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Trabajo Fin de Grado
Grado en Ingeniería de Telecomunicación
Especialidad en Imagen y Sonido
Segmentación automática del árbol dendrítico en
neuroimágenes de microscopía confocal
Autor: Santiago García Gutiérrez
Tutoras: Irene Fondón García y Auxiliadora Sarmiento Vega
Dep. Teoría de la Señal y Comunicaciones
Escuela Técnica Superior de Ingeniería
Universidad de Sevilla
Sevilla, 2014
Proyecto Fin de Carrera
Ingeniería de Telecomunicación
Segmentación automática del árbol dendrítico en
neuroimágenes de microscopía confocal
Autor:
J. Santiago García Gutiérrez
Tutores:
Irene Fondón García
Profesora Contratada Doctora
Auxiliadora Sarmiento Vega
Profesora Ayudante Doctora
Dep. de Teoría de la Señal y Comunicaciones
Escuela Técnica Superior de Ingeniería
Universidad de Sevilla
Sevilla, 2014
Proyecto Fin de Carrera: Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de
microscopía confocal
Autor: Javier Santiago García Gutiérrez
Tutores: Irene Fondón García y Auxiliadora Sarmiento Vega
El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes
miembros:
Presidente:
Vocales:
Secretario:
Acuerdan otorgarle la calificación de:
Sevilla, 2014
El Secretario del Tribunal
Mientras el cerebro sea un misterio, el universo continuará siendo un misterio
- Santiago Ramón y Cajal -
i
Agradecimientos
A mis tutoras del proyecto, Irene Fondón y Auxiliadora Sarmiento, por la paciencia, la ayuda
inestimable y por todo lo que me han enseñado.
A Alicia.
A mi madre y a mi padre, por todo, y a toda mi familia, por el apoyo.
A Baltar, Almenara, Carlos, Juan, Manelae, Parodi, Selu y a Yassin, porque estuvieron cuando hacía
falta.
Santi García
Septiembre de 2014
iii
Resumen
La microscopía confocal es una herramienta importante para los investigadores en neurociencia. Una
simple neurona puede ser marcada usando proteína verde fluorescente (GFP), de manera que la
estructura neuronal pueda ser visualizada en una pila de imágenes de microscopía confocal. Sin
embargo, la obtención del árbol dendrítico en secciones de tejido individual requiere desde horas a
meses de trabajo, y, en la práctica, la segmentación de imágenes se lleva a cabo de una manera
prácticamente manual.
La herramienta presentada pretende realizar una segmentación automática de dendritas en imágenes
de neuronas obtenidas con microscopio confocal. Para ello emplea un algoritmo utilizado
anteriormente para extracción de vasos sanguíneos en imágenes de retinas, y para la eliminación de
pelos en imágenes dermatoscópicas, basado en el uso de filtros adaptados de forma gaussiana, y
filtros de la derivada gaussiana de primer orden. El algoritmo se implementa sobre una interfaz
gráfica de usuario diseñada para el apoyo al investigador en neurociencia y la utilización por parte de
éste, sin necesidad de tener experiencia en procesado de la imagen ni conocimientos informáticos
previos.
v
Abstract
Confocal microscopy is a relevant tool for researches on neural sciences. A single neuron can be
labeled by using green fluorescent protein (GFP) such that the neuronal structure can be visualized in
a stack of confocal microscopic images. However, simple dendritic trees within individual tissue
sections require from hours to several months of work and, in practice, the segmentation of the
images are made almost in a manual way.
Some image processing techniques were applied to fluorescence confocal images in the past in order
to minimize the expert user intervention and made more accurate the segmentations. Each of them
works with different type of images, although the final purpose is to segment, measure and/or
reconstruct the neuron with visualization purposes.
The proposed tool tries to automatic segment dendrites in neuronal images obtained with confocal
microscopy. It uses an algorithm previously presented for retinal vessel extraction in retinal images,
and for hair removal in dermatoscopic images, based in the use of matched Gaussian-shaped filters,
and first-order derivative of the Gaussian filters. The algorithm has been implemented in a graphical
user interface adecuated for its use by any scientific researcher without any image processing
experience and with no previous informatical knowledge.
Índice
Agradecimientos i
Resumen iii
Abstract v
Índice vi
Índice de Figuras ix
Notación xi
1 Introducción 1 1.1 Motivación 1 1.2 Objetivos 1 1.3 Estructura del documento 2
2 La Neuroimagen Microscópica 5 2.1 Morfología de la neurona 5 2.2 Preparación del tejido para estudio en microscopio 6
2.2.1 Fijación 6 2.2.2 Seccionado 6 2.2.3 Montaje 7
2.3 Microscopía de Fluorescencia 7 2.4 Microscopía Confocal 8 2.5 Aplicaciones de la microscopía de fluorescencia 10
3 Estado del Arte 11 3.1 Detección de espinas dendríticas mediante filtrado morfológico direccional y método del camino más corto. 11 3.2 Detección de espinas dendríticas en imágenes XRMT 12 3.3 NeuronStudio (software no comercial) 13 3.4 SpineLab (software comercial) 14 3.5 SynD (software comercial) 15
4 La Herramienta Software 16 4.1 El Algoritmo 16
4.1.1 Filtro adaptado MGF 17 4.1.2 Filtro de la primera derivada gaussiana FDOG 18 4.1.3 Segmentación de dendritas 19
4.2 Interfaz Gráfica de Usuario (GUI) 20
5 Resultados 22
6 Conclusiones y Trabajo Futuro 26 6.1 Conclusiones 26 6.2 Trabajo futuro 26
vii
Referencias 29
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Morfología de la neurona, dibujada por Ramón y Cajal. Núcleo (a), axón (b),
dendritas (c). 6
Figura 2. Microscopio de Fluorescencia (extraído de [4]). 8
Figura 3. Funcionamiento del microscopio confocal (extraído de [4]). 9
Figura 4. Detección de espinas dendríticas (en rojo) (extraído de [6]). 12
Figura 5. Dendritas (verde) y espinas dendríticas (rojo), extraído de [7]. 13
Figura 6. Un ejemplo de los resultados obtenidos con el software NeuronStudio. Extraído de
[8]. 13
Figura 7. Extracción del esqueleto [9]. 14
Figura 8. Diagrama de bloques del algoritmo utilizado por SynD. Extraído de [3]. 15
Figura 9. Los dos filtros utilizados: MGF (arriba) y FDOG (abajo). (Extraído de [11]). 17
Figura 10. Respuestas a los filtros MGF y FDOG para una sección transversal gaussiana y
un borde escalón ideal. (a) Funciones a las que se aplican los filtros (a la izquierda, función
gaussiana; a la derecha, función escalón ideal), (b) respuestas al filtro MGC, (c) valor medio
local de las respuestas al filtro FDOG (dm). (Extraído de [11]). 18
Figura 11. Último paso antes de la segmentación para cierta imagen. A la izquierda, imagen
original. A la derecha, valor normalizado de la imagen de media local (Dm) de la respuesta al
filtro FDOG (D): Dm. La zona cercana al núcleo tiene valores más altos. 20
Figura 12. Ventana principal de la primera versión del software. 21
Figura 13. Un ejemplo de la herramienta presentada. 21
xi
Notación
FDOG First-order Derivative Of Gaussian
GFP Green Fluorescent Protein
GUI Graphical User Interface
JPEG Joint Photographic Expert Group (formato)
LSM Laser Scanning Microscopy
MGF Matched Gaussian Filter
TIFF Tagged Image File Format
XRMT X-Rays Micro-Tomography
1
1 INTRODUCCIÓN
l interés de este proyecto es proporcionar una ayuda para el análisis de imágenes neuronales,
que supone la base del estudio fisiológico de las funciones cognitivas.
