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ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES. Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble. Exposé. La cytogénétique et l’épigénétique des cancers - PowerPoint PPT Presentation
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ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES
EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES
ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES
EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du
Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble
2/49
ExposéExposé
La cytogénétique et l’épigénétique des cancers
La méthylation des gènes suppresseurs de tumeur et les méthodes d’étude
Les épendymomes de l’enfant Les neuroblastomes de l’enfant Conclusions et Perspectives
3/49
La génétique et les cancersLa génétique et les cancers
Le cancer est une maladie génétique acquise Altération au niveau de gènes suppresseurs de
tumeur (GSTs) et oncogènes Altérations inactivatrices
Délétion Mutation Translocation
Hypothèse de Knudson Sélection d’un clone plus robuste Avantage prolifératif
4/49
L’épigénétiqueL’épigénétique
Altérations qui1. ne changent pas la séquence de l’ADN
2. sont transmises au cours des divisions cellulaires
3. sont potentiellement réversibles. Deux modifications principales:
1. Acétylation et méthylation des histones
2. Méthylation de l’ADN
5/49
Définition: L’addition d’un groupement méthyl au niveau du
carbone 5 d’une cytosine dans un dinucléotide CpG
Les méthyltransférases (DNMT1, DNMT3a et DNMT3b)
La méthylation de l’ADNLa méthylation de l’ADN
N
NH2
O N
C
C
C
C
C
Cytosine
Démethylase
S-adenosylhomocysteine
ADN Méthyltrasferase
S-adenosylmethionine
N
NH2
O N
C
C
C
C
CH3
5-mC
5-méthylCytosine
6/49
La méthylation de l’ADNLa méthylation de l’ADN
Les dinucléotides CpG sont peu fréquents dans l’ADN sauf dans les « îlots »CpGs
Plus grande part des « îlots » sont retrouvés dans la région promotrice des gènes
La méthylation pourrait entraîner la répression de la transcription de l’ADN
deux mécanismes possibles
7/49
Mécanisme 1: la région promotriceMécanisme 1: la région promotrice
Cytosine non méthylée
Cytosine méthylée
Promoteur
Séquence codante
Facteurs de transcription
8/49
Mécanisme 2: l’acétylation des histonesMécanisme 2: l’acétylation des histones
Histone déacétylée
Histone
Histone acétylée
CpG non méthylée
CpG méthylée
9/49
Méthylation et les processus physiologiquesMéthylation et les processus physiologiques
Rôle important dans l’embryogenèse 4-6% de toutes les cytosines sont méthylées
chez l’adulte Fonction normale comme
Inactivation des rétrotransposons Inactivation du X Empreinte parentale
10/49
Méthylation et carcinogenèseMéthylation et carcinogenèse
Hypométhylation globale Inactivation des gènes suppresseurs de
tumeur par hyperméthylation Nombreuses études dans les tumeurs de
l’adulte
11/49
Intérêts de la méthylationIntérêts de la méthylation
Compréhension des mécanismes du développement tumoral
Cible thérapeutique Utilisation comme marqueur diagnostique et
pronostique (suivi clinique)
12/49
Le profil de méthylationLe profil de méthylation
Le gène ne doit pas être méthylé dans le tissu normal
Un type histologique donné ne peut pas être caractérisé par la méthylation d’un seul gène
Établissement difficile d’un profil spécifique d’une tumeur
Cancers de l’enfant et épigénétique
Cancers de l’enfant et épigénétique
14/49
Les cancers de l’enfantLes cancers de l’enfant
Rares Morbidité et mortalité élevées Caractéristiques particulières
Histologie différente Comportement souvent très agressif Souvent bonne réponse au traitement
Maladie du développement Altérations épigénétiques moins étudiées
15/49
Epigénétique et tumeur solide de l’enfantEpigénétique et tumeur solide de l’enfant
P16MGMT
RARBDAPK
APCCASP8
RASSF1A
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
16/49
Epigénétique et tumeurs solides de l’enfantEpigénétique et tumeurs solides de l’enfant
1. Rétinoblastome
Rb1: rétinoblastomes unilateraux et sporadiques
Zeschnigk et al., J Med Genet. 36:793-4, 1999.
