Embed Size (px)
Citation preview
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
QUẢ
N L
Ý V
À C
UN
G Ứ
NG
TH
UỐ
C
K
HÓ
A 2
01
3
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ
HÚNG QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI
VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG HÔ HẤP
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
TPHCM – 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ HÚNG
QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH
ĐƢỜNG HÔ HẤP
Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi
TPHCM – Năm 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Sinh viên
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn bộ Quý Thầy Cô của Trường
Đại học Nguyễn Tất Thành đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong
suốt khoảng thời gian em học ở đây. Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn
đến:
Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi, người thầy trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá
trình làm luận văn, luôn giúp đỡ em về mặt lý thuyết, lẫn những kỹ năng thực hành
chỉ dạy và truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu.
Em xin cám ơn Bộ môn Hóa sinh – Độc chất, Bộ môn Vi sinh - Kí sinh trùng và
Bộ môn Dƣợc liệu đã tạo điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận.
Em xin cám ơn cô Nguyễn Hữu Phƣơng Thảo, Võ Thị Nhàn của Bộ môn Vi sinh -
Kí sinh trùng đã luôn nhiệt tình, chỉ bảo giúp đỡ, để em có thể học hỏi nhiều kiến
thức mới, thu được nhiều kinh nghiệm quý giá và cũng như đã tạo điều kiện để em
có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Xin gửi lời cám ơn tới các bạn Phạm Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Lê
Nguyễn Khắc Tùng. Cảm ơn mọi người đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên em
trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Cuối cùng con xin cám ơn ba mẹ, những người thân đã luôn yêu thương, chăm sóc
và luôn tạo điều kiện để em an tâm học hành và thực hiện khóa luận trong thời gian
qua.
Xin chân thành cảm ơn.
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
i
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC ..................................................................................................................... I
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... III
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... IV
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... V
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ HÚNG QUẾ ........................................................................ 3
1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố....................................................... 3
1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................ 5
1.1.3. Một số nghiên cứu về các tác dụng khác nhau của O.basilicum ngoài khả năng
kháng khuẩn ................................................................................................................... 6
1.1.4. Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của O.basilicum ở Việt Nam
và trên thế giới ............................................................................................................... 7
1.1.5. Một số phƣơng pháp chiết tinh dầu .................................................................... 8
1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN........................................................................ 10
1.2.1. Vi sinh vật gây bệnh và tình trạng đề kháng kháng sinh .................................. 10
1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đƣờng hô hấp .............................................................. 11
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
.......................................................................................................................... 14
1.3.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên thạch .................................................................. 14
1.3.2. Phƣơng pháp pha loãng .................................................................................... 15
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ...................................................................................... 16
2.1.1. Đối tƣợng thử nghiệm ....................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................ 17
2.1.3. Môi trƣờng thử nghiệm ..................................................................................... 18
2.1.4. Thiết bị dụng cụ ................................................................................................ 18
ii
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 19
2.2.1. Phƣơng pháp thu hái xử lý dƣợc liệu................................................................ 19
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ................................................. 21
2.2.3. Xử lý số liệu thống kê ....................................................................................... 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................. 26
3.1. HIỆU SUẤT CHIẾT TINH DẦU .................................................................... 26
3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ...................................................................... 26
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 26
3.2.2. Xác định MIC và MBC .................................................................................... 28
3.3. BÀN LUẬN ...................................................................................................... 33
3.3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu .................................................................................... 33
3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn ...................................................................................... 34
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 36
4.1. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 36
4.2. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: BẢNG KẾT QUẢ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ
PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC
PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC
PHỤ LỤC 4: ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT
PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ MIC
iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
BHA Brain heart infusion agar Môi trƣờng thạch BHI
BHI Brain heart infusion broth Môi trƣờng lỏng BHI
CFU Colony Forming Unit Số đơn vị hình thành khuẩn lạc
DMSO Dimethyl sulfoxid Dimethyl sulfoxid
DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl
E. coli, EC Escherichia coli Escherichia coli
FTC Ferric thiocyanate Phƣơng pháp Ferric
thiocyanate
GAS Liên cầu tan huyết nhóm A
Streptococci
Group A beta-hemolytic
Streptococci
MBC Minimum Bactericidal
Concentration
Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MHA Mueller – Hinton Agar Thạch Mueller – Hinton
MHBA Mueller – Hinton Blood Agar Thạch máu Mueller – Hinton
MIC Minimum inhibitory
concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
MRSA, MR Methicilin-resistant
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus kháng
methicillin
MSSA, MS Methicilin-sensitive
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus nhạy
cảm methicillin
O.basilicum Ocimum basilicum Húng quế
P.aeruginosa,
Pseu
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
S.aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
S. pyogenes,
Pyo
Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes
S.pneumoniae,
Pneu
Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae
WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hai loại lá húng quế ......................................................................................... 4
Hình 1.2. Cây Húng quế .................................................................................................. 5
Hình 1.3. Hoa Húng quế .................................................................................................. 5
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Linalool ......................................................................... 6
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Cineole .......................................................................... 6
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Estragole ....................................................................... 6
Hình 2.1. Húng quế lá lớn và húng quế lá nhỏ .............................................................. 16
Hình 2.2. Hai loại lá Húng quế ...................................................................................... 17
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................. 19
Hình 2.3. Mô hình chƣng cất lôi cuốn ........................................................................... 21
Hình 2.4. Bộ chƣng cất tinh dầu .................................................................................... 21
Hình 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế MRSA của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá
lớn (LN: lá nhỏ, LL: Lá lớn) ......................................................................................... 28
Hình 3.2. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế S.pyogenes của tinh dầu húng quế lá nhỏ và
lá lớn (1: lá lớn, 2: lá nhỏ) ............................................................................................. 28
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách các vi khuẩn ƣu tiên của WHO cho nghiên cứu và phát triển các
kháng sinh mới [48] ....................................................................................................... 11
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng .......................................................................... 17
Bảng 2.2. Danh sách thiết bị .......................................................................................... 18
Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế ........................ 23
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu từ hai loại lá Húng quế ........................................... 26
Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá
nhỏ (mm) ....................................................................................................................... 27
Bảng 3.3. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá nhỏ .................................................. 30
Bảng 3.4. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá lớn ................................................... 31
Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ ....... 32
Bảng 3.6. Kết quả MBC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ ..................... 33
Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU LÁ HÚNG
QUẾ OCIMUM BASILICUM TRÊN MỘT SỐ LOÀI VI KHUẨN GÂY BỆNH
ĐƢỜNG HÔ HẤP
Lê Lƣơng Phƣơng Nghi
Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi
Mở đầu: Các cây dƣợc liệu thuộc họ Lamiaceae hiện đang đƣợc nghiên cứu khá nhiều về
hoạt tính kháng khuẩn và cho nhiều kết quả đáng mong đợi, một trong các cây đáng quan tâm
đó là Ocimum basilicum. Do đó chúng tôi chọn đề tài này nhằm cốt yếu tìm hiểu khả năng ức
chế của tinh dầu này đối với một số vi sinh vật gây bệnh.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu trên hai loại húng quế là húng
quế lá lớn và lá nhỏ sau đó tinh dầu đƣợc li trích bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi
nƣớc và đƣợc khảo sát trên sáu chủng vi khuẩn chuẩn (ATCC): Escherichia coli,
Staphylococcus aureus kháng methicillin, Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin,
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes và Streptococcus pneumoniae. Khảo sát
khả năng kháng khuẩn của tinh dầu, phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch đƣợc sử dụng
nhằm sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn đƣợc sử
dụng để xác định giá trị MIC và xác định giá trị MBC trên các chủng vi khuẩn chuẩn bằng
phƣơng pháp trải đĩa.
Kết quả: Hàm lƣợng tinh dầu vào khoảng 0,49% (lá lớn) và 0,51% (lá nhỏ) tính trên trọng
lƣợng tƣơi. Cả hai loại tinh dầu đều ức chế các chủng thử nghiệm ngoại trừ Pseudomonas
aeruginosa. Tinh dầu lá nhỏ cho hoạt tính ức chế ở nồng độ thấp, đặc biệt trên hai loài thuộc
chi Streptococcus, điển hình Streptococcus pyogenes bị ức chế với MIC là 2.5l/ml. Tinh dầu
lá lớn cũng cho hoạt tính ức chế tốt trên các chủng nghiên cứu nhƣng hoạt tính yếu hơn lá
nhỏ, điển hình Streptococcus pyogenes bị ức chế với MIC là 5l/ml.
Kết luận: Cả hai loại tinh dầu đều cho khả năng ức chế vi khuẩn tốt trên cả vi khuẩn Gram
dƣơng cũng nhƣ Gram âm. So với các nghiên cứu khác, nghiên cứu của đề tài cho khả năng
ức chế vi khuẩn rất tốt trên các chủng Streptococcus pyogenes và Streptococcus pneumoniae
(2 chủng phổ biến gây bệnh đƣờng hô hấp), tuy nhiên qua phân tích thống kê chỉ có sự khác
biệt về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu húng quế đối với hai chủng trên.
Từ khóa: Ocimum basilicum, tinh dầu, kháng khuẩn, Gram (-), Gram (+), MIC, MBC.
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 – 2018
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OIL EXTRACT OF OCIMUM
BASILICUM L. LEAVES ON A VARIETY OF PATHOGENIC BACTERIA
RELATED TO RESPIRATORY TRACT
LÊ LƢƠNG PHƢƠNG NGHI
SUPERVISOR: Ths. Nguyễn Thanh Tố Nhi
Introduction: The medicinal plants of the Lamiaceae family are currently being studied
extensively for their antimicrobial activity and for many expected results, one of the most
conspicuous plants is Ocimum basilicum. Therefore, the aim of this study was to determine
the inhibitory ability of this essential oil on some pathogenic microorganisms.
Materials and methods: This study researched on two types of basil is large leaves and small
leaves. The oil was extracted by steam distillation, then it would be tested on six standard
bacterial isolates: Escherichia coli, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Methicillin-
sensitive Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes and
Streptococcus pneumoniae. To investigate the antimicrobial properties, the solid diffusion
method was used to screen the antibacterial activity, the dilution method in media was used to
determine the MIC value, and MBC value was conducted by the disk spread method.
Results: The results showed that the oil content of Ocimum basilicum was about 0,49% for
large leaves and 0,51% for small leaves on fresh weight. In terms of antimicrobial activity,
both essential oils could inhibit all the strains tested except for Pseudomonas aeruginosa. In
particular, small leaf oil gave the inhibitory activity even at low concentrations, especially on
the Streptococcus species, typically Streptococcus pyogenes was inhibited at MIC
concentrations of 2,5l/ml. In addition, large leaf oil also showed very good inhibitory
activity on the strains studied but weaker than the small one, typically Streptococcus pyogenes
was inhibited at MIC concentrations of 5μl/ml.
Conclusion: Both types of oil showed good inhibitory activity against both Gram-positive
and Gram-negative bacteria, especially on Streptococcus pyogenes and Streptococcus
pneumoniae (two common strains related to respiratory disease), the analysing of statistics
showed the significant distinction of antimicrobial activity of basil oil to only this two strains.
Key words: Ocimum basilicum essential oil, Gram (-), Gram (+), antibacterial activity, MIC,
MBC.
