Universit de Grenoble Ecole Doctorale Chimie et Science du Vivant

Doctorat de lUniversit de Grenoble Spcialit : Virologie - Microbiologie - Immunologie

Etude des mcanismes daction de la PhotoChimiothrapie Extracorporelle chez lHommetel-00502158, version 1 - 13 Jul 2010

ThsePrsente et soutenue publiquement le 8 Juin 2010 A lUniversit de Grenoble Pour lobtention du grade de Docteur dUniversit

Par Dalil HANNANI

JURY

Rapporteurs : Dr. Georges ANDREU (INTS, Paris) Pr. Philippe SAAS (Inserm U645, EFS, Besanon) Examinateurs : Dr. Nathalie CHAPUT (Inserm U 1015, IGR, Villejuif) Pr. Alain FAVIER (UJF, CHU Grenoble) (Prsident du Jury) Directeur de thse : Dr. Joel PLUMAS (Inserm U823, EFS, Grenoble) 1

L'esprit qui invente est toujours mcontent de ses progrs, parce qu'il voit au-del

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Jean Le Rond dAlembert, Philosophe et Mathmaticien Franais 1717-1783

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RemerciementsJe tiens tout dabord remercier trs sincrement le Dr Georges Andreu pour mavoir fait limmense honneur dvaluer mon travail en tant que rapporteur. Vous tes lorigine du dveloppement de la PCE en systme dissoci, sans lequel une partie de ce travail naurait pu tre ralise.

Je remercie trs sincrement le Pr Philippe Saas pour avoir accept dtre rapporteur de ce travail. Merci pour lintrt que vous portez au sujet, et merci pour vos travaux qui mont beaucoup inspir.

Je remercie tout particulirement le Pr Laurence Zitvogel tout dabord pour

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lhonneur de vous compter parmi les membres de mon jury de thse, mais aussi pour vos travaux exceptionnels qui impacteront de faon considrable dans le domaine de la cancrologie et jen suis sr, dans le monde de la PCE. Cest pour moi une grande chance et un honneur de rejoindre votre groupe prochainement.

Je remercie galement le Pr. Alain Favier pour avoir accept de faire partie de mon jury. Mme si je nvoque pas notre travail sur la protomique dans cette thse, je tiens vous remercier pour votre investissement dans ce projetet pour votre sang !

Je remercie tout particulirement le Dr Joel Plumas, pour mavoir accueilli dans son laboratoire ds mon Master 2, et pour son encadrement de qualit et sa disponibilit tout au long de ma thse. Merci de mavoir confi ce projet en ayant pris en compte mon intrt pour la recherche applique. Merci de mavoir enseign la patience et la rigueur et davoir toujours cru en moi en considrant mes thories sur les mcanismes daction, et mes choix dans les expriences mener, mme lorsque lon sloignait du cadre fix. Tu mas galement permis de mpanouir en me laissant libre de prendre des responsabilits universitaires au cours de ma thse. Jespre sincrement que lon retravaillera ensemble.

Je remercie le Dr David Laurin a qui je dois tout ! Tu mas recrut tout petit en Master 1, et tu mas tout appris notamment relever les dfis, la signification du terme

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grosses manips et ne jamais perdre de vue notre rel but, aider les patients. Notre travail sur les mHAg restera une exprience inoubliable. Merci (surtout !) pour les moments moins srieux essentiels pour maintenir le cap. De matre de stage tu es devenu un ami. Profites bien de ces loges (crits en plus !) ce sont les derniers ! Pour quilibrer jai plusieurs vannes mais elles nont pas leur place icije te les rserve donc pour la prochaine occaz ;).

Je remercie chaleureusement le Dr Franoise Gabert qui ma donn le got pour limmunologie durant mon cursus universitaire. Cest en grande partie grce toi si je suis l aujourdhui. Merci pour ton implication dans ce projet, pour toutes nos discutions philosophiques sur la PCE. Je souhaite devenir MCU, et tu mas soutenu dans ce projet et permis de gagner en exprience dans lenseignement, tout

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dabord avec quelques TD puis mon premier coursmerci pour cette confiance ! Enfin, nos Tea Time me manqueront terriblement.

Un grand merci au Dr Etienne Merlin, qui a eu la bonne ide de travailler sur la PCE. Tu ne peux imaginer quel point a fait du bien de discuter avec quelquun qui se pose les mmes questions, et aussi de voir que lon est pas tout seul se casser la tte llaboration de mcanismes possibles. De plus, on avance plus vite 2 ! Merci dtre si engag envers tes tout petits (et moins petits) patients.

Je remercie vivement les Pr Justyna Kanold et Franois Demeocq du CHU de Clermont Clermont-Ferrand pour la mise en place dune collaboration fructueuse, sans laquelle une partie de ce travail naurait pu tre ralise.

Je remercie le Pr. Jean-Claude Bani pour son intrt pour le sujet, son expertise ainsi que ses conseils prcieux.

Je remercie lensemble des membres de lquipe (Julie, Jrmie, Ariane, Jean-Paul, Laurence, Claire et Alexandre) pour leur soutien technique et moral. Ce ft un rel plaisir de partager ces journes en votre compagnie. Merci tout particulirement au Dr Caroline Aspord pour avoir partag sa riche exprience travers de prcieux conseils. Malgr ton emploi du temps, tu as toujours t l lorsque jen ai eu besoin,

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et grce toi je sais que je naurais jamais pu tre chirurgien au vue de la qualit de mes greffes de peau ! Saches que tu as toujours t et restera un exemple pour moi. Yerem, ou devrais-je dire Dr Jeremy Di Domizio, nous avons volu ensemble depuis la L3et lheure ou jcris ces lignes tu es dj Houston ! (que de chemin parcouru !). Merci pour ton soutien et pour les supers moments partags durant toutes ces annes

Je remercie chaleureusement lensemble des personnes de lEFS Grenoble pour leur sympathie, leur aide et les bons moments que lon a pass. Vous faites de lEFS un endroit o il fait bon vivre. Merci, tout particulirement : Sylvie et Agns, amies du laboratoire de culture cellulaire, sans oublier mes amis du laboratoire

dimmunocytologie et du laboratoire HLA (citer tout le monde serait trop long mais

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chacun se reconnatra) ; Les Dr. Martine Pernollet et Dr Marie-Christine Jacob, pour leur acceuil mes dbuts ; Le Pr Jean-Claude Bensa pour son soutien depuis toujours et pour nos discussions scientifiques passionnantes ! Les infirmires et les mdecins du don du sang et du centre de soin pour les prlvements de volontaires sains et de patients. Un grand merci Michelle, Ahmed, Elizabeth, Christine, Franck, MariePierre, Lydie, Julien et Emmanuelle pour toutes nos pauses qui redonnent le sourire. Sans citer aucun nom, je compte sur mes pom-pom girls pour le jour J !!!!!!

Thank you very much to Anna Reinicke ! It was a real pleasure to lunch with you! You help me so much time for my English and thanks to you I have improved it! Our rackets experience was awesome! Good luck for the future dear friend !

Un grand merci aux Dr Marc Savasta, Dr Serge Perez, Pr Patrick Witomski, Pr Anne Milet et Pr Michel Robert-Nicoud pour mavoir permis de minvestir au sein de lEcole Doctorale Chimie et Science du Vivant et plus largement lUniversit. Vous avez toujours t dun grand soutien, mme au-del.

Merci mes amis qui ont toujours t l dans les coups durs, notamment : Newelle, Alderic, Chris, Isma, Marion et tous les autres ! Domo Arigato Gozamashita AssiaONee San !!!

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Je ddie cette thse :

A ma famille, sans qui je ne suis rien.

A Delphine, mes cts depuis le dbut

Aux patients qui donnent un sens mon travail, et au-del, ma vie.

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SommaireChapitre 1 - Introduction ...................................................... 111. Historique :..................................................................................12A. B. La Photothrapie moderne est ne il y a 100 ans:............................ 13 Le 8-mthoxypsoralen (8-MOP) est la substance active de lammi

majus : .............................................................................................................. 14 C. La PUVA (Psoralen + UV-A) thrapie ou Photochimiothrapie :

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Potentialisation de la photothrapie............................................................. 15 D. E. Naissance de la PhotoChimiothrapie Extracorporelle: (PCE) ........... 15 Article 1 : Photochimiothrapie Extracorporelle ou immunothrapie

utilisant des cellules modifies par photochimie. ....................................... 17

2. Applications cliniques : .............................................................18A. B. a. b. Introduction :......................................................................................... 18 Lymphome T cutan pidermotrope ou CTCL :.................................... 18 Dfinition : ................................................................................................. 18 Preuve de concept de lefficacit de la PCE dans le traitement du

CTCL: ................................................................................................................. 19 c. C. a. b. c. D. E. Etudes cliniques majeures : .................................................................... 20 Maladie du Greffon contre lHte ou GvHD : .................................... 23 Dfinition : ................................................................................................. 23 Traitements conventionnels de la GvHD : ........................................... 26 La PCE dans le traitement de la GvHD : .............................................. 27 Utilisation de la PCE dans dautres pathologies :.................................. 30 Conclusion gnrale sur les applications cliniques de la PCE : ......... 31 7

3. Immunologie de la PCE : De la clinique limmunologie fondamentale. .................................................................................32A. B. La PCE est une immunothrapie ......................................................... 32 Comment le systme immunitaire peut-il contrler les LT

pathognes ? ............................................................................................. 36 a. b. i. ii. La rponse immunitaire T et sa rgulation:......................................... 36 Les Lymphocytes T rgulateurs : ............................................................ 37 Dfinition :.............................................................................................. 37 Les lymphocytes T rgulateurs CD4+ : .............................................. 37 Les Lymphocytes T rgulateurs CD8+ : ............................................. 41 Les LT rgulateurs CD8+ CD103+ alloantignes spcifiques: .... 43

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iii. iv. c. i. ii. iii. d. i. ii. e. C.

La rponse rgulatrice anti-clonotypique :......................................... 44 Dfinition :.............................................................................................. 44 Les LT CD8+ rgulateurs cytotoxiques anti-clonotype: .................. 44 Les LT CD8+ rgulateurs HLA-E restreints :......................................... 45 La rponse rgulatrice anti-ergotypique :........................................... 46 Dfinition :.............................................................................................. 46 Les ergotopes et la rgulation anti-ergotypique: ........................... 47 Les Lymphocytes NK T rgulateurs : ...................................................... 50 Comment la PCE peut-elle induire une rgulation des LT

pathognes ? .................................................................................................. 52 a. i. ii. Effets connus de la PCE .......................................................................... 52 La PCE induit lapoptose des cellules traites................................. 52 Donnes cliniques : la PCE induit un contrle spcifique des LT

pathognes .................................................................................................. 54 b. Rponses rgulatrices potentiellement induites par la PCE : ........... 55 8

i. ii.

