1

TUGAS PRAKTIKUM BIOMOLEKULERBLOK 9

1. Ekstraksi DNA

Prinsip kerja dari ekstraksi DNA / DNA Extractiona. Preparasi sel/jaringan

Darah yang digunakan leukositnya, eritrosit dilisiskan dan dibuang. Secepatnya diekstraksi untuk mendapat hasil optimal,leukosit disimpan sebaiknya pada suhu 4 derajat C, penyimpanan yang lama (> 1 bulan) akan menurunkan hasil ekstraksi, volume 3 – 5 ml whole blood. Jaringan yang diambil secepatnya diekstraksi. Penyimpanan jaringan pada suhu -80 derajat. Jaringan yang disimpan dalam paraffin blok sulit untuk diekstraksi.

b. Lisis membran sel/organella (nukleus)Senyawa yang digunakan untuk melisiskan membran yaitu Phenol : senyawa yang sangat kuat untuk melisiskan membran, tetapi toksik. Selain itu digunakan Guanidine isothicyanate : tidak toksik, digunakan sebagai pengganti phenol

c. Denaturasi senyawa organik Untuk medenaturisasi protein yang ada digunakan senyawa Kloroform : paling banyak digunakan karena prosedur sederhana, murah, mudah diperoleh. Selain kloroform juga digunakan Proteinase K untuk denaturasi protein tetapi perlu inkubasi.

d. Presipitasi DNADigunakan senyawa Isopropanol dengan volume 1:1, atau Ethanol absolut dan sodium asetat 1 : 10

e. Pencucian/washingPencucian sisa senyawa mengunakan Ethanol 70%.

Metode-metode yang digunakan dalam ekstraksi DNAa. Phenol:chloroform

Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode standar untuk ekstraksi DNA,Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol

b. Salting OutMenggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M), untuk medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein

c. Guanidine isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis dinding sel , Memerlukan chloroform untuk denaturasi protein.

d. Silica GelSilica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang.

2

Pengukuran kualitas DNA

Kualitas DNA yaitu utuh, tidak putus-putus, konsentrasinya tinggi dan tidak banyak terkontaminasi protein. Menentukan kualitas DNA dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (protein 280 nm; DNA baik apabila pengukuran pada 260:280 = 1,7 – 1,9). Satu OD = 50 ng DNA. Dilihat dengan elektroforesis, band yang tebal secara kualitatif menunjukkan DNA yang bagus.

Penyimpanan DNADNA disimpan dalam TE buffer (tris-hydroxymethyl amino methana – EDTA), Disimpan –

80 derajat bisa tahan bertahun-tahun. Untuk kerja, sebaiknya disiapkan DNA yang sudah diencerkan menjadi 100 ng/mikroliter. Freezing – thawing berulang dapat meyebabkan kerusakan DNA.

Sumber:http://id.shvoong.com/exact-sciences/bioengineering-and-biotechnology/2111537-ekstraksi-dna-dna-extraction/#ixzz1zkwMzCRy

2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

a. Tinjauan UmumPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer

oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu

memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam

latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik).

Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan,

urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides

tertentu dapat diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara

primer. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-

panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal

otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus

denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan

dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan

dengan bromida etidium.

3

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi)

potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer

oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA

untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan

proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung

reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA

untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan

diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase,

deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu,

kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak

pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan

gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA

polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida

yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis

pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang

ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase

ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase

hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai

DNA templat.

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu

pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada

DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh

DNA polimerase.

b. Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya

4

kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

Ion logam monovalen, kalsium (K+).

c. Tahapan Reaksi

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

DenaturasiDenaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA untai ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

AnnealingSetelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Ekstensi/elongasiDilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

5

Pra-denaturasiDilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

Final ElongasiBiasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

d. Aplikasi teknik PCR

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen

Fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.

6

DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

3. Elektroforesis

7

a. Cara Kerja Elektroforesis Gel Agarosa

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumursumur pada gel

agarosa dan diletakkan pada kutub negatif. Apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan

larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Gel agarosa dengan tebal

0,5 cm akan memaksa DNA dengan ukuran 5 sampai 60 kb bergerak melewati celah

kerangka agarosa yang membentuk pori-pori dengan ukuran tertentu sesuai dengan konsentrasi

agarosa. Laju migrasi atau kecepatan pergerakan DNA dalam medan listrik berbanding

terbalik dengan massa DNA, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA.

Sebelum dilakukan elektroforesis, sampel perlu ditambahkan larutan pemberat (loading

buffer) yang terdiri dari polietilenglikol atau gliserin, bromfenol biru dan aquades.