Muchas alteraciones neurológicas, desde la incapacidad intelectual a enfermedades
neurodegenerativas o trastornos psiquiátricos, parten de un defecto en la morfología de las neuronas
[1][2]. En la investigación de los mecanismos moleculares de dichas alteraciones neurológicas se
utilizan generalmente modelos de ratones modificados genéticamente y estudios in vitro. Para
conocer las vías patogénicas subyacentes es necesario un estudio consistente y profundo de
diferentes aspectos de la morfología neuronal [3].
1.1 Motivación
El estudio manual de la morfología neuronal resulta laborioso, especialmente cuando se trata de
conjuntos de imágenes obtenidas por microscopía confocal. El trabajo que se presenta surge como
un proyecto de colaboración con expertos científicos del área de Fisiopatología Molecular de las
Sinapsis del Hospital Universitario Virgen Macarena, en Sevilla, quienes, para el estudio del
Síndrome de Down, realizan un análisis (hasta ahora manual) de imágenes de neuronas de ratones
modificados genéticamente. Las neuronas, marcadas con proteína fluorescente GFP (green
fluorescent protein), quedan representadas en imágenes obtenidas por microscopía confocal.
La separación de los componentes morfológicos de la neurona en la imagen, así como la
comparación del tamaño y densidad dendrítica entre imágenes, son aspectos que este proyecto trata
de resolver de manera automática, como una herramienta de ayuda para el experto, mediante la
creación de una interfaz gráfica de usuario (GUI, por sus siglas en inglés).
1.2 Objetivos
El objetivo principal del trabajo es el desarrollo de una herramienta de manejo simple, ejecutable en
cualquier ordenador, que implemente un algoritmo automático de extracción del árbol dendrítico en
imágenes de microscopio confocal minimizando la intervención manual del experto y con la
suficiente calidad en términos de precisión.
E
Introducción
2
El propósito final es facilitar las tareas de segmentación, medición y/o reconstrucción de la neurona
con propósitos de visualización y análisis a manos de los expertos.
1.3 Estructura del documento
Se presenta, en primer lugar, una introducción a la neuroimagen microscópica, su proceso de
obtención y los elementos utilizados para ello. La siguiente sección describe el estado del arte, con
algunos comentarios acerca de métodos ya existentes para la segmentación de neuronas y algunas
herramientas comerciales. A continuación se describe la herramienta presentada, el algoritmo y la
interfaz gráfica. Finalmente, una sección comenta los resultados obtenidos.
3 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
5
2 LA NEUROIMAGEN MICROSCÓPICA
a neuroimagen microscópica consiste en la observación del tejido nervioso utilizando sistemas
ópticos o electrónicos que permiten obtener imágenes a gran aumento para el estudio de su
microestructura y organización [4]. Con este objetivo se utilizan microscopios de campo claro,
de fluorescencia, confocal y multifotón, que emplean luz para la obtención de imágenes y permiten
una aproximación a la estructura celular del sistema nervioso.
El microscopio electrónico resuelve los problemas de resolución que origina el uso de luz, y utiliza
radiación electrónica para conseguir grandes magnificaciones y resolución a nivel molecular. Estos
sistemas necesitan un procesamiento previo del tejido, y se apoyan en el uso de técnicas de tinción y
marcaje selectivo de las muestras de estudio, que permitirán diferenciar los distintos componentes
del tejido nervioso y estudiar su distribución y características.
El desarrollo de marcadores fluorescentes compatibles con la fisiología celular ha permitido la
observación del tejido vivo, empleando sistemas de microscopía de fluorescencia, concretamente el
microscopio confocal y el microscopio multifotón. Esta aproximación ha permitido obtener una
información mucho más completa acerca del funcionamiento del sistema nervioso. Después de una
breve introducción a la morfología de la neurona, se sintetizan a continuación los fundamentos de los
sistemas de microscopía utilizados en el área de Fisiopatología Molecular de las Sinapsis.
2.1 Morfología de la neurona
La neurona es la unidad básica de funcionamiento del cerebro, la unidad estructural y funcional del
sistema nervioso, especializada en transmitir información a otras células nerviosas, glandulares, o
músculos.