Lapoptose peut tre un phnomne immunogne .................... 55 La localisation des cellules apoptotiques aprs rinjection peut

tre dterminante pour la nature de la rponse induite ..................... 59 iii. c. Mcanismes de rgulation T potentiellement induits par la PCE. 61 Synthse des mcanismes potentiels de la PCE : .............................. 75

Chapitre 2 Rsultats ........................................................... 781. Etude des mcanismes daction de la PCE chez lHomme...79A. Article 2: Extracorporeal Photochemotherapy induces the apoptosis

of monocytes without impairing their functions. .......................................... 80

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B.

Article 3: Extracorporeal Photochemotherapy induces a faster

apoptosis of pathogenic activated T cells than of resting normal T cells in Graft versus Host Disease. .............................................................................. 84 C. a. b. Rsultats Complmentaires............................................................... 113 Immunognicit des cellules traites par PUVA.............................. 113 Impact des cellules T traites par PUVA sur la fonctionnalit des

DC :.................................................................................................................. 122 D. Perspectives ........................................................................................... 134

2. Amlioration des pratiques cliniques de la PCE : optimisation du traitement de la GvHD par PCE chez lenfant........................137A. B. Article 4 : La PhotoChimiothrapie Extracorporelle chez lenfant. 137 Article 5: Cryopreservation photochemotherapy of mononuclear impair cells their in before vitro

extracorporeal

doesnt

antiproliferative capacities .......................................................................... 141 C. Article 6: Immunomonitoring of graft-versus-host minor

histocompatibility antigen correlates with graft-versus-host disease and absence of relapse after graft ..................................................................... 143 9

D. E.

Perspectives ........................................................................................... 145 Annexe 1 : Rsum du PHRC Photograft 2 .......................................... 147

Chapitre 3 - Discussion ....................................................... 154 Chapitre 4 - Rfrences Bibliographiques ....................... 162

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Chapitre 1 - Introduction

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1. Historique :

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Histoire

de

la

Photochimiothrapie

Extracorporelle est tout fait passionnante. Cette immunothrapie moderne trouve

son origine dans les civilisations les plus anciennes telles que celle des gyptiens du temps des Pharaons. A cette poque, le soleil tait vnr et sa lumire tait reconnue pour ces proprits curatives de certaines pathologies dermatologiques. Les gyptiens potentialisaient les effets de la lumire en ingrant une plante poussant le long du Nil, lAmmi majus. Dans cette partie, nous verrons comment lutilisation dune plante combine une exposition au soleil il y a 5000 ans, a pu progressivement donner naissance une immunothrapie moderne telle que la

Photochimiothrapie Extracorporelle.

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A. La Photothrapie moderne est ne il y a 100 ans:

La photothrapie est une thrapie base sur les proprits de la lumire, ne il y a environ 100 ans. A la fin du XIXe sicle, les patients atteints de lupus vulgaris (une manifestation cutane de la tuberculose) taient encore traits par hliothrapie, c'est--dire exposs de faon contrle, aux rayons du soleil. La principale limite cette thrapie tait la ncessit davoir un bon ensoleillement. Cest ainsi quun mdecin danois nomm Niels R. Finsen, dveloppa en 1901 la premire source de lumire artificielle. Il reu le prix Nobel de mdecine en 1903 pour ses travaux. Lutilisation de lumire artificielle marque le dbut de la photothrapie moderne.

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Les proprits curatives du soleil sont connues depuis les temps les plus anciens. En effet, les gyptiens ingraient les feuilles dune plante qui pousse le long du Nil, lAmmi majus (Figure 1), puis sexposaient au soleil afin de traiter le vitiligo (dpigmentation de la peau).

Figure 1 : Plante Ammi Majus

Les premires traces de lutilisation de lAmmi majus en France remontent la fin du VIIIe sicle. Charlemagne avait ordonn la culture de cette plante et lavait fait notifier dans Le capitulaire de Villis Vel Curtis Imperii . Cet acte lgislatif dfinissait, entre autres, la culture des plantes mdicinales au sein des jardins royaux de lpoque.

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B. Le 8-mthoxypsoralen (8-MOP) est la substance active de lammi majus :

La substance active de lAmmi majus fut isole et caractrise par IR Fahmy et H. Abu-Shady en 1948 (1). Ils la nommrent Ammodine avant de dcouvrir que cette substance correspondait la Xanthotoxine, isole en 1911 de la plante Fagara xantoxyloide par H. Priess. La nomenclature exacte de lammodine ou xanthotoxine est le 8-mthoxypsoralen ou 8-MOP. Le 8MOP fait partie de la famille des furocoumarines ou psoralnes. Sa structure est reprsente en Figure 2.

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Figure 2 : Structure du 8 mthoxypsoralne

En 1953, Aaron B. Lerner a dcrit pour la premire fois que le 8-MOP purifi pouvait tre administr en toute scurit lHomme (2). En effet des travaux antrieurs ont montr que chez le rat ou la souris, la LD50 (Lethal Dose 50) est de 400 600 mg/kg alors que la dose thrapeutique chez lHomme est infrieure 1 mg/kg. Les rsultats exprimentaux suggraient que le 8MOP seul tait inactif, et que lirradiation induisait la transformation du 8-MOP en un autre compos, actif, probablement responsable de leffet

thrapeutique. Ces travaux ont t pionniers dans la photopharmacologie moderne.

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C. La PUVA (Psoralen + UV-A) thrapie Potentialisation de la photothrapie.

ou Photochimiothrapie :

La PUVA thrapie consiste potentialiser les effets de la lumire, en loccurrence les UV-A laide dun photosensibilisant ou psoralne. Le terme PUVA rsulte de la contraction de Psoralne + UV-A. Le terme Photo-Chimiothrapie est employ comme synonyme car les patients sont traits par prise dune molcule chimique associe une exposition lumineuse. A la fin des annes 40, A.M. El Mofty montra que ladministration orale du 8-MOP combine la lumire du soleil favorisait la repigmentation de la peau de patients atteints de vitiligo (3). Depuis, son utilisation en

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dermatologie sest largement rpandue. Au dbut des annes 70, J.F. Walter et J.J Voorhees (4, 5) ont rapport que lutilisation topicale du 8-MOP suivie dune exposition aux UV pouvait traiter le Psoriasis. A la fin des annes 70, B.A Gilchrest et al. (6) ont trait avec succs par PUVA (et prise orale du 8-MOP), 9 patients atteints de mycosis fongodes (une des formes du lymphome T cutan ou CTCL pour Cutaneous T cell Lymphoma).

D. Naissance de la PhotoChimiothrapie Extracorporelle: (PCE)

La PCE a t dveloppe par un dermatologue amricain, Richard L. Edelson, au dbut des annes 80. Il dveloppa cette technique pour traiter des patients atteints dune forme avance du CTCL, le syndrome de Szary. Le CTCL est le lymphome T le plus frquent. Ds son stade prcoce, il est caractris par des plaques rythmateuses avec un infiltrat important de cellules T tumorales. Gilchrest traita pour la premire fois en 1976 des patients atteints de CTCL par PUVA- ou photochimio- thrapie (6). Un peu plus tard, il a t dmontr que les lymphocytes T taient sensibles au traitement PUVA (7, 8). 15

Le syndrome de Szary est un stade plus avanc du CTCL o le clone tumoral est retrouv sous forme circulante dans le sang. Edelson sest bas sur les travaux du groupe dIR Cohen qui a montr la mme poque que linjection dun clone T altr pouvait induire une rponse rgulatrice capable de rguler ce mme clone T (ce point sera dvelopp ultrieurement dans la partie 3.Immunologie de la PCE). Au vu des rsultats encourageants obtenus par Gilchrest dans le traitement du CTCL par photochimiothrapie et en se basant sur les travaux de Cohen, Edelson dveloppa lide de traiter directement au niveau sanguin les clones T tumoraux par Photochimiothrapie. Pour cela, les patients ingraient le 8MOP, et 2 heures aprs ingestion, celui-ci tait retrouv dans le sang. Les

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cellules sanguines contenant les cellules de Szary taient prleves et irradies aux UV-A en extracorporel puis ces cellules altres par photochimie taient rinjectes aux patients. Ainsi est ne la PhotoChimiothrapie Extracorporelle. Depuis, les progrs techniques ont permis doptimiser la procdure, notamment lamlioration des systmes daphrse, mais son principe reste inchang (Figure 3 et Article 1). En terme damlioration de la technique, on peut citer lexemple de ladministration orale du 8-MOP qui conduisait des concentration sanguines variables dune sance une autre et dun patient un autre. Il a fallu attendre le dbut des annes 90 pour que le 8-MOP soit directement ajout aux cellules prleves (9) et lan 2000 pour que lajout du 8-MOP en extracorporel soit approuv par la FDA (10). Ceci a permis la standardisation de la quantit de psoralen prsente dans lchantillon trait au moment de lirradiation aux UV.

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Figure 3 : Principe de la PhotoChimiothrapie Extracorporelle. Les PBMC sont collectes par aphrse. Les cellules, pralablement mises en contact avec lagent photosensibilisant (8-MOP, 200ng/ml), sont photoirradies (UV-A 365nm, 2J/cm) puis rinjectes au patient.

Les diffrentes techniques utilises en routine dans la pratique de la PCE ainsi que les problmatiques lies celle-ci sont dveloppes dans une revue parue dans la Revue de Mdecine Interne (Article 1 - ci dessous).

E. Article 1 : Photochimiothrapie Extracorporelle ou immunothrapie utilisant des cellules modifies par photochimie.

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La Revue de mdecine interne 31 (2010) 321324

Lexique

La photochimiothrapie extracorporelle ou limmunothrapie par cellules modies par photochimieExtracorporeal photochemotherapy or immunotherapy using cells modied by photochemistry D. Hannani a,b,c , F. Gabert a,b,c , L. Chaperot a,b,c , M.J. Richard a,b,d , J. Plumas a,b,c,b a Universit Joseph-Fourier, 38041 Grenoble, France Inserm, U823, immunobiologie et immunothrapie des cancers, 38706 La Tronche, France c EFS Rhne-Alpes, 29, avenue du Maquis-du-Grsivaudan, 38701 La Tronche, France d Hopital Michallon, cancrologie et biothrapie, 38043 Grenoble, France

Disponible sur Internet le 11 f vrier 2010 e

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Rsum La photochimiothrapie extracorporelle (PCE) est une technique de thrapie cellulaire autologue utilise dans le traitement de pathologies impliquant des lymphocytes pathognes : lymphomes cutans cellules T, rejet dorgane et maladie du greffon contre lhte. chaque sance de PCE, les patients recoivent un produit cellulaire compos de cellules mononucles autologues, contenant les cellules pathognes, traites par un agent photosensibilisant et un rayonnement UV-A. Lobjectif du traitement est dentraner une raction spcique du systme immunitaire modulant lactivit des lymphocytes pathognes non traits responsables de la pathologie et par consquent une amlioration des signes cliniques. Les mcanismes daction prcis restent cependant identier chez lhomme. Son efcacit associe labsence deffets secondaires peut conduire diminuer le recours aux immunosuppresseurs. La PCE apparat donc comme une immunothrapie par cellules modies par photochimie qui permet une immunomodulation spcique de lymphocytes pathognes. 2010 Socit nationale franaise de mdecine interne (SNFMI). Publi par Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs.Mots cls : Immunothrapie ; Photochimiothrapie ; Lymphome cutan ; Transplantation ; Maladie du greffon contre lhte (GvHD)

