THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Nguyễn Bích Nhi Viện Công nghệ Sinh họcMasashi SuzukiNational Istitute of Bioscience and Human Technology, Tsukuba, Japan

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast Growth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine, được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phân bào mạnh. Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạch máu, sửa chữa và làm lành vết thương... (Mc Keehan và cs., 1998).

Nhiều thành viên của nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệu peptide mã hóa cho các protein tiết. FGF-10 là thành viên thứ 10, dược phát hiện ra bởi Yamasaki và cs., 1996. cDNA của hFGF-10 mã hóa cho một protein gồm 208 acid amin, trong đó 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, là đoạn có vai trò như một tính hiệu peptide (Yamasaki và cs., 1996, Emoto và cs., 1997. Do đó FGF-10 có thể có khả năng tiết. Nhiều thành viên của nhóm FGF như FGF-5 (Bates và cs., 1991; Ozawa và cs., 1998, Clements và cs., 1993), FGF-6 (Asada và cs), FGF-7 (MacArthur và cs., 1995), FGF-9 (Santos - Ocampo và cs., 1996) ... có chứa vị trí N-glyccosyl và một số thành viên của nhóm FGF được tinh chế ở dạng glycosyl hóa. Để nghiên cứu, tìm hiểu các tính chất của FGF-10 và sự biến đổi của nó liên kết với các mạch carbohydrate , chúng tôi đã sử dụng và thiết kế vector pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hiện hFGF-10 ở các tế bào động vật có vú.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. ARN tổng số từ não người (Toyobo)

2. Vector tách dòng PCR -TRAP (GenHunter)

3. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)MycHis Version B (Invitrogen).

4. Làm sạch sản phẩm PCR: sử dụng PCR QiaQuick PCR Kit (Qiagen)

5. Tách ADN plasmid sử dụng MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem)

6. Xác định trình tự ADN sử dụng thiết bị ABI 310 - PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thiết kế cặp mồi để biểu hiện hFGF-10 ở tế bào động vật có vú:

Dựa vào trình tự của toàn bộ đoạn gen hFGF-10 (số đăng kí trong Gen Bank là AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhân hFGF-10 đã được thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-) Myc-His để biểu hiện ở tế bào động vật có vú với đầu 5' gắn thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và đầu 3' gắn vị trí cắt của enzym HindIII. Trình tự cặp mồi như sau:

2. Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) : 

Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ) từ ARN tổng số được tách ra từ não người và cung cấp bởi hãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reverse transcriptase) đã được tiến hành trong tổng thể tích 50 l với các thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm 5 X RT, 2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithio threitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5l RNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLV Reverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùng và 4l ARN tổng số (250 ng/l). Phản ứng được tiến hành ở 37oC trong 75 phút. Sau đó hỗn hợp phản ứng (cDNA đã được tổng hợp) được pha loãng 10 lần bằng nước cất và bảo quản ở -20oC.Phản ứng PCR được tiến hành tiếp theo sử dụng cDNA vừa được tổng hợp làm mẫu (template) để nhân toàn bộ đoạn gen hFGF-10. Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 25l bao gồm: 11l nước cất vô trùng, 2.5l 10 X đệm Pfu, 2l dNTPs (2.5mM), 8l sản phẩm của phản ứng RT đã pha loãng 10 lần, 0.5l mồi xuôi (10pmol), 0.5l mồi ngược (10pmol) và 0.5l Pfu polymerase (0.5U/l). Chương trình chạy PCR: các điều kiện để chạy PCR đã được tối ưu hóa như sau: Biến tính ở 94oC trong 2 phút; 40 chu trình : 94oC trong 45 giây, 55oC trong 45 giây và 72oC trong 2 phút; lần kéo dài chuỗi cuối cùng ở 72oC trong 10 phút.