Está formada por un cuerpo celular que contiene al núcleo, el citoplasma y todas sus prolongaciones
(que son fibras eléctricamente excitables), un axón y numerosas dendritas. Las dendritas son
“proyecciones ramificadas de una neurona”. Se extienden desde el cuerpo neuronal y reciben
mensajes de otras neuronas. En las dendritas aparecen pequeñas protusiones membranosas llamadas
espinas dendríticas. Los impulsos nerviosos llegan hasta el cuerpo celular a través de las dendritas, y
son expulsados por el axón.
El axón es una ramificación de la neurona, generalmente de mayor tamaño que las dendritas, que se
rodea de las llamadas células de Schwann. Cuando los axones de muchas neuronas se reúnen
(formando haces o fascículos) dan lugar a un nervio. La mayoría de los axones se ramifican en su
terminación en varias ramas, y cada una de estas se ensancha en una zona conocida como botón
sináptico, mediante el cual el axón conecta con las dendritas o el cuerpo celular de la neurona
L
La Neuroimagen Microscópica
6
siguiente. Los impulsos nerviosos viajan, a través del axón de una neurona, hasta las dendritas y
cuerpos celulares de otras neuronas.
Figura 1. Morfología de la neurona, dibujada por Ramón y Cajal. Núcleo (a), axón (b), dendritas (c).
2.2 Preparación del tejido para estudio en microscopio
2.2.1 Fijación
La fijación es el proceso que impide que se produzcan fenómenos de degeneración post mortem, a la
vez que permite que la estructura del tejido se preserve de forma similar a como es en vivo. Esto se
consigue con la inmersión del tejido en aldehídos (como el fomaldehído, paraformaldehído y
glutaraldehído), que establecen puentes moleculares entre las proteínas estructurales y solubles del
tejido, insolubilizándolas e inactivando las enzimas que darían lugar a la autólisis celular, con lo que
se mantiene de manera óptima la estructura del tejido [4].
2.2.2 Seccionado
El tejido ya fijado es cortado en rodajas (slices) o secciones para su procesamiento y observación al
microscopio. Para obtener secciones por debajo de los 30 µm se requiere dar firmeza al tejido
mediante su inclusión en medios como la parafina o la celoidina. También se emplea la congelación
del tejido. Las secciones gruesas (de 100 a 400 µm) se utilizan para mantener cierta integridad en las
estructuras a analizar (específicamente de las neuronas o conexiones locales, como en las tinciones
de Golgi o cuando se hacen cultivos de tejido).
Las secciones se realizan empleando microtomos o vibratomos. Estos son aparatos de precisión que
7 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
permiten obtener cortes finos de un grosor homogéneo. En el caso de tejido congelado se emplea un
criostato (microtomo dentro de una cámara a -20 ºC para evitar la descongelación del tejido [4]).
2.2.3 Montaje
Las secciones obtenidas en el proceso anterior serán montadas en respectivos portaobjetos (láminas
de vidrio), y se adhieren las secciones en su superficie con un cubrimiento de albúmina o gelatina. En
este punto, las secciones son teñidas según diferentes técnicas –en algunos casos, la tinción se realiza
previamente al montaje en el portaobjetos-.
La preparación se cubrirá con un medio de montaje transparente que presentará propiedades ópticas
adecuadas para la observación al microscopio; normalmente este medio de montaje tendrá un índice
de refracción similar al del vidrio y, en el caso de emplear marcadores fluorescentes, será un medio
de montaje hidrófilo (glicerol diluido) [4].
Por último, se cubrirá con una fina lámina de vidrio, el cubreobjetos, que protege a la muestra y
permite obtener una superficie lisa y homogénea que evita las distorsiones ópticas.
2.3 Microscopía de Fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que presenta algunas modificaciones para
observar la fluorescencia emitida por el tejido. La fluorescencia es una propiedad que presentan las
llamadas moléculas fluorescentes o fluoróforos, que al ser excitadas por una radiación luminosa de
determinada longitud de onda, liberan energía a través de la emisión de luz de una longitud de onda
mayor. El microscopio de fluorescencia está adaptado para el uso de fluoróforos como marcadores,
que ofrecen algunas ventajas sobre los marcadores tradicionales para luz transmitida.
Los microscopios de fluorescencia disponen de una fuente de luz (lámpara de mercurio o xenón)
capaz de emitir luz de gran intensidad en un amplio esprectro de longitudes de onda: desde el
ultravioleta -254 nm- hasta el rojo -650 nm-. Esta luz producirá la excitación de los fluoróforos.
Presentan una importante diferencia respecto a los microscopios de campo claro: la iluminación de la
muestra se produce a través del objetivo, que actúa por tanto como condensador (de la luz) y como
objetivo. Esto se conoce como epiiluminación [4].
En el microscopio de fluorescencia, el haz de luz producido por la lámpara es concentrado por un
condensador y atraviesa un filtro que selecciona el rango de longitud de onda adecuado para excitar
el fluoróforo que se esté empleando. La luz filtrada incide sobre un reflector cromático (espejo
dicroico), que presenta la propiedad de reflejar la luz de baja longitud de onda (luz incidente), pero
que puede ser atravesado por luz de mayor longitud de onda (emitida). La luz incidente es, por tanto,
reflejada por el reflector cromático, y enfocada por el objetivo sobre la muestra de tejido. Los
fluoróforos presentes en el campo iluminado del tejido son excitados por esta luz incidente y en
respuesta emiten luz de mayor longitud de onda, que es recogida por el objetivo y que será capaz de
atravesar el espejo dicroico. Esta fluorescencia emitida pasa después por un filtro barrera, que
permite el paso de longitudes de onda correspondientes a la emisión del fluoróforo empleado,
bloqueando otras posibles emisiones del tejido. Es esta emisión final la que se visualiza a través del
ocular (ver Figura 2).
La Neuroimagen Microscópica
8
Figura 2. Microscopio de Fluorescencia (extraído de [4]).
En el microscopio de fluorescencia, la intensidad de la fluorescencia emitida puede ser muy baja (por
ejemplo, cuando existen pocas moléculas de fluoróforo presentes en el tejido, o cuando se observa
tejido vivo, que no puede ser iluminado con luz incidente de alta intensidad). Por ello se emplea el
objetivo simultáneamente como condensador y como objetivo, para optimizar la iluminación de la
muestra y maximizar la captación de luz. La epiiluminación supone una importante mejora de la
eficacia en la captación de luz emitida cuando se emplean objetivos con una alta apertura numérica
[4].