Abstract Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is an autologous cell therapy used for the treatment of diseases involving pathogenic cells: cutaneous Tcell lymphoma, organ rejection and graft versus host disease. During an ECP procedure, patients receive a cellular product consisting of autologous mononuclear cells, containing the pathogenic cells, treated with a photosensitising agent and an UV-A radiation. The aim of the treatment is to induce a specic immune reaction modulating the activity of untreated pathogenic lymphocytes responsible for the disease and therefore an improvement of clinical manifestations. The precise mechanisms of action remain to be dened in humans. Its efcacy coupled with the absence of side effects could lead to decrease the use of immunosuppressive drugs. PCE appears as an immunotherapy using cells modied by photochemistry, which allows specic immune modulation of pathogenic lymphocytes. 2010 Socit nationale franaise de mdecine interne (SNFMI). Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.Keywords: Immunotherapy; Photochemotherapy; Cutaneous lymphoma; Transplantation; Graft versus host disease (GvHD)

Depuis la premire utilisation de la photochimiothrapie extracorporelle ou PCE dans les annes 1980 [1], plusieurs milliers de patients ont t traits dans le monde et plusieurs centaines de milliers de procdures de PCE ont t ralises. En raison de lintrt croissant des cliniciens pour ce type de

thrapie, ces chiffres ne cessent daugmenter. Les indications majeures de cette thrapeutique sont les traitements :

Auteur correspondant. Adresse e-mail : joel.plumas@wanadoo.fr (J. Plumas).

des lymphomes cutans cellules T (LCT) ; du rejet dorgane ; de la maladie du greffon contre lhte (graft versus host disease [GvHD]) [2,3].

0248-8663/$ see front matter 2010 Socit nationale franaise de mdecine interne (SNFMI). Publi par Elsevier Masson SAS. Tous droits rservs. doi:10.1016/j.revmed.2009.09.031

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D. Hannani et al. / La Revue de mdecine interne 31 (2010) 321324

Fig. 1. Principe dune sance de photochimiothrapie extracorporelle ou dimmunothrapie par cellules modies par photochimie : une suspension cellulaire enrichie en cellules mononucles est obtenue (1), puis traite par un psoralne et soumise un rayonnement UV-A (2). Les cellules traites constituent le principe actif qui est rinject au patient (3).

Contrairement ce que son nom laisse supposer, la photochimiothrapie extracorporelle nest pas une chimiothrapie mais une technique de thrapie cellulaire autologue au sens de larticle L1241-1 du Code de la sant publique. Le traitement implique bien une modication ex-vivo des cellules par irradiation UV-A en prsence dun psoralne mais ce sont les cellules ainsi modies qui constituent le principe actif de la thrapie et non le psoralne (Fig. 1). Quelles que soient les indications, le but de cette thrapie cellulaire est de moduler lactivit du systme immunitaire. Il serait en fait plus appropri dutiliser les termes dimmunothrapie par cellules modies par photochimie que photochimiothrapie extracorporelle car ils retent mieux la nalit thrapeutique sans tre source dinquitude chez les patients quant aux effets secondaires. En effet, dans limaginaire des patients le terme de chimiothrapie est associ un certain nombre de complications (anmie, nauses, vomissements, perte de cheveux, fatigue. . .) alors que la PCE est trs bien tolre depuis que le psoralne nest plus administr per os. Le traitement par PCE reste plus compliqu quune simple perfusion mdicamenteuse. En effet, une sance de PCE consiste obtenir une suspension cellulaire enrichie en cellules mononucles (prlvement par aphrse ou constitution dun buffy-coat en ligne), lui ajouter du 8-mthoxy-psoralne, qui est un agent photosensibilisant, puis exposer la suspension un rayonnement UV-A (ultra violet-A, 365 nm) dnergie contrle. Les cellules ainsi modies par photochimie sont rinjectes au patient la n de la sance (Fig. 1). Une sance de PCE dure entre deux trois heures et peut tre ralise en ambulatoire. Il existe lheure actuelle deux techniques permettant de raliser cet acte thrapeutique : le systme en ligne et le systme dissoci [4]. Dans le systme en ligne, le circuit de prlvement des cellules est coupl directement au circuit dajout du psoralne et dirradiation par les UV. Un mme dispositif mdical associe les deux fonctions : sparer les cellules et les traiter par UV-A. Dans le systme dissoci, ces deux fonctions sont ralises par des dispositifs diffrents. Chaque technique possde

des avantages et des inconvnients en termes de mise en uvre et de ralisation, du volume sanguin extracorporel, de la composition qualitative et quantitative de la suspension cellulaire, des contrles qualits ralisables, de la scurit et du cot. Malgr les diffrences entre les deux techniques, lefcacit thrapeutique est similaire. Le choix de la technique par les praticiens est gnralement fait sur des critres organisationnels dpendant de lenvironnement de la structure de soins. En France en 2007, 15 centres (tablissements de soins et tablissement de transfusion sanguine) ont ralis plus de 3200 procdures dont 53 % ont t ralises avec le systme dissoci (enqute de la socit francaise de photochimiothrapie extracorporelle). La premire indication de la PCE a t le lymphome T cutan (LCT) rythrodermique un stade avanc prsentant des cellules malignes circulantes. Les travaux pionniers de Richard Edelson ont montr la faisabilit et lintrt du traitement des LCT par PCE et ont apport les premiers rsultats cliniques [1]. Actuellement, la PCE est la seule alternative thrapeutique pour traiter les LCT un stade avanc [5], reconnu depuis 1988 aux tats-Unis. La PCE est rgulirement utilise chez les sujets transplants (cur, poumons, reins) pour le traitement et la prvention du rejet aigu ou chronique du greffon, pour diminuer les doses dimmunosuppresseurs usuels ou pour traiter le syndrome de bronchiolite oblitrante dans la greffe pulmonaire [3,6]. Cest dans le traitement de la maladie du greffon contre lhte (GvHD) que la PCE est actuellement la plus utilise (60 % des indications de PCE) et que par consquent les tudes sont les plus nombreuses [3,7,8]. La GvHD est une pathologie qui survient aprs une greffe allognique de cellules souches hmatopotiques. Les lymphocytes T allogniques issus du donneur prsents dans le greffon dtruisent les organes du receveur, reconnus comme trangers. Le premier tissu touch est la peau. La GvHD entrane une forte morbidit et une forte mortalit. Les traitements immunosuppresseurs utiliss pour la traiter ont des effets secondaires importants, ce qui augmente encore le taux de mortalit. Depuis quelques annes, de nombreux patients atteints de GvHD chronique et plus rcemment de GvHD aigu ont t traits par PCE. Les tudes cliniques [911] rvlent que plus la PCE est utilise tt aprs lapparition des signes cliniques de la GvHD, plus elle est efcace. Le grade clinique de la maladie est galement un paramtre important car plus le grade est faible, plus le taux de rponse objective augmente. Enn, ce sont les manifestations cutanes de la maladie qui rpondent le mieux au traitement suivi de celles du foie et du tube digestif. Lutilisation de la PCE a pour consquence de rduire la quantit dimmunosuppresseurs recue par le patient. La PCE constitue une alternative thrapeutique dans les formes graves de GvHD rsistantes aux thrapeutiques classiques. Le schma thrapeutique est variable selon les pathologies. Le nombre et la frquence des sances dpendent de lvolutivit de la maladie et de la rponse du patient au traitement. Le nombre de sances peut varier de deux 12 par mois avec une valuation defcacit un ou trois mois suivie dune phase dentretien, o la frquence des sances est diminue, selon que la pathologie est volutive ou non. Mme si lon peut regretter le manque dessais cliniques randomiss, la pratique courante et de nombreuses donnes

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de la littrature montrent que la PCE a une relle efcacit dans le traitement des pathologies voques prcdemment et quelle pourrait reprsenter une alternative lutilisation dimmunosuppresseurs conventionnels [6,11]. Contrairement aux traitements classiques, limmunosuppression observe aprs PCE est spcique et le traitement est bien tolr. Cependant, les mcanismes daction responsables des effets cliniques bnques sont encore trop peu connus ce qui est un frein au dveloppement de la PCE [2,7]. En effet, les cliniciens manquent de donnes pour dterminer les patients potentiellement rpondeurs ou dcider larrt du traitement sur des critres biologiques. Les observations cliniques, les tudes ralises in vitro ou in vivo dans des modles animaux et les connaissances actuelles en immunologie permettent davancer que la PCE est bien une immunothrapie dans le sens o elle agit sur le systme immunitaire des patients pour diminuer lactivit des lymphocytes pathognes responsables des manifestations cliniques. En effet, si les trois indications majeures de la PCE peuvent paratre htrognes dans leur prsentation clinique, elles ont en commun le fait quelles impliquent toutes lexistence de lymphocytes pathognes, quils soient tumoraux ou allogniques [2]. La prsence de ces lymphocytes pathognes dans la suspension cellulaire traite est ncessaire pour lefcacit du traitement. Le psoralne est une molcule chimique qui sintercale dans lADN et qui aprs photo-activation forme des liaisons covalentes avec les acides nucliques entranant la mort par apoptose des cellules traites selon une cintique plus ou moins rapide. Le principe actif de la PCE est donc un produit cellulaire constitu de cellules mononucles autologues pr-apoptotiques contenant des lymphocytes pathognes. Le pourcentage de lymphocytes pathognes peut tre trs lev dans le produit nal. En effet, les lymphocytes pathognes peuvent reprsenter 1 2 % des lymphocytes T alors que la frquence dun lymphocyte spcique dun antigne commun est infrieure un pour 10 000. chaque sance de PCE, un nouveau produit est fabriqu et inject au patient. Il est clair que la dpltion en cellules pathognes due directement la procdure nest pas responsable de lefcacit de la PCE car le contingent circulant de lymphocytes pathognes reprsente moins de 10 % de lensemble de cette population qui est majoritairement localise dans les tissus. Lhypothse actuelle est que la transfusion de cellules contenant une quantit leve de lymphocytes T pathognes modis photochimiquement va entraner une raction spcique du systme immunitaire. Cette raction permet de diminuer lactivit des lymphocytes pathognes non traits responsables de la pathologie, ce qui a pour consquence lamlioration des signes cliniques. La rponse immunitaire pourrait dans un premier temps tre non spcique impliquant des facteurs solubles, par exemple et expliquant les effets cliniques rapides observs dans certaines situations. Dans un deuxime temps, se mettrait en place une rponse spcique vis--vis des lymphocytes pathognes expliquant les effets cliniques long terme et labsence dimmunosuppression globale. Le systme immunitaire a dvelopp diffrentes stratgies pour contrler le dveloppement de lymphocytes potentiellement pathognes. Parmi elles, le dveloppement de lymphocytes rgulateurs ou cytotoxiques est

