trn mi trng cy vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kin nh.

  • 43 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Bc 3: Nh ch nui cy vi sinh vt cn kim tra vo l thch va mi c xong v ngn mt t lnh (4-100 C) t 1 n 2 gi ( cc hot cht khuch tn u vo mi trng) sau em nhit thch hp (da vo nhit pht trin ti u ca vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh) Bc 4: Quan st vng c ch cho n khi vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh pht trin ton b b mt mi trng. *c kt qu. Hot tnh i khng ca vi sinh vt i khng c th hin thng qua vng i khng (vng trn trong sut bao quanh khun lc ca vi sinh vt i khng), c tnh bng trung bnh cng gi tr kch thc vng v khun ca 3 ln lp li, biu th bng cng thc: Kch thc vng i khng (mm) = D-d Trong : - D l ng knh vng v khun (mm) - d l ng knh khun lc (mm) 2.2.3. Tuyn chn vi khun i khng bng phng php cy chm im Bc 1: Tri u vi sinh vt gy bnh (hoc vi sinh vt kim nh) ph ln b mt mi trng, nhit thch hp (i vi vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh) Lu : Sao cho b mt mi trng kh Bc 3: Cy trc tip vi sinh vt cn kim tra ln mi cy vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh sau em nhit thch hp (da vo nhit pht trin ti u ca vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh) Bc 4: Quan st vng c ch cho n khi vi sinh vt gy bnh hoc vi sinh vt kim nh pht trin ton b b mt mi trng.

  • 44 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn * c kt qu. Hot tnh i khng ca vi sinh vt i khng c th hin thng qua vng i khng (vng trn trong sut bao quanh khun lc ca vi sinh vt i khng), c tnh bng trung bnh cng gi tr kch thc vng v khun ca 3 ln lp li, biu th bng cng thc: Kch thc vng i khng (mm) = D-d Trong : - D l ng knh vng v khun (mm) - d l ng knh cm khun lc (mm) 2.2.4. Nghin cu cc c im sinh hc ca cc chng vi khun i khng Xc nh mt s c im sinh l, sinh ho ca cc chng vi khun i khng theo phng php ca N.W. Schaad 2001(62). Gm cc phn ng: Gram, hiu kh, k kh, pht trin trn mi trng YDC, pht quang trn mi trng KB, khuych tn trn mi trng KB, phn gii Ure, Oxidase, pht trin trn mi trng thch D1M. - Phn ng Gram: Ly mt u que cy chng vi khun cn xc nh cho vo 2 git KOH 3% v trn u. Nu thy hn hp ny nht tc l phn ng Gram m, nu khng nht l phn ng Gram dng. - Kh nng pht quang trn mi trng KB: Cy vi khun cn xc nh thnh cc vt trn mi trng KB v nui 250C. Sau 48h quan st kh nng pht quang di n t ngoi vi bc sng 366nm. - Pht trin hiu kh v k kh: Mi trng Basal: 2, 0 g pepton, 5,0 g NaCl, 0,3 g KH2PO4, 3 g agar, 3ml bromothymol blue (1% dung dch nc), 1 lt nc ct, pH 7,1 Ly 5 ml mi trng Basal cho vo cc ng tup di 13 cm v kh trng 1210C trong 20 pht, sau b sung vo mi ng tup 0,5 ml dung dch glucoza

  • 45 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 10% kh trng. Cy cc chng cn xc nh vo cc ng tup , mi chng cy hai ng, mt ng bnh thng (xc nh hiu kh), ng cn li ph ln trn b mt mt lp parafin dy khong 5mm (xc nh k kh), nui 300C v quan st s bin i mu. Cc chng c kh nng pht trin l cc chng lm bin i mu ca mi trng t mu xanh sang mu vng. - Pht trin trn mi trng YDC: Mi trng YDC: 10,0 g cao nm men, 20,0 g glucoza, 20,0 g CaCO3, 15,0 g agar, 1 lt nc ct. Cy cc chng cn xc nh trn mi trng YDC, nui nhit 300C v quan st s pht trin. - Pht trin trn mi trng D1M: Mi trng D1M: 5,0 g Cellobioza, 1,0 g NH4Cl, 1,0 g NaH2PO4, 1,0 g K2HPO4, 3,0 g MgSO4.7H2O, 10,0 mg Malachine green, 15,0 g thch, 1 lt nc ct, pH: 7,0 - Sc t khng pht quang trn mi trng KB: Cy vi khun cn xc nh thnh cc vt trn mi trng KB v nui 250C. Sau 48h quan st kh nng khng pht quang di n t ngoi vi bc sng 366nm - Th Urease: chun b mi trng Mi trng YS ci tin (800 ml): 0,5 g NH4H2PO4 , 0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 5 g NaCl, 1 g Cao men, 16 mg cresol, Sau khi kh trng b sung dung dch Urea (20g trong 180 ml nc ct, lc v trng bng phu lc c kch thc l 0,02 m) Phng php tin hnh: Nui lc vi khun nghin cu trong ng nghim (5ml) c cha mi trng YS c urea, ng i chng (-) ch c mi trng YS c urea khng cy vi khun, ng i chng (--) cy vi khun trong mi trng

  • 46 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn YS khng c ure, i chng (+) mi trng YS c urea v cy vi khun Ralstionia solanacearum. Phn ng dng tnh (sinh urease) khi mu vng ca mi trng c b sung urea c mu m, ng i chng (-), i chng (--) vn gi c mu vng, ng i chng (+) c mu m - Th Oxidaza: Dng que tm kh trng ly sinh khi vi khun nui cy 24h trn mi trng KB ch st ln ming giy thm tm dung dch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride. Phn ng dng tnh nu xut hin mu hng trong vng 10 giy v phn ng m tnh nu khng bin i mu sau 60 giy. - Hnh thnh bo t (Nhum bo t): Tin hnh lm hai cch song song. Cch 1: Dch ha sinh khi vi khun nghin cu trong ng eppendorf cha nc ct kh trng, Nh 1 git dch huyn ph vi khun ln trn lam knh v kh trong khng kh, nhum mu bng dung dch lc malachite 5% trong vng 10 pht, ra nh nhng mu di vi nc chy trong 2 pht sau kh trong khng kh (30 pht), nhum tip ln 2 bng dung dch safranin trong vng 15 giy, ra li mu di vi nc chy, sau d thm kh mu, em quan st di knh hin vi vt knh 40. T bo sinh dng c mu , bo t c mu xanh. Cch 2: Chia dch huyn ph vi khun thnh 2 phn. Phn th nht c x l nhit 90-950C trong vng 5 pht, sau tran dch huyn ph x l nhit v khng x l nhit trn mi trng dinh dng (Thch tht Pepton hoc King B) nui cy nhit 300C trong vng 24 h 48 h. Quan st s hnh thnh khun lc Nu nh vi khun nghin cu va c t bo mu xanh (Nh cch 1) v

