1

D D S.

DIAGNOSTIC Str. Vatra Luminosa, nr. 45, sect. 2, Bucuresti telefon: 0213440771, fax: 0214104009,

e-mail: office@ddsdiagnostic.ro

Manual de utilizare

Pentru analize de rutina

FreeT4 ELISA

Determinare imunoenzimatica directa a T4 liber (free T4-tiroxina libera) din ser uman

Varianta 2.2

96 teste

FT4 024 var.2.2

CUPRINS

2

Scopul 3

1 Semnificatia clinica 3

2 Principiu 3

3 Componente trusa 4

4 Materiale necesare neincluse in trusa 4

5 Preparare reactivi 4

6 Conditii de pastrare 5

7 Proba biologica 5

8 Precautii 5

9 Procedura de lucru 6

10 Controlul de calitate 7

11 Calculul rezultatelor 7

12 Exemplu de curba standard 7

13 Valori asteptate 8

14 Performante si caracteristici 8

15 Managementul deseurilor 9

16 Conditii de pastrare si transport 9

17 Bibliografie 9

18 Schema analizei 10

19 Simbol 11

3

Tiroxina libera (FreeT4)

Determinarea imunoenzimatica directa a FreeT4 in ser uman

SCOPUL

Acesta trusa se utilizeaza pentru determinarea cantitativa prin metoda imunoenzimatica, colorimetrica a tiroxinei libere (FreeT4) din ser uman.

1. SEMNIFICATIA CLINICA

Tiroxina (T4) este un hormon produs de glanda tiroida. In sinteza acestui hormon, un component important este iodul. Fractia majoritara de hormoni tiroidieni la nivelul sangelui este tiroxina (T4). Tiroxina

este transformata la nivel celular in triiodotironina activa prin intermediul deiodinazei (5’-iodinaza).

Principalul mod de transport in organism al hormonilor tiroidieni il constituie legarea acestora de o proteina si anume “thyroxine-binding globulin” (TGB).

Doar o mica fractie (0,03%) din acesti hormoni este libera (nelegata de proteina), aceasta fractie fiind biologic activa. Din aceasta cauza masurarea concentratiei hormonilor tiroidieni totali poate induce in

eroare si trebuie corelata cu concentratia hormonilor tiroidieni liberi.

Concentratia sanguina a hormonilor tiroidieni se afla sub controlul unui sistem de feedback negativ, in care este implicat TSH. Legarea tiroxinei de TGB constituie un rol cheie in sistemul de feedback.

Factorii ce pot influenta cresterea sau scaderea T4 total sanguin includ hormonii estrogeni (contraceptive orale, sarcina) sau medicamente care se leaga competitiv de TBG .

Hormonii tiroidieni au rol esential in dezvoltarea optima si in diferentierea celulara. De asemenea, acestia regleaza metabolismul proteinelor, grasimilor si carbohidratilor, influentand modul in care celulele

umane utilizeaza substantele generatoare de energie. Exista numerosi factori fiziologici si patologici care pot influenta sinteza hormonilor tiroidieni.

Tirotoxicoza sau hipertiroidismul sunt afectiuni datorate cresterii concentratiei de FT4 sau FT3 sau a ambelor fractii.

2. PRINCIPIUL TESTULUI

Aceasta este o metoda ELISA competitiva. Godeurile placii ELISA sunt acoperite cu T4. Peste T4 (din godeuri) se adauga proba, care contine antigen liber nativ (FT4) si apoi conjugatul enzimatic care

contine anticorp anti-T4 conjugat cu peroxidaza din hrean (HRP). Pe perioada incubarii, T4 din godeuri si FT4 prezent in proba concureaza pentru ocuparea situsurilor de legare ale anticorpului anti-T4 din

conjugatul enzimatic. Dupa timpul de incubare la temperatura camerei godeurile sunt spalate cu solutie de spalare (preparata asa cu este descris la punctul 5.2) pentru indepartarea conjugatului T4 care nu s-a legat.

Se adauga o solutie de TMB/H2O2 si apoi se incubeaza la temperatura camerei, rezultand o culoare albastra. Reactia este stopata cu H2SO4 0,2 M si absorbanta este citita cu spectrofotometru la 450 nm cu referinta

de 620-630 nm. Activitatea enzimatica a fractiei anticorp legat este invers proportionala cu concetratia de antigen liber nativ (FreeT4 din ser).

