The IAEA in Biological Dosimetry International Atomic Energy Agency Biodosimetryの放射線生物学国際原子力機関ヒューマンヘルス局応用放射線生物学・放射線

IAEA International Atomic Energy Agency

Biodosimetryの放射線生物学

国際原子力機関ヒューマンヘルス局応用放射線生物学・放射線治療課

オレグ・ベリヤコフ

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目次

10 June 2013 OvB BIODOSE-21, Hiroshima, Japan 2

• Cytogenetic Dosimetryに関するIAEA刊行物の紹介 • Biodosimetryにおける量の概念の応用 • 染色体損傷の放射線物理 • ヒトリンパ球 • 染色体構造 • 被曝に伴う染色体変異 • 血液サンプルの採取、保存 • in-vitro線量ー反応曲線 • 二動原体染色体分析 • 転座分析 • 未成熟染色体凝縮(PCC) 分析 • 細胞質分裂阻害小核(CBMN) アッセイ • 染色体分析の自動化 • 結論，謝辞

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Cytogenetic Dosimetry, IAEA 1986


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1986年 “Biological Dosimetry: Chromosomal Aberration Analysis for Dose Assessment” 技術報告書 No 260

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2001年 “Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment” 技術報告書 No 405

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IAEA WHO 2011年 “Cytogenetic Dosimetry Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies” IAEA, WHO, PAHO(汎米保健機構)の共同制作

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生物学的線量評価における放射線量の規定


• リンパ球の染色体欠失(ChA)から吸収線量を推定する． • あらかじめ検定した線量反応曲線から吸収線量を推定する．

• 線種ごとに線量を振ったin vitroの全血照射で検定を行い，線量反応曲線を作成する．

• 検定の線量は物理的測定で行い，1次標準(国家計量標準)，もしくは2次標準まで遡れることが望ましい．

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染色体損傷の放射線物理


• 電離放射線によって，電離や励起が発生する． • 飛跡に沿って与えられるエネルギー量が線エネルギー付与(LET)で表される．

• 電離放射線によるさまざまの反応の結果が生物学的効果比(RBE)として表される．

• RBEは，基準放射線（X線）量と同じ生物学的効果をもつ，対象放射線の放射線量の比である．

IAEA 10 June 2013 OvB BIODOSE-21, Hiroshima, Japan 8

Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment. A Manual, Technical Reports Series No. 405, IAEA, Vienna (2001)

二動原体染色体でみた線量反応曲線


Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment. A Manual, Technical Reports Series No. 405, IAEA, Vienna (2001)

RBEとLETの関係

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直線2次曲線(LQ)モデル


低LET線の線量反応曲線は1粒子によるものと2粒子によるものの総和となる．

Y = C +αD + βD2

Y:二動原体染色体の量, D:線量, C:コントロール（背景頻度）, α,β:係数

α/β比はαDとβD2の二動原体形成への寄与が等しいと

きの線量に相当する．


Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA, Vienna (2011)

ヒト末梢血リンパ球

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染色体の構造とクロマチン・パッキング


Courtesy REAC/TS, USA. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA, Vienna (2011)

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ヒトの核型と染色体中のDNA


男性女性

A banded chromosome/karyotype preparation from a normal male, 46, XY (left) and a normal female 46, XX (right, courtesy Mayo Clinic, USA. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA, Vienna (2011)

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細胞周期


Courtesy REAC/TS, USA. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA, Vienna (2011)

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電離放射線による染色体変異


• 電離放射線は飛跡に沿ってスパー(spur)，ブロブ(blob)，トラック(track)を時間的，空間的に分散した形で生成する．

• DNAの損傷は直接DNAが電離することによる直接

作用と，主に水の電離によって生まれたラジカルによる間接作用で発生する．

• 低LET線は限局した電離を単独の電子トラックで生成する．

• 高LET線は密に電離を起こし，かつ量も多い．

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放射線によるDNA損傷


• DNA損傷の種類として，塩基損傷(BD)，１本鎖切断(SSB)，塩基の喪失(AS)， DNA－蛋白質架橋 (DPC)，二本鎖切断(DSB)がある．

• LETの違いにより観測される損傷は異なる．



• 不安定型異常 • 二動原体染色体 • 環状染色体 • 無動原体染色体 • “rogue cell”