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avanc le plus couramment comme hypothse, mais dautres mcanismes sont aussi envisageables. Les efforts dans la comprhension des mcanismes dactions doivent tre poursuivis an daugmenter les connaissances des rponses immunitaires induites par la PCE. La littrature sur le sujet doit tre examine avec attention car le besoin de connaissance entrane parfois des interprtations ou des extrapolations trop rapides [7]. De plus, il faut se garder de vouloir transposer directement les rsultats obtenus dans des modles animaux lhomme car les cellules traites, les procdures de traitement, le contexte thrapeutique, les rponses immunitaires ne sont pas les mmes. En conclusion, la PCE est bien une immunothrapie par cellules modies par photochimie. Cette technique de thrapie cellulaire autologue est prometteuse dans le traitement de pathologies impliquant des lymphocytes pathognes car elle permet leur immunomodulation. De plus, la PCE permet de diminuer les doses usuelles dimmunosuppresseurs. Son efcacit associe labsence deffets secondaires conduit une utilisation croissante de la PCE avec un largissement des domaines dapplications vers les maladies auto-immunes par exemple [12,13]. Cependant, la mconnaissance des mcanismes daction est une limite son utilisation et sa reconnaissance par les autorits de tutelle. Les recherches en cours devraient permettre de prciser ces mcanismes de facon optimiser la thrapeutique pour une meilleure efcacit, standardiser les procdures et peut-tre permettre une rduction du nombre de sances ncessaires pour obtenir leffet immunologique recherch. Conit dintrt Les auteurs nont pas transmis de conit dintrt. Remerciements Les auteurs remercient lAssociation recherche et transfusion ainsi que ltablissement francais du sang pour leur soutien. Leurs auteurs adressent leurs remerciements au personnel du Centre de soins et de lunit mixte de thrapie cellulaire de Grenoble. Les auteurs remercient Julie Charles pour ses conseils. Rfrences[1] Edelson R, Berger C, Gasparro F, Jegasothy B, Heald P, Wintroub B, et al. Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results. N Engl J Med 1987;316:297303. [2] Plumas J, Drillat P, Jacob MC, Richard MJ, Favrot MC. Extracorporeal photochemotherapy for treatment of clonal T cell proliferations. Bull Cancer 2003;90:76370. [3] McKenna KE, Whittaker S, Rhodes LE, Taylor P, Lloyd J, Ibbotson S, et al. Evidence-based practice of photopheresis 19872001: A report of a workshop of the British photodermatology group and the U.K. skin lymphoma group. Br J Dermatol 2006;154:720. [4] Schooneman F. Extracorporeal photopheresis technical aspects. Transfus Apher Sci 2003;28:5161. [5] Zic JA. The treatment of cutaneous T-cell lymphoma with photopheresis. Dermatol Ther 2003;16:33746. [6] Barr ML, Meiser BM, Eisen HJ, Roberts RF, Livi U, DallAmico R, et al. Photopheresis for the prevention of rejection in cardiac trans-

324

D. Hannani et al. / La Revue de mdecine interne 31 (2010) 321324 plantation. Photopheresis transplantation study group. N Engl J Med 1998;339:174451. Plumas J, Manches O, Chaperot L. Mechanisms of action of extracorporeal photochemotherapy in the control of GVHD: Involvement of dendritic cells. Leukemia 2003;17:20612. Marshall SR. Technology insight: ECP for the treatment of GvHDcan we offer selective immune control without generalized immunosuppression? Nat Clin Pract Oncol 2006;3:30214. DallAmico R, Messina C. Extracorporeal photochemotherapy for the treatment of graft-versus-host disease. Ther Apher 2002;6:296304. Couriel D, Hosing C, Saliba R, Shpall EJ, Andelini P, Popat U, et al. Extracorporeal photopheresis for acute and chronic graft-versushost disease: Does it work? Biol Blood Marrow Transplant 2006;12: 3740. [11] Flowers ME, Apperley JF, van Besien K, Elmaagacli A, Grigg A, Reddy V, et al. A multicenter prospective phase 2 randomized study of extracorporeal photopheresis for treatment of chronic graft-versus-host disease. Blood 2008;112:266774. [12] Heshmati F. Extracorporeal photochemotherapy and transfusion medecine. Help Medical. Neuilly-sur-Seine 2008. [13] Knobler R, Barr ML, Couriel DR, Ferrara JL, French LE, Jaksch P, et al. Extracorporeal photopheresis: Past, present, and future. J Am Acad Dermatol 2009.

[7]

[8]

[9] [10]

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2.

Applications cliniques :A. Introduction :

La PCE a t initialement utilise dans le traitement du CTCL puis de la GvHD. Des tudes cliniques ont galement test son efficacit dans le traitement de pathologies autoimmunes ainsi que dans le rejet dorganes solides. Bien que ces pathologies soient trs diffrentes, elles partagent nanmoins un dnominateur commun : les lymphocytes T sont les acteurs pathognes principaux (LT alloractifs, tumoraux, autoimmuns). Depuis sa

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premire utilisation dans les annes 80 (11), plusieurs milliers de patients ont t traits et plusieurs centaines de milliers de procdures de PCE ont t ralises dans le monde. Dans cette partie, nous dtaillerons les rsultats cliniques majeurs obtenus pour lensemble de ces pathologies.

B. Lymphome T cutan pidermotrope ou CTCL :

a.

Dfinition :

Les lymphomes T cutans pidermotropes (CTCL) correspondent des lymphoprolifrations malignes, monoclonales, de lymphocytes T de

phnotype CD4+ dans la grande majorit des cas. Les lymphomes T cutans pidermotropes se rpartissent en deux entits : le mycosis fongode et le syndrome de Szary, ce dernier correspondant la forme leucmique des CTCL (12-13). Le mycosis fongode peut se prsenter sous une forme progressive, voluant successivement en une phase initiale de lsions eczmatiformes non infiltres, suivis ventuellement de plaques infiltres ; enfin le stade des tumeurs, ou encore lextension des lsions peut aboutir un 18

tat drythrodermie. Lvolution est trs variable dun cas lautre, et certaines formes se rvlent demble par des tumeurs. Le syndrome de Szary se rvle habituellement par une rythrodermie demble,

prurigineuse, souvent associe la prsence dadnomgalies superficielles. Les CTCL sont des pathologies rares, dont lincidence annuelle aux

tats-Unis a t value 0,4 pour 100 000 habitants, et qui touchent surtout ladulte avec un pic dincidence autour de la cinquantaine. Des formes de mycosis fongode existent chez lenfant. Ltiologie des lymphomes T cutans pidermotropes nest pas connue. Ce sont des pathologies potentiellement mortelles surtout en stade avanc car il nexiste pas de traitements efficaces. (Daprs H. Bachelez, Thrapeutique Dermatologique 2001)

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b. CTCL:

Preuve de concept de lefficacit de la PCE dans le traitement du

En 1987, Edelson a publi la premire tude clinique dans laquelle 37 patients, atteints de CTCL rsistants aux traitements conventionnels, ont t traits par PCE (11). Quatre-vingt trois pourcents des patients ont vu une amlioration en 22 semaines en moyenne, soit environ 5 cycles de traitement PCE. Vingt-quatre patients (65%) ont eu une amlioration de plus de 75% de leurs lsions cutanes et 15% des patients prsentant une rythrodermie extensive ont atteint une rmission complte. La PCE ninduit pas les effets secondaires observs avec les chimiothrapies standards comme la lymphopnie, les lsions du tube digestif, ou encore la perte capillaire. Ds cette tude, la PCE apparat comme une thrapie prometteuse pour les CTCL dissmins (syndrome de Szary). En 1988, la FDA a approuv lutilisation de la PCE dans le traitement du CTCL.

19

c.

Etudes cliniques majeures :

Depuis Edelson en 1987, 18 tudes tudes cliniques sur lutilisation de la PCE dans le traitement du CTCL ont t ralises. Elles sont reportes et

rsumes en Table 1. Cela reprsente un total de 441 patients entre 1987 et 2006. Au total, 274 patients (62%) ont rpondu au traitement. Ils ont tous t traits durant au moins 6 mois. Parmi eux, 92 patients soit 33.6% ont atteint une rmission complte. Les 74.4% restants (182 patients) ont atteint une rmission partielle (amlioration dau moins 25% des atteintes cutanes par rapport ltat initial i.e. avant la PCE).

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La PCE dans le traitement du CTCL semble apporter un rel bnfice thrapeutique pour 62% des patients dont 1/3 atteignent une rmission complte (33.6%). Cependant, on ne peut pas conclure de faon catgorique car il manque des tudes randomises large chelle. Nanmoins, la PCE na pas deffets secondaires majeurs et constitue donc une trs bonne alternative pour des patients ne rpondant pas aux traitements conventionnels.

20

Auteur (ref)

Anne

Nombre total de patients

Taux de rponses

Rponse Partielle

Rponse Complte

Edelson (11) Heald (14) DallAmico(15) Prinz (16) Owsianowski (17) Zic (18) Gottlieb (19) Duvic(20) Russell-Jones (21)

1987 1989 1991 1995 1996 1996 1996 1996 1997 1998 1999 2000 2000 2000 2001 2002 2004 2006 -

37 32 37 17 16 20 31 34 19 20 25 17 30 37 14 20 19 16 441

27 (73%) 17 (53%) 27 (73%) 12 (71%) 11 (69%) 10 (50%) 20 (65%) 17 (50 %) 10 (53%) 13 (65%) 20 (80%) 13 (76%) 22 (73%) 20 (54%) 7 (50%) 10 (50%) 12 (63.2%) 6 (37.5%) 274 (62%)

18 12 ND 6 7 5 13 11 7 15 3 12 15 3 3 9 182

9 (24%) 5 (14%) 9 (24%) 0 4 (25%) 5 (25%) 7 (23%) 6 (18%) 3 (16%) 5 (20%) 10 (59%) 10 (33%) 5 (14%) 4 7 3 (15.8%) 92 (33.6%)

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Zouboulis(22) Jiang (23) Wollina (24) Crovetti (25) Bisaccia (26) Wollina (27) Knobler (28) Quaglino (29) Rao (30) TotalTable 1 :

Principales tudes cliniques ralises de 1987 nos jours sur lutilisation de la PCE dans le traitement du CTCL. Mis jour partir de Knobler Ann N Y Ac Sci 2001(31)

Ces tudes sont htrognes car les patients sont atteints de diffrentes formes de CTCL (Mycosis Fongode ou Syndrome de Szary). De plus, le stade de la pathologie des patients est variable selon les tudes et parfois au sein mme de celles-ci. Pour quun patient atteint de CTCL puisse rpondre la PCE de faon optimale, il doit tre immunocomptent (32) i.e. capable dlaborer une 21

rponse immunitaire lencontre du clone T leucmique. Il semble ncessaire que le ratio de LT CD4 / CD8 soit proche de la norme car les cellules de Ssary (CD4+) ont la proprit de scrter de grandes quantits dIL-4, laborant ainsi un environnement Th2. Dans les stades avancs de la

pathologie, on observe un envahissement du sang et de la moelle osseuse par les LT leucmiques pouvant atteindre plus de 90% des LT circulants augmentant considrablement le ratio CD4/CD8 ce qui cre un

environnement Th2, dfavorable llaboration dune rponse Th1 dirige lencontre des LT leucmiques. Or la PCE est souvent utilise au stade tardif chez des patients rsistants aux traitements conventionnels. Ces patients ont souvent un ratio CD4/CD8 dj lev. Peut tre, faudrait-il considrer

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lutilisation de la PCE pour des patients en stade prcoce. En 2007, Miller et al. (33) ont publi une revue bibliographique ralise uniquement sur des patients atteints de CTCL en stade prcoce (IA, IB, IIA), traits par PCE entre 1987 et 2007. Au total cette tude reprend 16 publications et reprsente 124 patients traits par PCE en monothrapie ou associe une thrapie adjuvante. Selon les tudes, le taux de rponse varie entre 33 et 88%. Sont considres comme rponses au traitement : (i) Les rponses mineures (>25% damlioration), (ii) Les rponses partielles (> 50%) et les rponses compltes (100% damlioration). La conclusion de ltude est que la PCE semble tre efficace pour le traitement des stades prcoces du CTCL. L encore, une tude multicentrique randomise large chelle serait ncessaire.

