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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Trabajo de Investigación Tipo I
“VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO UV
PARA LA CUANTIFICACIÓN DE DIMENHIDRINATO EN
TABLETAS DE 50 mg”
AUTORES:
RODRÍGUEZ ALIAGA, ROSITA LISSET
RODRÍGUEZ PINEDO, CLAUDIA JOSEFINA
ASESOR:
Dr. ALVA PLASENCIA, PEDRO MARCELO
TRUJILLO-PERÚ
2011
Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
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JURADO EVALUADOR
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Mg. Jave Morales, Nelly
PRESIDENTE
_ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Mg. Saavedra Suárez, Francisco
MIEMBRO
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Dr. Alva Plasencia, Pedro
MIEMBRO
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DEDICATORIA
A nuestros padres por su apoyo incondicional,
por inculcarnos a seguir el buen camino de estudio,
la perseverancia para culminar satisfactoriamente
nuestra carrera profesional.
A nuestro asesor Dr. Pedro Alva
Plasencia por su valiosa y
desinteresada colaboración en el
desarrollo y culminación del presente
trabajo.
Claudia y Rosita
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AGRADECIMIENTO
Nuestro profundo agradecimiento a Dios por darnos la oportunidad
de cumplir con este trabajo, y a nuestro asesor Pedro Alva
Plasencia por su valioso asesoramiento
Claudia y Rosita
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ÍNDICE
ABSTRAT……………………………………….……………………….............. i
RESUMEN……………………………………………………………….............. ii
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….......... 1
II. MATERIAL Y MÉTODO………………………………………....………...... 7
III. RESULTADOS.………………………………………………………............ 18
IV. DISCUCIÓN.………………………………………………………................ 23
V. CONCLUSIÓN.………………………………………………………............. 26
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………….… 27
ANEXOS …………………………………………………………………………. 30
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ABSTRAT
The parameters for the validation of a validation of a spectrofotometric
method UV for the quantification of dimenhidrinato in 50 were determined
tablets of mg. The analysis of Dimenhidrinato 50 was made mg tablets lot
0010019. Water distilled like dissolvent was used.
The test of Linearity presented/displayed a correlation coefficient de1; the
Statistical Test of Linearity and the Factor Answer, expressed conformity.
When evaluating the Precision, in the test of the repeatability as much
obtained standard deviations to two concentrations for the system as for the
method respectively: RSD 90% = 0.756522869, RSD 110% =0,427672703 and
RSD 90% = 0.891352366, RSD 110% = 0,698070408. In the reproducibility the
coefficient of variation as much of the method as of the system was statistically
similar results in 2 different analysts and different days.
For the study of Exactitude, the percentage of Recovery of the method
was of 98,83% and 100,45% for the system. In Test G of Cochran experimental
G smaller was obtained than G tables (0.7977), of 0.496484277 and
0.095419579 for the standard and the sample respectively. For statistical test t
of Student experimental t smaller was obtained than t table (2,306004133), of
-0,674428225 and 1.831640499 for the standard and the sample respectively;
reason why the exactitude is correct according to its respective specifications.
The method used in the present report demonstrated to be specific to
determine the analito between the excipients, the samples were put under
degradation by UV, oxidation and basic acid hydrolysis and. The certain
parameters of renewal allow to give like validated to spectrofotometric method
UV for the quantification of dimenhidrinato in tablets of 50mg.
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RESUMEN
Se determinaron los parámetros para la validación de un validación de un
método espectrofotométrico UV para la cuantificación de dimenhidrinato en
tabletas de 50 mg.
Se realizó el análisis de Dimenhidrinato 50 mg tabletas lote 0010019. Se utilizó
agua destilada como disolvente. El ensayo de Linealidad presentó un
coeficiente de correlación de1; el Test Estadístico de Linealidad y el Factor
Respuesta, expresaron conformidad.
Al evaluar la Precisión, en el ensayo de la repetibilidad se obtuvo desviaciones
estándar a dos concentraciones tanto para el sistema como para el método
respectivamente: RSD 90% = 0,756522869, RSD 110% =0,427672703 y RSD
90% = 0,891352366, RSD 110% = 0,698070408. En la reproducibilidad el
coeficiente de variación tanto del método como del sistema se encontró
resultados estadísticamente similares en 2 analistas diferentes y en diferentes
días.
Para el estudio de Exactitud, el porcentaje de Recuperación del método fue de
98.83% y de 100.45% para el sistema. En el Test G de Cochran se obtuvo G
experimental menor que G tablas (0.7977), de 0,496484277 y 0,095419579
para el estándar y la muestra respectivamente. Para el ensayo estadístico t de
Student se obtuvo t experimental menor que t tabla (2,3060041333), de
-0,674428225 y 1,831640499 para el estándar y la muestra respectivamente;
por lo que la exactitud es correcta según sus respectivas especificaciones.
El método utilizado en el presente informe demostró ser específico para
determinar el analito entre los excipientes, las muestras fueron sometidas a
degradación por UV, oxidación e hidrólisis ácida y básica.
Los parámetros de revalidación determinados permiten dar como validado al
método espectrofotométrico UV para la cuantificación de dimenhidrinato en
tabletas de 50 mg.
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I. INTRODUCCIÓN
La industria farmacéutica consciente de su alta responsabilidad,
actúa siempre buscando la calidad del medicamento a lo largo del
proceso que lo crea1.
El desarrollo de técnicas analíticas novedosas es un problema
cotidiano. Siempre que esto sucede se exige como parte integral del
estudio la validación del método en cuestión2.
