ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA DAN NEWCASTLE DISEASE

A. INDENTIFIKASI VIRUS ND Sampel yang digunakan : Trachea, paru-paru, feces, isi usus, swab kloaka

dan jaringan yang dipakai adalah sumsum tulang. Isolasi dan identifikasinya :

Awalnya dapat dilakukan dengan melakukan inokulasi virus secara in vitro, in vivo, in ovo yaitu pada membran korioalantois dan yolk sack.

Inokulasi dilakukan pada telur ayam berembrio yang dieramkan 9-11 hari kemudian diperiksa dikamar gelap dengan mikroskop apakah mati/hidup

TAB yang hidup diberi tanda dengan pencil bagian mana yang merupakan letak embrio dan batas rongga hawa

Ambil telur yang akan diinokulasikan, suci hamakan kutub yang mengandung ruang hawa dan kerabang diatas embrio yang telah diberi tanda tadi dengan menggosokkan iodium tincture/alkohol 70% ditambah betadine

Buatlah lubang diatas embrio dan dikutub yang mengandung ruang hawa dengan memakai bor kecil/gerinda

Inokulasikan 0,1 ml suspensi virus yang telah disiapkan dengan kanule yang cukup halus ke dalam ruang alantois

Lubang ditutup dengan parafin yang dicairkan, lubang dikutub juga ditutup dengan parafin

Eramkan telur berembrio selama 2-3 hari dalam mesin tetas

Metode identifikasi menggunakan uji HA Cepat

Bertujuan untuk mengidentifikasi virus yang mampu mengaglutinasi eritrosit

ayam.

Caranya :

a. Objek ditetesi dengan satu tetes cairan khorioalantois yang mengandung virus di

dua tempat

b. Didekat tetesan tersebut ditetesi suspensi eritrosit ayam 2,5% dan satu tetes bagi

ditempat yang berjauhan (sebagai kontrol)

c. Kaca objek digoyang-goyangkan tunggu 5 menit

d. Diamati dan dibandingkan dengan kontrol

Metode identifikasi menggunakan uji HI Cepat

Bertujuan untuk mengidentifikasi virus ND

Caranya :

a. Cairan korioallantois diteteskan pada 2 tempat yang terpisah pada kaca benda

b. Satu serum anti ND diteteskan pada salah satu cairan korioallantois tadi

c. Dicampur, tunggu 5 menit

d. Eritrosit ayam diteteskan pada kedua tetesan, dicampur dan tunggu 5 menit, diamati

Metode identifikasi menggunakan uji HA Lambat

Bertujuan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam menginfeksi

eritrosit.

Caranya :

a. 12 Sumuran pelat mikro diisi dengan PBS dengan menggunakan dropper

masing-masing 0,05 ml

b. Kedalam sumuran pertama diisi 0,05 ml cairan korioallantois

c. Dengan menggunakan diluter 0,05 ml, cairan dari sumuran ke 11 dicuci

d. Ke dalam sumuran 1-12, dimasukkan 0,05 ml eritrosit ayam 0,5%. Ditunggu

sampai terjadi endapan eritrosit pada sumuran ke 12, diamati dan baca hasilnya

Metode identifikasi menggunakan uji HI Lambat

Bertujuan untuk mengetahui adanya antibodi yang menghambat proses

hemaglutinasi oleh virus.

Caranya :

a. Ke dalam sumuran 1-12 dimasukkan 0,025 ml PBS dengan menggunakan

dropper

b. Ke dalam sumuran 1 dimasukkan 0,025 ml serum ND pekat, dicampur dengan

menggunakan diluter 0,025 ml, kemudian dimasukkan kesumuran 2 dan

seterusnya sampai sumuran 10

c. Ke dalam sumuran 1-12 dimasukkan 0,025 ml virus 4-HA, ditunggu 15 menit

d. Ke dalam sumuran 1-12 dimasukkan 0,05 ml eritrosit ayam 0,5%

e. Ditunggu hingga terjadi endapan eritrosit disumuran 12, diamati dan dibaca

hasilnya

B. IDENTIFIKASI VIRUS AI

Sampel yang digunakan diantaranya adalah suspensi organ-organ paru-paru,

seka tonsil, dan otak. Isolasi virus pada kantong alantois telur ayam bertunas (TAB) dan

identifikasi dengan uji hemaglutinasi (Haemaglutinasi assay/HA) dan hambatan

hemaglutinasi (Haemaglutinasi inhibition/HI) dilakukan berdasarkan prosedur baku.

Suspensi dengan jaringan tersangka dalam kosentrasi 10% PBS dengan 5000

IU/ml penisillin dan 5000 Aµgml streptomisin diinokulasikan pada kantung alantois

TAB yang berumur 10 hari yang diperoleh dari perusahaan pembibitan. TAB yang

diinfeksi tersebut diinkubasikan pada temperatur 37oC. Setelah embrio tampak lemah

atau mati dilakukan pemanenan cairan alantois serta pengamatan pada embrio. Aktivitas

hemaglutinasi dalam cairan alantois diuji dengan ujia HA. Konfirmasi serologis agen

dilakukan dengan uji HI menggunakan serum yang mengandung antibodi terhadap virus

AI dan ND. Sebagai kontrol negatif digunakan virus ND galur lasota yang diperbanyak

pada telur bertunas.

Uji HA (titrasi Ag); langkah kerjanya adalah :

- Isi plate dengan PBS 25 µl- Stok Ag 25 µl- Encerkan 10 x- Tambahkan PBS 25 µl- Kocok dengan shaker- Tambahkan RBC 1% 25 µl- Kocok dengan shaker- Inkubasi 30 menit- Baca Hasil-

Uji HI, langkah kerjanya adalah :

- Isi plate dengan PBS 25 µl- Tambahkan serum serum 25 µl- Encerkan - Tambahkan Ag uji HA-AI 25 µl- Kocok dengan shaker- Inkubasi 30 menit- Tambahkan RBC 1% 25 µl- Kocok dengan shaker- Inkubasi 30 menit dan baca hasil

TUGAS KOASISTENSI DIAGNOSA DAN LABORATORIK

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA

DAN NEWCASTLE DISEASE

Rozaliana Rizal 09/298437/KH/6858

Dosen Pembimbing Paraf Dosen

Drh. Sidna Artanto,

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2011