INFORME DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TIPO I FARMACIA

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

INFORME DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

TIPO I

IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Y CUANTIFICACIÓN

DE TANINOS Y FLAVONOIDES (QUERCETINA) POR ESPECTROFOTOMETRÍA

UV - Vis EN Artemisia absinthium L. (ASTERACEAE) “AJENJO”

AUTORES:

CHONATE URTECHO CINDY MEDALÍ.

FIGUEROA NEYRA VICTOR HUGO.

ASESOR:

DR. SAGASTEGUI GUARNIZ WILLIAM

TRUJILLO - PERÚ

2011

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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JURADO DICTAMINADOR

Mg. GILMER ZARI GIL….…………….……………PRESIDENTE

Mg. FRANCISCO SAAVEDRA SUAREZ……….……...MIEMBRO

DR. WILLIAM SAGASTEGUI GUARNIZ…………..…MIEMBRO



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DEDICATORIAS

A Dios.

Por su inmenso amor

por haber iluminado mi camino

por nunca desampararme

y por brindarme la fuerza

para completar una meta.

CINDY



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A mis padres: Eva y Hermes.

Por su amor, cariño, comprensión y apoyo sin

condiciones, porque creyeron en mí, porque admiro

su fortaleza, porque en gran parte, gracias a ellos

veo alcanzada mi meta.

Con mucha gratitud, afecto, respeto y meritorio valor a mi

madre EVA CONCEPCION URTECHO ZAVALETA,

por lograr una hija profesional haciendo lo posible

de lo imposible, y muchas gracias por ayudarme

en momentos difíciles en el camino de mi vida.

Gracias por ser mi madre y mi amiga.

A mi hermano: Eduardo

Por haber estado siempre a mi lado,

por su cariño y apoyo incondicional,

por llenar mi vida de alegría,

por compartir mis triunfos y tristezas.

Te quiero mucho hermanito.

CINDY



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A mi amigo: Carlos Castillo Pizán

Por que simplemente eres un gran amigo.

Nunca voy a olvidar tus consejos, enseñanzas y

ayuda durante la realización de este trabajo de

investigación.

Gracias por todo mi AMIGO!

CINDY



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A DIOS

A Dios, por ser nuestro creador,

amparo y fortaleza, cuando más

lo necesitamos, y por hacer palpable

su amor a través de cada uno de los

que nos rodean. Por ser el amigo que

nunca falta.

VICTOR HUGO



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A MIS PADRES:

ANDRES Y LUPE

Por estar siempre a mi lado

aconsejándome y apoyándome.

Por hacer de mí una mejor

persona a través de sus consejos.

A MIS HERMANOS:

ANDRES, WALTER, FREDY

y EDINSON.

Por estar siempre a mi lado

brindándome confianza, amor y

cariño en los momentos más difíciles.

Por ser mis mejores amigos.

VICTOR HUGO



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A MIS AMIGOS:

JOHSSY, DHAILY, RENZO

Por su ayuda, confianza, comprensión y

Amistad por haber compartido momentos

maravillosos a lo largo de nuestra

carrera profesional. Siempre es muy bueno

contar con amigos como uds.

VICTOR HUGO



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AGRADECIMIENTOS

A los distinguidos miembros del jurado por sus sugerencias y aportes al

trabajo de investigación realizado. GILMER ZARI GIL (PRESIDENTE),

FRANCISCO SAAVEDRA SUAREZ (MIEMBRO) y WILLIAM SAGASTEGUI

GUARNIZ (MIEMBRO)

A nuestro asesor el DR. William Sagástegui Guarniz por su amistad, por su

paciencia y enseñanzas, por habernos ayudado en la realización de este

trabajo.

A nuestro amigo Carlos Pizán por su paciencia y enseñanzas desde el inicio del trabajo de

investigación.

CINDY Y VICTOR



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PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado:

En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del reglamento de

Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de

Trujillo, sometemos a vuestra consideración y elevado criterio, el presente informe de

investigación tipo I titulado: “Identificación de Metabolitos Secundarios y Cuantificación

de Taninos y Flavonoides (Quercetina) por Espectrofotometría UV - Vis en Artemisia

absinthium L. (Asteraceae) “Ajenjo”.

Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio

establecido, a pesar de la existencia de alguna deficiencia encontrada durante el desarrollo

del presente trabajo de investigación.

Trujillo, Mayo del 2011

Chonate Urtecho Cindy M. Figueroa Neyra Víctor H.

Autor Autor



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ÍNDICE

RESUMEN………………………………………….……………………..

ABSTRACT……….………………………………...…….……….……….

I. INTRODUCCIÓN…...……………………………………….……..

II. MATERIAL Y MÉTODO...………………………………………..

III. RESULTADOS………….……………………………….....……....

IV. DISCUSIÓN……………..…………………………………............

V. CONCLUSIONES………………...……………………………….

VI. RECOMENDACIONES……………………………………………

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………….…..