Mediante un proceso de validación, ya sea de carácter prospectivo,
retrospectivo o de revalidación, ésta garantiza la calidad de los análisis,
puestos que les confiere fiabilidad a los resultados obtenidos. Se
pueden validar técnicas analíticas, procesos de fabricación y
limpieza.3,4.
La validación de los métodos analíticos se fundamenta en la
determinación de diversos parámetros, que se aplican de acuerdo con
la categoría a la que pertenezcan4.
Según la USP XXXII los métodos analíticos se clasifican en varias
categorías para su validación. Los métodos que son objeto de estudio
en el presente trabajo pertenecen a la categoría I y se clasifican como
"métodos analíticos para la cuantificación de los principales
componentes del fármaco, o de los principios activos en productos
farmacéuticos terminados4.
Para realizar una validación efectiva del método analítico se
necesita de las características de desempeño del método las cuales se
expresan en función de los parámetros: selectividad, linealidad, rango,
precisión y exactitud4.
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La especificidad se define como la capacidad de un método para
determinar el contenido de un analito inequívocamente en presencia de
otros componentes (impurezas, matriz, etc.). Se considera que la
especificidad es 100% de la selectividad.5
Linealidad, es la capacidad del método analítico para obtener
resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad
del analito en un rango definido. Se determina mediante el tratamiento
matemático de los resultados obtenidos en el análisis del analito a
diferentes cantidades o concentraciones. La selección del rango y del
número de puntos experimentales está estrictamente relacionada con
la aplicación del método6,7,8.
Precisión, refleja la medida en que los valores de una serie repetida
de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea
son semejantes entre sí. Aunque la USP XXXII expresa que la
precisión es la expresión del grado de la reproducibilidad, la Norma
Británica incluye la repetibilidad y la reproducibilidad.
a) Repetibilidad. Refleja la precisión de un método, cuando se
desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra,
analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los
mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en
un período corto.
b) Reproducibilidad. Estudia la variabilidad del método bajo
condiciones operativas diferentes en laboratorios diferentes 7,8.
Otro parámetro es la Exactitud, que indica la capacidad del
método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al
valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error
aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él.
Cuando existen interferencias en el método por falta de selectividad
(desviación por exceso en los resultados), o cuando se trata de
métodos analíticos muy laboriosos, con varias etapas, como
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extracciones, purificaciones, entre otros (desviación por defecto en los
resultados), el método se considera no exacto. Para asegurar una
buena exactitud, según Martin-Smith y Rudd, es necesario eliminar los
errores que no están sujetos a tratamiento estadístico (calibración o
control incorrectos de equipos), los errores inherentes a blancos
(errores constantes) y los que dependen de la cantidad del analito
presente (errores proporcionales). Ellos opinan que la mejor manera de
identificar estos errores será realizando una prueba inter laboratorio, es
decir el trabajo realizado con el mismo método en diferentes
laboratorios9,10.
El rango se define como el intervalo entre la concentración
superior e inferior de analito para el cual se ha demostrado la correcta
precisión, exactitud y linealidad del método descrito. El intervalo de un
procedimiento analítico es la amplitud entre las concentraciones
inferiores y superior de analito en el cual se puede determinar al analito
con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad utilizando el
procedimiento según se describe por escrito. El intervalo normalmente
se expresa en las mismas unidades que los resultados de la prueba
obtenidos mediante el procedimiento analítico. El intervalo del
procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico
proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se
aplica a las muestras que contienen el analito en los extremos del
intervalo al igual que dentro del intervalo10,11,12
La investigación científica de los últimos tiempos esta apoyada y
facilitada por los métodos instrumentales y de análisis; los cuales,
entre sus diversas ventajas, incluyen el hecho de requerir cantidades
de muestra cada vez mas reducidas, así como también la rapidez con
que se realizan los procedimientos de cálculos mediante computadoras
incorporadas a ellos.
Muchos son los métodos analíticas utilizados para cuantificar
principios medicamentosos, desde los más sofisticados y costosos
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(HPLC, espectrometría de masa), hasta los más rápidos y baratos
(volumetría y espectrofotometría UV/VIS)
La espectrofotometría de absorción es una de ellas y tiene como
principio básico, la medida de la radiación que llega a un detector tras
producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia
absorbente. La espectrofotometría de absorción comprende las
regiones de longitud de onda: ultravioleta (200- 380 nm), infrarrojo
cercano (780nm -2.5um), e infrarrojo (2.5um – 40um)13.
Por otro lado en nuestro país existen una gran cantidad de
medicamentos multifuente que si bien sabemos son elaborados bajo
las normas BPM estas no convenientemente aseguran la calidad
terapéutica de los medicamentos, existiendo en nuestra población
cierta duda acerca de su eficacia. Entre estos medicamentos tenemos
al Dimenhidrinato en tabletas que es un antihistamínico derivado de la
etanolamina; químicamente, es una sal de dos sustancias:
difenhidramina y 8-cloroteofilina, se utiliza como antivertiginoso y
antiemético para prevenir y tratar las nauseas y vómitos asociadas a
los viajes en avión o en barco; por lo cual se produce en grandes
cantidades14,15.
En la actualidad el Perú no cuenta con una farmacopea establecida
por lo cual esta obligado a hacer uso Farmacopeas extranjeras, que
establecen métodos con tecnología avanzada, y por ende con costo
elevado, dificultándose de esta manera su aplicación.
Realizar el control de la calidad de dimenhidrinato en tabletas
permitirá asegurar que los medicamentos que llegan al comercio,
realmente tienen las características de calidad deseadas, siendo
necesario para ello contar con métodos de cuantificación que aseguren
resultados válidos.