  • 47 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn dung dch x l nhit vn c khun lc pht trin th vi khun c kh nng sinh bo t (dng tnh) cn li l m tnh (Khng sinh ni bo t) 2.2.5. Phn loi vi sinh vt i khng bng phng php gii trnh t on gen m ha phn t 16S ARN riboxom 2.2.5.1. Phng php PCR thng thng (n) Nguyn tc: tng hp mch ADN mi t mch khun vi mi chuyn bit nh enzym Taq polymerase vi s c mt ca cc dNTP v ion Mg2+ Thit k mi: Trnh t mi c thit k phi m bo cc nguyn tc sau : - Chiu di ca mi mi khong 17-28 Nucleotide - T l thnh phn G+C trong mi phi t t 50-60% - u kt thc (3) ca mi nn kt thc bng nucleotide G hoc C, hoc CG hoc GC. - Nhit bt mi thch hp nht t 55-80oC - Cc nucleotide u kt thc khng c c trnh t b sung vi nhau, v s gy ra hin tng bt cp mi, nh hng khng tt cho phn ng PCR. Thnh phn cho 1 phn ng PCR bao gm: H2O 13,5 l Buffer 10x 2,5 l MgCl2 25mM 1,5 l dNTP 2mM 2,5 l Primer F10M 1,0 l Primer R10M 1,0 l Taq Gold polymerase (1,5 U/l) 1,0 l ADN khun 2,0 l

  • 48 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Tng th tch 25,0 l Chu trnh nhit cho phn ng: Ty vo tng cp mi (nhit nng chy ca cp mi khc nhau nn nhit bt cp mi khc nhau) m thit k chu trnh nhit cho phn ng PCR. Mt chu trnh nhit cho phn ng PCR chng ti s dng thng nh sau: 94 0C : 3 pht 94 0C : 20 giy - 1pht 500C - 650C: 30 giy - 1,5pht 680C - 720C: 30 giy - 1,5pht 680C - 72 0C: 5pht -10 pht 4 oC : 2.2.5.2. Phng php kim tra sch v xc nh nng Nguyn tc o quang ph k: Da vo s hp th mnh nh sng t ngoi 260nm ca cc baz nit purin v pyrimidin. Gi tr mt quang bc sng 260nm (OD260) cho php xc nh nng axid nucleic da vo tng quan sau: Mt n v OD 260nm tng ng vi: 50mg/ml i vi ADN si i 40mg/ml i vi ARN v ADN si n. Do vy nng ADN c tnh theo cng thc sau: CADN = OD 260.50.d Lp li 35 chu trnh

  • 49 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn CADN: nng ADN (g/ml) d: pha long kim tra sch ca mu, cn tin hnh o OD 280nm. y l bc sng m cc protein hp th cao nht. Nhng cc protein cng hp th nh sng t ngoi 260nm, do lm sai lch gi tr o. Theo cc nh khoa hc th mt dung dch acid nucleic c t s OD260/OD280 trong khong 1,8- 2 c xem l sch (khng tp nhim). Phng php in di ADN trn gel agarose: Nguyn tc: ti pH trung tnh, ADN tch in m do c nhm Phosphate nn di tc ng ca dng in 1 chiu, phn t ADN s di chuyn v in cc dng. Trnh t tin hnh: chun b bn gel agarose, ly 4-10l sn phm trn vi 1l dung dch ti m in di (Loading Dye) tra mu vo cc ging gel, 4l thang chun ADN 1 kb chy so snh. Tin hnh in di trong m TAE 1X vi hiu in th 100V trong 30 pht ri nhum gel bng dung dch Ethidium Bromide trong 5 pht. Kt qu c quan st v chp nh trn my Gel-DOC. 2.2.5.3 Phng php lm sch sn phm PCR xc nh trnh t gen bng cch c trc tip t sn phm PCR, cn tin hnh lm sch sn phm. Cc bc lm sch bao gm (theo quy trnh ch dn ca b kit Bioneer: - in di cc mu cn lm sch - Nhum bn gel, soi di n UV, ct gel. Cn gel v cho vo ng

  • 50 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn eppendorf. Thm dung dch GB buffer vi t l 5 VGB: 1 Vgel (100 mg gel 100 l) - 600C trong 10 pht (hoc cho n khi gel tan ht) - Sau khi tan ht, dung dch s c mu vng. Nu dung dch c mu cam hoc tm, cn b sung thm 10 l dung dch CH3COONa 3M v trn u, dung dch s chuyn thnh mu vng. - Thm 1 ln th tch isopropanol vo mu v trn u - t ct c mng lc vo ng 2 ml - Ht ton b dch ADN cho vo ct (ch lng ln nht cho vo ct khng qu 750 l, nu dch ln hn th phi lm thm 1 ln na), ly tm 10.000 vng/pht trong 2 pht. - B dch li tm bn di, chn ct li. - Thm 500 l GB vo ct, ly tm li nh trn. - B dch, ra ct 2 ln bng dung dch WB buffer ( c pha long bng cn tuyt i 5 ln) mi ln 500 l. trong 5 pht v li tm li nh trn. - Nhc ct ra v t vo ng eppendorf 1,5 ml mi. - Thm 30-50 l dung dch m EL. nhit phng 5-10 pht, li tm 13.000 vng/pht trong 2 pht, chuyn dch li tm sang ng eppendorf 1,5 mi khc, gi -20 0C. Sau khi lm sch, sn phm PCR c in di kim tra li trn gel agarose 1,5%, m TAE 1X.