22

C. Maladie du Greffon contre lHte ou GvHD :

a.

Dfinition :

La

greffe

de

cellules

souches

hmatopoitiques

(HSTC

pour

Haematopoietic Stem Cell Transplantation) reprsente lun des principaux traitements des hmopathies malignes. Le nombre dHSCT est en constante augmentation avec 1472 greffes allogniques ralises en France en 2008 (daprs lAgence de la Biomdecine) ce qui reprsente une augmentation de 50% par rapport 2004 et 6.7% par rapport 2007.

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Le patient (receveur) est totalement irradi avant la greffe (TBI pour Total Body Irradiation) afin dradiquer lhmatopose et ainsi une grande partie des cellules tumorales. Les lsions causes par lirradiation au niveau des diffrents tissus, notamment les tissus pithliaux, induisent la production de cytokines inflammatoires (TNF, IL-1, IL-6 et GM-CSF) (34). Cest le cytokine storm ou orage cytokinique aprs TBI. Le greffon contient des cellules souches hmatopotiques capables de reconstituer chez le receveur une nouvelle hmatopose (celle du donneur) mais il contient galement des LT matures immunocomptents qui sont capables dtre activs en rponse aux signaux de danger produits au cours du conditionnement pr-greffe et de gnrer une rponse immunitaire. Cest la raction du greffon contre lhte (GvH pour Graft versus Host reaction). Les LT allogniques du greffon sont dirigs contre les molcules du complexe dhistocompatibilit (CMH) du receveur, ou HLA chez lHomme (pour Human Leukocyte Antigen) de classe I et II. Dans le cadre dune greffe HLA compatible, la GvH est principalement dirige lencontre des antignes mineurs dhistocompatibilit (35-36) (pour une revue voir Goulmy, Immunol Rev 1997 (37)). Lenvironnement pro-inflammatoire caus par la TBI exacerbe cette raction. 23

Leffet thrapeutique de la greffe est double. Tout dabord les cellules souches greffes ont pour rle de remplacer lhmatopose dtruite en grande partie lors de la TBI. Ensuite, les cellules tumorales rsiduelles sont reconnues et limines par les LT CD8+ cytotoxiques et CD4+ allogniques contenus dans le greffon. Cest leffet greffon anti-leucmie ou (GvL pour Graft versus Leukemia), recherch, car il est ncessaire lradication complte des cellules tumorales rsiduelles (38). En prsence de cytokines inflammatoires, les cellules pithliales, notamment de la peau et du tube digestif, surexpriment les molcules du CMH et dadhrence. Elles favorisent ainsi lactivation des LT alloractifs responsables de la destruction massive des organes du receveur (peau, tube

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digestif, foie, poumon etc) (39-41). Cest la maladie du greffon contre lhte (GvHD pour Graft versus Host Disease). La dpltion des cellules T matures du greffon prvient lapparition de la GvHD mais augmente considrablement les risques de rechute car ces LT sont ncessaires leffet GvL (42). Les LT alloractifs constituent une population oligoclonale car ils sont spcifiques dun nombre restreint dantignes immunodominants (43). Ds la greffe, ils sont trs fortement activs, prolifrent massivement, constituent une proportion trs importante des LT totaux dans les premiers mois post-greffe. Par la suite leur proportion diminue paralllement la reconstitution immunitaire et lapparition dun nouveau rpertoire T. Nanmoins ils persistent en grand nombre chez les patients nayant pas rsolu leur GvHD, ils sont dtectables dans le sang et leur frquence corrle aux manifestations cliniques de la GvHD (44). La GvHD est la premire cause de mortalit et de morbidit, en absence de rechute, aprs allogreffe HSCT.

La GvHD comporte 2 phases : aigu et chronique. 24

GvHD aigu : Elle survient gnralement dans les 100 jours suivant la greffe, la plupart du temps entre 2 et 5 semaines, avec une frquence de 30 70 % selon la greffe considre malgr le traitement prventif. Les trois organes cibles sont : la peau, le foie et le tube digestif. La GVHD aigu est classe en 4 grades de gravit croissante, selon le degr datteinte des 3 organes-cibles et avec altration plus ou moins marque de ltat gnral : grades I et II de pronostic favorable, grade III de pronostic rserv, grade IV presque toujours mortel.

GvHD Chronique : Par dfinition, la GvHD chronique, gnralement mais non

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constamment prcde par une GvHD aigu, apparat plus de 100 jours aprs la greffe, mais ses manifestations peuvent tre plus prcoces. Elle survient chez environ 50 % des patients et atteint, des degrs variables, la peau, les muqueuses et le foie. Elle est classe en formes limites [peau et (ou) maladies hpatiques] ou extensives. La symptomatologie de la GvHD chronique voque certaines maladies systmiques, dites "auto-immunes" (sclrodermie, syndrome de Gougerot-Sjgren ou cirrhose biliaire primitive). La GvHD chronique entrane la persistance dun dficit immunitaire responsable dinfections tardives potentiellement mortelles (infections CMV, aspergillose). La peau est gnralement le premier tissu atteint. Il sagit dune ruption maculopapuleuse, prurigineuse, inflammatoire, dvolution

fluctuante, touchant le visage, la paume des mains et la plante des pieds, douloureuse dans les deux derniers territoires. Elle peut stendre au tronc, aux membres puis lensemble du tgument. Toutes les formes sont possibles depuis lruption localise jusquau syndrome de Lyell. Les muqueuses peuvent tre atteintes (conjonctive, organes gnitaux externes).

25

b.

Traitements conventionnels de la GvHD :

Prvention :

Le traitement prventif de la GvHD est systmatique. Le protocole le plus utilis associe la ciclosporine et le mthotrexate (45). Dautres protocoles associent des degrs divers de la mthylprednisolone et lassociation cyclophosphamide / mthotrexate / corticodes ou moftil mycophnolate (46-47). La dpltion ex vivo des cellules T du greffon reste dlicate en raison de

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la perte de leffet GVL et du nombre important de rechutes. Nanmoins, un effet GvL peut tre obtenu par lintermdiaire des NK allogniques (48-49). Dans ces conditions, cette mthode a montr une bonne efficacit, en prvenant la GvHD aigu tout en conservant un effet GvL. Enfin de nouvelles stratgies de dpltion slective des LT alloractifs ont t proposes, notamment le ciblage dHSP90 et ouvrent de nouvelles perspectives (50).

Traitements :

Les atteintes modres sont actuellement traites par des corticodes forte dose. La ciclosporine et les globulines anti-thymocytes ne sont prescrites quen seconde intention. Le moftil mycophnolate est aujourdhui

largement utilis. Des essais cliniques ont montres lefficacit du rituximab (anti-CD20) en association avec les corticostrodes (51). La PUVA-thrapie a montr son efficacit dans les GvHD cutanes eczmateuses et

sclrodermiformes (52-53). La problmatique majeure du contrle de la GvHD est quil faut sans cesse adapter les traitements immunosuppresseurs car sils ont lavantage de 26

prvenir et/ou traiter lapparition de cette pathologie ils provoquent aussi des effets secondaires importants. Tout dabord, ils induisent une

immunodpression du patient, le rendant sensible toute infection opportuniste. Sur le long terme, le risque de dvelopper un cancer est accru. En cas de GvHD aigu de grade avance (grade III ou IV), le patient est trait prcocement par de fortes doses dimmunosuppresseurs augmentant les risques de rejet de greffe et surtout de rechute (du laltration dun des effets thrapeutiques majeurs de lallogreffe HSCT : leffet GvL). Inhiber la GvHD tout en favoriasant leffet GvL est le dfi majeur de lallogreffe HSCT. De nombreux concepts dimmunothrapie allant dans ce sens ont merg ces dernires annes (ciblage dantignes mineurs dhistocompatibilit

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particuliers, mismatchs KIR NK...) (38, 54-55). (Adapt daprs P. A Bcherel, Thrapeutique Dermatologique 2001) c. La PCE dans le traitement de la GvHD :

Les principales tudes cliniques sur lutilisation de la PCE dans le traitement de la GvH aigu et chronique sont reportes en Table 2. Le premier patient GvHD (chronique) a t trait par DallAmico en 1993 (56). Depuis, 157 patients atteints de GvHD aigu et 400 atteints de GvHD chronique ont t traits par PCE. Les amliorations au niveau cutan, hpatique et digestif ont t rsumes en Table 3. Les taux de rponses selon les organes et la phase de GvHD varient entre 46 et 81%. Les atteintes hpatiques et digestives chez les patients atteints de GvHD aigu ou chronique ont un taux de rponse quivalents (46 vs 54% et 58 vs 64%, respectivement). En revanche, il semblerait quau niveau cutan, les patients en GvHD aigu rpondent plus favorablement au traitement (81 vs 64%). En 2008, Flowers publia la premire tude prospective randomise comportant 95 patients atteints de GvHD chronique (57). Les rsultats ne sont pas aussi spectaculaires que ceux des tudes prcdentes. On retrouve les 27

mmes tendances, mais celles-ci ne sont pas statistiquement significatives. Il est difficile de maintenir le bras contrle sans traitement trop longtemps pour des raisons thiques videntes. Ainsi, ces tudes ont t conduites sur 12 semaines. Or les effets de la PCE, tardifs, sont souvent observs

ultrieurement. Nanmoins, lutilisation de celle-ci permet la diminution des immunosuppresseurs et rduit donc a minima les effets indsirables lis leur utilisation. En revanche, lorsque linvestigateur est inform du traitement du patient alors la probabilit dune bonne rponse au niveau de la peau aprs 12 semaines de traitement PCE est significativement suprieure compare celle du groupe contrle (Figure 4).

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Figure4 : Courbe de probabilit dobtenir des amliorations au niveau cutan chez des patients GvHD au cours des 12 premires semaines de traitement PCE. Source: Flowers, Blood 2008 (57).

Enfin, Justyna Kanold et al. ont dmontr que la PCE pouvait tre utilise avec succs dans le traitement de la GvHD en pdiatrie (58-59).

