TEST SEROLOGI :DEMAM TIFOID

& DEMAM DENGUE

E. M. Hidayat, SpPKDep. Patologi Klinik FKUPNVJ

DEMAM TIFOID

•Pendahuluan•Demam tifoid : demam yang

ditimbulkan oleh infeksi beberapa Salmonella (S. para-typhi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C), khususnya Salmonella typhi (S.typhi).

Pendahuluan (lanjutan)

Gejala demam tifoid • Biasanya mengenai di saluran

cerna • Gejala demam > satu minggu, • Gangguan pencernaan (seperti

konstipasi). • Gangguan kesadaran (pada

penderita sakit berat).

Pendahuluan (lanjutan)

• Masa inkubasi 10 – 14 hari, disertai gejala sakit kepala, lemah, konstipasi, bradikardia dan mialgia.

• Hallmark : demam berlangsung lama (prolonged and persistent fever) selama 4 – 8 minggu pada penderita yang tidak diobati.

Pendahuluan (lanjutan)

• Di Indonesia : penyakit endemik, berhubungan dengan :

• tingkat kesehatan, • tingkat pengetahuan tentang

kesehatan • sanitasi yang buruk. • Penyulit pemberantasan penyakit

ini : adanya pembawa kuman yang sehat (carrier), dimana fecal-carrier paling penting.

Pendahuluan (lanjutan)

• Diperkirakan 10% penderita yang sudah sembuh, dalam 3 bulan pertama selalu mengeluarkan kuman melalui tinja dan urin

• 2 – 5% penderita yang sembuh akan menjadi permanent-carrier.

Etiologi

• Salmonella typhi : basil Gram (-) bersifat aerobik, tidak berspora, bergerak dengan rambut getar.

• Memiliki 3 macam antigen Antigen O (somatik), sering

disebut endotoksin. Antigen H (flagela) Antigen Vi (antigen permukaan)

Patogenesis

• Salmonella typhi masuk melalui mulut bersama makanan atau minuman yang tercemar.

• kuman menembus mukosa usus, masuk aliran limfe usus, berbiak dan akhirnya masuk peredaran darah melalui ductus thoracicus.

Patogenesis (lanjutan)

• Bakteriemia I terjadi 24 – 72 jam setelah kuman masuk.

• mencapai organ-organ seperti hati, empedu, limpa, sumsum tulang dan ginjal.

• Bakteriemia ini berlangsung singkat akibat fagositosis oleh makrofag,

• masih terus berkembang di organ tertentu (empedu) karena ada kapsel Vi.

• Proses ini memerlukan waktu 7 – 10 hari.

Patogenesis (lanjutan)

• Dari kandung empedu, kembali ke usus halus dan jaringan getah bening, terutama plaque Peyer.

• menimbulkan reaksi peradangan, hiperplasia dan infiltrasi sel mononuklear,

• kemudian kuman kembali masuk ke sirkulasi darah lagi (bakteriemia II).

• Pada bakteriemia II dilepaskan endotoksin.

Pemeriksaan laboratorium

Darah tepi• Anemia normositik normokrom• Leukopenia (3.000 – 4.000/uL)

pada fase demam• Aneosinofilia pada permulaan

penyakit• Trombositopenia • Limfositosis relatif

Pemeriksaan laboratorium (lanjutan)

Urin• Proteinuria• Reaksi Diazo (Erlich)

Serologi ( Widal, hemaglutinasi, Elisa, dsb)

Bakteriologik : isolasi kuman. Sampel darah, aspirasi sumsum tulang, rose spot, urin, tinja

Test laboratorium untuk membantu menegakkan

diagnosis• Test serologis (mendeteksi kenaikan titer/ kadar antibodi terhadap antigen S.typhi dan menentukan adanya antigen spesifik dari S.typhi.

• Test biakan untuk mendeteksi kuman S.typhi dari spesimen darah, urin, feses, sumsum tulang.

• Test Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendeteksi DNA spesifik S. typhi.

Bahan Biakan / Kultur

• darah, urin, feses, sumsum tulang.

• darah : minggu I atau II sakit• urin : minggu II atau III sakit• tinja : minggu II atau III sakit• sumsum tulang : minggu I

sakit.