3. COMPONENTE TRUSA

3.1 Placa ELISA: 1x96 godeuri detasabile, acoperite cu T4, ambalate in folie de aluminiu. Dupa deschidere, placa se poate pastra la 2-8ºC timp de 2 luni.

3.2 Standarde FT4: 6 flacoane x 1ml/flacon. Matricea pentru standarde este ser uman in tampon fosfat (PBS). Contin conservanti.

Concentratii: 0 ; 0,38 ; 0,77; 1,93 ; 3,87; 7,75 ng/dl.

Nota. Dupa deschidere, standardele se pot pastra pana la 2 luni la 2-80C, in flacoane bine inchise.

3.3 Control 1: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 mL apa distilata.

Control 2: 1 flacon ser control liofilizat, se adauga 1 mL apa distilata.

Matricea pentru standarde este ser uman in tampon fosfat (PBS). Contin conservanti.

Concentratiile exacte sunt trecute pe flacon si in Certificatul de analiza. Dupa reconstituire, controlele se pot pastra pana la 2 luni la 2-80C, in flacoane bine inchise.

3.4 Solutie conjugat: 1 flacon x 11 ml, culoare rosie. Contine anticorp monoclonal anti-T4 (in Tris-NaCl cu BSA) conjugat cu peroxidaza din hrean (HRP). Contine conservanti: ProClin 300, 0.2 %.

Nota. Dupa deschidere, solutia conjugat se poate pastra pana la 2 luni la 2-80C la intuneric, in flacon bine inchis.

3.5 Solutie substrat TMB: 1 flacon x 12 ml, culoare roz. Contine tetrametilbenzidina cu peroxid, TMB. H2O2 0,25 g/l. Nota. Dupa deschidere, solutia substrat se poate pastra pana la 2 luni la 2-80C la

intuneric, in flacon bine inchis.

3.6 Solutie de stopare: 1 flacon x 7,5 ml. Contine acid sulfuric 0,2 M.

4

Nota. Dupa deschidere, solutia stopare se poate pastra pana la 2 luni la 2-80C la intuneric, in flacon bine inchis.

3.7 Solutie de spalare concentrata (de 40x): 1 flacon x 25 ml. Contine tampon fosfat (PBS) cu Tween 20. Nota. Dupa deschidere se pastreaza asa cum este specificat la punctul 5.2.

4. MATERIALE NECESARE NEINCLUSE IN TRUSA

4.1 Apa distilata

4.2 Pipete automate cu volum reglabil

4.3 Incubator

4.4 Spalator automat pentru sistem ELISA sau pipeta multicanal

4.5 Cititor ELISA cu filtru pentru lungime de unda 450 nm si 620-630 nm.

4.6 Hartie de filtru/absorbanta

4.7 Cronometru

4.8 Materiale control de calitate

5. PREPARARE REACTIVI

5.1 Standardele sunt gata de lucru.

5.2 Solutia de spalare: Se dilueaza continutul solutiei de spalare cu apa deionizata sau distilata in raport 1 volum solutie de spalare concentrata + 39 volume apa (ex. 25 ml solutie spalare concentrata cu 975

ml apa deionizata/distilata). Solutia preparata se poate pastra timp de 2 luni la temperatura camerei.

Solutia concentrata dupa deschidere este stabila pana la data de expirare a trusei.

5.3 Preparare controale incluse in trusa. Se adauga 1 mL de apa distilata, se omogenizeaza usor si se lasa sa se dizolve 30 minute.

5.4 Se seteaza incubatorul la temperatura de 370C.

6. CONDITII DE PASTRARE

Toate componentele trusei se pastreaza la 2-8°C. Nu se utilizeaza dupa data de expirare.

Reactivii sunt stabili timp de 60 zile dupa deschiderea trusei, daca sunt pastrati la 2-8oC si la intuneric.

Placa este stabila dupa deschidere, pana la data de expirare a trusei.

Ambalajul placii ELISA se deschide, NUMAI atunci cand a ajuns la temperatura camerei, se scoate numarul de godeuri necesar, dupa care se reambaleaza IMEDIAT si se introduce la frigider. Godeurile

se lucreaza IMEDIAT.