  • 51 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.4 Phng php tch dng v xc nh trnh t gen a.Phng php tch dng: Thc hin phn ng lai: Sn phm PCR gn u Adenine c ni vo vect pCR TOPO 2.1 m vng v c dnh sn u Thyamine. Thnh phn phn ng lai gm vector pCR TOPO 2.1, sn phm PCR, H2O kh ion v trng, m 10x v dung dch mui. Bin np vect ti t hp vo t bo kh bin E.coli DH5 bng phng php sc nhit. Nguyn tc bin np: Mng t bo vi khun di tc dng ca CaCl2 tr nn xp v to l cho cc phn t ADN ngoi lai c th chui vo (gi l t bo kh bin). Sau t bo c lm phc hi trong mi trng c b sung mt s nguyn t vi lng. Cc th bin np c pht hin trong mi trng c khng sinh, X-gal, IPTG . Sn phm ca phn ng lai sau c bin np vo t bo kh bin E. coli DH5 bng phng php sc nhit T bo kh bin chn lc s b da trn kiu hnh khng Kanamycin v mu sc xanh trng ca khun lc v c kim tra li bng k thut colony PCR vi cp mi SP6 v T7 Cc bc tin hnh: - Ly 4l dung dch sau phn ng ni ghp gen chuyn vo t bo DH5- T1 (t bo kh bin). trn trong 45 pht. Ch trn v khuy tht nh nhng trnh lm v t bo. - Sc nhit 42oC trong 45 giy trong b nhit. Ly nhanh chuyn sang

  • 52 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn t trn 2 pht. - Thm vo mi ng 100l SOC, t vo t lc 200-220v/p 37oC trong 1gi. - Tri a Agar- plate. Cy tri 10l dch t bo trn a mi trng LB c c b sung Kanamycin 40g/ml, X-gal. - t trong t 37oC qua m (20-22 gi). - Chn khun lc trng (tt nht l khun lc mu trng ng), lm giu trong 5ml mi trng LB c cha Kanamycin v X-gal, nui cy 37oC qua m. Tch Plasmid ADN Nguyn tc: Cc khun lc mang gen ti t hp c lm giu trn mi trng LB lng vi Kanamycin tng sinh khi, thu vi khun pha sinh trng, tch ADN plasmid bng Kit. Cc bc tin hnh: - Ly tm 3000 vng/pht trong 5 pht t 1-5 ml sinh khi vi khun E.coli , b dch ni thu sinh khi. - Thm 250 l dung dch RS Buffer vo sinh khi vi khun, dng pipet trn u. - Thm 250 l dung dch BL Buffer, lc trc tip cn bng tay t 3-4 ln. - Thm 350 l dung dch NE Buffer, tip tc lc bng tay 3-4 ln. - Ly tm 13.000vng/pht 4oC trong 10 pht. - Chuyn ton b dch pha trn vo ct v ly tm 13.000 vng/pht trong 1 pht. - Thm 500 l dung dch DE Buffer, 5 pht v ly tm 13.000 vng/pht

  • 53 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn trong 1 pht. - Nhc mng ADN sang ct 2ml khc. Thm 700 l dung dch WP Buffer vo v ly tm 13.000 vng/pht trong 1 pht. - Lm kh ct bng cch ly tm 13.000 vng/pht trong 1 pht. - Chuyn mng ADN sang mt ng 1,5ml mi. - Thm 50-100 l dung dch EL Buffer vo ct, i trong 1 pht ha ADN tan ht. - Ly tm 13000 vng/pht trong 1 pht thu ADN Plasmid. Kim tra ADN plasmid bng phng php colony PCR Sau khi thu c cc th bin np, tin hnh nh du cc th bin np mu trng v chn lm nguyn liu cho phn ng PCR vi cp mi SP6 v T7. Da vo kch thc sn phm PCR thu c c th kt lun th bin np c mang on ADN mong nun hay khng. Phng php tin hnh: Dng u tm v trng ly mt phn nh sinh khi khun lc cn kim tra, sau ha vo trong hn hp phn ng colony PCR c thnh phn sau: Thnh phn hn hp phn ng colony PCR (cho 1 phn ng) SapphireAmp Fast PCR Master Mix 8l Mi Sp6 1 l Mi T7 1 l Nc ct v trng 10 l Tng cng 20 l

  • 54 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Chu trnh nhit cho phn ng: 94 0C : 3 pht 94 0C : 45giy 500C : 30 giy 720C : 1,5pht 720C : 10 pht 4 oC : Sn phm PCR c in di kim tra li trn gel agarose 1,5%, m TAE 1X. b. Phng php gii trnh t gen: Plasmid ti t hp t khun lc 1 c chn tinh sch v xc nh trnh t gen. Nng ca plasmid c o bng quang ph k. Sau khi tnh ton c nng , gi 10g ADN i c trnh t. Qu trnh gii trnh t c thc hin bng my t ng ABI 3100 vi phn mm Sequencing Analysis. 2.2.5.5 Phng php tin sinh hc (s dng phn mm NCBI, EBI, Expasy) Kt qu gii trnh t c x l bng phn mm ABI PRISM 3100 - Avant Data Collection v1.0, DNA Sequencing Analysis, ClustalX, hoc BioEdit. Sau , trnh t c phn tch, so snh trn ngn hng genome NCBI v EBI. Lp li 30 chu trnh

  • 55 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn CHNG III. KT QU V THO LUN 3.1. Thu mu, phn lp v tuyn chn vi khun i khng Vi mc ch l tuyn chn nhng chng vi khun i khng v vi khun i khng vi vi khun gy bnh ho xanh. T 20 mu cy kho nh: cy c, c chua, vng, hnh, c di cc vng canh tc rau mu thuc cc tnh Thanh Ho, Ngh An, H TnhTrong c mt s mu c thu vng chuyn canh trng lc v vng, mt s mu khng thuc vng c bnh ho xanh. Kt qu phn lp c 43 chng vi khun trong khu h r, trong 16 chng vi khun phn lp t t trng Lc ti tnh Ngh An (k hiu NA1 n NA16) v 27 chng vi khun phn lp t t trng Lc ti tnh H Tnh ( k hiu t HT1 n HT43), c im hnh thi ca cc chng vi khun phn lp c m t bng 1 Bng3.1.Ngun gc v c im hnh thi ca cc chng vi khun phn lp c STT K hiu chng Ngun gc Xut s c im hnh thi khun lc Trn mi trng King B Hnh dng Kch c Mu sc 1 NA1 t trng Lc Ngh An Trn, mp gp np Trung bnh Trng c 2 NA2 Nhy Trung bnh Trng c 3 NA3 Phng, nhn Trung bnh Vng 4 NA4 Chy Trung bnh Vng nht 5 NA5 Trn, dng a c Nh Vng 6 NA6 Phng, nhn Trung bnh Xanh nht