La realización de un método de validación completo es una tarea
que puede ser tediosa, pero las consecuencias de no hacerlo conlleva
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a una pérdida de tiempo, dinero y recursos. Dentro de las razones que
justifican la validación de métodos analíticos se encuentran:
- Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis
propuestos en las condiciones descritas. La validación es la
herramienta que permite obtener las pruebas documentales
al respecto. - Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad en
los resultados, lo cual a su vez minimizará el número de
fallos y repeticiones permitiendo un importante ahorro de
costos15,16.
Trabajar con métodos validados permite no sólo el conocimiento del
método analítico sino también cumplir con las exigencias legales tanto
del registro de especialidades farmacéuticas como de las Buenas
Prácticas de Laboratorio, con el fin de asegurar la calidad y eficacia del
producto17.
Por lo mencionado nos planteamos el siguiente problema
¿Cumplirá las característ icas técnicas de validación el
método Espectrofotométrico UV para cuantif icación de
Dimenhidrinato en tabletas de 50 mg?
HIPÓTESIS:
Considerando que existe literatura científica que utiliza el método
espectrofotométrico UV para la cuantificación de Dimenhidrinato, el
método Espectrofotométrico UV para cuantif icación de
Dimenhidrinato en tabletas de 50 mg, cumple con las
características de validación aceptables.
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OBJETIVOS:
General
Validar el método Espectrofotométrico para la cuantificación de
Dimenhidrinato en tabletas de 50 mg
Específico
Determinar los parámetros de validación: linealidad, exactitud,
precisión y especificidad.
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II. MATERIAL Y MÉTODO
1. MATERIAL
1.1. Material de estudio.
Se muestreó 50 unidades de Dimenhidrinato 50mg en tableta, de un
mismo lote.
1.2. Material de Laboratorio.
a.- Material de vidrio.
6 fiolas de 50mL.
2 fiolas de 100mL.
5 pipetas de 5mL.
1 pipetas de 1 mL.
b.- Reactivos.
Dimenhidrinato Q.P.
Agua Bidestilada
c.- Equipo de laboratorio:
Espectrofotómetro GENESIS 10UV.
Balanza analítica.
d.- Otros:
1 pizetas
1 mortero con pilón
Etiquetas para rotular
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2. MÉTODO:
2.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
Las muestras a analizadas se obtuvieron de un Hospital Público,
elegidas al azar, con Nº de lote 01001914
2.2. MODO OPERATIVO15.
2.2.1. MÉTODO ANALÍTICO
Se trabajó adecuando el método espectrofotométrico
propuesto por Lütfi Genç, Hadi Bilaç, Erden Güler18.
A.- Preparación del Estándar
Se pesó exactamente 20mg de Dimenhidrinato Q.P. Se
disolvió en agua bidestilada, luego se aforó a 100 ml. Se
llevó a sonicar por 15 min. Se filtró, luego se tomó 5
muestras entre el intervalo de 1-5.5 ml de la solución
stock que fueron diluidas con 50ml de agua bidestilada.
Las absorbancias fueron medidas en 278.0 nm. Se
calculó la ecuación de la regresión y los coeficientes de la
regresión.
B.- Preparación de la Muestra
Se pesó 20 tabletas de Dimenhidrinato, se determinó el
peso promedio y se trituró en un mortero. Se pesó polvo
de tabletas equivalente a 20mg de Dimenhidrinato. Se
disolvió en agua bidestilada, luego se aforó a 100 ml. Se
llevó a sonicar por 15 min. Se filtró, se midió 3 ml de la
solución stock que fueron diluidas con 50ml de agua
bidestilada. Se leyó cada muestra a 278.0 nm.
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2.2.2. DESARROLLO DE LOS PARAMETROS A VALIDAR
2.2.2.1. LINEALIDAD6,7.
Linealidad del Estándar
Se prepararon muestras de trabajo a las concentraciones de:
80%, 90%, 100%, 110% y 120%.
Se pesó 16 mg, 18 mg, 20 mg, 22 mg y 24 mg
(correspondiente a cada concentración) del estándar
secundario; luego se prosiguió según el método
espectrofotométrico empleado. .
2.2.2.3. RANGO
Se prepararon muestras de trabajo a las concentraciones de:
80%, 90%, 100%, 110% y 120%.
Se pesó 16 mg, 18 mg, 20 mg, 22 mg y 24 mg
(correspondiente a cada concentración) del estándar
secundario; luego se prosiguió según el método
espectrofotométrico empleado.
2.2.2.3. EXACTITUD6
La muestra sobre la que se trabajará será preparada a
las concentraciones de 80%, 100%, y 120% del valor
teórico.
Preparación de las muestras:
Se pesó 62.64mg, 78.31mg y 93.97mg
(correspondiente a cada concentración) de
Dimenhidrinato en tabletas, y se prosiguió según el
método espectrofotométrico empleado.
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Cada concentración se preparó por triplicado y se realizó
las lecturas tres veces en el equipo procediendo según la
técnica analítica.
2.2.2.4. PRECISIÓN6
2.2.2.4.1 PRECISIÓN DEL SISTEMA (Estándar)
A. Repetibilidad
Se realizó el análisis de la muestra en validación por
quintuplicado, independientemente desde el principio activo
(preparación de la muestra) hasta el final (lectura de los
resultados) por el mismo analista y en el mismo
instrumento, en un corto intervalo de tiempo.
Preparación del estándar: Se utilizó las muestras en
validación a concentraciones de 90% y 110%, y se
procedió según método espectrofotométrico empleado.
