Trabalho Final Com Perguntas

8/17/2019 Trabalho Final Com Perguntas

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A UTILIZAÇÃO DA TECNOLOGIA DECRISPR-CAS9 COMO ALTERNATIVA

PARA O TRATAMENTO DA DMD

Ana CaroliSilvaF rnan!a CCaval"an#Fili$ Fi!

An!ra!


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CRISPR- "a% 9 , 3a"#4ria%

Fon# 5


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CRISPR- "a% 9 , 3a"#4ria%

Fon# 5 P


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:i%#1ri"o ;;;M "ani%,o ! CRISPR < Ca%

Fonte: Do&!na an! Cha $ n#i r


6/47

•

O r "onh "i, n#o !o alvo r & r #an#o o $ar a, n"o, %+RNA &an#o a $r % n'a ! PAM0

• PAM 4 "ri#i"a $ara a li+a'/o ini"ial ao DNA0

• Ca!a "a%9 # , &, r & ri, n#o !iB r n# ! PAM NGG@;

M "ani%,o ! CRISPR < Ca%


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CRISPR

Fonte: ; M i # al= 678?A!a$#a!o@

Fases G1,S, G2

FaG2

D

2

,i


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CRISPRComparação com Outras Tecnologias de Ediçãode Genoma

Vantagens

Limitaçes

• Fa"ili!a! ! "&%#o,i a'/o0

• Pa!r/o ! "liva+ , ? 2$ H !PAM@0

• Po%%i2ili!a! ! J$ ri, n#o%multiplex .0

• E "i n"ia $o! a#in+ir K 7 ;

• N " %%i!a! PAM % & n"ia alvo0

• Ma'( %of-target.


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CRISPR!plicaç es

F o n

t e :

: % & =

L a n

! r

Z h a n + =

6 7 8 >

;


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CRISPR!plicaç es

Fonte:

• R +&lar o n v l ! #ran%"ri'/o0

• Mar"a'/o ,&l#i"olor ! lo"i"ro,o%%*,i"o% ;


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CRISPR!plicaç es


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F o n

t e :

G n

4 # i " a

M o

l " &

l a r : & , a n a =

> R

! i ' / o

Di%#ro a M&%"&lar ! D&"h nn


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A%%o"ia!o aa"#ina

A%%o"ia!o% a ,a#riJ#ra" l&lar

Di%#ro a M&%"&lar ! D&"h nn! distro"na


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Di%#ro a M&%"&lar ! D&"h nn


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:i%#1ri"o


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:i%#1ri"o

Mio2la%#o%i,or#ali a!o%-


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:i%#1ri"o#ro$lemas no %so do !deno&

como Vetor:

• Gran! $ara a#rav %%arJ#ra" l&lar0

• E%"a%% ! r " $#or

a! nov r&% , "4l&la%• I,&no+ ni"i!a! ;


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• Corri+ir ,a'( % !o + n !a Dmd!a #4"ni"a CRISPR-"a%9 , !ia!o r $aro ! &n'/o ! $on#a% n/o ho,1lo

?N:E @ , # "i!o% ,&%"&lar % $ili an!o o v #or AAV9;

O2 #ivo


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•

A$r % n#a, "1!on ! $ara!a$r ,a#&ro no 4Jon 6 0

• &, !o% ,o! lo% ,ai%ili a!o% $ara %#&!o !a DMD0

Mo! lo mdx

Fon


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•

AAV 4 &, v r&% n/o-$a#o+ ni"o0• Ca$a"i!a! ! ,$a"o#a, n#o5 HW20

• I,&no+ ni"i!a! ,&i#o 2aiJa0

• AAV-9 a$r % n#a al#o #ro$i%,o $or # "i!o% ,&%"

V #or AAV


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E%#ra#4+ia !o E%#&!o


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Vali!a'/o


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Vali!a'/o

Tran%B "'/o?"a%9@ %+RNA

S l '/o J$an%/o!a% "4l&la%#ran%B "#a!a% EJ#ra'/o ! a,$li "

$or PCR

AnXli% !o$or !i+ %#

TYE8

Fonte: i"2;&%$;2r

F o n

t e : % o &

i , i " a

; $ #

F o n

t e 5

# h r , o

% "

h r ; " o ,


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Vali!a'/o


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EJ$ ri, n#o% , Zi+o#o md


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EJ$ ri, n#o% , Zi+o#o md#C( eSe)uenciamento


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EJ$ ri, n#o% , Zi+o#o md!n*lise+istol gica


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EJ$ ri, n#o% , Zi+o#o md!n*lise Funcional


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EJ$ ri, n#o% , Zi+o#o md!&aliação de al&osinespec'"cos


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EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+o mVetor !!V para E-pressão de Cas., sg(/! e GF#

EJ$ i # % C & !