  • 56 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 NA7 Phng, nhn Trung bnh Vng kem 8 NA8 Chy Ln Vng 9 NA9 Phng, nhn Trung bnh Trng c 10 NA10 Trn, bn mt nhn Ln Trng c 11 NA11 c Ln Trng 12 NA12 Phng, nhn Nh Vng sm 13 NA13 Chy Trung bnh Vng 14 NA14 Chy Trung bnh Trng 15 NA15 c Nh Trng kem 16 NA16 Chy Trung bnh Trng 17 HT1 t trng Lc Ngh An c Trung bnh Vng 18 HT2 Trn, dnh Nh Vng 19 HT3 c Trung bnh Vng 20 HT4 c, nhn Ln Vng sm 21 HT5 Trn, nhn, dnh Trung bnh Trng kem 22 HT6 Phng, nhn Trung bnh Trng c 23 HT7 Phng, nhn Trung bnh Trng 24 HT8 Chy Trung bnh Vng nht 25 HT9 Chy Trung bnh Xanh 26 HT10 Chy, nhy Trung bnh Trng kem 27 HT11 Nhn Nh Vng nht 28 HT12 Chy Trung bnh Trng 29 HT13 Phng, nhn Trung bnh Vng sm 30 HT14 c Trung bnh Trng sa 31 HT15 Chy, nhy Trung bnh Trng 32 HT16 Nhn Trung bnh Vng

  • 57 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 HT17 c Trung bnh Vng 34 HT18 Chy, mng Trung bnh Trng trong 35 HT19 Phng, c Trung bnh Trng c 36 HT20 Nhn, phng Nh Trng 37 HT21 Trn, bn mt nhn, kh Ln Trng c 38 HT22 Trn, dnh Nh Vng nht 39 HT23 Chy, nhy To Trng c 40 HT24 Trn Trung bnh Vng nht 41 HT25 c, nhn Trung bnh Vng sm 42 HT26 c, li Trung bnh Xanh nht 43 HT27 Nhn, x x Ln Vng tuyn chn chnh xc c nhng chng c kh nng i khng vi vi khun gy bnh ho xanh, sau khi phn lp v lm thun, 43 chng vi khun c th tng tc vi cc chng vi khun gy bnh ho xanh BHT1, TT1 (nh phn phng php). Kt qu cho thy 8 chng NA1, NA5, NA10, HT2, HT5, HT21, HT22 v HT24 th hin hot tnh i khng vi vi khun gy bnh ho xanh.

  • 58 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. nh gi hot lc i khng ca cc chng vi khun Hot lc i khng ca 8 chng vi khun i khng vi cc vi khun gy bnh ho xanh c th hin bng 2. Bng3. 2. Hot lc i khng ca cc chng vi khun vi i din cc chng vi khun gy bnh ho xanh R. solanacearum STT Vi khun gy bnh ho xanh ng knh vng c ch to ra bi cc chng vi khun i khng trn thm vi khun gy bnh ch th (cm) NA1 NA5 NA10 HT2 HT5 HT21 HT22 HT24 1 BHT1 1,4 1,0 2,2 1,4 1,4 1,4 0,8 2,2 2 TT1 1,4 1,2 2,4 1,6 1,6 1,0 0,6 2,4 3 TH1 1,4 1,0 2,4 1,6 1,8 0.8 0,6 2,4 4 HTV2 1,6 1,0 2,2 1,6 1,4 0.8 0,4 2,4 5 SV2 1,4 1,0 2,4 1,4 1,6 0,6 1,6 2,4 Kt qu bng 2 cho thy, 8 chng NA1, NA5, NA10, HT2, HT5, HT21, HT22 v HT24 u c tnh i khng vi hu ht tt c cc chng R. solanacearum. Trong cc chng NA10, HT24 l nhng chng c hot tnh i khng cao c kch thc ng knh vng c ch l ln nht 2,2cm 2,4cm. Cc chng vi khun cn li nh NA1, NA5, HT2, HT5, HT21, HT22 Mc d hot tnh i khng invitro thp hn, tuy nhin rt c th chng li c tnh i khng cao trong iu kin invivo khi th tng tc gia chng vi vi khun gy

  • 59 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn bnh ho xanh trn cy trng. Bi vy ch c th nh gi kh nng kim sot bnh ho xanh cy trng trong iu kin th nghim trc tip trn cy trng. Nh vy, ph c ch ca cc chng vi khun i khng vi R. solanacearum l rt rng, trn nhiu chng vi khun gy bnh. Hnh 3.1: Hot tnh i khng ca mt s chng vi khun i khng vi R. solanacearum BHT gy bnh ho xanh lc T kt qu trn m ra mt hng mi, c th s dng cc chng vi khun i khng trong phng tr bnh ho xanh cy trng ni chung, cy lc ni ring, v tt c cc chng vi khun i khng ny u c phn lp t ngoi t nhin, iu kin m mi trng rt khc nghit i vi nhiu loi vi sinh vt. NA10 NA5 HT2 HT24

  • 60 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3. c im sinh hc ca cc chng vi khun i khng Trong qu trnh sinh trng v pht trin, tt c cc chng vi khun i khng u c nhu cu oxy, nhit thch hp l 280C 310C, c kh nng sinh trng v pht trin trong iu kin mi trng c pH dao ng trong khong 5,0 8,5, nhng pH thch hp l 6,5 7,5, mi trng thch hp l mi trng King B (KB). Bng3. 3. c im hnh thi khun lc ca 8 chng vi khun i khng K hiu chng Nhu cu Oxy kin thch hp Hnh thi khun lc Kh nng di chuyn pH t (0C) Mi trng NA1 + 5,0 8,5 28 31 KB Trn, trung bnh gp np, mu vng nht + NA5 + 5,0 8,5 28 31 KB Trn nh mu trng Khun lc c, dnh + NA10 + 5,0 8,5 28 31 KB Trn to, nhn,dai mu trng c + HT2 + 5,0 8,5 28 31 KB Trn trung bnh, mu vng nu Khun lc c, dai + HT5 + 5,0 8,5 28 31 KB Khun lc trn, trung bnh, nhy,c mu trng ng + HT21 + 5,0 8,5 28 31 KB Khun lc trn, ln, nhn, mu trng c +