Se preparó cinco muestras por el analista, se realizó
doble lectura por cada muestra, enjuagando (mínimo 5
veces) la celda con la muestra.
B. Reproducibilidad
Se realizó el análisis de la muestra en validación a
diferentes condiciones: diferentes analistas (mínimo dos),
diferentes días.
Preparación del Estándar: Se utilizó una muestra en
validación a concentración del 100%, se procedió
según método espectrofotométrico empleado.
Se preparó dos muestras por el analista, y se realizó
doble lectura por cada muestra, enjuagando (mínimo 5
veces) la celda con la muestra.
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2.2.2.4.1 PRECISIÓN DEL MÉTODO (Muestra)
A. Repetibilidad
Se realizó el análisis de la muestra en validación por
quintuplicado, independientemente desde el principio activo
(preparación de la muestra) hasta el final (lectura de los
resultados) por el mismo analista y en el mismo
instrumento, en un corto intervalo de tiempo.
Preparación de la muestra: Se utilizó las muestras en
validación a concentraciones de 90% y 110%, y se
procedió según método espectrofotométrico empleado.
Se preparó cinco muestras por el analista, se realizó
doble lectura por cada muestra, enjuagando (mínimo 5
veces) la celda con la muestra.
B. Reproducibilidad
Se realizó el análisis de la muestra en validación a
diferentes condiciones: diferentes analistas (mínimo dos),
diferentes días.
Preparación de la muestra: Se utilizó una muestra en
validación a concentración del 100%, se procedió
según método espectrofotométrico empleado.
Se preparó dos muestras por el analista, y se realizó
doble lectura por cada muestra, enjuagando (mínimo 5
veces) la celda con la muestra.
2.2.2.5. ESPECIFICIDAD6
Preparación de la solución stock: Se pesó 20mg de
Estándar secundario. Se disolvió en agua bidestilada, luego
se aforó a 100 ml. Se llevó a sonicar por 15 min. Se filtró,
luego se midió 3 ml de la solución stock que fueron diluidas
con 50ml de agua bidestilada.
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2.2.2.5.1. OXIDACIÓN
En una fiola de 50 mL se midió 5 mL de solución stock,
se añadió 5 gotas de Peróxido de hidrógeno, se sometió
a baño maría a 60 ºC durante 2 horas, se dejo enfriar, se
enraso con solución diluyente y se filtró.
2.2.2.5.2. HIDROLISIS ALCALINA
En una fiola de 50 mL se midió 5 mL de solución stock,
se añadió 5 mL de Hidróxido de Sodio 1N y se colocó a
ebullición con reflujo por 1 hora, se dejo enfriar y se
añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1N. Se enrasó con
solución diluyente y se filtró.
2.2.2.5.3. HIDROLISIS ÁCIDA
En una fiola de 50 mL se midió 5 mL de solución stock,
se añadió 5 mL de Ácido Clorhídrico 1N y se colocó a
ebullición con reflujo por 1 hora, se dejo enfriar y se
añadió 5 mL de Hidróxido de Sodio 1N. Se enrasó con
solución diluyente y se filtró.
Todas las muestras fueron procesadas según método
espectrofotométrico empleado.
2.2.2.5.4. FOTOLISIS
De la solución stock que fue procesada según método
espectrofotométrico empleado, se midió una alícuota la
cual fue leída a 278 nm.
Luego la misma solución fue sometida a condiciones de
degradación (irradiación UV a 250 nm por 24 horas) para
posteriormente llevar a lectura a 278 nm.
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2.3. ANALISIS DE DATOS.
Los datos obtenidos serán sometidos a análisis estadístico de
regresión lineal, test G de Cochran y test T- Student.
2.3.1. EVALUACIÓN ESTADISTICA DE LA LINEALIDAD6
2.3.1.1. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN (r)
𝒓 =∑ 𝒙𝒚 −
∑ 𝒙 ∑ 𝒚𝒏
√(∑ 𝒙 𝟐 −(∑ 𝒙)𝟐
𝒏 ) (∑ 𝒚 𝟐 −(∑ 𝒚)𝟐
𝒏 )
Donde:
x= Concentración
y= Respuesta del método (áreas, volúmenes del
titulante, absorbancias, etc.)
n= Número de análisis realizados.
Criterios de Aceptación: r mayor a 0.999
2.3.1.2. COEFICIENTE DE DETERMINACIÓN (r2)
𝒓𝟐 = (𝒓)𝟐
Criterios de Aceptación: r2 mayor a 0.999
2.3.1.3. t EXPERIMENTAL DE r
𝒕𝒆𝒙𝒑(𝒓) =|𝒓|√(𝒏 − 𝟐)
√(𝟏 − 𝒓𝟐)
Criterios de Aceptación: texp(r) mayor a t tabla para n-2
grados de libertad y una probabilidad de 95% (=0,05)
de correlación entre x e y.
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2.3.1.4. DESVIACION ESTADAR RELATIVA O COEFICIENTE
DE VARIACIÓN DE LOS FACTORES DE RESPUESTA
(CVFR)
Factores de respuesta (f)
𝒇 = (𝒚
𝒙)
En una calibración lineal los factores de respuesta son
semejantes entre si, por este motivo se considera el
CVFR.
Se hallo según la fórmula:
(𝒂) = 𝑪𝑽𝑹𝑭 = 𝑺𝒇 × 𝟏𝟎𝟎 𝑭⁄
Donde:
Sf= Desviación estándar de los factores de respuesta.