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EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+o0i erentes odos de Entrega doV'rus !!V


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EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+o m(esgate da E-pressão de 0istro"na por 3n4eção 3

•

I,&no"olora'/oavalio& J$r %%!i%#ro na0

• : ,a#oJilina o%?: E@ "ar"# rhi%#o$a#ol1+i"a%# "i!o% !a !i%#ro

• Mio 2ra% n "rBora !i in& !a%;


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EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+o m(T5#C( do (/! de Camundongos 3n4etados (O eSe)uenciamento

$


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EJ$ ri, n#o , Ca,&n!on+o(esgate da E-pressão de 0istro"na por 3n4eção (O

EJ$ i # % C & ! +


37/47

EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+oesgate da E-pressão de 0istro"na por 3n4eção 3#

EJ$ i # % C & ! +


38/47

EJ$ ri, n#o% , Ca,&n!on+oedida da Força do Camundongos 3n4etados por 3#

R %&l# ! %


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• A J$r %%/o ! !i%#ro na Boi r %#a2 l "i!a !o ,[%"&lo li%o $or #o!a% a% via%= ,ai% B #$or RO0

• In"a$a"i!a! ! r %#a2 l "i, n#o !a J$r %%!i%#ro na no hi$o"a,$o0

• A&% n"ia ! vi! n"ia% ! ,a'( % in %$ "

R %&l#a!o%

Di%"&%%/


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Di%"&%%/o

•

A&, n#o $ro+r %%ivo !o n[, ro ! 2ra% !i%$o%i#iva% J$r %%/o $ r%i%# n# !a !i'/o0

• M %,o a&, n#o% $ & no% na J$r %%/o !$o! , , lhorar a "ar!io$a#ia0

Di%"&%%/o


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Di% &%%/o

Fonte: G

• \&al & r INDEL & in# r ra "o, &, % #ioa" $#or o& a" $#or ! %$li"in+ r %&l#arX ,

Jon %Wi$$in+0

• NAG 4 a % & n"ia "on% n%o ! a" $#or !%$li"in+ #a,24, a % & n"ia PAM $ara%$Ca%9;

Fonte: :&,an + n #i"%= >#h !i#ion

P a r a

r l

, 2 r

a r ; ; ;

P +& # %


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8@ So2r o %i%# ,a ! r $aro :DR N:E 4 $o%%a r,ar= J" #o5a@ O , "ani%,o ! r $aro N:E 4 J$r %%o$rin"i$al, n# na% Ba% % G8= S G62@ O , "ani%,o ! r $aro N:E 4 $ro$ n%o a rro%Br & n# , n# l va, ,a'( % ! in% r'/o o&! l '/o"@O r $aro $or :DR o"orr $riori#aria, n# no nal Ba% % !&ran# a Ba% G6

!@ C4l&la% al#a n# !iB r n"ia!a% ili a

P r+&n#a%

P r+&n#a%


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P r+&n#a%6@ \&al a B&n'/o !a% PAM] A%%inal a% al# rna"orr #a%5a@S/o %$a'a!or % no DNA;2@R %$on%Xv i% $ lo r "onh "i, n#o ! % lB"@ Pr % n# %o, n# , 2a"#4ria%!@S & n"ia ! r "onh "i, n#o ! "a%9

P r+&n#a%


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P r+&n#a%@ A !i%#ro a ,&%"&lar ! D&"h nn %#X n#r a% !o n'a%

$r val n# %= o"orr n!o , 8 a "a!a H77 in!iv !&o% !o % Jo

E%#a Bor,a ! !i%#ro a 4 % v ra r %&l#a , ! + n ra$ro+r %%iva Bal "i, n#o $r "o" ; E, "on#ra%# = a !i%#ro&,a Bor,a ! !i%#ro a "o, %in#o,a% ,ai% 2ran!o% %o2r vi!A,2a% a% !o n'a% %/o "a&%a!a% $or ,a'( % no + n &!i%#ro na ?N l%on # al; 678 a!a$#a!o@; So2r %%a% !o na r,ar5

a@ A$roJi,a!a, n# 6^ !a% ,a'( % , a,2a% a% !i%#ro"a&%a!a% $or ! l '( % , &, o& ,ai% 4Jon% !o + n &!i%#ro na

2@ A% ! l '( % $r % n# % na !i%#ro a ,&%"&lar ! 3 "Wal# ra'( % na ,a#ri ! l i#&ra

"@ A% ! l '( % na !i%#ro a ,&%"&lar ! D&"h nn r %&!an a na a#ri ! l i#&ra

P r+&n#a%


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P r+&n#a%

>@ U, !o% $ro2l ,a% a%%o"ia!o% ili a'/o !a #4! CRISPR 4 a $o%% v l o"orr n"ia ! ,a'( % ,

& n/o %/o o % #io alvo $ri,Xrio !o ! % nho !o$ % &i%a!or; S/o B rra, n#a% $ara v ri "a'/o o&$r !i'/o !a o"orr n"ia ! ,a'/o of-target = "o

J" '/o ! 5a@ S & n"ia, n#o2@ En%aio "o, a n i,a TYE8"@ Pro+ra,a% ! $r !i'/o in silico!@ PCR , # ,$o r al

P r+&n#a%


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H@ S/o van#a+ n% !o CRISPR= J" #o5A@ FX"il "&%#o,i a'/o3@ Al#a "i n"iaC@ Pa!r/o ! "liva+ , r "onh "i!oD@ N " %%i!a! !a $r % n'a ! PAM

P r+&n#a%

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N:E :DR/+E6 +0(

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