28

GvHD

Auteur (ref)

Anne

Nbre total de patients

Taux de rponses (Peau)

Taux de rponses (Foie)

Taux de rponses (Tube digestif)

Sniecinski (60) Miller (60) Smith (61) Salvaneschi (62) Messina (63) Garban (64) Greinix (65) Perfetti(66) Total GvHD Aigu Besnier (67) Smith (61) Miller (60) Sniecinski (60) Child (68) Zic (69) Salvaneschi (62) Padua (60) Apisarnthanarax (70) Kanold (58) Messina (63) Bisaccia (71) Rubegni (72) Foss (73) Garban (64) Marshall (60) Couriel (74) Total GvHD Chronique

1995 1998 1998 2001 2003 2005 2006 2008

11 4 6 9 33 12 59 23 157

1997 1998 1998 1998 1999 1999 2001 2002 2003 2003 2003 2003 2005 2005 2005 2006 2006

5 18 8 26 11 11 14 19 32 63 44 6 32 25 15 8 63 400

1/2 3/3 8/9 27/33 12/12 47/57 14/22 112/138 (81%) 4/4 4/10 5/7 12/15 10/10 6/8 10/12 15/18 19/32 31/51 20/36 4/6 22/27 15/25 12/15 4/5 33/56 226/337 (67%)

1/11 2/4 0/6 1/5 9/14 7/9 14/23 1/4 35/76 (46%) 1/1 3/13 0/1 5/12 1/6 2/5 6/9 7/9 24/33 12/20 3/3 18/23 0/6 4/4 3/21 89/166 (54%)

3/5 3/3 0/6 3/5 15/18 1/3 9/15 4/10 38/65 (58%) 2/7 0/2 7/8 2/10 8/12 2/2 23/25 6/13 3/4 53/83 (64%)

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Table 2 : Principales tudes cliniques ralises de 1995 nos jours sur lutilisation de la PCE dans le traitement de la GvHD aigu et chronique. Mis jour et complt daprs Marshall RS, Nat Cin Pract Oncol 2006 (60).

Chroniqueet

Aigu

La PCE est une thrapie efficace dans le traitement de la GvHD aigu chronique. Elle est une trs bonne alternative lusage des

immunosuppresseurs classiques car elle semble offrir une immunorgulation spcifique des Lymphocytes T alloractifs sans induire dimmunosuppression 29

gnralise (75), ni deffets secondaires. Son utilisation dans le traitement de la GvHD a permis un regain dintrt pour la recherche de ses mcanismes dactions afin doptimiser cette thrapie pour traiter efficacement cette pathologie dsastreuse.

D. Utilisation de la PCE dans dautres pathologies :

Depuis une quinzaine dannes, la PCE a t utilise avec succs dans de nombreuses pathologies autoimmunes mdies par les lymphocytes T. Les patients taient tous rfractaires aux traitements conventionnels pour leur pathologie. La PCE semble induire une immunorgulation spcifique des LT

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alloractifs, elle a donc t utilise pour renforcer linduction de tolrance aprs transplantation dorganes solides. Lensemble des pathologies est list en Table 3.Pathologie Date de 1re utilisation Rfrences

Pemphigus Vulgaris Sclrodermie Polyarthrite Rhumatode Pathologies Autoimmunes Lupus Systmique Erythmateux Psoriasis Diabete de type I Maladie de Crohn Cur Transplantation Poumon Rein Foie AutresTable 3 :

1991 1991 1991 1991 1992 2001 2001 1992 1995 1995 2000 1993

(76-78) (76, 79) (80-81) (82-83) (84) (85) (86) (87-88) (89) (90) (91) (92)

HIV

Tableau rcapitulatif de lutilisation de la PCE dans dautres pathologies et lanne de premire utilisation.

30

Malgr le nombre trs restreint de patients au sein de chaque tude, la PCE semble tre efficace dans le traitement des maladies autoimmunes et des rejets dallogreffes. Elle permet une diminution des immunosuppresseurs chez ces patients. Au vu de son efficacit vidente dans la GvHD, ces rsultats ne sont pas surprenants notamment dans le cadre des rejets dallogreffes o les LT pathognes, comme dans la GvHD, sont alloractifs.

E. Conclusion gnrale sur les applications cliniques de la PCE :

Depuis maintenant 23 ans, la PCE a su trouver sa place dans le panel

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des nombreux traitements des maladies causes par les lymphocytes T. Ses applications sont larges : pathologies tumorales, pathologies autoimmunes et allogniques (rejets en transplantation, GvHD). La PCE apparat comme une thrapie alternative efficace y compris chez des patients rsistants aux traitements conventionnels. Elle est bien tolre et ninduit pas deffets secondaires majeurs. De plus elle semble offrir une immunorgulation spcifique des LT pathognes sans immunosuppression gnralise ce qui reprsente un avantage majeur par rapport aux immunosuppresseurs conventionnels. En outre, elle permet de diminuer les doses

dimmunosuppresseurs administrs aux patients, rduisant ainsi les effets secondaires court et long terme associs ces derniers. Pour toutes ces raisons, la PCE apparat comme une thrapie prometteuse et davenir. En revanche, ses mcanismes daction ne sont toujours pas clairement identifis. Ceci reprsente la principale limite loptimisation, la

gnralisation et la standardisation de la PCE. De plus, la connaissance des mcanismes daction permettra de dfinir des indications prcises pour son utilisation.

31

3. Immunologie de la PCE : De la clinique limmunologie fondamentale.A. La PCE est une immunothrapie

La PCE est une thrapie cellulaire utilise dans des pathologies diverses dont le point commun est limplication des lymphocytes T pathognes (tumoraux dans le CTCL, alloractifs dans la GvHD et les transplantations dorganes solides, autoimmuns dans la sclrodermie etc..) dont lefficacit

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est dmontre en clinique (11, 60). Dans le CTCL, le traitement par PCE de patients cortico-rsistants a donn des rsultats probants. En effet, on observe une diminution (rponse partielle) voir une limination complte (rponse complte) du clone leucmique circulant (93-95) qui saccompagne dune amlioration de linfiltrat T cutan. Dans la GvHD, le traitement par PCE de patients cortico-rfractaires permet de contrler les lymphocytes T alloractifs responsables de la pathologie (57, 96-97). Ce contrle est spcifique car les patients traits par PCE ne sont pas immunodprims et restent capables de rpondre aux infections. La PCE permet (chez les patients rpondeurs) une nette diminution des doses dimmunosuppresseurs aprs greffe de cellules souches

hmatopotiques ou transplantation dorganes solides (87-88). Les mmes observations ont pu tre faites dans le cadre du traitement de maladies autoimmunes. Les observations cliniques ont t renforces par des modles murins de GVHD (98-101) ou de SLE (pour Systemic Lupus Erythematous) (102-103). Le principe exprimental est le mme dans ces diffrents modles : la 32

pathologie est induite chez une premire souris (Cf. Figure 5), les splnocytes (contenant les LT pathognes ) sont rcolts puis traits par PCE avant dtre rinjects une seconde souris syngnique saine. La rinjection de splnocytes photoirradies protge les seconds animaux du dveloppement de la pathologie. Cette protection est observe uniquement lorsque les cellules traites contiennent des clones T pathognes .

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Figure 5 : Modle de rejet cutan daprs Perez, Transplantation 1991(104). Une souris (#1) est greffe avec une peau allognique. La peau est rejete en 12 jours post greffe. Les splnocytes de la souris #1 sont rcuprs et traits in vitro par PUVA. Ils sont rinjects une deuxime souris syngnique (#2). Lorsque lon greffe de la peau allognique la souris #2 ayant reu les cellules traites, on observe un rejet dcal 22 jours. Ainsi la rinjection de cellules pathognes traites par PCE inhibe la raction de rejet de lallogreffe.

On retrouve une certaine analogie entre le modle dtude de la PCE dvelopp par Perez et al. et celui du groupe dIrhun Cohen (105) portant sur la protection du dveloppement de lEAE (Experimental Allergic Encephalomyelitis) (Figure 6). Dans ce modle exprimental de maladie autoimmune, la pathologie est initialement induite chez des rats sains en leur 33

injectant la protine basique de la myline (MBP) en prsence dadjuvant complet de freund. Ceci induit une rponse autoimmune dirige

lencontre des cellules nerveuses mylinises et conduit leur destruction. Les cellules responsables de la pathologie sont des LT CD4+ anti-MBP. Si lon vaccine un rat sain avec des cellules T pathognes altres par irradiation , linjection ultrieure de MBP ninduira pas dEAE. Dans ce modle, la protection est galement antigne spcifique. En effet le second animal est protg de lapparition de clones T CD4+ anti-MBP et il reste

immunocomptent. Bien que le traitement des cellules T pathognes soit diffrent (8MOP+UV-A versus Irradiation ) le principe actif dans ces expriences est

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similaire : il se compose de LT pathognes altrs. Il est important de noter que les travaux du groupe de Cohen reprsentent la base des travaux dEdelson pour le dveloppement de la PCE.

Figure 6 : Modle dencphalomylite autoimmune exprimentale (EAE) daprs Ben-Nun, Nature 1981(106).

34

Chez lHomme, les pathologies traites par PCE sont diffrentes mais dans toutes les situations pathologiques rencontres, le point commun rside dans la ncessit de la prsence des cellules T pathognes pour obtenir un effet thrapeutique de la PCE. Les cellules T pathognes modifies par photochimie reprsentent le principe actif (107) (Figure 7) et la rinjection rpte de ces cellules va entraner un contrle par le systme immunitaire de lensemble des cellules pathognes (non traites). Ainsi la PCE induit une immunomodulation spcifique des clones T pathognes.

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Figure 7 : Procdure simplifie de la PCE. (1) Les cellules monoclues du patient sont collectes par aphrse. (2) Elles sont ensuite irradies aux UV-A en prsence de 8MOP (3) Enfin, les cellules pathognes modifies par photochimie (principe actif de la PCE) sont rinjectes au patient. Source: Hannani, Rev Med Int 2010 (107)

Ainsi, nous proposons la PCE comme une immunothrapie par cellules modifies par photochimie permettant dinitier une rponse immunitaire spcifiquement dirige lencontre des lymphocytes T pathognes .

35

B. Comment

le

systme

immunitaire

peut-il

contrler

les

LT

pathognes ?

a.

La rponse immunitaire T et sa rgulation:

La rponse immunitaire T spcifique est essentielle la protection de lindividu lencontre des virus, des bactries et du dveloppement tumoral. On peut rsumer cette rponse en 3 phases (Figure 8): Initiation : Linduction dune rponse T ncessite une quantit dantigne adapte qui, combine aux signaux de lenvironnement sont intgrs par

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les DC qui initient une rponse T approprie (pro- ou anti-inflammatoire, humorale, cellulaire..). Les antignes sont apprts et prsents aux LT nafs par les DC dans le contexte des molcules du CMH. Action/effectrice : Les LT qui ont prolifr, maturent en cellules effectrices (LT CD4+ helper : Th1, Th2, Th17, LT rgulateurs et des LT CD8+ cytotoxiques) capables dliminer lagent pathogne. Contraction : Une fois lantigne radiqu, les cellules effectrices sont limines. Durant la phase de contraction, seules quelques cellules survivent et se diffrencient en cellules T mmoires, capables de rpondre beaucoup plus rapidement lors dun second vnement pathogne similaire.