F= Promedio de los factores de respuesta
Criterios de Aceptación: menor 2 %
2.3.1.5. t EXPERIMENTAL DE LA PENDIENTE (b)
𝒕𝒆𝒙𝒑(𝒃) =|𝒃|
√𝑺𝟐 𝒃
Criterios de Aceptación: texp(b) mayor a t tablas, para
n-2 grados de libertad y una probabilidad de 95%
(=0,05) que b es diferente de cero.
Limites de Confianza de la pendiente
𝒃 ± 𝒕√𝑺𝟐𝒃
Estos límites incluyeron al punto cero.
Donde:
b= Coeficiente de regresión.
S2b= Varianza de la pendiente.
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2.3.1.6. t EXPERIMENTAL DE TERMINO INDEPENDIENTE (a)
𝒕𝒆𝒙𝒑(𝒂) =|𝒂|
√𝑺𝟐 𝒂
Criterios de Aceptación: texp(a) mayor a t tablas, para
n-2 grados de libertad y una probabilidad de 95%
(=0,05) que a es diferente de cero.
Limites de Confianza del término independiente
𝒂 ± 𝒕𝑺𝒂
Donde:
a= Término independiente de la recta.
Sa= Error estándar del término independiente
S2a= Varianza del término independiente.
2.3.2. EVALUACIÓN ESTADISTICA DE LA PRECISIÓN6
2.3.2.1.DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA O COEFICIENTE
DE VARIACIÓN (RSD)
𝑹𝑺𝑫 =𝑺 × 𝟏𝟎𝟎
𝑿
Criterios de Aceptación Máximo 2% (Repetibilidad),
Máximo 3% (Reproducibilidad)
𝑫𝑺 = 𝑺 =
𝒏(𝒙 − 𝒙)𝟐
√𝒏
Donde:
S= Desviación estándar
x= Promedio de concentraciones halladas.
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2.3.3. EVALUACIÓN ESTADISTICA DE LA EXACTITUD6
2.3.3.1. PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN (R)
𝑹 =∑(𝑹𝟏)
𝒏
Donde:
R1 = % de recuperación individual = % de recuperación
=% hallado x 100 / % agregado
N= número de análisis realizados
Criterios de Aceptación: 95% - 105%
2.3.3.2. t EXPERIMENTAL DEL VALOR MEDIO
𝒕 𝒆𝒙𝒑 =|𝟏𝟎𝟎√−𝑹|𝒙𝒏
𝑹𝑺𝑫
Donde:
R= Porcentaje de recuperación
RSD= Desviación estándar relativa de los valores
hallados en los análisis realizados
Criterios de Aceptación: texp menor a t tablas, para n-1
grados de libertad y una probabilidad del 95% (=0,05)
que los valores y el valor considerado verdadero
estadísticamente son iguales.
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2.3.3.3. G EXPERIMENTAL (TEST DE COCHRAN DE
IGUALDAD DE VARIANZAS)
𝑮𝒆𝒙𝒑 =𝑺𝟐 𝒎á𝒙𝒊𝒎𝒂
𝑺𝟐𝟏 + 𝑺𝟐𝟐 + 𝑺𝟐𝟑
Donde:
S2 máxima = máxima varianza hallada
S2 máximo= (máxima desviación estándar hallada)
S21, S22 y S23 = Varianzas halladas de cada grupo
de concentraciones.
Criterios de Aceptación: Gexp < Gtablas
Gexp < Gtablas para un 95% de probabilidad (=0,05), 3
grupos de concentraciones (K=3:80%,100% y 120%) y 3
repeticiones por grupo (n=3), de que el factor de
concentración no influirá en la variabilidad de los
resultados.
2.3.4. EVALUACIÓN DEL RANGO
El establecimiento de este parámetro se realizó después de
la evaluación de linealidad, precisión y exactitud, de
cumplirse las especificaciones para estos parámetros se
establece que el método de análisis funciona
correctamente en los extremos superior e inferior de rango.
Así como dentro de ese intervalo de concentración.
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III. RESULTADOS
TABLA 01: Parámetros estadísticos del ensayo de Linealidad para la validación de Dimenhidrinato en tabletas.
*Tabla t de Student para: p=0,005 y n-2g.l.
**Tabla G de Cochran para homogeneidad de varianzas: p=0,005, k=5 y n=3
Parámetros evaluados Criterios de aceptación Resultados
Conforme No
conforme Estándar
Coeficiente de correlación (r) Mayor 0,999 1
Coeficiente de determinación(r2) Mayor 0,999 1
t experimental de r Mayor a t de
tabla(2,160368652)* 30128097,36
Coeficiente de variación de los
factores de respuesta (CFRVR) Menor 2% 0,409829
t experimental de b Mayor a t de
tabla(2,160368652)* 30128097,36
t experimental de a Mayor a t de
tabla(2,160368652)* 805558,5073
Test de Cochran ( Homogeneidad de
las Concentraciones)
Mayor a G de tabla (0,5981) 0,025289579
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FIGURA 01: Curva de calibración del ensayo de Linealidad para la validación de Dimenhidrinato en tabletas.
y = 27,76x + 0,009R² = 1
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
0.450
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg/mL)
Curva de Calibración
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TABLA 02: Parámetros estadísticos del ensayo de Precisión para la validación de Dimenhidrinato en tabletas.
Parámetros Evaluados Criterios de Aceptación
Resultado Conforme No
conforme
REPETIBILIDAD
Coeficiente de variación (RSD)
Máx.2%
Estándar RSD 90% = 0,756522869
RSD 110% =0,427672703
Muestra RSD 90% = 0,891352366
RSD 110% = 0,698070408
REPRODUCIBILIDAD
Coeficiente de variación (RSD)
Máx. 3%
Analista A Estándar RSD 100% = 0.5868
Muestra RSD 100% = 0.0000
Analista B Estándar RSD 100% = 0.5820
Muestra RSD 100% = 0.5726
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TABLA 03: Parámetros estadísticos del ensayo de Exactitud para la validación de Dimenhidrinato en tabletas.