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Giữa thế kỉ 16, Antony van Leeuwenhoek (1632 – 1723) hoàn thiện kính hiển vi và
khám phá ra thế giới vi sinh vật. Những năm sau đó, nhiều nhà khoa học đã chứng
minh vi sinh vật là nguyên nhân của các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên đến trƣớc thế
kỉ 20, việc chữa trị các bệnh nhiễm trùng chủ yếu vẫn dựa vào kinh nghiệm dân
gian. Năm 1928, Alexander Flemming tìm ra kháng sinh đầu tiên từ chủng nấm
Penicillium notatum. Việc phát hiện penicillin và các kháng sinh sau đó trở thành
cứu cánh cho điều trị bệnh nhiễm trùng trong một thời gian dài. Tuy nhiên, trong
những năm gần đây, hiện tƣợng đề kháng kháng sinh ngày càng phát triển phức tạp
đƣa nhân loại bƣớc vào thời kỳ hậu kháng sinh [6].
Nhiễm trùng đƣờng hô hấp là loại bệnh phổ biến nhất trong các bệnh nhiễm trùng.
Những chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp thƣờng là chủng gây nhiều đề kháng
nhất với kháng sinh và có khả năng gây bùng phát dịch bệnh cao. Nhiễm khuẩn hô
hấp cấp tính là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ em trên toàn thế giới.
Khoảng ba phần tƣ kháng sinh điều trị cho bệnh nhân ngoại trú dành cho các bệnh
nhiễm trùng đƣờng hô hấp, đặc biệt là đối với viêm xoang do vi khuẩn cấp tính cho
ngƣời lớn và viêm tai giữa do vi khuẩn cấp tính cho trẻ em. Việc lạm dụng nhiều
thuốc kháng sinh cho nhiễm trùng hô hấp mắc phải cộng đồng và bệnh viện làm
tăng nguy cơ mức độ kháng kháng sinh. Sự xuất hiện của vi khuẩn methicillin-
resistant Staphylococcus aureus mắc phải cộng đồng và các chủng vi sinh vật đa
kháng thuốc (ví dụ: Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa) trong bệnh viện tăng
thách thức trong việc điều trị thành công những ca nhiễm trùng này [18].
Nghiên cứu để tìm ra các kháng sinh mới bằng con đƣờng tổng hợp hóa học đang
không theo kịp với sự đề kháng của chúng. Để chống lại sự đề kháng của vi sinh
vật, đòi hỏi có những cấu trúc hóa học mới phức tạp hơn và các hợp chất tự nhiên
có trong cây cỏ là một trong những nguồn cấu trúc đó [3], [14].
Trong những năm gần đây, các loại tinh dầu và chiết xuất thảo dƣợc thu hút đƣợc
rất nhiều sự quan tâm từ các ngành khoa học nhờ vào tiềm năng lớn của chúng nhƣ
nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên và các hợp chất hoạt tính sinh học [12]. Một số
2
nghiên cứu cũng đã đƣợc thực hiện để khám phá tiềm năng của một số tinh dầu để
điều trị các bệnh truyền nhiễm nhƣ biện pháp thay thế dƣợc phẩm tiêu chuẩn [13].
Húng quế (Ocimum basilicum L.), là một thành viên của họ Lamiaceae, là một loại
thảo mộc phát triển hàng năm ở nhiều khu vực trên thế giới. Trong số hơn 150 loài
thuộc chi Ocimum, húng quế là loài chính để thu hoạch tinh dầu và chúng đƣợc
trồng thƣơng mại ở nhiều quốc gia [39]. Các bộ phận của cây Ocimum basilicum,
các hợp chất và tinh dầu chiết đƣợc cho thấy tiềm năng lớn trong việc kháng khuẩn
điển hình nhƣ nghiên cứu của Moghaddam và cs. (2011), Patil và cs. (2011) [33],
[36]. Hoạt tính kháng khuẩn của các loài tinh dầu mặc dù có cùng nguồn gốc từ một
loài thực vật nhƣng có thể khác nhau, điều này có thể là do kiểu gen quy định các
đặc điểm về hình thái giống cây trồng khác nhau cho hoạt tính kháng khuẩn khác
nhau.
Do đó đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá húng quế Ocimum
basilicum trên một số loài vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp” đƣợc thực hiện với
những mục tiêu chính sau:
- Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn các chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh đƣờng
hô hấp của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ.
- Xác định giá trị MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và MBC
(Minimum Bactericidal Concentration) của tinh dầu trên các chủng vi khuẩn
chuẩn.
3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ HÚNG QUẾ
1.1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố
1.1.1.1. Danh pháp, vị trí phân loại
Tên gọi:
Tên khoa học: Ocimum basilicum L.
Tên tiếng Anh: Sweet basil (Anh), basilic aux sauces (Pháp)
Tên khác: Húng chó, Húng giổi, Rau é, É tía, É quế
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc Lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc Lan: Magnoliophyta
Phân lớp Hoa Môi: Lamiidae
Bộ Hoa Môi: Lamiales
Họ Bạc hà: Lamiaceae
Chi: Ocimum
Loài: Ocimum basilicum [49]
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây mọc quanh năm, cỏ đứng, cao 0,5-1,2m, rất phân nhánh, toàn cây có mùi thơm.
Thân non màu xanh có phớt tía hoặc màu tía, rất ít lông. Lá đơn, mọc đối ch o chữ
thập. Phiến lá hình trứng nhọn ở đầu và đáy phiến hình nêm men dần xuống cuống,
kích thƣớc 3-8 x 2-5cm, màu xanh lục, mặt trên đậm hơn mặt dƣới, bìa có răng cƣa
cạn ở 2/3 phía trên, nhiều đốm tuyến. Gân lá hình lông chim, nổi r ở mặt dƣới, 6-8
cặp gân phụ hơi cong lên ở m p lá, có ít lông tơ ngắn. Cuống lá màu xanh nhạt,
hình trụ hơi phẳng ở mặt trên, dài 2-5cm, ít lông ngắn. Cụm hoa ở ngọn cành kiểu
chùm xim bó hoặc chùm xim biến dạng hình tháp. Kiểu chùm xim bó: 2 xim co 6
hoa mọc đối tạo thành vòng giả, khoảng cách giữa hai vòng giả 0,5-2cm, các vòng
giả tạo thành chùm dài 10-30cm. Kiểu chùm xim biến dạng hình tháp do phía dƣới
trục hoa phân nhánh phức tạp. Hoa nhỏ, không đều, lƣ ng tính, mẫu 5. Cánh hoa
4
màu trắng hồng, rìa màu hồng. Quả bế tƣ, màu đen, hình trứng ngƣợc, dài khoảng
1,2mm, đựng trong đài tồn tại [5].
Phân biệt hai loại lá húng quế
Húng quế lá lớn: kích thƣớc 6-8 x 2-3cm, gân lá hình lông chim, 6-8 cặp gân phụ
hơi cong lên ở m p lá, có ít lông tơ ngắn. Bìa mép lá có răng cƣa cạn, không nhún.
Húng quế lá nhỏ: kích thƣớc 3-4 x 1-2cm, gân lá hình lông chim nhƣng không có
cặp gân phụ. Bìa mép lá có răng cƣa cạn nhƣng nhún nhiều hơn so với lá lớn.
Hình 1.1. Hai loại lá húng quế
A: Húng quế lá lớn B: Húng quế lá nhỏ
1.1.1.3. Phân bố
Húng quế là một loài rau gia vị thuộc họ Hoa môi, có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung
Quốc nhƣng hiện nay chúng đƣợc trồng ở nhiều nƣớc ôn đới và nhiệt đới thuộc
Châu Âu và Châu Á nhƣ Pháp, Ý, Ấn Độ, Thái Lan và Việt Nam. Trên thế giới có
nhiều loại húng quế, nhƣng húng quế Việt Nam có mùi dịu nhẹ hơn. Ở Việt Nam,
húng quế có ở nhiều tỉnh. Cây ƣa sáng và ẩm, sinh trƣởng mạnh trong mùa mƣa ẩm,
thích hợp với đất phù sa và đất thịt. Mùa ra hoa thƣờng vào tháng 7-9 [1].
A B
5
Hình 1.2. Cây Húng quế Hình 1.3. Hoa Húng quế
1.1.2. Thành phần hóa học
Húng quế hiện nay là một loại cây chuyên dùng để sản xuất tinh dầu. Phần
trên mặt đất của cây Húng quế chứa tinh dầu có hàm lƣợng cao nhất lúc cây đã ra
hoa. Lƣợng tinh dầu chứa trong cây húng quế khá cao là 0,5-1,7%, trong tinh
dầu có linalool (60%), cineole, estragole (methyl-chavicol) cùng một số chất khác
nhƣ Germacrene D, Tau-cadinol, δ-Gurjunen, δ-Cadinene… Ngoài tinh dầu,
trong lá và hoa còn chứa protein, carbonhydrat và một lƣợng nhỏ Vitamin A
và Vitamin C. Cho tới nay ngƣời ta đã khám phá hơn 140 hợp chất khác nhau,
trong đó có trên 30 hợp chất monoterpen, khoảng 20 carboxylic acid, 11
aldehyd mạch thẳng, khoảng 20 hợp chất có mùi thơm và khoảng 20 hợp chất
khác [1].
6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Linalool
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Cineole
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Estragole
1.1.3. Một số nghiên cứu về các tác dụng khác nhau của O.basilicum ngoài khả
năng kháng khuẩn
Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa
7
Khả năng chống oxy hóa của cao chiết methanol từ Ocimum gratissimum và
Ocimum basillicum đƣợc nghiên cứu với nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng
pháp làm sạch các gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), làm sạch
hydrogen peroxi, phƣơng pháp Ferric thiocyanate (FTC)… Khả năng chống oxy
hóa của O.basilicum đƣợc cho là yếu hơn O.gratissimum. Theo phƣơng pháp
DPPH, phần trăm làm sạch các gốc tự do phụ thuộc vào nồng độ. Cao chiết acetone
và ethanol của O.basilicum đƣợc thƣc hiện ở nồng độ 50, 100, 250 và 500µg/ml.
Theo phƣơng pháp FTC, cao chiết ethanol của O.basilicum ở nồng độ 500µg/ml
cho 75,87%, khả năng kháng khuẩn gần với α-tocopherol (500µg/ml) 82,14% theo
tham chiếu [20].
Nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm
Cao chiết từ hạt O.basilicum trong phân đoạn ete dầu mỏ (400mg/kg) và ethanol
(400mg/kg) đƣợc sử dụng để điều trị kháng viêm do histamin và prostaglandin
(PGF2-a) gây ra ở 60 con chuột chia làm 10 nhóm. Ức chế đáng kể tình trạng phù
nề ở chân do histamine và PGF2-a đã chứng minh rằng hạt O.basilicum có hoạt tính
kháng viêm tiềm năng [35]. Kết quả ghi nhận rằng các chất chiết xuất methanol thô
ức chế các cytokine tiền viêm và các chất trung gian. Qua nghiên cứu cho thấy các
chất chiết xuất có hoạt tính chống viêm [40].
1.1.4. Tình hình nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của O.basilicum ở
Việt Nam và trên thế giới
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có nhiều nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của O.basilicum
khá tốt. Theo một nghiên cứu của Moghaddam và cộng sự tại Iran, tinh dầu chiết
xuất từ lá O.basilicum bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc cho hoạt tính
kháng khuẩn tốt trên các vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng bao gồm E.coli,
P.aeruginosa, Bacillus cereus, S.aureus. Kết quả MIC đối với Bacillus cereus dao
động từ 36-18μg/ml S.aureus 18μg/ml, E.coli và P.aeruginosa là 18-9μg/ml [33].
