Genomi 8

The Minimal Genome

The Minimal Genome project In a 1999 study among M. genitalium and Mycoplasma pneumoniae, the Craig Venter team mapped around 2,200 transposon insertion sites and identified 130 putative non-essentials genes in M. genitalium protein coding genes or M. pneumoniae orthologs of M. genitalium genes. In their experiment they grew a set of Tn4001 transformed cells for many weeks and isolated the genomic DNA from these mixture of mutants. Amplicons were sequenced to detect the transposon insertion sites in mycoplasma genomes. Genes that contained the transposon insertions were hypothetical proteins or proteins considered non-essential. Meanwhile, during this process some of the disruptive genes that at first were considered non-essential, after more analyses turned out be essential. The reason for this error could have been due to genes being tolerant to the transposon insertions and thus not being disrupted; cells may have contained two copies of the same gene; or gene product was supplied by more than one cell in those mixed pools of mutants. Insertion of transposon in a gene meant it was disturbed, hence non-essential, but because they did not confirm the absence of gene products they mistook all disruptive genes as non-essential genes. The same study of 1999 was later expanded and the updated results were then published in 2005. Some of the disruptive genes though to be essential were isoleucyl and tyrosyl-tRNA synthetases (MG345 and MG455), DNA replication gene dnaA (MG469), and DNA polymerase III subunit a (MG261). The way they improved this study was by isolating and characterizing M. genitalium Tn4001 insertions in each colony one by one. The individual analyses of each colony showed more results and estimates of essential genes necessary for life. The key improvement they made in this study was isolating and characterizing individual transposon mutants. Previously, they isolated many colonies containing a mixture of mutants. The filter cloning approach helped in separating the mixtures of mutants. Now, they claim completely different sets of non-essential genes. The 130 non-essential genes claimed at first have now reduced to 67. Of the remaining 63 genes 26 genes were only disrupted in M. pneumoniae which means that some M. genitalium orthologs of non-essential M. pneumoniae genes were actually essential. They have now fully identified almost all of the non-essential genes in M. genitalium, the number of gene disruptions based on colonies analyzed reached a plateau as function and they claim a total of 100 non-essential genes out of the 482 protein coding genes in M. genitalium The ultimate result of this project has now come down to constructing a synthetic organism, Mycoplasma laboratorium based on the 387 protein coding region and 43 structural RNA genes found in M. genitalium

1. Determinazione del genoma minimale

Mycoplasma genitalium with 517 genes (480 protein-coding genes plus 37 genes for RNA species) has the smallest gene complement of any independently replicating cell so far identified. Global transposon mutagenesis was used to identify nonessential genes in an effort to learn whether the naturally occurring gene complement is a true minimal genome under laboratory growth conditions. The positions of 2209 transposon insertions in the completely sequenced genomes of M. genitalium and its close relative M. pneumoniae were determined by sequencing across the junction of the transposon and the genomic DNA. These junctions defined 1354 distinct sites of insertion that were not lethal. The analysis suggests that 265 to 350 of the 480 protein-coding genes of M. genitalium are essential under laboratory growth conditions, including about 100 genes of unknown function.

Global Transposon Mutagenesis and a Minimal Mycoplasma Genome (1999)

I geni essenziali sono conservati filogeneticamente

Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium

1996: Sequenziati i genomi di Haemophilus influenzae e Mycoplasma genitalium, molto diversi tra loro, e prima proposta di genoma minimo teorico di 256 geni, basato sul confronto dei geni ortologhi presenti in entrambi i microrganismi (geni essenziali devono essere conservati).

Mycoplasma genitalium:

580 kb (517 geni) 480 geni codificanti proteine 37 geni codificanti per RNA considerato il più piccolo genoma cellulare

Mycoplasma pneumoniae:

816 kb (236 kb in più di M. genitalium) possiede i geni ortologhi di tutti i 480 geni di M.

genitalium + 197 geni addizionali

Le proteine codificate dai geni ortologhi hanno un’ omologia soltanto del 65%: distanza evolutiva elevata

ENTRAMBI COMPLETAMENTE SEQUENZIATI M pneumoniae è il parente più vicino a M genitalium

Microorganismi utilizzati per determinare il genoma minimale

• The smallest known cellular genome is that of Mycoplasma genitalium, which is only 580 kb. This genome has been completely sequenced, and analysis of the sequence revealed 480 protein-coding genes plus 37 genes for RNA species.

• Mycoplasma pneumoniae is the closest known relative of M. genitalium, with a genome size of 816 kb, 236 kb larger than that of M. genitalium

Comparison of the two genomes indicates that M. pneumoniae includes orthologs of virtually every one of the 480 M. genitalium protein-coding genes, plus an additional 197 genes. There is a substantial evolutionary distance between orthologous genes in the two species, which share an average of only 65% amino acid sequence identity.

Microorganismi utilizzati per determinare il genoma minimale

“The existence of these two species with overlapping gene content provided an experimental paradigm to test whether the 480 protein-coding genes shared between the species were already close to a minimal gene set. We applied transposon mutagenesis to these completely sequenced genomes, which permitted precise localization of insertion sites with respect to each of the coding sequences.”

Come determinare se un gene é essenziale?

