Trasportatori ABC

I trasportatori ABC rappresentano la famiglia di trasportatori di membrana più grande, presenti in tutti gli organismi viventi.

Molti trasportatori ABC hanno importanza clinica, alcuni sono responsabili della resistenza ai chemioterapici, altri traslocano i polipeptidi antigenici dal citoplasma al reticolo endoplasmatico nei processi che coinvolgono il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Nei batteri i trasportatori ABC sono principalmente coinvolti nell’up-take di nutrienti, sebbene contribuiscano anche all’esportazione di tossine e sostanze nocive, contribuendo alla resistenza multipla agli antibiotici.

L’enorme varietà di sostanze trasportate dagli ABC si riflette nella bassa omologia di sequenza dei domini transmembrana

Ciò che lega tra loro i membri di questa famiglia sono dei motivi di sequenza altamente conservati nella cassetta ABC, molti dei quali direttamente coinvolti nel legame e nell’idrolisi dell’ATP.

A fianco sono allineate le cassette ABC di diversi trasportatori con evidenziate le sequenze conservate.

Cell (2000) 101,789-800

I processi di riparazione del DNA interrotto su entrambi i filamenti richiedono un complesso proteico formato da Rad50/Mre11/Nbs1.

Di questo complesso, Rad50 e Mre11 sono presenti in tutti gli organismi viventi.

La proteina Rad50 da 150 kDa è un dominio catalitico/legame per l’ATP (Rad50cd) interrotto da un motivo a eptade ripetuta lungo 600-900 residui.

Due motivi, Walker A e Walker B, sono posti rispettivamente all’N e al C terminale.

Questa sequenza modulare suggerisce che due proteine Rad50 si assemblino in maniera antiparallela, in modo da formare due motivi Rad50cd unite da un segmento coiled coil.

I domini Rad50cd di tutte le sequenze Rad50 ortologhe hanno similarità di sequenza con le ABC-ATPasi, indice di una struttura e un meccanismo di catalisi comune.

La prima struttura che analizziamo è Rad50 isolata da Pyrococcus furiosus.

Per studiare la biochimica di Rad50, due segmenti corrispondenti all’N terminale (residui 1-152) e al C terminale (residui 735-882) furono coespressi.

In tutti i passaggi di purificazione, i due segmenti copurificavano come un unico complesso di circa 35kDa, chiamato il dominio catalitico di Rad50 (Rad50cd).

In presenza di ATP, due domini Rad50cd si uniscono per formare un omodimero del peso di circa 60kDa.

La presenza di ATP è inoltre richiesta per legare il DNA, come dimosta l’esperimento di gel-shift riportato in figura. In assenza di ATP Rad50 non lega il DNA (parte sinistra). L’aggiunta di ATP induce il legame Rad50cd-DNA, come evidenziato dalla minor mobilità elettroforetica del DNA (parte destra). In presenza di detergente (S), il complesso viene separato.

Struttura di Rad50cd senza ATP

Rad50cd è formata quindi dal segmento N e dal segmento C terminale della proteina Rad, privata del lungo tratto coiled coil.

Due molecole di Rad completa (150kDa) in disposizione antiparallela formano due “teste” che rappresentano due domini Rad50cd. Ogni Rad contribuisce a fornire l’N terminale ad un capo e il C terminale all’altro capo della struttura.

Rad50cd è quindi formato da due segmenti, N terminale e C terminale che si uniscono a formare una struttura con due lobi.

Il lobo I è formato principalmente dal segmento N terminale, i cui filamenti (7,6,5,4,1,2) si impaccano contro l’elica A.

Il lobo II è formato principalmente dal segmento C terminale in conformazione sandwich dovuto all’impaccamento delle eliche E,F,G tra due foglietti beta, uno formato dai filamenti 11,12,3,13,14 e l’altro formato dai filamenti 8,9,10.

I due lobi sono uniti nel foglietto beta centrale, che è formato dal filamento 3 del segmento N terminale e i filamenti 11,12,13,14 del segmento C terminale.