DIAGNOSIS

• Diagnosis demam tifoid sulit ditegakkan tanpa test laboratorium, sebab gambaran klinis penyakit ini sangat bervariasi dan pada umumnya tidak khas (spesifik).

• Diagnosis pasti : test biakan/kultur bakteri ditemukan S. typhi.

Test Widal

• Reaksi aglutinasi, dikembangkan pertama kali oleh Widal (1896).

• Di daerah non endemik, titer H dan O > 1: 80 menyokong diagnosis

• Di daearh endemik, titer H dan O > 1:160 menyokong diagnosis

• Kenaikan titer antibodi > 4x pada pemeriksaan ulangan 1 atau 2 minggu kemudian menyokong diagnosis

Prinsip Test Widal.

• reaksi aglutinasi. • antigen S.typhi/S.paratyphi bila

dicampurkan dengan serum penderita demam tifoid yang mengandung antibodi terhadap S.typhi/S.paratyphi akan terjadi aglutinasi.

Peralatan dan bahan pemeriksaan

• serum penderita demam tifoid• antigen somatik (O) dan flagelar (H) • larutan NaCl 0.85% (0.9%)• 1 microplate plastik dengan sumur-

sumur kecil• mikropipet dengan tips-nya.• mesin penggoyang (shaker

machine)

Antigen Somatik (O)

Salmonella grup A (S.paratyphi A): A-OSalmonella grup B (S.paratyphi B): B-OSalmonella grup C (S.paratyphi C): C-OSalmonella grup D (S. typhi) : O

Antigen flagelar (H)

Salmonella grup A : A-H Salmonella grup B : B-H Salmonella grup C : C-H Salmonella grup D (S.typhi) : H

Persiapan Penderita.

• Penderita sebaiknya belum mendapat terapi antibiotik.

• Jenis sampel : serum penderita tersangka demam tifoid, tidak hemolisis

 

Pengambilan sampel.

• Pengambilan sampel darah sebaiknya dilakukan pada fase akut dan fase konvalesen.

Cara Kerja Test kualitatif dengan Slide

1. teteskan satu tetes (0.04 mL) serum penderita (tidak diencerkan) di slide.

2. teteskan satu tetes suspensi antigen yang telah dikocok homogen di samping tetes serum.

3. campur serum dan suspensi antigen dengan batang pengaduk, sebarkan memenuhi lingkaran pengamatan.

Cara kerja (lanjutan)

• goyang slide perlahan-lahan dgn tangan selama 1 (satu) menit

• amati adanya aglutinasi pada slide baik antigen O dan antigen H.

• bila terjadi aglutinasi, lanjutkan test konfirmasi dengan menggunakan tabung reaksi untuk menentukan titer antibodi dalam sampel.

• nilai titer = pengenceran yang masih ada aglutinasi.

Test Kuantitatif dengan Cara Slide

1. pipet serum sampel yang belum diencerkan

• 0.08 mL (80 uL), (nilai 1 : 20)• 0.04 mL (40 uL), (1 : 40)• 0.02 mL (20 uL), (1 : 80)• 0.01 mL (10 uL). (1 : 160)• 0.005 mL (5 uL) (1 : 320)

Cara test kuantitatif dengan cara slide (lanjutan)

2. untuk pembanding, pipetkan 0.04 mL kontrol (+) dan 0.04 mL kontrol (-) di tempat terpisah pada slide.

3. teteskan satu tetes suspensi antigen yang telah dikocok homogen ke atas sampel serum, kontrol (+) & kontrol (-).

Cara test kuantitatif menggunakan slide (lanjutan)

4. campurkan serum dan suspensi antigen dengan batang pengaduk (tusuk gigi), mulai dari pengenceran terkecil ke pengenceran serum yang lebih besar,

5. sebarkan campuran sampai memenuhi lingkaran pengamatan.

6. Lakukan juga terhadap kontrol (+) dan kontrol (-).

Cara test kualitatif dengan cara slide (lanjutan)

1. putar slide dengan tangan atau rotator selama 2-3 menit.

2. baca hasil reaksi di bawah penerangan yang baik. Hasil positip ditandai dengan adanya aglutinasi.