Si inattivano i geni tramite mutagenesi traspositiva

(transposon mutagenesis)

Se il batterio trasformato cresce in coltura il gene non è

considerato essenziale (anche se potrebbe esserlo -> famiglie geniche) I geni nei quali non si riscontra inserzione sono considerati

essenziali

Transposon mutagenesis

Trasposone Tn4001 all’interno del plasmide di E. coli plSM2062

Trasformazione tramite elettroporazione in M. genitalium e M. pneumoniae

Il plasmide contiene la resistenza alla gentamicina -> in terreno con antibiotico crescono solo i batteri che hanno inglobato il plasmide e di conseguenza il trasposone

Estrazione del DNA, digestione, circolarizzazione, IPCR, digestione, clonaggio in pUC18, creazione di una libreria di giunzioni tra trasposone e DNA genomico

Sequenziamento

Identificazione della regione dove si è inserito il trasposone

Analisi di 2209 inserzioni ha rivelato 1354 siti di inserzione diversi, equalmente suddivisi fra I due microrganismi. Preferenza di inserzione in sequenze non codificanti (71% M. genitalium e 61% in M. pneumoniae). This represents a substantial preference for intergenic insertion because coding sequence

constitutes 85% of the M. genitalium genome and 89% of the M. pneumoniae genome, and is consistent with the idea that intergenic sequences are less critical than protein-coding regions for viability

Inserzioni in 140 geni in M. genitalium e 179 geni in M. pneumoniae

Inserzioni in M. pneumoniae soprattutto all’interno di geni specie-specifici. This result supports our

assumption that the M. pneumoniae–specific portion of the genome is fully dispensable

Consistente assenza di inserzioni in regioni considerate a priori essenziali. The conspicuous absence of

transposon insertions into certain regions expected to be essential - for example, the region containing a cluster of ribosomal genes - provides additional support for the validity of transposon mutagenesis as an assay for dispensability

Risultato della mutagenesi traspositiva

Inserzioni all’estremità 3’ possono rimuovere solo un terminale COOH non essenziale

Inserzioni all’estremità 5’ non sempre distruggono la funzione genica

Un’inserzione è considerata distruttiva se avviene entro l’80% della sequenza dall’estremità 5’, ma a valle del nono nucleotide della regione codificante la proteina. This criterion eliminates events in which the 5’

end of the gene may actually be intact because of duplication of a short sequence at the target site. Similarly, an insertion near the 5’ end of a gene may not always destroy gene function. Transposon Tn4001 contains an outward-directed promoter that could drive transcription of flanking chromosomal DNA, leading to translation if an internal start site is located nearby downstream

Quando considerare distruttiva un'inserzione:

Quindi i geni con inserzioni distruttive sono:

66% di M. genitalium

84% di M. pneumoniae

La differenza è da attribuirsi alla più alta proporzione di geni non-essenziali di M.pneumoniae

The majority of M. genitalium orthologs that have disruptive insertions are absent from the third fully sequenced mycoplasma genome, Ureaplasma urealyticum, consistent with the idea that they are not essential.

Dopo aver stabilito che i geni M. pneumoniae specifici non sono indispensabili, si è cercato di trovare il numero dei geni essenziali all’interno degli ortologhi

Dei 480 geni ortologhi, che M. genitalium e M. pneumoniae hanno in comune, sono stati trovati 129 geni con inserzione

non sono essenziali per la vita in laboratorio

We have also estimated the number of nonessential genes to be between 180 to 215 under the assumption that the number of sites hit per gene follows a Poisson distribution. These larger estimates fit reasonably with the observed proportion of orthologs hit in both species. Therefore, on the basis of our highest and lowest estimates for nonessential genes, we estimate that the number of essential mycoplasma protein-coding genes is between 265 and 350.

TEORICAMENTE:

480 (ortologhi) – 180/215 (geni non indispensabili)

265-350 GENI ESSENZIALI

SPERIMENTALMENTE:

480 (ortologhi) – 129 (geni non indispensabili)

351 GENI ESSENZIALI

The 351 M. genitalium orthologs for which we have not yet identified a disruptive insertion constitute a first approximation to the true set of essential mycoplasma genes. From our estimate, we predict that at least 3/4 of the 351 undisrupted genes are essential. We also expect that most undisrupted genes within each functional class represent essential genes. Examination of the gene disruption data, organized by functional role, reveals that all functional classes of genes are not equally mutable under the selective growth conditions used in this study, which suggests that the genes are closer to a minimal set for some cellular functions than for others

Pathway essenziali

Nessuna inserzione ritrovata in:

Geni della glicolisi (10 geni)

Geni delle pompe protoniche (8 geni)

Si è visto che:

sono essenziali anche 111 geni di qui non si conosce la funzione (unknown), che andranno caratterizzati in futuro

geni che si ipotizzavano essenziali come le lipoproteine non lo

sono esse servono per l’infezione della cellula ospite, quindi sono essenziali per la vita in natura, ma non per quella in laboratorio

Trasportatori ABC trasportano molecole all’interno della cellula sfruttando l’idrolisi di ATP

3 subunità: ATP-binding Permeasi Ligand-binding

ATP-binding sono le più rappresentate nel genoma ma alcune sembrano essere “orfane” dato che le altre due subunità sono meno numerose

I rompicapo

The fact that only 25% of the ATP-binding subunits in our data set tolerate insertions suggests that at least some of these orphan subunits do serve an essential function within the cell -> Analysis of the M. genitalium genomic sequence data with less stringent searching parameters aimed at finding partners of the orphan specificity subunits, led to the identification of potential transport partners

Trasportatore del fosfato è fondamentale per la vita

Delle 3 subunità, 2 possono essere distrutte quindi non è essenziale...PERCHÉ?