VIII. ANEXOS

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RESUMEN

Cada día se presta más atención al estudio de las plantas medicinales de forma

que la etnobotánica, la fitoterapia y la fitoquímica están tomando un auge insospechado

ya que el empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se ha

utilizado desde tiempo inmemorial, y que desde el comienzo de la medicina fueron ellas

las que proveyeron las estructuras bases para numerosos medicamentos. La finalidad del

estudio fue extraer e identificar metabolitos secundarios al mismo tiempo cuantificar

flavonoides expresados como quercetina y taninos con métodos validados en la

universidad de la Habana Cuba presentes en hojas de Artemisia absinthium L.

“Ajenjo”. Se trabajó con la marcha fitoquímica descrita por la Dra. Olga Look

realizando la extracción de principios activos a partir de 1 Kg de Artemisia absinthium

L. seco y molido, para luego comenzar a separar los mismos con solventes de diferente

polaridad (Extrato Hexánico, Extracto Etanólico y Extracto Acuoso Acido), a los cuales

se procedió a realizar la identificación del tipo cualitativo, haciendo uso de reactivos de

coloración y precipitación; también se realizó la identificación de Absintina por

cromatografía de capa fina. Se logró determinar la presencia de taninos, flavonoides,

esteroides, antraquinonas, cumarinas, alcaloides, sesquiterpenlactonas y absintina en

hojas de Artemisia absinthium L. Así mismo, se cuantifico flavonoides expresados en

quercetina mediante el método espectrofotométrico y taninos por el método de tungsteno-

molíbdico-fosfórico, y se obtuvieron como resultado 3.78% y 0.04% respectivamente.

Palabras claves: Artemisia absinthium L., metabolitos secundarios, Método

espectrofotométrico, Tungsteno-molíbdico-fosfórico, flavonoides (quercetina),

taninos.

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ABSTRACT

Every day, more attention is paid to the study of medicinal plants so that

ethnobotany, herbal medicine and phytochemistry are taking an unexpected boom since

the use of medicinal plants for healing is a practice that has been used since time

immemorial, and since the beginning of medicine was they who provided the basis for

many drug structures. The purpose of this study was to extract and identify secondary

metabolites simultaneously quantify flavonoids expressed as quercetin and tannins with

validated methods at the University of Havana Cuba present in leaves of Artemisia

absinthium L. "Wormwood." We worked with the phytochemical described by Dr. Olga

Look by extracting active ingredients from 1 kg of Artemisia absinthium L. dried and

ground, then begin to separate themselves with different polarity solvents (hexane extract,

ethanol extract and aqueous acid extract), to which was performed qualitative

identification, using the coloration and precipitation reagents also performed to identify

absinthin by thin layer chromatography. It was possible to determine the presence of

tannins, flavonoids, steroids, anthraquinones, coumarins, alkaloids, sesquiterpenlactone

and absinthin in leaves of Artemisia absinthium L. Likewise, was quantified flavonoids

expressed as quercetin by the spectrophotometric method and tannins by the method of

tungsten-molybdic-phosphoric, and obtained as a result of 3.78% and 0.04% respectively.

Keywords: Artemisia absinthium L., secondary metabolites, spectrophotometric

method, Tungsten-molybdic-phosphoric acid, flavonoids (quercetin), tannins.

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I. INTRODUCCIÓN

Con el transcurrir del tiempo el ser humano ha venido siendo un blanco

vulnerable, ante las enfermedades producidas por una serie de microorganismos

como bacterias, virus, hongos, etc.; ante este hecho se ha descubierto que la

mayoría del tratamiento a sus enfermedades se encuentra en las plantas1, 2, 3.

Las plantas medicinales han sido desde la antigüedad un recurso al

alcance del ser humano para su alimentación y la curación de sus enfermedades;

eran veneradas por las virtudes que se les había reconocido, transmitiéndose sus

virtudes de generación en generación; nadie buscaba el saber porqué o cómo

actuaban, pero era un hecho incontestable y que parecía mágico4.

El 80% de la población mundial, utilizan las plantas como principal

remedio medicinal, según nos señala la Organización Mundial de la Salud (OMS),

esta práctica está asociada al empirismo en muchos casos; faltan estudios químicos,

clínicos y epidemiológicos que confirmen de forma fehaciente los efectos

fisiológicos de las plantas y los principios activos responsables. Es importante

reconocer que el 25% de los fármacos existentes se obtienen de extractos vegetales,

o bien se han sintetizado a partir de sustancias halladas en la investigación

fitoquímica5.

La OMS considera como planta medicinal todo vegetal que contiene, en

uno o más de sus órganos, sustancias que pueden ser utilizadas con finalidades

terapéuticas o que son precursores en la semisíntesis químico-farmacéutica6.