En parallle dune rponse effectrice, de nombreux mcanismes de rgulation sont impliqus tels que lActivation-Induced Cell Death ou AICD (apoptose induite par la liaison FAS-FAS-L) (108). Ces mcanismes sont plus ou moins spcifiques de lantigne. En revanche, les LT rgulateurs sont capables dinhiber spcifiquement les LT effecteurs(Figure 8). Au cours de la rponse immunitaire, leur nombre est inversement proportionnel celui des LT effecteurs. Il saccrot jusqu lextinction de la phase effectrice(109). 36

Figure 8 :

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Schma synthtique des 3 phases majeures dune rponse immunitaire T.

La rgulation spcifique dun clone T du soi (ou anti-soi) passe notamment par linduction en priphrie de lymphocytes T rgulateurs,

capables de le contrler par contact direct, indirectement par la production de cytokines anti-inflammatoires, ou par cytotoxicit (109). Seuls ces mcanismes de rgulation T spcifiques seront dvelopps ici.

b.

Les Lymphocytes T rgulateurs :

i.

Dfinition :

Les cellules T rgulatrices sont fonctionnellement dfinies par leur capacit prvenir ou stopper le dveloppement de rponses immunitaires indsirables, excessives : inflammatoires, dirige contre le soi : autoimmunes.

ii.

Les lymphocytes T rgulateurs CD4+ :

37

Les LT rgulateurs (Treg) CD4+ les mieux caractriss sont les Treg naturels ou nTreg. Ils prennent naissance au niveau du thymus, lors de la slection thymique (Cf. Table 4) (110-111). Les lymphocytes T autoractifs de forte affinit sont limins tandis que ceux ayant une affinit intermdiaire peuvent tre convertis en LT rgulateurs. Le processus de conversion nest pas encore bien lucid (112). Les Treg sont caractriss par lexpression constitutive de CD25, la chaine du rcepteur lIL-2, ainsi quune forte expression du facteur de transcription forkhead box P3 (FoxP3). Ces Treg CD4+CD25+FoxP3+ ont t dcrits comme jouant un rle majeur dans la prvention de pathologies autoimmunes.

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Cellules T rgulatrices CD4+ nTreg

Phnotype

Induction

Mode de suppression Contact

Cibles

CD4+CD25+ FoxP3+ Tr1 Th3CD4+CD25+

Thymique

(GITR, CTLA4), IL-10, TGF

APC, LT

i Treg (induits en priphrie)Table 4 :

FoxP3+ CD4+CD25+ FoxP3+

IL-10

IL-10 +++ TGF+ TGF +++ IL-10+

LT, APC LT, APC

TGF, IL-4

Rcapitulatif des diffrentes populations de LT rgulateurs CD4+ chez lHomme ainsi que leur phnotype, mode dinduction, mode daction et leurs principales cibles.

La rgulation des clones T auto-ractifs, alloractifs, ou LT effecteurs trop abondants, est un phnomne qui se dveloppe au niveau des organes lymphodes secondaires travers la gnration de Treg dits induits (iTreg) (113). La gnration diTreg dpend de lenvironnement dans lequel les LT CD4+ nafs ont t activs. Seules les APC professionnelles telles que les DC sont capables dactiver des LT CD4+ nafs (priming) en LT CD4 effecteurs ou

38

mmoires. La nature des LT CD4+ effecteurs induits dpend de ltat de lAPC qui lui mme est dpendant des cytokines et de lantigne. Dans un contexte inflammatoire, en prsence dIFN et dIL-12, les APC induisent des LT CD4+ helpers de type 1 (Th1) capables de produire entre autres, de lIFN et de favoriser une rponse T CD8+ cytotoxique (Cf. Figure 9). En prsence dIL-4, les APC favorisent la diffrenciation des LT CD4+ en Th2 capables de soutenir une rponse humorale forte via la production de cytokines telles que lIL-4, IL-5 et lIL-13. En prsence dIL-6 et de TGF, les APC favorisent la diffrenciation des LT CD4+ en Th17 capables de produire de lIL17. Ces cellules rcemment dcrites, jouent un rle important dans la physiopathologie de maladies inflammatoires telles que le psoriasis, la

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polyarthrite rhumatode, la maladie de Crohn et la GvHD (114-117).

Figure 9 : Schma reprsentant les diffrentes sous populations CD4+ helpers et rgulateurs en fonction des cytokines prsentent dans lenvironnement. Source: Weaver, Immunity 2006

Les iTreg sont gnrs en prsence de cytokines anti-inflammatoires telles que le TGF ou lIL-10 (Cf table 5). On distingue 2 populations rgulatrices: Les Tr1 et les Th3. Les Tr1 sont gnrs en prsence dIL-10 et sont leurs tours capables dinhiber les rponses Th1 et Th2 via la production dIL10 en grande quantit. Les Th3, sont quant eux produits en prsence de TGF et le scrtent leur tour en grandes quantits. Les LT effecteurs sont rendus anergiques en prsence de TGF (118). 39

En plus des cytokines polarisantes prsentes dans lenvironnement, les DC ont galement un rle important jouer dans linduction de LT rgulateurs. En effet, la prsentation dun peptide un LT naf avec un dfaut de co-stimulation (CD40, CD80, CD86) entrane lanergie de ce dernier. Les APC sont sensibles aux cytokines de leur environnement et la prsence de TGF et/ou IL-10 entrane un dfaut de maturation de ces dernires. Elles sont alors incapables dinitier lactivation des cellules T CD4+ en cellules T effectrices de type Th1 ou Th2 ou des cellules T CD8+ cytotoxiques (Figure 10). Elles diminuent lexpression des molcules de co-stimulation, ne produisent plus ou peu dIL-12 et enfin produisent de lIL-10 favorable la gnration de Treg de type Tr1 (119). Lexpression de la molcule PD-L1 (programme death

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ligand 1) par les APC joue un rle galement trs important dans linduction et le maintien des iTreg (chez la souris) lors dinteractions APC cellule T (120).

Figure 10 : Mode daction des Treg sur les cellules prsentatrices de lantigne (APC). Le Treg induit un dfaut de maturation de lAPC via la scrtion de cytokines antiinflammatoires et/ou par des signaux inhibiteurs de contact. Source: Von Herrath, Nat Rev Immunol 2003.

Les cellules apoptotiques sont connues pour produire de lIL-10 et du TGF (121-124). Ainsi, leur prsence dans lenvironnement ou leur

phagocytose pralable par les APC peut affecter les fonctions de ces dernires et conduire la gnration de LT rgulateurs. 40

iii.

Les Lymphocytes T rgulateurs CD8+ :

Le concept de LT CD8+ rgulateurs (Treg) ou suppresseurs est relativement ancien (125). Lexistence de ces Treg CD8+ a t dmontre au cours des 10 dernires annes (126-128) grce aux avances techniques permettant une meilleure caractrisation phnotypique et fonctionnelle de ces cellules, notamment grce la cytomtrie en flux. Il existe plusieurs sous populations de Treg CD8+. Elles diffrent phnotypiquement selon leur origine et leur mode daction. Les diffrentes populations sont reportes dans la table 5 ci-dessous.

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Cellules T rgulatrices CD8+Thymique nTreg (naturels)

PhnotypeCD8+ HLAG+ CD8+CD122+ CD8+FoxP3+

InductionNaturelle Naturelle AutoAg et Pathognes AutoAg et Pathognes AutoAg et alloAg AlloAg

Mode de suppressionHLA-G soluble IL-10, TGF IL-10, TGF, CCL4 ILT3, ILT4, IDO ?

CiblesLT, APC LT APC LT, APC

Priphrique iTreg (induits)

CD8+NKG2A+ CD8+CD28CD8+CD103+

Table 5 : Rcapitulatif des diffrentes populations de LT rgulateurs CD8+ chez lHomme ainsi que leur phnotype, leur mode daction et leurs principales cibles.

Comme pour les LT CD4+, il existe 2 catgories de Treg CD8+ selon leur origine: les Treg naturels, gnrs dans le thymus, et les Treg induits, gnrs en priphrie, dans les organes lymphodes secondaires. On distingue 2 sous populations de Treg CD8+ naturels. les Treg CD8+HLA-G+ qui sont capables dinhiber les LT effecteurs via la scrtion de HLA G soluble (129). HLA-G est connu pour linduction de 41

tolrance lors de la grossesse. Plus rcemment il a t dmontr que HLA-G pouvait tre impliqu dans linhibition de prolifration des LT CD4+ et CD8+ allogniques (130-131). Les Treg CD8+CD122+ (CD8+CXCR3+ chez lhomme) qui ont la capacit dinhiber la production dIFN et la prolifration des LT CD4+ et LT CD8+ activs en scrtant de lIL-10. Cette fonction suppressive est induite par des signaux de co-stimulations de type CD28-B7 et dpendante dune reconnaissance par le TcR (132-133).

Et 4 autres sous-populations de Treg CD8+ induits en priphrie aprs contact avec lAg.

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Les Treg CD8+FoxP3+ qui sont gnrs au contact dAg du soi ou du non-soi. Ils sont eux mme subdiviss en sous-populations : CTLA4-,

CTLA4+ ou CD45 RClow . o Les Treg CD8+FoxP3+CTLA-4- ont un pouvoir suppressif qui est principalement mdi par la production dIL-10, de TGF et de CCL4 (134-136). o Les Treg CD8+FoxP3+CTLA-4+ dont linhibition est contactdpendante (112). o Les Treg CD8+FoxP3+CD45RClow, induits en stimulant des LT CD8+ naifs avec des cellules dendritiques plasmocytodes (pDC) en prsence dIL-10, inhibent les rponses primaires T via la production dIL-10 mais pas de TGF (137-138). Ils ont galement t dcrits in vivo chez des patients ayant reu une

transplantation de rein, tolrants long terme (139). Les Treg CD8+NKG2A+ dont les modes de suppression ne sont pas

encore bien connus (Mingari, Curr Opin Immunol 2005). Les Treg CD8+CD28- sont caractriss par labsence dexpression de CD28 (140). Leur mode de suppression est exerce par contact avec 42

des APC, conduisant la surexpression de molcules inhibitrices, linhibitory immunoglobulin-like transcript (ou ILT) 3 et 4 par ces dernires. La surexpression dILT3 par des APC est associe linhibition de lactivation du facteur de transcription NFkB conduisant un dfaut de maturation de ces dernires. Ces APC acquirent une capacit tolrogne et ne sont plus capables dinduire des rponses primaires de type Th1. Les Treg CD8+CD103+. Nous nous concentrerons dans la suite sur les mcanismes dinduction et daction de ces Treg plus particulirement cibls pour tre impliqus dans les mcanismes daction de la PCE (141).

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iv.