Theo một nghiên cứu khác của Patil và cộng sự tại Ấn Độ, khả năng kháng khuẩn
của các cao chiết ethanol, methanol và hexane của húng quế bằng phƣơng pháp đĩa
8
giấy khuếch tán và phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng thạch cho thấy hoạt
tính kháng khuẩn rất tốt trên các chủng Gram (-) và Gram (+). Trong đó cao chiết
hexan cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất [36].
Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên O.basilicum cũng đã đƣợc
tiến hành và cho kết quả rất tốt. Theo một nghiên cứu thực hiện trên húng quế của
tác giả Ánh đƣợc trồng và thu hoạch tại Tiền Giang cho thấy tinh dầu O.basilicum
có thể ức chế đƣợc một số chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nhƣ E.coli,
Salmonella typhmumrium, Shigella, Bacillus cereus, MRSA ngoại trừ P.aeruginosa
[1].
Ở một nghiên cứu khác, tinh dầu húng quế (O.basilicum) đƣợc phối hợp với một số
loại tinh dầu khác nhƣ tinh dầu quế (Oleum cinnamomum), tinh dầu sả chanh
(Cymbopogon flexuosus) và bạc hà (Mentha Arvensis) đƣợc cung cấp bởi công ty cổ
phần tinh dầu Việt Nam nhằm thử khả năng kháng nấm trên hai chủng sinh vật
Saccharomyces cerevisiae M1 đƣợc phân lập từ nho đỏ Ninh Thuận và Aspergillus
niger L2 đƣợc phân lập từ bơ Đắc Lắc. Chủng vi sinh vật đƣợc giải trình tự và định
danh tại công ty Nam Khoa. Hoạt tính kháng nấm đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp
khuếch tán trên thạch. Nghiên cứu cho thấy các loại tinh dầu quế, sả chanh, húng
quế và bạc hà dạng đơn và kết hợp đều cho khả năng ức chế S.cerevisiae M1 và
A.niger L2 hiệu quả. Tinh dầu có thể ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm A.niger
L2. Hỗn hợp tinh dầu húng quế - bạc hà có hiệu quả hơn khi từng loại tinh dầu của
chúng tác động dạng đơn [2].
1.1.5. Một số phƣơng pháp chiết tinh dầu
Phƣơng pháp trích ly sử dụng dung môi hữu cơ (Maceration extraction)
Phƣơng pháp này phân tách tinh dầu dựa vào tính chất tinh dầu tan tốt trong các
dung môi không phân cực (thƣờng sử dụng dung môi là các hydrocarbon nhƣ n-
hexane, có nhiệt độ sôi thấp để dễ loại bỏ).
Ƣu điểm: Phƣơng pháp này sử dụng ở điều kiện nhiệt độ phòng, do đó tinh dầu sẽ
không bị biến tính.
9
Nhƣợc điểm: Do sử dụng dung môi hữu cơ nên cần thêm một bƣớc loại dung môi ở
điều kiện chân không (thƣờng phải sử dụng máy cô quay chân không) nên tăng chi
phí về mặt thiết bị. Ngoài ra, nếu quá trình sau không loại hết dung môi ra khỏi sản
phẩm thì sẽ ảnh hƣởng rất nhiều tới chất lƣợng sản phẩm và một số loại dung môi
độc đối với ngƣời sử dụng và ảnh hƣởng tới môi trƣờng.
Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Thông thƣờng tinh dầu có nhiệt độ sôi khá cao, ví dụ nhƣ cineole thành phần chính
có trong rất nhiều loại tinh dầu nhƣ khuynh diệp, tràm gió... có nhiệt độ sôi là
176,4oC. Tuy nhiên, do nó không tan trong nƣớc nên nó sẽ tạo thành một hỗn hợp
hai chất lỏng không tan và hỗn hợp này có nhiệt độ sôi nhỏ hơn 1000C (nhiệt độ sôi
của nƣớc ở điều kiện bình thƣờng). Do nó không tan trong nƣớc và nhẹ hơn nƣớc
nên sau khi ngƣng tụ hỗn hợp nƣớc và tinh dầu sẽ tách thành hai lớp và có thể phân
tách đƣợc bằng phƣơng pháp chiết.
Ƣu điểm: thực hiện dễ dàng ở mọi điều kiện, thiết bị dễ lắp ráp và vận hành đơn
giản, giá thành rẻ.
Nhƣợc điểm: Không thích hợp cho một số loại tinh dầu có thành phần dễ biến tính
ở nhiệt độ cao. Nó tiêu tốn rất nhiều năng lƣợng cho quá trình hóa hơi nƣớc, ngoài
ra thời gian chƣng cất thƣờng khá lâu từ 4-6 giờ.
Phƣơng pháp ép lạnh
Phƣơng pháp p lạnh là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng cho các bộ phận có
chứa tinh dầu trong các túi tinh dầu, hàm lƣợng tinh dầu cao, dễ bị p bể nhƣ bƣởi,
cam, chanh.
Ƣu điểm: Phƣơng pháp này đơn giản, cho tinh dầu nguyên chất, giá thành sản xuất
tƣơng đối rẻ.
Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này lẫn màu và mùi của nguyên liệu, nhiều tạp (phần
không phải tinh dầu), không thể thực hiện đƣợc với các loại tinh dầu trong gỗ,
hoa,… Thời gian sử dụng của các loại tinh dầu này cũng khá ngắn.
Phƣơng pháp trích ly bằng dung môi siêu tới hạn
10
Đây là phƣơng pháp tiên tiến nhất hiện nay, do thu tinh dầu chất lƣợng cao với hiệu
suất cao, loại bỏ đƣợc nhiều tạp chất. Thƣờng sử dụng CO2 siêu tới hạn nhƣ một
dung môi để đẩy tinh dầu ra khỏi dƣợc liệu, ở nhiệt độ khoảng 350C dung môi đƣợc
bơm qua dƣợc liệu dƣới áp lực 8000 psi, ở điều kiện này CO2 trở thành lớp sƣơng
mù dày hoặc hơi nƣớc. Qua việc giải phóng áp lực trong cả hai quá trình, CO2 siêu
tới hạn thoát ra ở dạng khí, để lại tinh dầu đằng sau.
Ƣu điểm: Tinh dầu không bị biến tính, dễ dàng tách ra khỏi dung môi hoàn toàn
Nhƣợc điểm: Hệ thống phức tạp, giá thành tinh dầu cao gấp nhiều lần các loại tinh
dầu đƣợc chiết xuất bằng các phƣơng pháp khác. Theo các thực nghiệm bằng
phƣơng pháp này các chất nhƣ nhựa, sáp b o cũng bị lôi cuốn theo chứ không riêng
chỉ có tinh dầu [26], [37].
1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN
1.2.1. Vi sinh vật gây bệnh và tình trạng đề kháng kháng sinh
Việc phát minh ra nhiều loại kháng sinh đã giúp con ngƣời đối phó với bệnh nhiễm
trùng dễ dàng hơn. Tuy nhiên, vi khuẩn càng tiếp xúc với kháng sinh nhiều thì càng
gia tăng sự đề kháng thuốc và dẫn đến giảm hiệu lực của thuốc. Đơn cử nhƣ
penicillin đƣợc chính thức đƣa vào sử dụng trên lâm sàng vào năm 1940, tuy nhiên,
đến năm 1962 đã xuất hiện chủng đề kháng tại Anh. Vancomycin – kháng sinh
đƣợc dùng để điều trị các chủng S.aureus đề kháng – đƣợc các nhà khoa học tin
rằng gần nhƣ không thể phát sinh chủng đề kháng trên lâm sàng. Nhƣng đến năm
1979 đã xuất hiện chủng đề kháng [16].
Tiến hành khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa Hồi sức
tích cực và chống độc - Bệnh viện Cấp cứu Trƣng Vƣơng. Kết quả cho thấy,
S.aureus còn khá nhạy với oxacillin (72,7%) và vancomycin (60,7%). P.aeruginosa
kháng cao với imipenem (50%). E.coli kháng hầu hết các loại kháng sinh nhƣng vẫn
còn nhạy với imipenem và meropenem [4].
Danh sách những chủng vi khuẩn đề kháng nhiều loại kháng sinh và cần thiết tìm
kiếm kháng sinh mới để điều trị do WHO đề nghị đƣợc trình bày trong Bảng 1.1.
11
Bảng 1.1. Danh sách các vi khuẩn ƣu tiên của WHO cho nghiên cứu và phát
triển các kháng sinh mới [48]
Mức độ ƣu tiên Chủng vi khuẩn
Khẩn cấp Acinetobacter baumannii, kháng carbapenem
Pseudomonas aeruginosa, kháng carbapenem
Enterobacteriaceae, kháng carbapenem, sản xuất ESBL
Cao 1. Enterococcus faecium, vancomycin-resistant
2. Staphylococcus aureus kháng methicillin, kháng vancomycin
3. Helicobacter pylori, kháng clarithromycin
4. Campylobacter spp., kháng fluoroquinolone
5. Salmonella, kháng fluoroquinolone
6. Neisseria gonorrhoeae, kháng cephalosporin, kháng
fluoroquinolone
Trung bình 1. Streptococcus pneumoniae, không kháng penicillin
2. Haemophilus influenzae, kháng ampicillin
3. Shigella spp., kháng fluoroquinolone
1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh đƣờng hô hấp
Hiện nay, nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính chiếm 20-40% bệnh nhân ngoại trú và
12-35% số bệnh nhân nội trú trong các bệnh viện đa khoa. Nhiễm khuẩn đƣờng hô
hấp trên bao gồm viêm mũi họng, viêm họng, viêm amydal và viêm tai giữa chiếm
87,5% tổng số ca nhiễm khuẩn. Phần lớn các bệnh nhiễm trùng đƣờng hô hấp trên
cấp tính là do virus gây ra. Cảm lạnh thông thƣờng là do virus trong hầu hết các
trƣờng hợp và không cần sử dụng tác nhân kháng khuẩn trừ các ca nhiễm phức tạp
nhƣ viêm tai giữa cấp tính với tràn dịch, viêm amydal, viêm xoang và nhiễm trùng
đƣờng hô hấp dƣới. Hầu hết các trƣờng hợp viêm mũi xoang là do virus và do đó
không cần điều trị bằng thuốc kháng sinh. Các vi khuẩn phổ biến nhất gây viêm
xoang là S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis, S.aureus và S.pyogenes.
Khoảng 15% số ca nhiễm có thể do liên cầu tan huyết β nhóm A (GAS) gây ra [25].
12
Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng hô hấp:
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm hiếu khí hình que thuộc họ
Pseudomonadaceae. Nó là tác nhân gây bệnh cơ hội và nguyên nhân chính gây ra
nhiễm trùng hô hấp bệnh viện và đƣợc xem là tác nhân gây bệnh thách thức nhất
trên toàn cầu vì tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao [24]. Do nhu cầu dinh dƣ ng thấp
của P.aeruginosa nên chúng dễ dàng phát triển và tăng sinh trong môi trƣờng bệnh
viện. Chúng đề kháng với nhiều tác nhân kháng khuẩn và chỉ vài kháng sinh có hiệu
quả chống lại P.aeruginosa. Ở Mỹ, theo báo cáo của hệ thống giám sát nhiễm
khuẩn bệnh viện quốc gia, P.aeruginosa đứng thứ hai trong số tất cả các tác nhân
gây nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến bệnh viêm phổi. Tỷ lệ P.aeruginosa gây
nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả
Việt Nam.