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Un gran porcentaje de los principios activos de plantas deben su

actividad terapéutica a compuestos químicos complejos llamados metabolitos

secundarios, que son compuestos químicos de estructura relativamente compleja;

cuya función en el vegetal no es del todo bien conocida y no son esenciales en el

desarrollo de la planta ni tienen presencia universal para todas las especies

vegetales, tienen funciones como las relacionadas con los mecanismos de

defensa o protección, y actúan como biocidas, repelentes y/o inhibidores de la

alimentación para patógenos, herbívoros y competidores, de manera que puedan

garantizar su sobrevivencia4, 7.

En el proceso de determinación de metabolitos secundarios, se hace uso

de reacciones de precipitación y coloración, con la finalidad de identificar cual

es el metabolito secundario existente en tal o cual especie vegetal1, 3, 4. Estos son

de composición química muy variada, por lo general pertenecen a una de estas

categorías: fenoles, flavonoides, taninos, esteroides, quinonas, cardenólidos,

esteroides, alcaloides, leucoantocianidinas, saponinas, aceites esenciales

(esencias), gomas, resinas, etc.; cada uno de estos con diversa actividad

medicinal y que pueden encontrarse distribuidos por toda la planta en forma de

látex, jugos, secreciones, etc2.

En nuestro país, se encuentra la especie Artemisia absinthium L. (ajenjo)

es una hierba vivaz de la familia de las compuestas (asteraceae), de 50 a 80 cm

de altura, recubierta de un bello que le da un aspecto plateado. También crece en

Europa, Siberia y los Estados Unidos. Medicinalmente se utiliza las hojas y las

sumidades florales, principalmente su aceite en la preparación de ciertas bebidas



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alcohólicas, en especial el vermuth y la absenta. Esta última fue muy popular en

el siglo XIX en toda Europa, y comúnmente fue empleada por artistas y poetas,

incluido Vincent Van Gogh9. Así mismo, la absenta causo varios casos de daño

cerebral y algunas muertes y fue prohibida en muchos países a principios del

siglo XX. El aceite de ajenjo continúa siendo usado como agente aromático en

alimentos8, 9, 10.

Para el caso especial del ajenjo (Artemisia absinthium L.), la mayor parte

de información demuestra que esta planta contiene 2 metabolitos sumamente

importantes como son la tuyona y la absintina. Estas sustancias en cierta medida

son capaces de explicar la farmacología y toxicología de esta planta, sin

embargo también existen otros metabolitos de cierto interés fitoquímico, dentro

de los más comunes tenemos los alcaloides, esteroides, diterpenos,

sesquiterpenlactonas, flavonoides, cumarinas y quinonas 9, 11.

El aceite volátil de la Artemisia absinthium L. obtenida a través de la

destilación proporciona entre un 0.5 a 1.0% de rendimiento. Usualmente es de

color verde oscuro o algunas veces azul, y tiene un fuerte aroma y sabor amargo.

Este aceite es empleado en algunos lugares de Europa como analgésico, siendo

uno de los constituyentes primarios de este aceite el biciclo monoterpeno β-

tuyona (1S, 4R-tuyan-3-ona), el cual puede variar de 17.5 - 42.3% dependiendo

de la procedencia, clima y áreas de crecimiento de la droga12. También existe un

isómero de esta sustancia, la α-tuyona (1S, 4R-tuyan-3-ona), que contiene

cantidades entre 0.53 - 1.22%. Ambos metabolitos se pueden obtener a través de

extracción alcohólica en hojas de la planta. Durante mucho tiempo se sospecha



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que la tuyona, tenía efectos neurotóxicos y que era responsable de producir el

absentismo, el cual es una enfermedad que se caracteriza por una desintegración

física y mental. A pesar de estar en menos cantidad con respecto al β-tuyona, el

principal responsable del efecto psicoactivo y toxico del “ajenjo” es la α-

tuyona13.

Otro de los metabolitos secundarios encontrados en las plantas son los

taninos, estos están constituidos por un amplio grupo de compuestos

hidrosolubles con estructura polifenólica, de masa molecular entre 500 y 3000

aproximadamente, capaces de precipitar ciertas macromoléculas (proteínas,

alcaloides, celulosa, gelatina). Sus acciones farmacológicas son: antídotos en

intoxicaciones por metales pesados y alcaloides (debido a su capacidad para

formar estructuras complejas con estas sustancias), astringentes (debido a su

capacidad para precipitar proteínas de la piel, proteínas salivares, etc. Y por ello

se usan por vía externa como cicatrizante y por vía interna como antidiarreico. El

efecto antidiarreico lo ejercen en el intestino, y se administran combinados con

albumina o gelatina para evitar los ardores de estómago que producirían; como

antisépticos por su acción bactericida y bacteriostática y también ejercen un

efecto antifúngico; como protectores, los taninos se aplica en pomada de uso

externo, impermeabilizan la piel y la protegen de los agentes externos. En casos

de cicatriz favorecen la regeneración de la piel y tiene poder analgésico.