7. PROBA BIOLOGICA

Recoltarea de probe de sange se implementeaza in acord cu practicile curente. Proba folosita poate fi doar ser. Separarea serului se face cat mai rapid dupa recoltare pentru a evita hemoliza, care poate

afecta performantele testului. Fibrina din probe poate da rezultate fals positive.

Probele de ser pot fi pastrate la 18-250C pentru 8 ore sau la 3 zile la 2-8oC sau 30 zile la -20oC.

Atentie! Serul decongelat se lucreaza imediat si NU se recongeleaza! Folosirea probelor hemolizate, lipemice precum si cele cu fibrina pot da rezultate false.

8. PRECAUTII

8.1 Trusa se utilizeaza NUMAI pentru diagnostic in vitro in laboratoare medicale si NUMAI de catre personal specializat.

8.2 Pentru informatii privind substantele chimice si componentele biologice din trusa va rugam sa solicitati Fisa Tehnica de Securitate.

8.3 Materialele de origine umana folosite in prepararea serulul de control au fost testate si gasite nereactive pentru HBsAg, HIV1/2 si anticorpi HCV. Cu toate acestea se recomanda utilizarea lor ca si cum ar

fi potential infectate.

8.4 Evitati ca Solutia de stopare sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine acid sulfuric 0,15mol/L), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact accidental se recomanda spalarea

zonei cu cantitati mari de apa si neutralizarea cu solutie diluata de bicarbonat de sodiu. Se va solicita consult medical.

8.5 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu pielea sau mucoasele (contine tetrametilbenzidina si peroxid), deoarece poate provoca iritatii sau arsuri. In caz de contact accidental se recomanda spalarea

zonei cu cantitati mari de apa. Se va solicita consult medical.

8.6 Evitati ca Solutia substrat sa vina in contact cu lumina directa, metale sau oxidanti.

8.7 Nu se va pipeta cu gura.

8.8 Nu se mananca, bea, fumeaza in zona de lucru.

8.9 Este obligatorie purtarea echipamentului de protectie: halat, manusi latex. Contaminarea microbiana a reactivilor si a probelor poate conduce la rezultate false.

5

8.10 Manipularea reactivilor si a probelor, precum si indepartarea reziduurilor se va face respectand legislatia nationala in vigoare.

8.11 Pentru a obtine rezultate optime se recomanda respectarea protocolului de lucru, precum si calibrarea pipetelor si a cititorului.

8.12 Este interzisa utilizarea componentelor kit-urilor de la loturi diferite.

8.13 Trusa NU se va folosi pentru screening-ul noilor nascuti.

9. PROCEDURA DE LUCRU

9.1 Instructiuni generale:

Reactiile imunoenzimatice sunt puternic influentate de temperatura si timpul de reactie.

Reactivii, materialele de control trebuie sa fie la temperatura camerei inainte de inceperea testului;

Pentru a evita contaminarea se vor folosi varfuri de pipeta separate pentru fiecare standard, control, proba.

Se vor respecta cu strictete timpul si temperatura de incubare. Testul odata inceput, nu poate fi interupt. Asigurati-va ca aveti pregatiti toti reactivii si consumabilele necesare, precum si aparatura.

Se recomanda ca standardele, controalele si probele sa se lucreze in duplicat. Pentru fiecare set de probe lucrate se recomanda sa se realizeze curba de calibrare.

9.2 Modul de lucru:

1. Se scoate numarul de godeuri necesar din ambalaj. Godeurile care nu se utilizeaza se introduc in folia aluminizata (cu desicator) si apoi in punga de plastic cu fermoar si se inchide bine.

2. Se pipeteaza 50 µl din fiecare standard, control si proba in godeul corespunzator. Pipetarea probelor nu trebuie sa depaseasca 10 minute pentru a evita erorile de analiza.

3. Se pipeteaza 100 µl solutie conjugat in fiecare godeu.

4. Se roteste placuta cu grija, timp de 30 sec. pentru omogenizare.

5. Se incubeaza 60 minute la 37oC.

6. Se indeparteaza tot continutul godeurilor, prin aspirare.

7. Se spala godeurile de 5 ori cu 350 µl solutie spalare diluata. Se preseaza energic placuta cu godeurile in jos pe o hartie absorbanta de 2-3 ori, pentru a indeparta cat mai bine picaturile de lichid ramase

dupa spalare. Nu trebuie lasate godeurile sa se usuce dupa spalare pana la adaugarea solutiei substrat.

