Tramuta OLI Essenziali

Utilizzo degli oli essenziali Utilizzo degli oli essenziali per l'inibizione della crescita dei per l'inibizione della crescita dei

microorganismi indicatori di igiene microorganismi indicatori di igiene in prodotti a base di carnein prodotti a base di carne

Ricerca Fondazione CRT Richieste Ordinarie (anno 2017)

Tramuta Clara Tramuta Clara Savigliano, 7 giugno 2019 Savigliano, 7 giugno 2019

UNITA' OPERATIVE COINVOLTE

IZS PLV – S.C. Controllo Alimenti eIgiene delle Produzioni Decastelli Lucia

Terre dei Savoia - Mùses dell'Accademia Europea delle Essenze di Savigliano Cerutti Elena

Durata progetto: 16 mesiInizio: 28/03/2017Rendicontazione finale: 28/07/2019

Obiettivi del progetto

Valutare l’effetto antimicrobico di oli essenziali Valutare l’effetto antimicrobico di oli essenziali

Verificare il possibile utilizzo in prodotti a base di Verificare il possibile utilizzo in prodotti a base di carnecarne

Valorizzare le produzioni locali di erbe/piante Valorizzare le produzioni locali di erbe/piante aromatiche ricche di oli essenzialiaromatiche ricche di oli essenziali

Fasi progettuali

1. Selezione delle erbe

2. Fornitura degli oli

3. Valutazione in vitro dell'attività antibatterica

4. Valutazione in vivo dell'attività antibatterica

5. Divulgazione e disseminazione dei risultati

ATTIVITA' - S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni (IZS PLV)

- Valutazione dell'attività antimicrobica in vitro (metodo di diffusione in agar e microdiluizione in brodo)

- Valutazione dell'attività antimicrobica in vivo

ATTIVITA'- Terre dei Savoia, Mùses dell'Accademia Europea delle Essenze di Savigliano

- Selezione delle erbe aromatiche Regione Piemonte

- Fornitura degli oli estratti da assenzio, finocchio, maggiorana, menta piperita, rosmarino, salvia e timo rosso

Negli ultimi anni si è preso sempre più in considerazione l’aspetto della sicurezza e della qualità dei prodotti alimentari

I consumatori manifestano un marcato interesse verso prodotti alimentari privi di conservanti

I produttori sono orientati alla ricerca di metodi naturali per migliorare la stabilità e la sicurezza degli alimenti

La ricerca è sempre più concentrata sullo studio di metodi alternativi (es. impiego di componenti naturali)

Le erbe aromatiche ricche di oli essenziali con proprietà officinali

sono una fonte di molecole bioattive

usate per aumentare la durabilità e la sicurezza dei prodotti alimentari

Gli oli essenziali sono ottenuti per distillazione o per spremitura da semi, foglie, steli, fiori, etc.

3000 oli essenziali (300 commercialmente importati)

Erbe aromatiche e oli essenzialiErbe aromatiche e oli essenziali

In particolare studiati effetti antibatterici oli essenziali ottenuti da piante aromatiche

L' idrofobicità degli oli permette la penetrazione nella membrana cellulare incrementandone la permeabilità

Fuoriuscita di ioni e di molecole dalle cellule apoptosi

Gli oli essenzialiGli oli essenziali

Tra i possibili meccansmi d'azione:

- degradazione parete cellulare- danni membrana citoplasmatica- danni proteine di membrana- coagulazione del citoplasma

Potenziale applicazione oli essenziali come conservanti di origine vegetale

Possibile impiego sui prodotti a base di carne

Gli oli essenzialiGli oli essenziali

Produzioni in PiemonteProduzioni in Piemonte

Piemonte tra le regioni maggiormente prodruttrici di erbe aromatiche

E' la prima regione per aree di coltivazioni con circa 750 ettari di terreni coltivati con piante aromatiche

In particolare la lavanda, basilico, prezzemolo, menta, salvia, rosmarino, timo, alloro, finocchio, maggiorana, mirto, ginepro, dragoncello, cumino

usate per insaporire i cibi, prolungare la conservabilità di pietanze, in erboristeria, nelle industrie alimentari, cosmetiche e farmaceutiche

Il Mùses ha selezionato le erbe aromatiche che maggiormente vengono coltivate nella Regione Piemonte

IZSTO

Istituto ZooprofilatticoSperimentale del Piemonte,Liguria e Valle d’Aosta

Assenzio (Artemisia absinthium L.) - foglie e steliFinocchio (Foeniculum vulgare Mill.) - semiMaggiorana (Origanum majorana L.) - steli

Menta piperita (Mentha piperita L.) - foglie e steliRosmarino (Rosmarinum officinalis L.) - steli