Methicilin-sensitive Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dƣơng có hình cầu và sắp xếp thành cụm
đƣợc mô tả là “dạng hình trái nho”. Trên môi trƣờng dinh dƣ ng, các khuẩn lạc
thƣờng có màu vàng. Những sinh vật này có thể phát triển hiếu khí hoặc kỵ khí.
Trong số nhiều bệnh nhiễm trùng mà S.aureus gây ra, viêm phổi là một trong những
trƣờng hợp nổi bật nhất, ƣớc tính khoảng 50.000 ca nhiễm tụ cầu khuẩn mỗi năm
chỉ riêng ở Hoa Kỳ [28]. Là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi
do thở máy thở, S.aureus từ lâu đã gây cản trở môi trƣờng chăm sóc đặc biệt trong
bệnh viện [22]. Hơn nữa, tác nhân gây bệnh này ngày càng đƣợc công nhận là
nguyên nhân hàng đầu của viêm phổi mắc phải do cộng đồng, khả năng lây nhiễm
trên diện rộng đối với ngƣời lớn và trẻ em khỏe mạnh [29].
Methicilin-resistant Staphylococcus aureus
Việc quản lý lâm sàng bệnh viêm phổi tụ cầu ngày càng khó khăn là do một nửa số
chủng S.aureus hiện đang đƣợc phân loại là S.aureus kháng methicillin (MRSA),
chứa các gen khiến các chủng này không nhạy cảm với một nhóm kháng sinh mạnh.
Các quan sát lâm sàng gần đây đã ghi nhận rằng tỷ lệ tử vong do viêm phổi MRSA
13
có thể vƣợt quá 50%, qua đó có thể xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh do sinh
vật này gây ra [7]. Chi phí y tế trực tiếp ƣớc tính để điều trị bệnh nhân viêm phổi do
S. aureus vƣợt quá 35,000$, gây ra gánh nặng đáng kể cho nền kinh tế [38]. Những
rủi ro kết hợp của dịch tễ học thay đổi và sức đề kháng thuốc rộng rãi giữa các
chủng S.aureus đòi hỏi sự phát triển của các chiến lƣợc mới để phòng ngừa và điều
trị bệnh.
Streptococcus pneumoniae
Bệnh phế cầu khuẩn là một bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Streptococcus
pneumoniae gây ra . Những vi khuẩn này có thể gây ra nhiều loại bệnh nhƣ: viêm
phổi (nhiễm trùng phổi), nhiễm trùng tai, viêm màng nhĩ và nhiễm khuẩn huyết. Vi
khuẩn phế cầu khuẩn lan truyền qua ho, hắt hơi và tiếp xúc gần gũi với ngƣời bị
nhiễm bệnh. Các triệu chứng của bệnh phế cầu khuẩn phụ có thể bao gồm sốt, ho,
khó thở, đau ngực… Trong trƣờng hợp nặng, bệnh phế cầu khuẩn có thể gây mất
thính giác, tổn thƣơng não và tử vong.
Hàng năm có khoảng 2,6 triệu trẻ em vào khoảng 5 năm tuổi chết do viêm phổi chủ
yếu, khoảng một nửa trong số này tử vong là do S.pneumoniae hoặc kết hợp với
nhiễm trùng đƣờng hô hấp do virus, suy dinh dƣ ng hoặc nhiễm HIV. Phế cầu
khuẩn là một phần của hệ vi sinh vật tồn tại trong mũi và họng, đặc biệt là ở trẻ em
và dễ dàng truyền nhiễm thông qua nƣớc bọt từ ngƣời này sang ngƣời khác đặc biệt
nguy cơ này tăng cao khi bị lây nhiễm từ bệnh nhân nhiễm trùng đƣờng hô hấp.
Nhiều nghiên cứu đã ghi lại việc nhiễm phế cầu ở đƣờng mũi họng thƣờng xảy ra ở
độ tuổi nhỏ và là bệnh phổ biến nhất trong số các bệnh ở trẻ em tại các nƣớc phát
triển và nƣớc đang phát triển [34].
Streptococcus pyogenes
Nhiễm trùng đƣờng hô hấp trên là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất ở trẻ em. Viêm
họng do Streptococcus là khá phổ biến ở trẻ em trong các trung tâm chăm sóc trẻ
em. Sự truyền nhiễm xảy ra khi tiếp xúc trực tiếp hay hít phải vi sinh vật qua các
giọt nƣớc bọt [27]. Thời kỳ ủ bệnh liên cầu khuẩn gây viêm họng ngắn từ hai đến
năm ngày. Triệu chứng bao gồm ban đỏ, phù nề và sƣng họng, ngoài ra có thể
14
amydal mở rộng và có màu trắng xám [41]. Nếu không xử lý kịp thời, thì tốc độ
truyền nhiễm của GAS khoảng 35% trong gia đình hoặc trƣờng học. Điều kiện sống
đông đúc có thể tăng sự truyền nhiễm của GAS và có thể gây bùng phát thành dịch.
Việc trì hoãn điều trị hoặc không đáp ứng đƣợc điều trị liên cầu khuẩn viêm họng
có thể gây ra các biến chứng nghiêm trọng tiếp theo, chẳng hạn nhƣ sốt thấp khớp
cấp tính và viêm cầu thận cấp tính.
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH
VẬT
Hai phƣơng pháp chính dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh vật là phƣơng
pháp khuếch tán trên thạch và phƣơng pháp pha loãng [8], [9], [10].
1.3.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên thạch
Phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán
Thƣờng áp dụng với các chất không thể khuếch tán trong bản thạch. Đây là thử
nghiệm đi trƣớc thử nghiệm MIC. Là phƣơng pháp hay dùng để làm kháng sinh đồ.
Nguyên tắc: dùng đĩa giấy có tẩm dung dịch chất thử đặt lên mặt thạch đã tráng một
lớp huyền dịch vi khuẩn. Chất thử sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng
trƣởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế.
Ƣu điểm: nhanh, gọn, thực hiện dễ dàng.
Nhƣợc điểm: Nếu chất thử không khuếch tán vào bản thạch sẽ cho kết quả sai lệch.
Phƣơng pháp đục lỗ
Nguyên tắc: Dùng đĩa thạch đã đƣợc tráng sẵn một lớp huyền dịch vi khuẩn, để khô
mặt thạch, đục các lỗ tròn đến đáy hộp. Cho dung dịch thử vào các lỗ tròn, chất thử
sẽ khuếch tán vào lớp thạch xung quanh, tạo vùng ức chế quanh chỗ đục lỗ (vòng
vô khuẩn).
Ƣu điểm: Có thể thực hiện với hầu hết mọi chất.
Nhƣợc điểm: Cần thăm dò để tìm ra dung dịch đệm và môi trƣờng để chất thử
nghiệm khuếch tán tốt nhất. Phƣơng pháp này cũng đòi hỏi thời gian và kinh
nghiệm. Đối với các phƣơng pháp trên, chất thử đƣợc coi là có tính kháng khuẩn
15
nếu có vòng ức chế rõ ràng. Nếu vi khuẩn trên bề mặt thạch mọc yếu hay các chất
thử nghiệm có khả năng bay hơi thì cần lặp lại bằng phƣơng pháp pha loãng.
1.3.2. Phƣơng pháp pha loãng
Phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng lỏng
Nguyên tắc: Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trƣờng lỏng đã pha sẵn
chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đƣa vi khuẩn thử
nghiệm vào. Đem ủ ở 35 – 37oC trong vòng 16 – 20 giờ. Nếu có tác dụng kháng
khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng lỏng (môi
trƣờng sẽ trong), ngƣợc lại, nếu có sự tăng trƣởng của vi khuẩn, môi trƣờng sẽ đục.
Ƣu điểm: Nhanh gọn, dễ thực hiện.
Nhƣợc điểm: Chỉ áp dụng đƣợc với các chất dễ tan trong nƣớc.
Phƣơng pháp pha loãng trong thạch
Nguyên tắc: Pha loãng chất thử vào môi trƣờng thạch đun chảy, đổ vào hộp petri.
Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ từ 16 – 24 giờ. Nếu có khóm vi khuẩn
mọc lên thì chất thử không có tác dụng, nếu vi khuẩn không mọc thì chất thử có tác
dụng ức chế. Trƣờng hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm, kiểm tra các
yếu tố có thể ảnh hƣởng tới kết quả thử nghiệm (chất nhũ hóa, dung môi hòa tan,
nhiệt độ môi trƣờng,…).
Ƣu điểm: Có thể sử dụng cho các chất khó tan, không tan trong môi trƣờng.
Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này đòi hỏi kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên
bản thạch và phƣơng pháp này đòi hỏi số lƣợng vi khuẩn mỗi lần chấm là nhƣ nhau.
16
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng thử nghiệm
2.1.1.1. Dƣợc liệu
Húng quế sử dụng trong nghiên cứu của đề tài đƣợc trồng ở Khánh Hòa. Hai loại
húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trồng cùng thời điểm và thu hoạch từ lúc cây bắt đầu
ra hoa (sau 35 ngày trồng [43]) vào tháng 7/2018. Các cây đƣợc trồng tự nhiên
không có phân bón, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu hay các thuốc tƣơng tự cũng
nhƣ hóa chất. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng trong đề tài bao gồm lá tƣơi và
hoa (nếu có), tất cả đều dùng ở dạng tƣơi. Hai loại lá húng quế đƣợc thể hiện trong
hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.1. Húng quế lá lớn và Húng quế lá nhỏ
17
Hình 2.2. Hai loại lá Húng quế
A: Húng quế lá lớn B: Húng quế lá nhỏ
2.1.1.2. Vi sinh vật
Các thử nghiệm đƣợc thực hiện trên 6 chủng vi khuẩn tiêu chuẩn, đƣợc cung cấp
bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành nhƣ
sau:
Escherichia coli ATCC 35218
Staphylococcus areus ATCC 29213 (MSSA)
Staphylococcus areus ATCC 33591 (MRSA)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Streptococcus pyogenes ATCC 19625
2.1.2. Hóa chất
Danh sách hóa chất sử dụng trong đề tài đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng
STT Hóa chất Nhà sản xuất Nƣớc sản xuất Tiêu chuẩn
1 Nƣớc cất
Cemaco Việt Nam Công nghiệp
2 DMSO Merck Đức Công nghiệp
3 Tween 80 Merck Đức Công nghiệp
A B
18
2.1.3. Môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: môi trƣờng Brain Heart Infusion Agar (BHA) và
môi trƣờng Brain Heart Infusion Broth (BHI).
Môi trƣờng pha loãng vi khuẩn: nƣớc muối sinh lý 0.85% và 0.05% Tween 80.
Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn (khuếch tán kháng sinh trong
thạch từ đĩa giấy và kháng sinh đồ xác định MIC): môi trƣờng Mueller–Hinton
Agar (MHA) (Merck) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA
bổ sung 5% máu cừu đối với các chủng S.pyogenes và S.pneumoniae.
Tất cả môi trƣờng sau khi pha xong đƣợc hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 20
phút. Môi trƣờng đã hấp tiệt trùng nhƣng chƣa sử dụng đƣợc bảo quản trong tủ lạnh
ở 2 – 8°C.