Il sito di legame per il nucleotide, indicato come ansa P (chiamato anche motivo di Walker A o P loop) è nel Lobo I, vicino all’interfaccia tra i due lobi.

In questa posizione, il legame/idrolisi dell’ATP potrebbe essere accoppiato con dei cambiamenti conformazionali sul lobo II.

Quando la Rad50cd fu cocristallizzato con l’analogo non idrolizzabile dell’ATP (AMP-PNP) o in presenza di ATP ma assenza di magnesio dal mezzo di cristallizzazione, la struttura rivelò la presenza di omodimeri.

Le subunità del dimero sono unite in modalità testa coda, in cui ogni Lobo II si interfaccia con il Lobo I del Rad50cd opposto.

L’interfaccia del dimero corre diagonalmente nella struttura, formando un lungo solco di 65 Å, profondo 12 Å e largo 22 Å.

L’ATP è legato all’interfaccia del dimero, bloccato tra l’ansa P di un Rad50cd e una sequenza conservata chiamata motivo firma dell’altro Rad50cd.

Mutazioni nel motivo firma (residui da 792 a 797) eliminano la dimerizzazione di Rad50cd, indicando il ruolo fondamentale che questi residui hanno in Rad50.

In presenza di ATP sono quindi ipotizzabili due strutture che Rad50 completa può assumere: una singola struttura formata da due monomeri di Rad50 antiparalleli si ripiega e unisce le due teste, oppure due dimeri di Rad50 si uniscono testa a testa.

Il motivo firma contatta il fosfato dell’ATP con la catena laterale della Ser793 e l’azoto della Gly795.

In questo modo il motivo firma potrebbe funzionare come un sensore del fosfato presente sull’altra molecola.

Il Mg++ è legato ai fosfati e dell’ATP e ai residui Ser37 e Gln140.

Due molecole di acqua sono legate al Mg++ , di cui una lega Asp822 e Glu823 presenti sulla sequenza chiamata Walker B.

Una terza molecola di acqua, legata dall’ossigeno della catena principale di Tyr827 e dall’N del residuo di Gln140 è posizionata per un attacco in linea sul fosforo del fosfato .

Sovrapponendo le strutture ottenute in assenza ed in presenza di ATP, è evidente una rotazione del lobo II rispetto al lobo I.

Una rotazione dell’elica F del lobo II sposta di 9Å il motivo firma e produce il cambiamento conformazionale che promuove l’associazione dei dimeri Rab50cd e il reciproco legame dell’ATP.

Le Tyr827 sono presenti in una regione chiamata D loop (per dimerizzazione). Queste regioni sono continue con il segmento Walker B. Osservando la struttura, si nota che le molecole di acqua legate dai residui del Walker B sono parte del cluster che coordina il Mg++ in un sito dell’ATP, mentre l’acqua legata da Tyr 827 è pronta per l’attacco in linea sul fosfato dell’altra molecola di ATP. E’ molto probabile che il D loop leghi l’idrolisi di una molecola di ATP in un sito all’idrolisi dell’ATP nell’altro sito.

La struttura dimerica di Rad50cd suggerisce un meccanismo per spiegare il legame al DNA indotto dall’ATP. Il solco che si forma quando Rab50cd dimerizza è carico positivamente e potrebbe rappresentare la superficie in cui il DNA viene legato.

Rad50 è associata ad un altro fattore proteico, Mre11, probabilmente con interazioni dovute alla regione coiled coil.

Il legame con l’ATP indurrebbe lo stato dimerico che lega il DNA (complesso Rad50/Mre11).

L’idrolisi dell’ATP sarebbe attivata da una segnalazione durante il meccanismo di riparazione del DNA.

L’idrolisi dell’ATP provocherebbe il rilascio del DNA.

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Science (2002) 296,1091-1098

Analizziamo la struttura del trasportatore BtuCD di E.coli.

Questo complesso è un trasportatore ABC che media l’up-take di vitamina B12.

L’unità funzionale del trasportatore di vitamina B12 è formata da due copie per ciascuna delle subunità BtuC e BtuD.

Ciascuna subunità BtuC, in rosso e viola, è formata da 10 eliche transmembrana.