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy sản phẩm PCR là một băng đậm đặc hiệu, có kích thước khoảng 650 bp tương đương với kích thước của hFGF-10 có cộng thêm các vị trí cắt của các enzyme giới hạn đã thiết kế. Để kiểm tra xem sản phẩm PCR nhận được có phải là hFGF-10 hay không, sản phẩm PCR sau khi được tinh chế bằng Qia Quick Kit đã được cắt bằng enzyme NsiI và ScaI. Phản ứng cắt kiểm tra được tiến hành trong tổng thể tích là 10l với các thành phần như sau: 1l đệm 10X NsiI (hoặc đệm NE-II đối với ScaI), 2l sản phẩm PCR, 0.8lNsiI enzyme. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37C trong 1 giờ. Sản phẩm thủy phân được điện di để kiểm tra trên gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2).

Hình1: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn /HindIII.

Hình 2. Kiểm tra cắt sản phẩm PCR bằng enzyme ScaI . Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp; đường chạy số 2: sản phẩm PCR sau khi bị cắt bởi ScaI.

Kết quả nhận được ở hình 3 cho thấy sản phẩm PCR sau khi bị thủy phân bởi enzyme ScaI có 1 điểm cắt trong trình tự của hFGF-10 tại vị trí 273 sản phẩm PCR sau khi xử lí ScaI được chia thành 2 băng nhỏ hơn có kích thước khoảng 273 và 357 bp (hình 3, giếng 2). Như vậy sơ bộ có thể cho rằng sản phẩm PCR nhận được có nhiều khả năng là hFGF-10.

2. Tách dòng hFGF-10:

Để kiểm tra trình tự của sản phẩm PCR, vector tách dòng (PCR-TRAP Cloning System, version 3.0- GenHunter Corporation). Sản phẩm PCR được gắn vào vector TRAP trong tổng số 10l với thành phần sau: 2l PCR-TRAP vector đã chuẩn bị sẵn sàng để gắn các đoạn gen (insert), 1l 10X đệm gắn (ligation buffer), 2.5l sản phẩm PCR và 1l T4 -DNA ligase. Phản ứng được tiến hành ở 16C, qua đêm (khoảng 16 giờ). Sau đó hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào các tế bào khả biến chủng vi khuẩn GH với thành phần phản ứng bao gồm: 20l tế bào khả biến GH , 4l hỗn hợp phản ứng trên để ở trong đá (0C) trong 45 phút. Sốc nhiệt ở 42C trong 2 phút rồi để ngay vào đá 2 phút và cho thêm vào 0.4 ml môi trường LB (Luria-Bertani) lỏng, trộn đều và nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) tiếp ở 37C trong 1 giờ. Sau đó cấy trải dịch nuôi cấy trên lên đĩa petri LB đặc có bổ sung tetracycline (nồng độ cuối cùng 20 g/ml). Để đĩa petri qua đêm trong tủ ấm 37C qua đêm. Hôm sau kiểm tra đĩa thấy mọc các khuẩn lạc trắng. Kiểm tra sự gắn của sản phẩm PCR vào vector bằng cách phân tích khuẩn lạc. Lấy một ít khuẩn lạc bằng đầu côn cho vào ống eppendorf vô trùng có chứa 50l đệm TE (10mM Tris, 1mM EDTA pH8) có bổ sung 0.1% Tween 20. Trộn đều và ủ ở 95C trong 10 phút. Li tâm nhanh. Lấy 2l dịch nổi làm mẫu để chạy PCR với thành phần như sau: 2l 10 X đệm PCR, 2ldNTPs (200 mol), 2l mỗi loại Lgh và Rgh mồi được cung cấp bởi Kit, 0.2l Taq DNA polymerase. Chương trình PCR như sau: 30 chu trình của 94C trong 30 giây, 52C trong 40 giây , 72C trong 1 phút; tiếp theo 72C trong 5 phút và kết thúc ở 4C. Sau khi chạy PCR, phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1.5% (hình 3).