2.1.4. Thiết bị dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc
Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành. Danh sách các thiết bị sử dụng đƣợc trình bày
trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh sách thiết bị
STT Thiết bị Model
1 Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV110
2 Tủ sấy Memmert WBU 45 – UM 500
3 Kính hiển vi Optica ANHG 10609
4 Cân điện tử Sartorius Practum 2102 – 1S
5 Tủ cấy vô trùng Esco AVC-4A1
6 Máy vortex Labnet 3412EU
7 Tủ ấm Heraeus
8 Máy đo quang phổ
GeneQuant UV – 1280
9 Bếp đun bình cầu 1 lít
Glassco 1108 – 150
10 Bộ chƣng cất tinh dầu
19
Dụng cụ: đĩa petri Φ 40mm, Φ 60mm, Φ 90mm; que cấy, tăm bông tiệt trùng, đĩa
giấy Whatman 6mm, que trải tam giác, đèn cồn và các dụng cụ thủy tinh thông
thƣờng trong phòng thí nghiệm.
Dụng cụ dùng trong thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đƣợc hấp tiệt khuẩn ở 121oC
trong 20 phút, sấy ở nhiệt độ 80oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng cho nguội trƣớc khi
sử dụng.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo các bƣớc nhƣ Sơ
đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.1. Phƣơng pháp thu hái xử lý dƣợc liệu
Dƣợc liệu sau khi thu hoạch, đƣợc rửa sạch để loại bỏ bụi bám dính và rửa lại bằng
nƣớc cất, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ vừa phải
Húng quế lá nhỏ
Húng quế lá lớn
Thu hoạch sau 35 ngày trồng
Chiết xuất bằng phƣơng pháp
chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn bằng
phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán
Tinh dầu
Xác định MIC bằng phƣơng pháp pha loãng
trong môi trƣờng thạch
Xác định MBC bằng phƣơng pháp trải đĩa
20
và đƣợc dùng để chiết tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
trong vòng 3 giờ bằng bộ chƣng cất tinh dầu. Sau đó, tinh dầu sẽ đƣợc lấy ra và cho
vào eppendorf bảo quản trong tủ lạnh 2-8oC.
Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng đa số với quy mô phòng thí nghiệm. Chƣng cất lôi
cuốn hơi nƣớc là một trong các phƣơng pháp đặc biệt của phƣơng pháp chƣng cất
đối với các dƣợc liệu nhạy cảm với nhiệt độ nhƣ tinh dầu, nhựa, hydrocacbon,…
không hòa tan trong nƣớc và có thể bị phân hủy tại điểm sôi của chúng. Bản chất cơ
chế của chƣng cất hơi nƣớc cho ph p một hợp chất hoặc hỗn hợp của các hợp chất
đƣợc chƣng cất ở nhiệt độ thấp hơn đáng kể so với điểm sôi của thành phần riêng lẻ.
Tinh dầu chứa các chất có điểm sôi lên tới nhiệt độ từ 200°C trở lên, nhờ hơi nƣớc
hoặc khi nƣớc sôi các chất có thể bay hơi ở nhiệt độ gần 100°C ở áp suất khí quyển.
Nguyên liệu sử dụng trong phƣơng pháp là dƣợc liệu tƣơi hoặc đôi khi sấy khô
đƣợc đặt trong bình cầu có dung tích 1000ml có dẫn qua ống sinh hàn. Khi đến
nhiệt độ sôi nƣớc đi qua dƣợc liệu dƣới áp suất có thể làm mềm các tế bào và cho
ph p tinh dầu thoát ra theo hơi nƣớc dƣới dạng hơi. Nhiệt độ của hơi nƣớc phải đủ
cao để làm bay hơi dầu, nhƣng không quá cao để không phá hủy dƣợc liệu hoặc làm
kh t tinh dầu. Khi chúng đƣợc giải phóng, những giọt tinh dầu nhỏ bay hơi và cùng
với các phân tử hơi nƣớc, đi qua ống hứng tinh dầu. Khi hơi nƣớc nguội đi, nó
ngƣng tụ thành nƣớc. Tinh dầu tách lớp và nổi trên mặt chất lỏng [37].
Tiến hành:
Dƣợc liệu sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, đem đi cân và ghi nhận kết quả để tính
hiệu suất. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ cho vào bình cầu dung tích 1000ml cùng
với 500ml nƣớc cất, lƣợng nƣớc vừa đủ ngập dƣợc liệu. Lắp ráp hệ thống sinh hàn
hoàn chỉnh. Thời gian quá trình chƣng cất khoảng 3 giờ. Sau đó lấy lớp tinh dầu nổi
phía trên mặt chất lỏng cho vào eppendorf và bảo quản trong tủ lạnh. Mô hình thực
hiện phƣơng pháp chứng cất lôi cuốn đƣợc thể hiện trong hình 2.3 và 2.4.
Hiệu suất chiết tinh dầu tính theo công thức:
21
Hiệu suất chiết tinh dẩu: ƣợ ầ đƣợ
ƣợ á đ ế
Hình 2.3. Mô hình chƣng cất lôi cuốn Hình 2.4. Bộ chƣng cất tinh dầu
hơi nƣớc
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
2.2.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn
Tinh dầu đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn trình bày
ở mục 2.1.1.2, theo phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán, đƣợc qui định tại hƣớng dẫn
M44 – A và M02 – A11 của CLSI [23], [30].
2.2.2.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là Mueller–Hinton Agar (MHA) và môi
trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với
vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae. Sau khi pha và hấp tiệt trùng, môi trƣờng
đƣợc cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày
đồng nhất, khoảng 4mm. Thể tích môi trƣờng khoảng 6.5ml/đĩa đối với đĩa Φ
60mm và để thực hiện trên hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae và
Tinh dầu
Ống sinh hàn
Ống hứng
tinh dầu
Nƣớc
Bếp đun
Bình cầu
22
20ml/đĩa đối với đĩa Φ 90mm với các chủng vi khuẩn thƣờng. Để nguội ở nhiệt độ
phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 4 – 8°C. Khi sử dụng,
nếu đĩa ƣớt, để đĩa trong tủ ấm tối đa 30 phút cho đĩa khô hoàn toàn.
2.2.2.1.2. Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn chuẩn sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch BHA và BHA bổ
sung 5% máu cừu đối với chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae đƣợc ủ ở
37°C trong 24 giờ.
Chọn 3-5 khóm vi khuẩn giống nhau tách rời, dùng vòng cấy vô trùng lấy các khóm
cho vào ống chứa dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85% có thêm 0,05% Tween 80 và
phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc điều chỉnh về giá trị OD
0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 625nm. Giá trị này tƣơng đƣơng với khoảng 1 – 2 x 108
CFU/ml. Vi khuẩn sau khi pha xong phải sử dụng trong vòng 30 phút.
2.2.2.1.3. Chuẩn bị chất thử
Tinh dầu đƣợc tẩm lên các đĩa giấy đƣờng kính 6mm với lƣợng là 3l/đĩa giấy đối
với đĩa Φ 60mm, 7l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 90mm.
2.2.2.1.4. Tiến hành khảo sát
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng que bông vô trùng
nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn. Trải vi khuẩn lên môi trƣờng thử nghiệm bằng
que bông. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải theo đƣờng zic-zac sát nhau đến giữa đĩa
petri, sau đó xoay mặt thạch 600 rồi tiếp tục trải zic-zac nhƣ lần trên, rồi xoay tiếp
600 và trải các đƣờng sát nhau nhƣ vậy đến khi huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải đều
trên toàn bộ mặt thạch. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để
vi khuẩn đƣợc trải đều.
Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu lên bề mặt môi trƣờng bằng kẹp vô trùng. Sau khi đặt
đĩa dùng kẹp nhấn nhẹ đĩa xuống mặt thạch để đảm bảo đĩa tiếp xúc hoàn toàn với
mặt thạch. Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa giấy, phải ủ các đĩa thạch trong tủ ấm
ở 35 – 37°C trong 24 giờ. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.1.5. Đọc kết quả
23
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng tròn ức
chế đồng nhất. Đo và ghi nhận đƣờng kính vòng ức chế kể cả đƣờng kính của đĩa
tẩm tinh dầu bằng thƣớc kẹp có độ chia nhỏ nhất là 0,01mm.
Khả năng kháng mạnh hay yếu đƣợc đánh giá sơ bộ bằng giá trị đƣờng kính vòng
ức chế theo Bảng 2.3 [47].
Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế
Đƣờng kính vòng ức chế vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật
> 14 Mạnh
10 – 14 Vừa
7 – 9 Yếu
6 Không kháng
2.2.2.2. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC)
Tinh dầu có tác động ức chế sẽ đƣợc thử nghiệm tìm MIC bằng phƣơng pháp pha
loãng trong môi trƣờng rắn [45], [46]; mỗi thử nghiệm thực hiện lặp lại 6 lần.
2.2.2.2.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Tƣơng tự với mục 2.2.2.1.2. Sau đó, huyền dịch trên tiếp tục đƣợc pha loãng 10 lần
để đạt mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với 107 CFU/ml.
Vi khuẩn sau khi đƣợc pha chế phải đƣợc sử dụng ngay trong vòng 30 phút.
2.2.2.2.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng tốt nhất để thực hiện phƣơng pháp pha loãng môi trƣờng thạch xác định
MIC là MHA (Mueller-Hinton Agar). Chất thử nghiệm đƣợc hút chính xác và pha
thành dung dịch mẹ trong DMSO 1%. Chuẩn bị sẵn 1 dãy gồm 11 đĩa petri Φ
40mm vô trùng và đánh số từ 1 đến 10 ở đáy đĩa; đĩa số 11 đƣợc ký hiệu là đĩa
chứng và không cho chất thử vào. Tiến hành pha loãng trong môi trƣờng thử
nghiệm sao cho tạo thành dãy có nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trƣớc. Đối với hai
chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae, khi tiến hành pha loãng cho thêm vào
mỗi ống 5% máu cừu. Khoảng nồng độ cần pha phụ thuộc vào MIC dự đoán của
chất thử. Sử dụng máy vortex để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trƣờng. Đổ
vào đĩa petri và chờ thạch đông.
24
2.2.2.2.3. Tiến hành khảo sát
Chấm 1µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt đƣợc mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104
CFU/ml. Các đĩa thạch đƣợc để ngửa để dịch cấy trên các điểm cấy thấm hoàn toàn
lên mặt thạch khoảng 10-15 phút. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C. Thử nghiệm đƣợc lặp lại
6 lần.
2.2.2.2.4. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo
khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm.
Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy
có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.
2.2.2.3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
2.2.2.3.1. Môi trƣờng
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là BHA bổ sung 5% máu cừu đối với
S.pyogenes và S.pneumoniae và BHA đối với các chủng vi khuẩn còn lại.
2.2.2.3.2. Tiến hành khảo sát
Trên các đĩa thạch đã thực hiện MIC, chọn các đĩa có nồng độ nhƣ sau: 1 đĩa ngay
nồng độ MIC và 2 đĩa có nồng độ gấp 2, gấp 4 lần MIC.