La microscopía de fluorescencia, por tanto, requiere el empleo de objetivos que presentan una
apertura angular alta y utilizan medios de inmersión que maximizan la apertura numérica, ya que
optimizan la captación de luz y contribuyen a maximizar la resolución de la imagen.
La resolución del microscopio de fluorescencia es teóricamente inferior al del microscopio de luz
transmitida. Sin embargo, esta pérdida de resolución se ve compensada por el incremento en la
detectabilidad de la señal, porque en condiciones óptimas es posible detectar la presencia de una
única molécula de fluoróforo. El desarrollo de sondas fluorescentes con múltiples aplicaciones en
neurobiología aporta muchas ventajas al empleo de este tipo de microscopía.
2.4 Microscopía Confocal
La microscopía confocal se basa en el uso de un microscopio de fluorescencia modificado que
permite la obtención de imágenes confocales: imágenes de un espesor reducido del tejido que no
presentan elementos fuera de foco.
El microscopio confocal utiliza normalmente un láser como fuente de iluminación, que se desplaza
por la muestra, realizando un barrido punto a punto del tejido. Para dirigir la trayectoria del láser en
este barrido, se intercala en la vía óptica un sistema de espejos que giran en ángulos opuestos, cuyo
9 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
movimiento está controlado digitalmente. El láser es enfocado a través del objetivo para focalizar la
luz sobre un punto del tejido, minimizando la llegada de luz a las zonas adyacentes, tanto en el plano
horizontal como en el axial. Los fluoróforos presentes en el punto iluminado son excitados por la luz
incidente y responden emitiendo luz fluorescente de menor longitud de onda, que será captada por el
objetivo del microscopio, para posteriormente atravesar un condensador que focaliza la luz emitida
sobre un receptor (CCD, fotodiodo o fotomultiplicador). Entre el condensador y el receptor se sitúa
una apertura de diámetro reducido (pinhole) que sólo permite la entrada de luz proveniente del punto
iluminado, eliminando la posible emisión producida por las regiones adyacentes. Por último, un
ordenador integra la señal recogida en cada punto para generar la imagen final.
Los láseres empleados en el microscopio confocal emiten en un rango de longitudes de onda con
máximos en 488, 568 y 647 nm (azul, amarillo y rojo), por lo que permite el empleo de diversos
fluoróforos en la misma muestra. El sistema de filtrado de las longitudes de onda incidente y emitida
se realiza como en el microscopio de fluorescencia, a través de filtros y espejos dicroicos específicos
según los fluoróforos empleados. La luz emitida por el fluoróforo estará compuesta por distintas
longitudes de onda, que serán separadas por espejos dicroicos, por lo que cada longitud de onda es
registrada en un fotodetector diferente (ver Figura 3).
Figura 3. Funcionamiento del microscopio confocal (extraído de [4]).
En sistemas más modernos, los filtros y espejos dicroicos están siendo sustituidos por filtros
dinámicos, resultan más eficaces y pueden ser programados por el usuario para seleccionar diferentes
longitudes de onda en función de las necesidades de cada estudio, logrando discriminar hasta cuatro
colores de emisión.
La resolución horizontal del microscopio confocal es ligeramente superior a la de los microscopios
de luz transmitida y de fluorescencia. Existe un incremento teórico de un 30% en la resolución axial
La Neuroimagen Microscópica
10
respecto al microscopio de fluorescencia, pero en conjunto, el sistema confocal presenta un
importante aumento de la resolución tanto horizontal como axial, debido a la obtención de imágenes
confocales que recogen la señal de un único plano de foco, que representa un espesor reducido de la
muestra. Este espesor dependerá del objetivo empleado y de la apertura o pinhole seleccionado,
alcanzando valores mínimos de 0,5 µm empleando objetivos de alta apertura numérica y reducido
diámetro. La ausencia de estructuras fuera de foco permite una mayor definición de la imagen, que se
traduce en una mayor resolución. Estas imágenes se denominan secciones ópticas, y pueden ser
tomadas a diferentes profundidades del tejido, generando una serie de rodajas o secciones que
permiten la reconstrucción y análisis tridimensional del tejido estudiado.
2.5 Aplicaciones de la microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia ha visto una enorme expansión en las últimas décadas, gracias al
desarrollo y aplicación de múltiples sustancias fluorescentes que se emplean como marcadores
estructurales o como indicadores del estado fisiológico y de la actividad metabólica.
La posibilidad de emplear varios fluoróforos simultáneamente es una de las ventajas fundamentales
de la microscopía de fluorescencia. La emisión de estos distintos fluoróforos puede ser separada
mediante filtros y espejos dicroicos presentes en los sistemas de microscopía de fluorescencia. Se
pueden obtener dobles y triples marcajes, empleando fluoróforos con emisión en longitudes de onda
correspondientes al azul, el verde y el rojo, y mediante el empleo de filtros dinámicos se pueden
separar hasta cuatro emisiones que incluyen el color amarillo. La suma digital de las imágenes
resultantes de cada emisión produce la mezcla de colores allí donde existe la co-localización de
antígenos, de forma que la co-localización de dos sustancias marcadas con rojo y verde dará lugar al
amarillo.
El empleo de proteínas fluorescentes de origen biológico como la proteína fluorescente verde (GFP,
Green fluorescent protein), en combinación con técnicas de modificación genética, ha dado lugar a
nuevas estrategias de marcaje celular. El gen de esta proteína fluorescente puede ser introducido en el
núcleo de las células diana mediante infección vírica o transfección, de modo que su expresión dará
lugar al marcaje fluorescente de las células donde se ha incorporado. Habitualmente, el gen se
introduce en las células asociado a otro gen, de forma que las células que expresan el gen introducido
aparecerán fluorescentes por la expresión de GFP. Otra posibilidad es generar animales transgénicos
que presentan expresión de GFP asociada a la expresión de un determinado gen, lo que permite
identificar la población celular que expresa un gen en particular por la presencia de fluorescencia. Se
han generado otras proteínas similares, como la BFP o YFP, que emiten fluorescencia en el rango del
azul y el amarillo, lo que permite combinar estos marcadores para obtener información sobre la
expresión de varios genes simultáneamente.