Hình 3. Điện di phân tích khuẩn lạc bằng phương pháp PCR . Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn /HindIII; đường chạy số 2,3: sản phẩm PCR của khuẩn lạc 1 và 2; đường chạy số 4:thang ADN

chuẩn bậc thang 123 bp.

Kết quả phân tích khuẩn lạc cho thấy mẫu ADN của khuẩn lạc 1 cho 1 băng đặc hiệu có kích thước khoảng 770bp tương ứng với kích thước của đoạn gen hFGF-10 và cộng 120bp là phần thêm của vector TRAP như trong hướng dẫn sử dụng của vector. Như vậy ADN của khuẩn lạc 1 có mang đoạn gen cần gắn. Đối với mẫu khuẩn lạc 2, sản phẩm PCR là 2 băng có kích thước nhỏ không đúng với kích thước của đoạn gen cần gắn do đó ADN của khuẩn lạc 2 không chứa đoạn gen cần gắn.

Sau khi dã xác định được khuẩn lạc 1 có chứa đoạn gen nhân được, khuẩn lạc 1 được nuôi ở môi trường LB lỏng có bổ sung tetracycline và tách ADN plasmid sử dụng kit MiniPrep, ADN sau đó được kiểm tra OD260/280nm để định lượng và sử dụng 500 ng để xác định trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR nhân được có trình tự ADN hoàn toàn trùng khớp với trình tự của gen hFGF-10 trong ngân hàng gen, số đăng kí AB 002097 DDBJ. Như vậy là việc tách dòng gen hFGF-10 đã được thực hiện.

4. Gắn gen hFGF-10 vào vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His:

pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) là vector 5.5 kb được thiết kế để biểu hiện các protein tái tổ hợp trên tế bào động vật có vú. Vector có 3 vị trí đọc để gắn đoạn gen đích với đầu C tận cùng của polypeptide có gắn đuôi Histidine (His tag) và Myc (C-myc) epitope cho phép xác định và tinh chế hiệu quả protein tái tổ hợp. Promotor của vector -human cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu hiện cao ở nhiều loại tế bào động vật có vú. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-) Myc-His và vector tách dòng có chứa đoạn gen hFGF-10 cùng được xử lí bằng XhoI và HindIII, sau đó sản phẩm vector và gen đã xử lí enzyme được kiểm tra trên gel agarose 1% và tinh chế bằng phương pháp thôi gel, sử dụng Qia Quick Kit. Sau khi tinh sạch và xác định hàm lượng, gen được gắn vào vector nhờ phản ứng gắn sử dụng enzyme T4-ligase với thành phần như sau: 0.75l đệm gắn T4, 3l vector đã xử lí (250ng/l), 3.5l gen hFGF-10 (insert) đã xử lí (60ng/l) và 0.25l

T4-ligase. Phản ứng được thực hiện ở 16C qua đêm. và cấy trải trênaTiếp đó hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào tế bào khả biến DH5 đĩa LB có bổ sung ampicilline (50g/ml) và nuôi trong tủ ấm 37C qua đêm. Các khuẩn lạc được nuôi nhân trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline và tách ADN plasmid. Kiểm tra sự gắn của gen vào vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His bằng cách xử lí ADN plasmid tách được bằng 2 enzyme XhoI vàHindIII. Kết quả được thể hiện trên hình 4.

Hình 4. Các ADN plasmid được xử lí bằng enzyme XhoI và HindIII. Đường chạy số 1-5: ADN các plasmid từ 1-5 được xử lí bằng XhoI và HindIII; đường chạy số 6: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp.

Kết quả trên hình 4 cho thấy chỉ trừ các plasmid số 4 (đường chạy 4) là không chứa đoạn insert, các plasmid còn lại đều có chứa đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp tương ứng với hFGF-10. Như vậy việc gắn hFGF-10 vào vector biểu hiện pcDNA3.1(-)myc.his đã thành công. ADN của các plasmid này đã được sử dụng để chuyển gen hFGF-10 vào tế bào động vật có vú (Cos-7- tế bào thận khỉ) sử dụng các hóa chất chuyển gen (Lipo Fectamin-2000, SuperFect ).