Penambahan gliserin ini akan menaikkan densitas sampel sehingga akan masuk ke dalam

sumuran gel agarosa dengan baik. Sedangkan bromfenol biru merupakan pewarna yang dapat

digunakan untuk mengidentifikasi jalannya sampel pada gel agarosa.

Setelah proses elektroforesis selesai, selanjutnya dilakukan proses pewarnaan (staining)

agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Penambahan Etidhium Bromida (EtBr) pada

proses visualisasi akan mengikat DNA sehingga migrasi DNA dapat terdeteksi jika dikenai

sinar ultraviolet.

Larutan EtBr akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA

akan terlihat di bawah lampu ultraviolet. Larutan EtBr ini digunakan sebagai alat untuk

mengidentifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. Selain

itu larutan EtBr akan terikat diantara dua untai ganda DNA dan berinteraksi diantara basa molekul

DNA, sehingga menyebabkan pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar kuning jingga bila

disinari ultraviolet pada panjang gelombang yang pendek karena pewarna ini mengandung zat

fluoresence.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel agarosa akan tampak

setelah proses pewarnaan. Satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel.

Pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul yang

bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti

bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang

merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan

8

panjang amplikon atau ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka

tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat

dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.

b. Faktor Yang Mempengaruhi Kecepatan Migrasi DNA

Kecepatan migrasi selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh

beberapa faktor utama, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Molekul DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang

berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukuran panjangnya, misal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler.

Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah berbanding terbalik proporsional log-10

dari jumlah pasangan basa-basa.

2. Konsentrasi Gel Agarosa

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan

konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan

Tabel 2. Konsentrasi Gel Agarosa dan Ukuran Molekul DNA

No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi Range PemisahanPada DNA Linier (kb)

1 0,3 60 – 52 0,6 20 – 13 0,7 10 – 0,84 0,9 7 – 0,55 1,2 6 – 0,46 1,5 4 – 0,27 2,0 3 – 0,1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA, kita tahu bahwa ada

3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular, circular- opened dan linier. Meskipun

ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis

berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

a. konsentrasi gel agarosa

9

b. kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

c. densitas kembaran superheliks pada bentuk super-helix circular

d. pada beberapa kondisi bentuk super-helix circular lebih cepat dibanding bentuk

linier

e. tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, maka pengikatan

DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk super-

helix circular

f. konsentrasi EtBr kritis antara 0,1 mg/ml-0,5ml/mg

4. Penggunaan Voltage dan Arah Dari Bidang Elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya

untuk DNA ± 2kb pada gel agarosa bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans

untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai

kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi Basa DNA atau Temperatur

Elektroforesis DNA pada gel agarosa tidak dipengarui oleh komposisi basa DNA

maupun oleh suhu kamar saat gel dijalankan. Sehingga dalam gel agarosa mobilitas

elektroforesis fragmen DNA dengan berbagai ukuran tidak berubah antara 4oC dan 30oC.

Pada umumnya gel agarosa dijalankan pada temperatur kamar. Namun gel yang

mengandung agarosa kurang dari 1,5% adalah sangat lunak, sehingga paling baik bila

dijalankan pada 4oC supaya gel cukup keras.

6. Keberadaan Pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk

deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr

dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat

dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr

dapat digunakan untuk mendeteksi single atau double-stranded asam nukleat (DNA atau

RNA). PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, sehingga pengguna harus selalu

memakai sarung tangan pada saat bekerja dan lindungi mata dengan kaca pelindung pada saat

mengamati di atas UV-transilluminator.

10

7. Komposisi Buffer Elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan

untuk pembuatan gel agarosa, misal:

a. Tris-acetate: umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi

efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.

b. Tris-borat: resolusi cukup baik, tetapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarosa

kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarosa.

c. Prosedur Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar untuk memisahkan,

mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA. Cara pemisahan dengan

elektroforesis ini merupakan pemisahan fragmen DNA berdasarkan berat molekulnya

dengan menggunakan arus listrik. Prosedur elektroforesis dengan gel agarosa ialah sebagai

berikut:

1. Siapkan gel agarosa 0,8 – 1 %. Misal untuk gel agarosa 1 % pada cetakan ukuran besar,

maka bubuk agarosa ditimbang sebanyak 0,7 gram kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer.

2. Selanjutnya dilarutkan dengan TAE buffer sebanyak 70 ml.

3. Erlenmeyer ditutup dengan plastik wrapping dan diberi lubang kemudian dipanaskan dalam

microwave hingga agarosa larut.

4. Setelah agarosa larut yang ditandai dengan larutan berubah menjadi bening, dinginkan

selama 1-2 menit hingga temperatur hangat-hangat kuku atau sekitar 80oC.