Aplicados sobre heridas sangrantes pueden tener una acción hemostática; como

antioxidantes (son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación

lipídica); también efecto hipocolesterolemico, además pueden actuar factores

antinutrientes, debido que ciertos taninos disminuyen la eficacia de los alimentos



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porque inhiben algunas enzimas endógenas o porque absorben y ejercen un

efecto sistémico de precipitación de las proteínas de la dieta14, 15.

La quercetina es un flavonoide ampliamente distribuido en el reino

vegetal; se trata de un compuesto polifenólico presente naturalmente en

vegetales, frutas, bebidas no alcohólicas y plantas medicinales. Dependiendo de

la dieta, el consumo de quercetina para la alimentación llega a superar los 500

mg diarios. Entre las principales virtudes de la quercetina destaca su poder

removedor sobre los radicales libres, ejerciendo un papel citoprotector en

situaciones de peligro de daño celular. La quercetina retira oxígeno reactivo

especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidróxidos, peróxidos

lipídicos o hidroperóxidos y de esta manera bloquea el accionar deletéreo de

estas sustancias sobre las células16. Los efectos citoprotectores de la quercetina

son por ejemplo evidentes en fibroblastos de la piel humana, queratinocitos,

células endoteliales y ganglios sensoriales cultivados en presencia de sulfoxina-

butionina, un inhibidor irreversible de la glutatión sintetasa. Asimismo, la

quercetina ha demostrado inhibir in vitro la oxidación de la lipoproteína de baja

densidad (LDL) y reducir la citotoxicidad de la LDL oxidada. La propiedad

antioxidante de la quercetina se manifiesta por ejemplo, a través de la inhibición

de la peroxidación lipídica por intermedio de varios mecanismos17.

La quercetina demostró disminuir la incidencia de infarto de miocardio y

de derrames cerebrales en personas de tercera edad. Debido a la inhibición de la

peroxidación lipídica, la quercetina protege de la destrucción local del endotelio

por prostaciclina y el factor de relajamiento derivado del endotelio (EDRF). Las



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prostaciclinas y el EDRF inhiben la agregación plaquetaria y tienen acción

vasodilatadora18, 19.

La acción antiinflamatoria que poseen muchos flavonoides se relaciona

en parte con enzimas implicadas en el metabolismo del ácido araquidónico. En

general los flavonoides polihidroxilados actúan por la vía de la enzima 5-

lipooxigenasa, y los menos hidroxilados lo hacen por la vía de la ciclooxigenasa.

En cambio, in vivo pueden comportarse como inhibidores duales debido

probablemente a la biotransformación que sufren en el organismo. Por ejemplo,

se ha constatado a través de diversos ensayos clínicos que la quercetina

disminuye la inflamación de glándulas parótidas humanas, favorece la

cicatrización de heridas, en especial aquellas heridas supuradas del área

maxilofacial y cuello16, 17, 19.

Muchos de los trabajos que informan los principios activos de esta

planta, son de países europeos y asiáticos, tanto así que se describen métodos

para obtener aceites esenciales de las raíces según la farmacopea europea.

Actualmente en el Perú, se han reportado estudios de investigación realizados en

Artemisia absinthium, descubriendo que presentan metabolitos que tienen efecto

antipalúdico, antihelmíntico entre otros 20.

Sin embargo, no se ha reportado datos sobre estudios cuantitativos de los

principales metabolitos secundarios de esta planta, por lo que en este trabajo

pretendemos realizar a fin de determinar las concentraciones de Taninos y



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flavonoides expresados en quercetina. En base a estos antecedentes expuestos,

nos planteamos el siguiente problema de investigación:

¿Cuáles son los diversos Metabolitos Secundarios y cuál es la concentración

de Taninos y Flavonoides (Quercetina) que se encuentran en las hojas

Artemisia absinthium L. “ajenjo”, recolectada en la provincia de Contumazá,

Departamento de Cajamarca?

Para lo cual se plantearon los siguientes objetivos:

Extraer e identificar los metabolitos secundarios presentes en hojas

de Artemisia absinthium L. “Ajenjo”

Cuantificar flavonoides (quercetina) y taninos presentes en Artemisia

absinthium L. por el método espectrofotométrico.



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II. MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIALES

1.1. MATERIAL BIOLÓGICO.

Hojas de Artemisia Absinthium “ajenjo”, obtenidas en la provincia de

Contumazá, departamento de Cajamarca.

1.2. MATERIAL DE VIDRIO

De uso común en laboratorio.

1.3. EQUIPOS DE LABORATORIO

1.4. REACTIVOS

Bicloruro de Mercurio

Acido Fosfomolibdico

Acido Fosfórico

Acido Tánico

Acetato Plúmbico

Estufa Mermmet Tv-15u

Refrigeradora Imaco

Balanza analítica Sartorius ME 215

Baño maría Sartorius PRECISTERM

Bomba de vacio GAST 746ª

Espectrofotómetro UV/Vis HP



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Diclorometano

Tolueno

Resorcinol

Patrón de Quercetina

Hexano

Etanol 96°

Agua destilada

Acido Acético

Anhídrido Acético

Acido Sulfúrico concentrado

Acido Pícrico

Hidróxido de Potasio

Hidróxido de Sodio

Yoduro de Potasio

Amoniaco

Tricloruro Férrico

Tungstato de Sodio Dihidratado

Carbonato de Sodio

Acetona

Sulfato de Sodio Anhidro



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2. MÉTODO

2.1. Preparación de la muestra en estudio

Las muestras de hojas se limpiaron y secaron a temperatura ambiente,

luego se llevaron a secado en estufa a 40° C por tres días y se pulverizó.