Le subunità BtuD, in blu e verde, sono esposte al lato citoplasmatico, posizionate sulle subunità BtuC.

La disposizione dimerica della cassetta ABC del trasportatore BtuCD ricorda quanto visto nel dimero di Rad50.

Le due subunità BtuD sono allineate in modo che il P loop dell’una si contrappone al motivo firma dell’altra.

E’ quindi molto probabile che queste regioni siano responsabili del legame con l’ATP.

In BtuD, sono presenti tutte le sequenze coinvolte nel ciclo dall’ATP dei trasportatori ABC:WalkerAWalkerBDloopMotivo firmaQloopSwitch

Nel cristallo sono presenti due molecole di ciclotetravanadato, legate nel sito dell’ATP.

Sovrapponendo strutturalmente BtuD e Rad50 nella zona del sito di binding dell’ATP, due molecole di vanadato occupano la posizione dei fosfati e dell’ATP.

Struttura di BtuC

Ognuna delle due subunità transmembrana BtuC ha dieci eliche transmembrana, per un totale di venti eliche. Generalmente i trasportatori ABC hanno un numero di eliche transmembrana inferiore.

Questa differenza potrebbe essere dettata dalle dimensioni delle molecole che vengono trasportate.

BtuCD trasporta la vitamina B12, una molecola di grandi dimensioni.

Le eliche transmembrana sono impaccate tra loro in maniera piuttosto intricata.

Le eliche quattro e cinquecinque sono connesse da un loop citoplasmatico che forma il gate al centro del trasportatore.

Un altro loop citoplasmatico molto importante è quello tra le eliche sei e sette. Questo loop si struttura in due corti segmenti ad alfa elica indicati come L1 e L2, che hanno numerosi contatti con le subunità della cassetta ABC.

L’interfaccia tra le due subunità di membrana BtuC è data dall’impaccamento antiparallelo dell’elica cinque dell’elica cinque con l’elica 10 dell’altra subunità.

citoplasma

Queste eliche formano una cavità che si apre verso il periplasma, in grado di contenere una molecola di vitamina B12. L’interno della cavità è formato da residui idrofobici.

I residui del gate (loop tra elica 4 e 5) chiudono l’accesso al citoplasma.

Il gate separa l’accesso al canale dalla larga cavità citoplasmatica formata tra le regioni transmembrana e la cassetta ABC.

Regioni di contatto tra BtuC e la cassetta ABC BtuD

Le regioni di contatto tra BtuC e la cassetta ABC sono formate dalle corte alfa eliche presenti nel loop (L1 e L2) che connette elica sei e elica sette di BtuC

e le regioni che fiancheggiano il fiancheggiano il QQlooploop nella subunità BtucD.

Il motivo L loop (L1 e L2) è conservato nelle subunità di membrana dei trasportatori ABC.

Ipotesi di meccanismo di trasporto della vitamina B12

Per iniziare un ciclo produttivo di trasporto, il primo passaggio deve essere l’accoppiamento tra il legame della vitamina con delle variazioni nel sito di legame del nucleotide.

Nel caso di un “importo”, come per la vitamina B12, questo segnale deve essere trasmesso attraverso i domini transmembrana sino al sito di legame dell’ATP.

In un secondo passaggio, l’idrolisi dell’ATP deve essere accoppiata alla traslocazione del substrato.

Poiché sono le subunità di membrana a formare il gate, il ruolo della cassetta ABC è quello di modificare la conformazione del canale utilizzando l’energia liberata dall’idrolisi dell’ATP.

Se si confrontano strutturalmente la struttura del cristallo di Rad50cd, che rappresenta una cassetta ABC con ATP legato, con la struttura del dimero BtuD, che rappresenta una cassetta ABC senza nucleotide legato, emergono delle differenze strutturali che possono spiegare il meccanismo di apertura.

In Rad50, il Ploop ed il motivo firma sono più vicini di 4 Å rispetto a BtuD, indicando che il legame con ATP è causa di una chiusura delle subunità della cassetta ABC.