This finding forces us to consider the possibility that some as yet undefined transport system exists in these mycoplasmas that can compensate for mutations in the putative phosphate transporter

Nei due genomi sono presenti due omologhi di DNA pol III oltre che a recA e uvrA

Sono presenti inserzioni in

uno dei due omologhi di DNA pol III

recA

uvrA

It is almost certain that cells bearing such gene disruptions in nature would be quickly selected against. Although it is difficult to address this idea quantitatively, it poses a relevant question for consideration when attempting to define a minimal gene set for cellular life.

Osservate alcune inserzioni (circa l’1% di tutte le inserzioni mappate) in geni ritenuti essenziali

l’annotazione di geni in base alla similarità di sequenza è sbagliata le inserzioni non hanno distrutto i geni (poco probabile)

i geni sono stati duplicati (some cells might contain a functional duplicate copy of a gene

in addition to the disrupted gene)

le cellule incorporano enzimi dal mezzo

cross-feeding (one strain shows superior growth on the limiting primary resource (glucose)

but degrades it only partially and excretes product (e.g., acetate) that is used as secondary substrate by another strain

Conclusive proof of the dispensability of any specific gene requires cloning and detailed characterization of a pure population carrying the disrupted gene.

Sebbene M. genitalium contenga il più piccolo numero di geni, molti di essi non sono essenziali per la vita in laboratorio

Dei 111 geni a funzione ignota ed essenziali molti sono Mycoplasma specifici

Conclusioni della mutagenesi traspositiva Preferenza di inserzione in sequenze non codificanti (71% M. genitalium e 61%

in M. pneumoniae), di conseguenza le sequenze intergeniche non sono necessarie per la vita in senso stretto

Inserzioni in 140 geni (M. genitalium) e 179 (M. pneumoniae)

Inserzioni in M. pneumoniae soprattutto all’interno di geni specie-specifici NON condivisi o con bassa % di identità, di conseguenza la porzione specifica

di M. pneumoniae non è indispensabile Consistente assenza di inserzioni in regioni considerate a priori essenziali, di

conseguenza si è visto che la mutagenesi traspositiva è un buon metodo di analisi dei geni essenziali (genoma minimo)

2. Determinazione del genoma minimale

Mycoplasma genitalium has the smallest genome of any organism that can be grown in pure culture. It has a minimal metabolism and little genomic redundancy. Consequently, its genome is expected to be a close approximation to the minimal set of genes needed to sustain bacterial life. Using global transposon mutagenesis, we isolated and characterized gene disruption mutants for 100 different nonessential protein-coding genes. None of the 43 RNA-coding genes were disrupted. Herein, we identify 382 of the 482 M. genitalium protein-coding genes as essential, plus five sets of disrupted genes that encode proteins with potentially redundant essential functions, such as phosphate transport. Genes encoding proteins of unknown function constitute 28% of the essential protein-coding genes set. Disruption of some genes accelerated M. genitalium growth.

Essential genes of a minimal bacterium (2006)

“In 1999 we reported the use of global transposon mutagenesis to experimentally determine the genes not essential for laboratory growth of M. genitalium In that report we identified 130 putatively nonessential M. genitalium protein-coding genes or M. pneumoniae orthologs of M. genitalium genes. We estimated that 265–350 of the protein-coding genes of M. Genitalium are essential under laboratory growth conditions. However, proof of gene dispensability requires isolation and characterization of pure clonal populations, which we did not do. We grew Tn4001- transformed cells in mixed pools for several weeks and then isolated genomic DNA from those mixtures of mutants. Herein, we report an expanded study in which we have isolated and characterized M. genitalium Tn4001 insertion mutants that were present in individual colonies picked from agar plates. From this analysis, we made a more thorough estimate of the number of genes essential for growth of this minimalist bacterium.”

To exclude the possibility that gene disruptions were the result of a transposon insertion in one copy of a duplicated gene, we used PCR to detect genes lacking the insertion. These PCRs showed us that almost all of the colonies contained both disrupted and WT versions of the genes identified as having the Tn4001. Further analysis using quantitative PCR showed that most colonies were mixtures of two or more mutants In total, we analyzed 3,321 M. genitalium transposon insertion mutant primary colonies and subcolonies to determine the locations of Tn4001tet inserts Of the successfully sequenced subcolonies, 59% revealed a transposon insertion at a different site from that in the parental primary colony We mapped a total of 2,462 different transposon insertion sites on the genome. 84% of the mutations were in protein-coding genes. No rRNA, tRNA, or structural RNA genes contained insertions.

To address our central question of which M. genitalium genes were not essential for growth in SP4 (a rich laboratory medium), we used the same criteria to designate a gene disruption as in our previous study. We considered transposon insertions disruptive if they were after the first three codons and before the 3-most 20% of the coding sequence of a gene. After subcloning, we were able to isolate gene disruption mutant colonies for 100 different disrupted M. genitalium genes 48 of the 100 disrupted genes were either hypothetical proteins or proteins of unknown function, and there was an absence of disruptions in genes and regions expected to be universally essential Several mutants manifested remarkable phenotypes. Although some of the mutants grew slowly, mutants in lactate malate dehydrogenase (MG460) and conserved hypothetical proteins MG414 and MG415 mutants had doubling times up to 20% faster than WT M. genitalium. Mutants in MG185, which encodes a putative lipoprotein, floated rather than adhering to plastic as do WT cells. Cells with transposon insertions in the transketolase gene (MG066), which encodes a membrane protein and pentose phosphate pathway enzyme, grew in chains of clumped cells rather than in the monolayers characteristic of WT M. genitalium

Of the successfully sequenced subcolonies, 59% revealed a transposon insertion at a different site from that in the parental primary colon. However, the rate of accumulation of new insertion sites dropped after our first 600 sequences from independent colonies, indicating that we were approaching saturation mutagenesis of all nonlethal insertion sites We believe that we have identified nearly all of the nonessential genes in M. genitalium because, as shown in Fig. 1, the number of new gene disruptions reached a plateau as a function of the number of colonies analyzed.