• 安定型異常 • 相互転座 • 非相互転座 • 中間部転座 (挿入)


染色分体型異常(G0/G1期)

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染色分体型異常(G2/S期)


• 末端・中間部欠失 • 非染色性部位 • 同位染色分体欠失 • 不均衡型相互転座 • 均衡型相互転座 • 三放射状染色体



• PCC分析は照射直後の変化，修復/誤修復の過程を調べる上で有用な方法である．

• Fusion-PCC分析は，PCCを誘発するために分裂期の細胞と細胞融合を行う手法である．

• 迅速間期細胞染色体分析 (RICA)はFISHプローブを

用いることで放射線による損傷を可視化する方法である．

• 他にもDic-PCC・Ring-PCC分析がある．

未成熟染色体凝縮 (PCC)

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小核


• 小核(MN)は，無動原体染

色体断片や娘細胞の核に含まれない分裂後期の染色体からなる．

• サイトカラシンBを添加

することで細胞質分裂阻害し，感度を高めることができる．

John R K Savage Micronuclei : Pitfalls and Problems, July 2000, Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and

Haematology, http://atlasgeneticsoncology.org/Deep/MicronucleiID20016.html

http://atlasgeneticsoncology.org/Deep/MicronucleiID20016.html



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血液サンプルと採取タイミング


• 経静脈的に採取された血液検体を用いる． • 検体量は10mlが望ましい． • 全身被曝の場合は有効な検体を数時間後に採取できる．

• 部分被曝や不均一被曝の場合は，変異リンパ球の濃度が平衡状態に達するまで24時間程度必要である．

• 高線量被曝の場合は，リンパ球数が減少するまで数日から数時間しかない．

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抗凝固剤・容器・輸送


• 抗凝固剤には保存料を含まない経派厘リチウムが一般的だが，ヘパリンアンモニウム，ヘパリンナトリウムも使用可能である．

• ヘパリンリチウム入りの検体スピッツが複数の業者から市販されている．

• 輸送中の温度管理は18-24°Cに保たれるのが理想的である．

• 感染症がないことが確認されている場合には，UN 3373. BIOLOGICAL SUBSTANCE, CATEGORY B.とラベルをする．

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線量反応曲線の作成


• 検量線は環境によって誤差が生じるため，相互検証は重要である．

• 被曝事故の大半はγ線，X線によるものである． • in vivoに可能な限り近い環境にしたin vitroでリンパ球への照射をするべきである(温度，酸素分圧など)．

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測定上の留意点


• 線量反応曲線を作成する際には，校正された正確な物理的測定が必要である．

• 散乱線の影響を受けないように注意する． • 測定環境の正確な距離測定が必要である． • 測定した空気カーマから空気カーマあたりの吸収線量を求め，距離や吸収を補正することで最終的な線量を得る．