  • 61 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn HT22 + 5,0 8,5 28 31 KB Trn trung bnh, mu nu nht Khun lc nhy + HT24 + 5,0 8,5 28 31 KB Khun lc trn, trung bnh, trn , mu vng nht + Ch thch: KB: mi trng King B; +: c nhu cu oxy; Hnh 3.2. Hnh thi khun lc in hnh ca mt s chng vi khun i khng i din NA1 NA5 NA10 HT2 HT5 HT21 HT22 HT24

  • 62 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Hnh dng v kch thc t bo vi khun ca chng HT24 c chp di knh hin vi in t vi i phng i 20.000 ln Hnh 3.3. Hnh thi t bo chng vi khun HT24 chp di knh hin vi in t vi phng i 20.000 ln Hnh 3 cho thy t bo chng HT24 c hnh ovan. Da vo phng i c th o c kch thc t bo dao ng t 0,3-0,5 m x 0,7-1,1 m. 3.4. Mt s c im c bn ca cc chng vi khun i khng 3.4.1. Mt s c tnh sinh l, sinh ha ca cc chng vi khun i khng d dng hn cho vic phn loi cc chng vi khun i khng, xc nh mt s c im c bn ca cc chng vi khun ny theo phng php ca N.W. Schaad- 2001.

  • 63 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Bng3. 4. Mt s c im sinh hc c ca cc chng vi khun i khng c im/Tnh cht K hiu chng vi khun i khng NA1 NA5 NA10 HT2 HT5 HT21 HT22 HT24 Gram + - + + - + - - K kh - - - - - - - - Hiu kh + + + + + + + + Khun lc mu vng trn mi trng YDC - - - - - - - - Pht quang trn KB - + - - + - - + Sc t khng pht quang trn mi trng KB - - - - - - + - Urease - + + - - - Oxidaza - - + + + + + + Sinh trng trn mi trng D1M + - - + - - - - Sinh trng trn mi trng KB 40oC + - + + - + + - Hnh thnh bo t + - + + - + - - Hnh thnh khun ty - - - - - - - - Thy phn casein - - + - - - + + Thy phn tinh bt - - - + - - - - S dng xitrat lm ngun Carbon - - + + + + - + Kh nng to axit t Cellobioza + - + - - - -

  • 64 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Fructoza + + + + + + + + Glucoza + + + + + + + + Maltoza - - - - - + - - Manitol - - + - - - - Lactoza + - - - - - - - Galactoza + - + - - - - - Ch thch: +: dng tnh, -: m tnh. Trong 08 chng vi khun i khng, c 04 chng NA5, HT5,HT22 v HT24 thuc nhm vi khun gram m v 04 chng vi khun NA1, NA10, HT2 v HT21 thuc nhm vi khun gram dng. Trong nhm 04 vi khun gram m c 03 chng vi khun l chng vi khun NA5, HT5 v chng HT24 c xc nh thuc Chi Pseudomonas c kh nng pht quang trn mi trng KB v chng vi khun HT22 thuc chi Burkholderia. Trong nhm vi khun gram dng th c 04 chng c xc nh thuc chi Bacillus vi cc tnh cht rt c trng ca chi vi khun ny nh: khng pht trin k kh, khng hnh thnh khun ty, nhng sinh ni bo t. T nhng kt qu nghin cu trn mc d phng php cha kt lun c n loi vi khun, trong mt s trng hp cn cha xc nh c c chi vi khun no nhng th nghim cung cp thm cc d liu phc v nghin cu sau ny. c th xc nh c chnh xc n loi vi khun phng php ph bin hin ny l so snh trnh t on gen m ha phn t 16S ARN riboxom ca vi khun nghin cu vi cc on gen m ha phn t 16S ARN riboxom ca cc vi khun cng b trn ngn hng d liu th gii (Ngn hng gen) t tm ra mi lin h gia vi khun nghin cu vi cc loi vi khun cng b.

  • 65 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.2. nh gi nh hng ca cc chng vi khun i khng n qu trnh ny mm ca Lc nh gi s nh hng ca cc chng vi khun i khng ln s ny mm ca ht l rt quan trng v ngoi vic em li hiu qu trong phng tr bnh ho xanh, th cc chng vi khun i khng ny cn cn phi c cc c tnh khc nh: khng nh hng xu ti s ny mm ca ht cng nh sinh trng v pht trin ca cy. V vy, th nghim nh gi nh hng ca 8 chng vi khun i khng ln s ny mm ca ht v pht trin ca cy non c tin hnh nh phn phng php trn hai ging lc MD7 v L14. Bng3. 5. nh hng ca 8 chng vi khun i khng ln kh nng ny mm ca ht lc Ging Lc Ln T l ny mm (%) C NA1 NA5 NA10 HT2 HT5 HT21 HT22 HT24 MD7 1 91 90 93 93 91 94 91 68 92 2 92 91 92 92 91 92 90 65 91 L14 1 90 90 76 88 91 92 90 62 91 2 91 89 75 87 89 90 91 65 90 TB 91,0 90,0 84,0 90,0 90,5 92,0 90,5 65,0 91,0 Qua bng 5 cho thy, cng thc ht c x l chng vi khun HT22, t t l ny mm l thp nht (65%). C th chng ny c ch s ny mm ca ht. i vi cc chng vi khun i khng cn li t l ny mm tng ng vi cng thc i chng (sai khc khng ng k).

  • 66 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.3. nh gi hiu qu phng tr bnh ho xanh do R. solanacearum ca cc chng vi khun i khng c th s dng cc chng c hot tnh i khng cao vi vi khun R. solanaceatum nh l mt bin php phng tr sinh hc th chng phi th hin hot lc i khng v hiu qu phng bnh cao trn cy trng. Theo mt s nghin cu cho thy mt s chng i khng vi R. solanaceatum trn a thch l rt tt, nhng li khng th hin c hot lc i khng hoc th hin rt yu trn cy ch. V vy, cc chng ny cn c kim tra trn cc loi cy trng khc nhau v trong mt s iu kin khc nhau. Cc bc thc hin th nghim nh gi hot lc i khng vi vi khun R. solanacearum ca cc chng vi khun i khng v lp li 3 ln, thi gian chn theo thi v ca tiu chun ngnh i vi cy lc, nhm khng nh tc dng ca cc chng vi khun i khng a ra bin php phng chng ho xanh c hiu qu. Bng 3.6. Hiu qu phng tr bnh ho xanh do R. solanacearum ca cc chng vi khun i khng trn lc trong iu kin nh knh Ging Lc Cng thc th nghim S cy th nghim S cy sng st sau 30 ngy Tng s cy sng T l % cy sng st Ln1 Ln2 Ln3 MD7 C 20 3 3 2 8 13,3 NA1 20 13 12 8 33 55,0 NA5 20 10 12 5 27 45,0