2.2. Obtención de los extractos de las hojas de Artemisia absintium L.

Se pesó 100 gramos de hoja pulverizada, se colocó en los frascos de boca

ancha, se agregó cantidad suficiente de Hexano y etanol respectivamente,

exactamente hasta cubrir la droga, se dejó macerar por 7 días, a excepción de

la muestra que contiene agua acidulada, la cual solo fue llevado a infusión

por 45 minutos. Durante la maceración se agitó constantemente cada 24

horas. Luego, las muestras que contienen hexano y etanol, se filtraron

obteniéndose dos productos: el marco (droga ya tratada) y el extracto con

solvente. El marco se volvió a tratar 2 veces más con el respectivo solvente y

luego los extractos se juntaron, se llevaron a baño maria en vasos de

precipitación previamente tarados a 40°C hasta evaporar el solvente, se

volvió a pesar hasta peso constante y por diferencia de pesos se obtuvo el

rendimiento de cada extracto y finalmente se llevó a refrigeración de -5 hasta

0 °C. Para el caso de los extractos con agua acidulada, se filtró obteniéndose

nuevamente los productos antes mencionados. Finalmente, se pesaron los

vasos con extracto desecado y por diferencia de pesos se obtuvo el

rendimiento del mismo4, 21.



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2.3.Identificación de los metabolitos secundarios presentes en los extractos.

2.3.1. Identificación de Flavonoides

Reacción de Shinoda: En 0.1g del extracto etanólico desecado se

agregó alcohol y luego una pequeña porción de limaduras de

magnesio y dos gotas de acido clorhídrico concentrado21.

2.3.2. Identificación de Esteroles y Terpenoides

Reacción de Lieberman-Buchardat: Se colocó 1mg del extracto

hexánico desecado, luego se añadió 10 gotas de anhídrido acético, 20

gotas de acido acético y 1 gota de acido sulfúrico21.

2.3.3. Identificación de Alcaloides

Reacción de Mayer: Se aforó 1.35g de bicloruro de mercurio y 4g

de yoduro de potasio en una fiola de 100mL con agua destilada.

Luego los extractos (acuoso ácido y etanólico) desecados obtenidos

se acidularon con una solución de ácido clorhídrico al 1%4.

2.3.4. Identificación de Cumarinas

Se diluyó 0.1g de los extractos desecados en mención en 2 mL de

alcohol etílico 96 °. Luego se colocaron en tubos de ensayo y se

expusieron a lámparas UV (366 nm.)21.



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2.3.5. Identificación de Lactonas

Reaccion de Baljet: Se emplearon dos soluciones que se mezclaron

en volúmenes iguales antes de usarse. Solución A, 1g de acido

pícrico en 100mL de etanol de 96°; Solución B, 10g de hidróxido de

sodio en 100mL de agua. Para la prueba se pondrán 2-3mg de

compuesto y unas 3-4 gotas de reactivo4.

2.3.6. Identificación de Absintina

Se tomó de cada extracto desecado una cantidad equivalente a 5g de

ajenjo pulverizado, se agregó 5mL de solución de acetato plúmbico

10% para clarificar. El filtrado se extrajo con 50mL de

diclorometano, se separó la fase orgánica y se secó con sulfato de

sodio anhidro, finalmente el solvente se evaporó y el residuo se

diluyó en 0.5-1mL de etanol. Como no se disolvió completamente,

esto se colocó en baño maria. El extracto obtenido se colocó en

cromatoplacas de silicagel, y se tomó como patrón una cantidad

adecuada de resorsinol, debido a que ambas sustancias tienen el

mismo Rf. La fase móvil que se empleó fue una combinación de

acetona: acido acético 98%, tolueno: diclorometano en la proporción

de 10:10:30:50 v/v respectivamente4.

2.3.7. Identificación de Quinonas

Reacción de Bortranger: Se colocó en un tubo de ensayo una

pequeña porción de extracto desecado. Se añadió unos 5mL de

benceno y se agitó. El benceno tomó color amarillo. Luego se



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transvasó el benceno a otro tubo de ensayo y se añadieron unas gotas

de solución de KOH21.

2.3.8. Identificación de Saponina

Reacción de Rossel. Se colocó en una cápsula de porcelana cantidad

suficiente de extractos desecados (acuoso ácido o etanólico), se

añadió unas gotas de ácido sulfúrico concentrado4.

