docx
Nama: Satria Putra WicaksanaNIM: 04011381320077Hal: Tugas
praktikum Isolasi DNA Blok IX
1. Apakah artinya bila indeks kemurnian < 1,75? Perlu
dilakukan apa?Angka yang kurang dari 1,75 pada indeks kemurnian
menandakan adanya kontaminasi oleh protein dan tidak murni, karena
DNA yang diperoleh dari isolasi belum sesuai dengan standar. Bila
hal ini terjadi maka perlu dilakukan isolasi DNA kembali dengan
pengendapan protein agar diperoleh hasil yang sesuai.
2. Mengapa pada isolasi DNA darah, sel darah merah harus
dilisiskan?Hal tersebut dilakukan karena DNA yang diisolasi berasal
dari inti sel darah putih. Pelisisan dilakukan pada sel darah merah
agar dapat memisahkan sel darah merah dengan sel darah putih, sebab
sel darah merah tidak mengandung inti , sehingga tidak ada DNA
genom.3. Jelaskan prinsip dan teknik isolasi dan purifikasi
DNA!Pada dasarnya prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel
sehingga diperoleh inti sel yang mengandung DNA dan Protein, lalu
memisahkan DNA dari protein, kemudian mengendapkan DNA, dan
melarutkannya kembali, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan
menilai kemurnian DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak dan
karbohidrat. Teknik saat melakukan isolasi dan purifikasi DNA ada
dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian
atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan Di dalam sebuah mesin yang bernama mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm
(rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4; Lewiston
2002:13; LPCH 2005:2). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan
untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran.Adapun DNA yang
diisolasi berasal dari 2 tempat, yakni Inti sel dan Mitokondria.
Umumnya DNA yang berasal dari Inti sel lebih sering digunakan dalam
pengisolasian karena tidak terjadi perubahan seiring adanya
perkawinan.DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti
seperti pada sampel: darah, serum/plasma, jaringan, akar rambut,
sperma. Teknik utama dari isolasi DNA adalah:1) Penghancuran
dinding sel.2) Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS
atau Triton X).3) Membersihkan debris sel dengan proteinase.4)
Pencucian dengan menggunakan alkohol
Tahapan teknik isolasi DNA, yaitu:1) Penghancuran membran sel
dengan Cell Lysis Solution (CLS)2) Penghancuran membran inti dengan
Nuclei Lysis Solution (NLS)3) Pengendapan protein dengan Protein
Precipitation Solution (PPS)4) Pencucian DNA dengan isopropanol dan
alkohol 70%5) Rehidrasi DNA dengan Rehidration Solution
Tujuan sentrifugasi:1) Sentrifuge pertama bertujuan untuk
memisahkan nukleus dari sitoplasma2) Sentrifuge kedua bertujuan
untuk memisahkan DNA dari isi nukleus3) Sentrifuge ketiga bertujuan
untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi
4. Jelaskan fungsi larutan pada isolasi DNA!Berikut beberapa
larutan yang digunakan pada isolasi DNA, antara lain:1) larutan
lysis IFungsi larutan ini adalah untuk meresuspensi pelet sel
bakteri setelah pemanenan menggunakan sentrifus. EDTA sebagai
kelator untuk mengikat ion Mg2+ untuk inaktivasi enzim DNase,
glukosa untuk menyamakan potensial osmotik sel selama proses lysis
menggunakan SDS agar sel bakteri tidak meledak seketika.2) lysis
solutionFungsi larutan ini adalah untuk melisiskan sel dengan cara
melarutkan membran sel (oleh SDS), dan mendenaturasi DNA kromosol
namun tidak mendenaturasi DNA plasmid. DNA plasmid tidak
terdenaturasi karena sifatnya yang covalently closed circular DNA
(cccDNA)3) (neutralizing solution)Fungsi larutan ini adalah untuk
menetralisir pH menghentikan denaturasi DNA kromosomal sehingga
terbentuk presipitat DNA kromosom yang menempel dengan debris
seluler, dan memisahkan DNA plasmid yang larut di dalam
supernatan.4) TNES ureaFungsi : sebagai pelisis membrane sel5)
ProteinaseFungsinya sebagai enzim yang dapata mendegradasi
protein6) RNAseFungsinya sebagai enzim yang dapat mendegradasi
RNA7) PCIAA (Phenol Chlorofom Isoamyl Alcohol)Fungsinya untuk
memisahkan komponen lipid dan polisakarida dari larutan8) Etanol
absolutFungsinya untuk presipitasi DNA9) Etanol 70%Fungsinya untuk
memurnikan DNA10) TE (Tris-EDTA)Fungsinya sebagai pelarut DNA atau
RNA11) Buffer EkstraksiKarakteristik dan fungsi : untuk melisiskan
membrane sel dan membrane fosfolipid bilayer