  • 67 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn NA10 20 12 15 15 42 70,0 HT2 20 9 6 5 25 30,0 HT5 20 14 14 10 38 63,3 HT21 20 13 11 10 34 56,7 HT22 20 12 16 11 39 65,0 HT24 20 16 15 12 43 71,7 L14 C 20 2 3 2 7 11,7 NA1 20 5 9 6 20 33,3 NA5 20 6 9 4 19 31,6 NA10 20 16 14 15 45 75,0 HT2 20 8 9 6 23 38,3 HT5 20 9 11 8 28 46,6 HT21 20 9 10 6 25 41,6 HT22 20 12 9 8 29 48,3 HT24 20 15 14 16 45 75,0 Kt qu bng 6 cho thy, i vi cc cng thc c x l vi khun i khng cho t cy sng st cao hn so vi i chng trn c hai ging lc th nghim. Trong cc cng thc th nghim c b xung chng NA10 v HT22 t t l cy sng st cao nht (Trn 70% so vi i chng trn ging lc MD7 v 75% trn ging lc L14).

  • 68 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn Hnh3.4. Hiu qu phng tr bnh ho xanh do vi khun ca cc chng vi khun i khng trn Lc

  • 69 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.4. nh gi nh hng ca cc chng vi khun i khng ln qu trnh sinh trng v pht trin ca lc c th s dng cc chng vi khun i khng mt cch rng ri, ngoi kh nng hn ch bnh ho xanh do vi khun R. solanacearum, cc chng vi khun nghin cu cng khng gy tc ng tiu cc no n kh nng sinh trng v pht trin ca cy trng ni chung v cy ch ni ring. y chnh l cc nhn t phng tr hu hiu c trin vng nht trong chin lc phng tr bnh ho xanh. nh gi tc ng ca cc chng vi khun i khng ln s sinh trng v pht trin ca cy lc, tin hnh o chiu cao v chiu di r trn cy lc . Th nghim c tin hnh trn hai ging lc MD7 v L14. Kt qu thu c l gi tr trung bnh sau hai ln lp li v c x l thng k. Bng 3.7. Cc ch tiu sinh trng ca lc khi c b sung vi khun i khng Ging Lc K hiu chng Ch tiu sinh trng TL ti % hn, km so vi i chng Chiu di r % hn km so vi i chng MD7 NA1 25,6 16,36 18,4 2,22 NA5 18,3 -16,82 12,3 -31,67 NA10 26,9 22,27 24,5 36,11 HT2 22,5 2,27 21,3 18,33 HT5 25.0 13,64 22,4 24,44 HT21 21,5 -2,27 21,0 16,67 HT22 21,7 -1,36 19,7 9,44

  • 70 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn HT24 27,2 23,64 22,4 24,44 L14 NA1 28,3 13,20 21,3 6,50 NA5 21,4 -14,40 15,7 -21,50 NA10 28,4 13,60 23,4 17,00 HT2 29,2 16,80 21,7 8,50 HT5 26,1 4,40 18,3 -8,50 HT21 24,6 -1,60 14,2 -29,0 HT22 18,8 -24,80 12,1 -39,50 HT24 26,3 5,20 25,4 27,00 Kt qu bng 7 cho thy chng vi khun hai chng vi khun NA10 v HT22 c kh nng kch thch sinh trng trn c hai ging lc MD7 v L14, trong chng vi khun HT24 c kh nng kch thch cao c v chiu cao cy v chiu di r (i vi ging MD7 chiu cao cy tng 23,64 % v chiu di r tng 24,44 % so vi i chng, i vi ging L14 l 13,0 % v chiu di r 17% so vi i chng) v chng NA10 (i vi ging MD7 chiu cao cy tng 22,27 % v chiu di r tng cao nht 36,11 % so vi i chng, i vi ging L14 l 13,0 % v chiu di r 17% so vi i chng). T cc kt qu th hin trn cho thy hai chng NA10 v HT22 khng ch c hot tnh i khng mnh trong iu kin invitro m cn c tc dng kim sot bnh ho xanh cao v kch thch sinh trng cy trng mnh trong iu kin th nghim nh li. Hai chng vi khun ny tip tc c tin hnh cc th nghim tip theo.

  • 71 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.5. Xc nh vi tr phn loi cc chng vi khun nghin cu bng phng php gii trnh t on gen m ha phn t 16S ARN riboxom Nh trnh by phn trn hn ch ca cc phng php phn loi truyn thng l da vo cc nghin cu v hnh thi hc, c im sinh l, sinh ha, dn n nhiu trng hp phi xc nh li tn phn loi ca mt s vi sinh vt. T trc n nay, n v c bn ca nh tn vi sinh vt l loi, bao gm nhm cc c th c mc tng ng cao v cc c im hnh thi. Mc d c nhiu phng php truyn thng c s dng trong nghin cu phn loi nhng khng c phng php no t ra vn nng v thch hp cho mi i tng vi sinh vt, tnh chnh xc ch c th t c khi kt hp nhiu phng php khc nhau. khc phc nhng hn ch ny ch c th c gii quyt khi s dng phng php phn loi phn t, da vo vic phn tch trnh t gen phn t 16S ARN roboxom. * Tch ADN tng s Hai chng vi khun NA10 v HT24 khng ch c hot tnh i khng cao nht trong iu kin invitro v th nghim nh li, ng thi cn tc dng tch cc ln kh nng sinh trng v pht trin ca lc, v vy hai chng vi khun ny tip tc c tch dng v c trnh t gen m ha phn t 16S ARN roboxom. V vy, 2 chng ny c inh loi bng cch tch dng v c trnh t gen 16S ARN riboxom.

  • 72 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn NA5 HT24 Hnh3. 5. in di ADN tng s ca hai chng vi khun nghin cu Hai chng vi khun NA10 v HT24 c tch ADN tng s v in di kim tra trn gel agarose 1 %. Kt qu biu hin trn hnh 7, ARN c loi sch bng ARNaza, nng ADN chng vi khun NA5 t khong 1250 ng/l v chng vi khun HT24 t khong 1035 ng/l, sch theo t s A260/A280 t 1,8. Kt qu ny cho thy ADN ca 2 chng t tiu chun cho cc nghin cu tip theo.