2.3.9. Identificación de Taninos

Se preparó una solución de Tricloruro de Hierro al 3% y se agregó

unas gotas a cada uno de los extractos desecados obtenidos4.

2.4. Análisis de Resultados cualitativos:

Los resultados obtenidos se presentan en cuadros donde se explica en forma

cualitativa la presencia (+) o ausencia (-) de los metabolitos secundarios para

cada ensayo realizado.



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2.5. Cuantificación de Metabolitos Secundarios

2.5.1. Cuantificación de Taninos por el Método del Tungsteno-

molibdico-fosfórico, UV-Vis 22, 23.

2.5.1.1. Preparación de la solución muestra

Se agitaron 10g de muestra con 500mL de etanol al 50% durante

6 horas, se dejó en reposo 8 horas y se agitó nuevamente por 30

minutos, para posteriormente filtrar. Se transfirieron 3mL de

filtrado a un matraz aforado de 50mL y se diluyó con agua

destilada hasta enrasar (Sm).

2.5.1.2.Solución de Referencia de Acido Tánico

Se disolvió 25mg de ácido tánico (previamente secado a 100 ºC

durante 2 h) en 100 mL de agua destilada, se tomó 20mL y se

completó hasta 100mL.

2.5.1.3. Reactivo para taninos

Se disolvió 10.0 g de tungstato de sodio dihidratado, 0.2g de

ácido fosfomolibdico y 5mL de ácido fosfórico al 85% en 75mL

de agua destilada. Se reflujó 2h (hasta aparición de color

amarillo; no verde, ni azul) y después se completó a 100mL con

agua destilada.



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2.5.1.4.Solución de carbonato de sodio.

Se disuelven 10g de carbonato de sodio anhidro en 50mL de agua

destilada.

Finalmente se prepararon matraces aforados de 50mL, los cuales

contenían:

REACTIVOS BLANCO PATRÓN MUESTRA

Sm (Solución Muestra) - - 1mL

Sol. de Referencia de Acido Tánico - 3mL -

Agua destilada 5mL 2mL 4mL

Reactivo para Taninos 2mL 2mL 2mL

Se agitó y se dejó reposar durante 5 minutos.

Sol Carbonato de Sodio al

20% 1mL 1mL 1mL

Se completó con agua destilada hasta enrase y se mezcló para finalmente

llevarse a lectura a 700nm después de transcurridos 2 minutos de la

reacción.

La expresión para los cálculos es la siguiente:

𝑋 =𝐴𝑚 × 𝑃 × 1000 × 1 00

𝐴𝑝 × 𝑃𝑀 × (100 − 𝑝)

X = contenido de taninos en la droga (%)

P = masa de la sustancia de referencia (g)

Am = Absorbancia de la muestra

Ap = Absorbancia de la solución de

referencia

PM = masa de la droga (g)

P = humedad de la droga (%)



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1000 y 100 = factor matemático para el

cálculo.

2.5.2. Cuantificación de Flavonoides totales expresados como

quercetina por el Método espectrofotométrico22.

Se reflujó 0.5g de muestra, 2 horas con 20mL de acido sulfúrico

al 10% y 20mL de etanol al 50%, luego se enfrió y filtró con ayuda

de vacío. El residuo se lavó con 30mL de etanol al 50% para

desecharlo finalmente; el filtrado se evaporó en baño de agua hasta la

mitad del volumen inicial, se enfrió sobre baño de hielo durante

30min y luego se filtró, lavando el precipitado formado con 4

porciones de 10mL de agua destilada fría (10-15°C). Se eliminó el

filtrado y los lavados, y el residuo tanto del filtro como del recipiente

se disolvió con 70mL de etanol al 96%, calentando previamente a

50°C; la solución se pasó a una fiola de 100mL y se completó

volumen con etanol al 96% (solución muestra). Posteriormente se

leyó las absorbancias a 258nm. Como patrón se empleó 0.04g de

quercetina, los cuales se disolvieron con etanol al 96% hasta

completar un volumen de 50mL; de esta solución se tomó 1mL y se

diluyó a 100mL con etanol al 50%. El blanco consistió en una

solución de etanol al 50%.

La expresión que se empleará para el cálculo será la siguiente:

𝑋 =𝐴𝑚 × 𝑃𝑅 × 5 × 100

𝐴𝑅

X= contenido de flavonoides totales

expresados como quercetina (%)

Am= Absorbancia de la solución muestra



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(nm)

PR= peso de la sustancia de referencia (g)

AR= Absorbancia de la solución de referencia

III. RESULTADOS:

Cuadro Nº1: Resultados de metabolitos secundarios encontrados en hojas de Artemisia

absinthium L. utilizando los métodos de coloración, precipitación y CCF

EXTRATO M. SECUNDARIO REACCIÓN RESULTADO

EXTRACTO

ETANOLICO

Flavonoides Shinoda +

Alcaloides Mayer +

Cumarinas Fluorescencia +

Lactonas Baljet +

Absintina CCF +

Quinonas Bortranger +

Saponinas Rossel -

Esteroides Liebermann-Burchard +

Taninos FeCl3 +

EXTRACTO

HEXANICO

Esteroides Liebermann-Burchard +

Lactonas Baljet +

Absintina CCF +


Taninos FeCl3 +

EXTRACTO

ACUOSO ACIDO

Cumarinas Fluorescencia +

Taninos FeCl3 +

Alcaloides Mayer +


Saponinas Rosell -

Lactonas Baljet +



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Absintina CCF +

(+): Reacción positiva. Presencia del Metabolito Secundario

(-): Reacción Negativa. Ausencia del Metabolito Secundario

CCF: Cromatografía en capa fina.