Salvia (Salvia officinalis) - foglieTimo (Thymus vulgaris L.) - steli

Fornitura degli oli – Fornitura degli oli – estrazioneestrazione distillazione a corrente di vaporedistillazione a corrente di vapore (Menta estrazione ad ultrasuoni)(Menta estrazione ad ultrasuoni)

Tecniche per la determinazione Tecniche per la determinazione in vitroin vitro dell'attività dell'attività antibattericaantibatterica

Diffusione in agar: metodica qualitativa

Brodo/agar diluizione - determinazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC): metodiche quantitative

L'aromatogramma è un test che permette la valutazione del profilo di sensibilità batterica in vitro ad oli essenziali

Si esegue esponendo concentrazioni standard del microrganismo in Si esegue esponendo concentrazioni standard del microrganismo in esame ad una serie di concentrazioni di olio essenzialeesame ad una serie di concentrazioni di olio essenziale

Tecniche per la determinazione Tecniche per la determinazione in vitroin vitro dell'attività dell'attività antibatterica – diffusione in agarantibatterica – diffusione in agar

Principio

L'olio diffonde nell’agar in direzione centrifuga

Formazione di un alone di inibizione dovuto all'inibizione della crescita batterica indotta dall'olio

Misurazione in millimetri dei diametri degli aloni di inibizione che si creano intorno ai dischi contenenti l'olio

Tecniche per la determinazione Tecniche per la determinazione in vitro in vitro dell’attività dell’attività antibatterica – diffusione in agarantibatterica – diffusione in agar

Semina della sospensione sulla superficie di un terreno standardizzato

Posizionamento dei dischetti e incubazioneMisurazione degli aloni di inibizione ed interpretazione dei risultati

Allestimento di una sospensione batterica (1,5 x 108 CFU/ml)

Valutazione Valutazione in vitroin vitro dell'attività antibatterica - diffusione in dell'attività antibatterica - diffusione in agaragar

Sospensione batterica E. coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 33862)

Semina su piastre di MH agar

Dischetti imbibiti con ciascun olio essenziale -superficie del terreno -coperchio della piastra petri (componenti volatili)

Incubazione a 35°C per 16-20 ore

Misurazione dei diametri degli aloni di inibizione

Tecniche per la determinazione Tecniche per la determinazione in vitroin vitro dell'attività dell'attività antibatterica – microdiluizione in brodoantibatterica – microdiluizione in brodo

Determinazione Minima Determinazione Minima Concentrazione Inibente (MIC)Concentrazione Inibente (MIC)

Misura quantitativa dell’attività di un agente antimicrobico (olio) verso un determinato batterio

Definita come la più bassa concentrazione di agente antimicrobico (olio) capace di inibire la crescita batterica visibile

Solubilizzazione dell'olio (Tween 80 1%) e diluizioni (scalari 1:2) in brodo di coltura (MHB)

Semina dell’inoculo standardizzato (1.5x106 UFC/ml)

Incubazione a 37°C per 24h Lettura MIC = primo pozzetto senza crescita

visibile

ValutazioneValutazione in vitro in vitro dell'attività antibatterica – dell'attività antibatterica – microdiluizione in brodo microdiluizione in brodo

Tecniche per la determinazione Tecniche per la determinazione in vitroin vitro dell'attività dell'attività antibatterica – Minima Concentrazione Battericida - (MBC)antibatterica – Minima Concentrazione Battericida - (MBC)

La più bassa concentrazione di agente antimicrobico capace di uccidere il La più bassa concentrazione di agente antimicrobico capace di uccidere il 99.9% dell'inoculo99.9% dell'inoculo

Semina del contenuto dei pozzetti, senza crescita visibile, su AS

Incubazione a 37°C per 24h

Lettura MBC: diluizione più bassa alla quale non si osserva crescita batterica

Minima concentrazione dell’olio essenziale in grado di esercitare un’azione battericida

RisultatiRisultati attività antibatterica attività antibatterica in vitro in vitro – – Aloni di inibizioneAloni di inibizione

RisultatiRisultati attività antibatterica attività antibatterica in vitro in vitro – – Aloni di inibizioneAloni di inibizione

Attività antibatterica delle componenti volatili degli oli essenziali

OlioDiametro aloni (mm)

E. coli S. aureusAssenzio 0 > 50

Finocchio 0 0

Maggiorana 30 > 50

Menta piperita 0 > 50

Rosmarino 0 0

Salvia 12 > 50

Timo 31 > 50

RisultatiRisultati attività antibatterica attività antibatterica in vitroin vitro - - MIC e MBCMIC e MBC

OlioMIC (% olio) MBC (% olio)