Atentie! Etapa de spalare si indepartare a lichidului din godeuri este esentiala in obtinerea unor rezultate corecte!

8. Se adauga 100 µL solutie substrat TMB in fiecare godeu.

9. Se incubeaza 20 minute la temperatura camerei (22-28oC), la intuneric.

10. Se adauga 50 µL solutie de stopare in fiecare godeu pentru a opri reactia.

11. Se roteste usor 30 sec. pentru omogenizare.

12. Se citeste densitatea optica (OD) la 450 nm cu referinta 620-630 nm la spectrofotometru. Citirea trebuie sa se efectueze in maxim 15 minute de la adaugarea solutiei de stopare.

Atentie! Atat la pipetare cat si la manipularea godeurilor se evita atingerea partii inferioare atat pe interior cat si pe exterior! Pipetarea reactivilor trebuie facuta in aceeasi ordine a godeuri.

10. CONTROLUL DE CALITATE

Pentru validarea rezultatelor se recomanda ca fiecare laborator sa utilizeze probe de control, cu valori cunoscute, pentru nivel normal si patologic. Probele de control vor fi lucrate ca si probele de pacient

cu valori necunoscute. Pentru a urmari performantele metodei, valorile controalelor se vor inregistra si interpreta statistic. Daca valorile controalelor nu se incadreaza in limitele acceptabile stabilite de

laborator, va rugam sa verificati urmatoarele: modul si timpul de pipetare, modul de spalare, conditiile de incubare, modul de pastrare si data de expirare a reactivilor.

11. CALCULUL REZULTATELOR

11.1 Se calculeaza media absorbantelor pentru standarde, controale si probe (daca s-au lucrat in duplicat).Se realizeaza curba de calibrare astfel: pe axa Y (verticala) se inregistreaza absorbanta, iar pe axa X

(orizontala) se inregistreaza concentratia. Se reprezinta grafic valorile standardelor – absorbanta functie de concentratie, obtinandu-se astfel, o curba. Valoarea absorbantei probei (ser, plasma) se

extrapoleaza pe curba de calibrare, aflandu-se astfel, valoarea concentratiei probei. Valorile se pot obtine automat cu ajutorul soft-ului cititorului de placi ELISA, se recomanda pentru analize

imnunologice utilizarea tipului de curba 4PL (four Parameters Logistic) sau Point-to-point.

11.2 Concentratia probelor se poate obtine direct de pe curba de calibrare. Pentru probele cu concentratii mai mari decat a celui mai mare standard, se recomanda diluarea acestor probe cu standard 0. Pentru

calculul concentratiei probelor diluate se va tine cont de factorul de dilutie.

6

12. EXEMPLU DE CURBA STANDARD

Absorbanta fiecarui standard citita la lungimea de unda de 450 nm cu referinta 620-630 nm este reprezentata pe axa Y în functie de concentratia reprezentata pe axa X. Aceasta curba standard este doar un

exemplu si nu trebuie folosit pentru a calcula concentratiile probelor necunoscute. Fiecare laborator trebuie sa-si foloseasca propriile rezultate obtinute si curba standard proprie.

FT4 (ng/dl) Absorbanta (450 nm)

Ref. 630 nm

0 2,666

0,38 2,161

0,77 1,604

1,93 0,637

3,87 0,431

7,75 0,133

13. VALORI ASTEPTATE

Un studiu efectuat pe un lot de 120 persoane clinic sanatoase la momentul testarii, a condus la obtinerea urmatoarelor valori (pentru metoda ELISA):

Valoare medie

(ng/dl)

Domeniu (ng/dl)

Adult 1,2 0,65 – 1,74

Se recomanda ca fiecare laborator sa isi stabileasca propriul domeniu de valori normale, in functie de populatie.

14. PERFORMANTE SI CARACTERISTICI

14.1 Precizia

Variatia intra-serie

S-a determinat prin masurarea concentratiei FT4 in replicat (20x) utilizand 2 seruri de control pe nivele diferite.