2. Ostéosarcome RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK, p16: 93%
Hou et al, Cancer 106 :1602-9, 2006.
17/49
Méthode d’étude: les gènes étudiésMéthode d’étude: les gènes étudiés
19 gènes suppresseurs de tumeur : Gènes impliqués dans le cycle cellulaire (Rb1, p14 ARF,
p15INK4b, p16INK4a) Gènes impliqués dans l’apoptose (RASSF1A, DAPK,
CASP8, DRC1, DRC2, FLIP) Gènes de la réparation de l’ADN (MGMT) Gènes impliqués dans l’angiogenèse, adhésion cellulaire
et le remodelage tissulaire (APC, ECAD, TIMP3) Autres (RAR , FHIT, BLU, INI1, NF2)
18/49
Méthode d’étude: les gènes étudiésMéthode d’étude: les gènes étudiés
DAPK MGMT
INI1NF2
EP300
APC
RB
BLU
FHIT
P16
19/49
Méthode d’étudeMéthode d’étude
« Methylation specific PCR » (MSP) réalisée en deux étapes:
1. Traitement avec le bisulfite de sodium
2. PCR avec des amorces spécifiques
20/49
Le traitement bisulfiteLe traitement bisulfite
Échantillon d’ADN: 5’-CATGCGGTCGACGT-3’
ADN modifié:
Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’
Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’
M MM
Traitement Bisulfite:
Toutes les cytosines non méthylées sont transformées en uraciles.
21/49
Methylation-specific PCRMethylation-specific PCR
Echantillon non méthylé:
5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’
MSP avec les amorces Non methylé (U) et methylé (M)
Amorce U: 3’- ATACACCAACTACA-5’
Echantillon méthylé:
5’-UATGCGGTCGACGT- 3’
U
Amplification
ADN traité
M
Pas d’amplification
Echantillon non méthylé
Amorce M: 3’-ATACGCCAGCTGCA-5’
U
Pas d’amplification
ADN traité
M
Amplification
Echantillon méthylé
22/49
Methylation-Specific PCRMethylation-Specific PCR
Avantages: Sensible Facile
Inconvénient: Non quantitative
Méthylation et épendymomesMéthylation et épendymomes
24/49
Les épendymomes Les épendymomes
Troisième tumeur du SNC chez les enfants Pas de marqueur biologique connu Facteurs pronostiques: âge et résection
chirurgicale Pas de réponse à la radiothérapie et à la
chimiothérapie
25/49
Ependymomes et cytogénétiqueEpendymomes et cytogénétique
Perte du chromosome 22q dans 23% des cas
Perte du chromosome 6q dans 15% des cas Gain du 1q (20%) et altération du 17p (rare) Mais 40% des ependymomes n’ont pas
d’anomalie chromosomique Pas d’association avec survie ou réponse au
traitement
26/49
Nos hypothèsesNos hypothèses
Méthylation comme mécanisme d’inactivation des gènes localisés dans le bras long du chromosome 22 (INI1, NF2, TIMP3, EP300)
Profil épigénétique particulier Relation entre la méthylation et la survie
27/49
Matériel Matériel
27 épendymomes intracrâniens
7 papillomes du plexus choroïde
3 cortex adultes
28/49
RésultatsRésultats
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
EPENDYMOME
PAPILLOME DU PLEXUS CHOROIDE
29/49
RésultatsRésultats
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Months
Sur
viva
l Pro
babi
lity Casp8 Méthylé
Casp8 Non Méthylé
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Months