Dùng dao đầu nhọn đã tiệt trùng cắt phần thạch đã chấm vi khuẩn trên các đĩa đƣợc
chọn làm MBC. Sau đó cho vào mỗi eppendorf 100µl nƣớc muối sinh lý có thêm
0,05% Tween 80, vortex kỹ. Hút huyền dịch trong eppendorf cho vào đĩa môi
trƣờng đã đƣợc hấp tiệt trùng sẵn. Dùng que trải thủy tinh tam giác phân tán đều
huyền dịch trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch hoàn toàn khô.
Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C, nếu có vi khuẩn thì chúng sẽ mọc thành các khóm trên mặt
thạch. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.3.3. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ. Tính số khóm trung bình trên một hộp thạch ở cùng
nồng độ. MBC là nồng độ mà tại đó diệt 99,9% vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có
tổng số khóm dƣới 10, nồng độ của đĩa thạch này là MBC của chất thử đối với vi
25
khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ
thấp, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.
2.2.3. Xử lý số liệu thống kê
Đề tài sử dụng phần mềm phân tích xử lý số liệu thống kê MINITAB 18.1. Mục
đích của đề tài khi sử dụng xử lý thống kê đó là đánh giá sự khác biệt của hai loại lá
húng quế. Tất cả các thí nghiệm đƣợc thực hiện sáu lần cho mỗi loài vi khuần đối
với phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng
rắn để xác định nồng độ MIC và trải đĩa để xác định MBC. Kết quả sau sáu lần thực
hiện đƣợc xử lý bằng Nonparametrics test với phƣơng pháp Mann-Whitney để xem
xét và phân tích ý nghĩa thống kê sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn giữa húng
quế lá nhỏ và húng quế lá lớn. Kết quả có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05, điều
này có nghĩa là có sự khác biệt đáng kể về hoạt tính kháng khuẩn của hai loại húng
quế trên các chủng vi khuẩn.
26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. HIỆU SUẤT CHIẾT TINH DẦU
Kết quả hiệu suất chiết tinh dầu của hai loại lá húng quế đƣợc trình bày ở Bảng 3.1.
Hiệu suất chiết tinh dầu từ húng quế lá nhỏ không chênh lệch nhiều so với lá lớn.
Điều này cho thấy rằng bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc thì lƣợng
tinh dầu có trong lá nhỏ (0,6ml) thu đƣợc xấp xỉ so với lá lớn (0,5ml). Từ kết quả
cho thấy rằng sự khác biệt này không đáng kể có thể là do hai loại húng quế đều
đƣợc trồng trên cùng một khu vực có khí hậu giống nhau, điều kiện chăm sóc giống
nhau dẫn đến hàm lƣợng tinh dầu thu từ hai loại cây không khác biệt.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu từ hai loại lá Húng quế
Lƣợng mẫu (g) Lƣợng tinh dầu
(ml) Hiệu suất (%)
Lá lớn
100,91 0,5 0,495
101,73 0,5 0,491
100,34 0,5 0,498
Trung bình 100,93 ± 0,69 0,5 ± 0,0 0,495 ± 0,004
Lá nhỏ
119,33 0,6 0,502
119,18 0,6 0,503
111,30 0,6 0,539
Trung bình 117,27 ± 4,59 0,6 ± 0,0 0,51 ± 0,021
3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn
Kết quả đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu O.basilicum đƣợc
trình bày ở Bảng 3.2.
Kết quả cho thấy hai loại tinh dầu O.basilicum đều có khả năng ức chế trên các
chủng vi khuẩn: E.coli, MRSA, MSSA, S.pyogenes, S.pneumoniae, riêng trên
P.aeruginosa cho tác động ức chế rất yếu (7mm đối với cả hai loại). Trong đó, khả
năng ức chế vi khuẩn của húng quế lá nhỏ gần nhƣ tƣơng đƣơng với húng quế lá lớn
đối với chủng S.pyogenes, S.pneumoniae và P.aeruginosa.
27
Húng quế lá nhỏ cho khả năng ức chế tốt nhất trên MRSA và đƣờng kính vùng
ức chế vi khuẩn là lớn nhất trong tất cả các chủng 13mm; sau đó là S.pneumoniae
với đƣờng kính vùng ức chế là 11mm. Tác động ức chế đối với hai chủng vi khuẩn
trên đều ở mức trung bình. Tinh dầu húng quế cho tác dụng ức chế tốt sau hai chủng
trên là E.coli, MSSA và S.pyogenes với đƣờng kính vùng ức chế lần lƣợt là 10mm,
9,5mm và 10mm. Mặc dù cả ba chủng vi khuẩn đều bị ức chế nhƣng tác động ức
chế này khá yếu. Riêng đối với S.pyogenes và S.pneumoniae không có sự khác biệt
về đƣờng kính vòng ức chế trên cả hai loại húng quế.
Đối với húng quế lá lớn tác động ức chế cũng tốt nhất trên MRSA và
S.pneumoniae với vùng ức chế cả hai vi khuẩn là 11mm, tƣơng tự nhƣ húng quế lá
nhỏ và cho tác động ức chế ở mức trung bình. Tác động ức chế trên E.coli, MSSA,
S.pyogenes cũng ở mức khá yếu với đƣờng kính vòng ức chế lần lƣợt là 8,5mm,
8,5mm và 10mm.
So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn cho thấy húng
quế lá nhỏ cho đƣờng kính vòng ức chế lớn hơn so với lá lớn đối với các chủng
E.coli, MRSA, MSSA (giá trị p = 0,004 < 0,05), đối với các chủng còn lại không có
sự khác biệt đáng kể giữa húng quế lá nhỏ và lá lớn.
Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng ức chế vi khuẩn của hai loại tinh dầu húng quế
lá lớn và lá nhỏ (mm)
EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu
Lá nhỏ 10 ± 0,4 13 ± 1,8 9,5 ± 0,7 7 ± 0,0 10 ± 0,0 11 ± 0,0
Lá lớn 8.5 ± 0,4 11 ± 0,4 8,5 ± 0,0 7 ± 0,0 10 ± 0,0 11 ± 0,0
EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng
với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae
(p<0,05)
28
Hình 3.1. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế MRSA của tinh dầu húng quế lá
nhỏ và lá lớn (LN: lá nhỏ, LL: Lá lớn)
Hình 3.2. Kết quả đƣờng kính vòng ức chế S.pyogenes của tinh dầu húng
quế lá nhỏ và lá lớn (1: lá lớn, 2: lá nhỏ)
3.2.2. Xác định MIC và MBC
3.2.2.1. Xác định nồng độ MIC
Kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trình bày trong
Bảng 3.3, 3.4, 3.5.
Kết quả cho thấy cả hai loại tinh dầu đều có khả năng ức chế vi khuẩn tốt ngay cả
ở nồng độ thấp. Nồng độ MIC càng thấp điều đó chứng tỏ vi khuẩn càng nhạy cảm
với loại tinh dầu đang thử nghiệm. So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các
29
chủng vi khuẩn cho thấy húng quế lá nhỏ có hoạt tính kìm khuẩn mạnh hơn so với
lá lớn đối với các chủng E.coli (p=0,009), S.pyogenes, S.pneumoniae (giá trị p =
0,03 < 0,05), đối với các chủng còn lại không có sự khác biệt giữa húng quế lá nhỏ
và lá lớn.
Đối với lá nhỏ, nồng độ MIC đạt giá trị thấp trên các chủng E.coli, S.pyogenes,
S.pneumoniae là 2,5l/ml. Trên chủng MRSA và MSSA nồng độ MIC cũng khá
thấp nhƣng độ nhạy cảm yếu hơn so với ba chủng trên với các giá trị lần lƣợt là
5l/ml và 10l/ml.
Đối với lá lớn, tƣơng tự nhƣ lá nhỏ cả ba chủng E.coli, S.pyogenes,
S.pneumoniae đều cho hoạt tính ức chế cao nhất so với các chủng còn lại, tuy nhiên
nồng độ MIC cao hơn so với lá nhỏ với 5l/ml. Nồng độ MIC không khác biệt giữa
hai chủng vi khuẩn MRSA và MSSA, ngoài ra MRSA nhạy cảm yếu hơn so với lá
nhỏ (10l/ml). Đối với MSSA thì giá trị MIC không khác nhau giữa hai loại tinh
dầu.
Riêng P.aeruginosa chỉ bị ức chế khi nồng độ MIC đạt giá trị cao nhất trên cả hai
loại tinh dầu với 80l/ml. Kết quả MIC cho thấy sự tƣơng đồng với kết quả xác
định đƣờng kính vùng ức chế.
Tóm lại, tác động ức chế sự tăng trƣởng vi khuẩn của hai loại tinh dầu lá lớn và
lá nhỏ có sự khác biệt đáng kể trên các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae. Cụ
thể tinh dầu húng quế lá nhỏ có tác động ức chế vi khuẩn tốt hơn lá lớn. Tinh dầu
húng quế cũng có tác động ức chế mạnh nhất trên các chủng E.coli, S.pyogenes,
S.pneumoniae; trung bình trên MRSA, MSSA và yếu nhất trên P.aeruginosa.
30
Hình 3.3. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá nhỏ
Nồng độ
(l/ml)
Vi khuẩn
80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625
EC (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
MR (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+)
MS (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
PSEU (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
PNEU (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
PYO (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
Kí hiệu: (-)Không mọc
EC: Escherichia coli
MSSA: Staphylococcusaureus nhạy cảm với methicillin
MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin
(+)Mọc
PSEU: Pseudomonas aeruginosa
PYO: Streptococcus pyogenes
PNEU: Streptococcus pneumoniae
31
Hình 3.4. Kết quả MIC của tinh dầu húng quế lá lớn
Nồng độ
(l/ml)
Vi khuẩn
80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625
EC (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
MR (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
MS (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
PSEU (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
PNEU (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+)
PYO (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+)
Kí hiệu: (-) Không mọc
EC: Escherichia coli
MSSA: Staphylococcusaureus nhạy cảm với methicillin
MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin
(+) Mọc
PSEU: Pseudomonas aeruginosa
PYO: Streptococcus pyogenes
PNEU: Streptococcus pneumoniae
32
Hình 3.5. Tổng hợp kết quả MIC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và
lá nhỏ
EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng
với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae
(p<0,05)
3.2.2.2. Xác định nồng độ MBC
Kết quả MBC cùa hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trình bày trong
Bảng 3.6.
Từ kết quả MBC, ghi nhận đƣợc cả hai loại tinh dầu đều cho tác động kháng
khuẩn mạnh nhất đối với S.pyogenes (với giá trị MIC bằng MBC). Tác động kháng
khuẩn của lá nhỏ tốt hơn lá lớn trên chủng S.pyogenes với giá trị MBC là 2,5l/ml
trên lá nhỏ và 5l/ml trên lá lớn.
Tinh dầu húng quế cho tác động diệt khuẩn tốt thứ hai sau chủng vi khuẩn trên
là S.pneumoniae ở nồng độ MBC là 5l/ml với lá nhỏ và tác động của tinh dầu lá
lớn yếu hơn với giá trị MBC là 10l/ml.
Đối với chủng E.coli dù nhạy cảm đối với hai loại tinh dầu nhƣng tinh dầu húng
quế chỉ cho hoạt tính diệt khuẩn khi ở nồng độ 10l/ml và hoạt tính này không có
sự khác biệt giữa hai loại tinh dầu. Cả hai loại húng quế chỉ cho tác động diệt khuẩn
trên MSSA khi ở nồng độ 20l/ml. Riêng đối với P.aeruginosa, tinh dầu chỉ có tác
động ức chế cũng nhƣ diệt khuẩn ở nồng độ cao.