3. nilai titer antibodi sesuai dengan nilai pengenceran tertinggi yang didapat.

Interpretasi test Widal harus hati-hati

Banyak faktor mempengaruhi hasil test :

• Stadium penyakit.• Pemberian antibiotika• Teknik laboratorium• Test tidak spesifik

TUBEX-TF

• Suatu pemeriksaan laboratorium untuk mendeteksi adanya antibodi IgM di serum sampel terhadap antigen S.typhi LPS-O9 (lipopolisakarida) dengan metoda Immunoassay Magnetic Binding Inhibition (IMBI). Tingkat inhibisi setara dengan kadar antibodi IgM S.typhi dalam sampel

Prinsip Test TUBEX-TF

• TUBEX TF mendeteksi adanya antibodi IgM thd antigen LPS-O9 S.typhi di serum penderita dengan cara menghambat reaksi antara antigen berlabel partikel lateks magnetik(brown reagent) dan antibodi monoklonal berlabel lateks warna (blue reagents). Ikatan inhibisi dipisahkan dgn daya magnetik. Hasil dinyatakan dalam skala warna (color scale).

Bahan Pemeriksaan

• serum atau plasma heparin. • JANGAN menggunakan plasma EDTA atau

plasma sitrat. • Serum lipemik, hemolisis dan ikterik TIDAK

BOLEH digunakan, karena warna merah dari hemoglobin (pada hemolisis) atau bilirubin mengganggu warna yang terbentuk. pembacaan hasil test. Serum sampel disimpan pada suhu 2–8 C atau dibekukan (< -18C) bila belum akan segera diperiksa.

•  

Peralatan & Reagen

• Pipet presisi, vortex dan timer (pencatat waktu)

• Komponen dalam TUBEX TF :– TUBEX TF Brown Reagent, mengandung

antigen coated particles.– TUBEX TF Blue Reagent, mengandung

antibody coated particles.– Negative & Positive Control.– Reaction Well Strip & Sealing Tape– TUBEX TF Colored Sticker

•  

persiapan

• Biarkan reagen dan serum pada suhu kamar.

• Kocok (homogenisasikan) semua reagen sebelum digunakan,

• check apakah semua sedimen telah larut.

Prosedur Test (1)

• Letakkan TUBEX Reaction Well Strip dengan posisi tegak, nomor V-shape well dihadapan kita.

• Teteskan 45 uL TUBEX TF Brown Reagent pada tiap V-shape Well.

• Ag LPS-O9 S.typhi akan melekat pd partikel magnetik warna coklat

Prosedur Test (2)

• Tambahkan 45 uL sampel penderita, TUBEX TF Positive & Negative Control dan serum penderita pada V-shape Well (sumur-V),

• campur dengan hati-hati dengan menggunakan pipet (isap-dorong) sebanyak 10 x, usahakan agar tidak terjadi busa.

Prosedur Test (lanjutan)

Di V-shape well :• kontrol positip : Anti IgM Mab S.typhi berikatan dgn Ag LPS-O9.• serum sampel : serum Ab IgM S.typhi berikatan dengan Ag LPS-O9

Prosedur Test (3)

• Inkubasi selama 2 menit• Tambahkan 90 uL TUBEX TF Blue

Reagent ke semua V-shape well. • Di Well kontrol negatip : Mab IgM S.typhi melekat pada partikel lateks

warna biru berikatan dgn Ag LPS-O9• Di Well serum sampel : Reaksi Mab IgM S.typhi dgn Ag LPS-O9 di-

inhibisi oleh Ab IgM S.typhi dari serum

Prosedur test (lanjutan)

• Tutup TUBEX Reaction Well dgn TUBEX sealing Tape

• Homogenisasi 2 menit• Letakkan well strip di atas skala

magnetik untuk reaksi separasi selama 5 menit.

• Interpretasi hasil.

Interpretasi hasil

• < 2 negatip tidak menunjukkan infeksi. Kontrol negatip.

• 3 borderline pengukuran tidak dapat disimpulkanm ulangi test. Bila hasil meragukan, lakukan sampling ulang beberapa hari kemudian

• 4 positip lemah menunjukkan infeksi demam typhoid

Interpretasi (lanjutan)

• 6-10 positip indikasi kuat demam typhoid aktif. Kontrol positip.