A partir de 1950, el desarrollo de la microscopía electrónica, y posteriormente la microscopía de
fluorescencia, junto al desarrollo de marcadores fluorescentes, permite visualizar los procesos
biológicos en tiempo real, con un alto nivel de resolución espacial y temporal, y acceder a la
ultraestructura subcelular del tejido nervioso. Con toda seguridad la neuroimagen tal como se conoce
actualmente va a sufrir una importante transformación de la mano del desarrollo tecnológico, que va
a permitir emplear nuevas formas de iluminación con láser y sistemas de control y análisis digital,
ofreciendo importantes mejoras en la resolución y capacidad de análisis del tejido nervioso [4].
11 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
3 ESTADO DEL ARTE
a mayoría de científicos en el campo médico continúa haciendo uso de los tradicionales
métodos in-vivo e in-vitro como herramienta fundamental en el estudio de sistemas biológicos.
Estos métodos se consideran de gran importancia para las ciencias experimentales, pero tienen
notables limitaciones, en especial cuando el objeto de estudio se centra en sistemas complejos, como
las interacciones neuronales.
La adquisición de datos en laboratorio por medio de microscopía, y la visualización de las neuronas,
sus partes y conexiones, así como la obtención de la información morfológica de una neurona (tales
como la densidad de dendritas, orientaciones y extensión de las mismas, etcétera), constituye un
papel determinante para conocer la función de las neuronas [3]. Pero se trata de un proceso costoso
en tiempo y esfuerzo [4], sujeto al error y sesgo humano, y que, en la práctica, se realiza de manera
manual.
En los últimos tiempos se han desarrollado herramientas y métodos para segmentación de neuronas.
A continuación comentamos algunos de ellos, así como algunas herramientas comerciales
relacionadas con el proyecto presentado.
3.1 Detección de espinas dendríticas mediante filtrado morfológico direccional y método del camino más corto.
Introduce un método nuevo de extracción de espinas dendríticas basado en un proceso iterativo que
combina suavizado y extracción. Dicho método se divide en los siguientes pasos [6]:
Eliminación de ruido, utilizando un filtro de mediana.
Extracción del esqueleto de la dendrita, mediante un método iterativo que combina un
filtrado morfológico direccional y un filtrado hessiano mejorado para el refinamiento del
resultado (realiza una conexión de las partes de la dendrita que hubieran quedado separadas
tras el procesado).
Detección del borde de la dendrita, mediante un método de cálculo del camino más corto
(shortest path).
Una vez obtenidos los límites o bordes de las dendritas, las espinas dendríticas son aisladas
directamente. El algoritmo separa iterativamente dendritas y espinas dendríticas, y realiza
una conexión en las partes de la dendrita que hubieran quedado separadas tras el procesado.
L
Estado del Arte
12
Figura 4. Detección de espinas dendríticas (en rojo) (extraído de [6]).
Este método obtiene resultados notablemente buenos en la extracción de espinas dendríticas. No
obstante, hay que destacar que las imágenes con las que trabaja no son similares a las proporcionadas
por el Hospital Virgen Macarena para la realización de este proyecto, pues contienen únicamente
dendritas (no hay soma), y la extracción del árbol dendrítico resulta una tarea simple. Además, el
filtrado de mediana emborronaría los bordes de la imagen.
3.2 Detección de espinas dendríticas en imágenes XRMT
Detecta espinas dendríticas en imágenes de volúmenes microtomográficos obtenidos por rayos X (X-
rays micro-tomography, XRMT). El método sigue los pasos detallados a continuación [7]:
Extracción del eje central de la dendrita. Utiliza un método multiescalar basado en el
Hessiano. Para cada escala S, la matriz hessiana se calcula mediante una convolución de la
imagen con la segunda derivada de la función gaussiana de desviación estándar S.
Detección de la dendrita. Se elimina el ruido del eje central de la dendrita aplicando la
transformada de Hough en tres dimensiones. La dendrita es reconstruída aplicando un
proceso de dilatación condicionada, con un elemento estructural de tipo disco, de tamaño
prefijado.
Detección de espinas. Una vez detectadas las dendritas, se define una máscara donde deben
de aparecer las espinas dendríticas. Esta máscara se obtendrá aplicando una dilatación a la
reconstrucción de las dendritas del paso anterior. El tamaño del disco que se utiliza como
elemento estructural es función de la resolución de la imagen y de la máxima distancia entre
una espina y su dendrita.
13 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Figura 5. Dendritas (verde) y espinas dendríticas (rojo), extraído de [7].
El problema que surge de aplicar operaciones morfológicas con estructuras de tamaño fijo es que,
para diferentes grosores o tamaños en la imagen, el método no será válido.
3.3 NeuronStudio (software no comercial)
Detecta dendritas y espinas dendríticas automáticamente, analiza su forma y clasifica a las espinas
dendríticas de imágenes de microscopio multifotón (LSM, Laser Scanning Microscopy) [8].
Utiliza umbralización local adaptativa, clustering y muestreo Rayburst para generar un perfil de
estimaciones de los diámetros, que será utilizado, como en [7] para clasificar las espinas según su
tipo de morfología.
Figura 6. Un ejemplo de los resultados obtenidos con el software NeuronStudio. Extraído de [8].
Un problema de este método es que, al basar la detección de las espinas en una detección previa de
las dendritas (las imágenes que utiliza no son de neuronas completas), algunas espinas se omitirán y
Estado del Arte
14
no serán detectadas como tales, como se señala en [7].
3.4 SpineLab (software comercial)
Reconstruye el esqueleto neuronal a partir de imágenes 3D de pilas de imágenes de microscopio
multifotón. Crea un esqueleto de características, y ofrece la posibilidad de hacerlo de dos maneras
distintas: automáticamente o con interacción manual (reajuste de los parámetros mediante
“realimentación visual” [9]). El resultado obtenido (el esqueleto) puede ser modificado a mano.
