TRANSGENESISEl mejoramiento gentico se basa en la existencia de
variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y el
desarrollo de mtodos no sexuales para transferir genes. La
ingeniera gentica permite introducir en plantas genes provenientes
de otras especies vegetales muy alejadas e incluso de hongos,
virus, bacterias y animales. Se desea incorporar caractersticas
favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. Se busca
obtener plantas con resistencia a virus, insectos, hongos y
bacterias, tolerancia a herbicidas y a estreses abiticos y
modificacin de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. La
transformacin gentica tambin es til para conocer acerca de la
estructura y funcin de genes especficos.
1 Se identifica el gen (es lo ms difcil).2 Se selecciona el
vector que vehiculiza el fragmente de inters y permite su
amplificacin (autorreplicacin).3Se genera ADN recombinante: ADN a
clonar + vector, con ADN en forma pura ligados por ADN-ligasa.4
Introducir el ADN en recombinante. No todas incorporaron el vector,
se seleccionan usando marcadores.ETAPAS BSICAS DE CLONACIN DE
FRAGMENTOS DE ADNa) ADN a clonar y plsmido se cortan con la misma
enzima de restriccin.b) Se ponen en contacto en presencia de ligasa
para obtener ADN recombinante.c) Se introduce en bacterias que
multiplican el plsmido con el fragmento de inters.Requerimientos
para la obtencin de plantas transgnicas Se requiere un transgen
(secuencias regulatorias y codificante clonadas en un vector de
transformacin) y una metodologa de transferencia eficiente. Una vez
introducido el gen de inters se induce el desarrollo de plantas,
que se analizan para identificar aquellas que porten y expresen los
transgenes en los niveles deseados. Elementos bsicos que se
requieren: 1. Un sistema de cultivo de tejidos que permita
regenerar plantas completas y frtiles. 2. Vectores apropiados, que
permitan el clonado del gen de inters y/o su transferencia. 3. Un
protocolo de transformacin (sistema de transferencia de genes y de
seleccin del material transformado). 4. Herramientas de anlisis
para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo
en la planta. Cultivo de tejidos vegetales Los mtodos de
transformacin se basan en la obtencin de clulas transgnicas y
recuperacin de plantas completas y frtiles a travs del cultivo y
seleccin in vitro. Construccin del vector Para introducir un
transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en
un vector (por ejemplo un plsmido). Se corta el ADN extrado de un
organismo con enzimas de restriccin, que reconocen secuencias
especficas. Los fragmentos obtenidos son ligados enzimticamente a
vectores de clonado, obtenindose clones de ADN recombinante. Un
transgen est compuesto por una secuencia codificante (regin
comprendida entre los codones de iniciacin y terminacin de la
traduccin) y por secuencias regulatorias que determinan el tejido,
el momento del desarrollo y el nivel de expresin del transgen en la
planta. Los genes utilizados provienentes de bacterias usualmente
no pueden expresarse eficientemente en clulas eucariotas, por ello
se reemplazan las secuencias regulatorias bacterianas por otras
aptas para su expresin en clulas vegetales, la secuencia ms
importante es el promotor, donde se une la ARN-polimerasa para
iniciar la transcripcin. Los promotores son constitutivos, que
permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua,
los inducibles que responden a factores ambientales y los
especficos que permitirn la transcripcin en determinados rganos y
tejidos. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de
restriccin multiple (poli linker). El fragmento de ADN posee sitios
de restriccin para varias enzimas. Son: plsmidos, bacterifagos,
cosmidos, fasmidos o cromosomas artificiales.El nivel y patrn de
expresin del gen puede estar afectado por la posicin en el genoma,
debido a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas, a
la estructura de la cromatina, al patrn de metilacin, etc. La
solucin es dirigir la secuencia de inters a sitios especficos del
genoma vegetal, usando sistemas de recombinacin heterloga
sitio-especficos o mediante reemplazo gnico por recombinacin
homloga. PLASMIDOS: ADN circular (ms estable), doble cadena,
extracromosmico. Est presente en bacterias, son pequeos (fciles de
aislar y manipular). Poseen replicacin independiente al ADN de la
clula. Tiene mltiples copias y genes de resistencia utilizados como
marcadores.Mtodos de transformacin Transformacin mediada por
Agrobacterium Son bacterias Gram-negativas aerbicas obligadas que
viven en el suelo, son capaces de desarrollar un crecimiento
saproftico o parastico. Infectan una amplia variedad de especies de
dicotiledneas a travs de las heridas, atacando clulas individuales
y provocando su proliferacin. La capacidad patognica est asociada a
la presencia de megaplsmidos llamados Ti (inductor de tumores) o Ri
(inductor de races), presentes en algunas de las agrobacterias.