Mostly, we mutated the kinds of genes we expected to be nonessential: 48 of the 100 disrupted genes were either hypothetical proteins or proteins of unknown function, and there was an absence of disruptions in genes and regions expected to be universally essential. Still, many disrupted genes encoded proteins that one might think would be important because of the roles they play in metabolism or information storage and processing. None of the genes encoding the key enzymes of DNA replication were disrupted. However, we isolated mutants in other DNA metabolism genes that were expendable for the duration of our experiment, but might be necessary to maintain the M. genitalium genome over periods much longer than this experiment, like the genes involved in recombination and DNA repair.

Metabolic pathways and substrate transport mechanisms encoded by M. genitalium. Metabolic products are colored red, and mycoplasma proteins are black. White letters on black boxes mark nonessential functions or proteins based on our current gene disruption study. Question marks denote enzymes or transporters not identified that would be necessary to complete pathways, and those missing enzyme and transporter names are colored green. Transporters are colored according to their substrates: yellow, cations; green, anions and amino acids; orange, carbohydrates; purple, multidrug and metabolic end product efflux. The arrows indicate the predicted direction of substrate transport. The ABC type transporters are drawn as follows: rectangle, substrate-binding protein; diamonds, membrane-spanning permeases; circles, ATP-binding subunits.

Under our laboratory conditions, we identified 100 nonessential genes. Logically, the remaining 382 M. genitalium proteincoding genes, 3 phosphate transporter genes, and 43 RNAcoding genes presumably constitute the set of genes essential for growth of this minimal cell Accordingly, these families’ functions may be essential, and we expanded our projection of the set of essential genes to 387 to include them. This is a significantly greater number of essential genes than the 265–350 predicted in our previous study of M. genitalium These data suggest that a genome constructed to encode 387 protein-coding and 43 structural RNA genes could sustain a viable synthetic cell, a Mycoplasma laboratorium

3. TRASFERIMENTO DI UN GENOMA COMPLETO DA UNA SPECIE BATTERICA AD UN’ALTRA

Genome Transplantation in Bacteria: Changing One Species to Another

As a step toward propagation of synthetic genomes, the genome of a bacterial cell was completely replaced with one from another species by transplanting a whole genome as naked DNA. Intact genomic DNA from Mycoplasma mycoides, virtually free of protein, was transplanted into Mycoplasma capricolum cells by polyethylene glycol–mediated transformation. Cells selected for tetracycline resistance, carried by the M. mycoides chromosome, contain the complete donor genome and are free of detectable recipient genomic sequences. These cells that result from genome transplantation are phenotypically identical to the M. mycoides LC donor strain as judged by several criteria.

un intero genoma batterico da una specie è “trapiantato” (trasformazione PEG mediata) in un'altra specie batterica

il ricevente mostra genotipo e fenotipo del donatore

il ricevente perde il proprio genoma

non c'è ricombinazione tra i cromosomi in entrata e in uscita

cambio di una specie batterica in un'altra

“GENOME TRANSPLANTATION”

1994: Osvald Avery scopre che il DNA nudo può essere incorporato da P. pneumoniae 2005: Itaya et al. primo trasferimento di un genoma quasi completo da Synechocystis PCC6803 a Bacillus subtilis, ma riscontrati diversi problemi a livello di silenziamento genico 2007: R. A. Holt et al. trasferiscono un intero genoma da

Haemophilus influenzae a Escherichia coli con l’utilizzo di BAC. Sono stati riscontrati problemi di incompatibilità tra i due

genomi.

Premesse

Perché é stato scelto il Mycoplasma?

uso di UGA per codificare

triptofano (invece di un codone di stop)-> no proteine prodotte

in E. coli durante il clonaggio

piccoli genomi

la mancanza totale di una parete cellulare lo rende più simile ad una cellula eucariotica e rende più semplice l’inserimento di DNA presenta un accrescimento rapido

(divisione ogni 80-100 min)

Specie usate per il “trapianto”:

1. Mycoplasma mycoides sottospecie mycoides LC (large colony) ceppo GM12

come cellule donatrici. Presenta resistenza alla tetraciclina e il gene lac-Z

2. Mycoplasma capricolum sottospecie capricolum, ceppo California kid come

cellule riceventi

I genomi dei due microrganismi sono stati sequenziati e comparati:

91.5% identità nucleotidica

We found that 76.4% of the 1,083,241-bp draft sequence of the M. mycoides LC genome could be mapped to the 1,010,023-bp M. capricolum genome, and this content matched on average at 91.5% nucleotide identity. The remaining ~24% of the M. mycoides LC genome contains a large number of insertion sequences not found in M. capricolum.

