TFG TEC-Lanotec Dec 12th 2016 PDF

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SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANO POR EL MÉTODO DE GELACIÓN IONOTRÓPICA COMO POTENCIAL SISTEMA DE LIBERACIÓN

CONTROLADA DE ANTIBIÓTICOS.

Rosvin E. Des Bouillons Gamboa

Tutores: Gabriela Montes de Oca, MSc Ricardo Starbird-Pérez, Dr. rer. nat

Lectores: José Roberto Vega-Baudrit, PhD Bernal Sibaja Hernández, PhD

201269016

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Rosvin E. Des Bouillons Gamboa ©

Contenido

Introducción Objetivos

Metodología Resultados & Discusión

Conclusiones Recomendaciones

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Fuente: The Royal Society & The Royal Academy of Engineering (20004)

Diseño, fabricación y uso de sistemas nanoestructurados

Nanopartículas (NP)

Nanotecnología2015 $1 Trillón Prod Global

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Watkins et al. (2015) . Int. J. Nanomedicine. 2015:10 6055–6074 doi: 10.2147/IJN.S92162

Nan

opar

tícul

as

(10-1000nm)

Chitosano (CS)

Liberación controlada de fármacos

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Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133 Taylor et al. (2015) Nature Scientific Reports. 5:10608. DOI: 10.1038/srep10608.

Brizzi, 2016 Scienza&Tecnica-ANSA

Chitosano (CS)

Desacetilación

Grado de desacetilación(%DDA)

QuitosanoQuitina

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https://dx.doi.org/10.3390/md13031133

http://www.nature.com/srep/2015/150601/srep10608/full/srep10608.html

Propiedades del CS%DDA Masa Molecular

Biodegradabilidad Mucoadhesividad

Biocompatibilidad

Baja Toxicidad

Antimicrobiano

Liberación controlada

&

Quitanasas, quitosanasas, lisozimas

6 g/kg azúcar∼

Cargas positivas Interacciones electrostáticas

No rx alérgicas/rechazo

Glicoproteínas

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Nanopartículas de CS(CSNPs)

Carga positiva

Internalizadas por tejidos y

células.

Área Superficial

50-100nm

Circulación Prolongada

Xiong et al. (2014).Advanced Drug Delivery Reviews doi:10.1016/j.addr.2014.02.002

Biodistribución

Especificidad

Ad y absorberCopyright


http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2014.02.002

8

Diagnosis y Terapia del Cáncer

saquinavir – VIH- Jurkat Linfocitos T

Ramana et al. (2014) Biochimica et Biophysica Acta 1840 (2014) 476–484 Lee et al. (2014) Nanomedicine (2014) 9(11), 1697–1713 de Campos et al. (2004) Pharmaceutical Research, 21(5)

Terapia VIH Tratamiento oftalmológico

Otras aplicaciones de las CSNPs

Conjuntiva – CSFL NP – CSFL - FMarcadores fluorescentes – NIRF

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Métodos de Síntesis de CSNPs

Entrecruzamiento por emulsión

Micelas reversasSpray-drying

Método de tamizadoCoacervación/precipitación

Gelación Ionotrópica

Solventes orgánicos

Viabilidad celular

Procesos complicados

Desestabilización del agente activo

NP de gran tamaño

Equipo

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Método de Gelación Ionotrópica

CS policatión Tripolifosfato de Sodio (TPP)

Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133

Entrecruzamiento iónico reversible

Fuerzas electrostáticas

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https://dx.doi.org/10.3390/md13031133

Método simple

No solventes orgánicos

T. ambiente

No entrecruzamiento químico

Entrecruzamiento físico reversible

Agente activo protegido

Disolución acuosa

Koukaras et al. (2012). Mol. Pharm. 9(10), 2856–2862. doi: 10.1021/mp300162j

VentajasMétodo de Gelación Ionotrópica

Relaciones CSTPP

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Sintetizar nanopartículas de quitosano utilizando el método de gelación ionotrópica por entrecruzamiento con Tripolifosfato (TPP).

Caracterizar las nanopartículas por Dispersión Dinámica de Luz (DLS), Espectroscopía Infraroja con Transformada de Fourier (FTIR), Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) y Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Evaluar la actividad antibacteriana in vitro, utilizando el método de la determinación de la concentración mínima inhibitoria en Escherichia coli (gram negativa) y Staphylococcus aureus (gram positiva).

Objetivo General

Sintetizar nanopartículas de quitosano por medio del método de gelación ionotrópica como sistema de liberación controlada de antibióticos

Objetivos Específicos

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Metodología

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Síntesis de CSNPs Caracterización MIC

[Se define relac. CSTPP por DLS]

FTIRTEM AFM

S. aureusE. coli

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Síntesis de CSNPs por gelación ionotrópica

-10°C

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Caracterización

Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)

Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)

ZetaPotencial DHP3mL 1,5mL

5μL 1:50 Rejilla Desecador

5μL 1:50 Mica T. amb

150 kHz mica hidrofílica

modo intermitenteal aire

Rayado MH 1x 24h antes

Inóculo 2h antes Centrifugación

Pellet Dsln Salina

D.O. ideal

Ensayo resazurina

inhibición del crec.

viabilidad celular

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Resultados & Discusión

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Síntesis de CSNPs

100-300kDa %DDA 75-85%

CS

Prueba preliminar

Dsln. Opalescente

Dsln. turbia

Formación de NPs

Precipitación

Inestabilidad, floculación

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Espectroscopía Infraroja con Transformada de Fourier (FTIR)

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Interacción entre los iones fosfato (del TPP) y amonio (del CS).