Control

n

Concentratia medie

(ng/dL)

CV (%)

1 20 1,42 2,08

2 20 2,51 2,91

Variatia inter-serie

S-a determinat prin masurarea concentratiei FT4 in replicat (2x) utilizand 2 seruri de control pe nivele diferite si doua loturi diferite de reactivi, o data pe zit imp de 20 zile.

Control n Concentratia medie

(ng/dL)

CV%

1 40 1,16 6,94

2 40 1,71 2,85

14.2 Sensibilitatea

Determinarea sensibilitatii s-a realizat prin utilizarea standardului 0 in replicat de (20X) in cadrul aceleasi analize. Concentratia minima de FT4 detectata a fost de 0,19 ng/dl.

7

14.3 Specificitatea anticorpilor (Reactivitatea incrucisata).

Reactivitatea incrucisata a anticorpilor tiroxina este prezentata in tabelul urmator:

Substanta Reactivitate

incrucisata,%

L-Tiroxina 100

L-Triiodotironina 1,89

D-Triiodotironina 1,44

Diiodotironina 0,003

3-iodo-L-tirozina 0,002

3,5-diodo-L-tirozina 0,008

14.4 Corelarea cu alte metode

Trusa a fost comparata cu Roche Cobas FT4. Au fost utilizate probe provenind de la donatori cu hipotiroidie, eutiroidie si hipertiroidie (valorile s-au inscris in domeniul: 0,3 ng/dl – 7,77 ng/dl). Au fost testate

219 probe.

Corelarea s-a realizat prin metoda regresiei lineare: y = 0,9877x – 1,528 cu coeficientul de corelare 0,985.

14.5 Efectul Hook

Nu este prezent pana la o concentratie de 100 ng/dl.

15 MANAGEMENTUL DESEURILOR

Reactivii si deseurile trebuie utilizate si eliminate din circuitul laboratorului conform normelor legislative in vigoare.

16 CONDITII DE DEPOZITARE SI TRANSPORT

Valabilitatea este indicata pe cutie. Trebuie pastrata in loc intunecat la 2-80C. Transportarea se poate face cu orice mijloc de transport acoperit la 9-200C nu mai mult de 10 zile. Inghetarea este interzisa.

17 BIBLIOGRAFIE

1. Dinu V., Trutia E., Cristea-Popa E., Popescu A., Biochimie Medicala – Mic tratat, Ed. Medicala, 1996.

2. Cucuianu M., Crisnic I., Plesca-Manea L., Biochimie Clinica, Ed. Dacia, 1998.

3. Analize de laborator si alte explorari diagnostice, Ed. MedicArt, 2007.

8

18. SCHEMA ANALIZEI FT4

Pregatirea testului

Pregatirea reactivilor si probelor conform procedurii descrise.

Selectarea numarului de godeuri si inserarea lor in suportul special destinat.

Procedura de lucru

Standard 0-5 Control Proba

Standard 0-5 50 µL - -

Control - 50 µL -

Proba - - 50 µL

Solutie conjugat 100 µL 100 µL 100 µL

Se agita usor microplaca 30 secunde pentru omogenizare.

Se acopera godeurile cu o bucata de hartie.

Se incubeaza timp de 1 ora la 370C.

Se spala de 5 ori cu 350 µL de solutie de spalare diluata (ca la pct. 5.2).

Substrat TMB 100 µL 100 µL 100 µL

Se incubeaza 20 minute la temperatura camerei 22-280C, la intuneric.

Solutie stopare 50 µL 50 µL 50 µL

Se agita usor microplaca pentru amestecarea completa a solutiilor.

Se citeste absorbanta solutiei din godeuri in maxim 15 minute, la 450 nm si referinta 620-630 nm, cu un spectrofotometru de microplaci.

9

19. Simbol

Simbol Definitie

Risc biologic

Instructiuni de utilizare

Termen de valabilitate

Numarul total de teste

Data productiei

Numar lot

Precautie, consultati manualul de instructiuni

Diagnosticare in vitro

Limita de temperatura

Numar de catalog

Ferit de lumina solara

Initialele marcajului de conformitate “CE” conform

Anexa X din Directiva 98/79/CE

Adresa si datele producatorului conform directivelor

UE/90/385/CEE, 93/42/CEE si 98/79/CE

LOT

IVD

REF