  • 73 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn * Kt qu PCR 0,1 l ADN tng s (~100 ng) c dng lm khun phn lp gen 16S ARN riboxom. Sn phm PCR c in di trn gel agarose 1% (hnh 6). Hnh3. 6. in di sn phm PCR ca cc chng vi khun nghin cu M: Marker 100 bp Theo hnh 8 c 2 chng vi khun u c 1 bng c hiu c kch thc > 1,5 kb ng vi kch thc l thuyt. Cc sn phm ny c dng tch dng. * Tch dng on gen m ha phn t 16S ARN riboxom Vecto tch dng trong b kit TA cloning kit ca hng Invitrogen c thit k c u gn Timin, phn ng PCR c xc tc bng enzym Taq gold ADN polymeraza c 75% sn phm c u gn Adenin. V vy, sn phm PCR mi c dng gn vo vect tch dng PCR. Cc bc thc hin c tin hnh theo phng php nu v c xc tc bi T4 ligaza. 1,2 kb 1,5 kb 2,0 kb NA5 M HT24

  • 74 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn * Bin np vo t bo vi khun E.coli DH5 T bo kh bin E.coli chng DH5 l chng t bin khng cha gen lacI nn khng ngn cn s biu hin ca gen lacZ, v vy khi cho vo mi trng X-Gal (c cht ca l sn phm ca gen lacZ) cc khun lc cha plasmid khng ti t hp s c mu xanh v c to ra s phn hy c cht X-Gal. Ngc li, cc khun lc ti t hp do c 1 on gen xen vo gia gen lacZ khin n b bt hot v vy khng to c sn phm enzym do X-Gal khng b phn hy. Sn phm ni ghp gen c bin np vo t bo kh bin trn v nui qua m 37oC. Kt qu l c nhiu khun lc trng s c chn lc tch plasmid tin hnh kim tra cc th mang gen nghin cu bng phn ng colony PCR. Hnh3.7. Tuyn chn cc khun lc mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca cc chng vi khun NA10 v HT24 bng phng php colony PCR - Ging s 1 v 2: Cc th bin np mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun NA10. - Ging s 3: Thang ADN chun. - Ging s 4,5,6,7: Cc th bin np mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun HT24. - Ging s 8(C-): Khng c ADN.

  • 75 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn * Tch AND plasmid Cc khun lc mang gen m ha on gen 16S ARN roboxom c tch ADN plasmid v in di kim tra li trn gel agarose 0,8 % gii trnh t. Kt qu c trnh by trn hnh 8 Hnh 3.8. Tch v kim tra plasmid mang on gen m ha phn t 16S riboxom ca cc chng vi khun i khng - Ging 1 v 2: Vect ti t hp mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun NA10 - Ging 5 v 6:Vect ti t hp mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun TH 24 Plasmid thng tn ti 1 trng thi siu xon, xon v vng m, do vy trn bn in di mt plasmid s cho 2,3, hoc 4 bng, cc bng chy xung trc l dng xon cht hn. Da vo cao thp trn in di chn lc plasmid

  • 76 S ha bi Trung tm Hc Liu i hc Thi Nguyn http://www.lrc-tnu.edu.vn ti t hp ch mang tnh cht tng i v n khng phn nh ng thc cht kch thc plasmid dng ng vng, tuy nhin vn c th da vo y chn cc plasmid mang sn phm PCR v nu trong cng 1 iu kin cc plasmid gn thm sn phm PCR s c kch thc cao hn c th chy xung sau. Sau khi tch plasmid bng phng php thng thng s ln rt nhiu sn phm khc nh hnh s 10. Sau mi mt ging mu u c mt vng sng (phn ln l cc ARN) c th s dng cc plasmid ny gii trnh t th cc plasmid ny cn c loi b ARN ra khi mu, phng php c trnh by nh phn phng php. Kt qu loi ARN ra khi mu c th hin hnh 9. Hnh 3.9. Kt qu tinh sch vect ti t hp bng enzim ARNaza - Ging 1: Vect ti t hp mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun NA10 c loi ARN - Ging 5:Vect ti t hp mang gen m ha on 16S ARN riboxom ca chng vi khun TH 24 c loi ARN - TA: Vect TA


TAZOCIN® - vnras.com · - Nhiễm khuẩn do nhiều loại vi khuẩn (gram dương/gram âm hiếu khí và kỵ khí). Trẻ em (từ 2 tuổi trở lên): - Nhiễm khuẩn có

TAZOCIN® - vnras.com · - Nhiễm khuẩn do nhiều loại vi khuẩn (gram dương/gram âm hiếu khí và kỵ khí). Trẻ em (từ 2 tuổi trở lên): - Nhiễm khuẩn có

Documents
TẠO DÒNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI BIỂU HIỆN KHÁNG …

TẠO DÒNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI BIỂU HIỆN KHÁNG …

Documents
ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG PROBIOTIC VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN … · (Fuller, 1989). Sự gia tăng hoạt động kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn probiotic đã

ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG PROBIOTIC VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN … · (Fuller, 1989). Sự gia tăng hoạt động kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn probiotic đã

Documents
Thêm bằng chứng khoa học khẳng định vi khuẩn Wolbachia ... · Thêm bằng chứng khoa học khẳng định vi khuẩn Wolbachia ngăn chặn sự lan truyền vi-rút

Thêm bằng chứng khoa học khẳng định vi khuẩn Wolbachia ... · Thêm bằng chứng khoa học khẳng định vi khuẩn Wolbachia ngăn chặn sự lan truyền vi-rút

Documents
Vi khuẩn acetic và lên men giấm.doc

Vi khuẩn acetic và lên men giấm.doc

Documents
PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA METHANE NHẰM NGHIÊN CỨU ỨNG …

PHÂN LẬP VI KHUẨN OXY HÓA METHANE NHẰM NGHIÊN CỨU ỨNG …

Documents
Nghiên cứu khả năng tạo Bacteiocin của vi khuẩn Lactobacillus acidphilus.pdf

Nghiên cứu khả năng tạo Bacteiocin của vi khuẩn Lactobacillus acidphilus.pdf

Documents
NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Aeromonas sp. TRÊN CÁ …

NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Aeromonas sp. TRÊN CÁ …

Documents
HƢỚNG DẪN - HICShics.org.vn/sites/default/files/attachment/5._huong_dan_ve_sinh_tay.pdf+ Vi khuẩn định cư: Gồm các cầu khuẩn gram (+): S. epidermidis, ... Proteus

HƢỚNG DẪN - HICShics.org.vn/sites/default/files/attachment/5._huong_dan_ve_sinh_tay.pdf+ Vi khuẩn định cư: Gồm các cầu khuẩn gram (+): S. epidermidis, ... Proteus

Documents
d Web viewMột sự tái tổ hợp giữa vật chất di truyền của thực khuẩn thể T 4 và của vi khuẩn Sal 2A đã xảy ra trong TB vi khuẩn Sal 2A

d Web viewMột sự tái tổ hợp giữa vật chất di truyền của thực khuẩn thể T 4 và của vi khuẩn Sal 2A đã xảy ra trong TB vi khuẩn Sal 2A

Documents
TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHO VI KHUẨN Acetobacter

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHO VI KHUẨN Acetobacter

Documents
THU VI?N PHÁP LU?T · Web viewFlorfenicol Dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá da trơn

THU VI?N PHÁP LU?T · Web viewFlorfenicol Dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá da trơn

Documents
Vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn kị khí

Science
Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus

Documents
SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

Documents
VI KHUẨN TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC

VI KHUẨN TẠO CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT SINH HỌC

Documents
Bạn có thể được chữa khỏi nếu chẳng may bị mắc bệnh lao · Lao (còn gọi là TB) là một bệnh lý do vi khuẩn gây ra. Vi khuẩn là vi sinh vật

Bạn có thể được chữa khỏi nếu chẳng may bị mắc bệnh lao · Lao (còn gọi là TB) là một bệnh lý do vi khuẩn gây ra. Vi khuẩn là vi sinh vật

Documents
vietjack.com  · Web view2021. 7. 6. · A. Vi khuẩn, vi khuẩn lam.C. Vi khuẩn, động vật. B. Nấm men, thực vật.D. Vi khuẩn, nấm men. Câu 16: Địa y được

vietjack.com  · Web view2021. 7. 6. · A. Vi khuẩn, vi khuẩn lam.C. Vi khuẩn, động vật. B. Nấm men, thực vật.D. Vi khuẩn, nấm men. Câu 16: Địa y được

Documents
NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Aeromonas sp. TRÊN CÁ

NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Aeromonas sp. TRÊN CÁ

Documents
CHÔÏ COÂNG NGHEÄ VAØ THIEÁT BÒ…), vi khuẩn, vi trùng gây bệnh, gây sốt… hiện diện trong hệ thống nước, cho ra nước tinh khiết, vô khuẩn, không

CHÔÏ COÂNG NGHEÄ VAØ THIEÁT BÒ…), vi khuẩn, vi trùng gây bệnh, gây sốt… hiện diện trong hệ thống nước, cho ra nước tinh khiết, vô khuẩn, không

Documents
NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC VI … · 5.2. Tính kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn tiết niệu phân

NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC VI … · 5.2. Tính kháng kháng sinh của một số chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn tiết niệu phân

Documents
4.1 Các triệu chứng thường gặp Pa… · triển, toàn cây héo, biến vàng và chết. Các bệnh héo vi khuẩn gây triệu chứng héo, chết cây và một số

4.1 Các triệu chứng thường gặp Pa… · triển, toàn cây héo, biến vàng và chết. Các bệnh héo vi khuẩn gây triệu chứng héo, chết cây và một số

Documents
Vi khuẩn acetic và lên men giấm.pdf

Vi khuẩn acetic và lên men giấm.pdf

Documents
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH …

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH …

Documents
BẢN TIN IR · Với công dụng kháng khuẩn tối ưu, Dr.Clean diệt tới 99,9% vi khuẩn gây hại, đặc biệt là vi khuẩn E.Coli gây bệnh tiêu chẩy. Khác

BẢN TIN IR · Với công dụng kháng khuẩn tối ưu, Dr.Clean diệt tới 99,9% vi khuẩn gây hại, đặc biệt là vi khuẩn E.Coli gây bệnh tiêu chẩy. Khác

Documents
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH CÓ TÍNH KHÁNG KHU N …

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH CÓ TÍNH KHÁNG KHU N …

Documents
Cấu trúc tế bào vi khuẩn - WordPress.com · Web viewCấu trúc của ribosom vi khuẩn so với ribosom 80S ở các sinh vật nhân thật (nấm, thực vật, động

Cấu trúc tế bào vi khuẩn - WordPress.com · Web viewCấu trúc của ribosom vi khuẩn so với ribosom 80S ở các sinh vật nhân thật (nấm, thực vật, động

Documents
KHẢO SÁTCÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNHVÀ VIỆC SỬ DỤNG KHÁNG SINH … · 2020. 7. 25. · 1 khẢo sÁtcÁc chỦng vi khuẨn gÂy bỆnhvÀ viỆc sỬ dỤng khÁng

KHẢO SÁTCÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNHVÀ VIỆC SỬ DỤNG KHÁNG SINH … · 2020. 7. 25. · 1 khẢo sÁtcÁc chỦng vi khuẨn gÂy bỆnhvÀ viỆc sỬ dỤng khÁng

Documents
Đề Tài Đánh Giá Hiệu Quả Diệt Khuẩn Của Bình Sữa Nano Bạc Đối Với Các Loại Vi Khuẩn - Vi Khuẩn Hiếu Khí, Coliform, Escheria Coli Trong Sữa Bò

Đề Tài Đánh Giá Hiệu Quả Diệt Khuẩn Của Bình Sữa Nano Bạc Đối Với Các Loại Vi Khuẩn - Vi Khuẩn Hiếu Khí, Coliform, Escheria Coli Trong Sữa Bò

Documents
THU C KH TRÙNG VÀ THU C SÁTTRÙNG · Thuốc khử trùng (disinfactants):Thuốc khử trùng (disinfactants): tiêu diệt vi khuẩn tiêu diệt vi khuẩn hoặc các vi sinh

THU C KH TRÙNG VÀ THU C SÁTTRÙNG · Thuốc khử trùng (disinfactants):Thuốc khử trùng (disinfactants): tiêu diệt vi khuẩn tiêu diệt vi khuẩn hoặc các vi sinh

Documents