*Tabla t de Student para: ρ = 0.05; y n –1 g.l.
**Tabla G de Cochran para homogeneidad de varianzas: p=0,005, k=3 y n=3
Parámetros evaluados Criterios de aceptación Resultados
Conforme No
conforme Estándar Muestra
Porcentaje de
recuperación (R) 95% - 105% 100.45% 98.83%
t experimental (del valor
medio)
Menor a t tabla
(2,306004133)* -0,674428225
1,831640499
G experimental (test de
cochran) Menor a G tabla (0.7977)**
0,496484277
0,095419579
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TABLA 04: Ensayo de Efectividad (estándar secundario) para la validación de
Dimenhidrinato en tabletas
CONCENTRACIONES (mg/mL)
Estándar al 100% antes
de degradación
Hidrólisis
Ácida
Hidrólisis
Básica Oxidación
Fotolisis
(250 nm)
1 0,0208 0,0398 0,0290 0,0205 0,0208
2 0,0208 0,0398 0,0290 0,0205 0,0207
3 0,0208 0,0398 0,0290 0,0206 0,0208
TABLA 05: Ensayo de Efectividad (muestra) para la validación de
Dimenhidrinato en tabletas
CONCETRACIONES (mg/mL)
Muestra al 100%
antes de degradación
Hidrólisis
Ácida
Hidrólisis
Básica Oxidación
Fotolisis
(250 nm)
1 0,0219 0,0249 0,0356 0,0198 0,0218
2 0,0219 0,0250 0,0356 0,0198 0,0219
3 0,0219 0,0250 0,0356 0,0198 0,0218
TABLA 06: Ensayo de Rango para la validación de Dimenhidrinato en tabletas
Parámetro estudiado Resultado Criterio de Aceptación
RANGO
Establecido en base a la
evaluación de Linealidad,
Precisión y Exactitud.
El método funciona
correctamente entre 80% -
120% que fueron las
concentraciones mínima y
máxima trabajadas
Cumplir con las
especificaciones de
Linealidad, Precisión y
Exactitud.
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IV.- DISCUSIÓN
El método analítico propuesto para la cuantificación de dimenhidrinato en
tableta de 50 mg mediante espectrofotometría ultravioleta actualmente no figura
en ninguna obra oficial, por lo tanto al no estar registrado en alguna farmacopea,
debe ser validado previamente a su uso en rutina, con el fin de proporcionar un
alto grado de confianza, seguridad y calidad de los resultados, lo cual se traduce
en disminución de errores y repeticiones del análisis.6,19
En el TABLA 01 para la evaluación de la linealidad, se obtuvo un
coeficiente de correlación r igual a 1, el cual es mayor al valor mínimo aceptable
de 0,999; lo que indica una significativa correlación lineal entre la concentración y
absorbancia que reporta el analito en el análisis. Pero como la información
obtenida mediante el cálculo del coeficiente de correlación es limitado y no
justifica por sí sola la linealidad, hallamos el coeficiente de determinación (r2), que
aporta una mayor significancia estadística ya que expresa la proporción de la
variación total del método, es así que obtuvimos un r2 igual a 1, lo cual indica una
probabilidad mayor del 99% de que el porcentaje de variación de respuesta es
producida por la concentración.6,20 Este comportamiento se evidencia en forma
objetiva en la FIGURA 01.
Para comprobar que la regresión es lineal, se aplico una prueba t-student
con la finalidad de evaluar la existencia de una pendiente significativamente
diferente de cero para n–2 grados de libertad y una probabilidad de 95%. El valor t
experimental de r fue de 30128097,36 cumpliéndose que es mayor al ttabla
(2,160368652); corroborando linealidad. Debido a que en una calibración lineal
los factores de respuesta deben ser semejantes entre sí, se considero al
coeficiente de variación de los factores de respuesta (CFVR), el cual se obtuvimos
igual a 0,409829, menor al 2%; lo que indicó la linealidad entre la relación
absorbancia/concentración, reflejando la sensibilidad del calibrado.6,20
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Así mismo, hallamos un t experimental de la pendiente b igual a
30128097,36 mayor al ttabla (2,160368652), lo que significa una probabilidad del
95% que b (pendiente de la recta) sea diferente de cero. El t experimental del
término independiente a fue de 805558,5073 que es mayor al t tabla
(2,160368652), lo indicaría que la recta no pasa por el origen de las coordenadas,
comprobando de esta manera que el término independiente (valor de a ) es
estadísticamente diferentes de cero.6,20,21
En el TABLA 02 se reportan los resultados para el ensayo de precisión,
donde se evaluó en términos de repetibilidad y reproducibilidad del sistema como
del método. En el caso de precisión del sistema se evidenció un elevado grado de