RASSF1A Méthylé
RASSF1A non méthylé
30/49
RésultatsRésultats
31/49
DiscussionDiscussion
Peu d’études réalisées Différents gènes étudiés Possibilité d’une relation avec l’âge du
patient et la localisation tumorale Enfant ≠ adultes Intra-crâniennes ≠ rachidiennes
32/49
DiscussionDiscussion
Les voies de l’apoptose Utilisation possible:
le diagnostic différentiel la détection précoce d’une rechute
Autres gènes à étudier
Méthylation et neuroblastomeMéthylation et neuroblastome
34/49
Les neuroblastomesLes neuroblastomes
Le neuroblastome est la tumeur extra crânienne solide la plus fréquente chez les enfants de moins de 5 ans
La présentation clinique est très variable: de la régression spontanée à l’évolution métastatique rapide
35/49
CytogénétiqueCytogénétique
La ploïdie L’amplification de NMYC La délétion du chromosome 1p et du 11q La trisomie du chromosome 17q
36/49
Classification des neuroblastomes Classification des neuroblastomes
Tableau 1. Groupes de risque de neuroblastomes selon les facteurs biologiques
Caractéristique Type 1 Type 2 Type 3
Ploïdie Triploïde Diploïde Diploïde
NMYC Non amplifié Non amplifié Amplifié
Délétion 1p Non Incertain Oui
Stades Majoritaires 1, 2 ou 4S 3 ou 4 4
Survie >90% 25-50% 5%
37/49
Nos hypothèsesNos hypothèses
Méthylation : mécanisme d’oncogenèse dans les neuroblastomes
Profil de méthylation caractéristique des neuroblastomes
Profil particulier en fonction des différents stades cliniques
38/49
MatérielMatériel
45 tumeurs primitives
17 rechutes
39/49
RésultatsRésultats
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
RASSF1A TIMP3 CASP8 DcR1 DcR2 BLU
Tumeur PrimitifRechute
40/49
RésultatsRésultats
StadeNombre de patients (%)
Ampl NMYC
Nombre moyen de gènes méthylés
CASP8 BLU
124s
7 (15)12 (27.5)3 (7.5)
1/22 1.95 2/22 3/22
34
6 (12.5)17 (37.5)
10/23 3.3 14/23 11/23
41/49
RésultatsRésultats
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Time (months)
Su
rviv
al
pro
ba
bil
ity
CASP8 methylated
CASP8 Non methylated
p = 0,0648
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Time (months)
Su
rviv
al
pro
ba
bil
ity
NMYC Amplified
NMYC Non Amplified
p-value 0,0001
42/49
RésultatsRésultats
METHYLATION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES IN NEUROBLASTOMA: THE RASSF1A GENE IS ALMOST ALWAYS METHYLATED IN PRIMARY TUMORS.
Pediatric Blood and Cancer
En cours de soumission après revision du manuscrite.
43/49
DiscussionDiscussion
CASP8 La méthylation inhibe l’expression du gène dans des lignées
cellulairesTeitz et al., Nat Med 6:529–35, 2000.
La voie TRAIL Différence de profil de méthylation entre les ganglioneuromes et les
neuroblastomes Rétablissement de ces gènes après traitement avec des agents
déméthylantsBanelli et al., Cancer Lett 228:37-41, 2005.
RASSF1 Méthylé dans 100% des lignées cellulaires Corrélation avec la méthylation de CASP8 Possibilité d’un sous-type de neuroblastomeYang et al., Clin Cancer Res 10:8493-500, 2004.
