Dieter  Buyst1,2*,    Vicky  Gheerardijn2,  Bjorn  Van  Gasse1,  Jos  Van  den  Begin2,  Annemieke  Madder2  &  José  C.  MarBns1    

1  NMRSTR,  Department  of  Organic  Chemistry,  University  of  Ghent,  Krijgslaan  281  S4,  B-­‐9000,    Ghent,  Belgium  2  OBCR,  Department  of  Organic  Chemistry,  University  of  Ghent,  Krijgslaan  281  S4,  B-­‐9000,    Ghent,  Belgium    

(*e-­‐mail:  Dieter.Buyst@UGent.be)  

In   the   development   of   esterase   like   DNAzymes,  recent   advances   in   OBCR  made   the   introducBon   of  amino   acid-­‐like   side   chain   func8onali8es   on   the  thymine   base   possible.   The   hydrophobic   and   chiral  environment   of   a   B-­‐DNA   helix   is   used   as   a   new  scaffold   for   the  development  of   synthe8c  enzymes.  Both   first   generaBon,   single   hisBdine   modified  systems   and   second   generaBon,   double   modified  systems  are  subjected  to  a  systemaBc  study.  

1.  General  concept  &  design  

Towards  DNA  based  esterases:  uncovering  Hoogsteen  face  regula8on  of  the  pKaH  of  a  tethered  imidazole  func8onality  by  

NMR  and  molecular  dynamics  

From  melBng  temperatures:  •  No  loss  of  stability  due  to  modificaBon  •  Increase   in   stability   is   dependent   on   posiBon   of  

modificaBon:  T8ImH+  (+  5-­‐6°C)  

0,0  

0,2  

0,4  

0,6  

0,8  

1,0  

1,2  

5   6   7   8   9   10  

δobs,  norm  

pH  

T8ImH+  

T6ImH+  T7ImH+  Building  block  

sT21ImH+  

T8ImH+A21  7,17  ±  0,02  

 7,92  ±  0,04  

 

8,13  ±  0,04  

8,72  ±  0,02    8,88  ±  0,05    

9,07  ±  0,02  

References  [1]  Broo,  K.S.,  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  1997,  119(47),  11362-­‐11372  [2]  Wüthrich,  K.,  NMR  of  Proteins  And  Nucleic  Acids,  1986  

Acknowledgements  The  700MHz  is  part  of  the  INMRF  jointly  operated  by  UGent,  UA  and  VUB.    

2.  First  glimpse  of  the  pKaH  regula8ng  mo8f  

•  Solely  for  T8ImH+  there’s  a  clear  set  of  nOe  contacts  to  posiBon  n+3  (A11-­‐T18  base  pair)  

•  T8ImH+A21  and  sT21ImH+  prove  that  an  AT  base  pair  is  tolerated  as  well  as  that  the  moBf  is  robust  and  sequence-­‐independent  

    T-­‐T  mismatch   A-­‐T  base  pair  

System   WT   T6ImH+   T7ImH+   T8ImH+   WT   T8ImH+A21   sT21ImH+  

Tm  (°C)   48,6  ±  0,5   50,5  ±  0,2   50,1  ±  0,3   54,6  ±  0,1   59,0  ±  0,3   64,1  ±  0,6   59,4  ±  0,2  

5’-GACCATTTGCAGCG-3’ 3’-CTGGTAATCGTCGC-5’

7

23

strand 1 è

ç strand 2

22

21

6 8

Template  sequence  =  Wild  Type  

14#mer'B"DNA&double'helix'

Concerns:'•  'stability&&&•  spectral&complexity&'

TIm  =  

versus  T8ImH+  Hε2  –  G19O6  

Running  average  interval  =  25  

T7ImH+  Hδ1  –  T21O4  

Running  average  interval  =  25  

50ns  of  MD  trajectory  shows  persistent  H-­‐bridging  in  T8ImH+  and  close  interproton  contacts  validated  in  nOe’s  