Poichè le subunità BtuD sono strettamente legate alle subunità di membrana BtuC, questo si tradurrebbe in una forza che, attraverso il loop L, apre il gate.

Il meccanismo funzionerebbe perché le subunità transmembrana sono impaccate tra loro è quindi la forza applicata si tradurrebbe in una deformazione della struttura , ma non in una dissociazione del complesso.

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PNAS (2002) 99,16642-16647

La maggior parte dei trasportatori ABC batterici sono deputati all’importo di nutrienti. Le molecole da trasportare sono legate in maniera specifica da proteine che le veicolano sul complesso ABC e innescano il ciclo di traslocazione del trasportatore.

La proteina trasportatrice resta legata sul complesso ABC finchè uno o entrambi i prodotti di idrolisi dell’ATP non sono stati rilasciati, impedendo al substrato di permeare dal lato “sbagliato” della membrana.

Analizziamo la proteina BtuF, che trasporta la vitamina B12 sul complesso ABC BtuCD.

BtuF è formata da due domini, in cui un foglietto centrale formato da cinque filamenti è circondato da alfa eliche.

I due domini sono uniti da un segmento ad alfa elica (indicato dall’asterisco).

Una singola molecola di vitamina B12 è legata in un profondo solco tra i due domini.

Sei residui aromatici, tre per ciascun dominio, contattano la B12 nel sito di legame.

Di questi, Trp66 e Trp85 sono posti ai lati del gruppo benzimidazolico della B12.

Nel fondo del sito di legame c’è una rete di legami a idrogeno che coinvolge molecole di acqua, B12 e residui della proteina.

Ci sono anche legami a idrogeno diretti tra gruppi laterali della B12 e l’azoto di Ala32, la catena laterale di Asp242 e la catena laterale di Arg246.

Il legame di BtuF con il trasportatore ABC BtuCD è stato dimostrato in vitro, mescolando un eccesso di proteina BtuF a BtuCD in presenza di vitamina B12 e sottoponendo a gel filtrazione la soluzione

Il primo profilo di eluizione è riferito al solo trasportatore di membrana BtuCD. Il corrispondente SDS page evidenzia che BtuC forma due bande, una del monomero e una del dimero, indicando la forte interazione che tiene unita la struttura transmembrana del trasportatore ABC.

Il secondo profilo si riferisce a BtuF da solo. Il picco è ritardato rispetto a BtuCD.

Il terzo profilo di eluizione si riferisce alla mix. Sono presenti due picchi, uno “pesante” che contiene tutti gli elementi del complesso BtuCD/BtuF e uno che contiene l’eccesso di BtuF non legato.

Modello di interazione tra BtuF e BtuCD

L’interazione tra due residui di glutamato (72 e 202) presenti nei due domini di BtuF con due zone di carica opposta in BtuCD (Arg56 e 59 sull’elica due e Arg295 sull’elica 9 di BtuC) posiziona la vitamina B12 in asse con il canale di conduzione del trasportatore ABC. Le sequenze di proteine leganti B12 e trasportatori ABC mostrano conservazione di questi residui.

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Nature (2006) 443,180-185

Analizziamo adesso la struttura di Sav1866, un trasportatore ABC di Staphylococcus aureus responsabile dell’estrusione di antibiotici.

Come abbiamo visto, l’architettura generale dei trasportatori batterici è formata da due subunità transmembrana che formano il canale di permeazione, e due subunità citoplasmatiche che idrolizzano ATP.

Le proteine batteriche che conferiscono multi-resistenza ai farmaci vengono invece espresse come “semi-trasportatori” in cui una subunità transmembrana è fusa con una subunità legante ATP.

Il trasportatore completo viene formato dall’unione di due “semi-trasportatori”; si tratta quindi di un omodimero.

Sav1866 mostra omologia di sequenza con trasportatori ABC umani responsabili della resistenza delle cellule cancerose ai chemioterapici.

La struttura è formata dalle due subunità, i cui domini transmembrana (TMDs) e leganti nucleotidi (NBDs) sono in forte interazione.