So sánh tác động giữa hai loại húng quế trên các chủng vi khuẩn cho thấy
không có sự khác biệt về hoạt tính diệt khuẩn đối với tất cả chủng vi khuẩn ngoại
trừ hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05). Tóm lại, tinh
Nồng độ
tinh dầu
(l/ml)
EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu
Lá nhỏ 2,5 5 10 80 2,5 2,5
Lá lớn 5 10 10 80 5 5
33
dầu húng quế đều có tác động diệt khuẩn tốt trên hầu hết các chủng vi khuẩn thử
nghiệm cho giá trị MBC ≤ 4MIC [19], và tác động kháng khuẩn yếu trên
P.aeruginosa với nồng độ cao 80l/ml.
Hình 3.6. Kết quả MBC của hai loại tinh dầu húng quế lá lớn và lá nhỏ
Nồng độ
tinh dầu
(l/ml)
EC MRSA MSSA Pseudo Pyo Pneu
Lá nhỏ 10 20 20 80 2,5 5
Lá lớn 10 20 20 80 5 10
EC: E.coli; MSSA: S.aureus nhạy cảm với methicillin; MRSA: S.aureus đề kháng
với methicillin; Pseudo: P.aeruginosa; Pyo: S.pyogenes; Pneu: S.pneumoniae
(p<0,05)
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Hiệu suất chiết tinh dầu
Theo nhƣ nghiên cứu của Heyland và cs. (2006) [21], Dachler và cs. (1999) [15],
và Marquard và cs. (2002) [31], hàm lƣợng tinh dầu húng quế phụ thuộc trên nhiều
yếu tố nhƣ kiểu gen và giống cây trồng, thời tiết, khí hậu, ngày gieo và thời gian thu
hoạch. Nghiên cứu của Heyland và cs. cũng báo cáo về sự đa dạng trong hiệu suất
chiết tinh dầu húng quế nằm trong khoảng 0,04% đến 0,7%, trong khi nghiên cứu
của Dachler và cs. giá trị này từ 0,5% đến 1,5%.
Trong nghiên cứu của đề tài, thì hiệu suất chiết của húng quế lá nhỏ và lá lớn lần
lƣợt là 0,51% và 0,49%; kết quả này nằm trong khoảng hiệu suất chiết nhƣ các
nghiên cứu trên đã nêu ra. Theo nghiên cứu của Eleni và cs. (2011) [44] cũng thực
hiện khảo sát trên một loại húng quế lá lớn và lá nhỏ, nhìn chung, hiệu suất chiết
của hai loại tinh dầu không có khác biệt đáng kể (húng quế lá lớn 1,67%; húng quế
lá nhỏ 1,66%). Hiệu suất chiết tinh dầu húng quế (còn gọi là năng suất khai thác
tinh dầu) đƣợc đánh giá quan trọng trên thị trƣờng quốc tế bởi một sản phẩm đƣợc
chấp nhận về mặt thƣơng mại khi năng suất tinh dầu của nó cao hơn 0,4% [21],
[31].
34
3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu O.basilicum có khả năng ức chế sự
phát triển của vi khuẩn nhƣng khả năng kháng khuẩn là khác nhau đối với mỗi
chủng. Tinh dầu húng quế cho hoạt tính kháng khuẩn tốt trên nhiều chủng vi sinh
vật khác nhau [33].
Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, hoạt động kháng khuẩn của tinh dầu O.basilicum
trên các chủng vi khuẩn Gram (+) tốt hơn so với Gram (-). Ở một số nghiên cứu
khác, Silveiravà cs. (2012) [42], trên một số chủng vi khuẩn nhƣ trong đề tài cho
thấy khả năng kháng của O.basilicum tốt hơn trên Gram (-). Trong đề tài của chúng
tôi, nồng độ MIC của E.coli và MSSA lần lƣợt là 2,5l/ml và 5l/ml (trên lá nhỏ)
cao gấp đôi so với kết quả MIC của Silveira là 1,25l/ml và 2,5l/ml; ngoài ra nồng
độ MIC của MSSA cũng cao hơn so với E.coli. Khi so sánh kết quả của đề tài với
nghiên cứu Mehdizadeh và cs. (2016) [32] trên hai chủng này thì lại cho kết quả
ngƣợc lại; giá trị MIC của MSSA (0,62l/ml) thấp hơn so với E.coli (10l/ml).
Nhƣng đối với P.aeruginosa thì kết quả của đề tài cho khả năng ức chế rất yếu so
với kết quả từ nghiên cứu của Silveira không cho hoạt tính ức chế vi khuẩn. Kết quả
từ đề tài chúng tôi cho thấy khả năng ức chế khá tốt trên các chủng vi khuẩn Gram
(+), đặc biệt là hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae với kết quả MIC lần lƣợt là
2,5l/ml và 5l/ml (trên lá nhỏ).
Qua kết quả nghiên cứu của đề tài, khi so sánh tác động giữa hai loại húng quế trên
các chủng vi khuẩn cho thấy húng quế lá nhỏ có hoạt tính kìm khuẩn mạnh hơn so
với lá lớn đối với các chủng E.coli, S.pyogenes, S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 <
0,05), đối với các chủng còn lại không có sự khác biệt giữa húng quế lá nhỏ và lá
lớn. Khi so sánh hoạt tính diệt khuẩn của hai loại húng quế trên tất cả chủng vi
khuẩn thì không có sự khác biệt đáng kể giữa hai loại húng quế, ngoại trừ hai chủng
S.pyogenes và S.pneumoniae % (giá trị p = 0,03 < 0,05) có sự khác biệt đáng kể.
Từ kết quả nghiên cứu của đề tài và khi so sánh với các nghiên cứu khác cho thấy
sự khác biệt của hàm lƣợng các hợp chất trong dƣợc liệu và phƣơng pháp chiết xuất
35
có thể ảnh hƣởng đến hoạt động kháng khuẩn. Đầu tiên, trong quá trình chiết xuất,
thời gian và nhiệt độ không ổn định có thể làm bay hơi tinh dầu và các hợp chất
chứa trong tinh dầu húng quế cho hoạt tính kháng khuẩn. Thứ hai, trong tinh dầu
húng quế có chứa khá nhiều hợp chất bay hơi, điều này ảnh hƣởng đến khả năng
khuếch tán của tinh dầu trên mặt thạch dẫn đến việc ức chế vi khuẩn của tinh dầu
khi thực hiện phƣơng pháp khuếch tán trên thạch cho đƣờng kính vùng ức chế vi
khuẩn nhỏ. Ngoài ra khi thực hiện khảo sát tác động diệt khuẩn, các chủng vi khuẩn
đều cho giá trị MBC bằng hoặc gấp hai lần so với giá trị MIC, riêng đối với chủng
E.coli chuẩn, do đặc tính của chủng là kháng betalactam dẫn đến tinh dầu húng quế
chỉ cho tác dụng diệt khuẩn với giá trị MBC (10l/ml) cao gấp 4 lần so với MIC
(2,5l/ml) [19].
36
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt đƣợc mục tiêu đề ra với những kết
quả sau:
Xác định đƣợc nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu của hai loại tinh dầu:
Tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn đều có hoạt tính kháng khuẩn. Cả hai loại
húng quế đều cho tác động ức chế và diệt khuẩn mạnh nhất trên hai loài thuộc chi
Streptococcus, là nguyên nhân phổ biến gây bệnh đƣờng hô hấp với giá trị MBC
bằng với giá trị MIC lần lƣợt là 2,5l/ml (lá nhỏ) và 5l/ml (lá lớn) đối với
S.pyogenes; 5l/ml (lá nhỏ) và 10l/ml (lá lớn) đối với S.pneumoniae.
Trên các chủng E.coli, MRSA và MSSA, cả hai loại húng quế cho hoạt tính diệt
khuẩn thấp hơn so với hai chủng trên. Cả hai loại húng quế đều cho khả năng kháng
khuẩn rất yếu đối với P.aeruginosa.
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu húng quế lá nhỏ và lá lớn có sự khác biệt
đáng kể trên hai chủng S.pyogenes và S.pneumoniae (giá trị p = 0,03 < 0,05), tuy
nhiên không có sự khác biệt đáng kể trên các chủng còn lại.
37
4.2. ĐỀ NGHỊ
Do thời gian có hạn, đề tài chỉ thực hiện một số mục tiêu và đạt đƣợc kết quả nhƣ
trên. Trong thời gian sắp tới, chúng tôi đề nghị tiến hành thêm những nghiên cứu
sau:
1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, cũng nhƣ hoạt chất có tác động
kháng khuẩn – kháng nấm của tinh dầu húng quế.
2. Thử nghiệm tính kháng khuẩn của cao toàn phần và cao phân đoạn từ húng quế
trên các chủng vi khuẩn chuẩn gây bệnh khác và các chủng vi khuẩn đƣợc phân lập
từ ngƣời bệnh.
3. Nghiên cứu thêm các hoạt tính sinh học nhƣ hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính
kháng viêm và hoạt tính kháng nấm của tinh dầu húng quế cũng nhƣ các loài trong
chi Ocimum.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Ánh H T, (2009), Nghiên cứu bước đầu khả năng kháng khuẩn của các loại tinh
dầu li trích từ cây Húng quế (Ocimum basilicum L) và cây Húng cây (Mentha
arvensis L)- ĐH Nông Lâm TP.HCM, pp.
2. Liêu Thùy Linh, Ngô Nguyễn Nhật Hà, Phan Thị Kim Liên, Hà T T M, et al,
(2017), "Khảo sát ảnh hƣởng của tinh dầu quế, sả chanh, húng quế, bạc hà và
tác dụng kết hợp của chúng tới Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger",
Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường ĐH Công nghiệp Thành phố Hồ Chí
Minh (1982-2017), pp. 127-134.
3. Đỗ Tất Lợi, (2011), Các cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, pp.
4. Thịnh B N, Phạm Anh Tuấn P T H G, Nguyễn Hồng Trƣờng, (2013), "Khảo sát
tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa Hồi sức tích cực và chống
độc", pp.
5. Trần Lê Anh Thùy, Trƣơng Thị Đẹp, (2011), "Đặc điểm hình thái và giải phẫu
các loài của chi Ocimum họ Bạc hà (Lamiaceae) ở Việt Nam", Y Học TP Hồ
Chí Minh, 15 (1), pp. 378-385.
Tài liệu tiếng Anh
6. Abbasi J, (2016), "Infectious disease expert sees threat from colistin-resistant
superbug", Jama, 316 (8), pp. 806-807.
7. Athanassa Z, Siempos I, Falagas M, (2008), "Impact of methicillin resistance on
mortality in Staphylococcus aureus VAP: a systematic review", European
Respiratory Journal, 31 (3), pp. 625-632.
8. Badarinath A, Rao K M, Chetty C M S, Ramkanth S, et al, (2010), "A review on
in-vitro antioxidant methods: comparisions, correlations and considerations",
International Journal of PharmTech Research, 2 (2), pp. 1276-1285.
9. Balekar N, Katkam N G, Nakpheng T, Jehtae K, et al, (2012), "Evaluation of the
wound healing potential of Wedelia trilobata (L.) leaves", Journal of
Ethnopharmacology, 141 (3), pp. 817-824.
10. Balekar N, Nakpheng T, Srichana T, (2014), "Wedelia trilobata L.: A
phytochemical and pharmacological review", Chiang Mai Journal of Science,
41 (3), pp. 590-605.