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統計上の留意点


• 低LET線では小核形成や染色体異常の数(Y)と線量(D)はLQモデルに近似される： Y = C + αD + βD2

• 高LET線では，αが支配的になりY = C + αD に近似される．

• 曲線回帰はポアソン統計を前提としているため，各設定線量での計測値がポアソン分布に従うことを検定する必要がある．

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培養


• 二動原体染色体分析では2日，細胞質分裂阻害微小核 (CBMN)分析では3日間の培養が必要．

• Fusion-PCCでは培養は必要ないが，化学誘導法では必要となる．

• 二動原体法やその他の分裂中期に行う解析はコルセミドによる分裂阻害が必要．

• CBMN法ではサイトカラシンBによる細胞質分裂阻害が必要．

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固定


• リンパ球培養は48～52時間行うことが多い． • 培養液を遠心分離し，上清を取り除いてから低張液に移す．

• 15分間37°Cにおき，もう一度遠心分離してから低張液を取り除き，つど準備した固定液(メタノール:酢酸＝3:1)で再懸濁する．

• 縣濁液2，3滴をとり，スライドに乗せ，自然乾燥させる．

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染色


• 蛍光ギムザ(FPG) 染色を用いることでin vitro環境での第1分裂とそれ以降に染め分けることができるため推奨されている．

• ギムザ(2%)染色も多く用いられる． • 汎動原体プローブを用いたFISHやCバンド法を用

いると動原体をより特異的に染色することができる．

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スライドの分析


• まず低倍率(~x100-x200)から検鏡を始める． • 観察に適した分裂細胞を見つけたら，高倍率

(~x1000-x2000)で検鏡する． • コンピュータを用いた検鏡システムもある．デジタル化された画像で異常染色体の検索を半自動的に行うことができるが，完全に自動化されたシステムはない．

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データの記録


• サンプル，スライド，関連する文書に固有の識別コードやラベリングシステムを適用する．

• 実験のためであっても被曝調査のためでも，サンプルの受領書と処理手続きを研究室記録に残す．

• データ管理，保管は電子化されたものが市販されている．

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情報・プレパラートの保管


• 研究データは将来参照できるように記述，保管を行う．

• プレパラートは乾燥した場所に室温で保管されることが多い．

• 色あせたプレパラートはカバーガラスを慎重に外し，再染色することで再度観察が可能である．

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線量評価


• 適切な近似曲線を設定する必要がある． • 誤差を抑えるために，500細胞ないしは100の二動原体をカウントすることが推奨される．

• 物理線量の不確実性も考慮する． • 臨界事故や低線量被曝，長期分割被曝，局所被曝，血液採取遅延，放射性物質の摂取などの場合には特別な操作が必要である．

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転座分析


• 二動原体や小核は不安定であり，細胞分裂に伴って排除されていく．このため，これらを用いる手法は検体採取の遅れにより評価が不正確となっていく．

• 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法により転座の検出が容

易となり，転座を用いた線量評価が可能となった．


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細胞培養と固定操作


• 血液採取，リンパ球培養，細胞固定の手順は前述した二動原体染色体分析と同様である．

• 生物学的線量評価ではゲノムの一部しか標識しないため，二動原体染色体分析より多くの細胞を評価する必要がある．

• したがって評価に耐えうる質の分裂中期細胞が多く含まれるスライドを作るとコスト効率が良い．

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染色体蛍光染色


• 全染色体標識． • 汎動原体プローブの使用． • multicolour FISH (mFISH)による全染色体標識． • 挟動原体逆位をはじめとする染色体内交換は，q腕

p腕をそれぞれ別の色に染色することで検出できる． • 単腕内での転座は、染色体内を複数の色で標識するmBAND法で検出することができる．

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評価基準


• 現在FISH法の技術の解像度は11-15Mbp程度であり，その解釈には一定の主観的評価が入る．

• 命名法と記載 • 染色体変異を記載する方法としてPAINTが開発された． • SavageとSimpson (S&S)は英数字で変異を記載する方法を提唱した．

• 現在改定版PAINTが最も用いられている．

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ゲノム変異頻度の推定


• 1992年，Lucasらによって検出頻度からゲノム全体の変異頻度を推定する方法が提唱された．

FG :ゲノム変異頻度 Fp：FISH法で検出された転座頻度

fp ：プローブがカバーするゲノムの割合

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バックグラウンドの転座数


バックグラウンドの転座数は二動原体染色体より頻度が高い．これは染色体異常が安定的であり，蓄積されていくことによる(Sigurdson et al.2008).