Tre fasi principali del “trapianto”:

Plasmidi di M. mycoides LC con origine del complesso di replicazione (ORC)

2. Preparazione delle cellule riceventi di M. capricolum 3. Inserimento del genoma isolato nelle cellule riceventi

1. Isolamento del genoma intatto del donatore da M. mycoides LC

M. mycoides

M. capricolum

Plasmidi di M. capricolum LC con origine del complesso di replicazione (ORC)

We chose our donor and recipient cells for genome transplantation on the basis of our observation that plasmids containing a M. mycoides LC origin of replication complex (ORC) can be established in M. capricolum, whereas plasmids with an M. capricolum ORC cannot be established in M. mycoides LC

Preparazione delle cellule donatrici: M. mycoides

1. Ridurre al massimo le manipolazioni del genoma per non romperlo

Cellule messe in blocchi di agarosio, trattate con detergenti ed enzimi proteolitici per ottenere DNA purificato

2. Inserimento delle cellule nei plug di agarosio

Interessa avere DNA circolare: usata elettroforesi a campo pulsato (PFGE) per separare il DNA circolare (intrappolato nel plug) da quello danneggiato (lineare). Circular DNA is indeed trapped into the agarose. Cirlces become hooked on

threads of agarose fibers and become frozen in their forward motion.

Ulteriori prove per confermare di avere solo DNA circolare: trattamento con nucleasi analisi dei plug (verifica della purezza del DNA) spettrometria di massa (verifica della purezza del DNA)

3. Liberazione del DNA dai plug

Trasfrormazione di M. capricolum

1. Trattamento delle cellule di M. capricolum con PEG per la trasformazione in presenza del genoma di M. mycoides,

3. Recupero della cellule e semina su piastre contenenti tetraciclina e X-gal. (il batterio donatore ha il gene di resistenza all’antibiotico e il gene lac-Z)

Cosa ci si aspetta???

Dato che il genoma donatore possiede i geni per la resistenza alla tetraciclina e l’operone lac, la cellula ricevente, che ha assunto il genoma donatore, possiede resistenza all’antibiotico e assume colorazione blu in presenza di X-gal

Cosa si é osservato?

Si sono osservate colonie resistenti all’antibiotico e blu in un primo tempo, successivamente si è notata la comparsa di

piccole colonie bianche

Si pensa che per un breve periodo di tempo la cellula mantiene entrambi i genomi, perché quello del ricevente non è stato tolto: le colonie resistenti e bianche devono derivare da ricombinazione

The plates were incubated at 37°C until large blue colonies, putatively M. mycoides LC, formed after ~3 days. Sometimes, after ~10 days smaller M. capricolum colonies, both blue and white, were visible. Thus, all of these colonies were tetracycline-resistant, as evidenced by their surviving the antibiotic selection, and only some expressed b-galactosidase. These colonies might be the result of recombination. We observed that these colonies appeared after almost twice as many days as it took for the transplants to become visible The blue, tetracycline-resistant colonies resulting from M. mycoides LC genome transplantation were to be expected if the genome was successfully transplanted. However, colonies with that phenotype could also result from recombination of a fragment of M. mycoides LC genomic DNA containing the tetM and lacZ genes into the M. capricolum genome. To rule out recombination, we examined the phenotype and genotype of the transplanted clones.

Analisi genotipiche

PCR con primer specie-specifici I risultati non escludono che la ricombinazione non avvenga

Analisi SOUTHERN BLOT di donatore, ricevente e “trapiantati”

Il 54% dei trapiantati hanno profilo identico al wild-type

SEQUENZIAMENTO di un campione delle librerie genomiche totali di uno dei due cloni “trapiantati”

Analisi di 1300 reads di ciascun clone

(2), e tutte si appaiono con la sequenza di M. mycoides

Le analisi genotipiche hanno confermato il corretto inserimento del genoma del donatore nel ricevente, ma lasciano aperta l’ipotesi di una possibile ricombinazione tra i due genomi

Analisi fenotipica

COLONY WESTERN BLOT su donatore e ricevente e quattro diversi cloni “trapiantati” utilizzando degli anticorpi specifici per gli antigeni di superficie di M. capricolum e successivamente per M. mycoides

Nei blot dei “trapiantati” l’anticorpo specifico per l'antigene di superficie di M. mycoides ibrida con la stessa intensità che si osserva nel blot del wild-type. Invece l’anticorpo specifico per l' antigene di superficie di M. capricolum non ibrida nei blot dei “trapiantati”

E' stata effettuata un'analisi proteomica consistente in un' ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE su lisati cellulari (proteine).

Spot di M. capricolum MOLTO DIVERSI (più del 50%) dagli spot dei “trapiantati” Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dalle analisi MALDI-MS (spettrometria di massa a dessorbimento-ionizzazione laser assistito da matrice)

Spot di M. mycoides IDENTICI agli spot dei “trapiantati”

Questi dati hanno dimostrato che è possibile il “trapianto” di interi genomi da una specie ad un’altra. La progenie risultante è genotipicamente e fenotipicamente uguale al donatore

Si pensa che subito dopo il “trapianto” gli organismi portino entrambi i genomi

Negli esperimenti più efficienti, solo 1 cellula ricevente su ~ 150,000 è stata “trapiantata”; questa bassa efficienza non ha permesso di dimostrare un mosaicismo momentaneo.

Conclusioni del trapianto di un genoma batterico

Il “trapianto” di genoma funziona per le specie scelte

MA PER LE ALTRE SPECIE FUNZIONERA‘?