~  2  ns  

T8ImH+  

G19  

Hε1  

 Star8ng  structure  

T8ImH+  

TImH+     TIm    +  H+    

Thermal  stability  

TImH+  pKaH  study  via  1H  NMR  

 1H  NMR  pH  BtraBon:  follow  ε1  and  δ2  

of  the  TImH+  

O

OH

HO

N

NH

O

O

NH

OHN

NH

H

Hε1  

δ2  

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

"T8 His" 11 2 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

T7His 7 1 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

"T8 His" 11 2 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

T8HisA21 3 1 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

T8ImH+' T8ImH+A21' sT21ImH+

'T7ImH+'

Hε1'–'T21'CH3'

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

T21modHis 2 1 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

F2 [ppm] 9.0 8.5 8.0 7.5

F1

[ppm

] 8

6

4

2

T21modHis 2 1 "/Users/Dieter/Documents/NMR Data/NMR Data 700MHz"

Diagonal'peak'

C7'H5'

T5'CH3''

T5'H2’'T5'H2”'

Hε1'–'Hδ2'

G6'H8'

T5'H1’'

T5'H3’'C7'H3’'

T5H6'

C20'H5'

T18'CH3'

T18'H2’'T18'H2”'

Hε1'–'Hδ2'

G19'H8'

T18'H1’'

T18'H3’'C17'H3’'

9.0' 9.0' 9.0'8.7'

2.0'

4.0'

6.0'

8.0'

Hε1'

Specific  nOe  contacts  

22

7

6

23

18

11

5’-GACCATTTImHGCAGCG-3’ 3’-CTGGTAAT CGTCGC-5’

9

21

20

19

8

10

T8ImH+  

sT21ImH+   5’-GACCTGCA TTAGCG-3’ 3’-CTGGACGTImHAATCGC-5’

22

21

24

23

6

8 5

7

9

10

22

23

3.  Molecular  Dynamics   4.  Applica8on  of  the  mo8f  in  double  modified  systems  

    A-­‐T  base  pair  

System   WT   T6T8ImH+   T7T8ImH+  

Tm  (°C)   59,0  ±  0,3   65,0  ±  0,4   63,9  ±  0,3  

Δ  to  WT   -­‐   +  6,0   +  4,9  

Thermal  stability  

22

7

6

23

18

11

5’-GACCATImHTTImHGCAGCG-3’ 3’-CTGGTA AA CGTCGC-5’

9

21

20

19

8

10

T6T8ImH+  

22

6

7

23

18

11

5’-GACCATTImHTImHGCAGCG-3’ 3’-CTGGTAA A CGTCGC-5’

9

21

20

19

8

10

T7T8ImH+  

0,0  

0,2  

0,4  

0,6  

0,8  

1,0  

1,2  

5   6   7   8   9   10  

δobs,  norm  

pH  

T8ImH+  T6ImH+  

Building  block  

0,0  

0,2  

0,4  

0,6  

0,8  

1,0  

1,2  

5   6   7   8   9   10  

δobs,  norm  

pH  

T7ImH+  

Building  block  

T8ImH+  

T6T8ImH+   T7T8ImH+  

System   pKaH   Δ  pKaH  

T6T8ImH+  T6ImH+   7,82  ±  0,07   -­‐  0,10  

T8ImH+   8,90  ±  0,05   ≈  

System   pKaH   Δ  pKaH  

T7T8ImH+  T7ImH+   6,96  ±  0,07   -­‐  0,96  

T8ImH+   8,70  ±  0,06   -­‐  0,20  

•  Increase   in  melBng   temperature   is   consistent  with   presence   of   the   pKaH   regulaBng  moBf  for  T8ImH+  in  both  systems    

 •  Increase   in   melBng   temperature   is   less   pronounced   with   increasing   vicinity   of   the  

imidazole  funcBonaliBes  

•  In  both  systems  the  T8ImH+  funcBonality  shows  an  increased  pKaH  value  due  to  the  intact  moBf    •  For  the  other  TImH+  funcBonaliBes  (T6  or  T7ImH+)  pKaH  decreases  with  increasing  proximity  due  to  repulsive  posiBve  

charge  interacBons