FTIR

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Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

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Stokes-Einstein

Mov. Browniano

Análisis de Fluct. De Intensidad

D

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Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP) y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)

Entrecruzamiento NH3 Libres

100-300kDa %DDA 75-85%

CS

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Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP) y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)

Entrecruzamiento NH3 Libres

100-300kDa %DDA 75-85%

CS

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Distribución de DH de CSNPs

81,90% 18,30%

87,50% 10,40%

84,10% 11,8%

83,10% 16,90%

Dos Familias PdI

100-300kDa %DDA 75-85%

CS

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Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)

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Vacío

Hidratación Mínima

Morfología No-esféricas

Dos poblaciones

Promedio=(65±13,77)nm

Desecación

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Vacío

Hidratación Mínima

Morfología No-esféricas

Dos poblaciones

(65±13,77)nm (194,57±9,23)nm Vs.

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Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)

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CSNPs no liof.

(102,34±17,91)nm diámetro

(10,27±2,82)nm altura

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CSNPs liof.

(557,69±178,58)nm

(12,71±4,78)nmAgregación

Centrifugación

Liofilización

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Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)

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inhibición del crec. viabilidad celular

Ensayo de la Resazurina

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Columna 7

S. aureus

E. coli

Inhibición

Columna 6Inhibición


CSNPs en dsln. síntesis

A)

B)

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Modelos de interacción CSNPs - Células+ -

Fuerzas Electrostáticas

CS compite con iones Ca2+

En Membrana celular

Cambios en permeabilidad

Desbalances osmóticos

Viabilidad

salida de electrolitos intracelulares

Iones potasio, proteínas, ácidos nucleicos, glucosa y lactato

deshidrogenasa

http://bvs.sld.cu/

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Xu et al., 2015 Polymers 2015, 7(9), 1850-1870; doi:10.3390/polym7091488

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http://dx.doi.org/10.3390/polym7091488

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Catherine Stanley

Jeon et al., 2014 PLoS ONE 9(3): e92723. doi:10.1371/journal.pone.0092723.g003

Cadena O del LPS

Más negativa

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E. coli


NO HAY EFECTO1,38-0,25µg/mL

Crecimiento Celular

S. aureus

A)

B)

Crecimiento Celular

CSNPs proceso de liof.

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E. coli


NO HAY EFECTO22-4µg/mL

Crecimiento Celular

S. aureus

A)

B)

Crecimiento Celular

CSNPs proceso de liof.

[ 12 veces]∼

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Posibles Razones

Concentración

Kauper & Forrest (2006)

[CSNPs]

Filtrar 0,45μm y 0,22μm

35%

Valor de MIC >22μg/mL

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Posibles RazonesLiofilización

Centrifugación

Agregación del sistema

Congelamiento

DesestabilizaciónÁrea superficial

Interacción con las bact.

Con CSTPP NPs Var. 142,8%

Cristales

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Valor de MIC 100-22µg/mL

Total Inhibición550-100µg/mL

S. aureus

A)

B)

E. coli

Crecimiento Celular22-4µg/mL

Quitosano

Copyright



Valor de MIC 100-22µg/mL

Total Inhibición550-100µg/mL

S. aureus

A)

B)

E. coli

Crecimiento Celular22-4µg/mL

Quitosano

Copyright


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Se logró definir la relación CSTPP 4:1 como la mejor relación valores de tamaño y ZetaPot adecuados.

Se logró caracterizar por los diferentes métodos físico químicos las CSNPs.

Se logró dar un acercamiento sobre la capacidad de inhibición de las CSNPs en solución de síntesis, pero no se logró obtener el mismo resultado luego de que las CSNPs fueron expuestas al proceso de liofilización.

Para las CSNPS 4:1 en solución de síntesis se vio una muy pequeña diferencia de inhibición entre S. aureus y E. coli, en donde S. aureus aparenta ser un poco más sensible.

Se logró acercar el rango para la determinación de la concentración mínima inhibitoria para el CS entre 100µg/mL y 22µg/mL.

ConclusionesCopyright


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Como un extra se se realizó la curva de calibración (R2=0,9965) para la ampicilina y se realizaron pruebas para la Eficiencia de Carga (EE) de las NPs con ampicilina, sin embargo se obtuvieron valores de (16,83± 2,36) por lo que se recomienda realizar más pruebas.

Evaluar la efectividad de diferentes crioconservantes como manitol, sacarosa y trehalosa para la preservación de la estabilidad de las CSNPs ante los procesos de centrifugación, congelamiento y liofilización.

Realizar ensayos comparativos entre las CSNPs, antibiótico y las CSNPs cargadas con antibiótico.

Realizar análisis por AFM, TEM y SEM de las bacterias tratadas con NPs para elucidar el mecanismo de acción de las NPs.

RecomendacionesCopyright


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Dr. José Vega-Baudrit, Lanotec, PoliUNA, CeniBiot, CeNAT, CIB, Gaby Oca, Bernal, Michael, Rey, Gaby Ávila, Laura, Daniels, MaJosé, Cano, Cristofer, Cristina,, Steph, Gia, Karen, Sebas, Mixie, Mattey, HDi, Antonio M.U., Hazel, D. Duesing,

AgradecimientosCopyright


DIAPOSITIVAS DE APOYO

EE Ampicilina 197nm Curva calibración R2=0,9965 EE=(16,83±2,36)%

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Movimiento Browniano

Colisiones aleatorias con moléculas del

Solvente

Para NPs de mayor tamañoEl coef de Difusión es

pequeño,Se mueven más lento.

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Documents

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