SONO FILOGENETICAMENTE MOLTO SIMILI

In assenza di trattamenti con detergenti o proteasi K, i nucleoidi delle cellule di M. mycoides LC non producono “trapiantati”.

Non è una trasformazione naturale del DNA

il “trapianto” del genoma in questione non richiede la ricombinazione

il DNA che si inserisce è circolare

non è stata identificata la presenza di geni di uptake per il DNA nel genoma di M. capricolum

“These data demonstrate the transplantation of whole genomes from one species to another such that the resulting progeny are the same species as the donor genome. However, they do not explain the mechanism of the transplant.”

Data l’improbabilità di un evento naturale come il libero fluttuare di genomi batterici, il “trapianto” di genoma potrebbe essere un

fenomeno solo da laboratorio

In ogni caso, E' STATA MESSA A PUNTO UNA FORMA DI TRASFERIMENTO DI DNA BATTERICO CHE PERMETTE ALLE CELLULE RICEVENTI DI FUNGERE DA PIATTAFORME PER LA

PRODUZIONE DI NUOVE SPECIE con l’uso di genomi naturali modificati o sintetici

4. SINTESI CHIMICA, ASSEMBLAGGIO E CLONAGGIO DI UN GENOMA

Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome

A 582,970–base pair Mycoplasma genitalium genome has been synthesized. This synthetic genome, named M. genitalium JCVI-1.0, contains all the genes of wild-type M. genitalium G37 except MG408, which was disrupted by an antibiotic marker to block pathogenicity and to allow for selection. To identify the genome as synthetic, “watermarks” were inserted at intergenic sites known to tolerate transposon insertions. Overlapping “cassettes” of 5 to 7 kilobases (kb), assembled from chemically synthesized oligonucleotides, were joined by in vitro recombination to produce intermediate assemblies of approximately 24 kb, 72 kb (“1/8 genome”), and 144 kb (“1/4 genome”), which were all cloned as bacterial artificial chromosomes in Escherichia coli. Most of these intermediate clones were sequenced, and clones of all four 1/4 genomes with the correct sequence were identified. The complete synthetic genome was assembled by transformation-associated recombination cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae, then isolated and sequenced. A clone with the correct sequence was identified.

Mycoplasma genitalium

batterio con il genoma più piccolo (580,076bp) 485 geni codificanti proteine di cui 100 non essenziali non si sa quali dei 100 sono non essenziali simultaneamente

We proposed that one approach to this question would be to produce reduced genomes by chemical synthesis and introduce them into cells to test their capacity to provide the essential genetic functions for life

“The largest previously published synthetic DNA that we are aware of is a 32-kb polyketide gene cluster»

Come costruire il genoma sintetico? 1. Divisione del genoma in 101 cassette di 5-7 Kb tramite:

sintesi sequenziamento ligazione

2. Inserimento di sequenze watermark nelle cassette 14-29-39-

55 e 61 → corte sequenze inserite in siti intergenici, utilizzate per distinguere il genoma sintetico da quello nativo

3. Inserimento di 2514 bp (resistenza aminoglicosilica) nella cassetta 89, all'interno gene MG408, allo scopo di perdere la patogenicità nei mammiferi

4. Dimensione del genoma sintetico ottenuto (JVCI-1.0) è di 582,970 bp, partendo da 580,076 bp (M. genitalium)

Le cassette:

Le cassette sono state sintetizzate dalla Blue Heron Technology ognuna contiene una o più geni completi ogni cassetta termina con una sequenza che si

sovrappone alla successiva per poterle assemblare la cassetta 101 si sovrappone alla 1 per formare una

struttura circolare

clonaggio in E. coli

clonaggio in S. cerevisiae

Fasi (5) di assemblaggio del genoma:

assemblaggio delle cassette in vitro e clonaggio in E. coli (A-B-C)

assemblaggio delle cassette in vivo e clonaggio in S. cerevisiae (D e E)

Le cassette sono state recuperate dai rispettivi plasmidi e sottoposte alle seguenti reazioni:

Assemblaggio in vitro e clonaggio in E. coli

In seguito a digestione con 3’-esonucleasi, le cassette espongono le estremità sovrapponibili Le estremità si appaiano formando una lunga molecola composta da 4 cassette

Il costrutto così ottenuto viene quindi riparato con Taq-polimerasi e Taq-ligasi

PCR amplification was used to produce a unique BAC vector for the cloning of each assembly, with terminal overlaps to the ends of the assembly. Each PCR primer includes an overlap with one end of the BAC, a Not I restriction site, and an overlap with one end of the cassette assembly.

Because the M. genitalium JCVI-1.0 genome does not contain a Not I site, all of the assemblies can be released intact from the BAC.

The 3′ ends of the mixture of duplex vector and cassette DNAs were then digested to expose the overlap regions using T4 polymerase in the absence of dNTPs. The annealed joints were repaired using Taq polymerase and Taq ligase

Dopo la replicazione in E. coli si recupera il frammento d'interesse mediante restrizione con NotI.

A questo punto, i BAC neo-sintetizzati vengono inseriti in E. coli per la moltiplicazione.

In questo modo sono state ottenute le 25 serie A

B-series assemblies were constructed from Not I–digested A-series clones C-series assemblies were constructed from Not I–digested B-series assemblies.

Dato che si sospettava l’instabilità di grandi assemblaggi in E. coli, è stato necessario passare in lievito utilizzando la tecnica TAR (Transformation Associated Ricombination), che si basa sulla ricombinazione omologa durante la co-trasformazione in sferoplasti di lievito.