• Indeterminate : ketidakjelasan pengukuran diakibatkan oleh :

1. Protokol test tidak diikuti dgn baik.

Ulangi test 2. Kualitas sampel kurang baik. Lakukan sampling ulangi test

Pemeriksaan Serologi Demam Dengue (IgG/IgM)

Pendahuluan • Demam Dengue disebabkan oleh Virus

Dengue yang disebarkan oleh nyamuk, Stegomyia aegypti (dulu dikenal sebagai Aedes aegypti) dan Aedes albopictus

• Dikenal 4 serotipe virus : Dengue virus 1 Dengue virus 2 Dengue virus 3 Dengue virus 4

Pendahuluan (lanjutan)

• virus Dengue, termasuk genus Flavivirus, famili Flaviviridae.

• berbentuk sferis berukuran 40-50 nm, mempunyai 2 tipe protein :

1) protein struktural (3 macam) : protein C (core), protein M (membran), protein E (envelope) 2) protein non struktural (7 jenis) :

NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

Pendahuluan (lanjutan)

• Orang yg terinfeksi sering mengalami demam sub fibril dan sembuh sendiri

• Bila terinfeksi kedua kali dengan virus serotipe lain, keluhan menjadi lebih berat dan dapat mengalami dengue hemorrhagic fever (DHF), dengue shock syndrome (DSS)

Demam Dengue

• Di Indonesia, demam dengue merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat, karena selalu menimbulkan wabah yang muncul pada bulan-bulan tertentu setiap tahun.

•  

Patogenesis dan Patofisiologi

• Setelah gigitan nyamuk, virus Dengue, berkembang biak di kelenjar limfe regional, menyebar melalui sistem limfatik dan sirkulasi darah ke jaringan lain.

• Masa inkubasi demam dengue berkisar antara 3 – 14 hari, umumnya 4 – 7 hari.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

• demam tinggi disertai kejang dan perdarahan saluran cerna akibat infeksi sekunder (infeksi ke dua kalinya) oleh serotipe lain.

• demam ringan umumnya terjadi pada infeksi primer.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

• Hal ini disebabkan antibodi anti-dengue dari infeksi sebelumnya berikatan dengan virus Dengue serotipe lain yang menginfeksi saat ini membentuk kompleks Ag-Ab yang akan merangsang penglepasan sitokin dan mengaktivasi komplemen (penglepasan anafilatoksin C3a dan C5a) yang merangsang pengeluaran histamin.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)

• Akibatnya terjadi gangguan fungsi endotel (antara lain peningkatan permiabilitas endotel kapiler ). Terjadi kebocoran / perembesan plasma ke ruang ekstravaskuler, sehingga terjadi renjatan (shock) hipovolemik.

•

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)

• Perubahan vaskuler, kerusakan trombosit, trombositopenia dan gangguan faktor-faktor pembekuan menimbulkan gangguan hemostasis dan terjadi perdarahan.

• Berat ringannya gejala tergantung pada serotipe dan galur virus Dengue, usia dan sifat genetik penderita serta derajat viremia.

Diagnostic test

• Immunochromatographic assay• Isolation of virus• Antigen detection in fixed tissues• RT-PCR (Reverse Transcription-

PCR)• Hemagglutination-inhibition test

Dengue IgG / IgM Rapid test

• Solid phase immunochromatographic assay.

• Sifat Test : rapid, kualitatif deteksi antibodi IgG dan IgM virus Dengue di serum atau plasma.

• Presumptive diagnosis antara infeksi primer dan infeksi sekunder.

Prinsip Test

• Didesain secara simultan mendeteksi antibodi IgG dan IgM virus dengue

• Mendeteksi semua serotipe dengue menggunakan campuran protein envelope recombinant dengue.

• Test dilengkapi dengan 3 garis (pre-coated lines: “G” (IgG), “M” (IgM), “C” (kontrol).

• Garis “C” harus selalu muncul pd tiap test

Prinsip Test

• Bila sampel diteteskan di sumur sampel, anti dengue IgG / IgM di serum bereaksi dgn recombinant Dengue virus envelope protein-colloidal gold conjugates membentuk komplek Ag-Ab.