concordancia entre los resultados de una serie repetida de ensayos sobre la
misma muestra a concentraciones de 90% y 110%; al igual que para la precisión
del método, demostrando así que el método es repetible al hallar las siguientes
desviaciones estándar a dos concentraciones tanto para el sistema como para el
método respectivamente RSD 90% = 0,756522869, RSD 110% =0,427672703 y
RSD 90% = 0,891352366, RSD 110% = 0,698070408; esto se traduce en
resultados estadísticamente similares bajo las mismas condiciones de operación
en intervalos cortos de tiempo. Uno de los factores que influyentes en la
repetibilidad es la concentración del analito, debido a que la desviación estándar
de las respuestas aumenta al disminuir la concentración del analito, también
depende del proceso de preparación de las muestras, es decir, a mayor
manipulación de la muestra mayor probabilidad de que la variabilidad
aumente.6,20,21
Por otra parte para determinar la reproducibilidad tanto del método como
del sistema se encontró resultados estadísticamente similares en 2 analistas
diferentes y en diferentes días. Las condiciones operativas y ambientales que
pueden influir en el ensayo de reproducibilidad abarcan humedad, temperatura
ambiental, variación de condiciones instrumentales, y reactivos de diferente
calidad.6,22
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En el TABLA 03 se presentan los resultados del ensayo de exactitud, del
sistema como del método, donde se demuestra la capacidad de dar resultados
próximos al valor verdadero. Mediante la prueba de t experimental del valor medio
se determinó, con una probabilidad de 95%, que el valor hallado y el verdadero no
difieren significativamente. A su vez a prueba de G experimental determinó con un
95% de probabilidad, que el factor concentración no influye en los resultados. El
porcentaje de recuperación del método fue de 98.83% y de 100.45% para el
sistema; El porcentaje de recuperación depende de la matriz de la muestra, la
concentración del analito en ésta y el procedimiento de preparación.6,20
Referente al parámetro de especificidad (TABLA 04 y TABLA 05), nos
permite demostrar que el método cuantifica productos de degradación por
hidrólisis ácida y básica, situación que para nuestro caso no se daría,
considerando que el método lo proponen para tabletas, que son formas
farmacéuticas secas No se evidencia alteración química del dimenhidrinato por
oxidación y fotolisis, fenómeno que, para tabletas podrían suceder.
En el TABLA 06 se detalla que para el ensayo del rango, el método
funciona correctamente entre 80% - 120% que fueron las concentraciones mínima
y máxima trabajadas, debido a que el método cumple con las especificaciones de
Linealidad, Precisión y Exactitud.6,10.
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V.- CONCLUSIÓN
Los datos recolectados, así como la evaluación estadística de los mismos,
dan como validado el método analítico por espectrofotometría ultravioleta para la
cuantificación de dimenhidrinato en tabletas de 50 mg de acuerdo a la
conformidad en los resultados de los parámetros de validación: linealidad,
precisión, exactitud, especificidad y rango.
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ANEXO Nº 01: LINEALIDAD
%
TEÓRICO
Nº
CONCENTRACION ABSORBANCIA xy
x2
y2
x (mg/mL) y
80
1 0,0094 0,271 0,002558 0,000089 0,073441 2 0,0093 0,268 0,002500 0,000087 0,071824 3 0,0096 0,276 0,002655 0,000093 0,076176
90
4 0,0113 0,323 0,003654 0,000128 0,104329 5 0,0109 0,312 0,003405 0,000119 0,097344 6 0,0109 0,311 0,003383 0,000118 0,096721
100
7 0,0120 0,342 0,004103 0,000144 0,116964 8 0,0122 0,347 0,004225 0,000148 0,120409 9 0,0119 0,340 0,004054 0,000142 0,115600
110
10 0,0131 0,373 0,004891 0,000172 0,139129 11 0,0131 0,372 0,004864 0,000171 0,138384 12 0,0130 0,370 0,004812 0,000169 0,136900
120
13 0,0143 0,407 0,005835 0,000206 0,165649 14 0,0144 0,410 0,005923 0,000209 0,168100 15 0,0145 0,412 0,005981 0,000211 0,169744
SUMA TOTAL 0,180079 5,134000 0,062843 0,002205 1,790714
PROMEDIO 0,012005 0,342267 0,004190 0,000147 0,119381
Ecuación de la recta: y = 27,76x + 0,009
Pendiente b = 27.76
Intercepto a =0.009
Coeficiente de correlación r = 1
Coeficiente de determinación r2 = 1
Test de hipótesis texp = 30128097,36 ttabla(=0,005;) 2,160368652
Especificación texp > ttabla
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ANEXO Nº 02: COEFICIENTE DE VARIACIÓN DE LOS FACTORES DE
RESPUESTA.