Les LT rgulateurs CD8+ CD103+ alloantignes spcifiques:

Lintgrine E7 ou CD103 est le rcepteur lE-cadhrine et a t dcrit comme tant une molcule dadressage (homing) des LT CD8+ au niveau des pithliums (142). CD103 est galement exprime par les LT CD8+ infiltrant les greffons allogniques. Hadley et al. (143) ont t les premiers dmontrer lexpression de CD103 sur les LT CD8+ alloactivs ayant infiltr des greffons rnaux. Ces cellules T CD8+CD103+ peuvent tre gnres ex vivo aprs une stimulation allognique (141). Elles ont t dcrites pour avoir des proprits suppressives et sont capables dinhiber la prolifration de cellules autologues lors dune raction mixte lymphocytaire (MLR). Bien quelles scrtent de grandes quantits dIL-10, leur action suppressive est contact dpendante (141). Lexpression de CD103 lors dune MLR est augmente en prsence dIL4, dIL-10 ou de TGF et diminue par la prsence dIL-12. De plus le TGF a la proprit de favoriser et maintenir lexpression de CD103 (144). Il est intressant de noter que lexpression de CD103 par les Treg CD4+FoxP3+ a galement t rapporte (145). 43

c.

La rponse rgulatrice anti-clonotypique :

i.

Dfinition :

Une rponse T anti-clonotypique est une rponse immunitaire T dirige lencontre dune population clonale de LT, spcifique de dterminants antigniques (idiotopes) exprims par le TcR.

ii.

Les LT CD8+ rgulateurs cytotoxiques anti-clonotype:

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A la fin des annes 70, Bellgrau et al. (146) ont dmontr lexistence dune rponse immunitaire T lencontre de LT dans un model de GvHD chez le rat. Dans ce modle, la GvHD est induite en injectant des rats F1 (AxB), ayant subi pralablement une irradiation corporelle totale (ou TBI pour Total Body Irradiation), des lymphocytes T dun des parents (A ou B). La TBI cause une immunodpression, et les LT dorigine parentale vont ragir lencontre des antignes de lautre parent (B ou A respectivement), causant une GvHD. Les rats F1 n'ayant pas reu de TBI (rats immunocomptents) sont rsistants au dveloppement de la GvHD aprs injection de LT dorigine parentale. Linjection des splnocytes provenant des rats rsistants, des rats ayant reu une TBI protge ces derniers du dveloppement de la GVHD, suite linjection de LT parentaux. La dpltion des cellules T contenues dans les splnocytes provenant de rats rsistants abolit leur effet protecteur aprs rinjection des animaux ayant reu une TBI. Ce travail dmontre lexistence dune rponse immunitaire T capable de ragir spcifiquement lencontre de lymphocytes T pathognes semi-allogniques. Au dbut des annes 80, il a t dmontr que dans le modle de lEAE cette rponse T anti-T pathognes passait par une reconnaissance spcifique du TcR des lymphocytes pathognes , ici des LT CD4+ anti-MBP 44

(106, 147). De plus, il a t dmontr que la vaccination avec des peptides issus de la rgion V dun TcR exprim par un clone, empchait par la suite lapparition de ce clone (148). Cest une rponse anti-TcR. Les fragments peptidiques du TcR ou idiotopes sont prsents dans le contexte des molcules de classe I et II aux LT CD4+ et CD8+ anti-TcR. Ces lymphocytes T anti-clonotypiques sont cytotoxiques et par consquent sont des cellules rgulatrices au sens large du terme. Plus tard, il a t dmontr quune partie de la population rgulatrice des LT CD8+ anti-TCR tait restreinte par les molcules du CMH Ib (nonclassiques), notamment HLA-E ou Qa-1 (chez lHomme ou la souris respectivement). Ce point est dvelopp dans la partie suivante.

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iii.

Les LT CD8+ rgulateurs HLA-E restreints :

Au dbut des annes 1990, Hong Jiang (149)

a dmontr dans le

modle de lEAE limportance de la population LT CD8+ dans le contrle de la pathologie. Aprs une premire injection de MBP protine (induction de lEAE suite lactivation de LT CD4+ anti-MBP autoractifs), et aprs une premire rmission spontane de la pathologie, les animaux sont protgs dun dveloppement secondaire de lEAE suite une seconde injection de la MBP. Linjection pralable dun anticorps anti-CD8 abolit totalement la protection des animaux suggrant labsence de rgulation par les LT CD4+. Il dmontra par la suite que les LT CD4+ pathognes taient contrls par des LT CD8+ reconnaissant spcifiquement leur TcR (V8) et de faon dpendante de la molcule de CMH Qa-1 (HLA-E chez lHomme) (150-151). De mme, la vaccination danimaux avec des cellules T CD4+ V8+ actives, induit la gnration dune population rgulatrice T CD8+ reconnaissant spcifiquement les peptides issus du TcR V8 prsents par Qa1 (Figure 11) (152-154). Rcemment, il a t dmontr dans le mme modle 45

quaprs injection de clones T CD4+ anti-MBP activs et altrs, ces derniers sont phagocyts et crossprsents par des DC capables de primer des LT CD8+ suppresseurs HLA-E restreints cytotoxiques in vivo (155). Ainsi linjection dune population clonale de LT CD4+ activs et altrs (apoptotiques) permet linduction dune rponse rgulatrice LT CD8+ dirige spcifiquement lencontre de ce clone (rponse anti-clonotypique).

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Figure11 : Schma reprsentant laction des LT CD8+ suppresseurs Qa-1 restreints. (A) lactivation dun LT CD4+ par une APC conduit lexpression de la molcule Qa-1 prsentant des peptides du soi, notamment des peptides issus du TCR par le LT CD4+ activ. (B) Le clone T CD4+ activ va tre rgul par un LT CD8+ rgulateur spcifique du peptide prsent par le clone LT CD4+ activ et restreint par la molcule Qa-1. Source : Jiang, J Clin Invest 2004 (156)

d.

La rponse rgulatrice anti-ergotypique :

i.

Dfinition :

Ergotope : Ergo est dorigine latine. Cela signifie en travail / en activit . Ainsi un ergotope est un pitope (ou dterminant antignique)

spcifiquement exprim par des cellules actives. Un ergotope T est donc par 46

dfinition driv dun marqueur dactivation T. Ces pitopes sont prsents dans le contexte des molcules de CMH de classe I et II.

Lymphocyte T anti-ergotypique : Ce sont des lymphocyte T CD4+ ou LT CD8+ (TcR-+ ou TcR-+) ayant pour cible un ergotope dont les cibles antigniques sont les cellules actives.

ii.

Les ergotopes et la rgulation anti-ergotypique:

La chaine du rcepteur lIL-2 (CD25) apparat comme un trs bon

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candidat dergotope. En 2004, Mimram et al. ont mis en vidence (157) lapparition dune population T anti-ergotypique reconnaissant

spcifiquement CD25 suite la vaccination de rats laide de lADN codant pour CD25. Dans un modle de maladie autoimmune, cette vaccination protge les animaux de lapparition de la polyarthrite (dveloppe par le groupe contrle). Dans ce modle, les LT pathognes expriment CD25 en sactivant et sont reconnus et limins par les LT anti-ergotypiques (anti-CD25) avant lapparition des signes de la pathologie. Lexpression de CD25 tant restreinte aux LT activs, ce marqueur dactivation constitue un ergotope T spcifique. LHSP60 (Heat Shock Protein) est une protine de stress exprime par lensemble des cellules de lorganisme. Elle a t dcrite comme jouant un rle en tant que mdiateur inflammatoire (158-159). HSP60 est prsente dans le contexte du CMH par les LT activs. De faon intressante, la vaccination de rats laide dun ADN codant pour le gne de lHSP60 les protge du dveloppement de la polyarthrite, de faon similaire la vaccination par lADN codant pour CD25 (160). Ainsi, bien que HSP60 soit prsente dans diffrents types cellulaires, le fait quelle soit prsente par des LT CD4+ activs et quelle soit antignique fait tout de mme de cette protine un 47

ergotope car la reconnaissance de HSP60 permet une limination des LT CD4+ activs. On parle dergotopes partags . Les Lymphocytes T rgulateurs anti-ergotypiques sont des Lymphocyte T CD4+ ou CD8+ + ou des LT +. Les LT + reconnaissent les peptides ergotopes prsents dans le contexte du CMH et les LT CD8+ + exercent une activit cytotoxique lencontre des LT activs. Contrairement aux LT +, le mcanisme de reconnaissance des LT CD4+ activs par les LT + anti-ergotypiques nest pas restreint par le CMH (Classe I et II) (157). Linduction des T rgulateurs anti-ergotypique est schmatise de faon simplifie dans la figure 12. La rponse anti-ergotypique est trs certainement un des mcanismes

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de rgulation constitutif chez lindividu sain. Cest un phnomne bnficiant dun grand champ daction car il rgule lensemble des lymphocytes T CD4+ activs. Cest un moyen par lequel le systme immunitaire peut limiter lexpansion trop importante dun clone T CD4+ et apparat comme un phnomne garant de lhomostasie lymphocytaire T.

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Figure 12 : Induction dune rponse rgulatrice CD8+ anti-ergotypique. Les LT CD4+ expriment (1) des ergotopes en sactivant, ici CD25. Plus tard une partie de ces LT vont entrer (2) en apoptose notamment par lAICD. Les antignes issus de ces LT apoptotiques pourront (4) tre apprts et cross-prsents par les DC aux LT CD8+. Parmi ces antignes, on retrouve des ergotopes. La prsentation de ces peptides issus dergotopes dans le contexte du CMH de classe I induit (4) une rponse T CD8+ antiergotypique (spcifiques de peptides issus du CD25 dans cet exemple) conduisant (5) la reconnaissance et (6) llimination de lensemble des LT CD4+ activs. Ceci permet in fine lextinction des rponses immunitaires aprs limination de lantigne et permet notamment de contrler lexpansion des LT CD4+ au cours de ces rponses.

49

e.

Les Lymphocytes NK T rgulateurs :

Les lymphocytes Natural Killer T (NKT) sont une sous population de lymphocytes partageant des caractristiques des cellules NK comme lexpression du CD161 et du CD94 et des caractristiques des LT en exprimant un TcR . Lexpression dun TcR les diffrencie fondamentalement des Lymphocytes NK. Parmi les NKT, les plus tudis expriment un TcR semiinvariant : le V24-J18 et V11 chez lHomme. De plus ce TcR invariant ne reconnat pas des peptides associs au CMH I et II classiques mais des glycolipides prsents par CD1d, une molcule du CMH non classique et non polymorphique. Les NKT se diffrencient au niveau du thymus, on les retrouve

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de faon prdominante dans le foie et leur frquence dans le sang priphrique reprsente 0.2% des lymphocytes T. Peu de ligands naturels des NKT sont connus nos jours. On en dnombre 6 : 3 ligands endognes et 3 autres bactriens (pour une review : (161)). Le ligand le plus efficace pour activer les NKT est le glycolipide synthtique -galactosylceramide (GalCer), initialement driv dune ponge marine. Il est largement utilis comme antigne hautement spcifique aussi bien chez lHomme que chez la souris. La capacit des NKT rpondre trs rapidement aprs activation par la scrtion de cytokines est typique dune rponse de limmunit inne. Ils peuvent pro