Cuadro Nº 2: Concentración de Taninos en hojas de Artemisia absinthium L. por el

método del Tungsteno-molíbdico-fosfórico en espectrofotometría

UV-Vis.

TANINOS

Concentración en mg Porcentaje (%)

44.38 0.44

Cuadro Nº 3: Concentración de Flavonoides (Quercetina) en hojas de Artemisia

absinthium L. por el Método Espectrofotométrico UV.

FLAVONOIDES (QUERCETINA)

Concentración en mg Porcentaje (%)

18.88 3.78



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IV. DISCUSIÓN

En el presente trabajo se propuso identificar los metabolitos secundarios y

cuantificar taninos con el método tungsteno-molíbdico-fosfórico y flavonoides

expresados como quercetina según el método espectrofotométrico, presentes en

hojas de Artemisia absinthium. Para ello se realizó la identificación preliminar

mediante métodos fisicoquímicos por reacciones de coloración, de precipitación

y de cromatografía en capa fina, los metabolitos secundarios presentes en los

diversos extractos de la droga obtenidos con solventes orgánicos de diferente

polaridad: Hexánico, Etílico, y con Agua acidulada24.

En el cuadro N° 01 se reporta los metabolitos secundarios identificados con

reacciones de coloración, precipitación y de cromatografía en capa fina en los

diferentes extractos, teniendo en cuenta la polaridad del solvente empleado,

encontrándose la presencia de flavonoides, alcaloides, sesquiterpenlactonas,

antraquinonas, taninos, esteroides, absintinas y cumarinas, no se logró

identificar saponinas en ninguno de los extractos.

Los resultados muestran que las lactonas de naturaleza sesquiterpénica,

según el ensayo, se obtuvieron de acuerdo a su intensidad de coloración, en

mayor proporción en el solvente de más baja polaridad; resultando menor en

etanol y casi nula en el agua acidificada. Esto justifica la presencia de lactonas

muy lipofílicas, las cuales están poco solvatadas con agua, en contraposición con

las solubles en agua, que poseen sustituyentes hidrofílicos24.



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Las sesquiterpenlactonas, se encuentran distribuidas en la familia

Asteraceae, notablemente en géneros Artemisia y Ambrosia. Son sustancias

amargas que se encuentran en todas las partes de la planta, en concentraciones

que varían entre 0.01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones mayores

generalmente en las hojas. Además, son de gran importancia por la variada

acción biológica que han demostrado siendo la acción citotóxica, antitumoral,

analgésica, inhibidoras del crecimiento de bacterias, entre otras25.

Para identificar la presencia de absintina, se utilizó el método de

cromatografía en capa fina, utilizando como estándar el resorsinol. Este

metabolito es la principal sesquiterpenlactona presente en la Artemisia

absinthium, la cual es un guainólido dimérico, es decir que se encuentra

formado por dos núcleos lactónicos, y que en los análisis organolépticos es el

responsable del sabor amargo12, 25.

En el estudio químico de la especie se decidió cuantificar taninos y

flavonoides totales expresados como quercetina, por ser metabolitos secundarios

que se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal con múltiples

propiedades farmacológicas : antioxidantes, antiinflamatorias, antiagregantes

plaquetarios, antimicrobianas, antirradicales libres, antimutagénicas,

anticarcinogénicas, antiaterogénicas y quimioprotectoras25.

Se obtuvo 0.44% de taninos en hojas de Artemisia absinthium obtenidas de

la provincia de Cajamarca-Perú (cuadro N° 02). Cabe señalar que los datos son

validos solo para las muestras analizadas ya que se conoce que la variabilidad de



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los taninos depende de diferentes factores como: condiciones edafológicas,

tiempo de cosecha, forma de almacenamiento de la hoja lo mismo que el tiempo

de almacenamiento e incluyendo la individualidad entre los mismos cultivos

sembrados en diferente o igual localidad. Como concluye el Dr. Yi Yun en el

estudio clínico Comparison of Tannin Contents in Artemisia argyi from

Different Areas donde las concentraciones de taninos varían desde 2.92% hasta

13.29%. Esto tienen relación con un estudio realizado en la provincia de Sari-

Iran, donde se encontró una concentración de taninos de Artemisia absinthium

que varía entre 14.99% ± 0.97%, utilizando el mismo método de tungsteno-

molíbdico-fosfórico26, 27, 28.