11. Bell S, Smith D, (1976), "Quantitative throat-swab culture in the diagnosis of
streptococcal pharyngitis in children", The Lancet, 308 (7976), pp. 61-63.
12. Bozin B, Mimica-Dukic N, Simin N, Anackov G, (2006), "Characterization of
the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the
antimicrobial and antioxidant activities of the entire oils", Journal of
agricultural and food chemistry, 54 (5), pp. 1822-1828.
13. Celiktas O Y, Kocabas E H, Bedir E, Sukan F V, et al, (2007), "Antimicrobial
activities of methanol extracts and essential oils of Rosmarinus officinalis,
depending on location and seasonal variations", Food Chemistry, 100 (2), pp.
553-559.
14. Cowan M M, (1999), "Plant products as antimicrobial agents", Clinical
microbiology reviews, 12 (4), pp. 564-582.
15. Dachler M, Pelzman H, (1999), "Arznei-und Gewürzpflanzen: Anbau–Ernte–
Aufbereitung", Österreichischer agrarverlag, klosterneuburg, pp. 141-143.
16. Elisha I L, Jambalang A R, Botha F S, Buys E M, et al, (2017), "Potency and
selectivity indices of acetone leaf extracts of nine selected South African trees
against six opportunistic Enterobacteriaceae isolates from commercial chicken
eggs", BMC complementary and alternative medicine, 17 (1), pp. 90.
17. Epidemiology C f D C B o, Division C f D C Q, Division C f P S Q, (1991),
Health information for international travel, US Department of Health,
Education, and Welfare, Public Health Service, Center for Disease Control,
Bureau of Epidemiology, pp.
18. File T M. Introduction to Respiratory Tract InfectionsNetter’s Infectious
Diseases. Elsevier, pp. 126
19. Gatsing D, Tchakoute V, Ngamga D, Kuiate J-R, et al, (2015), "In vitro
antibacterial activity of Crinum purpurascens Herb. leaf extract against the
Salmonella species causing typhoid fever and its toxicological evaluation",
Iranian Journal of Medical Sciences, 34 (2), pp. 126-136.
20. Gülçin İ, Elmastaş M, Aboul‐ Enein H Y, (2007), "Determination of
antioxidant and radical scavenging activity of Basil (Ocimum basilicum L.
Family Lamiaceae) assayed by different methodologies", Phytotherapy
Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and
Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 21 (4), pp. 354-361.
21. Heyland K-U, Hanus H, (2006), Ölfrüchte, Faserpflanzen, Arzneipflanzen und
Sonderkulturen, Handbuch des Pflanzenbaus Band 4, Stuttgart, Eugen Ulmer
KG, ISBN 978-3-8001-3203-4, pp. 346-349.
22. Hidron A I, Edwards J R, Patel J, Horan T C, et al, (2008), "Antimicrobial-
resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: annual
summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the
Centers for Disease Control and Prevention, 2006–2007", Infection Control &
Hospital Epidemiology, 29 (11), pp. 996-1011.
23. Hiremath S, Kolume D, Muddapur U, (2011), "ANTIMICROBIAL ACTIVITY
OF ARTEMISIA VULGARIS LINN.(DAMANAKA)", International Journal
of Research in Ayurveda & Pharmacy, 2 (6), pp.
24. Hugbo P, Olurinola P, (1992), "Resistance of pseudomonas aeruginosa to
antimicrobial agents: implications in medicine and pharmacy", Nig J Pharm
Sci, 4 pp. 1-10.
25. Jain N, Lodha R, Kabra S, (2001), "Upper respiratory tract infections", The
Indian Journal of Pediatrics, 68 (12), pp. 1135-1138.
26. Kaufmann B, Christen P, (2002), "Recent extraction techniques for natural
products: microwave‐ assisted extraction and pressurised solvent extraction",
Phytochemical Analysis: An International Journal of Plant Chemical and
Biochemical Techniques, 13 (2), pp. 105-113.
27. Kim S J, (2000), "Bacteriologic characteristics and serotypings of
Streptococcus pyogenes isolated from throats of school children", Yonsei Med J,
41 (1), pp. 56-60.
28. Klevens R M, Morrison M A, Nadle J, Petit S, et al, (2007), "Invasive
methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States",
Jama, 298 (15), pp. 1763-1771.
29. Kollef M H, Shorr A, Tabak Y P, Gupta V, et al, (2005), "Epidemiology and
outcomes of health-care–associated pneumonia: results from a large US database
of culture-positive pneumonia", Chest, 128 (6), pp. 3854-3862.
30. Leber A L, (2016), Clinical microbiology procedures handbook, ASM Press
Washington, DC, USA:, pp.
31. Marquard R A, Kroth E, Bingel S, Cergel S, et al, (2002), nb u und
u lit ts nforderungen usgew hlter rzneipfl nzen II, Buchedition Agrimedia
GmbH, pp. 26-33.
32. Mehdizadeh T, Hashemzadeh M, Nazarizadeh A, Neyriz-Naghadehi M, et al,
(2016), "Chemical composition and antibacterial properties of Ocimum
basilicum, Salvia officinalis and Trachyspermum ammi essential oils alone and
in combination with nisin", Research Journal of Pharmacognosy, 3 (4), pp. 51-
58.
33. Moghaddam A M D, Shayegh J, Mikaili P, Sharaf J D, (2011), "Antimicrobial
activity of essential oil extract of Ocimum basilicum L. leaves on a variety of
pathogenic bacteria", Journal of Medicinal Plants Research, 5 (15), pp. 3453-
3456.
34. O’Brien K, Nohynek H, (2003), "World Health Organization Pneumococcal
Vaccine Trials Carriage Working G. Report from a WHO working group:
standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus
Pneumoniae", Pediatr Infect Dis J, 22 (2), pp. e1-11.
35. Pankaj R, Sunil S, Milind P, (2010), "Anti-inflammatory potential of the seeds
of Ocimum basilicum Linn. in rats", Asian Journal of Bio Science, 5 (1), pp. 16-
18.
36. Patil D D, Mhaske D K, Wadhawa G C, (2011), "Antibacterial and Antioxidant
study of Ocimum basilicum Labiatae (sweet basil)", Journal of Advanced
Pharmacy Education & Research, 2 pp. 104-112.
37. Rao V P, Pandey D. Extraction of essential oil and its applications, 2007.
38. Rubin R J, Harrington C A, Poon A, Dietrich K, et al, (1999), "The economic
impact of Staphylococcus aureus infection in New York City hospitals",
Emerging infectious diseases, 5 (1), pp. 9.
39. Sajjadi S E, (2006), "Analysis of the essential oils of two cultivated basil
(Ocimum basilicum L.) from Iran", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences,
14 (3), pp. 128-130.
40. Selvakkumar C, Gayathri B, Vinaykumar K S, Lakshmi B S, et al, (2007),
"Potential anti-inflammatory properties of crude alcoholic extract of Ocimum
basilicum L. in human peripheral blood mononuclear cells", Journal of health
science, 53 (4), pp. 500-505.
41. Shet A, Kaplan E, (2004), "Addressing the burden of group A streptococcal
disease in India", The Indian Journal of Pediatrics, 71 (1), pp. 41-48.
42. Silveira S, Anildo I, Jr A, Gerson I, et al, (2012), "Chemical composition and
antimicrobial activity of essential oils from selected herbs cultivated in the South
of Brazil against food spoilage and foodborne pathogens", Ciência Rural, 42 (7),
pp. 1300-1306.
43. Singh S, Singh M, Singh A K, Kalra A, et al, (2010), "Enhancing productivity
of Indian basil (Ocimum basilicum L.) through harvest management under
rainfed conditions of subtropical north Indian plains", Industrial crops and
products, 32 (3), pp. 601-606.
44. Wogiatzi E, Papachatzis A, Kalorizou H, Chouliara A, et al, (2011),
"Evaluation of essential oil yield and chemical components of selected basil
cultivars", Biotechnology & Biotechnological Equipment, 25 (3), pp. 2525-2527.
45. CLSI, (2009), Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for
Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Eighth Edition, pp.
46. Menon T, Umamaheswari K, Kumarasamy N, Solomon S, et al, (2001),
"Efficacy of fluconazole and itraconazole in the treatment of oral candidiasis in
HIV patients", Acta tropica, 80 (2), pp. 151-154.
47. Muanza D, Kim B, Euler K, Williams L, (1994), "Antibacterial and antifungal
activities of nine medicinal plants from Zaire", International Journal of
Pharmacognosy, 32 (4), pp. 337-345.
48. Organization W H, (2017), "Global priority list of antibiotic-resistant bacteria
to guide research, discovery, and development of new antibiotics", Geneva:
World Health Organization, pp.
Tài liệu Internet
49. Trƣơng Thị Đẹp (2011), Ocimum basilicum L,
http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/271, truy cập ngày 30/8/2018.
PL-1
PHỤ LỤC 1: BẢNG KẾT QUẢ ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ
Lần
thực
hiện
Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo
Lá nhỏ
1 9,5 9,5 11,5 6 9 11
2 10 10,5 14 6 9 11
3 9,5 9,5 14 6 9 11
4 10 10,5 11,5 6 9 11
5 10 9,5 11,5 6 9 11
6 9,5 10,5 14 6 9 11
Lá lớn
1 8 8,5 11 6 9 11
2 8,5 9 11 6 9 11
3 8,5 8,5 11 6 9 11
4 8,5 8,5 11 6 9 11
5 8 9 11 6 9 11
6 8,5 9 11 6 9 11
PL-2
PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC
Lần
thực
hiện
Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo
Lá nhỏ
1 5 5 10 80 2,5 2,5
2 2,5 5 10 80 2,5 2,5
3 2,5 5 10 80 2,5 2,5
4 2,5 5 10 80 2,5 2,5
5 2,5 5 10 80 2,5 2,5
6 5 5 10 80 2,5 2,5
Lá lớn
1 5 5 10 80 5 5
2 10 10 10 80 5 5
3 10 10 10 80 5 5
4 10 10 10 80 5 5
5 5 5 10 80 5 5
6 10 10 10 80 5 5
PL-3
PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ GIÁ TRỊ MIC
Lần
thực
hiện
Ecoli MRSA SA Pseudo Pyo Pneumo
Lá nhỏ
1 10 20 20 80 2,5 5
2 10 20 20 80 2.5 2,5
3 10 20 20 80 2,5 5
4 10 20 20 80 5 5
5 10 20 20 80 2,5 5
6 10 20 20 80 2,5 5
Lá lớn
1 10 20 20 80 5 10
2 10 20 20 80 5 10
3 10 20 20 80 10 10
4 10 20 20 80 5 5
5 10 20 20 80 5 10
6 10 20 20 80 5 10
PL-4
PHỤ LỤC 4: ĐƢỜNG KÍNH VÒNG ỨC CHẾ VI SINH VẬT
A
B
C
PL-4
A: E.coli B: MRSA C: MSSA
D : P.aeruginosa E: S.pyogenes F: S.pneumoniae
1: Lá lớn; LL: Lá lớn 2: Lá nhỏ; LN: Lá nhỏ
D
F
E
PL-5
PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ MIC
A: Lá lớn B: Lá nhỏ
E: Ecoli; R: MRSA; S: MSSA; P: P.aeruginosa
A
B
PL-5
A: Lá lớn B: Lá nhỏ
Y: S.pyogenes N: S.pneumoniae
A
B