Durante la patognesis el fragmento T-DNA (transfer-DNA), es
transferido a la clula vegetal, donde se integra al ADN cromosmico
de la planta y su expresin causa proliferacin de clulas de la
planta a travs de la sntesis y alteracin de la respuesta a hormonas
vegetales. El T-DNA contiene genes que se expresan y producen
sntesis de hormonas vegetales (oncogenes responsables de la
proliferacin anormal del tejido) y genes que provocan la sntesis de
opinas (fuente de carbono y nitrgeno para la bacteria). La
integracin del T-DNA en el ADN cromosmico de la planta se produce
al azar, por recombinacin ilegtima, en regiones con actividad
transcripcional y con la participacin de protenas de la bacteria y
de la planta. Transformacin directa o por mtodos fsicos -
Transformacin de protoplastos: Se basa en el hecho de que la pared
celular es la principal barrera para la introduccin de ADN en las
clulas vegetales por lo que sta es temporariamente removida. Los
protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso
enzimtico que digiere la pared. Los protoplastos son transformados
utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o
liposomas, que permiten integracin del ADN forneo. Es la metodologa
ms sofisticada de cultivo in vitro de plantas, representa gran
complejidad experimental y est disponible slo para algunas
especies. - Bombardeo de micropartculas: Micropartculas cubiertas
con ADN son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en
clulas vegetales. La fuerza impulsora est dada por el sistema de
helio comprimido, se utilizan microproyectiles de oro o tungsteno
(qumicamente inertes), que al ser disparados a grandes velocidades
pueden atravesar pared y membranas de la clula vegetal bombardeada
sin causarle daos letales. El explante es sometido a un tratamiento
osmtico pre y pos bombardeo, que produce plasmlisis celular,
evitando que el impacto y la penetracin de las partculas daen las
clulas. Desventajas: Algunas especies oponen resistencia a la
penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes
celulares lignificadas o superficies vellosas. Bajo nmero de
transformantes producido por un solo episodio de bombardeo. La
biolstica es la mejor opcin en soja, sorgo, papaya, esprrago, caa
de azcar y trigo. Transformacin directa vs. indirecta
A. tumefaciens posee un mecanismo natural muy eficiente para
transferir, al ncleo celular, el T-DNA que contiene el transgen y
producir una integracin aleatoria en regiones cromosmicas con
actividad transcripcional. Los patrones de insercin de transgenes
son ms sencillos en comparacin a los producidos por el mtodo
biolstico. El nmero de copias que se incorpora es bajo y cuando hay
ms de una copia, suelen distribuirse en loci independientes, lo que
facilita la posterior eliminacin de las copias no deseadas por
segregacin. El T-DNA est acompaado de protenas que lo protegen de
la accin de nucleasas. En el mtodo biolstico el ADN transferido no
est asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado,
slo parte del mismo llega al ncleo. Cuando se utiliza el mtodo
biolstico, el segmento de ADN plasmdico que se integra al ADN
cromosmico no est definido, como en el caso de T-DNA, sino que es
de longitud variable. La construccin de vectores es mucho ms
sencilla en el caso del mtodo biolstico. En ambos mtodos la
integracin del transgen en el genoma se produce al azar. La
aplicacin de cualquiera de estos mtodos depende de la
disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in
vitro. En A. tumefaciens, debido a que se trata de una interaccin
biolgica entre una planta y una bacteria, la dependencia del
genotipo es mucho ms acentuada, ya que influyen ambos genotipos.
Genes de seleccin e informadores El gen marcador codifica para una
protena que confiere resistencia a agentes fitotxicos como
antibiticos o herbicidas, las clulas que lo expresen podrn crecer y
desarrollarse en medio de cultivo que contenga estos agentes
selectivos. Los genes marcadores visualizables o informadores
posibilitan la observacin directa de las clulas que los expresan.
Codifican para protenas que no estn presentes en las clulas
vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida
observacin.Tcnicas de deteccin del transgen y sus productosLuego de
la seleccin in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas
para identificar aquellas que porten y expresen los transgenes en
los niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como: - Reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR): con el uso de primers homlogos a
la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del
mismo. Un resultado positivo indica solamente que en la muestra
existe una secuencia que amplifica con los primers utilizados pero
no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la
planta. - Hibridacin southern o Southern blotting: Indica la
presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de
la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de
copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la
integracin). Esta tcnica ha sido reemplazada por la PCR en tiempo
real ya que es menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos
cantidad de material vegetal para realizar el anlisis. - Anlisis de
ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin reversa seguida de PCR) con
la hidridacin de ARN o Northern blotting permiten detectar los
transcriptos de inters presentes en la muestra. Ventajas: se
requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y
la muestra es de fcil preparacin. La hibridacin del ARN utiliza
como sonda el transgen, ofrece informacin sobre el tamao del
transcripto y permite su cuantificacin. - ELISA y Western blotting:
Las plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como
transcripto, son analizadas con estas tcnicas inmunolgicas para
determinar la presencia de la protena codificada por el
transgen.Aporte de la transformacin gentica a la variabilidad
gentica Puede ser realizado de diferentes maneras: a) La expresin
de secuencias codificantes no existentes en la especie (protenas
insecticidas de origen bacteriano). b) La expresin de nuevas formas
allicas de genes ya presentes en el genoma (tolerancia al glifosato
en soja). c) La expresin de secuencias codificantes presentes en el
genoma bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que
modifican su nivel o patrn de expresin (protenas relacionadas a la
patognesis). d) La inhibicin de la expresin de genes residentes en
el genoma. Para lograr la inhibicin de la expresin gnica se pueden
usar diferentes tcnicas: cosupresin, antisentido y la denominada
interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un proceso
denominado silenciamiento gnico post-transcripcional que involucra
la degradacin del ARN mensajero producido por un gen determinado.
Importancia y aplicaciones de las plantas transgnicas Los cultivos
transgnicos actuales corresponden a la primera generacin que tiene
por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la
reduccin en el uso de agroqumicos, la conservacin de la tierra
arable, el agua y la energa, la reduccin de la contaminacin del
ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos
aspectos. La segunda generacin tendr ms beneficios directos para
los consumidores: mejoramiento de la calidad nutricional (protenas,
aceite, vitaminas y minerales), la eliminacin de alergenos, la
fitoremediacin y la utilizacin de plantas como bioreactores para la
expresin de protenas recombinantes para la produccin de vacunas
comestibles, anticuerpos y otras protenas de uso teraputico o
industrial.