Assemblaggio in vivo e clonaggio in S. cerevisiae

Il vettore TAR è costituito da: sequenza BAC sequenza YAC due 'ganci' alle due estremità che

subiscono una ricombinazione con le regioni omologhe del gene d’interesse circolarizzazione

All'interno del lievito riusciamo ad assemblare l'intero genoma

Estrazione del genoma sintetico di M.genitalium dal lievito e verifica della sua sequenza:

DNA totale isolato in agarosio

Taglio selettivo del cromosoma sintetico con NotI

Separazione del frammento sintetico tramite elettroforesi

Analisi CHEF

4.4

6.6

9.4

23.0 48.5 96.0

582.0

145.5

Sequenziamento del DNA del clone sMgTARBAC37 con copertura 7x

Kb

L’intero cromosoma di M. genitalium è stato progettato, sintetizzato, assemblato e clonato in lievito

Il costrutto è formato da 104 oligonucleotidi lunghi 50

basi ciascuno; fino ad ora è la più grande molecola sintetica a struttura nota ottenuta (582,970 bp)

L'efficacia della procedura in vitro è diminuita con

l'aumentare della dimensione degli assemblati, per cui l’assemblaggio dei frammenti più grandi va effettuato mediante ricombinazione in vivo

Conclusioni della sintesi chimica, assemblaggio e clonaggio di un genoma

We are currently using a TARBAC vector to propagate the synthetic chromosome in yeast. We do not know whether this vector might interfere with the production of viable cells by transplantation, nor do we know whether the genomic location of the vector could affect viability. It may be necessary to alter the vector sequences or even to excise the vector before transplantation.

In closing, we wonder whether use of the UGA codon to code for tryptophan in mycoplasmas, rather than for termination as in the “universal” code, contributed to our success in cloning the synthetic M. genitalium JCVI-1.0 genome. This may make cloning in E. coli and other organisms less toxic because most M. genitalium proteins will be truncated. If so, then it should be possible to synthesize other genome constructions using this same code. The genome would then need to be installed, for example, by transplantation, in a cytoplasm that can properly translate the UGA to tryptophan. To generalize on this phenomenon, it might be possible to use other codon changes as long as there is a receptive cytoplasm with appropriate codon usage.

5. Creazione di una cellula batterica controllata dal genoma sintetico

Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome

The 1.08 Mb Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genome has been designed, synthesised, and assembled starting from digitized genome sequence information Then, the JCVI-syn1.0 genome has been transplantated into a M. capricolum recipient cell to create new M. mycoides cells that are controlled only by the synthetic chromosome. The only DNA in the cells is the designed synthetic DNA sequence, including “watermark” sequences and other designed gene deletions and polymorphisms, and mutations acquired during the building process. The new cells have expected phenotypic properties and are capable of continuous self-replication.

Because M. genitalium has an extremely slow growth rate, we turned to two faster-growing mycoplasma species, M. mycoides subspecies capri (GM12) as donor, and M. capricolum subspecies capricolum (CK) as recipient.

Ostacoli iniziali

Metodo per estrarre il cromosoma intatto dal lievito richiede miglioramento capire se è possibile “trapiantare” il cromosoma estratto da lievito in una

cellula batterica verificare che la cellula batterica sia controllata esclusivamente dal genoma

sintetico

M. genitalium crescita troppo lenta

M. mycoides subspecies capri (donatore) crescita più veloce

M. capricolum subspecies capricolum (ricevente)

M. mycoides e M. capricolum possiedono il medesimo sistema di restrizione!

Nel lievito il genoma sintetico non è metilato mentre il sistema di restrizione presente nel ricevente richiede la metilazione

3 soluzioni proposte:

metilazione del DNA estratto da lievito (donatore) con metilasi purificate

metilazione del DNA estratto da lievito (donatore) con estratti crudi dalla specie di M. mycoides o M. capricolum

disattivazione del sistema di restrizione del ricevente

Sequenziamento di due ceppi di M. mycoides subspecies capri: CP001621 e CP001668 (le 2 sequenze differiscono per 95 siti ma sono state considerate entrambe affidabili) Disegno di “cassette” geniche sulla base della sequenza del ceppo

CP001668. Aggiunta di 4 watermarks per differenziare ulteriormente il genoma

sintetico dal naturale.

Fasi del processo

Cassette geniche di 1080 pb con 80 pb che si sovrappongono alla cassetta adiacente Sintesi di oligonucleotidi affidata

alla Blue Heron Inserzione di un sito di restrizione

Not I nelle cassette e negli intermedi di assemblaggio Assemblaggio gerarchico in 3

passaggi

Strategia di assemblaggio del genoma sintetico

I PASSAGGIO: ASSEMBLAGGIO DI INTERMEDI

SINTETICI DI 10 Kb

• For the first stage of assembly, a yeast/E. coli shuttle vector, termed pCC1BAC-LCYEAST, was produced

• Cassette e un vettore sono ricombinati in lievito (sovrapposizione cassette da 1Kb per formare quelle da 10 Kb)

• Trasferimento in E. coli

• Screening delle cellule e selezione dei cloni contenenti il DNA plasmidico In general, at least one 10-kb assembled

fragment could be obtained by screening 10 yeast clones

• Sequenziamento e selezione dei cloni che non

contengono errori per il passaggio successivo Nineteen out of 111 assemblies contained errors. Alternate clones were selected, sequence-verified, and moved on to the next assembly stage