KẾT LUẬN

1. Đã tách dòng được gen hFGF-10 từ ARN tổng số não người bằng phản ứng RT-PCR.

2. Đã thiết kế được vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His có gắn đoạn gen hFGF-10 để biểu hiện ở tế bào động vật có vú.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Asada M., Yoneda A., Oda Y., Ota K., Ozawa K., Fukuta K., Omae M., Orikasa N., Suzuki M., Oka S., Makino T. and Imamura T. (1999) Growth Factor 16, 293-303.2.Bates B., Hardin J., Zhan X., Drickamer K., and Goldfarb M.(1991). Mol.Cell Biol. 11,1840-1845.

3. Clements D.A., Wang J.K., Dionne C.A. and Goldfarb M. (1993)Oncogene 8, 1311-13164. Emoto H., Tafashira S., Mattei M.G. and Yamasaki M, (1997) J. Biol. Chem. Vol. 272, No.37, 23191-23194.5. Hsu Y.R., Hsu E.W., Katta V., Brankow D., Tseng J., Hu S., Morris C.F., Kenney W.C. and Lu H.S. (1998) Protein Expr.Purf. 12, 189-200.6. MacArthur C.A., Lawshe A., Shankar D.B., Heikinheimo M., Shackleford G.M. (1995) Cell Growth Differ. 6,817-825.7. McKeehan W.L., Wang F. and Kan M. (1998) Prog.Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59. 135-176.8. Revest J.M., DeMoerlooze L. and Dickson C. (2000) J.Biol.Chem. 275, 8083-8090.9. Santos-Ocampo S., Colvin J.S., Chellaiah A. and Ornitz D.M. (1996) J.Biol.Chem. 19, 1726-1731.10. Yamasaki M., Miake A., Tagashira S. and Itoh N. (1996) J.Biol.Chem. 271,15918-15921.11. Yoneda A., Asada M., Suzuki M. and Imamura T. (1999)Biotechniques 27, 576-590.

SUMMARY

Construction of mammalian expression vector For human fibroblast growth factor-10 (hfgf-10)

Nguyen Bich Nhi Institute of Biotechnology (IBT), NCSTMasashi SuzukiNational Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Tsukuba, Japan

Full length human Fibroblast Growth Factor (hFGF-10) cDNA (650 bp) was amplified from human brain total RNA (Toyobo) by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using synthetic oligonucleotide primers. These primers contain sequences that flank both ends of the full length hFGF-10 (amino acid 1-208) with additional XhoI and HindIII sites located at their 3’ and 5' ends, respectivetly. The amplified product was sub-cloned into the PCR-TRAP (GenHunter) cloning vector and the DNA sequence was verified by ABI310-PRISM Genetic Analyzer as the hFGF-10 (acession number AB 002097 in the DDBJ and GenBank Nucleotide Sequence Databases). For expression of recombinant hFGF-10 protein in mammalian cells, we used an expression vector, pcDNA3.1(-)Myc-His (Invitrogen) which is designed to introduce a C-terminal peptide containing a myc sequence and polyhistidine metal -binding sequence tags into the target protein for efficent detection and purification. The amplified product was digested with XhoI and HindIII restriction enzymes, purified by QiaQuick Kit (Qiagen) and was ligated at XhoI and HindIII sites of the corresponding sites of the enzyme-digested pcDNA3.1(-)Myc-His vector to allow production of recombinant protein in mammalian cells from T7 promoter . The ligation product then was transformed into the DH5- competent cells and cultured at 37C overnight. The plasmid DNAs were extracted from the culture of white colonies by using

MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem) and the recombinant expression pcDNA 3.1(-) Myc-His vector bearing hFGF-10 gene was confirmed by XhoI/HindIII enzyme digestion of plasmid DNAs.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc Dao.