SpineLab está basado en el software de reconstrucción morfológica NeuRA2 (Algoritmo de
reconstrucción neuronal NeuRA) [9]. Combina reducción de ruido simple y operadores de
segmentación, como filtrado de mediana o segmentación global, y también filtros de difusión
anisotrópica.
El proceso se divide en los siguientes pasos:
Pre-procesado de las pilas de imágenes 3D, aplicando un filtro de mediana con tamaño de
vecindad pequeño para reducir ruido (emborronará bordes). Posteriormente, las imágenes se
ajustan al valor máximo de la proyección sobre el eje Z.
Generación de Neuronal Feature Skeletons. Se segmentan las proyecciones de las pilas de
imágenes, y las líneas centrales de las regiones segmentadas se extraen utilizando el método
Augmented Fast Marching de Telea, detectando los bordes de las partes segmentadas en la
imagen.Se genera entonces un grafo que contiene nodos y bordes conectando los nodos.
Obtención de características (como tamaño y volumen de las espinas). El volumen de las
espinas sólo podrá ser calculado si se encuentran orientados en la dirección de los ejes X
o Y (no en la de Z). Para la separación Dendrita / Espinas dendríticas se utiliza el
algoritmo de reconstrucción neuronal NeuRA2 (algoritmo Marching-Cubes). El volumen
de las espinas es calculado usando el Teorema de la Divergencia de Gauss.
Figura 7. Extracción del esqueleto [9].
15 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Las imágenes son obtenidas por una técnica diferente (microscopio multifotón), y es apreciable que
se trata de imágenes de dendritas (y no de neuronas completas).
3.5 SynD (software comercial)
Análisis automático de la imagen basado en un algoritmo que implementa filtros orientados y
deconvoluciones para analizar las dendritas y las características de las sinapsis en imágenes de
inmunofluorescencia de microscopio confocal LSM. Se obtiene la morfología de la dendrita, el
tamaño y número de la sinapsis, y acumulación de proteínas en la sinapsis, en función de la distancia
al soma.
Filtro paso-bajo mediante un filtro adaptativo de Wiener para reducir ruido. Utiliza vecindad
7x7 y asume una distribución gaussiana del ruido. El problema asociado a esto es, una vez
más, que emborrona los bordes de la imagen.
Se umbraliza la imagen, para separar fondo y neurona. En las imágenes utilizadas para
nuestro proyecto, la umbralización tendría consecuencias negativas, puesto que muchos de
los niveles de gris son muy bajos y se confundirían fondo y neurona.
Para la separación soma - neuritas (axón, dendritas), se realiza una operación morfológica de
apertura (erosión más dilatación) con un elemento estructural tipo disco de radio 15. Un
radio y un elemento estructural fijos no sirven para imágenes con neuronas de características
muy diversas en cuanto a tamaños, intensidad, grosor… como las que nos ocupan.
Se colocan arbitrariamente diez regiones de interés (no solapadas) sobre el soma para
cuantificar la expresión de la proteína con la que previamente se realizara el marcaje. El
problema es que, dado que la umbralización no tendrá buenos resultados en nuestras
imágenes, el soma no podrá ser aislado.
Para la detección de las neuritas, comenzando desde el soma, se aplica un filtro orientado que
busca crestas brillantes rodeadas de regiones oscuras. El filtro orientado se basa en la
derivada de orden dos de la función gaussiana, y la dirección óptima de orientación del filtro
es calculada utilizando la matriz hessiana.
Por último, las sinapsis son detectadas en un proceso de umbralización y deconvolución.
Figura 8. Diagrama de bloques del algoritmo utilizado por SynD. Extraído de [3].
La Herramienta Software
16
4 LA HERRAMIENTA SOFTWARE
n esta sección describimos en detalle la herramienta software presentada, así como el algoritmo
implementado para la detección del árbol dendrítico .
4.1 El Algoritmo
El método implementado para la detección de dendritas en imágenes de microscopio confocal se
basa en la técnica propuesta en [10] para detección de pelos en imágenes dermatoscópicas, dado el
parecido entre las secciones transversales de las estructuras dendríticas y las líneas de pelos en
imágenes de dos dimensiones. Considerando el hecho de que la sección transversal de una dendrita
puede ser modelada como una función gaussiana, una serie de filtros de forma gaussiana pueden ser
utilizados para “adaptarse” a las dendritas con el objetivo de detectarlas, como ya se hiciera
anteriormente con vasos sanguíneos o pelos [10][11]. El método no ha sido utilizado antes para la
segmentación de la morfología neuronal.
La imagen original es filtrada inicialmente, para eliminar posible ruido existente, con un filtro de
difusión anisotrópico, especialmente útil en la reconstrucción de estructuras fibrilares y la
eliminación de ruido en las zonas de alto gradiente de una imagen [12]. Por tanto se elimina el ruido
preservando los bordes de la imagen.
La detección de dendritas se llevaba a cabo con un método basado en un conjunto de filtros
adaptados. Primero aplicamos un filtro adaptado gaussiano (MGF, por sus siglas en inglés: Matched
Gaussian Filter), útil por su simplicidad y efectividad. Será necesaria la posterior aplicación de un
segundo filtro, el filtro de la primera derivada de la función gaussiana (FDOG, por sus siglas en
inglés: First-order Derivative Of Gaussian), que ajustará el valor de algunos de los parámetros que
utiliza el filtro MGF, corrigiendo detalles que el MGF no contempla.
E
17 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Figura 9. Los dos filtros utilizados: MGF (arriba) y FDOG (abajo). (Extraído de [11]).