5. Kemudian larutan agarosa dituangkan dalam cetakan yang telah diatur keseimbangan

posisinya dan telah dipasang sisirnya. Tuangkan dari sebelah pojok kanan bawah dan

dibiarkan memadat selama 30-45 menit pada suhu ruang (250C).

6. Apabila gel telah mengeras, sisir diambil kemudian gel dan cetakannya dimasukkan ke

dalam tangki elektroforesis dan dituang TAE buffer sampai gel terendam, sekitar 1 mm

di atas gel.

7. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur loading buffer dengan komposisi 2 μl

DNA dan 1 μl loading buffer. Semuanya dicampur dengan pipet mikro kemudian

diinjeksikan ke dalam sumur pada gel agarosa.

11

8. Hubungkan elektroda dengan power supply yang dialiri arus listrik 50 Volt hingga proses running

selesai (sekitar 60 menit) atau mencapai sekitar 1,5 cm dari batas bawah gel agarosa. Setelah

selesai, matikan dan ambil gel.

9. Kemudian rendam gel agarosa sekitar 15-20 menit pada larutan TAE yang telah ditambahkan 5

µl EtBr 1 mg/ml.Pindahkan gel agarosa ke UV-translluminator dan amati hasilnya.

Selanjutnya hasil didokumentasikan dengan menggunakan Chemidoc Gel Imaging

(Gambar 10).

Elektroforesis gel agarosa juga dapat digunakan untuk mengamati hasil PCR DNA.

Perbandingan komposisi yang digunakan antara loading buffer dan sampel adalah 1 : 5.

Marker yang digunakan memiliki ukuran 1 kn sebanyak 1 μl.

4. Primer

Gen yang dipilih dalam tugas untuk membuat primer ini adalah gen APCDD1

(adenomatosis polyposis coli down-regulated 1) pada kromosom 18. Gen ini merupakan gen

pembawa sifat kebotakan pada manusia.

Berikut hasil primer gen yang telah dibuat (via frodo.wi.mit.edu/ )

Primer3 Output

PRIMER PICKING RESULTS FOR Gen Kebotakan APCDD1

No mispriming library specifiedUsing 1-based sequence positionsOLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT PRIMER 87 19 60.52 63.16 5.00 0.00 GGCCTACACTGTCCCCTTGRIGHT PRIMER 188 19 61.55 57.89 6.00 1.00 GTCCCAAGCCTCGGAAAGTSEQUENCE SIZE: 213INCLUDED REGION SIZE: 213

PRODUCT SIZE: 102, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

1 CCGAGGGCCACTCGAGCGCTCCCAGCCGGCGGAGGCAGCCCGGGCGCCGCGGAGCCCGCG

61 GAGGCGTCGGGTCTGGATCGCGGCACGGCCTACACTGTCCCCTTGGCGGGGCGGGTCCGA >>>>>>>>>>>>>>>>>>>

121 GGGGAGCCCCGCGCCTGCCGTCTCAGCCCTGGGAGAGGGGGCTCTGCCCACTTTCCGAGG <<<<<<<<<<<

12

181 CTTGGGACCGCTCTCCCCCAGGGCGCCCGGAGC <<<<<<<<

KEYS (in order of precedence):>>>>>> left primer<<<<<< right primer

ADDITIONAL OLIGOS start len tm gc% any 3' seq

1 LEFT PRIMER 88 19 60.52 63.16 5.00 2.00 GCCTACACTGTCCCCTTGG RIGHT PRIMER 188 19 61.55 57.89 6.00 1.00 GTCCCAAGCCTCGGAAAGT PRODUCT SIZE: 101, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

2 LEFT PRIMER 87 19 60.52 63.16 5.00 0.00 GGCCTACACTGTCCCCTTG RIGHT PRIMER 188 18 60.74 61.11 6.00 1.00 GTCCCAAGCCTCGGAAAG PRODUCT SIZE: 102, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

3 LEFT PRIMER 87 19 60.52 63.16 5.00 0.00 GGCCTACACTGTCCCCTTG RIGHT PRIMER 187 18 60.74 55.56 6.00 1.00 TCCCAAGCCTCGGAAAGT PRODUCT SIZE: 101, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

4 LEFT PRIMER 88 19 60.52 63.16 5.00 2.00 GCCTACACTGTCCCCTTGG RIGHT PRIMER 188 18 60.74 61.11 6.00 1.00 GTCCCAAGCCTCGGAAAG PRODUCT SIZE: 101, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

Statistics con too in in no tm tm high high high sid many tar excl bad GC too too any 3' poly end ered Ns get reg GC% clamp low high compl compl X stab okLeft 1087 0 0 0 561 0 3 513 0 0 0 6 4Right 1059 0 0 0 335 0 3 696 0 0 0 9 16Pair Stats:considered 64, unacceptable product size 47, high end compl 9, ok 8primer3 release 1.1.4