%TEÓRICO
Nº
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA f (y/x) x (mg/mL) y
80
1 0,0094 0,271 28,713588 2 0,0093 0,268 28,724633 3 0,0096 0,276 28,695730
90
4 0,0113 0,323 28,555669 5 0,0109 0,312 28,584554 6 0,0109 0,311 28,587285
100
7 0,0120 0,342 28,510270 8 0,0122 0,347 28,499172 9 0,0119 0,340 28,514804
110
10 0,0131 0,373 28,446374 11 0,0131 0,372 28,448264 12 0,0130 0,370 28,452078
120
13 0,0143 0,407 28,387739 14 0,0144 0,410 28,383042 15 0,0145 0,412 28,379950
SUMA TOTAL 0,180079 5,134000 427,883152
PROMEDIO 0,012005 0,342267 28,525543
D.E. 0,116906
C.V.% 0,409829
Promedio de f xf = 28.525543
Desviación estándar sf = 0.116906
Coeficiente de variación C.V.f = 0.409829%
Especificación C.V.f ≤ 2%
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ANEXO Nº 03: PRECISIÓN DEL SISTEMA (estándar secundario)
REPETIBILIDAD
Nº mg/mL Promedio
Estándar 90% mg/mL
Promedio Estándar 110%
1 0,0108 0,0135 1 0,0107 0,01075 0,0135 0,0135 2 0,0106 0,0135 2 0,0108 0,0107 0,0135 0,0135 3 0,0109 0,0134 3 0,0110 0,01095 0,0133 0,01335 4 0,0107 0,0133 4 0,0108 0,01075 0,0133 0,0133 5 0,0108 0,0133 5 0,0108 0,0108 0,0134 0,01335
Promedio 0,01079 0,0134
Desv.Est. 9,61769E-05 9,35414E-05
DSR 0,891352366 0,698070408
Especificación C.V.f ≤ 2%
REPRODUCIBILIDAD
1º día 2º día
ANALISTA A 0,0120 0,0121 0,0121 0,0120
ANALISTA B 0,0122 0,0119 0,0121 0,0119
PARAMETROS PARA TODOS LOS VALORES PROMEDIO 0,01 D.E. 0,00
C.V.% 0,88 C.V.% < 2
1ºdía A 1ºdía B
PROMEDIO 0,0121 0,0122 D.E. 0,0001 0,0001 C.V.% 0,5868 0,5820
2ºdía A 2ºdíaB
PROMEDIO 0,0121 0,0119 D.E. 0,0001 0,0000 C.V.% 0,5868 0,0000
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ANEXO Nº 04: PRECISIÓN DEL MÉTODO (muestra)
REPETIBILIDAD
Nº mg/mL Promedio
Muestra 90% mg/mL
Promedio Muestra 110%
1 0,0110 0,0132 1 0,0110 0,011 0,0133 0,01325 2 0,0108 0,0133 2 0,0108 0,0108 0,0133 0,0133 3 0,0109 0,0134 3 0,0108 0,01085 0,0134 0,0134 4 0,0108 0,0133 4 0,0108 0,0108 0,0134 0,01335 5 0,0108 0,0134 5 0,0109 0,01085 0,0133 0,01335
Promedio 0,01086 0,01333
Desv.Est. 8,21584E-05 5,70088E-05
DSR 0,756522869 0,427672703
Especificación C.V.f ≤ 2%
REPRODUCIBILIDAD
1º día 2º día
ANALISTA A 0,0123 0,0124 0,0123 0,0124
ANALISTA B 0,0122 0,0124 0,0122 0,0123
PARAMETROS PARA TODOS LOS VALORES PROMEDIO 0,01 D.E. 0,00
C.V.% 0,68 C.V.% < 2
1ºdía A 1ºdía B
PROMEDIO 0,0123 0,0122 D.E. 0,0000 0,0000 C.V.% 0,0000 0,0000
2ºdía A 2ºdíaB
PROMEDIO 0,0124 0,0124 D.E. 0,0000 0,0001 C.V.% 0,0000 0,5726
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ANEXO Nº 05: EXACTITUD DEL SISTEMA (estándar secundario)
Porcentaje teórico
Promedio en % encontrado
Porcentaje recuperado
80 82,65 103,31 80 80,35 100,44 80 82,98 103,73 100 99,36 99,36 100 99,96 99,96 100 98,86 98,86 120 116,97 97,48 120 120,68 100,57 120 120,38 100,32
Promedio recuperado 100,45
Desviación estándar 1,99
Coeficiente de variación % < 2 1,98
Porcentaje esperado: 90 - 100%
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EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN SOBRE LOS RESULTADOS
Aplicación de la prueba estadística: G de Cochran
𝐺𝑒𝑥𝑝 =
𝑠2 𝑚á𝑥
𝑠21+𝑠2
2+𝑠23 = 1.790876764
4.058994789 = 0,496484277
Gtabla (a = 0.05; K = 3; N = 3) = 0,7977
Especificación Gexp< Gtabla
Las varianzas de las concentraciones son homogéneas
El factor concentración influye en la variabilidad de los resultados
EVALUACIÓN DE LA RECUPERACIÓN DEL MÉTODO
Aplicación de la prueba estadística: t de Student
𝑡𝑒𝑥𝑝 =[100−𝑅](𝑛)1/2
𝐷𝑆𝑅 = -0,674428225
ttabla (n - 1 g.l. = 8) = 2,306004133
Especificación texp< ttabla
No existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100, por lo que la exactitud es correcta
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ANEXO Nº 06: EXACTITUD DEL MÉTODO (muestra)
Porcentaje teórico
Promedio en % encontrado
Porcentaje recuperado
80 79,05 98,81 80 78,15 97,69 80 77,65 97,06 100 98,66 98,66 100 100,66 100,66 100 95,26 95,26 120 120,58 100,48 120 120,48 100,40 120 120,58 100,48
Promedio recuperado 98,83
Desviación estándar 1,89
Coeficiente de variación % < 2 1,91
Porcentaje esperado: 90 - 100%
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EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN SOBRE LOS RESULTADOS
Aplicación de la prueba estadística: G de Cochran
𝐺𝑒𝑥𝑝 =
𝑠2 𝑚á𝑥
𝑠21+𝑠2
2+𝑠23 = 2.730079364
3.665016747 = 0,095419579
Gtabla (a = 0.05; K = 3; N = 3) = 0,7977
Especificación Gexp< Gtabla
Las varianzas de las concentraciones son homogéneas
El factor concentración influye en la variabilidad de los resultados
EVALUACIÓN DE LA RECUPERACIÓN DEL MÉTODO
Aplicación de la prueba estadística: t de Student
𝑡𝑒𝑥𝑝 =[100−𝑅](𝑛)1/2
𝐷𝑆𝑅 = 1,831640499
ttabla (n - 1 g.l. = 8) = 2,306004133
Especificación texp< ttabla
No existe diferencia significativa entre la recuperación media y 100, por lo que la exactitud es correcta
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