Conclusions et PerspectivesConclusions et Perspectives
45/49
ConclusionsConclusions
Étude de la méthylation de l’ADN dans les épendymomes et les neuroblastomes
Suggestion d’un profil spécifique Dans le cas des épendymomes:
Altération épigénétique dans les voies d’apoptose présente dans les tumeurs bénignes (papillome du plexus choroïde)
Dans le cas des neuroblastomes: Altérations liées au stade clinique dans les
neuroblastomes Possibilité d’une relation avec l’évolution tumorale
46/49
PerspectivesPerspectives
Plus grand nombre de tumeurs Autres tumeurs Application de méthodes quantitatives ADN dans le sang et le liquide
céphalorachidien Collaboration avec d’autres centres et
comparaison avec les données cliniques et génétiques
47/49
PerspectivesPerspectives
Méthylation comme marqueur diagnostique et/ou pronostique
Utilisation thérapeutique agents déméthylants association de la méthylation et la résistance au
traitement
RemerciementsRemerciements
49/49
RemerciementsRemerciements
Les directeurs de thèse: Mr Plantaz et Mme Favrot
Les rapporteurs: Mr Chastagner et Mr Dellatre
Mlle Florence de Fraipont Le gouvernement du Brésil (CNPq) “Ministère de la
Science” Les techniciennes du laboratoire et l’UF
Cancérologie et Biothérapie Le Service de Pédiatrie du CHU de Grenoble
LES QUESTIONSLES QUESTIONS
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TUMEUR CEREBRALESTUMEUR CEREBRALES
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LEUCEMIESLEUCEMIES
Chez les adultes les méthylations plus fréquentes : p15INK4B et p16INK4A dans les LAL et LAM.
Chez l’enfant: Beaucoup moins d’études Méthylation de p15 dans moins de 50% des LAL Méthylation de p16 m’est pas très important
Réarrangement MLL lié aux LALs du jeune enfant et caractérisé par l’hyperméthylation et non trascription de FHIT
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MÉTHODES QUANTITATIVESMÉTHODES QUANTITATIVES
Figure 1. Un exemple de pyroséquençage.
Les cytosines non méthylées (C) sont mesurées par le pyroséquençage comme la quantité relative de T dans un site CpG, et les cytosines méthylées (mC) sont mesurées comme la quantité relative de C dans un site CpG.
D’après: http://www. Biotagebio.com Pyrosequencing TM
54/49
PUCES À ADNPUCES À ADNFigure 1. Vue schématique de l’analyse de la méthylation par MSO.
L’ADN génomique est traité avec le bisulfite et amplifié par PCR pour une région CpG d’intérêt. Le produit amplifié est étiqueté avec un colorant fluorescent Cy5 et hybridé à une sonde oligonucléotide liée à la surface d’une vitre. À gauche, une sonde oligonucléotide est désignée pour former une liaison parfaite avec une cible d’ADN portant un allèle non méthylé. À droite, la sonde est désignée pour se lier parfaitement avec une cible d’ADN méthylé.
CG
GC
TG
AC
GC
TG
AC
Cy5
5’
GC
AC
GC
AC
Cy5
5’
CG
CG mCG
UG mCG
TG CG
CG
UG
TG
mCG
mCG
CG
Allèle non méthylé Allèle méthylé
5’ 5’
Traitement de Bisulfite
PCR
Etiquetage fluorescent ethybridation des oligonucl’eotide
C6 Amino-linker
probe
CG
GC
TG
AC
GC
TG
AC
Cy5
5’
GC
AC
GC
AC
Cy5
5’
CG
CG mCG
UG mCG
TG CG
CG
UG
TG
mCG
mCG
CG
Allèle non méthylé Allèle méthylé
5’ 5’
Traitement de Bisulfite
PCR
Etiquetage fluorescent ethybridation des oligonucl’eotide
C6 Amino-linker
probe
55/49
DiscussionDiscussion
Rousseau et al.(2003) Neuropathology and Applied Neurobiology 29: 574–583
p16
p15
56/49
CpGs methyléesMethyl binding proteins
Groupe AcétylHMT Groupe Methyl
La méthylation et la chromatineLa méthylation et la chromatine
57/49
Agents déméthylantsAgents déméthylants
58/49
Agents déméthylantsAgents déméthylants
Réactivation des gènes hyperméthylés par ces composants in vitro
Résultats cliniquement significatifs dans les myélodysplasies, leucémies aigues myéloïdes (LAM) et leucémies myéloïdes chroniques (LMC)