4.1.1 Filtro adaptado MGF
El filtro MGF detecta dendritas mediante el filtrado de la imagen original y la posterior
umbralización del resultado. Se basa en una aproximación de la sección transversal de las dendritas a
la función de distribución gaussiana. El filtro adaptado gaussiano se define en [11] como:
𝑓(𝑥, 𝑦) = 1
√2𝜋𝑠exp (−
𝑥2
2𝑠2) − 𝑚, |𝑥| ≤ 𝑡 · 𝑠, |𝑦| ≤𝐿
2 (1)
Donde 𝑠 representa la escala del filtro, 𝑚 se utiliza para normalizar el valor medio del filtro a 0 (y
hacer posible la eliminación del fondo después del filtrado), y 𝐿 es el tamaño de la vecindad a lo
largo del eje Y, para suavizar el ruido, que dependerá del valor de s (cuando la escala del filtro sea
pequeña, L se ajustará a un valor relativamente pequeño). El parámetro 𝑡 será una constante
relacionada con la desviación estándar de la función gaussiana, normalmente ajustada al valor 3
debido a que más del 99% del área bajo la curva de Gauss se encuentra entre los límites de esa
desviación [10].
Un problema conocido de este filtro adaptado gaussiano es que no sólo detectará formas dendríticas,
sino también bordes del núcleo. Esto se debe a que el filtro tendrá, en cierta medida, respuestas
positivas también en bordes bruscos (ver Figura 10-b). Para evitar esto, el algoritmo introduce un
segundo filtrado: los filtros de la primera derivada de la función gaussiana (FDOG), que servirán
para determinar con mayor precisión qué bordes no pertenecen a dendritas.
La Herramienta Software
18
4.1.2 Filtro de la primera derivada gaussiana FDOG
El resultado del filtrado MGF no será útil, por sí solo, para distinguir estructuras dendríticas. La
respuesta de una función gaussiana (aproximamos las dendritas a una función gaussiana) al filtro
MGF será fuertemente positiva, pero la respuesta de dicha función gaussiana al filtro FDOG será
antisimétrica (ver Figura 10-b). Aprovecharemos esta particularidad para descartar bordes (no
pertenecientes a dendritas) que tuvieran respuesta positiva al filtro MGF.
Figura 10. Respuestas a los filtros MGF y FDOG para una sección transversal gaussiana y un borde escalón ideal. (a)
Funciones a las que se aplican los filtros (a la izquierda, función gaussiana; a la derecha, función escalón ideal), (b)
respuestas al filtro MGC, (c) valor medio local de las respuestas al filtro FDOG (𝑑𝑚). (Extraído de [11]).
19 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
El filtro FDOG se obtiene directamente derivando en (1):
𝑔(𝑥, 𝑦) = 1
√2𝜋𝑠3 𝑒𝑥𝑝 (−𝑥2
2𝑠2) , |𝑥| ≤ 𝑡 · 𝑠, |𝑦| ≤𝐿
2 (2)
La respuesta al filtro FDOG será muy cambiante y no será válida para localizar estructuras, por lo
que es necesario hacer uso del valor medio local de la respuesta de la imagen al filtro FDOG (y no
de su respuesta directamente), que llamaremos 𝒅𝒎. En esta media local, el valor de cada píxel queda
definido por el valor medio de los píxeles vecinos. Llamemos 𝑇 al umbral utilizado para distinguir
entre estructuras dendríticas y fondo o soma. Dicho umbral se aplica a la respuesta de la imagen al
filtro MGF, pero 𝑇 se ajusta en base a la respuesta de la imagen al filtro FDOG.
Como veremos más adelante, si el valor de 𝑑𝑚 es bajo en cierto punto, existirá en la vecindad de este
píxel una estructura de tipo dendrítica (ver Figura 11), y 𝑇 se ajustará pequeño para detectar las
dendritas. El umbral 𝑇 dependerá directamente de 𝑑𝑚 y de un umbral de referencia 𝑇𝑐 [11]. El
umbral 𝑇𝑐 depende, a su vez, de la respuesta de la imagen al filtro MGF y a un valor 𝑐 que en la
herramienta software presentada es ajustable por el usuario experto (aunque ajustada por defecto al
valor 10, por los resultados experimentales obtenidos), ya que el resultado puede variar en función de
la imagen.
El filtrado se llevará a cabo con diferentes escalas (para buscar dendritas de diferente grosor), por lo
que será necesaria la sucesiva aplicación del filtro con diferentes valores en el parámetro 𝑠.
Además, será necesario aplicar el filtro en diferentes orientaciones (para encontrar dendritas en todas
ellas), por lo que se aplica la siguiente rotación:
𝑓𝜃(𝑥′, 𝑦′) = 𝑓(𝑥, 𝑦) (3)
donde 𝑥′ = 𝑥 · 𝑐𝑜𝑠𝜃 + 𝑦 · 𝑠𝑒𝑛𝜃 e 𝑦′ = 𝑦 · 𝑐𝑜𝑠𝜃 − 𝑥 · 𝑠𝑒𝑛𝜃.
Después de filtrar la imagen neuronal con los filtros MGF y FDOG, se obtendrán dos imágenes
respuesta: 𝐻 (respuesta al filtro MGF) y 𝐷 (respuesta al FDOG). La imagen de media local de la
respuesta 𝐷 se calcula filtrando 𝐷 con un filtro de mediana:
𝐷𝑚 = 𝐷 ∗ 𝑊 (4)
donde 𝑊 es un filtro 𝑤 × 𝑤 cuyos elementos son todos 1
𝑤2 [11]. Tras esto, la imagen de media local
se normaliza para que sus elementos se encuentren en [0, 1]. Llamemos �̅�𝑚 a la imagen normalizada
de 𝐷𝑚. El umbral 𝑇 (utilizado para detectar las dendritas) se obtiene como:
𝑇 = (1 + �̅�𝑚) · 𝑇𝑐 (5)
siendo 𝑇𝑐 un valor umbral de referencia, que depende del valor medio de la imagen respuesta 𝐻 y de
la constante 𝑐 (ajustada a 10 por defecto).
