Titolo

Sommario

Massa 1

Massa 2

Stato dell’arte

The Field-Flow Fractionation principleThe Field-Flow Fractionation principle

Thickness

External fieldSample introduction

Flow

Detector

Length

Breadth

Parabolic flow

Th

ickn

ess

Sample

HF FlFFF / perché?

• A

• A

• B

• C

• D

The HF FlFFF channelThe HF FlFFF channel

FlowFlowFieldField

FlowFlow

1/8” 1/8” PEEK ferrulePEEK ferrule1/8” 1/8”

PEEK ferrulePEEK ferrule

1/8” 1/8” Teflon tubeTeflon tube

cPVC / PSfcPVC / PSfHF membraneHF membrane24x0.08 ID cm24x0.08 ID cm

1/8” 1/8” PE fittingPE fitting

1/8” 1/8” PE TeePE Tee

Modo normale in HF FlFFFModo normale in HF FlFFF Meccanismo di ritenzione BrownianoMeccanismo di ritenzione Browniano

vlFlussoFlusso

radV

inV outV

z

CampoCampo

L

Ux

rrff

2

2

12fr

zvzv

D

Uzczc exp0

Fase mobile:

Ammonio acetato 50 mM ;pH7

Vin=0.70 ml/min ;Vrad=0.38 ml/min

BSA 2% in FM ;mw 66 kDa

Hrp 1% in FM ; mw40 kDa

AP 1% in FM ; mw 160 kDa

Fer 1% in FM ; mw 449 kDa

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

50

100

150

200

250

300

segna

leU

V @

280 n

m (

mA

U)

tempo (min)

Frazionamento di proteine in HF FlFFF

9,5 10,0 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5

-8,5

-9,0

-9,5

-10,0

-10,5

-11,0

AP

BSA

Fer

Hb

Hrp

mioln D

ln M

Y = A + B * X

Parameter Value Error

A -5.929670.30651

b -0.375130.02702

Costruzione della retta di taratura lnD vs lnM

tR= —8D

ln —Vout

VinD= kT

3d

rf2

D=A M-b

NUOVO ASSETTO STRUMENTALE PER ACCOPPIAMENTONUOVO ASSETTO STRUMENTALE PER ACCOPPIAMENTOHF FFF ES/TOF/MSHF FFF ES/TOF/MS

mobileFase

He

W

W

oo o

oo o

ES/TOF/MS

Rivelatore UV-VIS (DAD)

POMPA II

Acquisizione ed elaborazione

dati

Acquisizione ed elaborazione

dati

POMPA I M1

M2

W

Hol

low

fib

er

56000 58000 60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000 80000mass0

100

%

+55

1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850m/z0

100

%

+50+45

+40

+36+60

66397.8Peso Molecolare calcolato:66397.81±1.74Peso Molecolare teorico: 66398.61

BSA non denaturata

UV

TIC

Spettro HF-FFF-MS della MioglobinaSpettro HF-FFF-MS della Mioglobina

17400 17450 17500 17550 17600 17650 17700 17750 17800 17850mass0

100

%

1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0

100

%

2196.71

1952.90

1757.67

1959.69

1970.98 2189.54

2510.602204.62

2212.08 2928.752519.242704.01

A9 A8

A7

A6

17566.70

A:17566.69±0.58 Da

Peso Molecolare Mioglobina:16951.51 Da

Peso Molecolare Eme:615.35 Da

1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600

m/z0

100

%

0

100

%

2196.71

1952.90

1757.67

1959.69

1971.08 2189.54

2510.712204.62

2212.08 2519.24

1542.04

1696.15

1546.95

1551.66

1615.49

1884.521701.41

1706.88

1785.45

2119.911890.46

1995.272422.66

B11 B10

B9

B8B7

A10

A9 A8

A7

A:17566.69±0.58 Da

B:16951.48±0.27 Da

HF-FFF-MS

LC-MS

UV

UV

1925 1930 1935 1940 1945 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995m/z0

100

%

0

100

%

1952.86

1946.83

1955.23

1957.74

1960.11

1973.461971.011962.10 1975.60

1952.90

1947.11

1959.71

1955.43 1970.981964.60

A9

A9

+Na+

+2Na+

+3Na+

+CH3COO-

Introduzione Diretta

HF-FFF

Confronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/EmeConfronto spettri ES/MS del complesso Mioglobina/Eme

1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600m/z0

100

%

D212021.55

F221967.09D22

1929.76C22

1925.72F231881.54D23

1845.88

C231842.05

A221888.27

C212017.34

B211982.61

F212060.65

E212056.50

D202122.62

C202118.21

A202077.15

F202163.65

E202159.32

F192277.42D19

2234.34

C192229.48

2168.61

F182403.89D18

2358.292353.22

2281.38B18

2312.61

E182399.04

2364.08

D172497.09

C172491.802409.55

2412.89

F172545.25

2497.97 2550.92

2601.99

41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0

100

%

A41521.9

B41600.4

C42343.1

D42422.0 E

43165.0

F43243.0

Spettro dell’HRPTICUV

41200 41400 41600 41800 42000 42200 42400 42600 42800 43000 43200 43400 43600mass0

100

%

C42343.1

D42422.0

E43165.

0

F43244.1

GlicosilazioneGlicosilazioneA

41521.5

B41600.

4

2 Ca 2+

2 Ca 2+2 Ca 2+

Conclusioni e Prospettive

Ringraziamenti

EfficiencyEfficiency in HF FlFFF in HF FlFFF

0*

2

min 2LL

Dc

crHt LoDfr

ipolylongneqH

injHHHHH

FocusingFocusing

L0

radV

inV outV

van Bruijnsvoort, M.; Kok, W.Th; Tijssen, R. Anal Chem 2001, 73, 4736

ElutionElution

1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500m/z0

100

%

13700 13800 13900 14000 14100 14200 14300 14400 14500 14600 14700 14800 14900mass0

100

%

+8

+9+7

+6+10

Peso Molecolare misurato:14304.94±0.35 DaPeso Molecolare teorico: 14305.16 Da

14304.9

13600 13700 13800 13900 14000 14100 14200 14300 14400 14500 14600 14700 14800 14900mass0

100

%

+8

+7

+9

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 2700 2800 2900m/z0

100

%

Peso Molecolare misurato:14305.06±1.05 Da

14305.1

Spettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSASpettro ES/MS del lisozima separato in FFF dalla BSA

1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450m/z0

100

%

60000 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 76000 78000mass0

100

%

Peso Molecolare misurato:66399.53±4.38 Da

66399.53

Liso+8

Liso+7+40

+35

+30

+27

+43

Spettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozimaSpettro ES/MS della BSA separata in FFF dal lisozima

TICUV

The HF FlFFF instrumental schemeThe HF FlFFF instrumental scheme

Waste

Meteringvalve

4-wayvalve

T-valve

Mobilephase

0

1 23

Waste

Injectionport

Meteringvalve

Mobilephase

0.75

0.750.75

0.50

Pump 1

0.75

0.750.75

0.50

Pump 2

Ho

llo

w f

iber

ch

ann

el

Pressuregauge

Pressuregauge 0

1 23

UV-DADUV-DAD

ESI/qTOFESI/qTOF

Splittingvalve