E. coli S. aureus E. coli S. aureus

Assenzio 1,56 0,78 1,56 0,78

Finocchio 25 12,5 50 50

Maggiorana 0,195 0,097 0,39 0,097

Menta piperita 0,78 0,097 1,56 0,097

Rosmarino 1,56 0,39 1,56 1,56

Salvia 0,39 0,195 0,39 0,39

Timo 0,048 0,048 0,097 0,048

MIC=MBC olio ha azione sia batteriostatica che battericida

ValutazioneValutazione dell'attività antibatterica dell'attività antibatterica in vivoin vivo

Campioni di carne macinata (10 g) inoculati con i ceppi ATCC 105 UFC/g e 103 UFC/g

Timo e maggiorana testati alle concentrazioni 1% e 2%

Omogeneizzazione in Stomacher

Incubazione a 4°C per 0h, 5h, 24h, 48h

Diluizione della carne (10 g) in BPW (90 ml)

Diluizioni seriali 1:10 in acqua peptonata

Semina in terreni agarizzati TBX (E. coli) e RPF (S. aureus)

Incubazione a 44°C/37°C per 24h-48h, conta batterica (UFC\g)

Risultati - Attività antibatterica Risultati - Attività antibatterica in vivoin vivoEscherichia coli (Log UFC/g)

0 5 h 24 h 48 h

Controllo negativo 0 0 0 0

Controllo positivo 5 5 5 5

Maggiorana 5 4,9 4,86 4,83

Timo 5 4,9 4,87 4,79

Maggiorana / Timo 1%Maggiorana / Timo 1%

Conc. batt 10Conc. batt 1055 UFC/g UFC/g

100.000 UFC/g

69.000 UFC/g

62.000 UFC/g

4,65

4,7

4,75

4,8

4,85

4,9

4,95

5

5,05

0h 5h 24h 48h

Escherichia coli

Controllo positivo

Maggiorana

TimoLOG

UFC

/g


0 5 h 24 h 48 h



Maggiorana 5 4,9 4,6 4,5

Timo 5 4,9 4,5 4,3



100.000 UFC/g

29.000 UFC/g

21.000 UFC/g

3,8

4

4,2

4,4

4,6

4,8

5

5,2

0h 5h 24h 48h

Escherichia coli

Controllo positivo

Maggiorana

TimoLOG

UFC

/g


0 5 h 24 h 48 h




Timo 3 2,8 2,6 2,3



1.000 UFC/g

400 UFC/g

200 UFC/g

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0h 5h 24h 48h

Escherichia coli

Controllo positivo

Maggiorana

Timo

LOG

UFC

/g

Risultati - Attività antibatterica Risultati - Attività antibatterica in vivoin vivoStaphylococcus aureus (Log UFC/g)

0 5 h 24 h 48 h




Timo 3 2,8 2,6 2,2



1.000 UFC/g

300 UFC/g

150 UFC/g

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0h 5h 24h 48h

Staphylococcus aureus

Controllo positivo

Maggiorana

Timo

LOG

UFC

/g

ConclusioniProve in vitro

Timo e maggiorana maggiore attività antibatterica – elevate % di composti fenolici

In generale, osservata maggiore efficacia oli verso lo Staphylococcus aureus rispetto E. coli (carattere riconducibile alle differenze inerenti la struttura della parete cellulare)

Le componenti volatili degli oli (timo, maggiorana, menta, assenzio e salvia) mostrano eccellente azione soprattutto nei confronti di S. aureus

ConclusioniProve in vivo

Osservata attività antibatterica nelle 48h a basse conc. di olio (2%)

Più complessa la valutazione nell'alimento: necessaria una quantità superiore di olio (>100-200) per avere l'effetto ottenuto in vitro

Concentrazioni spesso inconciliabili con le caratteristiche sensoriali Concentrazioni spesso inconciliabili con le caratteristiche sensoriali della carnedella carne

Conclusioni

Più complessa la valutazione nell'alimento...perchè?

- La maggiore disponibilità di nutrientimaggiore disponibilità di nutrienti negli alimentinegli alimenti rispetto ai terreni di coltura permette ai batteri di riparare più velocemente i danni subiti delle cellule- La sensibilità dei batteri influenzata dalle proprietà intrinseche proprietà intrinseche dell'alimento dell'alimento (grassograsso, proteine, contenuto di acqua, etc)

Può proteggere i batteri dall'azione dell'olio

Diminuisce la dispersione dell'olio nell'alimento

Conclusioni

Ulteriori prove su matrici alimentari relativamente più semplici e possibili azioni sinergiche tra gli oli

Ridurre il rischio microbiologico e migliorare la qualità dei prodotti

Timo e maggioranaRappresentano una buona alternativa all’utilizzo di sale e additivi sintetici in campo alimentare a vantaggio della salute dei consumatori

Grazie per l'attenzioneGrazie per l'attenzione

Gruppo di lavoroGallina S, Tramuta C, Bianchi DM, Golfieri G, Falsetti S, Zaquini L,

Cerutti E, Decastelli L

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