Existen diferentes métodos para cuantificar taninos, entre los que destacan

métodos fisicoquímicos, químicos y biológicos, siendo este último el más

adecuado. Sin embargo, los taninos no se reconocen como causantes de

hemólisis pero en recientes estudios se han demostrado que algunos de ellos si

presentan propiedades hemolíticas, por lo que se hace necesario la evaluación de

esta actividad en aquellas plantas que los presenten, según el estudio sobre la

actividad hemolítica de los posibles taninos extraídos a partir de la Boldoa

purpurascens Cav. 29. No obstante, dentro de los métodos químicos podemos

realzar el método utilizado en este estudio ya que mide la capacidad reductora de

la muestra, esto se basa en la reducción del acido fosfomolíbdico por los fenoles

en un álcalis acuoso. Además, determina la totalidad de los grupos fenólicos

libres y por consiguiente determina la totalidad de fenoles solubles tanto taninos

hidrolizados como taninos condensados. Otra de las ventajas es que el método

espectrofotométrico utilizado es más selectivo, preciso, exacto, que un análisis

por valoración volumétrica que usa el método de jean29, 30, 31.



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Se encontró también un 3.78% de flavonoides expresados como

quercetina en “ajenjo” de la provincia de Cajamarca-Perú, cuadro N°03,

mientras que en el estudio en Artemisia absinthium de Iran, el resultado obtenido

fue de 1.24%, estas variaciones posiblemente se deben a factores ambientales

descritos anteriormente 27. Esta cuantificación se realizó por el método

espectrofotométrico, donde los flavonoides son hidrolizados con calefacción en

solución de etanol/H2SO4 y cuantificados en la región ultravioleta a la 258nm

32, 33. Los métodos de cuantificación utilizados en este estudio fueron validados

por el instituto de Farmacia y Alimentos de la Universidad de la Habana20, 34.



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V. CONCLUSIONES

De los resultados obtenidos en el presente trabajo se concluye lo siguiente:

Los metabolitos secundarios identificados en el extracto de hojas de

Artemisia absinthium L. son: taninos, flavonoides, esteroides,

quinonas, lactonas, cumarinas, absintina y alcaloides.

La concentración de taninos en las hojas de artemisia absinthium

provenientes del departamento de Cajamarca, fue de 0.44%.

La concentración de flavonoides expresados en quercetina en las

hojas de artemisia absinthium provenientes del departamento de

Cajamarca, fue de 3.78%.



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VI. RECOMENDACIONES

1. Este trabajo pretende estimular la realización de futuros estudios para evaluar

el posible efecto farmacológico de los metabolitos secundarios encontrados

en las hojas de Artemisia absinthium L. y ver su posible aplicación contra

alguna patología.

2. Divulgar la información obtenida de este estudio para contribuir a promover

la evaluación preliminar de metabolitos secundario en plantas.



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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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ANEXO 1: IDENTIFICACION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Reacción de Shinoda: Flavonoides Reacción de Lieberman: Esteroles

Reacción de Mayer: Alcaloides Fluorescencia: Cumarinas

Reacción de Baljet: Lactonas Reacción de Borntrager:

Antraquinonas



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Cromatografía en Capa Fina: Absintina

Reacción de Rosell: Saponinas Reacción con FeCl3: Taninos



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ANEXO 2: REACCIONES QUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN

REACCION DE LIEBERMANN-BURCHARD

(Verde azulado o anaranjado)

REACCION DE MAYER

CH3

CH3

CH3

CH3 O CH3

O OS

O

O

OOH H_

__

__ __

__

___

__

HgCl2 + 4KI Hg2-

III

I

. K+

. K++ 2 KCl

Hg2-

III

I

. K+

. K++

2

N+R

H. HSO4

-

Hg

III

I

N+R

H

N+R

H

2-

Ppdo Blanco

CH3

CH3

CH3

C- C-O CH3CH3

OO

H H

__ __ ++

CH3

CH3

CH3

C- C-O CH3CH3

OO H

H

+

+__

__

_

_ _ _ __



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REACCION DE SHINODA

O

O

MgCl2

O+

OMgCl

O

O

O+

O-

O+

O-

Mg

(Rojo)

Flavona

O

OOH

MgCl2

O+

O

O

Mg Cl

H

O

O

OH

(Rojo a Crimson)

Flavonol

___

O+

O-

O+

H

Mg

O+

O-

O+

H



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REACCION DE BORNTRAGER

O

O

MgCl2

Flavanona

O+

O Mg Cl

O

O

O+

O

O+

O Mg

(Crimson a Magenta)

O

O

OOH

H

Na+OH -

O-

O

OOH

O

O

O-

OH

. Na+

(Rojo)

Antraquinona



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ANEXO 3: FOTO DEL ENSAYO DE LA CUANTIFICACIÓN DE TANINOS EN

HOJAS DE Artemisia absinthium L.



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