Ogni subunità ha quindi un dominio di membrana (TMD) formato da sei eliche e un dominio che lega nucleotidi (NBDs) che è la cassetta ABC. I due domini sono legati da un polipeptide che esce dalla elica sei della regione TMD.

I due domini NBD delle due subunità sono strutturalmente simili a quelli degli altri trasportatori ABC.

Questi domini NBD espongono all’interfaccia le sequenze responsabili del legame e dell’idrolisi dell’ATP organizzate nella disposizione testa-coda tipica delle cassette ABC.

La caratteristica delle cassette ABC è la presenza di due siti in cui avviene l’idrolisi dell’ATP formati dal P loop di una subunità e il motivo firma dell’altra.

Nel cristallo di Sav1866 sono presenti due molecole di ADP, legate dai P loop e dai motivi firma delle subunità opposte.

La sovrapposizione strutturale del sito legante nucleotidi tra Sav1866 e un trasportatore ABC di un archeabatterio cristallizzato in presenza di ATP (MJ0796) mostra che le conformazioni delle sequenze coinvolte sono molto simili.

Al contrario, la sovrapposizione con il trasportatore di vitamina B12 BtuCD evidenzia un sostanziale allontanamento dei due motivi in assenza di nucleotidi legati.

Ogni dominio TMD attraversa con sei eliche la membrana; in questo modo la regione transmembrana è formata da dodici eliche, in accordo con la topologia di un trasportatore ABC canonico.

Circa a metà del doppio strato lipidico, il fascio di eliche diverge in due “ali”.

Piuttosto che rappresentare un singolo dominio TMD, ciascuna delle ali è formata dalle eliche 1-2 di una subunità e le eliche 3-6 dell’altra.

I segmenti transmembrana sono connessi da loop extracellulari (ECLs) corti e da lunghi loop intracellulari (ICLs) che sono strutturati ad alfa elica e prolungano le eliche transmembrana di circa 25 Å nel citoplasma.

Interfaccia di trasmissione

I cambiamenti conformazionali generati dal legame e dall’idrolisi dell’ATP sono trasmessi dai domini NBD ai domini TMD attraverso interazioni non covalenti nella regione di interfaccia.

I domini TMD di Sav1866 contribuiscono a questa interfaccia principalmente tramite due loop, ICL2 e ICL1.

Entambi i loop contengono delle eliche corte (indicate come coupling helix) orientate parallelamente alla membrana, che sono responsabili dei contatti con i domini NBD.

E’ interessante notare che le coupling helix contattano principalmente il dominio NBD della subunità opposta.

Ritornando un attimo indietro, nel trasportatore (un “importatore”) della vitamina B12 BtuCD, i domini transmembrana contattano solo un dominio legante ATP, formando una larga cavità citoplasmatica.

L’architettura dei loop ICL e delle coupling helix è probabilmente conservata tra gli esportatori ABC, come suggerito dalla significativa similarità di sequenza nelle regioni corrispondenti.

I domini NBD contattano i domini TMD principalmente attraverso il Qloop, come osservato nell’importatore BtuCD.

Ci sono due importanti eccezioni date dai residui conservati Tyr391 e Glu473.

Glu473 è particolarmente interessante, in quanto interagisce con entrambi i loop ICL1 e ICL2 e fa parte di una sequenza conservata nei soli esportatori ABC chiamata X-loop.

Poiché l’X-loop precede il motivo firma, probabilmente risponde al legame e all’idrolisi dell’ATP e trasmette il cambiamento conformazionale agli ICL.

La mancanza della sequenza X-loop negli importatori batterici ABC dipendenti da binding protein (come il sistema BtuCD-BtuF) suggerisce che esistano meccanismi di accoppiamento diversi tra importatori ed esportatori ABC.

Una larga cavità è presente tra i due domini transmembrana.

Vie di traslocazione del substrato

Nonostante sia spostata verso il citoplasma, la cavità è accessibile dal lato extracellulare.

La presenza di cariche sui residui che ne compongono la superficie indicano che la cavità rappresenta un percorso di uscita più che un sito di legame per molecole idrofobiche.