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転座の持続性


• 二動原体染色体分析の最大の欠点は，被曝後の時間経過に伴い変異量が減るということにある．

• 安定型染色体異常のバックグラウンドレベルは不安定型染色体異常より高く，時間経過とともに増える傾向にある．

• したがって転座分析の感度は一般的に二動原体染色体分析より低い．

• 質の高いバックグラウンド解析とフォローアップが必要である．

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検量線作成


• 各研究室ごとに検量線を作成する必要がある． • FISHによる線量推定は，分割した高線量被曝や，

長期関係化した症状のない低線量被曝の場合で用いられる．

• LQカーブが使用される急性被曝評価のときと異なり，直線部分にあたるα成分が相対的に重要となる．


• 生物学的線量推定や物理線量推定を行ったことがない集団．

• 物理線量推定が行われた集団． • 被曝直後に従来の二動原体染色体分析により生物学的線量評価をしたことのある集団 (例：トリチウ

ムによる被曝，ゴイアニア，ドイツ，エストニア，イスタンブール，グルジアの事故など）．

後ろ向き生物学的線量評価 FISH法使用の具体例

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未成熟染色体凝縮(PCC)分析


• 生物学的線量評価では被曝後の初回分裂時の二動原体染色体や，転座を分析する．

• 放射線による分裂遅延や細胞死が問題となってくる高線量被曝後では過小評価となる．

• 初回分裂前にPCCを誘導することで，誤差を小さくすることが可能である．

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PCC


• Chinese Hamster Ovary(CHO)細胞を用いたPCC • 標準的な染色体異常分析 • 二動原体染色体分析にはCバンド法を用いる • 染色体蛍光染色による転座・二動原体分析

• 化学誘導によるPCC • 迅速喚起細胞染色体分析(RICA) • Ring-PCC分析

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間期リンパ球内のFISH法でペイントしたヒト染色体のRICA


Courtesy Pathak and Prasanna, AFRRI, USA Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA,

Vienna (2011)

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細胞質分裂阻害小核(CBMN) 分析


• 無動原体染色体断片や染色体全体が，本来の核と別の小さな核を形成することから小核と呼ばれる．

• 1990年代に入って，汎動原体プローブを使用したFISHで動原体を可視化するCBMN分析が開発された．

• 近年，CBMN分析をさらに改良したCBMN Cytと呼ばれる分析法が開発されている．

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CBMN分析評価基準


• 二核 (BN)細胞である． • 核は完全な膜を持ち、同一細胞内にある． • 核は大きさ、染色パターン・強度が等しい． • 核は微細なnucleoplasmic bridgeで繋がっていても良い． • 核は接していても良いが，重ならないことが望ましい． • 核が重なっていても，境界が識別可能であれば評価可能． • 細胞質の境界は完全で，ほかの細胞と識別可能である．

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小核の評価基準


• 小核(MN)の直径が主核の直径の1/16-1/3． • MNが非屈折性である． • MNが主核と連絡，結合していない． • MNは主核と接触していても良いが，重ならないこ

とが望ましい．主核との境界が識別可能でなければならない．

• MNは通常主核と同じ染色強度だが，主核より強染することもある．

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生物学的線量測定へのCBMNアッセイの応用


CBMNアッセイは感度がよく，低線量全身被ばく後の循環リンパ球のゲノム損傷を検出できる。

• 患者研究 (例：放射性ヨウ素のcase study) • 生物モニタリング研究 • チェルノブイリやイスタンブール事故，セミパラチンスク核実験場，50kV接触型X線治療装置の事故

• 数百人規模での大規模被曝事故

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染色体アッセイの自動化


細胞遺伝学の研究室の自動化: • サンプル準備の自動化 • 分析の自動化 • サンプル追跡やデータ取り扱いのための研究室情報マネジメント

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自動サンプル処理


細胞遺伝学研究室における自動サンプル処理には以下の装置が必要である:

• 血液取り扱いロボット • Metaphase harvester • Metaphase spreader • 自動染色機

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自動画像分析


• 顕微鏡画像の自動分析は生物学的線量評価の分野ではまだ一般的には使われていない。

• 中期細胞探査と画像収集システム • 二動原体染色体アッセイの自動化 • 小核の自動評価 • PCC分析の自動化は二動原体染色体分析の自動化と類似している．

• 自動FISH転座分析は現在開発中．

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研究室情報マネジメントシステム (LIMS)


サンプル識別サンプル輸送検査構成スケジューリング

安全管理・監査記録報告機器の統合

Courtesy Ramakumaand Prasanna, AFRRI, USA in Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies, EPR-Biodosimetry, IAEA, Vienna (2011)

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結論


• 染色体による後ろ向き生物学的線量評価は物理的測定と線量推定の検証に重要な手段である．

• 様々な手法が開発され，現在検証中の手法も多数ある．

• 従来の刺激血中リンパ球の二動原体染色体分析は依然として生物学的線量評価の標準である．

• FISH法に基づく転座分析，PCC，CBMN分析もよ

く検討され，正確な線量推計を行うことが可能となっている．

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謝辞


Contributors to drafting and review Ainsbury, E. Health Protection Agency, United Kingdom Barquinero, J.F. Universidad Autónoma de Barcelona, Spain Beinke, C. Bundeswehr Institute of Radiobiology, Germany Blakely, W.F. Armed Forces Radiobiology Research Institute, United States of America Braselmann, H. Helmholz Zentrum, Germany Buglova, E. International Atomic Energy Agency (IAEA) Carr, Z. World Health Organization (WHO) Di Giorgio, M. Autoridad Regulatoria Nuclear, Argentina Fenech, M. Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), Australia Garcia Lima, O. Center for Hygiene and Radiation Protection, Cuba Kodama, Y. Radiation Effects Research Foundation, Japan Lindholm, C. Radiation and Nuclear Safety Authority (STUK), Finland Livingston, G. Oak Ridge Associated Universities (ORAU), United States of America Lloyd, D.C. Consultant, United Kingdom Maznyk, N.A. Institute for Medical Radiology of ANSU, Ukraine Prasanna, P.G.S. National Institutes of Health, United States of America Previsani, N. World Health Organization (WHO) Romm, H. Bundesamt für Strahlenschutz (BfS), Germany Roy, L. Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), France Voisin, P.J. Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), France Vral, A. Ghent University, Belgium Wilkins, R.C. Health Canada, Canada Yoshida, M. Hirosaki University, Japan

Comments received Azizova, T. Southern Urals Biophysics Institute, Russian Federation Barrios, L. Autonomous University of Barcelona, Spain Bognár, G. National Research Institute for Radiobilogy and Radiohygiene, Hungary Darroudi, F. Leiden University Medical Centre, Netherlands Devantier, Y, Chalk River Laboratories, Canada Espinoza Zevallos, M. Instituto Peruano de Energía Nuclear, Peru Guerrero Carbajal, Y.C. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, Mexico Güçlü, I. Çekmece Nuclear Research and Training Centre (ÇNAEM), Turkey Hayata, I. Consultant, Japan Martínez-López , W. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Uruguay Natarajan, A.T. University of Tuscia, Italy Oliveira, M. Instituto de Radioproteção e Dosimetria, Brasil Palitti, F. University of Tuscia, Italy Pantelias, G. Institute of Radioisotopes and Radiodiagnostics, National Centre for Scientific Research “Demokritos”, Greece Sasaki, M.S. Kyoto University, Japan Sotnik, N. Southern Urals Biophysics Institute, Russian Federation Turai, I. National Research Institute for Radiobiology and Radiohygiene, Hungary Valdivia Pottstock, P. Chilean Nuclear Energy Commission, Chile Vozilova, A. Urals Research Centre for Radiation Medicine (URCRM), Russian Federation Wilkinson, D. Defence and Research Development Canada, Canada

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