• Dengan daya kapilaritas, komplek Ag-Ab bermigrasi dan sampai ke anti-human IgG dan/atau IgM yg ada di garis test dan menimbulkan pembentukan warna

Bahan Test

Dengue IgG/IgM test strip :• Gold conjugates : recombinant

Dengue virus envelope protein-gold colloid.

• Garis “G” : mouse monoclonal anti- human IgG

• Garis “M” : mouse monoclonal anti-human IgM

• Garis kontrol : rabbit anti-Dengue IgG

Bahan Test (lanjutan)

• Assay diluent : 100mM phosphate buffer, Sodium azide

• 5 uL capillary pipette atau mikropipet

Pengambilan dan Penyimpanan Sampel

• Serum : ambil darah vena, masukkan di tabung reaksi tanpa antikoagulan, biarkan 30’ , sentrifuge, pisahkan serum dari bekuan darah

• Plasma : ambil darah vena, masukkan di tabung reaksi mengandung antikoagulan (heparin/Na-EDTA/Na-sitrat), pisahkan plasma dari sel-sel darah.

Pengambilan & penyimpanan sampel

• Bila tidak segera diperiksa, simpan sampel di suhu 2-8 C.

• Bila disimpan > 2 minggu, dianjurkan di bekukan.

• Suhu test : suhu kamar.• Sampel mengandung presipitat

harus di jernihkan dulu sebelum test.

Pengambilan & Pengumpulan Sampel (lanjutan)

Sampel • hemolisis, • lipemik, • ikterik, • mengandung faktor rheumatoid • dapat mengganggu test.

Prosedure Test

• Siapkan Kit test dan sampel pada suhu kamar.

• Isap sampel (serum/plasma) menggunakan pipet kapiler sampai “black line” (5 uL) atau menggunakan mikropipet.

• Teteskan serum/plasma 5 uL di sumur bertanda “S”.

Prosedur Test (lanjutan)

• Tambahkan 3-4 tetes assay diluent ke sumur assay diluent yang berbentuk bulat

• Baca hasil test dalam waktu 15 – 20’. (jangan dibaca sesudah 20’ )

Interpretasi Test

• Negatif. Hanya tampak garis pink “C”• Positip. IgM (+) (infeksi dengue primer) :

tampak 2 garis pink “C” dan “M”. IgG (+)(infeksi dengue sekunder atau

pernah terinfeksi di masa lalu) : tampak 2 garis pink “C” dan “G”.

IgM dan IgG (+) : tampak 3 garis pink “C”, “M”, “G”.

• Invalid : garis “C” tidak ada

Keterbatasan Test

• Test jangan digunakan sebagai satu-satunya test untuk mendiagnosis infeksi dengue (should not be used as the sole criterion for diagnosis)

• Pada infeksi dini, kadar antibodi mungkin rendah, dan pada beberapa penderita kadar antibodi terdeteksi baru pada hari 7 – 10. Bila gejala klinik ada lakukan re-test dalam 3 – 4 hari

Keterbatasan Test (lanjutan)

• Reaksi silang mungkin dapat terjadi dengan grup Flivivirus (virus dengue, St.Louise encephalitis, Japanese encephalitis, West Nile dan yellow fever).

• Bila hasil test (-), tetapi gejala klinik ada, disarankan test lagi dengan metoda lain.

Expected value

• Dengue primer ditandai ditemukannya IgM 3 – 5 hari pasca infeksi.

• Dengue sekunder ditandai dengan peningkatan IgG 1 – 2 hari setelah infeksi dan pada sebagian kasus diikuti dengan peningkatan IgM.

Sensitivitas dan spesifitas test

• Sensitivitas : % jumlah kasus (+) benar dari jumlah semua kasus (+).

• Jumlah kasus (+) :102• Jumlah kasus (+) dgn test ini : 93• Sensitivitas test : 93/102 x 100%=

91.2%

Spesifitas test

• Spesifitas : % jumlah kasus (-) benar dari jumlah seluruh kasus (-).

• Jumlah kasus (-) : 200• Jumlah kasus (-) dgn test ini : 180• Jumlah kasus (+) palsu 20• Spesifitas test : 180/200 x 100% =

90%