4.1.3 Segmentación de dendritas
Finalmente, aplicando 𝑇 a la respuesta de la imagen al filtro MGF (𝐻), obtendremos el plano
dendrítico definitivo 𝑀𝐻 tal como sigue:
𝑀𝐻 = {0, 𝐻(𝑥, 𝑦) < 𝑇(𝑥, 𝑦)1, 𝐻(𝑥, 𝑦) ≥ 𝑇(𝑥, 𝑦)
(6)
De las ecuaciones anteriormente presentadas podemos concluir que, si existe una dendrita en la
imagen, entonces en la zona correspondiente la magnitud de �̅�𝑚 será baja, y por tanto el umbral 𝑇
será disminuido. De esta forma, las dendritas serán detectadas de manera simple por (6).
En la Figura 11 (�̅�𝑚 para cierta imagen), es apreciable cómo en la zona donde se encuentra el núcleo
de la neurona, la magnitud de �̅�𝑚 es más alta.
La Herramienta Software
20
Figura 11. Último paso antes de la segmentación para cierta imagen. A la izquierda, imagen original. A la derecha,
valor normalizado de la imagen de media local (𝐷𝑚) de la respuesta al filtro FDOG (𝐷): �̅�𝑚. La zona cercana al núcleo
tiene valores más altos.
4.2 Interfaz Gráfica de Usuario (GUI)
La herramienta presentada ha sido desarrollada con el software MATLAB® R2014a y Guided User
Interface (GUI). Ha sido diseñada para un manejo simple (sin ningún conocimiento informático
previo) por parte de los investigadores y científicos para los que está destinada. Se encuentra en una
versión de prueba, sujeta a cambios y en constante desarrollo.
La interfaz está dividida en ventanas de manejo intuitivo. Dispone de una ventana principal desde la
cual es posible cargar una imagen para su segmentación automática, y un pulsador para dar
comienzo al procesado de la imagen. Es posible elegir el plano de la imagen sobre el que se quiere
trabajar.
Asimismo, dispone de la posibilidad de cargar una imagen verdad de referencia para una posible
comprobación de resultados estadísticos, tales como la sensibilidad, especificidad o la precisión.
Una vez terminado el proceso de segmentación, es posible visualizar, en diferentes ventanas, el
resultado de la segmentación, la densidad dendrítica (en porcentaje) en la imagen, el esqueleto del
mapa dendrítico, o los ya comentados resultados estadísticos. Estos resultados pueden ser importados
a un fichero de texto, y las imágenes resultado obtenidas pueden ser guardadas en diferentes
formatos (TIFF, JPEG).
21 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Figura 12. Ventana principal de la primera versión del software.
Figura 13. Un ejemplo de la herramienta presentada.
Resultados
22
5 RESULTADOS
Para la validación de la herramienta, se utilizaron 30 stacks (pilas) de imágenes de neuronas de ratón,
proporcionadas por el Hospital Universitario Virgen Macarena. Las imágenes, obtenidas mediante
microscopía confocal, contienen un número indeterminado de neuronas.
Así mismo, para la obtención de medidas estadísticas, un experto dibujó una imagen verdad de
referencia (ground truth), con segmentaciones manuales, para cada una de las imágenes utilizadas en
la validación. Los valores numéricos empleados para la medición objetiva de la eficacia del
algoritmo fueron:
Sensibilidad: La sensibilidad caracteriza la capacidad del algoritmo para detectar dendritas en
aquellos puntos donde éstas existen. Se define como:
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (%) = (𝑉𝑃
𝑉𝑃+𝐹𝑁) · 100
Especificidad: Caracteriza la capacidad del algoritmo para detectar la ausencia de dendritas
en aquellos puntos donde no existan dendritas. Se define como:
𝐸𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 (%) = (𝑉𝑁
𝑉𝑁 + 𝐹𝑃) · 100
Precisión: muestra la exactitud de nuestro algoritmo en la extracción de dendritas. Se define:
𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛 (%) = (𝑉𝑃 + 𝑉𝑁
𝑉𝑃 + 𝐹𝑁 + 𝐹𝑃 + 𝑉𝑁) · 100
Se obtuvieron los resultados para cada una de las 30 imágenes. La siguiente tabla muestra la media
de los valores calculados:
(%) Sensibilidad Especificidad Precisión
Técnica propuesta 80.83 98.67 98.12
Tabla 1. Medidas de la precisión media de la segmentación para detección de dendritas en 30 imágenes.
A continuación se presentan algunos de los resultados obtenidos:
23 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Resultados
24
25 Segmentación automática del árbol dendrítico en neuroimágenes de microscopía confocal
Figura 14. Algunos resultados obtenidos (derecha) para imágenes originales (izquierda).
Es preciso hacer hincapié en la complejidad de las imágenes y las diferencias entre ellas: somas de
tamaños variados, núcleos que aparecen en el borde, dendritas de planos más profundos (aparecen
con menor intensidad en la imagen), neuronas superpuestas, etcétera. El algoritmo no responde con
la misma precisión a todas ellas, sin embargo, los resultados son objetivamente satisfactorios.
Conclusiones y Trabajo Futuro
26
6 CONCLUSIONES Y TRABAJO FUTURO
6.1 Conclusiones
Para alcanzar los resultados presentados, se llevó a cabo un estudio previo de la viabilidad de otras
técnicas y métodos para tratamiento de imagen (operaciones morfológicas, filtrado top-hat, filtrado
en base a la varianza de la imagen…) que no dieron resultado. El algoritmo implementado
finalmente ha permitido alcanzar los objetivos planteados al comienzo del proyecto. La herramienta
diseñada extrae el árbol dendrítico en imágenes de neuronas obtenidas mediante microscopía
confocal, y facilita el trabajo del investigador. Una versión de la misma ha sido presentada, para su
próximo uso, a los trabajadores del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla que
colaboraron en el proyecto.
6.2 Trabajo futuro
Como línea de trabajo futuro, se propone un ajuste en la detección de espinas dendríticas, que
presenta gran complejidad por el tamaño de las mismas en la imagen original. Así mismo, no se
descarta la inclusión de otras funcionalidades que faciliten la tarea del investigador, como el cálculo
de la intensidad media de las dendritas en los diferentes planos de la imagen, o el porcentaje de
proteína presente en la muestra.
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REFERENCIAS
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