II PASSAGGIO: ASSEMBLAGGIO DI INTERMEDI

SINTETICI DI 100 Kb

• Ricombinazione in lievito per dare intermedi di 100 Kb

• Estrazione del DNA ricombinante dal lievito

(no trasferimento in E.coli, perché non è stabile)

• Multiplex PCR (coppia di primer per ogni 10 Kb) per

verificare la presenza di tutti gli ampliconi = assemblaggio corretto. In general, 25% or more of the clones screened contained all of the amplicons expected for a complete assembly

• Dimensione corretta verificata su gel di

agarosio: a second stage assembly intermediate of the

correct size was usually produced. In some cases, however, small deletions occurred. In other instances,multiple 10-kb fragments were assembled, which produced a larger second-stage assembly intermediate

III PASSAGGIO: COMPLETO ASSEMBLAGGIO

DEL GENOMA

• Isolamento degli 11 frammenti circolari (100 Kb) da sferoplasti di lievito mediante lisi alcalina

• Le 11 cassette sono state assemblate in

lievito • Digestione di una piccola frazione degli

intermedi con Not I e purificazione attraverso FIGE

• PCR Multiplex a livello delle giunzioni per

verificare il corretto assemblaggio • Genoma di M. mycoides assemblato!!

In preparation for the final stage of assembly, it was necessary to isolate each of the 11 second-stage assemblies from yeast spheroplasts by an alkaline-lysis procedure. To further purify the 11 assembly intermediates, they were treated with exonuclease and passed through an anion-exchange column. A small fraction of the total plasmid DNA (1/100) was digested with Not I and analyzed by field-inversion gel electrophoresis (FIGE). The method above does not completely remove all of the linear yeast chromosomal DNA, which we found could substantially decrease the yeast transformation and assembly efficiency. To further enrich for the 11 circular assembly intermediates, ~200 ng samples of each assembly were pooled and mixed with molten agarose. As the agarose solidifies, the fibers thread through and topologically “trap” circular DNA. Untrapped linear DNA can then be separated out of the agarose plug by electrophoresis, thus enriching for the trapped circular molecules. The 11 circular assembly intermediates were digested with Not I so that the inserts could be released. Subsequently, the fragments were extracted from the agarose plug, analyzed by FIGE, and transformed into yeast spheroplasts . In this third and final stage of assembly, an additional vector sequence was not required because the yeast cloning elements were already present in assembly 811-900.

Il genoma sintetico di M. mycoides contenuto nel lievito YCp235 viene “trapiantato” nella cellula ricevente M.

capricolum (con sistema di restrizione inattivo)

Selezione delle colonie contenenti il genoma sintetico è fatta mediante crescita in terreno selettivo SP4 con tetraciclina e X-gal a 37˚C

“Trapianto” del genoma sintetico nella cellula ricevente

Sequenziamento Sequenziamento del genoma di M. mycoides JCVI-syn1.0 e

confronto con il genoma minimo disegnato

Diversità:

8 SNP

Trasposone omologo a quello di E. coli (ISI)

Duplicazione di 85bp

Assenza di sequenze di M. capricolum: completo rimpiazzo del genoma sintetico

The transposon insertion exactly matches the size and sequence of IS1, a transposon in E. coli. It is likely that IS1 infected the 10-kb subassembly following its transfer to E. coli. The IS1 insert is flanked by direct repeats of M. mycoides sequence, suggesting that it was inserted by a transposition mechanism. The 85-bp duplication is a result of a nonhomologous end joining event, which was not detected in our sequence analysis at the 10-kb stage. These two insertions disrupt two genes that are evidently nonessential.

Osservazione morfologica

Cellula sintetica in grado di replicarsi autonomamente con curva di

crescita logaritmica

Osservazione colonie (piastre con agar SP4 e X-gal) con microscopio

ottico

WT

M. mycoides JCVI-syn1.0

Ulteriori analisi:

Analisi proteomica, mediante elettroforesi

bidimensionale

Confrontati i profili di M. mycoides con genoma

sintetico e del ceppo wild-type

Risultato: i profili sono identici

Saggi di colorazione e tasso di crescita (confrontata la

velocità di crescita tra sintetico e wild-type)

presentano lievi differenze

Ottenere un genoma sintetico senza errori è una pratica molto complessa

Questo lavoro rappresenta la base per l’assemblaggio e la caratterizzazione di un genoma sintetico

Si sono apportate piccole modifiche alla sequenza di partenza,

ma nulla impedisce a lavori futuri, di apportare maggiori modifiche in base alle varie richieste biotecnologiche

Questo lavoro ha aperto una serie di discussioni di tipo etico

CONCLUSIONI

Com’è arrivata al mondo questa informazione??

La Repubblica GENETICA

Nasce la prima vita artificiale "Ecco la cellula in laboratorio" Su Science l'annuncio del gruppo guidato da Craig Venter: un batterio col Dna sintetico. "Può riprodursi". Obiettivo: creare nuovi farmaci e salvare il clima di ELENA DUSI

Corriere della Sera

Ecco l'inizio della «vita artificiale» Costruita la prima cellula Svolta epocale nella ricerca. È controllata da un Dna sintetico ed è in grado di dividersi e moltiplicarsi

The Economist Artificial lifeforms

Genesis redux A new form of life has been created in a laboratory, and the era of synthetic biology is dawning May 20th 2010