Meccanismo di trasporto

Il meccanismo di trasporto più semplice implica due stati: una conformazione aperta verso il citoplasma con il sito di legame per il substrato esposto verso l’interno della cellula, e una conformazione con una tasca di estrusione aperta verso il periplasma.

La struttura di Sav1866 indica che lo stato di forte interazione dei domini leganti nucleotidi è accoppiato alla conformazione aperta verso il periplasma.

In questa conformazione, i substrati legati possono spostarsi verso il lato periplasmatico della membrana o entrare nella fase acquosa esterna, a seconda della loro idrofobicità.

L’idrolisi dell’ATP dovrebbe riportare il trasportatore nello stato aperto verso il citoplasma.

La quantità di ATP richiesta e il numero di molecole estruse per ogni ciclo sembrano dipendere dalle dimensioni del substrato.

L’architettura dell’interfaccia tra i domini di membrana e la cassetta ABC di Sav1866 impone un modello diverso da quanto generalmente proposto (a) per i trasportatori ABC.

Le due subunità di Sav1866 interagiscono in maniera intricata, con il dominio legante nucleotidi in interazione con il dominio transmembrana (attraverso i loop ICL) della subunità opposta (b).

In più, ogni ala della regione transmembrana è formata da eliche appartenenti ad entrambe le subunità.

E’ difficile immaginare che le due subunità possano associarsi e dissociarsi come proposto in alcuni modelli di funzionamento del trasportatore.

Science (2009) 323,1718-1722

La glicoproteina P (chiamata anche MDR1 o ABCB1) detossifica le cellule esportando centinaia di tossine diverse.

Data la sua azione, è implicata nei fenomeni di multiresistenza ai farmaci chemioterapici (multidrug resistance, abbreviata MDR).

Recentemente è stata cristallizzata la glicoproteina P (P-gp) di topo, che ha una identità di sequenza dell’87% con la proteina umana.

P-gp è costituita da un unico peptide in cui sono presenti i due domini TMD (ognuno contribuisce con sei eliche transmembrana) e i due domini NBD.

La struttura presenta un conformazione aperta verso il citoplasma, organizzata in due metà simmetriche.

I domini NBD sono distanti circa 30 Å.

Nelle figure a fianco è presentata la struttura vista dai due lati. Nella regione transmembrana, due aperture permettono l’ingresso di molecole idrofobiche direttamente dalla fase di membrana.

Nella regione idrofobica, la cavità ha un volume di circa 6000 Å3 e può contenere almeno due composti simultaneamente.

Su 73 residui accessibili nella cavità, 15 sono polari e solamente due potenzialmente carichi.

P-gp distingue tra differenti stereoisomeri dell’inibitore QZ59.

QZ59-SSSQZ59-RRRP-gp è stata cristallizzata in presenza di queste due forme di inibitore. Come possiamo vedere, una forma si lega in stechiometria 1:1 con la proteina (QZ59-RRR), mentre dell’altra forma (QZ59-SSS) vengono legate due molecole per proteina.

Questi co-cristalli indicano che la conformazione aperta verso il citoplasma è competente per il legame al substrato.

E’ interessante notare che la co-cristallizzazione con QZ59 è stata possibile solo immettendo l’inibitore fin dall’inizio, mentre molecole più piccole possono entrare nella cavità anche quando il cristallo è già formato.

E’ quindi possibile che in membrana la cavità possa essere ancora più grande.

P-gp è anche una “flippasi” che muove in maniera unidirezionale i lipidi dallo strato interno allo strato esterno della membrana.

P-gp, attraverso le aperture nella porzione idrofobica del foglietto interno, potrebbe scansionare questa zona del doppio strato e selezionare l’ingresso nella cavità di alcuni lipidi e molecole idrofobiche.

La conformazione presente in questi cristalli rappresenterebbe P-gp in uno stato di pre-trasporto.

Durante il ciclo catalitico, il legame dell’ATP, stimolato dalla presenza di substrati nella cavità, indurrebbe l’avvicinamento dei domini NBD.

Il cambiamento strutturale porterebbe all’apertura verso il lato extracellulare.